CN117177776A - 穿过血脑屏障并引起减弱的体液应答的合理多倍体aav病毒粒子 - Google Patents

穿过血脑屏障并引起减弱的体液应答的合理多倍体aav病毒粒子 Download PDF

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Abstract

本发明涉及穿过血脑屏障(BBB)的合理多倍体腺相关病毒(AAV)病毒粒子的实质上同类的群，其中所述合理多倍体包含来自穿过BBB的任何AAV血清型的VP3病毒结构蛋白。在一些实施方案中，当全身性或鞘内施用于受试者时，合理多倍体穿过BBB。在一些实施方案中，除了VP3蛋白之外，合理多倍体AAV病毒粒子还包含至少一种VP1和/或VP2病毒结构蛋白。在一些实施方案中，VP3衣壳蛋白来自非人灵长类动物，并且在一些实施方案中，VP3衣壳蛋白是AAV恒河猴血清型。在具体实施方案中，合理多倍体AAV病毒粒子包含来自AAV8的VP1衣壳蛋白、和来自穿过BBB的任何AAV血清型的至少VP3衣壳蛋白。

Description

穿过血脑屏障并引起减弱的体液应答的合理多倍体AAV病毒 粒子
交叉引用的申请
本发明要求2021年4月16日提交的美国临时申请63/175,954、以及2021年4月27日提交的美国临时申请63/180,414的根据35U.S.C.§119(e)的权益，其各自的内容通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用以其整体并入此处。所述的ASCII副本创建于2021年4月26日，命名为046192-098020PL02_SL.txt，大小为139904字节。
技术领域
本发明针对生产具有期望特性的一组合理多倍体(rational polyploid)腺相关病毒(AAV)颗粒、病毒粒子和病毒衣壳的方法，所述病毒粒子、该病毒粒子的实质上同类(homogenous)的群、生产实质上同类的群的方法以及其用途。更具体地，本发明针对包含来自任何AAV血清型的VP3结构蛋白的多倍体AAV病毒颗粒，所述病毒颗粒穿过血脑屏障(BBB)，并且其中在全身性或鞘内施用时，多倍体AAV病毒粒子穿过BBB和/或转导BBB的细胞。
背景技术
中枢神经系统(CNS)疾病是最难治疗的一些疾病，因为血脑屏障(BBB)几乎完全限制了许多治疗药物进入CNS。腺相关病毒(AAV)载体已被广泛用于治疗各种中枢神经系统(CNS)疾病。由于血脑屏障(BBB)的存在，基于AAV的CNS疾病治疗的早期尝试主要通过颅内注射进行。例如，在治疗中枢神经系统(CNS；即大脑和脊髓)的疾患时，基于AAV的疗法的递送很复杂，直接施用通常涉及侵入性手术，如果全身性施用，血脑屏障会阻碍基于AAV的疗法进入CNS。此外，需要高剂量的基于AAV的疗法以产生足够的靶标CNS组织的转导，鉴于需要高的施用量，导致增高的副作用的风险和/或生产难度。尽管外周神经系统(PNS；即大脑和脊髓以外的神经组织)可被认为对更易于接受治疗干预，但某些PNS组织、如背根神经节仍然难以靶向。AAV血清型AAV9因其穿过BBB以转导星形胶质细胞的能力而被广泛研究，但其效率有限。例如，AAV9的全身性注射已在多种CNS疾病的临床试验中进行评估。然而，开发全身性AAV注射来治疗CNS疾病仍与许多挑战相关，如AAV穿过BBB的效率、由AAV递送的基因的表达引起的外周毒性以及血液中针对AAV的免疫屏障。
到目前为止，已经识别出12种AAV血清型和多于100种的变体，以及动物和非人灵长类AAV血清型，包括恒河猴(AAVrh)和黑猩猩。不同血清型的衣壳在组织或培养细胞中具有不同的感染性，这取决于细胞表面上的初级受体和共受体、或胞内运输途径本身。尽管AAV载体的应用已被证明是安全的，并显示出治疗效果，但血清型之间存在差异，包括不同的转导和生物分布特征。
在一些临床试验中，报道了小鼠、非人灵长类动物和人类之间的转基因表达存在明显的物种特异性差异，在小鼠的临床前研究中表现出高的转基因表达，但在人类临床试验中缺乏类似的基因表达，包括消除了AAV转导的肝细胞的潜在的衣壳特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，导致治疗失败。因此，这些临床试验的结果强调了在不增加载体衣壳负载的情况下探索增强AAV转导的有效方法的必要性。此外，大多数人已经自然暴露于AAV。结果，大部分人群在血液和其他体液中产生了针对某些血清型AAV的中和抗体(Nabs)。
已经评估了对腺相关病毒的全谱免疫应答，包括先天免疫、细胞毒性T细胞(CTL)应答和体液应答。预先存在的抗AAV免疫、特别是针对AAV血清型的中和抗体(NAbs)已经成为AAV载体介导的基因递送的临床应用的重大挑战。多项研究讨论了针对常用AAV血清型(例如AAV血清型1-9型)的预先存在的NAbs的普遍性。多项研究表明，在生命早期由自然暴露至AAV引起的抗体诱导可能会影响AAV作为基因治疗载体的后续使用，和/或由AAV载体诱导的强的体液应答可能会影响用相同AAV载体重复给药的潜在需求(Hurlbut等，Mol Ther，2010，18(11):1983；Manno等，Nat Med，2006，12(3):342；和Wang等，Blood，2006，107(5):1810；Calcedo等，Front Immunol，2013，4，341；其各自的内容通过引用以其整体并入本文)。
因此，针对AAV载体的体液免疫代表了有效的基因转移的重大障碍，使得AAV载体在进入靶细胞之前就被清除。针对AAV衣壳的抗体在人类中高度流行，人类是该病毒的天然宿主，并且由于衣壳蛋白序列的同源程度，该抗体与广泛的血清型发生交叉反应。由于NAb可以有效阻断AAV介导的体内转导，用于克服针对病毒衣壳的体液免疫的策略对于实现成功的基因转移至关重要。
就此而言，需要定制AAV载体，使其有效地穿过BBB，并具有期望的特征的组合集，包括不同的转导效率和减弱的免疫应答，这对基因治疗药物的开发将是非常有益的。
发明内容
本文中的技术涉及合理多倍体或单倍体AAV载体、病毒粒子或其药物组合物的实质上同类的群，它们穿过血脑屏障(BBB)和/或具有减弱的抗原性。众所周知，通过基因治疗和病毒载体向CNS递送治疗基因的障碍是血脑屏障。血脑屏障是内皮细胞的半透性边界，其阻止血流中的某些化学物质和分子进入中枢神经系统的细胞外液。本文中，发明人合理地设计AAV病毒粒子以包含来自多于一种的血清型的结构VP蛋白，从而提高全身性和鞘内递送后向CNS和PNS的载体转导效率。本发明的实施方案基于如下出乎意料的发现，来自已知有效穿过血脑的AAV血清型的VP3病毒结构蛋白负责血脑穿越表型。因此，可以设计合理多倍体以穿过血脑屏障，并避免对亲代血清型的免疫应答，例如，规避中和抗体，并针对产生合理多倍体的亲代血清型引起较少的体液应答。
之前的报告表明，设计由来自两个以上的AAV血清型的衣壳组成的AAV载体(如合理多倍体)可以从各个血清型获取用以改变如向性、转导或抗原性等行为的优势。这些多倍体病毒中的一些具有改变向性和转导效率以及逃避中和抗体(Nabs)的中和的能力。
发明人此前发现了如下方法，它允许合理设计和生产病毒粒子，其中病毒粒子有时被称为合理多倍体病毒粒子，是指衣壳蛋白VP1、VP2和VP3来自至少两种不同的血清型，而不是全部来自同一血清型。术语单倍体有时用于指其中衣壳蛋白VP1、VP2和VP3来自至少两种不同血清型的病毒粒子，并且术语三倍体通常用于指其中衣壳蛋白VP1、VP2和VP3来自三种不同血清型的病毒粒子。特别是，这种合理多倍体、例如合理的单倍体病毒粒子及其生产方法在美国专利No.10550405中公开，其通过引用以其整体并入本文。
在本文中，该技术通常涉及合理多倍体腺相关病毒(AAV)颗粒、病毒粒子和病毒衣壳的同类的群，包括来自穿过血脑屏障(BBB)的任何AAV血清型的VP3结构蛋白，并且其中多倍体AAV病毒粒子穿过BBB、和/或在全身性或鞘内施用后转导血液成分以允许通过脑循环递送到大脑。在一些实施方案中，VP3衣壳蛋白来自非人灵长类动物，例如AAV恒河猴(rhAAV)血清型。合理多倍体AAV病毒粒子还可以包括来自与VP3蛋白不同的血清型的至少一个VP1和/或VP2病毒结构蛋白。在一些实施方案中，合理多倍体AAV病毒粒子包括来自AAV8的VP1衣壳蛋白和来自穿过BBB的任何AAV血清型的至少VP3衣壳蛋白。在一些实施方案中，病毒结构蛋白(例如任一种或多种VP1、VP2或VP3)可以被修饰，例如通过对核苷酸的改变、经化学修饰、混合血清型等。
例如，使用来自有效地穿过BBB的任何AAV血清型的VP3结构蛋白改变了全身性或鞘内施用后的转导效率和生物分布，并且尤其是显示了AAV载体穿过BBB并转导CNS或外周神经系统(PNS)中的一个或多个组织的增高的能力。在一些实施方案中，本文公开的AAV多倍体病毒粒子显示了改变的生物分布以及AAV载体转导脑血管(BBV)和/或血液成分(例如血液中的细胞)的增高的能力，以允许将经AAV转导的细胞通过脑循环递送到大脑(或CNS或PNS)。在一些实施方案中，所述合理多倍体载体包含VP3病毒结构蛋白，该蛋白来自选自于由AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rh10、rh74、rh39和rh43所组成的组中的任何血清型。在一些实施方案中，合理多倍体载体包含来自任何非人灵长类AAV血清型、例如恒河猴AAV血清型的VP3病毒结构蛋白。
在一些实施方案中，合理多倍体载体包含来自高效穿过BBB的VP1或VP2结构蛋白、或VP1和VP2结构蛋白两者，所述血清型例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rh10、rh74、rh39和rh43。在其他实施方案中，本文公开的合理多倍体载体包含VP1或VP2、或VP1和VP2结构蛋白两者，所述结构蛋白来自不能穿过BBB的血清型。在一些实施方案中，合理多倍体载体包含VP1或VP2、或VP1和VP2结构蛋白两者，所述结构蛋白来自任何非人灵长类动物AAV血清型、例如恒河猴AAV血清型(rhAAV或AAV rh)，只要所述恒河猴血清型中的至少一种是不同的。或者，在一些实施方案中，合理多倍体载体包含并非来自非人灵长类动物AAV血清型的VP1或VP2、或VP1和VP2两者。AAV血清型的非限制性实例在2018年12月19日提交的PCT/US2018/066551(WO2019126356A1)或2014年09月12日提交的PCT/US2014/055490(WO2015038958)或Molecular Therapy:Methods&Clinical Development，第20卷，2021年3月中描述，从其中可以选择本发明的合理多倍体群中的VP3，其各自通过引用以其整体并入本文。AAV恒河猴血清型的非限制性实例为AAVrh10、AAV rh74、AAV rh39、AAV rh43、AAVrh38、AAV rh40、AAV rh2、AAV rh25、AAV rh57、AAV rh50、AAV rh49、AAV rh58、AAV rh61、AAV rh52、AAV rh53、AAV rh51、AAV rh64、AAV rh8、AAV rh1、AAV rh62、AAV rh48、AAVrh54、AAV rh55、AAV rh35、AAV rh37、AAV rh36、AAV rh13、AAV rh32、AAV rh33、AAV rh34(例如，如Gao等，Journal of Virology，June 2004，pg 6381-6388中所述，其通过引用以其整体并入本文)，从其中可以选择本发明的合理多倍体群中的VP3。
在一些实施方案中，相对于AAV8载体，本文公开的合理多倍体载体具有增强的与脑微血管内皮细胞(BMVEC)的结合。在一些实施方案中，相对于AAV8、AAV9、PHP.B或PHP.eB，合理多倍体AAV病毒粒子的群具有增强的与脑微血管内皮细胞(BMVEC)的结合。在一些实施方案中，相对于AAV8，该群具有至少2倍增强的结合、至少3倍增强的结合、至少4倍增强的结合、至少5倍增强的结合、至少6倍增强的结合、至少7倍增强的结合、至少8倍增强的结合、至少9倍增强的结合、至少10倍或更高的增强的结合。在一些实施方案中，与AAV9、PHP.B或PHP.eB相比，合理多倍体AAV病毒粒子的群具有等同的与BMVEC的结合。在一些实施方案中，相对于不能高效穿过血脑屏障的AAV(如AAV 8或AAV 2或AAV 5)，单倍体AAV病毒粒子的群具有脑微血管内皮细胞(BMVEC)的增强的穿透。在一些实施方案中，相对于缺乏高效穿过血脑屏障的能力的非合理多倍体AAV颗粒，本文公开的合理多倍体载体具有对受试者的皮层、纹状体、丘脑、髓质、海马体、小脑和脊髓中的一个或多个的增强的转导。在一些实施方案中，相对于AAV2、AAV8或AAV5中的任一者，本文公开的合理多倍体载体在选自于由髓质、颈部、胸部、腰椎和脉络丛所组成的组中的一个或多个CNS区域中具有增强的转导。
在一些实施方案中，本文公开的合理多倍体载体转导CNS的细胞或组织。CNS的细胞可以但不限于是神经元(例如兴奋性神经元、抑制性神经元、运动神经元、感觉神经元、自主神经元、交感神经元、副交感神经元、浦肯野(Purkinje)神经元、Betz神经元等)、神经胶质细胞(例如小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞)和/或大脑支持细胞例如免疫细胞(如T细胞)。CNS的组织可以但不限于是皮层(例如额叶皮层、顶叶皮层、枕叶皮层、颞叶皮层)、丘脑、下丘脑、纹状体、壳核、尾状核、海马体、内嗅皮层、基底神经节或小脑深部核团。在一些实施方案中，本文公开的合理多倍体载体转导PNS的细胞或组织。PNS的细胞或组织可以但不限于是背根神经节(DRG)。
在一些实施方案中，本文公开的合理多倍体载体具有在CNS中的生物分布，并且在一些实施方案中，所述在CNS中的生物分布与AAV9在CNS中的生物学分布相同(即等同)、或者更多(即增加)。
在一些实施方案中，本文公开的合理多倍体载体具有至少0.05vg/细胞、0.1vg/细胞、至少0.2vg/细胞、至少0.4vg/细胞、至少0.6vg/细胞、至少0.8vg/细胞、至少1vg/细胞、至少5vg/细胞、至少10vg/细胞、至少20vg/细胞、至少25vg/细胞或优选更多。
在一些实施方案中，与亲代AAV VP1或AAV VP2血清型引起的体液应答相比，本文公开的合理多倍体载体引起更少或更低的体液免疫应答——也就是说，例如，如果合理多倍体载体包含来自AAV8血清型的VP1和/或VP2以及来自穿过BBB的血清型的VP3，则与AAV8亲代病毒粒子相比，合理多倍体载体引起的体液免疫应答更少。与亲代AAV VP1或AAV VP2血清型相比，体液应答的降低可以为至少10％、20％、30％、40％或多于40％。在一个实施方案中，与亲代AAV VP3血清型引起的体液应答相比，体液应答降低。在一些实施方案中，与亲代AAV VP3血清型引起的体液应答相比，本文公开的合理多倍体载体引起更少或更低的体液免疫应答——也就是说，例如，如果合理多倍体载体包含来自AAV8血清型的VP1和/或VP2以及来自穿过BBB的血清型(包括AAVrh血清型，如AAVrh10或AAVrh74血清型)的VP3，则与AAVrh10或AAVrh74亲代病毒粒子相比，合理多倍体载体引起的体液应答更少。在一些实施方案中，与亲代AAV VP3血清型相比，体液应答的降低可以为至少10％、20％、30％、40％或多于40％。在实施方案的某些方面，VP3选自非人细小病毒血清型，例如此处和实施例中公开的AAVrh，如AAVrh10或AAVrh74。在一些实施方案中，由于与针对亲代血清型的体液免疫应答相比降低的体液免疫应答，因此允许重复给药，例如，可以多次给予本文公开的合理多倍体载体，例如初次剂量后接一剂或多剂后续剂量(例如加强剂)。
在一些实施方案中，本文公开的合理多倍体载体逃避针对VP1、VP2或VP3病毒结构蛋白的亲代血清型的中和抗体——也就是说，例如，如果合理多倍体载体包含来自AAV8血清型的VP1和/或VP2以及来自穿过BBB的血清型(例如来自AAV9血清型)的VP3，则合理多倍体载体逃避针对亲代AAV8和/或AAV9血清型的中和抗体。在一些实施方案中，来自针对亲代血清型的抗AAV中和抗体的合理多倍体载体的中和的量低于30％、或低于20％、或低于10％、或甚至低于10％。仅为说明目的，在一些实施方案中，如果针对亲代血清型的抗AAV抗体将亲代AAV血清型中和50％，则针对亲代血清型的抗AAV抗体中和或使合理多倍体失活40％、或30％、或20％、或10％或低于10％。
在一些实施方案中，本公开涉及使得能够重复给药的合理多倍体AAV病毒粒子的群，该群包括：AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一个，和AAV VP3病毒结构蛋白；其中VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自任何AAV病毒血清型，且VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAV血清型；并且其中，相比于由VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引起的体液应答，合理多倍体AAV病毒粒子的群引起减弱的体液应答，其中VP1和VP2并不来自恒河猴AAV血清型，并且其中重复给药包括合理多倍体AAV病毒粒子的群的第一施用以及VP1结构病毒蛋白或VP2结构病毒蛋白的亲代AAV血清型的第二施用。
由于合理多倍体病毒粒子具有减弱的体液免疫应答，如本发明中所述的合理多倍体病毒粒子允许亲代AAV血清型重复给药，例如，重复给药包括合理多倍体病毒粒子的第一施用以及亲代AAV血清型的第二施用，将亲代AAV血清型用于为合理多倍体病毒粒子的VP1或VP2提供结构蛋白。仅为说明目的，合理多倍体载体AAV8-8-rh10作为第一剂施用，第二剂可以是AAV8-8-8血清型。在一些实施方案中，合理多倍体病毒粒子允许重复给药，其中重复给药包括合理多倍体病毒粒子的第一施用以及亲代AAV血清型VP3病毒结构蛋白的第二施用，其中VP3来自AAV恒河猴血清型。仅为说明目的，合理多倍体载体AAV8-8-rh10作为第一剂施用，第二剂可以是AAVrh10-rh10-rh10血清型
在一些实施方案中，至少一个病毒衣壳蛋白是经修饰的病毒衣壳蛋白。在一些实施方案中，至少一个病毒衣壳蛋白是嵌合的病毒衣壳蛋白。病毒衣壳蛋白可以通过一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失来修饰。在一些实施方案中，至少一个VP衣壳病毒蛋白是不嵌合的。在一些实施方案中，VP1是嵌合的VP1蛋白。在一些实施方案中，VP1和VP2是嵌合的，并且只有VP3是不嵌合的。例如，仅由来自嵌合AAV2/8(AAV2的N末端和AAV8的C末端)的VP1/VP2组成的病毒粒子与仅来自任何其它非AAV8载体(例如rh10、rh74等)的VP3配对。在另一个实施方案中，只有VP3是嵌合的，而VP1和VP2是不嵌合的。在另一个实施方案中，病毒蛋白中的至少一个来自完全不同的血清型。在另一个实例中，没有嵌合存在。
在一个实施方案中，本文所述的用壳体包裹AAV基因组(包括定位在2个AAV ITR之间的异源基因)的AAV合理多倍体病毒粒子可以仅由两个病毒结构蛋白VP1和VP3形成。在一个实施方案中，这样的AAV合理多倍体病毒粒子在构象上是正确的，即具有T＝1的二十面体对称。在一个实施方案中，本文描述的AAV单倍体病毒粒子是具有感染性的。ITR可以为来自任何血清型(例如AAV8或AAV2)的ITR，或来自被分离用于基因治疗的12种血清型的AAV中的任一者、其他物种、突变血清型、这些基因的改组的(shuffled)血清型(例如AAV1、AAV2、VP1.5、AAV4 VP2、AAV4 VP3、Rh10 VP3、Rh74 VP3、Rh74 VP2或任何其他期望的AAV血清型，如表1所公开的)的ITR。
在一些实施方案中，本文公开的AAV合理多倍体病毒粒子的实质上纯的群为至少101个病毒粒子，至少102个病毒粒子，至少103个病毒粒子，至少104个病毒粒子，至少105个病毒粒子，至少106个病毒粒子，至少107个病毒粒子，至少108个病毒粒子，至少109个病毒粒子，至少1010个病毒粒子，至少1011个病毒粒子，至少1012个病毒粒子，至少1015个病毒粒子，至少1017个病毒粒子。在一个实施方案中，该群至少为100个病毒粒子。在一个实施方案中，本文公开的AAV合理多倍体病毒粒子的群为109到1012个病毒粒子。
在一个实施方案中，该群为至少1×104个病毒基因组(vg)/mL，至少1×105个病毒基因组(vg)/mL，至少1×106个病毒基因组(vg)/mL，至少1×107个病毒基因组(vg)/mL，至少1×108个病毒基因组(vg)/mL，至少1×109个病毒基因组(vg)/mL，至少1×1010vg/mL，至少1×1011vg/mL，至少1×1012vg/mL。在一个实施方案中，该群的范围为约1×105vg/mL至约1×1013vg/mL。
在某些实施方案中，本文公开的多倍体AAV载体用于治疗大脑或脊髓的疾病或疾患、或神经元疾病或神经退行性疾病的方法，用于达到治疗效果的示例性剂量为至少约1.0E12到4.0E12vg/kg、或约1.2E12到3.0E12vg/kg、或约1.2E12到2.5E12vg/kg、或约2.5E12到4.0E12vg/kg的滴度。
实质上同类的群为仅本文所述的期望的AAV合理多倍体的至少90％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％。在一个实施方案中，该群是完全同类的。因此，本文所述技术的某些方面涉及用于生产实质上同类的单倍体或合理多倍体AAV病毒粒子的系统，该系统包括载体，所述载体包含编码如下的核酸：仅来自选自表1的一个AAV血清型的VP1，以及可选的仅来自选自表1的一个AAV血清型的VP2，以及来自高效穿过BBB的任何AAV血清型(例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rh10、rh74、rh39和rh43)的VP3。在一些实施方案中，VP3蛋白来自非人灵长类动物、例如黑猩猩或恒河猴AAV(AAVrh)血清型，如本文公开的AAVrh.10、AAVrh.74、AAVrh.73、AAVrh.75、AAVrh.76、rAAVrh.39、rAAVrh.43。在一些实施方案中，示例性的系统包括：(i)启动子，所述启动子可操作地连接至仅编码来自第一AAV血清型的VP1和VP2、但不表达来自第一AAV血清型的VP3的核酸，其中第一AAV血清型选自表1中列出的任何血清型，以及(ii)启动子，所述启动子可操作地连接至编码来自本文公开的高效穿过BBB的任何血清型(例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rh10、rh74、rh39和rh43)的VP3蛋白的核酸。
本文提供的一个方面提供了适用于穿过血脑屏障的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，合理多倍体AAV病毒粒子包含AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一个以及AAVVP3病毒结构蛋白；其中，VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自任何AAV血清型，并且VP3病毒结构蛋白来自高效穿过血脑屏障且不同于VP1或VP2中的至少一种的血清型的AAV血清型，并且其中，该合理多倍体AAV病毒粒子的群穿过血脑屏障(BBB)和/或转导BBB的内皮细胞，和/或为全身性施用或鞘内施用时穿过BBB的血液成分。
在本文任意方面的一个实施方案中，相对于缺乏穿过血脑屏障的能力的非合理多倍体AAV颗粒，该群表现出增强的穿过血脑屏障的转导活性。
在本文任意方面的一个实施方案中，VP3病毒结构蛋白是AAV恒河猴血清型。
在本文任意方面的一个实施方案中，VP3病毒结构蛋白来自高效穿过血脑屏障的血清型，所述血清型选自于由AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAVrh.39和AAVrh43所组成的组。
在本文任意方面的一个实施方案中，相对于缺乏高效穿过血脑屏障的能力的非合理多倍体AAV颗粒，该群具有对受试者的皮层、纹状体、丘脑、髓质、海马体、小脑和脊髓的增强的转导。
在本文任意方面的一个实施方案中，相对于AAV2，所述合理多倍体AAV在一个或多个CNS区域具有增强的转导，CNS区域选自于由髓质、颈部、胸部、腰椎和脉络丛所组成的组。
在本文任意方面的一个实施方案中，相对于AAV8，所述合理多倍体AAV具有对脑微血管内皮细胞(BMVEC)的增强的结合。
在本文任意方面的一个实施方案中，该群具有在CNS中的生物分布。
在本文任意方面的一个实施方案中，CNS生物分布为至少0.05vg/细胞、0.1vg/细胞、至少0.2vg/细胞、至少0.4vg/细胞、至少0.6vg/细胞、至少0.8vg/细胞、至少1vg/细胞、至少5vg/细胞、至少10vg/细胞、至少20vg/细胞、至少25vg/细胞，或优选更多。
在本文任意方面的一个实施方案中，VP1或VP2选自穿过血脑屏障的AAV血清型。
在本文任意方面的一个实施方案中，VP1或VP2选自不能穿过血脑屏障的AAV血清型。
在本文任意方面的一个实施方案中，VP1或VP2不选自AAV恒河猴血清型。
在本文任意方面的一个实施方案中，VP1或VP2选自AAV恒河猴血清型。
在本文任意方面的一个实施方案中，与由亲代AAV VP1或AAV VP2血清型引起的体液应答相比，该群引起更少的体液免疫应答。
在本文任意方面的一个实施方案中，该群逃避了针对AAV VP1、VP2或VP3病毒结构蛋白的亲代血清型的中和抗体。
本文提供的一个方面提供了用于递送穿过血脑屏障的转基因的方法，包括施用本文所述的任意合理多倍体AAV病毒粒子的群。
本文提供的一个方面提供了重复给药的方法，包括第一和第二施用，其中，重复给药包括本文所述的任何合理多倍体AAV病毒粒子的第一施用，以及VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型的第二施用，其中与由VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引起的体液应答相比，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群引发减弱的体液应答，并且其中，VP1或VP2并不是来自恒河猴AAV血清型。
本文提供的一个方面提供了使得能够重复给药的合理多倍体AAV病毒粒子的群，该群包括：
AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一个，和AAV VP3病毒结构蛋白；其中，VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自任何AAV病毒血清型，且VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAV血清型；其中，与由VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引起的体液应答相比，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群引起减弱的体液应答，其中，所述VP1和VP2不来自恒河猴AAV血清型，并且其中，重复给药包括合理多倍体AAV病毒粒子的群的第一施用，以及VP1结构病毒蛋白或VP2结构病毒蛋白的亲代AAV血清型的第二施用。
本文提供的一个方面提供了合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，该群包括(a)选自AAV8病毒血清型的AAV病毒结构蛋白VP1和VP2，以及(b)选自AAV恒河猴血清型、AAVrh10或AAVrh74的VP3。
其中，比起由亲代AAV8血清型引起的体液应答，所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群引起减弱的体液应答。
本文提供的一个方面提供了重复给药的方法，包括第一和第二施用，其中，第一施用为本文所述的任意合理多倍体AAV病毒粒子的群，且第二施用为VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型，其中，相对于由VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引起的体液应答，第一施用引起减弱的体液应答，并且其中，VP1或VP2不来自恒河猴AAV血清型。
在本文任意方面的一个实施方案中，该群逃避了针对AAV VP1、VP2或VP3病毒结构蛋白的亲代血清型的中和抗体。
本文提供的一个方面提供了用于递送转基因穿过血脑屏障的方法，包括施用本文所述的任意合理多倍体AAV病毒粒子的群。
在本文任意方面的一个实施方案中，VP3蛋白是来自AAVrh10或AAVrh74血清型的突变的VP3蛋白。
在本文任意方面的一个实施方案中，突变的AAVrh74 VP3蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的蛋白，或者其中突变的AAVrh74VP3包括SEQ ID NO:2的至少一个以下的修饰：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H、N736P。
在本文任意方面的一个实施方案中，突变的AAVrh10 VP3蛋白由SEQ ID NO:5的核酸编码，与SEQ ID NO:5的AAVrh10_VP3核酸相比，包含Q214N、S462N和D517E突变中的至少一个或多个，或者包含与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性的核酸序列，其包含选自Q214N、S462N和D517E的至少一个突变。
在本文任意方面的一个实施方案中，VP3蛋白是AAVrh74 VP3蛋白，该蛋白包含SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的蛋白，或者包含SEQ ID NO:2的以下的氨基酸修饰中的至少一个：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H、N736P。
本文提供的一个方面提供了本文所述的任意病毒粒子的实质上同类的群，其中该群至少为101个病毒粒子。
本文提供的一个方面提供了一种核酸，该核酸以5'至3'的方向包含：(a)第一核酸，所述第一核酸编码AAVrh10 VP3衣壳蛋白，可操作地连接至第一启动子；(b)第一poly A序列；(c)第二核酸，所述第二核酸编码rep蛋白；(d)第三核酸，所述第三核酸编码AAV8 VP1和VP2病毒结构蛋白，并且其中第三核酸序列不能表达AAV8 VP3病毒结构蛋白；以及(e)第二poly A序列。
本文提供的一个方面提供了一种核酸，该核酸以5'至3'方向包含：(a)第一核酸，所述第一核酸编码AAVrh74 VP3衣壳蛋白，可操作地连接至第一启动子；(b)第一poly A序列；(c)第二核酸，所述第二核酸编码rep蛋白；(d)第三核酸，所述第三核酸编码AAV8 VP1和VP2病毒结构蛋白，并且其中第三核酸序列不能表达AAV8 VP3病毒结构蛋白；以及(e)第二poly A序列。
本文提供的一个方面提供了一种病毒载体，该载体包含：(a)本文所述的任意的AAV病毒粒子；以及(b)包含至少一个末端重复序列和异源基因的核酸，其中该核酸由AAV衣壳包封。
在本文任意方面的一个实施方案中，该群包括嵌合的或经修饰的病毒结构蛋白，其中经修饰的病毒结构蛋白包括一个或多个氨基酸的插入、缺失或替换。
在本文任意方面的一个实施方案中，与包含亲代AAV血清型的病毒粒子的实质上同类群相比，所述实质上同类的群在体内于血清中产生显著更少的针对VP1或VP2结构蛋白的亲代AAV血清型的抗AAV IgG抗体。
在本文任意方面的一个实施方案中，亲代AAV血清型为AAV8。
本文提供的一个方面提供了使得能够重复给药的合理多倍体AAV病毒粒子的群，该群包括：AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种，以及AAV VP3病毒结构蛋白；其中，VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自任何AAV病毒血清型，且VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAV血清型；其中，合理多倍体AAV病毒粒子的群逃避了针对VP3病毒结构蛋白的亲代AAV恒河猴血清型的中和抗体，其中，VP1和VP2不来自恒河猴AAV血清型，其中，重复给药包括VP3结构蛋白的亲代AAV恒河猴血清型的群的第一施用以及合理多倍体AAV病毒粒子的群的第二施用；并且其中，合理多倍体病毒粒子的VP3结构蛋白是AAV恒河猴突变的病毒结构蛋白VP3。
在本文任意方面的一个实施方案中，AAV恒河猴突变的病毒结构蛋白VP3来自突变的AAV rh10 VP3病毒结构蛋白或来自突变的AAV rh74 VP3病毒结构蛋白。
在本文任意方面的一个实施方案中，突变的病毒结构蛋白VP3包括在对应于如下的氨基酸处的突变：选自于由N263、G264、T265、S26T、G268、T270、T274、E533所组成的组中的氨基酸，其中所有氨基酸位置对应于AAV rh10或AAVrh74的天然VP1序列编号。
在本文任意方面的一个实施方案中，突变选自于由N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K所组成的组。
在本文任意方面的一个实施方案中，突变的病毒结构蛋白VP3进一步包括在对应于选自于由R727和N737所组成的组中的氨基酸的氨基酸处的突变，其中所有氨基酸位置对应于AAVrh10的天然VP1序列编号。
在本文任意方面的一个实施方案中，突变选自于由R727H和N737P所组成的组。
在本文任意方面的一个实施方案中，突变的病毒结构蛋白VP3进一步包括在对应于选自于由R726和N736所组成的组中的氨基酸的氨基酸处的突变，其中所有氨基酸位置对应于AAVrh74的天然VP1序列编号。
在本文任意方面的一个实施方案中，突变选自于由R726H和N736P所组成的组。
在本文任意方面的一个实施方案中，突变的病毒结构蛋白VP3进一步包括对应于581处的W的氨基酸的突变，其中W被两个随后的V残基(VV)替换，并且其中所有氨基酸位置对应于AAV rh74的天然VP1序列编号。
在本文任意方面的一个实施方案中，AAV VP1或VP2病毒结构蛋白为选自表1的任意AAV血清型。
在本文任意方面的一个实施方案中，AAV VP1或VP2结构蛋白为AAV8。
在额外的实施方案中，本发明提供了AAV合理多倍体病毒载体，包括：(a)本文公开的合理多倍体AAV载体；以及(b)包含至少一个末端重复序列的核酸，其中所述核酸被AAV合理多倍体病毒包裹。AAV合理多倍体病毒载体可以是AAV单倍体颗粒，并且本文公开的AAV合理多倍体病毒载体蛋白、衣壳、病毒载体和/或AAV单倍体颗粒可以存在于进一步包含药学上可接受的载体的组合物中。
在进一步的实施方案中，本发明提供了向细胞施用核酸的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的AAV单倍体病毒载体和/或本发明的组合物接触。
本文还提供了将核酸递送至受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的AAV单倍体病毒载体和/或组合物。
此外，本文提供的是用作有益地治疗疾病或疾患的药物的本发明的AAV8单倍体衣壳蛋白、衣壳、病毒载体、AAV颗粒和/或组合物。
在进一步的实施方案中，本发明提供了使得能够重复给药(即，初始剂量，以及1个、或2个、或3个、或4个、或5个或多于5个的后续剂量或加强剂)的合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述群包括：AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一个，以及AAV VP3病毒结构蛋白；其中，VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自任何AAV病毒血清型，且VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAV血清型(rhAAV)；并且其中，合理多倍体AAV病毒粒子的群逃避了针对VP3病毒结构蛋白的亲代AAV恒河猴血清型的中和抗体，其中VP1和VP2不来自恒河猴AAV血清型，且重复给药包括VP3结构蛋白的亲代AAV恒河猴血清型的群的第一施用以及合理多倍体AAV病毒粒子的群的第二施用，并且其中合理多倍体病毒粒子的VP3结构蛋白是AAV恒河猴突变的病毒结构蛋白。在一些实施方案中，VP3结构蛋白是来自rhAAV的经修饰的VP3蛋白，例如来自rh10或rh74的经修饰的VP3蛋白。在一些实施方案中，经修饰的VP3蛋白是本文公开的rh10-LP2VP3蛋白。在一些实施方案中，经修饰的VP3蛋白是本文公开的rh74-LP2 VP3蛋白。
在一些实施方案中，使得能够重复给药的合理多倍体病毒粒子的群的重复给药包括合理多倍体AAV病毒粒子的第一施用以及恒河猴血清型的亲代AAV VP3病毒结构蛋白的第二施用，并且其中，合理多倍体病毒粒子的VP3结构蛋白是AAV恒河猴突变的结构蛋白VP3，其中所述群包括AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一个以及AAV VP3病毒结构蛋白；其中，VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自任何AAV病毒血清型，并且VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAV血清型；其中，合理多倍体AAV病毒粒子的群逃避了针对VP3病毒结构蛋白的亲代AAV恒河猴血清型的中和抗体，并且其中，VP1和VP2中的至少一个不来自恒河猴AAV血清型。在一些实施方案中，VP1和VP2结构蛋白均不来自恒河猴AAV血清型。
包含恒河猴的经修饰的VP3蛋白(例如包含本文公开的以下的任一种或多种修饰的rh10-VP3蛋白：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R727H、N737P，或者包含如下的任一种或多种的rh74-VP3蛋白：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H、N736P)的合理多倍体可以逃避针对亲代AAV恒河猴血清型的中和抗体。在一些实施方案中，该群可以逃避针对亲代AAV VP1血清型或AAV VP2血清型的中和抗体，其中VP1或VP2不来自恒河猴血清型。
本发明的这些和其他方面将在下面阐述的本发明的描述中详细地论述。
附图说明
本申请文件包含至少一张彩色绘制的图表。根据请求并支付必要费用，专利局将会提供具有彩色图表的本专利申请公开的副本。附图阐释了本发明的方面。
下述的详细说明通过实例给出，但并非旨在将本发明限制于所描述的具体实施方式，可结合附图进行理解，并通过引用并入本文。现在将通过非限制性实例并参考附图来描述本发明的各种优选特征和实施方式，其中：
图1A-图1B示出了用于生成如本文所公开的AAV8单倍体的一体式构建体的示意图。图1A示出了用于生成AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74载体的构建体的示意图，所述构建体包含(i)启动子，所述启动子可操作地连接至编码来自AAVrh10血清型或AAVrh74血清型的VP3蛋白的核酸，后随着poly A序列，(ii)核酸序列，所述核酸序列编码Rep 2基因(例如，包含启动子p5、p15和p40)，以及(iii)核酸，所述核酸编码来自AAV8血清型的VP1和VP2，其中用于VP3衣壳蛋白表达的起始密码子失活。该构建体可用于在体外生成单倍体AAV8病毒。图1B示出了用于生成AAV8-8-rh74单倍体载体的示例性质粒图。
图2示出了AAV8-8-rh10(左侧)和AAV8-8-rh74(右侧)单倍体病毒的结构模型(来自一个群的四个随机衣壳，因为VP亚基可以以不同方式组合)，其中红色是由于AAV8 VP1或VP2衣壳蛋白引起的病毒粒子的表面，绿色示出来自AAVrh10血清型的VP3衣壳蛋白的代表，以及蓝色示出来自AAVrh74血清型的VP3衣壳蛋白的表面的代表。
图3示出了来自AAVrh10血清型(左侧)或AAVrh74血清型(右侧)的VP3衣壳蛋白的蛋白质三级结构的模拟和模型。
图4为亲代血清型、AAV88rh.10和AAV88rh.74单倍体、用AAVrh.74中的对应残基替换AAVrh.10残基的突变体以及使用这些突变体而不是亲代AAVrh.10VP3的结果的单倍体的界面分析。Y轴示出VP3亚基与所有直接接触的相邻亚基之间的经计算的相互作用能。在计算相互作用能之前，各复合体都被最小化，并且每个复合物重复该过程30次。相互作用能的平均值通过Wilcoxon配对检验进行比较。箱线图顶部的不同的标记字母代表组之间的统计学显著差异。
图5示出了用于生成包含来自AAV8血清型的VP1和VP2的AAV8单倍体的构建体的示意图，示出了将两个ATG起始密码子修饰为GTG而产生两个氨基酸替换M203V和M211V，以防止VP3 AAV8衣壳蛋白的翻译。图5按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:40。
图6示出了与AAV8或AAV8-8-VP3KO相比，来自AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的VP1、VP2和VP3蛋白的蛋白质印迹的结果。上子图是图1中示出的用于生产AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的构建体的示意图，并且下子图示出了如下的蛋白质印迹分析：用AAV8载体或AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体感染的Pro10细胞，以及用于检测来自AAV8血清型的VP1和VP2、以及来自AAVrh74(泳道1)或AAVrh10(泳道2)或AAV8(泳道4)的VP3的抗CAP抗体。泳道3示出了VP3衣壳蛋白表达的不存在，表明VP3未从包含核酸的构建体中表达，其中两个ATG起始密码子变为GTG以产生氨基酸替换M203V和M211V，其阻止VP3 AAV8衣壳蛋白的翻译和表达。
图7示出了与AAV8载体(AAV8-8-8[WT])或AAV8-VP3KO(AAV8-8-VP3KO)相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的基因组保护测定的结果。
图8是通过qPCR和ELISA确定的AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的比生产率的表格，显示出AAV8-8-rh10生产率与AAV8和AAVrh10对照相当。与AAV8-8-rh10和对照相比，AAV8-8-rh74的生产率水平较低。平均值的比较无统计学意义。
图9A-图9B示出了AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的AEX层析和亲和层析结果。图9A示出了亲和层析结果，显示出AAV8-8-rh74单倍体的较低的SEC 260/280值(见箭头)，表明生产过程中的较低的包装效率。图9B示出了AEX层析，其中在亲和层析后，进行碘克沙醇密度梯度超速离心(DGUC)工艺步骤以从完整衣壳中分离空衣壳，并将碘克沙醇池稀释并上样到AEX柱上。SEC 260/280值接近1.3(～75％或更高)表明成功富集完整衣壳，AAV8-8-rh74的值(箭头)为1.1表示较低的富集。
图10A-图10D示出了与AAV8和AAVrh10对照相比，通过qPCR和ELISA确定的来自AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的产品回收结果。图10A示出了来自AAV8对照的产品回收，并且图10B示出了来自AAVrh10对照的产品回收。基于qPCR测定，AAV8和AAVrh10的当前工艺产品回收率为8％-12％，并且AAV8和AAVrh10对照的回收率彼此相当。图10C示出了包含荧光素酶基因的AAV8-8-rh10载体的产品回收率，其显示出总体回收率与AAV8和AAVrh10对照相当(分别为图10A和图10B)。图10D示出了包含荧光素酶基因的AAV8-8-rh74载体的产品回收率，显示出总体回收率低于5％，具有较低的初始生产率，产生较低的回收率，然而，DSP单元操作报告了从亲和层析开始的较低的回收率(～5％-12％)。
图11A-图11C示出了与AAV8和AAVrh10对照相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的电泳图分析。图11A示出了与AAV8和AAVrh10对照相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的VP1、VP2和VP3的比例。图11B示出了AAV8对照(3个单独制剂的叠加)的电泳图分析。图11C示出了AAV8-8-rh10(底部)和AAV8-8-rh74(顶部)单倍体的电泳图分析。
图12A-图12B示出了AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的代表性电泳图分析。图12A示出了AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的两个代表性电泳图，显示出AAV8参考物和AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74病毒粒子中的每一个。图12B示出了AAV5和AAV9血清型的代表性电泳图，显示出不同血清型表现出三种衣壳蛋白的不同相对比例。
图13A-图13B示出了与AAV8和AAVrh10对照相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体在Pro10细胞中的转导效率的结果。图13A是确定每个AAV8单倍体载体的转导效率的方案的示意图，其中将用于生成载体的质粒用来转导Pro10生产细胞系。图13B示出了与AAV8和AAVrh10对照相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的两个实验(左图和中图)和组合元分析(右图)在100K MOI下的转导效率的结果，显示出在单倍体载体转导Pro10细胞的能力方面存在一些差异：AAV8-8-Rh74单倍体与AAV8对照类似地转导Pro10细胞。通过ANOVA+Tukey检验进行统计分析。
图14A-图14B示出了与AAV8和AAVrh10对照相比，通过AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体逃避AAV8中和抗体。图14A示出了来自两次实验(左侧图和中间图)和组合元分析(右侧图)的结果，表明与AAV8和AAVrh10对照相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体可以有效逃避中和抗体AAV8 1/100，并因此与对照相比表现出更低的荧光素酶抑制％。图14B示出了两次实验(左侧图和中间图)和联合元分析(右侧图)的结果，如与对照相比表现出更低的荧光素酶抑制％所表明的，与AAV8和AAVrh10对照相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体逃避中和抗体AAV8 1/200的效率更高。
图15(实验1、实验2和组合元分析)示出在存在AAV8中和抗体(来自接种有AAV8的小鼠的血清)的情况下，AAV8介导的荧光素酶表达以剂量依赖性的方式受到影响，而在存在或不存在(黑条棒)AAV8中和抗体的情况下，AAV8-8-rh74介导的荧光素酶表达不受影响。通过ANOVA+Tukey检验进行统计分析。
图16(实验1、实验2和组合元分析)示出，在存在包含AAV8中和抗体的来自接种了AAV8的小鼠的血清的情况下，AAV8-8-rh10介导的荧光素酶表达受到的影响几乎与AAV8对照相似(如图15所示)。如图16的下子图所表明的，AAV8中和抗体(AAV8血清)显示出对AAVrh10的交叉反应性。通过ANOVA+Tukey检验进行统计分析。
图17A-图17B示出了与AAV8和AAVrh10对照相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体在人成纤维细胞系GM16095细胞中的转导效率的结果。图17A是确定每个AAV8单倍体载体的转导效率的方案的示意图，其中将用来生成载体的质粒用于转导神经元细胞系GM16095。图17B示出与AAV8和AAVrh10对照相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体在100K MOI下的转导效率的结果，其表明单倍体载体转导GM16095细胞的能力存在一些差异：AAV8-8-Rh74单倍体转导的GM16095细胞显著比AAV8或AAVrh10对照更高效，而在该GM16095细胞系中AAVrh10比AAV8更高效。通过ANOVA+Tukey检验进行统计分析。
图18A-图18B示出与AAV8和AAVrh10对照相比，通过AAV8-8-rh74单倍体逃避GM16095细胞中的AAV8中和抗体(Nab)。图18A示出，接种有AAV8的小鼠血清中的NAb以剂量依赖性的方式抑制了AAV8对GM16095细胞的转导。AAV8-8-Rh74单倍体载体有效逃避了抗AAV8 NAb，并且在存在和不存在NAb的情况下，未发现荧光素酶转基因表达的差异。与AAV8对照相比，NAb以类似的程度抑制AAV8-8-Rh10单倍体的转导。检测到抗AAV8 NAb对AAVRh10的交叉反应性。图18B示出，以1/100或1/200接种有AAV8的小鼠的血清中的NAb抑制了AAV8和AAV8-8-rh10对GM16095细胞的转导，但在1/100或1/200的浓度下都不会抑制AAV8-8-rh74对GM16095细胞的转导，表明AAV8-8-Rh74单倍体载体能够逃避抗AAV8 NAb，而用AAV8-8-Rh10单倍体的转导被NAb以与AAV8对照相似的程度抑制。检测到抗AAV8NAb对AAVRh10的交叉反应性。
图19A-图19B示出了与AAV8和AAVrh10对照相比，通过AAV8单倍体载体体外转导Pro10细胞的效率和通过AAV8-8-rh74单倍体在Pro10细胞中逃避中和抗体(Nab)。图19A示出，与AAV8或AAVrh10相比，在100K MOI(左侧)并在1/100(中间)和1/200浓度的AAV8血清存在下，AAV8-8-rh74对Pro10细胞的转导效率更高。图19B示出，接种有AAV8的小鼠血清中的NAb以剂量依赖性方式抑制了AAV8对Pro10细胞的转导。AAV8-8-Rh74单倍体载体能够逃避抗AAV8 NAb，并且在存在和不存在NAb的情况下，在AAV8-8-rh74介导的荧光素酶转基因表达中没有发现差异。以与AAV8对照相比类似的程度，AAV8-8-Rh10单倍体的转导受到NAb的抑制。检测到抗AAV8 NAb针对AAVRh10的交叉反应性。
图20是示出在小鼠体内，与AAV8和AAVrh10对照相比，分析AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的转导的生物分布的方案的示意图。实验用四组小鼠进行，每组小鼠中有5只；每组中4只小鼠注射实验载体(实验小鼠)，而1只不处理(对照小鼠)。对小鼠静脉注射5×1010vg/小鼠的对照AAV8(对照小鼠)或AAVrh10或单倍体AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74(实验小鼠)。
图21A-图21D示出了通过荧光素酶表达确定的来自AAV8单倍体的转导在体内的生物分布。图21A示出了与AAV8(组1)和AAVrh10(组4)对照相比，在注射AAV8-8-rh10(组2)或AAV8-8-rh74(组3)单倍体后7天(dpi)暴露30秒后，荧光素酶表达的腹侧生物分布，示出了AAV8-8-Rh74载体的不同生物分布，表明全身性生物分布以及AAV8-8-Rh74在脑和脊髓中并穿过血脑屏障的显著分布。图21B示出了与AAV8(组1)和AAVrh10(组4)对照相比，在注射AAV8-8-rh10(组2)或AAV8-8-rh74(组3)单倍体后7天(7dpi)暴露1分钟后，荧光素酶表达的腹侧生物分布，示出了AAV8-8-Rh74显著更高的分布，并证实了21A中所示的结果。图21C示出了与AAV8(组1)和AAVrh10(组4)对照相比，在注射AAV8-8-rh10(组2)或AAV8-8-rh74(组3)单倍体后7天(7dpi)自动暴露后荧光素酶表达的腹侧生物分布，示出了所有四组中的基础生物发光水平，并因此进一步证实了与其他组相比AAV8-8-rh74的显著增强的生物分布。图21D是在7天后荧光素酶表达的背视图与腹视图的总通量(p/s)的图示。通过ANOVA+Tukey检验进行统计(n＝4只小鼠/组)。在注射后14天和21天获得类似的结果，其中与其它组相比，在体内AAV 8-8-rh74持续显示出增强的全身性生物分布，例如在CNS和其他组织中。通过ANOVA+Tukey检验进行统计(n＝4只小鼠/组)。在注射后14天和21天获得类似的结果，其中与其它组相比，AAV 8-8-rh74持续显示出增强的全身性生物分布，例如在CNS和其他组织中。
图22示出了来自AAVrh10(顶部序列)的VP3衣壳蛋白相比于来自AAVrh74(底部序列)的VP3衣壳蛋白的氨基酸序列比对，显示出这些序列仅在4个区域不同。
图23A-图23C示出了AAVrh.10(绿色)相比于AAVrh.74(青色)。来自两种血清型的VP3结构域仅在5个位置不同：Q417N(红色)、VV581W(蓝色)、S665N(品红色)和D720E(橙色)[使用来自VP1衣壳蛋白的氨基酸序列的命名/编号]。图23A示出了来自AAVrh.10与AAVrh.74的VP3衣壳蛋白的叠加的三级结构，其中感兴趣的残基如所述着色，而图23B示出了AAVrh10的表面，且图23C示出了AAVrh74衣壳，采用之前描述的颜色约定。图23B和图23C清楚地示出，除417之外，所有位置都可接近于溶剂(和NAbs)。AAVrh.10中的Q417和AAVrh.74中的N417均被遮盖(表面上没有红色斑块)，因此它们可能不负责在通过NAbs进行的识别方面的任何差异。位置581和/或665和/或者720可能负责由AcNs对AAVrh.10与AAVrh74的不同识别，这种差异可扩展至包含它们的单倍体。
图24来自AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体之间的蛋白酶切割谱。对49种蛋白酶中的19种裂解变量(cleavages variate)的数进行了分析。由此可以突出以下组：(i)组织蛋白酶K(预测集合中唯一的溶酶体酶)。AAVrh.74具有额外的切割位点，(ii)基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3和基质金属蛋白酶-9。AAVrh.74失去了-1和-3的位点，并获得了MMP-2和-9的一个位点。与组织蛋白酶K一样，衣壳可能在其正常的生物分布和感染过程中与这些酶接触。(iii)颗粒酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和半胱天冬酶：这些酶可能与对病毒的免疫应答有关。(iv)胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶是消化酶。
图25A-图25D示出与AAV8和AAVrh10对照相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的体液免疫应答。图25A示出抗AAV8 IgG水平(1/1000血清稀释度)，并且图25B示出了抗AAV8 IgG水平(1/5000血清稀释度)，示出与注射AAV8的小鼠相比，接种两种单倍体载体的小鼠血清中检测到显著降低的抗AAV8 IgG水平。在所测试的血清稀释度下，用AAVrh10接种的小鼠的血清未发现针对AAV8的交叉反应性。图25C示出了抗AAVrh10 IgG水平(1/1000血清稀释度)，而图25D示出了抗AAVrh10 IgG水平(1/5000血清稀释度)，并且示出AAVrh10的免疫原性显著低于AAV8，且在所测试的血清稀释度下，在接种AAVrh10的小鼠和剩余的实验组之间的抗AAVrh10 IgG水平方面没有观察到显著差异。通过ANOVA+Tukey检验进行统计(每组n＝4只小鼠)。
图26A-图26B示出对AAV8、AAVrh10、单倍体AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74的体液免疫应答；以及在Nabs的存在下(例如在来自接种AAV8(组1)、AAV8-8-rh10(组2)、AAV8-8-rh74(组3)、AAVrh10(组4)的小鼠和无处理对照(组5)的血清的存在下)，AAV8介导的GM16095细胞转导。图26A示出AAV8血清以剂量依赖性方式中和AAV8介导的GM16095细胞的转导，而在来自接种AAV8-8-rh10(组2)或AAV8-8-rh74(组3)单倍体或AAVrh10(组4)的小鼠或未处理的对照(组5)的血清(1/100、或1/200、或1/400的稀释度)的存在下，AAV8介导的转导未被中和。图26B示出由1/100稀释度(左侧)或1/200稀释度(右侧)的AAV8血清中和的图，其显示出仅AAV8的荧光素酶表达被抑制，而AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体或AAVrh10的表达不受抑制，显示出这些浓度的AAV8血清不中和由AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体进行的转染或转导效率。
图27A-图27B示出了对AAV8、AAVrh10、单倍体AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74的体液免疫应答；在Nabs(例如来自接种AAV8(组1)、AAV8-8-rh10(组2)、AAV8-8-rh74(组3)、AAVrh10(组4)的小鼠和无处理对照(组5)的血清)的存在下，AAVrh10介导的GM16095细胞转导。图27A示出用来自接种AAVrh10的小鼠(组4)的血清在所测试的任何稀释度(1/100、1/200和1/400)下均未检测到用AAVrh10转导的GM16095细胞的中和。图27B示出了由1/100稀释度(左侧)或1/200稀释度(右侧)的AAVrh10血清中和的图，显示出对AAV8、AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74的荧光素酶表达的抑制，表明它们对AAVrh10血清的交叉反应性，显示出由1/100稀释度(左侧)或1/200稀释度(右侧)的AAVrh10血清中和的图，显示出对AAV8、AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74的荧光素酶表达的抑制，表明它们对AAVrh10血清的交叉反应性。
图28示出了用于产生AAV8-8-rh74单倍体(顶部构建体)或AAV8-8-rh10单倍体(底部构建体)的构建体的示意图。还示出了来自AAVrh10的VP3衣壳蛋白(顶部序列)相比于来自AAVrh74的VP3衣壳蛋白(底部序列)的氨基酸序列比对，显示出这些序列仅在4个区域中不同；当使用来自AAVrh10的VP3衣壳蛋白的氨基酸序列的命名/编号时，Q214N、VV378W、S462N、D517E(也在图22中示出)。根据AAVrh10的VP1衣壳蛋白，对应的氨基酸位点为Q417N、V581(del)V582W、S665N和D720E。
图29A-图29C示出了包含氨基酸修饰的AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的产率。图29A示出与AAV8-8-rh74(未修饰的)的产率相比，AAV8-8-rh74(W581VV)(也称为AAV8-8-rh74vv)的产率增加了多于4倍并且该产率与AAV8-8-rh10的产率相似。在图29A中，AAVrh74vv被表示为AAV8-8rh74 581-W582V(在整个申请中可互换地用作W581VV)。rh74VP3蛋白的N417Q和N664S以及E719D的修饰没有提高产率(参见AAV8-8-rh74(N417Q)、AAV8-8-rh74(N664S)、AAV8-8-rh74E719D)。结果显示为来自3个独立的转导实验。图29B示出，与未修饰的AAV8-8-rh10相比，AAV8-8-rh10(V581del)和AAV8-8-rh10(V582W)显著降低了产率，而与未修饰的AAV8-8-rh10相比，AAV8-8-rh10(S665N)和AAV8-8-rh10(D720E)没有显著影响产率。图29A和图29B一起通过正向和反向突变证实了来自Rh10的VP3衣壳蛋白的氨基酸位置581和582对于病毒产生是重要的。图29C在DNase和蛋白酶K处理后使用ITR-qPCR分析进一步证实Q417N、S665N和D720E不会强烈影响病毒产生，而与未修饰的AAV8-8-rh10相比，V581del和V582W减少了病毒产生。在DNase和蛋白酶K处理后使用ITR-qPCR分析进一步证实Q417N、S665N和D720E不会强烈影响病毒产生，而与未修饰的AAV8-8-rh10相比，V581del和V582W降低了病毒产生。
图30A-图30C示出了来自静脉内施用AAV8-8-rh74载体的小鼠的大脑和脊髓组织中的荧光素酶转基因的基因表达，证明它穿过血脑屏障(BBB)。图30A示出了评估单倍体AAV8-8-Rh74或AAV8-8-Rh10载体在大脑、脊髓和小肠中的生物分布的方案，显示出在静脉内施用2.5×1012vg/kg的AAV载体28天后，收集组织并通过RT-PCR评估荧光素酶转录物。图30B示出静脉内施用2.5×1012vg/kg的AAVRh10、AAV8、AAV8-8-Rh74或AAV8-8-Rh10(n＝4)28天后，小鼠脑组织中的荧光素酶的RT-PCR结果。图30C示出了在静脉内施用2.5×1012vg/kg的AAVRh10、AAV8、AAV8-8-Rh74或AAV8-8-Rh10(n＝4)28天后，小鼠脊髓组织中的荧光素酶的RT-PCR结果。
图31示出了在静脉内施用AAVRh10、AAV8、AAV8-8-Rh74或AAV8-8-Rh10(n＝4)28天后，测定小鼠小肠中的荧光素酶转基因的基因表达的RT-PCR结果，表明与AAVRh10、AAV8和AAV8-8-Rh10相比，AAV8-8-rh74载体具有显著的向性并有效地转导小肠。
图32示出了表9、表10、表11和表12。
具体实施方式
现在将参考附图描述本发明，其中示出了本发明的代表性实施方式。然而，本发明可以以不同的形式体现，并且不应被解释为限于本文所阐述的实施方式。相反，这些实施方式的提供是为了使本公开彻底且完整，并将本发明的范围充分传达给本领域的技术人员。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文中用于描述本发明的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、登录号和其他参考文献全部通过引用以其整体并入本文。
本发明的说明书和所附权利要求中对AAV衣壳病毒结构蛋白中的所有氨基酸位置的指定是相对于VP1衣壳亚基编号(天然AAV8VP1衣壳蛋白：GenBank登录号AF513852.1，蛋白ID:AAN03856.1)。本领域技术人员将理解，如果插入AAV衣壳基因中，本文所述的修饰可能会产生构成衣壳亚基的结构病毒蛋白VP1、VP2和/或VP3的修饰。或者，可以独立地表达衣壳亚基以仅在一个或两个衣壳亚基(VP1、VP2、VP1+VP2)中实现修饰。
特别是，在先前的研究中，发明人已经证明，通过使用来自多种血清型的VPs的多倍体(例如单倍体)AAV载体产生不同的生物分布，在特定组织(例如肝脏)中有更高的转导。
本文中，该技术通常涉及合理多倍体腺相关病毒(AAV)颗粒、病毒粒子和病毒衣壳的同类的群，所述群包含来自穿过血脑屏障(BBB)的任何AAV血清型的VP3结构蛋白，并且其中多倍体AAV病毒粒子穿过BBB和/或转导BBB的细胞或脑血管(BBV)内皮细胞(BBV-EC)和/或全身性施用或鞘内施用时穿过BBB的血液成分。在一些实施方式中，VP3衣壳蛋白来自非人灵长类动物，并且在一些实施方式中，VP3衣壳蛋白是AAV恒河猴血清型。在一些实施方式中，除了VP3蛋白之外，合理多倍体AAV病毒粒子还包含至少一种VP1和/或VP2病毒结构蛋白。在特定实施方式中，合理多倍体AAV病毒粒子包含来自AAV8的VP1衣壳蛋白和至少来自穿过BBB的任何AAV血清型的VP3衣壳蛋白。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体腺相关病毒(AAV)颗粒的同类的群可穿过BBB和/或转导BBB的细胞或脑血管(BBV)内皮细胞(BBV-EC)和/或穿过BBB的血液成分，可以选自以下的任一种：AAV8-8-rh10、AAV8-8-rh74、AAV8-8-rh74vv、AAV8-8-rh10LP2、AAV8-8-rh74LP2、AAV8-8-rh74vvLP2。在一些实施方式中，穿过BBB和/或转导BBB的细胞或BBV-EC或穿过BBB的细胞的这种AAV单倍体病毒粒子可包含AAV8 VP1和VP2结构蛋白(例如，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)或者包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的修饰蛋白、以及VP3蛋白，该VP3蛋白选自以下的任一种：rh10 VP3(SEQ ID NO:1)、rh74 VP3(SEQ ID NO:3)、rh74vv VP3(SEQ ID NO:2)、rh10-LP2 VP3蛋白(SEQ ID NO:14)、rh74-LP2 VP3蛋白(SEQID NO:17)和rh74vv-LP2 VP3蛋白(SEQ ID NO:15)，或具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18中的任何一个至少85％序列同一性的氨基酸序列的VP3蛋白。
本文所述的技术部分地基于如下的发现，使用VP3结构蛋白(此处也称为来自有效地穿过BBB的任何AAV血清型的“衣壳蛋白”)改变了在全身性施用或鞘内施用后的载体的生物分布和转导效率，并且特别是在一些实施方式中，显示出AAV载体穿过BBB以及转导CNS或外周神经系统(PNS)中的一个或多个组织的能力增加。在一些实施方式中，其显示出BBB内皮细胞(BBB EC)和/或BBB的成分的转导增加，或脑血管(BBV)内皮细胞的转导增加，或穿过BBB的血液成分的转导增加。在一些实施方式中，所述合理多倍体载体包含VP3病毒结构蛋白，该蛋白来自选自于由AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rh10、rh74、rh39和rh43所组成的组中的任何血清型。在一些实施方式中，合理多倍体载体包含VP3病毒结构蛋白，该蛋白来自任何非人灵长类AAV血清型，例如恒河猴AAV血清型。
仅出于说明目的，实施例展示了示例性多倍体、例如单倍体载体，该载体在全身性施用或鞘内施用时具有增强的穿过BBB的能力。仅出于示例的目的，这样的单倍体载体包含来自高效地穿过BBB的任何AAV血清型的VP3、以及来自AAV8血清型的VP2和/或VP1。AAV VP1和/或VP2结构蛋白可以是来自选自表1的任何AAV血清型的VP1或VP2。因此，本文描述了示例性单倍体载体，该载体包含衣壳蛋白VP1以及至少衣壳蛋白VP3，其中所述衣壳蛋白VP1来自AAV8血清型，其中所述衣壳蛋白VP3来自穿过BBB和/或非人灵长类动物的任何AAV血清型，而不是AAV8血清型。
优选地，这样的合理多倍体病毒粒子的群是实质上同类的。在一些实施方式中，本发明的合理多倍体病毒粒子可包含VP2衣壳蛋白、或其嵌合VP2蛋白，其中所述VP2衣壳蛋白来自任何血清型，或其中VP2衣壳蛋白来自与VP3来源的血清型相同的任何血清型、或者另外地其中所述VP2衣壳蛋白来自不同于VP3来源的血清型。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体病毒粒子包含来自AAV8血清型的VP1和至少VP3衣壳蛋白，其中VP3不是来自AAV8，而是选自穿过BBB的任何血清型和/或是非人灵长类动物AAV血清型，该病毒粒子被产生。
I.定义
以下术语用于本文的说明书和所附权利要求中：
除非上下文另有明确指示，否则单数形式的“一个/一种”(a、an)和“所述/该”(the)旨在包括复数形式。
此外，本文中使用的术语“约”在指代可测量值(如多核苷酸或多肽序列的长度、剂量、时间、温度等的量)时，意味着涵盖特定量±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
同样如本文所使用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关联列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当解释为替代性(“或”)时指不进行组合。
如本文所使用的，过渡短语“基本上由…组成”是指权利要求的范围将被解释为涵盖权利要求中列举的特定材料或步骤，以及“不会实质性地影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤”。参见In re Herz,537F.2d 549,551-52，190USPQ 461,463(CCPA 1976)(原文中的强调)；另见MPEP§2111.03。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由…组成”并不旨在被解释为等同于“包括/包含”。除非上下文另有指示，否则特别是本文所描述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。
此外，本发明还考虑的是，在本发明的一些实施方式中，可以排除或省略本文中提出的任何特征或特征的组合。
为了进一步说明，例如，如果说明书指出特定氨基酸可以选自A、G、I、L和/或V，则该语言还指示该氨基酸可以选自这些氨基酸的任何子集，例如A、G、I或L，A、G、I或V，A或G；只有L等，就如同在此处被明确地阐述的每个这样的子组合一样。此外，这种语言还指出，一种或多种特定的氨基酸可以被放弃(例如，通过否定但书)。例如，在具体实施方式中，氨基酸不是A、G或I，不是A；不是G或V等，就如同在此处被明确地阐述的每一种此类可能的放弃一样。
如本文所使用的，术语“减少、降低(reduce、reduces、reduction)”和类似术语意味着至少约25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更多的降低。如本文所使用的，术语“增强、增加(enhance、enhances、enhancement)”和类似术语表示至少约25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的增加。相对于缺乏穿过血脑屏障的能力的AAV病毒粒子，本发明的合理多倍体病毒粒子穿过血脑屏障的转导能力得到增强。与缺乏穿过血脑屏障能力的AAV病毒粒子相比，合理多倍体病毒粒子穿过血脑屏障的转导能力增强至少25％、50％、60％、70％、80％、90％或95％、或100％以上、或至少1.2倍、或至少1.5倍、或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或更多。缺乏穿过血脑屏障的能力的AAV血清型的非限制性实例包括AAV2、AAV5、AAV8。在一个实施方式中，相对于不能有效穿过血脑屏障的AAV血清型(AAV8、AAV2或AAV5)，所述群表现出增强的穿过血脑屏障(BBB)的转导活性。在一个实施方式中，相对于AAV8，所述群表现出增强的穿过血脑屏障(BBB)的转导活性。在一个实施方式中，相对于AAV2，所述群表现出增强的穿过血脑屏障(BBB)的转导活性。在另一个实施方式中，相对于AAV5，该群表现出增强的穿过血脑屏障(BBB)的转导活性。在一些实施方式中，相对于AAV8，合理多倍体AAV病毒粒子的群在脑和脊髓中具有增强的生物分布。本文所使用的术语“细小病毒”涵盖细小病毒科(Parvoviridae)，包括自主复制的细小病毒(parvoviruses)和依赖性病毒(dependoviruses)。自主性细小病毒包括细小病毒(Parvovirus)属、红细胞病毒(Erythrovirus)属、浓核病毒(Densovirus)属、Iteravirus和Contravirus属的成员。示例的自主性细小病毒包括但不限于小鼠微小病毒(minute virus of mouse)、牛细小病毒(bovine parvovirus)、犬细小病毒(canine parvovirus)、鸡细小病毒(chickenparvovirus)、猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus)、猫细小病毒(feline parvovirus)、鹅细小病毒(goose parvovirus)、H1细小病毒、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus)、B19病毒，以及现在已知或以后发现的任何其他自主性细小病毒。本领域的技术人员知晓其他自主性细小病毒。参见例如，BERNARD N.FIELDS等，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven出版社)。
如本文所使用的，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于AAV1型、AAV2型、AAV3型(包括3A型和3B型)、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型、AAV10型、AAV11型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、羊AAV，以及现在已知或后来发现的任何其他AAV。参见例如，BERNARD N.FIELDS等，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven出版社)。已经鉴定出许多相对新的AAV血清型和进化枝(参见例如，Gao等，(2004)1Virology78:6381-6388；Moris等，(2004)Virology 33-375-383；以及表3)。
各种血清型AAV和自主性细小病毒的基因组序列，以及天然末端重复序列(TRs)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列在本领域中是已知的。这些序列可见于文献或公共数据库，如GenBank。参见例如，GenBank登录号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC 001540、AF513851、AF513852、AY530579，其公开内容通过引用并入本文，用于教导细小病毒以及AAV核酸和氨基酸序列。另见例如，Srivistava等，(1983)J.Virology 45:555；Chiarini等，(1998)J.Virology 71:6823；Chiarini等，(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal等，(1999)J.Virology 73:939；Xiao等，(1999)J.Virology73:3994；Muramatsu等，(1996)Virology 221:208；Shade等，(1986)J.Virol.58:921；Gao等，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris等，(2004)Virology 33-:375-383；国际专利公开WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；以及美国专利No.6156303；其公开内容通过引用并入本文，用于教导细小病毒以及AAV核酸和氨基酸序列。另见表1。
自主性细小病毒和AAV的衣壳结构在BERNARD N.FIELDS等,VIROLOGY,第2卷,第69&70章(第4版，Lippincott-Raven出版社)中更详细地描述。另见AAV2(Xie等，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.99:10405-10)、AAV4(Padron等，(2005)J.Virol.79:5047-58)、AAV5(Walters等，(2004)J.Virol.78:3361-71)和CPV(Xie等，(1996)J.Mol.Biol.6:497-520和Tsao等，(1991)Science 251:1456-64)的晶体结构的描述。
本文使用的术语“向性”是指病毒优先进入某些细胞或组织，任选地随后在细胞中表达(例如，转录以及任选地翻译)病毒基因组携带的序列，例如，对于重组病毒，表达感兴趣的异源核酸。
如本文所使用的，“全身性向性”和“全身性转导”(和等同术语)表示本发明的病毒衣壳或病毒载体表现出对遍布全身的组织(例如，大脑、肺、骨骼肌、心脏、肝、肾和/或胰腺)的向性和/或转导。在本发明的实施方式中，观察到中枢神经系统(例如，大脑、神经元细胞等)的全身性转导。
如本文所使用的，“选择性向性”或“特异性向性”是指将病毒载体递送到某些靶细胞和/或某些组织、和/或某些靶细胞和/或某些组织的特异性转导。
除非另有指明，否则“有效转导”或“有效向性”或类似术语可以通过参考合适的对照(例如，与对照相比，分别至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、500％或更高的转导或向性)来确定。在一些实施方式中，用作确定AAV病毒粒子是否能“有效穿过血脑屏障”的对照是缺乏穿过血脑屏障的能力的AAV病毒粒子。在特定的实施方式中，本文所述的合理多倍体病毒载体有效地转导CNS或外周神经系统(PNS)(包括神经元细胞和非神经元细胞)、或对其具有效向性。合适的对照将取决于各种因素，包括期望的向性和/或转导概况。通过在类似条件下监测跨CNS区域(例如大脑区域)的转导比AAV2更好，本领域技术人员可以确定本文公开的合理多倍体AAV载体是否可以有效地穿过血脑屏障。例如，如Molecular Therapy,vol.19,no.8,aug.2011所述，通过引用以其整体并入本文。监测可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行，并包括大脑和脊髓组织的RT-PCR分析、大脑和脊髓组织的蛋白质印迹、或者动物模型的大脑和脊髓组织的免疫组织化学、以及动物模型中的表达荧光素酶的合理多倍体的体内生物发光分析。优选的是，在穿过血脑屏障和转导CNS区域(如大脑区域)方面，有效穿过血脑屏障的血清型比AAV6更好。在一个实施方式中，比起AAV5，该群可以更好地穿过血脑屏障并转导CNS区域。在一些实施方式中，与AAV8相比，该群对受试者的皮层、纹状体、丘脑、髓质、海马体、小脑和脊髓中的一个或多个具有增强的转导，AAV8是缺乏有效穿过血脑屏障的能力的非单倍体AAV颗粒。在一些实施方式中，通过静脉内注射或鞘内注射或大脑的血管内注射在受试者中施用合理多倍体的群。与在类似条件下的AAV2或AAV5病毒粒子相比，本文公开的合理多倍体病毒粒子转导CNS或大脑区域的转导能力增强至少20％以上、或30％以上、或40％以上、或50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上、或100％以上、或至少1.2倍、或至少1.5倍、或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或更多。
类似地，通过参考合适的对照，可以确定病毒是否“不能有效地转导”靶组织或对靶组织“没有有效的向性”，或类似的术语。在特定实施方式中，病毒载体不能有效地转导(即没有有效的向性)肝、肾、性腺和/或生殖细胞。在具体实施方式中，组织(例如，肝脏)的转导(例如，不期望的转导)是期望的目标组织(例如骨骼肌、膈肌、心肌和/或中枢神经系统细胞)的转导水平的20％或更低、10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.1％或更低。
在本发明的一些实施方式中，包含本发明衣壳的AAV颗粒可以表现出对某些组织/细胞的有效转导的多个表型、以及对特定组织/细胞的非常低水平的转导(例如，减少的转导)(其转导是不期望的)。
如本文所使用的，术语“多肽”涵盖肽和蛋白质，除非另有说明。
“多核苷酸”是核苷酸碱基的序列，并且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂交序列(包括天然存在和非天然存在的核苷酸)，但在代表性实施方式中是单链或双链DNA序列。
如本文所使用的，“分离的”多核苷酸(例如“分离的DNA”或“分离的RNA”)是指与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他成分至少部分分离的多核苷酸，例如，通常发现的与多核苷酸相关的细胞或病毒结构成分或其他多肽或核酸。在代表性实施方式中，与起始材料相比，“分离的”核苷酸富集至少约10倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。
同样地，“分离的”多肽是指与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他成分至少部分分离的多肽，例如，细胞或病毒结构成分或通常发现的与多肽相关的其他多肽或核酸。在代表性实施方式中，与起始材料相比，“分离的”多肽富集至少约10倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。
“分离的细胞”是指在其自然状态下与正常相关的其他成分分离的细胞。例如，分离的细胞可以是本发明的培养基中的细胞和/或药学上可接受的载体中的细胞。因此，可以将分离的细胞递送和/或引入受试者。在一些实施方式中，分离的细胞可以是从受试者中移出并如本文所述离体操作然后返回受试者的细胞。
可以通过本文所述的任何方法产生病毒粒子的群。在一个实施方式中，该群是至少101个病毒粒子。在一个实施方式中，所述群是至少102个病毒粒子、至少103个病毒粒子、至少104个病毒粒子、至少105个病毒粒子、至少106个病毒粒子、至少107个病毒粒子、至少108个病毒粒子、至少109个病毒粒子、至少1010个病毒粒子、至少1011个病毒粒子、至少1012个病毒粒子、至少1013个病毒粒子、至少1014个病毒粒子、至少1015个病毒粒子、至少1016个病毒粒子或至少1017个病毒粒子。病毒粒子的群可以是异源的，也可以是同类的(例如，实质上同类或完全同类)。
本文使用的术语“实质上同类的群”是指大部分相同的病毒粒子的群，其中很少或没有污染的病毒粒子(不相同的那些)。实质上同类的群是至少90％相同的病毒粒子(例如，期望的病毒粒子)，并且可以是至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％相同的病毒粒子。
完全同类的病毒粒子的群只包含相同的病毒粒子。
如本文所使用的，“分离”或“纯化”(或语法等同物)病毒载体或病毒颗粒或病毒颗粒的群意味着病毒载体或病毒颗粒或病毒颗粒的群与起始材料中的至少一些其他组分至少部分分离。在代表性实施方式中，与起始材料相比，“分离的”或“纯化的”病毒载体或病毒颗粒或病毒颗粒的群被富集至少约10倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。
“治疗性多肽”是如下多肽，其可以缓解、减少、预防、延缓和/或稳定因受试者或细胞中蛋白质缺失或缺陷而引起的症状，和/或是在其他方面对受试者有益的多肽，例如，抗癌作用或提高移植存活率或诱导免疫应答。
术语“治疗(treat、treating或treatment of)”(及其语法变体)是指受试者病情的严重程度减轻、至少部分改善或稳定，和/或实现至少一种临床症状的一些减轻、缓解、降低或稳定，和/或疾病或紊乱的进展延迟。
术语“预防(prevent、preventing和prevention)”(及其语法变体)是指相对于在不存在本发明的方法的情况下会发生的那些，预防和/或延缓疾病、紊乱、和/或受试者的临床症状的发作，和/或减轻疾病、紊乱和/或临床症状的发作的严重程度。预防可以是完全的，例如疾病、紊乱和/或临床症状完全不存在。预防也可以是部分的，使得受试者的疾病、紊乱和/或临床症状的发生和/或发病的严重程度实质上小于在不存在本发明的情况下会发生的情况。
本文所使用的“治疗有效”量是足以为受试者提供一些改善或益处的量。或者说，“治疗有效”量是能够对受试者中的至少一种临床症状提供一些缓解、减轻、减少或稳定的量。本领域技术人员将理解，治疗效果不需要是完全的或治愈的，只要向受试者提供一些益处。
本文所使用的“预防有效”量是相对于在没有本发明的方法的情况下将发生的情况而言，足以预防和/或延缓疾病、紊乱、和/或受试者的临床症状的发作，和/或减少和/或延缓疾病、紊乱和/或受试者的临床症状发作的严重程度的量。本领域技术人员将理解，预防水平不需要是完全的，只要为受试者提供一些预防益处即可。
术语“异源核苷酸序列”和“异源核酸分子”在本文中可互换使用，并且指的是非天然存在于病毒中的核酸序列。通常，异源核酸分子或异源核苷酸序列包括编码感兴趣的非翻译RNA和/或多肽(例如，用于递送至细胞和/或受试者)的开放阅读框。
如本文所用，术语“病毒载体”、“载体”或“基因递送载体”是指起到核酸递送媒介作用的病毒(例如，AAV)颗粒，并且其包含包装在病毒粒子中的载体基因组(例如，病毒DNA[vDNA])。或者，在某些情况下，术语“载体”可单独用于指代载体基因组/vDNA。
“rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一个或多个异源核酸序列的AAV基因组(即vDNA)。rAAV载体通常只需要顺式的末端重复序列(TR)来产生病毒。所有其他病毒序列都是可省略的，并且可以反式提供(Muzyczka，(1992)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.158:97)。通常，rAAV载体基因组将仅保留一个或多个TR序列，以使可以被载体有效包装的转基因的大小最大化。结构和非结构蛋白质编码序列可以反式提供(例如，来自载体，如质粒，或通过将序列稳定地整合到包装细胞中)。在本发明的实施方式中，rAAV载体基因组包含至少一个TR序列(例如，AAV TR序列)，任选的两个TR(例如，两个AAV TR)，其通常位于载体基因组的5'端和3'端，并侧接于异源核酸、但不必与其相邻。TR可以彼此相同或不同。
术语“末端重复序列”或“TR”包括任何的病毒末端重复序列或合成序列，该序列形成发夹结构并作为反向末端重复序列发挥作用(即，介导期望功能，如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等)。TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，非AAV TR序列、如其他细小病毒的序列(例如，犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒(MVM)、人细小病毒B-19)或任何其他合适的病毒序列(例如，用作SV40复制起点的SV40发夹)可以用作TR，其可进一步通过截短、替换、缺失、插入和/或添加进行修饰。此外，TR可以是部分或完全合成的，例如如Samulski等在美国专利No.5478745中描述的“双D序列”。
“AAV末端重复序列”或“AAV TR”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，或现在已知或将来发现的任何其他AAV(参见例如表1)。AAV末端重复序列不需要具有天然末端重复序列(例如，天然AAV TR序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变而改变)，只要末端重复序列介导期望的功能，例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等。AAV蛋白VP1、VP2和VP3是一起相互作用以形成二十面体对称的AAV衣壳的衣壳蛋白。VP1.5是美国公开号2014/0037585中描述的AAV衣壳蛋白。在本发明中，在一些实施方式中，AAV ITR为145bp。在一些实施方式中，AAV ITR小于145bp。在一些实施方式中，AAVITR为130bp。
本发明的病毒载体还可以是国际专利公开WO 00/28004和Chao等(2000)Molecular Therapy 2:619中描述的“靶向”病毒载体(例如，具有定向向性)和/或“杂交”细小病毒(即，其中病毒TR和病毒衣壳来自不同的细小病毒)。
本发明的病毒载体还可以是国际专利公开WO 01/92551中所述的双链细小病毒颗粒(其公开内容通过引用整体并入本文)。因此，在一些实施方式中，双链(双联体)基因组可以被包装到本发明的病毒衣壳中。
此外，病毒衣壳或基因组元件可以包含其他修饰，包括插入、缺失和/或替换。
本文所使用的“嵌合的”病毒结构蛋白是指相对于野生型，通过衣壳蛋白的氨基酸序列中的一个或多个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等)氨基酸残基的替换而进行修饰的AAV病毒结构蛋白(衣壳)，以及相对于野生型，通过氨基酸序列中的一个或多个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等)氨基酸残基的插入和/或缺失而进行修饰的AAV病毒结构蛋白(衣壳)。在一些实施方式中，来自一种AAV血清型的完整或部分的结构域、功能区、表位等可以以任何组合取代不同AAV血清型的相应的野生型结构域、功能区、表位等，以产生本发明的嵌合衣壳蛋白。在其它实施方式中，替换均来自于同一血清型。在其它实施方式中，替换均来自AAV或者是合成的。嵌合衣壳蛋白的生产可以根据本领域熟知的方案进行，并且在文献以及本文中描述了大量的嵌合衣壳蛋白，所述嵌合衣壳蛋白可以被包括在本发明的衣壳中。在一些实施方式中，合理多倍体包含至少一种嵌合病毒结构蛋白。在这方面，病毒结构蛋白由一种AAV血清型的N末端和另一种AAV血清型的C末端产生。在一些实施方式中，合理多倍体不包含嵌合病毒结构蛋白。
“修饰的”病毒结构蛋白可以是包含非衣壳蛋白或修饰的结构衣壳蛋白，或者是化学修饰的病毒结构蛋白，例如添加非天然存在或合成的氨基酸，或用非天然存在的氨基酸替换氨基酸，以及对AAV衣壳蛋白的一个或多个现有氨基酸的化学修饰。对衣壳蛋白的表面修饰公开于美国专利10294281、9409953和美国申请2018/0105559中，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，表面修饰可以包括靶向CNS的靶向蛋白，例如，如WO2020028751、特别是WO20200287.51的表2中所公开的，其通过引用整体并入本文。在某些实施方式中，将合理的工程化和/或突变方法用于修饰和/或靶向对靶组织(例如CNS或PNS)具有增强的转导的肽。本文公开的合理多倍体载体的一种或多种衣壳蛋白的使用和修饰的靶向肽可以通过本领域已知的任何方法来鉴定和/或设计，例如，使用Deverman等(NatureBiotechnology 34(2):204-209(2016))以及国际专利申请公开号WO2015038958和WO2017100671中描述的CREATE系统，以其整体并入本文。
在替代的实施方式中，可以构建病毒粒子，其中来自于由AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3所组成的组中的至少一种病毒蛋白与形成能够包封AAV基因组的病毒粒子所需的至少一种其他病毒蛋白不同。对于存在的每种病毒蛋白(VP1、VP2和/或VP3)，该蛋白是相同类型的(例如，均为AAV2 VP1)。在一种情形中，至少一种病毒蛋白是嵌合病毒蛋白，而另外两种病毒蛋白中的至少一种不是嵌合的。在一个实施方式中，VP1和VP2是嵌合的，并且只有VP3是非嵌合的。例如，仅由来自嵌合的AAV2/8(AAV2的N端和AAV8的C端)的VP1/VP2组成的病毒粒子与仅来自AAV2的VP3配对；或者仅嵌合的VP1/VP2 28m-2P3(N末端来自AAV8且C末端来自AAV2，没有VP3起始密码子突变)与仅来自AAV2的VP3配对。在另一个实施方式中，只有VP3是嵌合的，而VP1和VP2是非嵌合的。在另一个实施方式中，至少一种病毒蛋白来自完全不同的血清型。例如，仅嵌合的VP1/VP2 28m-2P3与仅来自AAV3的VP3配对。在另一个实例中，不存在嵌合体。
如本文所使用的，术语“氨基酸”涵盖任何天然存在的氨基酸、其修饰形式和合成的氨基酸。天然存在的左旋(L-)氨基酸如表10所示。
或者，氨基酸可以是经修饰的氨基酸残基(非限制性实例在表12中示出)和/或可以是通过翻译后修饰(例如乙酰化、酰胺化、甲酰化、羟基化、甲基化、磷酸化或硫酸化)进行修饰的氨基酸。
此外，非天然存在的氨基酸可以是“非天然”氨基酸，如Wang等，Annu Rev BiophysBiomol Struct.35:225-49(2006)所述。这些非天然氨基酸可以有利地用于将感兴趣的分子与AAV衣壳蛋白化学连接。
如本文所使用的，术语“同源重组”是指一种基因重组，其中核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分子之间交换。同源重组也产生DNA序列的新组合。这些新的DNA组合代表了遗传变异。同源重组也用于水平基因转移，以在不同毒株和病毒物种之间交换遗传物质。
病毒感染宿主可以刺激宿主的免疫防御系统，以保护受感染的宿主免受病毒感染。宿主激活以保护其免受外源物质攻击的免疫应答之一是体液免疫应答，其产生抗体介导的免疫。
如本文所使用的，术语“体液免疫”是指抗体介导的β细胞免疫系统，其由细胞外液中发现的大分子(与细胞介导的免疫相对；如分泌的抗体、补体蛋白和某些抗微生物肽)介导。特别地，它指的是宿主的抗体介导的免疫应答。
如本文所使用的，“抗原的(antigenic)”或“抗原性(antigenicity)”可与“免疫原性(immunogenicity)”互换使用，并且指的是物质、例如合理多倍体病毒粒子诱导特异性免疫应答的能力。它也指该物质能够刺激免疫应答的程度，例如，该物质能够与抗体或T细胞受体或B细胞结合的能力。
如本文所使用的，术语“中和抗体”与“Nab”互换使用，并且是指特异性结合至对病毒功能至关重要的表位并干扰病毒感染性的抗体，例如，阻断AAV病毒粒子进入宿主细胞。定义中包含的中和抗体(NAbs)是指通过抑制或中和其生物学上的任何作用来保护细胞免受抗原或传染源的影响的抗体。通常，抗体与抗原结合，并向白细胞发出该抗原已被靶向(即标记)的信号。经标记的抗原被处理并因此被破坏，而中和抗体中和抗原本身的生物效应。NAb可以是对病毒的多种血清型有效的广泛中和抗体(bNAb)，也可以是特异性识别一种血清型的特异性NAb。
对病毒、特别是对AAV衣壳和AAV血清型的“中和”在本文中被定义为通过中和化合物(如抗体)与病毒血清型的结合和/或细胞表面的结合并防止与AAV的相互作用，在体外或体内消除病毒感染性。在本发明的上下文中，该定义不包括通过与(宿主)细胞表面上的病毒受体结合的中和抗体阻断感染。
在一些实例中，通过测量报告基因产物(例如荧光素酶、GFP)的活性来确定中和能力。抗体对特定AAV血清型的中和能力可以是至少50％，例如至少55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
如本文所使用的，“血脑屏障”或“BBB”是指内皮细胞的高度选择性半透性边界，其防止循环血液中的溶质非选择性地进入神经元所在的中枢神经系统的细胞外液。血脑屏障由毛细血管壁的内皮细胞、包裹毛细血管的星形胶质细胞终足和包埋入毛细血管基底膜中的周细胞形成。该系统允许一些分子通过被动扩散，以及各种营养物质、离子、有机阴离子和对神经功能至关重要的大分子(如葡萄糖、水和氨基酸)的选择性和主动运输进行穿过。
如本文所使用的“脑血管”或“BBV”是指大脑中的血管和毛细血管，它们是大脑循环的一部分，并且具有血脑屏障功能。
如本文所使用的短语“BBB细胞”是指BBB的一部分或组成成分的任何细胞，并且包括BBB的毛细血管壁的内皮细胞、包裹毛细血管的星形胶质细胞终足和包埋入毛细血管基底膜中的周细胞。
如本文所使用的短语“BBB的内皮细胞”可在本文中与“BBB ECs”或“BBB内皮细胞”互换使用，并指BBB毛细血管壁的内皮细胞。
如本文所使用的短语“穿过BBB的细胞”是指能够穿过完整BBB(即BBB未泄漏或受损)的任何细胞。可以穿过BBB的细胞包括但不限于血管周细胞、巨噬细胞、T细胞和单核细胞。
如本文所使用的，本文所使用的“血液成分”是指血液中的细胞，并且可包括血小板(platelets/thrombocytes)、红细胞(red blood cells/rbc/erythrocytes)、白细胞(包括淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和中性粒细胞)。
如本文所使用的术语“基因编辑”、“基因组编辑”或“基因组工程化”是指一种遗传学工程化，其中，使用经工程化的核酸酶或“分子剪刀”在活体基因组中插入、删除或替换DNA。这些核酸酶在基因组中的期望位置产生位点特异性双链断裂(DSBs)。
如本文所使用的术语“基因递送”是指将外源DNA转移到宿主细胞用于基因治疗的过程。
如本文所使用的术语“CRISPR”代表规律间隔成簇短回文重复序列，它是构成CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基础的细菌防御系统的标志。
如本文所使用的术语“锌指”是指小蛋白质结构基序，其特征在于一种或多种锌离子的配位，以稳定折叠。
II.合理的单倍体或多倍体AAV载体的概述
本文所使用的合理多倍体(例如，合理单倍体)是指由来自至少两种不同的AAV血清型的病毒结构蛋白VP1、VP2或VP3形成的病毒粒子，其中，VP1、VP2或VP3中的每一个仅来自一种亲代AAV血清型。非合理的单倍体可以指嵌合单倍体或镶嵌(mosaic)单倍体。在一个实施方式中，亲代血清型的病毒结构蛋白可以是经修饰的病毒结构蛋白质，或者可以是嵌合的。在一个实施方式中，亲代血清型不是嵌合血清型。在一些实施方式中，经修饰的亲代AAV血清型包括一个或多个氨基酸的插入、缺失或替换。本发明的合理多倍体病毒粒子(例如合理单倍体)不是镶嵌病毒粒子。
在一些实施方式中，本文公开的AAV杂交颗粒可以是合成的AAV杂交病毒载体，其被设计为显示适用于不同的体外和体内应用的一系列期望的表型。因此，在一个实施方式中，本发明提供了AAV杂交颗粒或病毒粒子。在一个实施方式中，本发明提供实质上纯的AAV杂交颗粒或病毒粒子的群。
本发明提供了一系列合成的病毒载体，其显示出一系列适用于不同的体外、体内和临床应用的期望的表型。
特别地，本发明基于以下的预料不到的发现，即将仅来自有效穿过BBB的任何AAV血清型的至少VP3衣壳蛋白与仅来自不同血清型的VP1和/或VP2衣壳蛋白(例如，来自表1中所选的AAV血清的VP1和/或VP2衣壳蛋白)组合，允许开发出在每个衣壳中具有多种期望表型的改良的AAV病毒粒子，包括但不限于增强的全身递送和向性以及不同的抗原特性，例如体内施用后逃避中和抗体(Nab)的能力。
在一些实施方式中，由于合理多倍体载体的穿过BBB的能力，本文公开的合理多倍体载体在CNS和/或PNS中具有生物分布。在一些实施方式中，由于转导脑血管(BBV)和/或血液成分的能力，本文公开的合理多倍体载体在CNS和/或PNS中具有生物分布。在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体载体通过转导脑血管(BBV)和/或血液成分(例如血液中的细胞)而在CNS和/或PNS中具有生物分布，其允许通过脑循环将AAV转导的细胞递送到大脑。在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体载体可以转导穿过内皮细胞的细胞，包括血管周细胞和巨噬细胞，以及其他免疫细胞，例如T细胞和血液单核细胞。也就是说，在一些实施方式中，合理多倍体AAV载体通过间接途径在大脑中具有生物分布——本文公开的AAV多倍体载体可以通过转导进入大脑的细胞和/或通过转导脑血管(BBV)(包括大脑中的内皮细胞)而间接到达大脑。在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体载体可被接触脑血管或其他器官的神经元和/或非神经元细胞摄取，例如，通过自主神经纤维或外周神经纤维从外周器官逆行转运至CNS。在一些实施方式中，与AAV8相比，本发明的合理多倍体具有增强的与脑微血管内皮细胞(BMVECs)的结合。在一些实施方式中，与AAV2相比，本发明的合理多倍体具有增强的与脑微血管内皮细胞(BMVECs)的结合。与BMVECs的结合描述于MolecularTherapy，Methods&Clinical development，vol 20，March 2021，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方式中，本发明的合理多倍体可以扩散或胞吞转运(trancytose)或穿梭通过内皮屏障，例如血脑屏障，其中，与AAV2相比，它不影响血脑屏障的完整性。相反，AAV2经内吞作用转导BMVECs，穿过内皮屏障的扩散最小。本发明的合理多倍体参与BMVECs的胞吞转运并转导CNS区域，例如脑实质细胞。原代BMVECs产生有效的内皮屏障，并充当与人BBB相关的模型，以测试AAV血清型的胞吞转运、内吞和转导，如J Neurochem 2017January 140(2)，216-230和J Neurochem 2017，140，192-194所述，两者均通过引用以其整体并入本文。
这种单倍体或多倍体病毒粒子有时被称为三倍体病毒粒子，指的是衣壳蛋白VP1、VP2和VP3来自至少两种不同的血清型。本文描述了生产这种AAV单倍体病毒粒子的示例性方法。通过防止来自VP1或VP2 AAV血清型的VP3的不期望的开放阅读框的翻译，这些方法引起生成的病毒粒子的同类的群的产生。
产生同类的(例如，基本上或完全)重组AAV单倍体病毒粒子的群的能力显著减少或消除了不期望的/污染的病毒粒子特性的携带(例如，转导特异性或抗原性)。
在一个实施方式中，本文所述的包封AAV基因组(包括位于2个AAV ITR之间的异源基因)的AAV单倍体病毒粒子可以仅用两种病毒结构蛋白VP1和VP3形成。在一个实施方式中，这样的AAV单倍体病毒粒子在构象上是正确的，即具有T＝1二十面体对称性。在一个实施方式中，本文所述的AAV单倍体病毒粒子具有感染性。在一个实施方式中，与天然AAV血清型相比，本文所述的AAV单倍体病毒粒子具有不同的生物分布，例如本文描述的AAV单倍体病毒粒子与天然AAV血清型相比具有全身性转导。在一个实施方式中，与天然AAV血清型相比，本文所述的AAV单倍体病毒粒子具有降低的抗原特性，例如，与天然AAV血清型相比，本文所描述的AAV单倍体病毒粒子具有降低的诱导体液免疫应答的能力，或与天然AAV血清型相比，逃避中和抗体(Nab)的能力增加。
AAV病毒粒子具有T＝1二十面体对称性，并且由三种结构病毒蛋白VP1、VP2和VP3组成。60拷贝的这三种病毒蛋白以1:1:8至1:1:10的比例(分别为VP1:VP2:VP3)形成病毒粒子(Rayaprolu，V.，等，J.Virol.87(24):13150-13160(2013)。
在一个实施方式中，包封AAV基因组的AAV病毒粒子可以仅用两种病毒结构蛋白VP1和VP3形成，所述AAV基因组包括在2个AAV ITR之间的异源基因。在一个实施方式中，该病毒粒子在构象上是正确的，即具有T＝1二十面体对称性。在一个实施方式中，病毒粒子是感染性的。感染性病毒粒子包括VP1/VP3或VP1/VP2/VP3。通常，仅包含VP2/VP3或仅包含VP3的病毒粒子不是感染性的。
在一些实施方式中，本文的技术还提供了AAV衣壳，其中所述衣壳包含衣壳蛋白VP1，其中所述的衣壳蛋白VP1来自一种或多种第一AAV血清型和衣壳蛋白VP2，其中所述衣壳蛋白VP2来自一种或多种第二AAV血清型，并且其中所述第一AAV血清型中的至少一种以任何组合不同于所述第二AAV血清型中的至少一种，并且其中VP1、VP2或VP3中的至少一种来自恒河猴AAV(AAVrh)血清型。在一些实施方式中，病毒粒子中不存在嵌合病毒结构蛋白。
在一些实施方式中，本文公开的AAV单倍体颗粒可包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含衣壳蛋白VP3，其中所述衣壳蛋白VP3来自一种或多种第三AAV血清型，并且其中所述第三AAV血清型是穿过BBB的AAV血清型，其中所述一种或多种第三AAV血清型中的至少一种以任何组合不同于所述第一AAV血清型和/或所述第二AAV血清型，并且其中所述第一或第二AAV血清型，但不是两者都是恒河猴AAV(AAVrh)血清型。在一些实施方式中，本文所述的AAV衣壳可包含衣壳蛋白VP1.5。
本发明进一步提供了一种AAV颗粒，该颗粒包含腺相关病毒(AAV)衣壳，其中所述衣壳包含衣壳蛋白VP1，其中所述衣壳蛋白VP1来自一种或多种第一AAV血清型(例如，选自表1的血清型)和衣壳蛋白VP1.5，其中所述衣壳蛋白VP1.5来自一种或多种第二AAV血清型，并且其中所述第一AAV血清型中的至少一种以任何组合不同于所述第二AAV血清型中的至少一种，并且第一AAV血清型或第二AAV血清型、但非两者来自恒河猴AAV(AAVrh血清型)。
在一些实施方式中，衣壳包含衣壳蛋白VP3，其中所述衣壳蛋白VP3来自一种或多种第三AAV血清型，所述第三AAV血清型是穿过BBB的AAV血清型，其中，所述一种或多种第三AAV血清型中的至少一种以任何组合不同于所述第一AAV血清型和/或所述第二AAV血清型，并且其中所述第一AAV血清型、所述第二AAV血清型或所述第三AAV血清型中的至少一种来自穿过BBB的AAV血清型，或者在一些实施方式中来自非人类AAV血清型(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，而另外的血清型则选自表1中的任何AAV血清型。在一些实施方式中，本文所述的AAV衣壳可包含衣壳蛋白VP1.5。
在一些情况下，VP3蛋白可以被化学修饰以穿过BBB，或者在一些实施方式中，包含靶肽以增加其穿过BBB的能力。本发明进一步提供腺相关病毒(AAV)衣壳，其中所述衣壳包含衣壳蛋白VP1，其中所述衣壳蛋白VP1来自一种或多种第一AAV血清型和衣壳蛋白VP1.5，其中所述衣壳蛋白VP1.5来自一种或多种第二AAV血清型，并且其中所述第一AAV血清型中的至少一种以任何组合不同于所述第二AAV血清型中的至少一种，并且其中第一AAV血清型或第二AAV血清型(但不是两者)来自恒河猴AAV(AAVrh)血清型，并且另外的血清型则选自表1中的任何AAV血清型。
在一些实施方式中，本发明的AAV衣壳包含衣壳蛋白VP3，其中所述衣壳蛋白VP3来自一种或多种第三AAV血清型，所述第三AAV血清型是穿过BBB的AAV血清型，其中，所述一种或多种第三AAV血清型中的至少一种以任何组合不同于所述第一AAV血清型和/或所述第二AAV血清型，并且其中所述第一AAV血清型、或第二AAV血清型、或第三AAV血清型中的至少一种来自穿过BBB的AAV血清型，并且在一些实施方式中来自非人灵长类AAV(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，而另外的血清型则可选自表1中的任何AAV血清型。在一些实施方式中，本文所述的AAV衣壳蛋白可包含衣壳蛋白VP2。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体病毒粒子可以是合成的合理多倍体AAV病毒载体，该载体被设计用于显示适用于不同的体内和体外应用的一系列的期望表型。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种合理的多倍体AAV病毒载体或病毒粒子。在一个实施方式中，本发明提供了一种实质上纯的合理的多倍体AAV病毒载体或病毒粒子的群。
病毒感染宿主可以刺激宿主的免疫防御系统，以保护受感染的宿主免受病毒感染。宿主激活以保护其免受外源物质攻击的免疫反答之一是体液免疫反答，它产生抗体介导的免疫。在一个实施方式中，与亲代血清型相比，本文公开的合理的多倍体病毒粒子激发经诱导的体液应答，或与亲代血清型相比，受抗AAV中和抗体的影响较小。
仅出于解释目的，中和抗体与非中和抗体不同。基于免疫的抗体由中和抗体和非中和抗体组成；非中和抗体构成了免疫应答过程中产生的抗体库的大部分，但只有少数是功能性的并参与感染细胞的清除，有时通过与其他免疫细胞和/或与补体系统的相互作用。相比之下，中和抗体特异性结合对病毒功能至关重要的表位，并干扰病毒的感染性，例如阻断病毒进入宿主细胞。中和抗体(NAbs)通过多种机制结合并抑制靶细胞的AAV转导。AAV中和抗体已成为许多研究的焦点，归因于它们对AAV介导的基因治疗功效的显著的有害影响。最近的研究表明，AAV结合抗体也可能对AAV载体的分布和安全性具有影响(Klasse等，JGen Virol，2002，83(Pt 9):2091；以及Wang等，Hum Gene Ther，2011，22(11):1389；其各自的内容通过引用整体并入本文)。
在AAV基因递送中检测AAV衣壳和AAV血清型的预先存在的中和抗体对于开发如何克服这些先前抗体带来的挑战的适当的方法至关重要。使用不同/替换的AAV衣壳和AAV血清型(在患者或患者的组中检测到针对其的较低滴度或不存在中和抗体)可克服这一挑战。III.穿过BBB的合理的AAV多倍体载体
本发明提供了一系列合成的合理多倍体AAV病毒载体，显示出一系列适用于不同的体外和体内应用的期望表型。特别地，本发明基于如下的预料不到的发现，将有效穿过BBB的至少VP3结构蛋白(如衣壳蛋白)与来自单个衣壳的任何不同的AAV血清型的至少VP1衣壳蛋白和/或VP2衣壳蛋白组合，使得能够开发改进的AAV衣壳，其在各单个衣壳中具有多种期望表型，例如选自但不限于如下的至少一种性质：增加的针对CNS和/或PNS的向性、穿过血脑屏障(BBB)和/或转导血脑血管(BBV)或血液成分以允许通过脑循环向大脑递送合理的AAV衣壳的能力，引发降低的体液应答的能力，体内施用后逃避中和抗体(Nab)的能力。在一些实施方式中，由合理多倍体AAV病毒粒子示出的一种期望特性是允许其被选择为重复给药载体(redosing vector)的能力。这样的单倍体或多倍体病毒粒子是指衣壳蛋白VP1、VP2和VP3来自至少两个不同的血清型。本文描述了生产这样的合理多倍体AAV病毒粒子的示例性方法。通过防止对来自VP1和/或VP2蛋白的AAV血清型的VP3的不期望的开放阅读框的翻译，这些方法引起所生成的病毒粒子的同类的群的产生。
生成重组的合理多倍体AAV病毒粒子的同类(例如实质上或完全)的群的能力极大减少或消除了不期望/污染的病毒粒子的性质(例如转导特异性或抗原性)的残留。
在一些实施方式中，相对于缺乏穿过血脑屏障的能力的非单倍体AAV颗粒(例如AAV2、或AAV5或AAV8)，本文公开的合理多倍体AAV病毒粒子的群对受试者的以下中的一种或多种具有增强的转导：脑血管内皮细胞(BBV)、星形胶质细胞、少突胶质细胞、CC1+少突胶质母细胞、包括遍布大脑的NeuN+细胞的神经元亚型、中脑酪氨酸羟化酶(TH)+多巴胺能神经元、钙结合蛋白+小脑浦肯野细胞、中间神经元群和CD31+内皮细胞。在一些实施方式中，相对于具有穿过血脑屏障的能力的非单倍体AAV颗粒，合理多倍体AAV病毒粒子的群对受试者的以下中的一种或多种具有等同或增强的转导：皮层、纹状体、丘脑、髓质、海马体、小脑和脊髓。在实施方式的一些方面中，相对于具有穿过血脑屏障的能力的非合理多倍体AAV颗粒，合理多倍体AAV病毒粒子的群对受试者的以下中的一种或多种具有等同或增强的转导：星形胶质细胞、少突胶质细胞、CC1+少突胶质胶质细胞、包括遍布大脑的NeuN+细胞的神经元亚型、中脑酪氨酸羟化酶(TH)+多巴胺能神经元、钙结合蛋白+小脑浦肯野细胞、中间神经元群和CD31+内皮细胞。
确定相对转导效率的方法描述于www.moleculartherapy.org,vol.19no.8，1440-1448,2011，该非专利文献以引用的方式整体并入。在一些实施方式中，相对于AAV2或AAV5，本文公开的单倍体AAV病毒粒子的群在整个CNS中具有增强的转导。在一些实施方式中，相对于AAV2或AAV5，单倍体AAV病毒粒子的群在纹状体中具有增强的转导，与在类似条件下的AAV2或AAV5病毒粒子的转导相比，在纹状体中的转导增强例如至少20％、或30％、或40％、或50％、60％、70％、80％、90％、或95％、或100％以上、或至少1.2倍、或至少1.5倍、或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或更高。
在一个实施方式中，本发明提供腺相关病毒(AAV)单倍体或多倍体衣壳，其中所述衣壳包含衣壳蛋白VP1，其中所述衣壳蛋白VP1来自任何血清型和至少衣壳蛋白VP3，其中所述衣壳蛋白质VP3来自穿过BBB的任何AAV血清型和/或是非人灵长类动物的，并且其与VP1(或VP2，如果存在)AAV血清型的血清型不是同一血清型。优选地，这样的合理多倍体病毒粒子的群实质上是同类的。在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体病毒粒子可包含VP2衣壳蛋白，其中所述VP2衣壳蛋白来自表1中公开的任何AAV血清型、或其嵌合VP2蛋白，或其中VP2衣壳蛋白来自与VP3来源的血清型相同的任何血清型，或者另外地，其中所述VP2衣壳蛋白来自与VP3来源的血清型不同的血清型。本文公开的合理多倍体例如单倍体病毒粒子的VP1-VP2-VP3的示例性配置可以表示如下：X-Y-Z、X-X-Z、Z-X-Z、X-Z-Z，其中X、Y和Z各自仅来自一种AAV血清型并且是不同的血清型，并且其中X和Z可以选自表1中公开的任何血清型，且Z来自穿过BBB的任何血清型。也就是说，在任何合理的单倍体载体中，VP3仅来自一个Z血清型，VP1仅来自一个X血清型及诸如此类。在一些实施方式中，X和Y可以选自穿过BBB的任何血清型和/或非人灵长类AAV血清型，但在这种情况下，它们来自与Z的血清型不同的血清型。在一些实施方式中，Z来自任何非人灵长类AAV血清型、例如来自恒河猴血清型。在一些实施方式中，Z可以选自任何血清型：AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rh10、rh74、rh39和rh43。
在一个实施方式中，本文所述的合理的单倍体病毒粒子包封AAV基因组(包括位于2个AAV ITR之间的异源基因)，可以仅由两种病毒结构蛋白VP1和VP3形成。在一个实施方式中，这种合理的单倍体AAV病毒粒子在构象上是正确的，即具有T＝1二十面体对称性。在一个实施方式中，本文所述的合理单倍体AAV病毒粒子是感染性的。
AAV病毒粒子具有T＝1二十面体对称性，并且由三种结构病毒蛋白VP1、VP2和VP3组成。60拷贝的三种病毒蛋白质以1:1:8至1:1:10的比例(分别为VP1:VP2:VP3)形成病毒粒子(Rayaprolu,V.等，J.Virol.87(24):13150-13160(2013))。
在一个实施方式中，合理多倍体AAV病毒粒子是分离的病毒粒子，该病毒粒子具有来自与其他VP不同的血清型的病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3中的至少一种，并且各VP仅来自一个血清型。仅为了说明的目的，如果VP1仅来自AAV2，VP2仅来自AAV4，且VP3仅来自穿过BBB、而非AAV2或AAV4的血清型。在一些实施方式中，相对于AAV8，合理多倍体AAV病毒粒子的群在大脑和脊髓中具有增强的生物分布。在一些实施方式中，CNS生物分布为至少0.1vg/细胞、至少0.2vg/细胞、至少0.4vg/细胞、至少0.6vg/细胞、至少0.8vg/细胞、至少1vg/细胞、至少2vg/细胞、至少3vg/细胞、至少4vg/细胞、至少5vg/细胞、至少6vg/细胞、至少7vg/细胞、至少8vg/细胞、至少9vg/细胞、至少10vg/细胞、至少在10vg/细胞-15vg/细胞之间、至少在15vg/细胞-20vg/细胞之间、至少在20vg/细胞-30vg/细胞之间、至少在30vg/细胞-40vg/细胞之间、至少在40vg/细胞-50vg/细胞之间、至少50vg/细胞、至少在50vg/细胞-60vg/细胞之间、至少在60vg/细胞-70vg/细胞之间、至少在70vg/细胞-80vg/细胞之间、至少在80vg/细胞-90vg/细胞之间、至少在90vg/细胞-100vg/细胞之间、至少100vg/细胞或更多。
CNS生物分布构成大脑区域和脊髓区域中的生物分布。非限制性示例性CNS生物分布区域包括：嗅球、纹状体、海马体、皮层、丘脑、下丘脑、小脑、髓质、颈部、胸部、腰椎、脉络丛、缰核、海马角、齿状回、尾壳核、杏仁核。在一些实施方式中，比起在神经胶质细胞中，合理多倍体AAV病毒粒子的群在神经元中具有增强的转导。在一些实施方式中，合理多倍体病毒粒子的群在星形胶质细胞中具有增强的转导。在一些实施方式中，本发明的合理多倍体AAV病毒粒子的群在除CNS以外的组织中具有显著的转导。在实施方式的多个方面中，合理多倍体AAV病毒粒子的群在肺、肾中具有转导，并且在肝、心脏、骨骼肌、肠和脾中具有超生理水平的转导。
在一些实施方式中，本发明的合理多倍体AAV病毒粒子的群具有显著的脑血管内皮细胞(BBV)转导。在一些实施方式中，本发明的合理多倍体AAV病毒粒子的群对作为BBB一部分的细胞具有显著转导，所述细胞包括BBB的内皮细胞中的任一种或多种，被称为星形细胞足(也被称为“胶质界膜”)的星形胶质细胞投影围绕BBB的内皮细胞。在一些实施方式中，本发明的合理多倍体AAV病毒粒子的群对可穿过BBB的血液组分具有显著转导，包括但不限于活化的T细胞、血液单核细胞、巨噬细胞。
在一个实施方式中，包封含有在2个AAV ITR之间的异源基因的AAV基因组的合理多倍体AAV病毒粒子可以仅用两种病毒结构蛋白VP1和VP3形成，其中VP3来自有效穿过BBB的血清型。在一个实施方式中，该病毒粒子在构象上是正确的，即具有T＝1二十面体对称性。在一个实施方式中，病毒粒子是感染性的。
感染性病毒粒子包括VP1/VP3或VP1/VP2/VP3。通常，仅包含VP2/VP3或仅包含VP3的病毒粒子不具有感染性。
在一些实施方式中，用于产生这些合理多倍体AAV病毒粒子的群的病毒结构蛋白VP2可以来自为了基因治疗而分离的12种AAV血清型中的任一种、其他物种、突变血清型、这些基因的改组的血清型，例如AAV1、AAV2、AAV VP1.5、AAV4 VP2、AAV4 VP3、AAV Rh10 VP3、AAV Rh74 VP3、AAV Rh74 VP2或期望的任何其他AAV血清型，例如如表1中所公开的。
如本文所公开的，VP3结构衣壳蛋白选自有效穿过BBB的任何AAV血清型。穿过BBB的这种AAV血清型选自AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rh10、rh74、rh39和rh43中的任何一种。用于本文公开的方法和组合物中的包含VP1、VP2和VP3蛋白的示例性合理多倍体载体包括但不限于：AAV-X-Y-1、AAV-X-X-1、AAV-X-Y-6、AAV-X-X-6、AAV-X-Y-6.2、AAV-X-X-6.2、AAV-X-Y-7、AAV-X-X-7、AAV-X-Y-9、AAV-X-X-9、AAV-X-Y-rh10、AAV-X-X-rh10、AAV-X-Y-rh74、AAV-X-X-rh74、AAV-X-Y-rh39、AAV-X-X-rh39、AAV-X-Y-43和AAV-X-X-43，其中X和Z各自仅选自一种AAV血清型并且是不同的血清型且选自表1中公开的任何血清型。在一些实施方式中，X和/或Y可以来自穿过BBB的任何血清型，或者可替换地来自任何非人灵长类AAV血清型，并且当这种情况发生时，X和/或Y的血清型不同于VP3的血清型。在合理多倍体包含VP1、VP2和VP3蛋白的一些实施方式中，VP1蛋白血清型的血清型与穿过BBB的VP3蛋白的血清型相同，并且VP2蛋白的血清型来自不同的血清型。在合理多倍体包含VP1、VP2和VP3蛋白的一些实施方式中，VP2蛋白血清型的血清型与穿过BBB的VP3蛋白的血清型相同，并且VP1蛋白的血清型来自不同的血清型。
在一些实施方式中，合理多倍体载体可以仅包含VP1和VP3蛋白，或者仅包含VP2和VP3蛋白，并且用于本文公开的方法和组合物中的此类示例性合理多倍体载体包括但不限于：AAV-X-1、AAV-X-6、AAV-X-6.2、AAV-X-7、AAV-X-9、AAV-X-rh10、AAV-X-rh74、AAV-X-rh39、AAV-X-43，其中X是VP1或VP2，并且仅选自来自表1中公开的任何血清型中的一种血清型。在一些实施方式中，X可以来自穿过BBB的任何血清型，或者可替换地来自任何非人灵长类AAV血清型，并且当这种情况发生时，X的血清型不同于VP3的AAV血清型。
在一些实施方式中，VP3可以选自穿过BBB的任何AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAVrh39和AAVrh43，或与天然氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的变体。穿过BBB的AAV血清型公开于Zhang等，Mol.Therapy，19(8)；2011；1440-1448，Nonnenmacher等，Mol Ther:Methods and Clinical development；2021，336和Gao等，J.Virol，2004；6381-6388，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，本文公开的合理AAV多倍体载体包含VP1、VP2或VP3蛋白，其中VP1、VP2或VP3各自来自不同的血清型，其中血清型X或Y是选自表1的任何AAV血清型，血清型Z来自仅穿过BBB的任何血清型，和/或可替换地，以及非人灵长类AAV、或并非血清型X或血清型Y的穿过BBB的任何血清型或嵌合或非天然存在的血清型。
在一些实施方式中，AAV合理多倍体包括三种血清型，例如X、Y和Z，其中VP1、VP2和VP3仅来自一种血清型，其中每一个都是不同的血清型，并且其中X和Y可以选自来自表1中的任何血清型，并且VP3(血清型Z)来自穿过BBB的任何AAV血清型。这些组合在表2中所示。
表2：包含三种不同血清型的合理的AAV多倍体的不同衣壳蛋白的组合的表：X、Y和Z，其中血清型Z选自穿过BBB的任何AAV血清型。
VP1 VP2 VP3
血清型X 血清型Y 血清型Z(BBB)
血清型X 血清型X 血清型Z(BBB)
血清型Z(BBB) 血清型Y 血清型Z(BBB)
血清型X 血清型Z(BBB) 血清型Z(BBB)
在一些实施方式中，AAV合理单倍体载体仅包含两种血清型，其中一种血清型是穿过BBB的任何AAV血清型(称为血清型Z)，并且其中一种血清型(血清型X)来自选自表1的任何血清型。在一些实施方式中，血清型A的示例性血清型包括但不限于AAV8、AAV9、AAV3、AAV3b。在一些实施方式中，血清型Z的示例性血清型是穿过BBB的AAV血清型，所述血清型选自AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAVrh39中的任一种。在一些实施方式中，血清型Z的血清型也可以选自任何非人灵长类AAV血清型，包括恒河猴血清型AAVrh.10、AAVrh.74、AAVrh.73、AAVrh.75、AAVrh.76、rAAVrh39、rAAVrh.43。
IV.穿过BBB的示例性AAV8单倍体载体
在一个实施方式中，本文公开的合理多倍体载体是腺相关病毒8(AAV8)单倍体或多倍体衣壳，其中所述衣壳包含衣壳蛋白VP1和至少衣壳蛋白VP3，其中所述衣壳蛋白VP1来自AAV8血清型，其中所述衣壳蛋白VP3来自穿过BBB的任何AAV血清型和/或是非人灵长类的、并且不是AAV8血清型。优选地，这样的AAV8单倍体病毒粒子的群实质上是同类的。在一些实施方式中，本发明的AAV8单倍体衣壳可包含VP2衣壳蛋白，其中所述VP2衣壳蛋白来自AAV8血清型或其嵌合VP2蛋白，或其中所述VP2衣壳蛋白来自与VP3来源的血清型相同的任何血清型，或可替换地，其中所述VP2衣壳蛋白来自与VP3来源的血清型不同的血清型。本发明的AAV8单倍体衣壳中的VP1-VP2-VP3的示例性构造可以表示为如下：AAV8-8-Y、AAV8-X-Y、AAV8-Y-Y，其中X是来自任何血清型(除了AAV8)的VP2衣壳蛋白，并且Y是来自任何血清型(除了AAV8)的VP3蛋白，其中X和Y来自不同的血清型，并且其中X和Y可以选自穿过BBB的任何血清型和/或非人灵长类AAV血清型。
在一些实施方式中，本文公开的AAV8单倍体或多倍体病毒粒子包含来自AAV8血清型的VP1和至少VP3衣壳蛋白，其中VP3不来自AAV8并且选自穿过BBB的任何血清型和/或是非人灵长类AAV血清型，该病毒粒子被产生。例如，仅产生AAV8单倍体或多倍体病毒粒子，其中VP1和任选的VP2来自AAV8血清型，而VP3不来自AAV8并且选自穿过BBB的任何AAV血清型和/或是非人灵长类AAV血清型。
在一个实施方式中，AAV8病毒粒子是分离的病毒粒子，该病毒粒子具有来自AAV8血清型的至少VP1和来自与AAV8不同的血清型的病毒结构蛋白(VP2和/或VP3)之一，其中VP2和/或VP3来自任何AAV血清型，其中天然AAV载体穿过BBB。例如，本文所述的AA8单倍体病毒粒子可以包含来自AAV8的VP1以及来自如下的VP2或VP3或VP2和VP3两者：AAV9、AAV7(登录号AF513852，其是AAV7的全基因组)、rAAVrh74、rAAVrh.39、rAAVrh.43或其变体。
在一个实施方式中，AAV8病毒粒子是分离的病毒粒子，该病毒粒子具有来自AAV8血清型的至少VP1和来自与AAV8不同的血清型的病毒结构蛋白(VP2和/或VP3)之一，其中VP2和/或VP3来自任何非人灵长类AAV血清型。例如，VP1仅来自AAV8，而VP2和/或VP3来自恒河猴。例如，本文所述的AA8单倍体病毒粒子可以包含来自AAV8的VP1以及来自如下的VP2或VP3或VP2和VP3两者：rAAVrh.10、rAAVrh.74、rAAVrh.39或rAAVrh.43或其变体。在整个申请中，本文描述的病毒粒子可以表示为AAV(VP1)-VP2-VP3，或者可替换地表示为“AAVnnn”。例如，仅出于说明的目的，具有来自AAV8的VP1、来自AAV8的VP2和来自AAVrh.10的VP3的病毒粒子可以表示为AAV8-8-rh10或AAV88rh10。因此，使用该命名法，本文中的示例性AAV8单倍体病毒粒子包括但不限于AAV8-8-rh10、AAV8-8-rh74、AAV8-8-rh39、AAV8-8-rh43或其变体，其中VP1和VP2衣壳蛋白来自AAV8，并且VP3来自所示的血清型。其他示例性AAV8单倍体载体包括但不限于AAV8-X-rh10、AAV8-X-rh74、AAV8-X-rh39、AAV8-X-rh43或其变体，其中X是来自除AAV8以外的任何血清型的VP2。在一些实施方式中，X是来自任何恒河猴AAV血清型的VP2衣壳蛋白，包括但不限于AAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh.39或rAAVrh.43或其变体。
在本文的一些实施方式中，可以构建病毒粒子，其中VP1衣壳蛋白来自AAV8，并且VP2或VP3病毒蛋白中的至少一种不来自AAV8。在一些实施方式中，VP1和VP2可以来自AAV8血清型。在本文公开的所有实施方式中，VP3不是来自AAV8。在一些实施方式中，VP2和VP3来自相同的血清型，例如AAV8-rh10-rh10。在一些实施方式中，VP2和VP3来自不同的血清型，例如AAV8-8-rh10或AAV8-rh74-rh10。在本文所述的所有实施方式的各方面中，至少需要来自AAV8的VP1和来自另一血清型的VP3衣壳蛋白来形成能够包封AAV基因组的病毒粒子。对于每个病毒粒子，衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3)，该蛋白是相同类型的(例如，所有病毒粒子都包含AAV8 VP1)。在一些实施方式中，所述病毒衣壳蛋白的至少一种是嵌合病毒蛋白，并且其他两种病毒蛋白中的至少一种不是嵌合的。在一些实施方式中，VP1是嵌合的AAV8 VP1蛋白。在一些实施方式中，VP1和VP2是嵌合的，并且只有VP3是非嵌合的。例如，仅由来自嵌合的AAV2/8(AAV2的N末端和AAV8的C末端)的VP1/VP2组成的病毒粒子与仅来自任何其它非AAV8载体(例如rh10、rh74等)的VP3配对。在另一个实施方式中，仅VP3是嵌合的，而VP1和VP2是非嵌合的。在另一个实施方式中，至少一种病毒蛋白来自完全不同的血清型。在另一个实例中，不存在嵌合体。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体病毒粒子是AAV8单倍体病毒粒子，并且可以选自以下中的任一种：AAV88rh10、AAV88rh74、AAV88rh74vv、AAV88rh10LP2、AAV88rh74LP2、AAV88rh74vvLP2，其各自在本文提供的实施例部分中描述。在一些实施方式中，这些AAV8单倍体病毒粒子可以表示为AAV8-8-rh10、AAV8-8-rh74、AAV8-8-rh74vv、AAV88-rh10LP2、AAV8-8rh74LP2、AAV8-8-rh74vvLP2。仅作为解释，这些AAV单倍体病毒粒子包含AAV8VP1和VP2结构蛋白(例如，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)或包含SEQ ID NO:7或SEQID NO:8的修饰蛋白，以及选自以下中的任一种的VP3蛋白：rh10 VP3(SEQ ID NO:1)、rh74VP3(SEQ ID NO:3)、rh74vv VP3(SEQ ID NO:2)、rh10-LP2 VP3蛋白(SEQ ID NO:14)、rh74-LP2 VP3蛋白(SEQ ID NO:17)、以及rh74vv-LP2 VP3蛋白(SEQ ID NO:15)，或具有与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18中的任一个至少85％序列同一性的氨基酸序列的VP3蛋白。在一些实施方式中，经修饰的AAV8 VP1或VP2蛋白包含在VP1和/或VP2蛋白中的适当位点处的肽插入，包括但不限于如本文所公开的靶向肽或BBB穿透肽。在一些实施方式中，接头、例如肽接头可以侧接于靶向肽(即，靶向肽的每一端可以包含肽接头)，或者存在位于靶向肽的一端的肽接头。在一些实施方式中，AAV8 VP1和/或VP2结构蛋白被修饰为双突变体(Y444+733F)或三突变体(Y444+733FT494V)，如Gilkes Site-specific modifications to AAV8 capsid yields enhancedbrain transduction in the neonatal MPS IIIB mouse.Gene Ther(2020)中所公开的，其中该非专利出版物通过引用整体并入本文。其中该非专利出版物通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，仅产生含有来自AAV8的VP1衣壳蛋白和来自与AAV8不同的血清型的VP3衣壳蛋白的病毒粒子。例如，VP1和VP2来自AAV8血清型，并且VP3仅来自可替换的血清型。在其他实施方式中，VP1来自AAV8血清型，并且VP2和VP3仅来自另一血清型，其中VP2和VP3衣壳蛋白来自穿过BBB的血清型和/或是非人灵长类AAV血清型。在另一个实施方式中，仅产生其中VP1来自AAV8血清型、VP2来自第二血清型且VP3来自又一血清型的粒子，并且在本文中被称为多倍体AAV8病毒粒子。
这可以通过例如位点特异性缺失和/或添加、改变剪接供体位点、剪接受体位点、起始密码子及其组合来实现。
这允许方法用于产生实质上同类的多倍体病毒粒子(例如单倍体粒子)的群。
在一些实施方式中，示例性AAV8单倍体载体选自以下：
a.AAV8-8-rhY(其中Y是来自非人灵长类AAV血清型的VP3，包括恒河猴)，
b.AAV8-8-rh10，
c.AAV8-X-rh10，其中X是除Rh10以外的任何血清型；
d.AAV8-X-rh10，其中X是除AAV8以外的任何血清型；
e.AAV8-8-rh74，
f.AAV8-8-rh74vv，其中rh74 VP3衣壳蛋白包含W581VV修饰；
g.AAV8-X-rh74或rh74vv，其中X是除Rh74以外的任何血清型；
h.AAV8-X-rh74/rh74vv，其中X是除AAV8以外的任何血清型；
i.AAV8-8-Y，其中Y是来自穿过BBB的任何血清型的VP3衣壳蛋白(例如，穿过BBB的示例性VP3衣壳蛋白可选自AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7(登录号AF513852，其为AAV7的全基因组)、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43)；
j.AAV8-X-Y，其中X是除AAV8之外的任何血清型，并且其中Y是来自穿过BBB的任何血清型的VP3，并且其中Y不来自AAV8；
k.AAV8-X-Y，其中X是穿过BBB的任何血清型，其中Y是来自穿过BBB的任何血清型的VP3，并且其中X和Y分别不是来自AAV8血清型的VP2或VP3衣壳蛋白，其中穿过BBB的血清型可选自AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7(登录号AF513852，其为AAV7的全基因组)、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39和rAAVrh43)；
l.AAV8-X-X，其中X是穿过BBB的任何血清型，并且其中X不是分别来自AAV8血清型的VP2或VP3衣壳蛋白，其中穿过BBB的血清型可以选自AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7(登录号AF513852，其为AAV7的全基因组)、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43；
m.AAV8-X-Y，其中X是除AAV8之外的任何血清型，并且其中Y是来自穿过BBB的任何血清型的VP3，并且其中Y不来自AAV8。
在一些实施方式中，表4中公开了穿过BBB的示例性AAV单倍体载体。
表4：示例性合理多倍体或多倍体载体，其中VP3来自穿过BBB的血清型(例如，选自AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAVrh39中的任一种)，并且VP1和/或VP2来自与VP3的血清型不同的血清型，并且也可以来自穿过BBB或选自AAV8或X的血清型，其中X是非AAV8的血清型并且可以选自表1中的任何血清型。
(i)AAV8-8-rh10单倍体载体
在一些实施方式中，示例性AAV单倍体载体是AAV8-8-rh10，其中VP1和VP2仅来自AAV8血清型，并且VP3仅来自恒河猴AAV10(AAVrh10)血清型。在一些实施方式中，VP3衣壳蛋白是来自AAVrh10血清型的嵌合的VP3蛋白。在一些实施方式中，AAV8-8-rh10单倍体载体包含VP3衣壳蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1是来自AAVrh10的密码子优化的VP3衣壳蛋白的氨基酸。在一些实施方式中，VP3是经修饰的VP3蛋白，该蛋白包含选自以下的至少1种、或至少2种或至少3种修饰：SEQ ID NO:1的Q214N、S462N和D517E。包含来自AAVrh10血清型的VP3的氨基酸的SEQ ID NO:1由SEQ ID NO:5的核酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少95％或至少98％核酸序列同一性的变体编码。
在一些实施方式中，示例性AAV8单倍体载体是AAV8-8-rh10，其中VP1和VP2由SEQID NO:6的核酸序列编码，其包含M203V和M211V、M204和/或M212、M204和/或M212，使得来自AAV8血清型的VP3蛋白不被表达。在一些实施方式中，核酸变体包括位于SEQ ID NO:6的412-414位的ACG中的至少一个碱基的修饰，以破坏或使VP2的起始密码子(苏氨酸(T或Thr))不可操作，使得SEQ ID NO:6的核酸仅编码AAV8血清型的VP1，而不编码来自AAV8血清型的VP2或VP3。在这样的实施方式中，AAV8单倍体载体可包含来自不同血清型(例如，AAVrh血清型)的VP2蛋白，或者可替换地，如本文所讨论的，VP2可不存在于AAV8单倍体中，使得来自AAV8血清型的VP3蛋白不表达。在一些实施方式中，核酸变体包括位于SEQ ID NO:6的412-414位的ACG中的至少一个碱基的修饰，以破坏或使VP2的起始密码子(苏氨酸(T或Thr))不可操作，使得SEQ ID NO:6的核酸仅编码AAV8血清型的VP1，而不编码来自AAV8血清型的VP2或VP3。在这样的实施方式中，AAV8单倍体载体可以包含来自不同血清型(例如，AAVrh血清型)的VP2蛋白，或者可替换地，如本文所讨论的，VP2可以不存在于AAV8单倍体中。
如本文实例所示，与亲代AAV8相比，合理多倍体AAV8-8-rh10产生较少的体液应答(图25A)，表明该AAV8-8-rh10单倍体与亲代AAV8载体相比具有不同且较少的抗原谱。图8B和图10C还表明，AAV8-8-r h10的产量和比生产率与AAV8或AAVrh10对照相当。
在一些实施方式中，AAV8-8-rh10单倍体是使用SEQ ID NO:12的质粒产生的，该质粒包含SEQ ID NO:13的构建体。
(ii)AAV8-8-rh74单倍体载体
在一些实施方式中，示例性AAV单倍体载体是AAV8-8-rh74，其中VP1和VP2仅来自AAV8血清型，并且VP3仅来自恒河猴AAV74(AAVrh74)血清型。在一些实施方式中，VP3衣壳蛋白是来自AAVrh74血清型的嵌合的VP3蛋白。在一些实施方式中，AAV8-8-rh74单倍体载体包含VP3衣壳蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:3是来自AAVrh74的野生型VP3衣壳蛋白的氨基酸。
在一些实施方式中，rh74 VP3是包含至少1个或多个氨基酸修饰的经修饰的VP3蛋白。在具体实施方式中，AAVrh74 VP3衣壳蛋白是包含W581VV修饰的经修饰的VP3蛋白，其中SEQ ID NO:3的氨基酸位点581处的色氨酸(W或Trp)被两个连续的缬氨酸(V或val)氨基酸取代(使用来自AAVrh74的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列的命名/编号)。因此，在一些实施方式中，AAV单倍体载体是包含VP3衣壳蛋白的AAV8-8-rh74vv单倍体载体，所述衣壳蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2有至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:2是rh74vv-VP3衣壳蛋白的氨基酸，其包含W581VV修饰。
包含rh74vv-VP3衣壳蛋白的氨基酸的SEQ ID NO:2由SEQ ID NO:4的核酸序列编码。
在一些实施方式中，AAV单倍体载体是包含VP3衣壳蛋白的AAV8-8-rh74vv单倍体载体，所述VP3衣壳蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:2是包含W581VV修饰的rh74vv-VP3衣壳蛋白的氨基酸，并且其中所述rh74vv-VP3衣壳蛋白由如下编码：包含SEQ ID NO:4的核酸序列，或与SEQ ID NO:4具有至少85％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的序列同一性的核酸序列。
在本文任何方面的一个实施方式中，AAV8-8-rh74vv单倍体载体中的AAVrh74 VP3蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的蛋白，或其中突变的AAVrh74 VP3包含SEQ ID NO:2的以下修饰中的至少一种：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H、N736P。
在本文任何方面的一个实施方式中，AAV8-8-rh74vv单倍体载体中的AAVrh10 VP3蛋白由SEQ ID NO:5的核酸编码，与SEQ ID NO:5的AAVrh10_VP3核酸相比，包含Q214N、S462N和D517E突变中的至少一个或多个，或包含与SEQ ID NO:5有至少85％序列同一性的核酸序列，其包含选自Q214N、S462N和D517E的至少一种突变。
在本文任何方面的一个实施方式中，AAV8-8-rh74vv单倍体载体中的AAVrh74 VP3蛋白包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的蛋白，或包含SEQ ID NO:2的以下氨基酸修饰中的至少一种：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H、N736P。
重要的是，如本文在实施例和图30B-图30C中所公开的，与用亲代AAV血清型免疫的小鼠相比，单倍体AAV8-8-rh74载体具有改善的转导大脑和脊髓以及穿过BBB的能力。
重要的是，如本文实施例中所公开的，单倍体AAV8-8-rh74载体具有改善的从用亲代血清型免疫的血清中逃避中和抗体的能力。重要的是，在全身性施用后，比起亲代AAV8或AAVrh10血清型，AAV8-8-rh74在转导整个小鼠身体方面出乎预料地更有效，并且比单倍体AAV8-8-rh10更有效(参见例如，图21A-图21D)。此外，与AAV8相反，AAV8-8-rh74显示出穿过血脑屏障的能力，因此与其亲代AAV8相比，AAVrh10显示出预料不到的结果并且与AAV8单倍体显示出的表型不同。此外，单倍体载体AAV8-8-rh74转导Pro10细胞的效率与AAV8对照相似，并且重要的是，比起亲代载体AAV8，该单倍体载体转导GM16095细胞显著更高效。此外，发现AAV8-8-rh74单倍体逃避抗AAV8中和抗体(参见图18A-图18B；图19)，并且与亲代AAV8相比产生较少的体液应答(图25A)，表明该AAV8-8-rh74单倍体与亲代AAV8载体相比具有不同且较少的抗原谱。
在一些实施方式中，AAV8-8-rh74单倍体是使用SEQ ID NO:10的质粒产生的，该质粒包含SEQ ID NO:11的构建体。
V.AAV单倍体或多倍体衣壳的变体
在一些实施方式中，本文涵盖的AAV单倍体或多倍体病毒粒子可由多于典型的3种病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3形成(参见例如，Wang，Q.等，“Syngeneic AAV Pseudo-particles Potentiate Gene Transduration of AAV Vectors”，Molecular Therapy:Methods and Clinical Development，Vol.4,149-158(2017))。这样的AAV单倍体或多倍体病毒衣壳也落入本发明的范围内。例如，分离的AAV病毒粒子具有足以形成包封AAV基因组的AAV单倍体或多倍体病毒粒子的病毒衣壳结构蛋白，其中VP1来自表1中列出的任何AAV血清型，并且VP3来自穿过BBB的任何血清型。在进一步的实施方式中，分离的AAV单倍体或多倍体病毒粒子具有至少两种病毒结构蛋白，该蛋白来自于由AAV衣壳蛋白VP1、VP1.5和VP3所组成的组，其中这两种病毒蛋白足以形成包封AAV基因组的AAV单倍体或多倍体，并且其中VP1或VP1.5来自表1中列出的任何AAV血清型，并且VP3来自穿过BBB的任何血清型。例如，VP1.5可以来自表1中列出的任何AAV血清型，并且VP3可以来自穿过BBB的AAV血清中的任何一种或多种，包括但不限于AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43。
在一些实施方式中，本发明的衣壳包含衣壳蛋白VP1.5，其中所述衣壳蛋白VP1.5不是来自与VP1相同的血清型或与VP3衣壳蛋白相同的血清型。在一些实施方式中，本文所述的AAV单倍体或多倍体衣壳蛋白可包含本文所述的衣壳蛋白VP2。
在一些实施方式中，本发明的衣壳包含衣壳蛋白VP2，其中所述衣壳蛋白VP2选自以下的任一种：AAV8血清型或表1中列出的任何血清型，或与衣壳的VP3蛋白相同的血清型，或者与用于VP3的血清型不同的血清型。在一些实施方式中，本文所述的合理多倍体AAV载体可包含衣壳蛋白VP1.5。VP1.5描述于美国专利公开No.2014/0037585中，并且本文提供了VP1.5的氨基酸序列。
因此，在某些实施方式中，病毒结构蛋白中的至少一种(例如VP1、VP2或VP3)可以是嵌合病毒结构蛋白，即，可以包含来自多于一种的蛋白的区段。在一个实施方式中，嵌合病毒结构蛋白全部来自相同血清型。在另一个实施方式中，嵌合病毒结构蛋白由来自多于一种的血清型的成分组成，但这些血清型不同于至少一种其他血清型。在一个实施方式中，病毒结构蛋白不是嵌合的。在一个实施方式中，嵌合AAV结构蛋白不包含来自犬细小病毒的结构氨基酸。在一个实施方式中，嵌合AAV结构蛋白不包含来自b19细小病毒的结构氨基酸。在一个实施方式中，嵌合AAV结构蛋白不包含来自犬细小病毒或b19细小病毒的结构氨基酸。在一个实施方式中，嵌合AAV结构蛋白仅包含来自AAV的结构氨基酸。在一些实施方式中，合理多倍体AAV载体不包含嵌合VP1蛋白。在一些实施方式中，合理多倍体AAV载体包含嵌合VP1蛋白，例如来自AAV8血清型的嵌合VP1蛋白。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV病毒粒子可以由多于典型的3种病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3形成(参见例如，Wang，Q.等，“Syngeneic AAV Pseudo-particlesPotentiate Gene Transduction of AAV Vectors”，Molecular Therapy:Methods andClinical Development，Vol.4,149-158(2017))。这样的病毒衣壳也落入本发明的范围内。例如，一种分离的AAV病毒粒子，该病毒粒子具有足以形成包封AAV基因组的AAV病毒粒子的病毒衣壳结构蛋白，其中至少一种病毒衣壳结构蛋白不同于其他病毒衣壳结构蛋白，并且其中各病毒衣壳结构蛋白仅为相同类型。在进一步的实施方式中，分离的AAV病毒粒子具有至少两种病毒结构蛋白，该蛋白选自于由AAV衣壳蛋白VP1、VP2、VP1.5和VP3所组成的组，其中这两种病毒蛋白足以形成包封AAV基因组的AAV病毒粒子，并且其中所存在的病毒结构蛋白中的至少一种来自与另外的病毒结构蛋白不同的血清型，并且其中VP1仅来自一种血清型，VP2仅来自一种血清型，并且VP3仅来自有效穿过BBB的一种血清型。在一个实施方式中，所述合理多倍体包含VP1.5。仅出于示例性目的，VP1.5可以来自AAV血清型8，并且VP3可以来自穿过BBB的AAV血清型和/或可替换地来自AAVrh血清型。
在一些实施方式中，仅产生如下的病毒粒子，该病毒粒子含有来自一种血清型(例如，表1中列出的血清型)的VP1衣壳蛋白以及来自与VP1的血清型不同的血清型的VP3衣壳蛋白，并且其中AAV血清型有效穿过BBB。例如，VP1和VP2可以来自表1中列出的任何血清型、例如AAV8血清型，而VP3仅来自穿过BBB的替代血清型。在其他实施方式中，VP1仅来自一种血清型(例如，AAV8血清型)，而VP2和VP3仅来自另一血清型，其中VP2和VP3衣壳蛋白来自穿过BBB的血清型。在另一个实施方式中，仅产生如下颗粒，在该颗粒中VP1来自表1中列出的血清型(例如，AAV8血清型)、VP2仅来自第二血清型、并且VP3仅来自穿过BBB的又一血清型，并且在本文中称为多倍体AAV8病毒粒子。
这可以通过例如位点特异性缺失和/或添加、改变剪接供体位点、剪接受体位点、起始密码子及其组合来实现。
这允许方法用于产生实质上同类的多倍体病毒粒子的群(例如单倍体粒子的群)。
在一些实施方式中，本文的技术还提供了AAV衣壳，其中所述衣壳以任意组合包含衣壳蛋白VP1和衣壳蛋白VP2，其中所述衣壳蛋白VP1来自一种或多种第一AAV血清型，其中所述衣壳蛋白VP2来自一种或多种第二AAV血清型，并且其中至少一种所述第一AAV血清型不同于至少一种所述第二AAV血清型，并且其中VP1、VP2或VP3中的至少一种来自穿过BBB的血清型，或者可替换地来自非人灵长类AAV血清型、例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型。在一些实施方式中，病毒粒子中不存在嵌合病毒结构蛋白。
VI.VP1和VP3衣壳蛋白的修饰
本发明进一步提供了一种组合物，该组合物可以是药学制剂，包含本发明的衣壳蛋白、衣壳、病毒载体、AAV颗粒组合物和/或药学制剂以及药学上可接受的载体。
在一些非限制性实例中，本发明提供了AAV衣壳蛋白(VP1、VP1.5、VP2和/或VP3)，该衣壳蛋白包含三重轴环4(three-fold axis loop4)中的氨基酸序列的修饰(Opie等，J.Viral.77:6995-7006(2003))以及病毒衣壳和包含经修饰的AAV衣壳蛋白的病毒载体。本文公开的合理多倍体或多倍体AAV载体包含来自穿过BBB的AAV血清型的至少一种VP结构蛋白(例如，来自穿过BBB的血清型的VP3)，与亲代AAV载体相比，在全身性或鞘内递送后具有不同的转导特性，并且出乎预料的是，在鞘内或全身性递送之后具有增加的穿过BBB的能力、和/或具有增加的转导BBB的内皮细胞和/或穿过BBB的血液成分的能力。例如，本文在实施例中公开的AAV8-8-rh74单倍体AAV载体在全身性施用后显示出全身性转导的显著增加，因此增加了各靶组织如骨骼肌、心肌等的转导。
在一个实施方式中，经修饰的AAV衣壳可由通过DNA改组(以通过定向进化开发细胞类型特异性载体)产生的VP1、VP2和/或VP3组成。AAV的DNA改组大致描述于Li，W.等，Mol.Ther.16(7):1252-12260(2008)中，其通过引用并入本文。在一个实施方式中，DNA改组可用于使用来自两种或多种不同的AAV血清型、AAV嵌合体或其他AAV的衣壳基因的DNA序列来产生VP1、VP2和/或VP3。在一个实施方式中，单倍体AAV可以由通过DNA改组产生的VP1、通过DNA改组产生的VP2和/或通过DNA改组生成的VP3组成。在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体病毒粒子的VP1蛋白被修饰，而VP3不是经修饰的蛋白。在一些实施方式中，合理多倍体病毒粒子包含经修饰的VP3蛋白，并且其中VP1未被修饰。在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体病毒粒子包含经修饰的VP1蛋白和经修饰的VP3蛋白。
经修饰的VP1蛋白的实例包括但不限于在VP1蛋白中插入肽。这样的肽包括但不限于作为靶向肽的肽，例如本文公开的靶向CNS或PNS的细胞的肽。在一些实施方式中，靶向肽是透过BBB的肽，例如，如美国专利8748567或9757470中公开的RVG-9R肽或其变体，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，肽可以被插入或取代入选自天然AAV8 VP1衣壳蛋白的氨基酸残基450-480、氨基酸残基575-600之间和/或多倍体病毒粒子的AAV8 VP2衣壳蛋白(基于AAV8 VPI编号的编号)的任意位置，或来自另一AAV的衣壳蛋白的相应位置。
在另一个实施方式中，编码VP1、VP2和/或VP3的核酸可以通过DNA改组产生。在一个实施方式中，通过DNA改组产生的第一核酸将编码VP1。在该同一实施方式中，通过DNA改组产生的第二核酸将编码VP2和VP3。在另一个实施方式中，通过DNA改组产生的第一核酸将编码VP1。在该同一实施方式中，通过DNA改组产生的第二核酸将编码VP2，而第三核酸将编码VP3。在进一步的实施方式中，通过DNA改组产生的第一核酸将编码VP1和VP2，并且通过DNA改组形成的第二核酸将编码VP3。在另外的实施方式中，通过DNA改组产生的第一核酸将编码VP1和VP3，并且通过DNA改组形成的第二核酸将编码VP2。
在本发明的实施方式中，本文公开的合理多倍体载体具有增加的对CNS和/或外周神经系统(PNS)中的一种或多种组织的转导。在一些实施方式中，相对于缺乏有效穿过血脑屏障的能力的非合理多倍体，在体内向受试者全身性或鞘内施用后，本文公开的合理多倍体载体具有增强的对以下的一种或多种的转导：皮层、纹状体、丘脑、髓质、海马体、小脑和脊髓。在一些实施方式中，与亲代AAV载体相比，本文公开的合理多倍体或多倍体载体在大脑和/或脊髓中具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、或95％、或2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍或高于1000倍的转导水平。
在具体的实施方式中，本发明的经修饰的AAV衣壳蛋白包含三重轴环4的氨基酸序列中的一个或多个修饰(例如，天然AAV8 VP1衣壳蛋白的氨基酸位置575至600[包含]或来自另一AAV的衣壳蛋白相应区域)。如本文所用，氨基酸序列中的“修饰”包括替换、插入和/或缺失，其中每一个可以涉及一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸。在具体的实施方式中，所述修饰是替换。例如，在具体的实施方式中，来自一个AAV的三重轴环4的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个氨基酸可以被取代入选自天然AAV8VP1衣壳蛋白的氨基酸残基450-480、氨基酸残基575-600之间和/或多倍体病毒粒子的AAV8 VP2衣壳蛋白的任意位置处(基于AAV8 VP1编号的编号)或来自另一AAV的衣壳蛋白的相应位置处。在一些实施方式中，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个氨基酸可以插入选自天然AAV8 VP1的氨基酸残基450-480、氨基酸残基575-600之间和/或合理多倍体病毒粒子的AAV8 VP2病毒结构蛋白的任意位置处。在一些实施方式中，插入物是肽，包括但不限于靶向肽、或透过BBB的肽。在一些实施方式中，插入物是美国专利8748567或9757470中公开的RVG-9R肽，其通过引用整体并入本文。然而，本发明的经修饰的病毒衣壳不限于其中来自一个AAV衣壳的氨基酸被取代入另一个AAV衣壳中的AAV衣壳，并且所取代和/或插入的氨基酸可以来自任何来源，并且可以进一步是天然存在的、或部分或完全合成的。
如本文所述的，来自多种AAV的衣壳蛋白的核酸和氨基酸序列在本领域中是已知的。因此，对于任何其他AAV，可以容易地确定与天然AAV8衣壳蛋白的氨基酸位置575至600(包含)或氨基酸位置585至590(包含)“对应”的氨基酸(例如，通过使用序列比对)。
在一些实施方式中，本发明预期的是本发明的经修饰的衣壳蛋白可以通过对现在已知或后来发现的任何AAV的衣壳蛋白进行修饰来产生。此外，待修饰的AAV衣壳蛋白可以是天然存在的AAV衣壳蛋白(例如，表1中所示的AAV8、AAVrh10、AAVrh74、AAV3a或AAV3b、AAV9、衣壳蛋白或任何AAV)，但不限于此。本领域技术人员将理解的是，对AAV衣壳蛋白的各种操作在本领域中是已知的，并且本发明不限于对天然存在的AAV衣壳蛋白的修饰。例如，与天然存在的AAV(例如，源自天然存在的AAV衣壳蛋白，例如AAV8、AAVrh10、AAVrh74、AAV3a或AAV3b、AAV9或现在已知或以后发现的任何其它AAV)相比，待修饰的衣壳蛋白可能已经具有改变。这样的AAV衣壳蛋白也在本发明的范围内。
例如在一些实施方式中，待修饰的AAV衣壳蛋白可以包括直接在天然AAV8衣壳蛋白序列的氨基酸264之后的氨基酸插入(参见例如，PCT公开WO 2006/066066)和/或可以是如PCT公开WO 2009/108274中所述的具有经改变的HI环的AAV和/或可以是经修饰以包含poly-His序列来促进纯化的AAV。作为另一个说明性实例，AAV衣壳蛋白可以具有作为插入物或取代物而并入其中的肽靶向序列。此外，AAV衣壳蛋白可包含来自另一AAV的大结构域，该大结构域已被取代和/或插入衣壳蛋白中。
因此，在具体的实施方式中，待修饰的AAV衣壳蛋白(例如VP3蛋白)可来源于天然存在的AAV，但进一步包含一个或多个外源序列(例如，对天然病毒而言外源的序列)，所述外源序列被插入和/或取代入衣壳蛋白和/或通过一个或更多个氨基酸的缺失而被改变。
在一些实施方式中，合理多倍体病毒粒子包含AAV恒河猴修饰或突变的VP3结构蛋白，其中VP1和VP2不是AAV恒河猴血清型。在该实施方式的某些方面，经突变的VP3衣壳蛋白是经突变的AAVrh10VP3或经突变的AAVrh74 VP3病毒结构蛋白。在该实施方式的某些方面，AAV恒河猴突变的VP3包含在如下氨基酸处的至少一种突变，该氨基酸对应于选自于由如下所组成的组中的氨基酸：N263、G264、T265、S266、G268、T270、T274、E533、R727和N737，其中所有氨基酸位置对应于天然VP3。在一些实施方式中，AAV恒河猴突变的VP3病毒结构蛋白在对应于AAVrh10的天然VP1序列编号的氨基酸位置N263、G264、T265、S266、G268、T270、T274、E533、R727和N737的氨基酸位置处包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或所有突变。在一些实施方式中，AAV恒河猴rh10突变的VP3包含选自于由以下所组成的组中的突变：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R727H和N737P。在一个示例性实施方式中，AAV恒河猴rh10突变的VP3包含N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R727H和N737P(AAVrh10LP2或rh10LP2)。在一些实施方式中，经修饰的AAVrh10 VP3结构蛋白包含SEQ IDNO:14的氨基酸(rh10-LP2VP3)，或与SEQ ID NO:14具有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性的蛋白。在一些实施方式中，经修饰的AAVrh10 VP3结构蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸(rh10-LP2 VP3)，或与SEQ ID NO:14具有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性的蛋白。
在实施方式的一些方面中，AAV恒河猴突变的VP3包含对应于选自于由N263、G264、T265、S266、G268、T270、T274、E533、R726和N736所组成的组中的氨基酸的氨基酸处的突变，其中所有氨基酸位置对应于AAV rh74的天然VP1序列编号。在一些实施方式中，AAV恒河猴突变的VP3病毒结构蛋白在对应于AAVrh74的天然VP1序列编号的氨基酸位置N263、G264、T265、S266、G268、T270、T274、E533、R726和N736的氨基酸位置处包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或所有突变。
在一些实施方式中，AAV恒河猴rh74突变的VP3包含选自于由以下所组成的组中的突变：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H和N736P。在一个示例性实施方式中，AAV恒河猴rh74突变的VP3包含N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H和N736P(AAVrh74LP2或rh74LP2)。此处的编号基于rh74 VP1编号。在一些实施方式中，经修饰的AAVrh74VP3结构蛋白包含SEQ ID NO:15的氨基酸(rh74vv-LP2-VP3)、或与SEQ ID NO:15具有至少85％、90％、95％或98％序列同一性的蛋白。在实施方式的一些方面中，突变位于VP3病毒结构蛋白的极末端C末端结构域中、或位于VR-IV中、或位于环1(VRI)中。在实施方式的一些方面中，突变位于这些区域中的至少两个区域中。
在实施方式的另一个方面中，经突变的AAVrh74 VP3病毒结构蛋白进一步包含突变，其中位于位置581处的W或色氨酸被两个后随的缬氨酸(VV)残基取代。rh74VP3突变包含W581VV、N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H和N736P，同义地表示为AAVrh74VVLP2(或rh74VVLP2)。在一些实施方式中，本发明的合理多倍体病毒粒子的病毒结构蛋白VP3包含rh74VVLP2。发明人合理设计了包含rh10VP3LP2、rh74VP3LP2和rh74VVP3LP2的多倍体病毒粒子，并且测试了它们的特性，包括它们的抗原性，例如，逃避中和抗体和/或体液免疫应答。在一些实施方式中，用于本文公开的方法和组合物中的合理AAV多倍体病毒粒子选自以下中的任何一种：AAV8-8-rh10、AAV8-8-rh74、AAV8-8-rh74vv、AAV8-8-rh10LP2、AAV8-8-rh74LP2和AAV8-8rh74LP2vv，可互换地称为单倍体AAV8-8-rh10、AAV8-8-rh74、AAV8-8-rh74vv、AAV8-8-rh10LP2，AAV8-8-rh74LP2，AAV8-8-rh74LP2vv病毒粒子。
在本发明的所有方面中，VP1、VP2、VP3病毒结构蛋白与VP1、VP2、VP3衣壳蛋白互换使用。换句话说，术语“病毒衣壳蛋白”和“病毒结构蛋白”在本文中互换使用，并指VP1、VP2、VP3病毒结构蛋白(或结构病毒蛋白)。
因此，当在本文中提及特定的AAV衣壳蛋白(例如，选自AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh4中的任何一种的VP3蛋白)、或来自表1中所示的任何AAV的VP1或VP2衣壳蛋白等时，其旨在涵盖天然衣壳蛋白以及具有除本发明的修饰之外的改变的衣壳蛋白。这种改变包括替换、插入和/或缺失。在具体的实施方式中，与天然AAV衣壳蛋白序列相比，衣壳蛋白包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个、少于20个、少于30个、少于40个、少于50个、少于60个或少于70个插入其中的氨基酸(本发明的插入物除外)。在本发明的实施方式中，与天然AAV衣壳蛋白序列相比，衣壳蛋白包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个、少于20个、少于30个、少于40个、少于50个、少于60个或少于70个氨基酸取代(根据本发明的氨基酸取代除外)。在本发明的实施方式中，与天然AAV衣壳蛋白序列相比，衣壳蛋白包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个、多于20个、多于30个、多于40个、多于50个、多于60个或多于70个氨基酸的缺失(除本发明的氨基酸缺失之外)。
使用AAV血清型8作为本文公开的合理多倍体载体的VP1和VP2的示例性血清型，M1是VP1起始密码子，T138是VP2起始密码子，并且M203和M211是VP3起始密码子。虽然起始密码子的缺失(通常通过M1和T138的替换)将使VP1和VP2的表达不起作用，但VP3起始密码子的类似的缺失是不足够的。这是因为病毒衣壳ORF包含许多具有不同强度的ATG密码子作为起始密码子。因此，在设计不表达VP3的构建体时，必须注意确保不产生替换的VP3物种。关于VP3，需要消除M204和M212，或者如果期望VP2，但不需要VP3，则M204和M212的缺失通常是最好的方法(Warrington，K.H.Jr.，等，J.of Virol.78(12):6595-6609(2004年6月))。这可以通过突变(如取代)、或本领域已知的其他方法来实现。可以很容易地确定其他血清型中的相应的起始密码子，以及额外的ATG序列(例如VP3)是否可以用作替代的起始密码子。
因此，例如，术语“AAV8衣壳蛋白”包括具有天然AAV8衣壳蛋白序列的AAV衣壳蛋白(参见天然AAV8 VP1衣壳蛋白：GenBank登录号AF513852.1，蛋白ID:AAN03856.1)，以及在天然AAV8衣壳蛋白序列中包含替换、插入和/或缺失(如前一段所述)的那些。
在具体的实施方式中，AAV衣壳蛋白具有天然AAV衣壳蛋白序列或具有与天然AAV衣壳蛋白序列至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相似或相同的氨基酸序列。例如，在具体的实施方式中，“AAV8”衣壳蛋白涵盖天然AAV8衣壳蛋白序列以及与天然AAV8衣壳蛋白序列至少约75％、80％、<85％、90％、95％、97％、98％或99％相似或相同的序列。
确定两个或多个氨基酸序列之间的序列相似性或同一性的方法是本领域已知的。序列相似性或同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定，包括但不限于Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2，482(1981)的局部序列同一性算法；通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48，443(1970)的序列同一性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup，575Science Drive，Madison，Wis.)，通过Devereux等，Nucl.Acid Res.12，387-395(1984)描述的最佳拟合序列程序，或通过检查。
另一种合适的算法是BLAST算法，描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215，403-410，(1990)和Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，5873-5787(1993)。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其获取自Altschul等，Methods in Enzymology，266，460-480(1996)；blast.wustl/edu/blast/README.html。WU-BLAST-2使用多个检索参数，其可选地被设置为默认值。参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和检索感兴趣的序列所依据的特定数据库的组成来建立；然而，可以调整这些值以增加灵敏度。
此外，额外的有用的算法是空位BLAST(gapped BLAST)，如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25，3389-3402所报道的。
本发明还提供了一种病毒衣壳，该病毒衣壳包含本发明的经修饰的AAV衣壳蛋白、基本上由或由本发明的经修饰的AAV衣壳蛋白组成。在具体的实施方式中，病毒衣壳是细小病毒衣壳，其可以进一步是自主性细小病毒衣壳或依赖性病毒衣壳。任选地，所述病毒衣壳是AAV衣壳。在具体的实施方式中，AAV衣壳包含VP3蛋白以及VP1和/或VP2，和/或通过一个或多个插入、替换和/或缺失而来源于前述任一者，所述VP3蛋白选自AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43中的任一种，所述VP1和/或VP2来自表1中所示的任何其它AAV或已知或后来发现的其它AAV。
在本发明的实施方式中，分离的AAV病毒粒子或实质上同类的AAV病毒粒子的群不是表达一种血清型的VP1、VP2和VP3的一种核酸辅助质粒与表达另一血清型的VP1、VP2和VP3的另一核酸辅助质粒的混合物的表达产物，这种表达被称为“变装(cross-dressing)”。
在本发明的实施方式中，分离的AAV病毒粒子不包含镶嵌衣壳，并且实质上同类的AAV病毒粒子的群不包括实质上同类的镶嵌衣壳的群。
VI.用于治疗CNS紊乱和疾病的合理多倍体AAV载体
在一些实施方式中，合理多倍体载体可包含衣壳，所述衣壳包含靶向序列(也称为靶肽)(例如，被取代入或插入病毒衣壳中)，所述靶向序列引导病毒衣壳与存在于期望的靶组织上的细胞表面分子相互作用(参见例如，国际专利公开号WO 00/28004和Hauck等，(2003)J.Virology 77:2768-2774)；Shi等，Human Gene Therapy 17:353-361(2006)[描述了整合素受体结合基序RGD在AAV衣壳亚基的520和/或584位置处的插入]；以及美国专利No.7314912[描述了在AAV2衣壳亚基的氨基酸位置447、534、573和587之后插入含有RGD基序的P1肽])。AAV衣壳亚基内耐受插入的其他位置在本领域中是已知的(例如Grifman等，Molecular Therapy 3:964-975(2001)描述的位置449和588)。
例如，本发明的一些病毒衣壳对大多数感兴趣的靶组织(例如，肝、骨骼肌、心脏、膈肌、肾、脑、胃、肠、皮肤、内皮细胞和/或肺)具有相对低效的向性。靶向序列可被有利地并入到这些低转导载体中，从而赋予病毒衣壳期望的向性，并且任选地赋予对特定组织的选择性向性。例如在国际专利公开WO 00/28004中描述了包含靶向序列的AAV衣壳蛋白、衣壳和载体。作为另一种可能性，如Wang等，Annu Rev Biophys Biomol Struct.35:225-49(2006))所述的一种或多种非天然存在的氨基酸可在正交位点处被并入AAV衣壳亚基中，作为将低转导载体重定向到期望的靶组织的手段。这些非天然氨基酸可以有利地用于将感兴趣的分子与AAV衣壳蛋白化学连接，包括但不限于：聚糖(甘露糖树突细胞靶向)；RGD、铃蟾肽或神经肽，用于靶向递送至特定癌症细胞类型；选自靶向特定的细胞表面受体(如生长因子受体、整合素等)的噬菌体展示的RNA适体或肽。化学修饰氨基酸的方法是本领域已知的(参见例如，Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，第1版，Academic Press，1996)。
在代表性实施方式中，靶向序列可以是将感染导向特定细胞类型的病毒衣壳序列(例如，自主性细小病毒衣壳序列、AAV衣壳序或任何其他病毒衣壳序列)。
B19使用红细胞糖苷脂作为其受体感染原代红系祖细胞(Brown等，(1993)Science262:114)。B19的结构已被确定为分辨率(Agbandje McKenna等，(1994)Virology 203:106)。B19衣壳与红细胞糖苷脂结合的区域已被映射在氨基酸399-406之间(Chapman等，(1993)Virology 194:419)，这是β桶结构E和F之间的环状区域(Chipman等，(1996)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 93:7502)。因此，B19衣壳的红细胞糖苷脂受体结合结构域可以被取代入AAV衣壳蛋白中，以将病毒衣壳或包含该病毒衣壳的病毒载体靶向至红系细胞。
在代表性的实施方式中，外源靶向序列可以是编码改变病毒衣壳或包含经修饰的AAV衣壳蛋白的病毒载体的向性的肽的任何氨基酸序列。在具体实施方式中，靶向肽或蛋白可以是天然存在的，或者可替换地，完全或部分合成的。示例性靶向序列包括与细胞表面受体和糖蛋白结合的配体和其他肽，例如RGD肽序列、缓激肽、激素、肽生长因子(例如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子I和II等)、细胞因子、黑色素细胞刺激激素(例如，α、β或γ)、神经肽和内啡肽等，及其保留将细胞靶向至其同源受体的能力的片段。其他示例性的肽和蛋白质包括P物质、角质细胞生长因子、神经肽Y、胃泌素释放肽、白细胞介素2、鸡蛋清溶菌酶、红细胞生成素、性腺激素、皮质抑素、β-内啡肽、亮氨酸脑啡肽、rimorphin、α-新脑啡肽、血管紧张素、pneumadin、血管活性肠肽、神经降压素、胃动素及其片段，如上所述。作为另一种选择，来自毒素(例如破伤风毒素或蛇毒素，如α-银环蛇毒素等)的结合结构域可以被取代入作为靶向序列的衣壳蛋白中。在又一个代表性实施方式中，AAV衣壳蛋白可以通过将如Cleves(Current Biology 7:R318(1997))所描述的“非经典”输入/输出信号肽(例如，成纤维细胞生长因子-1和-2、白细胞介素1、HIV-1Tat蛋白、疱疹病毒VP22蛋白等)取代入AAV衣衣壳蛋白中来修饰。还在考虑之列的是直接被特定细胞摄取的肽基序，例如FVFLP肽基序(SEQ ID NO:26)触发肝细胞摄取。
噬菌体展示技术以及本领域已知的其他技术可用于鉴定识别任何感兴趣的细胞类型的肽。
靶向序列可以编码靶向至细胞表面结合位点的任何肽，包括受体(例如，蛋白质、碳水化合物、糖蛋白或蛋白聚糖)。细胞表面结合位点的实例包括但不限于硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和其他糖胺聚糖，在粘蛋白、糖蛋白和神经节苷脂上发现的唾液酸部分，MHC I糖蛋白、在膜糖蛋白上发现的碳水化合物组分，包括甘露糖、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、半乳糖等。
在具体的实施方式中，硫酸乙酰肝素(HS)或肝素结合结构域被取代入病毒衣壳中(例如，在不与HS或肝素结合的AAV中)。本领域已知的是HS/肝素结合是由富含精氨酸和/或赖氨酸的“碱性斑块(basic patch)”介导的。在示例性实施方式中，基序BXXB之后的序列，其中“B”是碱性残基，且X是中性和/或疏水性的。作为一个非限制性实例，BXXB是RGNR(SEQID NO:27)。在具体实施方式中，BXXB取代天然AAV2衣壳蛋白中的氨基酸262至265位或另一AAV衣壳蛋白中的相应位置。
作为又一替代方案，靶向序列可以是可用于化学偶联(例如，可包括精氨酸和/或赖氨酸残基，该残基可通过其R基团化学偶联)至另一分子的肽(靶向进入细胞的进入物)。
作为另一种选择，本发明的AAV衣壳蛋白或病毒衣壳可包含WO 2006/066066中所描述的突变。例如，衣壳蛋白可包含天然AAV2衣壳蛋白的263、705、708和/或716位的选择性氨基酸取代，或来自另一AAV的衣壳蛋白中的相应变化。另外或可替换地，在代表性实施方使中，衣壳蛋白、病毒衣壳或载体包括直接在AAV2衣壳蛋白的氨基酸264位之后的选择性氨基酸插入，或来自其他AAV的衣壳蛋白中的相应变化。通过“直接在氨基酸位置X之后”，意味着插入紧接在所示出的氨基酸位置之后(例如，“在氨基酸264位之后”表示在265位的点插入或更大的插入，例如，从265位到268位等)。本发明的前述实施方式可用于将异源核酸递送至本文所述的细胞或受试者。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体载体可用于将异源核酸递送至细胞，包括CNS和/或外周神经系统中的神经元和非神经元细胞。在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体载体用于治疗与CNS组织或细胞和/或PNS组织或细胞中的基因的异常基因表达相关的医学病症或疾病。CNS细胞可以是例如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞或小胶质细胞。CNS组织可以是例如受试者的皮层、纹状体、丘脑、髓质、海马体、中脑、浦肯野组织、小脑和脊髓，包括颈部、腰椎、脊髓和髓质，以及CNS的脉络丛。
例如，本文公开的合理多倍体或单倍体载体可用于治疗脑部疾病，包括脑部癌症和脑癌(例如，胶质母细胞瘤)、神经退行性疾病，包括但不限于阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多巴胺转运体缺乏综合征(一种儿童帕金森综合征，由单一基因DAT1/SLC6A3的功能缺失突变引起)。待使用本文公开的合理多倍体或单倍体载体治疗的CNS的其他医学病症或疾病包括例如神经系统疾病和/或紊乱。这类神经系统疾病和/或紊乱包括但不限于例如：多巴胺转运体缺乏综合征、注意力缺陷/多动障碍(ADHD)、双相情绪障碍、癫痫、多发性硬化症、τ蛋白病(tauopathies)、Krabbe病、肾上腺脑白质营养不良、运动神经元疾病、大脑性瘫痪、Batten病、戈谢病、Tay Sachs病、Rett综合征、Sandhoff病、夏科-马里-图思病、天使综合征(Angelman syndrome)、Canavan病、晚期婴儿型神经元蜡样脂褐质沉积症、IIIA型粘多糖贮积症、IIIB型粘多糖贮积症、异染性脑白质营养不良、遗传性溶酶体贮积症(如C1型尼曼匹克病)和/或神经元蜡样质脂褐质沉积症(如Batten病、进行性核上性麻痹、皮质基底节综合征和脑癌(包括星形细胞瘤和胶质母细胞瘤))。在本发明的一些优选实施方式中，基因编码治疗性表达产物(任选地在CNS中)，优选适用于治疗与异常基因表达相关的疾病或病症的治疗性多肽。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体载体可用于表达用来治疗CNS疾病的治疗性表达产物。术语“CNS疾病”原则上是本领域技术人员所理解的。该术语涉及可通过向CNS、特别是CNS细胞施用活性化合物来治疗和/或预防的疾病。在一些实施方式中，CNS疾病是神经系统疾病和/或紊乱。
作为非限制性实例，CNS疾病可选自：缺乏透明隔、酸性脂酶病、酸性麦芽糖酶缺乏症、获得性癫痫性失语、急性播散性脑脊髓炎、注意力缺陷/多动障碍(ADHD)、艾迪氏瞳孔、艾迪氏综合征、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不全、失认症、Aicardi综合征、Aicardi-Goutieres综合征、AIDS-神经系统并发症、亚历山大病、Alpers病、交替性偏瘫、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、无脑畸形、动脉瘤、天使综合征、血管瘤、缺氧症、抗磷脂综合征、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿诺德-基亚里畸形、动静脉畸形、阿斯伯格综合征、共济失调、共济失调毛细血管扩张、共济失调与小脑或脊髓小脑性退化、心房颤动与中风、注意力缺陷多动障碍、自闭症谱系障碍、自主神经功能失调、背痛、巴氏综合征、Batten病、Becker肌强直、白塞氏病、贝尔氏麻痹症、良性原发性眼睑痉挛、良性局灶性肌萎缩、良性颅内高压、Bernhardt-Roth Syndrome综合征、宾斯旺格病(Binswanger'sDisease)、眼睑痉挛、Bloch-Sulzberger综合征、臂丛神经分娩性损伤、臂丛神经损伤、Bradbury-Eggleston综合征、脑与脊椎肿瘤、脑动脉瘤、脑损伤、脊髓半切综合征、脊髓延髓性肌萎缩症、伴有皮质下梗死和白质脑病的脑常染色体显性动脉病(CADASIL)、Canavan病、腕管综合征、灼性神经痛、海绵状瘤、海绵状血管瘤、海绵状血管畸形、颈脊髓中央综合征、中央脊髓综合征、中枢性疼痛综合征、脑桥中央髓鞘溶解症、头部紊乱(CephalicDisorder)、神经酰胺酶缺乏症、小脑退化、小脑发育不良、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、脑型脚气病、脑海绵状血管瘤、脑性巨人症、脑缺氧、脑性瘫痪、脑-眼-面部骨骼(COFS)、夏科-马里-图斯病、Chiari畸形、胆固醇酯贮积病、舞蹈症、舞蹈性棘红细胞增多症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性直立不耐受、慢性疼痛、II型Cockayne综合征、Coffin Lowry综合征、空洞脑(Colpocephaly)、昏迷、复杂性区域性疼痛综合征、先天性双侧面瘫、先天性肌无力、先天性肌病、先天性血管海绵状畸形、皮质基底退化、颅动脉炎、颅缝早闭、Cree脑炎脑炎、克雅氏病、累积性创伤障碍、库兴氏综合征(Cushing's Syndrome)、巨细胞包涵体病、巨细胞病毒感染、舞眼舞足综合征、Dandy-Walker综合征、Dawson病、DeMorsier综合征、Dejerine-Klumpke麻痹、痴呆症、痴呆症-多发性梗塞、语义性痴呆、皮质下痴呆、路易体痴呆、齿状核小脑共济失调、齿状核红核萎缩、皮肌炎、发育性运动障碍、Devic综合征、糖尿病神经病变、弥漫性硬化、Dravet综合征、自主神经障碍、书写障碍、阅读障碍、吞咽障碍、运动障碍、肌阵挛性小脑性协调障碍、进行性小脑协调障碍、肌张力障碍、婴儿早期癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、昏睡性脑炎、脑膨出、脑病、脑病(家族性婴儿性)、脑三叉神经血管瘤病、癫痫、癫痫性偏瘫、Erb麻痹、Erb-Duchenne and Dejerine-Klumpke麻痹、原发性震颤、脑桥外髓鞘溶解症、Fabry病、Fahr综合征、昏厥、家族性自主神经功能障碍、家族性血管瘤、家族性特发性基底节钙化、家族性周期性瘫痪、家族性痉挛性瘫痪、Farber病、热性惊厥、纤维肌性发育不良、Fisher综合征、婴儿低肌张力综合征、足下垂、Friedreich共济失调、额颞叶痴呆、戈谢病、全身性神经节苷脂储积症、格斯特曼综合征、格斯特曼-施特劳斯勒尔-沙因克尔病、巨轴索神经病、巨细胞动脉炎、巨细胞包涵体病、球形细胞脑白质营养不良、舌咽神经痛、肝糖原累积病、Guillain-Barre综合征、哈勒沃登-施帕茨病、头部受伤、头痛、连续性偏头痛、面肌痉挛、交替性偏瘫、遗传性神经病、遗传性痉挛性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、带状疱疹、耳带状疱疹、平山综合征、Holmes-Adie综合征、前脑无裂畸形、HTLV-1相关脊髓病、Hughes综合征、亨廷顿病、积水性无脑畸形、脑积水、正常压力性脑积水、脊髓积水、皮质醇增多症、嗜睡症、张力亢进、张力减退、缺氧症、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失禁症、婴儿张力减退、婴儿神经轴索营养不良、婴儿植烷酸贮积症、婴儿雷夫叙姆病、婴儿痉挛、炎性肌病、枕骨裂脑露畸形、肠性脂质营养不良、颅内囊肿、颅内高压、Isaacs综合征、Joubert综合征、Kearns-Sayre综合征、肯尼迪病、Kinsbourne综合征、Kleine-Levin综合征、Klippel-Feil综合征、Klippel-Trenaunay综合征(KTS)、Kliiver-Bucy综合征、科尔萨科夫氏综合征、克拉伯病、库格尔贝格-韦兰德病、库鲁病(Kuru)、Lambert-Eaton肌无力综合征、Landau-Kleffner综合征、股外侧皮神经卡压综合征、延髓外侧综合征、学习障碍、利氏病、Lennox-Gastaut综合征、莱施-尼汉综合征、脑白质营养不良、Levine-Critchley综合征、路易体痴呆、脂质贮积病、类脂蛋白沉积症、平脑症、闭锁综合征、Lou Gehrig病、狼疮-神经系统后遗症、莱姆病-神经系统并发症、马查多-约瑟夫病、巨脑、巨脑畸形、梅-罗综合征、脑膜炎、脑膜炎和脑炎、Menkes病、感觉异常性股痛、异染性脑白质营养不良、头小畸型、偏头痛、Miller Fisher综合征、小中风、线粒体肌病、莫比乌斯综合征、单体性肌萎缩、运动神经元疾病、烟雾病、粘脂质贮积症、粘多糖贮积症、多发性梗塞性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化症、多系统萎缩、伴直立性低血压的多系统萎缩、肌营养不良症、先天性肌无力、重症肌无力、髓鞘破坏的弥漫性硬化、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、先天性肌病、甲状腺毒性肌病、肌强直、先天性肌强直、发作性睡病、神经棘红细胞增多症、伴脑铁积聚的神经变性、神经纤维瘤病、抗精神病药恶性综合征、AIDS的神经系统并发症、莱姆病的神经系统并发症、巨细胞病毒感染的神经后果、庞贝病的神经系统表现、狼疮的神经后遗症、视神经脊髓炎、神经性肌强直、神经元蜡样脂褐质沉积症、神经元移行障碍、遗传性神经病变、神经结节病、神经梅毒、神经毒性、海绵状痣、尼曼-匹克病、O'Sullivan-McLeod综合征、枕神经痛、大田原综合征(Ohtahara Syndrome)、橄榄桥脑小脑萎缩、眼阵挛肌阵挛、直立性低血压、过度使用综合征、慢性疼痛、泛酸激酶相关神经变性、副肿瘤综合征、感觉异常、帕金森病、阵发性舞蹈手足徐动症、阵发性偏头痛、Parry-Romberg、佩-梅病、Pena Shokeir II综合征、外周神经囊肿、周期性麻痹、周围神经病变、脑室周围白质软化症、持续植物状态、广泛性发育障碍、植烷酸贮积症、皮克氏病、神经挟捏、梨状肌综合征、垂体瘤、多发性肌炎、庞贝病、脑穿通畸形、脊髓灰质炎后综合征、疱疹后神经痛、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、体位性直立性心动过速综合征、体位性心动过速综合征、原发性齿状萎缩、原发性侧索硬化症、原发性进行性失语症、朊病毒病、进行性面偏侧萎缩症、进行性运动性共济失调、进行性多灶性脑白质病、进行性硬化性脊髓灰质炎营养不良、进行性核上性麻痹、面孔失认症、Pseudo-Torch综合征、假弓形虫病综合征、假性脑瘤、心因性运动、Ramsay Hunt综合征I、Ramsay Hunt综合征II、Rasmussen脑炎、反射性交感神经营养不良综合征、雷夫叙姆病、婴儿雷夫叙姆病、重复性运动障碍、重复性应激损伤、不宁腿综合征、逆转录病毒相关性脊髓病、Rett综合征、Reye综合征、风湿性脑炎、Riley-Day综合征、骶神经根囊肿、Saint Vitus舞蹈症、唾液腺疾病、Sandhoff病、Schilder病、脑裂畸形、Seitelberger病、癫痫、语义性痴呆、视神经发育不良、婴儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)、摇晃婴儿综合征、带状疱疹、Shy-Drager综合征、干燥综合征、睡眠呼吸暂停、昏睡病、小儿巨脑畸形综合征、痉挛、脊柱裂、脊髓梗死、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、小脑萎缩症、脊髓小脑变性、斯-里-奥三氏综合征、僵人综合征、纹状体黑质变性、中风、斯特奇-韦伯综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉硬化性脑病、短暂性单侧神经痛样(SUNCT)头痛、吞咽障碍、小舞蹈病、晕厥、梅毒性脊髓硬化症、脊髓空洞积水症、脊髓空洞症、系统性红斑狼疮、脊髓痨、迟发性运动障碍、Tarlov囊肿、泰萨二氏病(Tay-Sachs Disease)、颞动脉炎、脊髓栓系综合征、Thomsen肌强直、胸廓出口综合征、甲状腺毒性肌病、三叉神经痛、托德麻痹、抽动秽语综合征、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性瘫痪、Troyer综合征、结节性硬化症、血管性勃起肿瘤、中枢和外周神经系统的血管炎综合征、Von Economo病、Von Hippel-Lindau病(VHL)、VonRecklinghausen综合征、Wallenberg综合征、韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-HoffmanDisease)、韦尼克-科尔萨科夫综合征、West综合征、Whiplash、惠普尔病(Whipple'sDisease)、Williams综合征、Wilson病、沃尔曼病、X-连锁脊髓和延髓肌肉萎缩。
在一些实施方式中，CNS疾病选自：多巴胺转运体缺乏综合征、注意力缺陷/多动障碍(ADHD)、双相情绪障碍、癫痫、多发性硬化症、τ蛋白病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、Krabbe病、肾上腺脑白质营养不良、运动神经元疾病、大脑性瘫痪、Batten病、戈谢病、Tay Sachs病、Rett综合征、Sandhoff病、夏科-马里-图思病、天使综合征、Canavan病、晚期婴儿型神经元蜡样脂褐质沉积症、IIIA型粘多糖贮积症、IIIB型粘多糖贮积症、异染性脑白质营养不良、遗传性溶酶体贮积症(例如C1型尼曼匹克病)、和/或神经元蜡样质脂褐质沉积症(例如Batten病、进行性核上性麻痹、皮质基底节综合征和脑癌(包括星形细胞瘤和胶质母细胞瘤)。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体载体可用于表达用来治疗选自以下中的任一种疾病的治疗性表达产物：甲基丙二酸血症(MMA)、α1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)、常染色体显性多囊肾病(ADPKD)。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体载体可用于表达用来治疗选自以下中的任一种疾病的治疗性表达产物：肌营养不良症，包括强直性肌营养不良症(DM1和DM2)、肢带MD、杜兴氏MD、贝克MD、先天性MD、面肩肱型MD、Emery-Dreifuss MD、远端型MD、眼咽型MD、VI型胶原相关的MD。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体载体可用于表达用来治疗胃肠道源性疾病或胃肠紊乱的治疗性表达产物，所述疾病例如选自如下的任何胃肠紊乱或小肠紊乱：炎症性肠病(IBD，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、肠易激综合征(IBS)、乳糜泻、遗传性血色病、林奇综合征(Lynch syndrome)、家族性腺瘤性息肉病、幼年性息肉症、Peutz-Jerghers综合征、嗜酸性胃肠疾病(如嗜酸细胞性胃肠炎(EGE))、微绒毛包涵体病、巨膀胱-微小结肠-小肠蠕动功能障碍综合征、线粒体神经胃肠型脑病综合征、小肠淋巴管扩张症、自身免疫性胃肠动力障碍、热带口炎性腹泻、惠普尔病、乳糖不耐受和遗传性淀粉样变性。
在某些实施方式中，将本文公开的合理多倍体AAV载体预防性地施用至受试者，以预防疾病的发作。在另一个实施方式中，施用本公开的AAV颗粒以治疗疾病或其症状(或减轻其影响)。在另一个实施方式中，施用本文公开的合理多倍体AAV载体以治愈(消除)疾病。在另一个实施方式中，施用本文公开的合理多倍体AAV载体以预防或减缓疾病的进展。在另一个实施方式中，将本公开的AAV颗粒用于逆转疾病的有害影响。疾病状态和/或进展可以通过本领域已知的标准方法来确定或监测。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV载体可用于医学领域，以用来治疗、预防、减轻或改善神经系统疾病和/或紊乱。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV载体可用于医学领域，以用来治疗、预防、缓解或改善τ蛋白病。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV载体可用于医学领域，以用来治疗、预防、缓解或改善阿尔茨海默病。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV载体可用于医学领域，以用来治疗、预防、缓解或改善Friedreich共济失调或源自frataxin蛋白的缺失或部分缺失的任何疾病。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV载体可用于医学领域，以用来治疗、预防、缓解或改善帕金森病。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV载体可用于医学领域，以用来治疗、预防、缓解或改善肌萎缩侧索硬化症。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV载体可用于医学领域，以用来治疗、预防、缓解或改善亨廷顿病。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV载体可用于医学领域，以用来治疗、预防、减轻或改善慢性或神经性疼痛。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV载体可用于医学领域，以用来治疗、预防、缓解或改善与中枢神经系统(CNS)相关的疾病。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体AAV载体可用于医学领域，以用来治疗、预防、缓解或改善与外周神经系统(PNS)相关的疾病。
在某些实施方式中，将本公开的AAV颗粒施用至具有至少一种本文所述的疾病或症状的受试者。
如本文所用，与中枢或外周神经系统及其组成部分(如神经元)相关的任何疾病都可被视为“神经系统疾病”。
任何神经系统疾病都可以用本公开的AAV颗粒或其药物组合物治疗，包括但不限于，缺乏透明隔、酸性脂酶病、酸性麦芽糖酶缺乏症、获得性癫痫性失语、急性播散性脑脊髓炎、注意力缺陷/多动障碍(ADHD)、艾迪氏瞳孔、艾迪氏综合征、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不全、失认症、Aicardi综合征、Aicardi-Goutieres综合征、AIDS-神经系统并发症、亚历山大病、Alpers病、交替性偏瘫、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、无脑畸形、动脉瘤、天使综合征、血管瘤、缺氧症、抗磷脂综合征、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿诺德-基亚里畸形、动静脉畸形、阿斯伯格综合征、共济失调、共济失调毛细血管扩张、共济失调与小脑或脊髓小脑性退化、心房颤动与中风、注意力缺陷多动障碍、自闭症谱系障碍、自主神经功能失调、背痛、巴氏综合征、Batten病、Becker肌强直、白塞氏病、贝尔氏麻痹症、良性原发性眼睑痉挛、良性局灶性肌萎缩、良性颅内高压、Bernhardt-RothSyndrome综合征、宾斯旺格病、眼睑痉挛、Bloch-Sulzberger综合征、臂丛神经分娩性损伤、臂丛神经损伤、Bradbury-Eggleston综合征、脑与脊椎肿瘤、脑动脉瘤、脑损伤、脊髓半切综合征、脊髓延髓性肌萎缩症、伴有皮质下梗死和白质脑病的脑常染色体显性动脉病(CADASIL)、Canavan病、腕管综合征、灼性神经痛、海绵状瘤、海绵状血管瘤、海绵状血管畸形、颈脊髓中央综合征、中央脊髓综合征、中枢性疼痛综合征、脑桥中央髓鞘溶解症、头部紊乱(Cephalic Disorder)、神经酰胺酶缺乏症、小脑退化、小脑发育不良、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、脑型脚气病、脑海绵状血管瘤、脑性巨人症、脑缺氧、脑性瘫痪、脑-眼-面部骨骼(COFS)、夏科-马里-图斯病、Chiari畸形、胆固醇酯贮积病、舞蹈症、舞蹈性棘红细胞增多症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性直立不耐受、慢性疼痛、II型Cockayne综合征、Coffin Lowry综合征、空洞脑(Colpocephaly)、昏迷、复杂性区域性疼痛综合征、先天性双侧面瘫、先天性肌无力、先天性肌病、先天性血管海绵状畸形、皮质基底退化、颅动脉炎、颅缝早闭、Cree脑炎脑炎、克雅氏病、慢性进行性外眼肌麻痹、累积性创伤障碍、库兴氏综合征(Cushing's Syndrome)、巨细胞包涵体病、巨细胞病毒感染、舞眼舞足综合征、Dandy-Walker综合征、Dawson病、De Morsier综合征、Dejerine-Klumpke麻痹、痴呆症、痴呆症-多发性梗塞、语义性痴呆、皮质下痴呆、路易体痴呆、发育性运动障碍、齿状核小脑共济失调、齿状核红核萎缩、皮肌炎、发育性运动障碍、Devic综合征、糖尿病神经病变、弥漫性硬化、远端遗传性运动神经元病、Dravet综合征、自主神经障碍、书写障碍、阅读障碍、吞咽障碍、运动障碍、肌阵挛性小脑性协调障碍、进行性小脑协调障碍、肌张力障碍、婴儿早期癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、昏睡性脑炎、脑膨出、脑脊髓炎、脑病、脑病(家族性婴儿性)、脑三叉神经血管瘤病、癫痫、癫痫性偏瘫、发作性共济失调、Erb麻痹、Erb-Duchenne andDejerine-Klumpke麻痹、原发性震颤、脑桥外髓鞘溶解症、Faber病、Fabry病、Fahr综合征、昏厥、家族性自主神经功能障碍、家族性血管瘤、家族性特发性基底节钙化、家族性周期性瘫痪、家族性痉挛性瘫痪、Farber病、热性惊厥、纤维肌性发育不良、Fisher综合征、婴儿低肌张力综合征、足下垂、Friedreich共济失调、额颞叶痴呆、戈谢病、全身性神经节苷脂储积症(GM1、GM2)、格斯特曼综合征、格斯特曼-施特劳斯勒尔-沙因克尔病、巨轴索神经病、巨细胞动脉炎、巨细胞包涵体病、球形细胞脑白质营养不良、舌咽神经痛、肝糖原累积病、Guillain-Barre综合征、哈勒沃登-施帕茨病、头部受伤、头痛、连续性偏头痛、面肌痉挛、交替性偏瘫、遗传性神经病、遗传性痉挛性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、带状疱疹、耳带状疱疹、平山综合征、Holmes-Adie综合征、前脑无裂畸形、HTLV-1相关脊髓病、Hughes综合征、亨廷顿病、Hurler综合征、积水性无脑畸形、脑积水、正常压力性脑积水、脊髓积水、皮质醇增多症、嗜睡症、张力亢进、张力减退、缺氧症、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失禁症、婴儿张力减退、婴儿神经轴索营养不良、婴儿植烷酸贮积症、婴儿雷夫叙姆病、婴儿痉挛、炎性肌病、枕骨裂脑露畸形、肠性脂质营养不良、颅内囊肿、颅内高压、Isaacs综合征、Joubert综合征、Kearns-Sayre综合征、肯尼迪病、Kinsbourne综合征、Kleine-Levin综合征、Klippel-Feil综合征、Klippel-Trenaunay综合征(KTS)、Kliiver-Bucy综合征、科尔萨科夫氏综合征、克拉伯病、库格尔贝格-韦兰德病、库鲁病(Kuru)、Lambert-Eaton肌无力综合征、Landau-Kleffner综合征、股外侧皮神经卡压综合征、延髓外侧综合征、学习障碍、利氏病、Lennox-Gastaut综合征、莱施-尼汉综合征、脑白质营养不良、Levine-Critchley综合征、路易体痴呆、Lichtheim病、脂质贮积病、类脂蛋白沉积症、平脑症、闭锁综合征、LouGehrig病、狼疮-神经系统后遗症、莱姆病-神经系统并发症、溶酶体贮积症、马查多-约瑟夫病、巨脑、巨脑畸形、梅-罗综合征、脑膜炎、脑膜炎和脑炎、Menkes病、感觉异常性股痛、异染性脑白质营养不良、头小畸型、偏头痛、Miller Fisher综合征、小中风、线粒体肌病、线粒体DNA耗竭综合征、莫比乌斯综合征、单体性肌萎缩、莫旺综合征、运动神经元疾病、烟雾病、粘脂质贮积症、粘多糖贮积症、多发性梗塞性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化症、多系统萎缩、伴直立性低血压的多系统萎缩、肌营养不良症、先天性肌无力、重症肌无力、髓鞘破坏的弥漫性硬化、脊髓炎、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌阵挛性癫痫、肌病、先天性肌病、甲状腺毒性肌病、肌强直、先天性肌强直、发作性睡病、NARP(神经病变、共济失调和视网膜色素变性)、神经棘红细胞增多症、伴脑铁积聚的神经变性、神经退行性疾病、神经纤维瘤病、抗精神病药恶性综合征、AIDS的神经系统并发症、莱姆病的神经系统并发症、巨细胞病毒感染的神经后果、庞贝丙的神经系统表现、狼疮的神经后遗症、视神经脊髓炎、神经性肌强直、神经元蜡样脂褐质沉积症、神经元移行障碍、神经性疼痛、遗传性神经病变、神经病、神经结节病、神经梅毒、神经毒性、海绵状痣、尼曼-匹克病、O'Sullivan-McLeod综合征、枕神经痛、大田原综合征(Ohtahara Syndrome)、橄榄桥脑小脑萎缩、眼阵挛肌阵挛、直立性低血压、过度使用综合征、慢性疼痛、泛酸激酶相关神经变性、副肿瘤综合征、感觉异常、帕金森病、阵发性舞蹈手足徐动症、阵发性偏头痛、Parry-Romberg、佩-梅病、Pena Shokeir II综合征、外周神经囊肿、腓骨肌萎缩症、周期性麻痹、周围神经病变、脑室周围白质软化症、持续植物状态、广泛性发育障碍、植烷酸贮积症、皮克氏病、神经挟捏、梨状肌综合征、垂体瘤、多发性肌炎、庞贝病、脑穿通畸形、脊髓灰质炎后综合征、疱疹后神经痛、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、体位性直立性心动过速综合征、体位性心动过速综合征、原发性齿状萎缩、原发性侧索硬化症、原发性进行性失语症、朊病毒病、进行性延髓性麻痹、进行性面偏侧萎缩症、进行性运动性共济失调、进行性多灶性脑白质病、进行性肌萎缩、进行性硬化性脊髓灰质炎营养不良、进行性核上性麻痹、面孔失认症、假性延髓麻痹、Pseudo-Torch综合征、假弓形虫病综合征、假性脑瘤、心因性运动、Ramsay Hunt综合征I、Ramsay Hunt综合征II、Rasmussen脑炎、反射性交感神经营养不良综合征、雷夫叙姆病、婴儿雷夫叙姆病、重复性运动障碍、重复性应激损伤、不宁腿综合征、逆转录病毒相关性脊髓病、Rett综合征、Reye综合征、风湿性脑炎、Riley-Day综合征、骶神经根囊肿、Saint Vitus舞蹈症、唾液腺疾病、Sandhoff病、Schilder病、脑裂畸形、Seitelberger病、癫痫、语义性痴呆、视神经发育不良、婴儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)、摇晃婴儿综合征、带状疱疹、Shy-Drager综合征、干燥综合征、睡眠呼吸暂停、昏睡病、小儿巨脑畸形综合征、痉挛、脊柱裂、脊髓梗死、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑共济失调、小脑萎缩症、脊髓小脑变性、散发性共济失调、斯-里-奥三氏综合征、僵人综合征、纹状体黑质变性、中风、斯特奇-韦伯综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉硬化性脑病、短暂性单侧神经痛样(SUNCT)头痛、吞咽障碍、小舞蹈病、晕厥、梅毒性脊髓硬化症、脊髓空洞积水症、脊髓空洞症、系统性红斑狼疮、脊髓痨、迟发性运动障碍、Tarlov囊肿、泰萨二氏病(Tay-Sachs Disease)、颞动脉炎、脊髓栓系综合征、Thomsen肌强直、胸廓出口综合征、甲状腺毒性肌病、三叉神经痛、托德麻痹、抽动秽语综合征、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性瘫痪、Troyer综合征、结节性硬化症、血管性勃起肿瘤、中枢和外周神经系统的血管炎综合征、维生素B12缺乏病、Von Economo病、Von Hippel-Lindau病(VHL)、VonRecklinghausen综合征、Wallenberg综合征、韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-HoffmanDisease)、韦尼克-科尔萨科夫综合征、West综合征、Whiplash、惠普尔病(Whipple′sDisease)、Williams综合征、Wilson病、沃尔曼病、X-连锁脊髓和延髓肌肉萎缩。
在一些实施方式中，由本文公开的合理多倍体或单倍体载体编码的治疗基因或表达产物可以例如选自于由以下所组成的组：NPC1、EAAT2、NPY、CYP46A1、GLB1、APOE(例如ApoE2、ApoE3或ApoE4)、HEX、CLN1、CLN2、CLN3、CLN4、CLN5、CLN6、SUMF1、DCTN1、PRPH、SOD1、NEFH、GBA、IDUA、NAGLU、GUSB、ARSA、MANB、AADC、GDNF、SOD1、NTN、ASP、MAPT、APOE、HTT、MECP2、PTCHD1、GJB1、UBE3A、HEXA、MOG。
此外或可替换地，表达产物可以是抗体、抗体片段或抗体样支架蛋白。在一些实施方式中，示例性多肽表达产物包括神经保护多肽和抗血管生成多肽。一方面，本文公开的合理多倍体载体包括编码多肽有效载荷的病毒基因组。所述多肽可以是但不限于抗体、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、存活运动神经元1(SMN1)、frataxin(FXN)、ApoE2、GBA1、GRN、ASPA、CLN2、GLB1、SGSH、NAGLU、IDS、NPC1或GAN。
额外的合适的多肽包括但不限于，神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、nurturin、睫状神经营养因子(CNTF)、神经生长因子(NGF；例如神经生长因子-β)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4(NT-4)、神经营养因子-6(NT-6)、表皮生长因子(EGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、Wnt多肽、可溶性Fit-1、血管抑素、内皮抑素、VEGF、抗VEGF抗体、可溶性VEGFR、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)以及刺猬因子(hedgehog)家族的成员(音猬因子、印度刺猬因子和沙漠刺猬因子等)。
在一些实施方式中，有用的治疗性表达产物包括激素以及生长和分化因子，包括但不限于胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管抑素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞增长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子α超家族中的任何一种(包括TGFa、激活素、抑制素或骨形态发生蛋白(BMP)BMPs 1-15中的任一种)、生长因子的heregluin/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族中的任何一种、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和神经营养因子NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、neurturin、agrin、semaphorins/脑衰蛋白家族的任何一种、netrin-1和netrin-2、肝细胞生长因子(HGF)、ephrins、noggin、音猬因子和酪氨酸羟化酶。
此外或可替换地，由本文公开的合理多倍体或单倍体载体编码的治疗基因或表达产物可以是针对疾病等位基因的基因编辑系统(如CRISPR-Cas9系统、TALEN、ZFN等)。另外或可替换地，表达产物可以是一种或多种调节性多核苷酸，例如作为治疗剂的RNA或DNA分子。例如，所述调节性多核苷酸可以是miRNA或siRNA。靶基因可以是与任何神经系统疾病相关的任何基因，例如但不限于本文所列的那些。例如，siRNA双链体或经编码的dsRNA可以减少或沉默CNS细胞中的靶基因表达，从而改善神经系统疾病的症状。在一个非限制性实例中，靶基因是huntingtin(HTT)。在另一个非限制性实例中，靶基因是微管相关蛋白tau(MAPT)。在一些实施方式中，有用的表达产物包括调节免疫系统的蛋白质，包括但不限于细胞因子和淋巴因子，如血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL)IL-1至IL-25(包括IL-2、IL-4、IL-12和IL-18)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素(α、β和γ)、干细胞因子、flk-2/flt3配体。由免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。这些包括但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体和单链T细胞受体、I类和II类MHC分子、以及经工程化的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物还包括补体调节蛋白，如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。
在一些实施方式中，有用的表达产物包括激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白和免疫系统蛋白的受体中的任一种。有用的异源核酸序列还包括用于胆固醇调节和/或脂质调节的受体，包括低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL)受体和清道夫受体。本发明还涵盖了基因产物的用途，例如类固醇激素受体超家族的成员，包括糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其他核受体。此外，有用的基因产物包括转录因子，例如jun、fos、max、mad、血清应答因子(SRF)、AP-1、AP-2、myb、MyoD和肌细胞生成素、含有蛋白质的ETS盒、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT-box结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、Wilms肿瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA盒结合蛋白，例如GATA-3和翼螺旋蛋白(winged helix proteins)的叉头(forkhead)家族。
在一些实施方式中，有用的表达产物包括非天然存在的多肽，例如具有包含插入、缺失或氨基酸替换的非天然存在氨基酸序列的嵌合或杂交多肽。进一步合适的表达产物包括微小RNA(miRNA)、干扰RNA、反义RNA、核酶和适体。
在替代的实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体载体可用于在体内将异源核酸递送至受试者的细胞。在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体载体可用于治疗如本文所述的以下疾病中的任何一种或多种：溶酶体贮积症，如粘多糖贮积症(例如，Sly综合征[β-葡萄糖醛酸酶]、Hurler综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、Scheie综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、Hurler-Scheie综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、Hunter综合征[艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、Sanfilippo综合征A[乙酰肝素硫酸胺酶]、B[N-乙酰氨基葡萄糖苷酶]、C[乙酰辅酶A:α-氨基葡糖苷乙酰转移酶]、D[N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶]、Morquio综合征A[半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶]、B[β-半乳糖苷酶]、Maroteaux-Lamy综合征[N-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯酶]等)，Fabry病(α-半乳糖苷酶类)，戈谢病(葡萄糖脑苷脂酶)，或糖原贮积症(例如庞贝病；溶酶体酸α-葡萄糖苷酶)。
本领域技术人员将理解，对于一些AAV衣壳蛋白，相应的修饰将是插入和/或替换，这取决于相应的氨基酸位置是部分或完全存在于病毒中，或者还是完全不存在。同样，当对除AAV2以外的AAV进行修饰时，特异性氨基酸位置可以不同于AAV2中的位置(参见例如表3)。如本文其他地方所讨论的，使用公知技术，相应的氨基酸位置对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
在代表性实施方式中，衣壳蛋白中的插入和/或替换和/或缺失产生如下的氨基酸的插入、替换和/或者重新定位，该氨基酸(i)维持该区域中的亲水环结构、(ii)改变所述环结构的构型、(iii)带电荷、和/或(iv)可通过在AAV2衣壳蛋白中264之后的翻译后修饰(例如，糖基化)或另一AAV衣壳蛋白的相应变化而被磷酸化或硫酸化或以其他方式获得电荷。用于插入/替换的合适氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸或谷氨酰胺。在具体的实施方式中，苏氨酸被插入或替换到衣壳亚基中。许多其他AAV中的相应位置的非限制性实例在表3(位置2)中示出。在具体的实施方式中，氨基酸插入或取代是苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或苯丙氨酸(除了在该位置分别具有苏氨酸、谷氨酸或苯丙氨酸的AAV之外)。
在进一步的实施方式中，经修饰的衣壳蛋白或衣壳可包含WO 2009/108274中所述的突变。
作为另一种可能性，AAV衣壳蛋白可以包含Zhong等描述的突变(Virology 381:194-202(2008)；Proc.Nat.Acad.Sci.105:7827-32(2008))。例如，AAV衣壳蛋白可以在氨基酸位置730处包含YF突变。
可将上述修饰彼此结合和/或与现在已知或后来发现的任何其他修饰结合而插入到本发明的衣壳蛋白或衣壳中。
本发明还涵盖了包含本发明的经修饰的衣壳蛋白和衣壳的病毒载体。在具体的实施方式中，病毒载体是细小病毒载体(例如，包含细小病毒衣壳和/或载体基因组)，例如AAV载体(例如包含AAV衣壳和/或载体基因组)。在代表性的实施方式中，病毒载体包含经修饰的AAV衣壳和载体基因组，所述经修饰的AAV衣壳包含本发明的经修饰的衣壳蛋白亚基。
例如，在代表性的实施方式中，病毒载体包含：(a)经修饰的病毒衣壳(例如，经修饰的AAV衣壳)，该病毒衣壳包括本发明的经修饰的衣壳蛋白；以及(b)包含末端重复序列的核酸(例如，AAV TR)，其中包含末端重复序列的核酸被经修饰的病毒衣壳包封。核酸可以任选地包含两个末端重复序列(例如两个AAV TR)。
在代表性的实施方式中，病毒载体是包含编码感兴趣的多肽或功能性RNA的异源核酸的重组病毒载体。下文会更详细地描述重组病毒载体。
在一些实施方式中，本文公开的合理多倍体(例如，合理单倍体)AAV载体：(i)与非多倍体亲代AAV载体相比，在全身性施用或鞘内施用后具有增高的穿过BBB的能力，(ii)与非单倍体亲代AAV载体的转导水平相比，在CNS或PNS或两者中具有增高的生物分布增加、和/或具有增高的转导脑组织(例如神经元和非神经元细胞)的能力，(iii)与通过非合理多倍体亲代AAV载体的转导水平观察到的水平相比，在动物受试者中表现出通过病毒载体的增强的全身性转导，(iv)与非合理多倍体亲代AAV载体引发的免疫应答水平相比，具有降低的体液免疫应答，(v)与非多倍体亲代AAV载体对相同中和抗体的中和水平相比，具有降低的通过针对亲代AAV载体的中和抗体进行的中和。
此外，在本发明的一些实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体AAV载体证明了CNS和/或PNS靶组织的有效转导，包括但不限于受试者的皮层、纹状体、丘脑、髓质、海马体、中脑、浦肯野组织、小脑和脊髓，包括颈部、腰椎、脊髓和髓质以及CNS的脉络丛。
在一些实施方式中，允许重复给药的合理多倍体AAV病毒粒子的群，该群包括：AAVVP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种和AAV VP3病毒结构蛋白；其中，所述VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自AAV8病毒血清型，并且所述VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAVrh10血清型；其中，与亲代AAV8血清型引发的体液应答相比，所述合理多倍体AAV8-8-rh10病毒粒子的群引发降低的体液应答，并且其中，重复给药包括合理多倍体AAV8-8-rh10病毒粒子的群的第一施用，以及亲代AAV血清型8病毒粒子的第二施用。为了说明的目的，在受试者或动物(例如小鼠)注射合理多倍体AAV8-8-rh10病毒粒子或注射AAV8病毒粒子后，通过抗AAV8抗体(例如IgG)的血清水平来测量本文公开的体液应答。因此，与在类似条件下对受试者或动物施用AAV8病毒粒子时产生的抗AAV8 IgG相比，当对受试者或动物施用合理多倍体(例如，合理单倍体)AAV8-8-rh10病毒粒子时，降低的体液应答引起产生较少的抗AAV8 IgG。用合理多倍体(例如合理单倍体)AAV8-8-rh10产生的较少的抗AAV8 IgG使其更适合用作其中需要第二施用的基因治疗方案。对于AAV基因治疗方案的这个具体实例，适合使用合理多倍体AAV8-8-rh10作为第一施用，随后或者以AAV8载体进行第二施用。
在一些实施方案中，允许重复给药的合理多倍体AAV病毒粒子的群，该群包括：AAVVP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种和AAV VP3病毒结构蛋白；其中，所述VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自AAV 8病毒血清型，并且所述VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAVrh74血清型；其中，与亲代AAV8血清型引发的体液应答相比，所述合理多倍体AAV8-8-rh74病毒粒子的群引发降低的体液应答，并且其中，所述重复给药包括合理多倍体AAV8-8-rh74病毒粒子的群的第一施用，以及亲代AAV血清型8病毒粒子的第二施用。为了说明的目的，在受试者或动物(例如小鼠)注射合理多倍体AAV8-8-rh74病毒粒子或注射AAV8病毒粒子后，通过抗AAV8抗体(例如IgG)的血清水平来测量本文公开的体液应答。
因此，与在类似条件下对受试者或动物施用AAV8病毒粒子时产生的抗AAV8 IgG相比，当对受试者和动物施用合理多倍体(例如合理单倍体)AAV8-8-rh74病毒粒子时，降低的体液应答引起产生较少的抗AAV8 IgG。用合理多倍体(例如合理单倍体)AAV8-8-rh74产生的较少的抗AAV8 IgG使其更适合用作其中需要第二施用的基因治疗方案。对于AAV基因治疗方案的这个具体实例，适合使用合理多倍体AAV8-8-rh74作为第一施用，随后或者以AAV8载体进行第二施用，反之亦然。
本文中，AAV载体和AAV病毒粒子可互换使用。
在一些实施方式中，合理多倍体AAV病毒粒子的群允许重复给药，该群包括：AAVVP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种和AAV VP3病毒结构蛋白；其中，所述VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自AAV8病毒血清型，并且所述VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAVrh10血清型或AAVrh74血清型；其中，与亲代AAV8血清型引发的体液应答相比，所述合理多倍体AAV8-8-rh10病毒粒子的群或AAV8-8-rh74病毒粒子的群引发降低的体液应答，并且其中，所述重复给药包括亲代AAV血清型8病毒粒子的第一施用，以及合理多倍体AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74病毒粒子的群的第二施用。为了说明的目的，在这个具体实例中，与AAV8病毒粒子产生相比，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74引发降低的体液应答，例如产生更少的抗AAV8 IgG。这种AAV基因治疗方案(第一施用例如AAV8的亲代AAV血清型，且第二施用合理多倍体(例如AAV8-8-rh10、或AAV8-8-rh74))适合用合理多倍体(例如，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74)的第二施用进行有效转导。如图26所示，第一施用AAV8在血清中产生抗AAV8 IgG，其可以中和或抑制AAV8介导的转导，而在含有抗AAV8 IgG的血清的存在下，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74介导的传导不被抑制，从而证实了AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74作为第二施用的合适用途，其中第一施用是用AAV8。
在一些实施方式中，合理多倍体AAV病毒粒子的群允许重复给药，该群包括：AAVVP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种和AAV VP3病毒结构蛋白；其中，所述VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自任何AAV病毒血清型，并且所述VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAV血清型；其中，与由VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引发的体液应答相比，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群引发降低的体液应答，其中，所述VP1和VP2不来自恒河猴AAV血清型，并且其中，重复给药包括VP1结构病毒蛋白或VP2结构病毒蛋白的亲代AAV血清型的第一施用，以及合理多倍体AAV病毒粒子的群的第二施用。
在一些实施式案中，重复给药的方法包括第一和第二施用，其中，重复给药包括VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型的第一施用，以及合理多倍体AAV病毒粒子的第二施用，其中合理多倍体病毒粒子的VP3病毒结构蛋白来自有效穿过血脑屏障的AAV血清型，并且不同于VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种的血清型，其中，与VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引发的体液应答相比，合理多倍体病毒粒子的群引发降低的体液应答，并且其中VP1或VP2不来自恒河猴AAV血清型。
本领域技术人员将理解的是，本发明的经修饰的衣壳蛋白、病毒衣壳、病毒载体和AAV颗粒不包括那些衣壳蛋白、衣壳、病毒载体和AAV颗粒，因为它们将以其天然状态存在或发现。
VII.产生病毒载体的方法
本文公开的AAV合理载体可通过本领域已知的任何方法生产。仅作为说明性实例，使用AAV单倍体病毒粒子作为示例性实例，所述方法包括：(a)用一种或多种质粒转染宿主细胞，所述质粒组合地提供组装AAV单倍体颗粒所需的所有功能和基因；(b)将一种或多种核酸构建体引入包装细胞系或生产细胞系中，以组合地提供组装AAV单倍体颗粒所需的所有功能和基因；(c)将一种或多种重组杆状病毒载体引入宿主细胞中，该载体组合地提供组装AAV单倍体颗粒所需的所有功能和基因；和/或(d)向宿主细胞中引入一个或多个微环或使用封闭线状DNA(clDNA)或杠铃形DNA，其组合地提供组装AAV单倍体颗粒所需的所有功能和基因。
本文所公开的进一步提供了生产如本文公开的作为AAV颗粒的合理多倍体或单倍体AAV载体的方法。因此，本发明提供了一种制备包含本发明的合理多倍体AAV载体的AAV单倍体病毒粒子的方法，包括：(a)用一种或多种质粒转染宿主细胞，所述质粒组合地提供组装AAV单倍体载体粒子所需的所有功能和基因；(b)将一种或多种核酸构建体引入包装细胞系或生产细胞系中，以组合地提供组装AAV颗粒所需的所有功能和基因；(c)将一种或多种重组杆状病毒载体引入宿主细胞，该载体组合地提供组装AAV颗粒所需的所有功能和基因；和/或(d)将一种或多种重组疱疹病毒载体引入宿主细胞，其组合地提供组装AAV颗粒所需的所有功能和基因。AAV单倍体病毒粒子的形成条件是在细胞(例如，哺乳动物或昆虫细胞)中产生AAV载体的标准条件，作为非限制性实例，其包括在Ad辅助质粒或其他辅助病毒(如HSV)的存在下转染细胞。
制备本发明的病毒载体的各种方法的非限制性实例描述于Clement和Grieger(“Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors for clinicaltrials”Mol.Ther.Methods Clin Dev.3:16002(2016))和Grieger等(“Production ofrecombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells andcontinuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1clinical vector”Mol Ther 24(2):287-297(2016))，其全部内容通过引用并入本文。
在一个代表性实施方式中，该技术还提供了一种生产病毒载体的方法，该方法包括向细胞提供：(a)包含至少一个TR序列(例如，AAV TR序列)的核酸模板，以及(b)足以复制核酸模板和包被到AAV衣壳中的AAV序列(例如，编码本发明的AAV衣壳的AAVrep序列和AAVcap序列)。任选地，核酸模板进一步包含至少一个异源核酸序列。在具体的实施方式中，核酸模板包含两个AAV ITR序列，该序列位于异源核酸序列(如果存在)的5'和3'，尽管它们不需要与其直接邻接。
核酸模板以及AAV rep和cap序列在使得于细胞中产生包含包装在AAV衣壳内的核酸模板的病毒载体的条件下提供。该方法可以进一步包括从细胞中收集病毒载体的步骤。病毒载体可以从培养基和/或通过裂解细胞来收集。
在一个实施方式中并且如本文在实施例中所公开的，核酸模板被改变，使得衣壳(Cap)序列不能从仅来自一种血清型的核酸序列(第一核酸序列)表达所有三种病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3。这种改变可以通过例如消除至少一种病毒结构蛋白的起始密码子来实现。模板还将包含来自不同血清型的至少一个额外的核酸序列(第二核酸序列)，其编码并能够表达不能由第一核酸序列表达的病毒结构蛋白，其中所述第二核酸序列不能够表达能够由所述第一核酸序列表达的病毒结构蛋白。在一个实施方式中，第一核酸序列能够表达两种病毒结构蛋白，而第二核酸序列能够仅表达剩余的病毒序列。例如，第一核酸序列能够表达来自一种血清型的VP1和VP2、而非VP3，并且第二核酸序列能够表达来自另一血清型的VP3、而非VP1或VP2。该模板不能表达这三种病毒结构蛋白中的任何其他蛋白。在一个实施方式中，第一核酸序列仅能够表达这三种病毒结构蛋白中的一种，第二核酸序列仅能表达另外两种病毒结构蛋白，但不能表达第一种。
在另一个实施方式中，存在来自第三血清型的第三核酸序列。在该实施方式中，三个核酸序列中的每一个仅能够表达三种衣壳病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3中的一种，并且每一个不表达由所述序列中的另一个表达的病毒结构蛋白，从而共同地产生包含VP1、VP2和VP3的衣壳，其中衣壳中的每个病毒结构蛋白都仅来自相同的血清型，并且在该实施方式中VP1、VP2和VP3都来自不同的血清型。
阻止表达的改变可以通过本领域已知的任何手段进行。例如，消除起始密码子、剪接受体、剪接供体及其组合。可以使用缺失和添加以及位点特异性变化来改变阅读框架。核酸序列也可以合成产生。这些辅助模板通常不包含ITR。
该细胞可以是允许AAV病毒复制的细胞。可以使用本领域中已知的任何合适的细胞。在具体的实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。作为另一种选择，细胞可以是反式补充包装细胞系，其提供从复制缺陷的辅助病毒中删除的功能，例如293细胞或其他E1a反式补充细胞。
AAV复制和衣壳序列可以通过本领域已知的任何方法提供。目前的方案通常在单个质粒上表达AAV rep/cap基因。AAV复制和包装序列不需要一起提供，尽管这样做可能很便利。AAV rep和/或cap序列可以由任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可以由杂交腺病毒或疱疹病毒载体(例如，插入到所缺失的腺病毒载体的E1a或E3区中)提供。EBV载体也可用于表达AAV cap和rep基因。这种方法的一个优点为EBV载体是附加型的，但在连续的细胞分裂过程中会保持高拷贝数(即，作为染色体外元件稳定地整合到细胞中，被指定为“基于EBV的核附加体”，参见Margolski，(1992)Curr.Top.Microbiol.Immun.158:67)。
作为进一步的替代方案，可将rep/cap序列稳定地并入细胞中。通常，AAV rep/cap序列将不会侧接有末端重复序列(TR)，以防止这些序列的拯救和/或包装。
可以使用本领域已知的任何方法将核酸模板提供至细胞。例如，模板可以通过非病毒(如质粒)或病毒载体提供。在具体的实施方式中，核酸模板由疱疹病毒或腺病毒载体(例如，插入到所缺失的腺病毒的E1a或E3区中)提供。作为另一示例，Palombo等，(1998)J.Virology72:5025描述了杆状病毒载体，该载体携带侧接有AAV TR的报告基因。EBV载体也可用于递送模板，如上文关于rep/cap基因所述。
在另一个代表性实施方式中，核酸模板由复制性rAAV病毒提供。在其他实施方式中，将包含核酸模板的AAV原病毒稳定地整合到细胞的染色体中。
为了提高病毒滴度，可以向细胞提供促进生产性AAV感染的辅助病毒功能(例如，腺病毒或疱疹病毒)。AAV复制所需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。或者，腺病毒或疱疹病毒序列可以由另一种非病毒或病毒载体提供，例如，作为非感染性腺病毒小质粒，其携带促进有效AAV生产的所有辅助基因，如Ferrari等，(1997)Nature Med.3:1295和美国专利No.6040183和6093570所述。
此外，辅助病毒功能可以由具有嵌入染色体中、或者维持为稳定的染色体外元件的辅助序列的包装细胞提供。通常，辅助病毒序列不能被包装到AAV病毒粒子中，例如不会侧接有TR。
本领域技术人员将理解，在单个辅助构建体上提供AAV复制和衣壳序列以及辅助病毒序列(例如腺病毒序列)可能是有利的。该辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体。作为一个非限制性说明，辅助构建体可以是包含AAV rep/cap基因的杂交腺病毒或杂交疱疹病毒。
在一个具体的实施方式中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。该载体还可以进一步包含核酸模板。AAV rep/cap序列和/或rAAV模板可被插入到腺病毒的缺失区(例如E1a或E3区)。
在进一步的实施方式中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。根据该实施方式，rAAV模板可以作为质粒模板提供。
在另一个示例性实施方式中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供，并且rAAV模板作为原病毒整合到细胞中。或者，rAAV模板由EBV载体提供，该载体作为染色体外元件(例如，作为基于EBV的核附加体)被维持在细胞内。
在进一步的示例性实施方式中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助物提供。rAAV模板可以作为单独的复制性病毒载体提供。例如，rAAV模板可以由rAAV颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。
根据前述方法，杂交腺病毒载体通常包含足以用于腺病毒复制和包装的腺病毒5'和3'顺式序列(即，腺病毒末端重复序列和PAC序列)。将AAV rep/cap序列和rAAV模板(如果存在)嵌入腺病毒骨架中，并侧接5'和3'顺式序列，使得这些序列可以被包装到腺病毒衣壳中。如上所述，腺病毒辅助序列和AAV rep/cap序列通常并不侧接TR，使得这些序列不会被包装到AAV病毒粒子中。Zhang等，((2001)Gene Ther.18:704-12)描述了包含腺病毒以及AAV rep和cap基因两者的嵌合辅助物。
疱疹病毒也可用作AAV包装方法中的辅助病毒。编码AAV Rep蛋白的杂交疱疹病毒可以有利地促进可扩展的AAV载体生产方案。已经描述了表达AAV-2rep和cap基因的杂交单纯疱疹病毒I型(HSV-1)载体(Conway等，(1999)Gene Therapy 6:986和WO 00/17377)。
作为进一步的替代方案，本发明的AAV单倍体载体可以在昆虫细胞中使用杆状病毒载体来递送rep/cap基因和rAAV模板来生产，例如由Urabe等(2002)Human Gene Therapy13:1935-43所描述的。
不含污染的辅助病毒的AAV单倍体载体库可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，AAV和辅助病毒可以根据大小而容易地区分。AAV单倍体载体也可以基于对肝素底物的亲和力从辅助病毒中分离(Zolotukhin等(1999)Gene Therapy 6:973)。可以使用经删除的复制缺陷型辅助病毒，使得任何污染的辅助病毒都不具有复制能够。作为进一步的替换方案，可以使用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助物，因为仅需要腺病毒早期基因表达来介导AAV病毒的包装。对晚期基因表达而言缺陷性的腺病毒突变体是本领域已知的(例如ts100K和ts149腺病毒突变体)。
在一些实施方式中，根据美国专利9441206中描述的方法，产生如本文所公开的rAVV单倍体载体的方法可以使用产生rAAV的细胞系，其通过引用整体并入本文。具体地，AAV单倍体载体或rAAV病毒粒子使用如下方法产生，所述方法包括：(a)提供产生rAAV的细胞系，即AAV单倍体载体表达系统；(b)在其中产生AAV单倍体颗粒的条件下培养细胞；以及(c)任选地分离AAV单倍体载体颗粒。可对质粒的三重转染比例和转染混合物体积进行优化，用XX680、AAV rep/cap辅助物和TR质粒的不同质粒比例来确定用于rAAV载体的生产的最佳质粒比例。
在一些情况下，将细胞在产生AAV8单倍体颗粒的条件下以悬浮液进行培养。在另一个实施方式中，将细胞在无动物成分的条件下培养。无动物成分培养基可以是与rAAV生产细胞系相容的任何无动物成分的培养基(例如，无血清培养基)。实例包括但不限于SFM4Transfx-293(Hyclone)、Ex-Cell 293(JRH Biosciences)、LC-SFM(Invitrogen)和Pro10细胞或Pro293-S(Lonza)。足以复制和包装AAV颗粒的条件可以是例如存在AAV序列，所述AAV序列足以复制本文所述的rAAV基因组，并且包被入AAV衣壳(例如，AAV rep序列和AAV cap序列)，以及来自腺病毒和/或疱疹病毒的辅助序列。
在重组AAV载体的制造过程中，来自质粒骨架的细菌DNA序列可能被非故意地包装到AAV8单倍体衣壳中，使得通过其与TLR9的相互作用激活先天免疫系统(Akira，2006；Chadeuf，2005；Wright，2014)。因此，在一些实施方式中，可以使用各种技术来消除重组AAV单倍体制剂中的质粒骨架序列，例如具有有限可扩展性的微环(Schnodt，2016)。另一种避免质粒骨架中的细菌DNA序列的方法是使用封闭末端线性双链DNA，其包括一系列DNA复制技术，包括但不限于doggy bone DNA(dbDNATM)，用于特异性地制造重组AAV载体。使用封闭末端线性双链DNA(例如dbDNATM)消除细菌骨架，并且其已被用于生产疫苗和慢病毒(Walters等，2014；Scott等，2015；Karda等，2019)，并被显示为不能触发DNA疫苗开发者的TLR9应答。
因此，在替代的实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体AAV载体的产生(如AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的产生)例如可以使用封闭末端线性双链DNA进行，包括但不限于杠铃形DNA，如美国申请2018/0037943和Karbowniczek等，Bioinsights，2017中公开的，两者均通过引用以其整体并入本文。简而言之，使用封闭末端线性双链DNA技术生产AAV的质粒可以包含ITRs、启动子和感兴趣的基因，其侧接有56bp的回文原核端粒酶(protelomerase)识别序列。使质粒变性，并在Phi29 DNA聚合酶和适当引物的存在下，Phi29启动滚环扩增(RCA)，产生原始构建体的双链多联体(cancatameric)重复序列。当加入原核端粒酶时，发生回文原核端粒酶识别序列的结合，并发生切割连接反应，从而产生单体双链(ds)线性共价封闭的DNA构建体。添加常见的限制性内切移除了不期望的DNA质粒骨架序列，并用核酸外切酶活性进行消化，从而产生dbDNA，其可以进行大小分级以分离编码ITR、启动子和感兴趣的基因的dbDNA序列。使用封闭末端的线性双链DNA(例如dbDNATM技术)产生rAAV载体的示例性质粒以如下的5'至3'方向包括：5'-原核端粒酶RS、5'ITR、LSP启动子、hGAA、3'UTR、hGH poly(A)、3'ITR、3'-原核端粒酶RS(有义链)，其中有义链与链状(ds)线性共价封闭的DNA构建体的互补的反义链连接。作为制造用于本文公开的方法和组合物中的AAV载体的起始材料的封闭末端线性双链DNA(例如doggy bone DNA(dbDNATM))的使用消除了用于繁殖含有AAV载体的质粒的细菌骨架，其不具有使产物触发Toll样受体9(TLR9)应答的能力。
制备AAV颗粒的额外的方法在本领域中是众所周知的，并且描述于例如美国专利No.US6204059、US5756283、US6258595、US6261551、US6270996、US6281010、US6365394、US6475769、US6482634、US6485966、US6943019、US6953690、US7022519、US7238526、US7291498和US7491508、US5064764、US6194191、US6566118、US8137948；或国际公开号WO1996039530、W01998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、W02000055342、W02000075353和W02001023597；Methods In Molecular Biology，ed.Richard，Humana Press，NJ(1995)；O'Reilly等，Baculovirus Expression Vectors，ALaboratory Manual，Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等，Vir.63:3822-8(1989)；Kajigaya等，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing等，J.Vir.66:6922-30(1992)；Kimbauer等，Vir.，219:37-44(1996)；Zhao等，Vir.272:382-93(2000)，其各自的内容通过引用整体并入本文。在某些实施方式中，AAV颗粒是使用国际专利公开WO2015191508中描述的方法制备的，其内容通过引用整体并入本文。
病毒复制细胞可选自任何生物有机体，包括原核(如细菌)细胞和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。病毒复制细胞通常用于重组AAV病毒颗粒的生产，包括但不限于HEK293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞和其他哺乳动物细胞系，描述于美国专利号US6156303、US5387484、US5741683、US5691176和US5688676；美国专利申请公开号2002/0081721，以及国际专利公开号WO 2000047757、WO 2000024916和WO 1996017947，其各自的内容通过引用整体并入本文。病毒复制细胞可以包括其他哺乳动物细胞，例如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2和来源于哺乳动物的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。病毒复制细胞可以包括来源于哺乳动物物种的细胞，包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、兔子和仓鼠。病毒复制细胞可以包括来源于细胞类型的细胞，包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、细胞系转化细胞等。
VIII.重组AAV多倍体病毒载体
本发明提供了一种向细胞施用核酸分子的方法，该方法包括使细胞与本发明的组合物或药学制剂和/或rAVV单倍体载体接触。
本发明还提供了一种将核酸递送至受试者的方法，该方法包括向受试者施用本发明的AAV单倍体病毒载体、AAV颗粒和/或组合物或药学制剂。
在具体的实施方式中，受试者是人，并且在一些实施方式中，受试者具有或处于可通过基因治疗方案治疗的紊乱的风险中。此类紊乱的非限制性实例包括神经系统紊乱，包括但不限于：癫痫、抑郁症、亨廷顿病、帕金森病或阿尔茨海默病、ADHD、ASD、自身免疫性疾病、囊性纤维化、地中海贫血、Hurler综合征、Sly综合征、Scheie综合征、Hurler-Scheie综合征、Hunter综合征、Sanfilippo综合征A、B、C、D、Morquio综合征、Maroteaux-Lamy综合征、Krabbe病、苯丙酮尿症、Batten病、脊髓性脑共济失调、LDL受体缺乏症、高氨血症、贫血、关节炎、视网膜退行性疾病(包括黄斑变性)、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢障碍和癌症(包括肿瘤形成癌症)。
在本发明的方法的一些实施方式中，可向骨骼肌、心肌和/或膈肌施用本发明的rAVV单倍体载体和/或组合物或药学制剂。
在本文所述的方法中，可通过全身性途径(例如，静脉内、动脉内、腹膜内等)向本发明的受试者施用/递送本发明的rAVV单倍体载体和/或组合物或药学制剂。在一些实施方式中，可通过脑室内、脑池内、脑实质内、颅内和/或鞘内途径向受试者施用病毒载体和/或组合物。在具体的实施方式中，本文公开的合理多倍体或单倍体AAV载体和/或本发明的药学制剂鞘内或静脉内施用。
本文公开的rAVV单倍体载体用于在体外、离体和在体内将核酸分子递送至细胞。具体地，rAVV单倍体载体可以有利地用于将核酸分子递送或转移到动物细胞，包括哺乳动物细胞。
任何感兴趣的异源核酸序列都可以在本发明的rAVV单倍体载体中递送。感兴趣的核酸分子包括编码多肽的核酸分子，包括治疗性(例如，用于医学或兽医用途)和/或免疫原性(例如用于疫苗)多肽。
治疗多肽包括但不限于囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、肌营养不良蛋白(包括小肌营养不良蛋白和微肌营养不良蛋白，参见例如，Vincent等，(1993)Nature Genetics5:130；美国专利公开号2003/017131；国际专利公开号WO/2008/088895，Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13714-13719(2000)；和Gregorevic等，Mol.Ther.16:657-64(2008))、肌生长抑制素前肽、卵泡抑素、激活素II型可溶性受体、IGF-1、抗炎多肽(如Ikappa B显性突变体)、sarcospan、肌营养不良蛋白相关蛋白(utrophin)(Tinsley等，(1996)Nature 384:349)、迷你肌营养不良蛋白相关蛋白、凝血因子(如因子VIII、因子IX、因子X等)、促红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、超氧化物歧化酶、瘦素、LDL受体、脂蛋白脂酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、β-珠蛋白、α-珠蛋白、血影蛋白、α1-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖胺酶A、支链酮酸脱氢酶、RP65蛋白、细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白细胞介素-2、白细胞介素-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子、神经营养因子和激素(例如，生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4、脑源性神经营养因子、骨形态发生蛋白[包括RANKL和VEGF]、神经胶质细胞源性生长因子、转化生长因子-α和转化生长因子-β等)、溶酶体酸α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、受体(例如，肿瘤坏死生长因子-α可溶性受体)、S100A1、小清蛋白、6型腺苷酸环化酶、调节钙处理的分子(例如SERCA2A、PP1的抑制剂1及其片段[例如，WO2006/029319和WO 2007/100465])、影响G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子(例如截短的组成型活化的bARKct)、抗炎因子(例如IRAP)、抗肌生长抑制素蛋白、天冬氨酸酰基转移酶、单克隆抗体(包括单链单克隆抗体；示例性Mab是Mab)、神经肽及其片段(例如，甘丙肽、神经肽Y(参见美国专利No.7071172)、血管生成抑制剂(例如Vasohibins和其他VEGF抑制剂；例如，Vasohibin 2[参见WO JP2006/073052])。其他示例性异源核酸序列编码自杀基因产物(例如，胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子)、对癌症治疗中使用的药物赋予耐药性的蛋白质、肿瘤抑制基因产物(例如p53、Rb、Wt-1)、TRAIL、FAS配体和对有需要的受试者具有治疗效果的任何其他多肽。AAV载体也可用于递送单克隆抗体和抗体片段，例如，针对肌生长抑制素的抗体或抗体片段(参见例如，Fang等，NatureBiotechnology23:584-590(2005))。
编码多肽的异源核酸序列包括编码报告多肽(例如，酶)的那些。报告多肽是本领域已知的，并且包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶基因。
任选地，异源核酸分子编码分泌多肽(例如，多肽，其为天然状态的分泌多肽、或已被工程化为分泌的多肽，例如，通过与本领域已知的分泌信号序列的可操作的结合)。
或者，在本发明的具体的实施方式中，异源核酸分子可以编码反义核酸分子、核酶(例如，如美国专利No.5877022所述)、影响剪接体介导的反式剪接的RNA(参见Puttaraju等，(1999)Nature Biotech.17:246；美国专利No.6013487、6083702)、干扰RNA(RNAi)(包括介导基因沉默的siRNA、shRNA或miRNA(参见Sharp等，(2000)Science287:2431))，以及其他未翻译的RNA，如“引导”RNA(Gorman等，(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95:4929；授予Yuan等的美国专利No.5869248)等。
在一个方面，合理多倍体载体包含编码RNAi试剂有效载荷的病毒基因组，其中，例如，所述RNAi试剂可以是但不限于dsRNA、siRNA、shRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA。当RNAi试剂表达时，其抑制或阻抑细胞中的感兴趣的基因的表达，其中感兴趣的基因可以是但不限于SOD1、MAPT、APOE、HTT、C90RF72、TDP-43、APP、BACE、SNCA、ATXN1、ATXN2、ATXN3、ATXN7、SCN1A-SCN5A或SCN8A-SCN11A。
在一个方面，本文公开的合理多倍体载体包含编码多肽有效载荷的病毒基因组。多肽可以是但不限于抗体、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、存活运动神经元1(SMN1)、frataxin(FXN)、APOE(APOE2、APOE3或APOE4)、GBA1、GRN、ASPA、CLN2、GLB1、SGSH、NAGLU、IDS、NPC1或GAN。
示例性的未翻译的RNA包括针对多重耐药(MDR)基因产物的RNAi(例如，用于治疗和/或预防肿瘤和/或用于施用至心脏以防止化疗造成的损伤)、针对肌生长抑制素的RNAi(例如，用于杜兴氏肌营养不良症)、针对VEGF的RNAi(例如，用于治疗和/或预防肿瘤)、针对受磷蛋白的RNAi(例如，用于治疗心血管疾病，参见例如，Andino等，J.Gene Med.10:132-142(2008)和Li等，Acta Pharmacol Sin.26:51-55(2005))；受磷蛋白抑制性或显性失活分子，例如受磷蛋白S16E(例如，用于治疗心血管疾病，参见例如，Hoshijima等Nat.Med.8:864-871(2002))、针对腺苷激酶的RNAi(例如，用于癫痫)、以及针对病原生物和病毒(例如，乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、CMV、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)的RNAi。
此外，可以递送指导选择性剪接的核酸序列。为了说明，与肌营养不良蛋白外显子51的5'和/或3'剪接位点互补的反义序列(或其他抑制性序列)可以与U1或U7小核(sn)RNA启动子联合递送，以诱导该外显子的跳跃。例如，包含位于反义/抑制序列的5'的U1或U7snRNA启动子的DNA序列可以在本发明的经修饰的衣壳中包装并递送。
病毒载体还可包含与宿主细胞染色体上的基因座共享同源性并与之重组的异源核酸分子。例如，这种方法可以用来校正宿主细胞中的遗传缺陷。
本发明还提供表达免疫原性多肽、肽和/或表位的rAVV单倍体载体，例如用于疫苗接种。核酸分子可编码本领域已知的任何感兴趣的免疫原，包括但不限于来自人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、流感病毒、HIV或SIV gag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。
细小病毒作为疫苗载体的用途是本领域已知的(参见例如，Miyamura等，(1994)Proc.Nat.Acad.Sci USA 91:8507；授予Young等的美国专利No.5916563，授予Mazzara等的美国专利No.5905040，授予Samulski等的美国专利No.5882652和No.5863541)。抗原可以存在于细小病毒衣壳中。或者，免疫原或抗原可以由引入重组载体基因组中的异源核酸分子表达。本文所述和/或本领域已知的任何感兴趣的免疫原或抗原都可以由本发明的病毒载体提供。
如本文所公开的用作疫苗的用于通过rAAV单倍体载体递送的免疫原性多肽可以是适于引发免疫应答和/或保护受试者免受感染和/或疾病的任何多肽、肽和/或表位，该感染和/或疾病包括但不限于微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和/或病毒感染和疾病。例如，免疫原性多肽可以是正粘病毒免疫原(例如，流感病毒免疫原，如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白，或马流感病毒免疫源)、或慢病毒免疫原(例如，马传染性贫血病病毒免疫原、猴免疫缺陷病毒(SIV)免疫原、或人类免疫缺陷病毒(HIV)免疫原，如HIV或SIV包膜GP160蛋白、HIV或SW基质/衣壳蛋白，以及HIV或SIV gag、pol和env基因产物)。免疫原性多肽也可以是沙粒病毒免疫原(例如，拉沙热病毒免疫原，例如拉沙热病毒核衣壳蛋白和拉沙热包膜糖蛋白)、痘病毒免疫原(例如，痘苗病毒免疫原，例如痘苗L1或L8基因产物)、黄病毒免疫原(例如，黄热病病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、丝状病毒免疫原(例如埃博拉病毒免疫原或马尔堡病毒免疫原，例如NP和GP基因产物)、布尼亚病毒免疫原(例如RVFV、CCHF和/或SFS病毒免疫原)、或冠状病毒免疫原(例如，传染性人类冠状病毒免疫原(如人类冠状病毒包膜糖蛋白)、或猪传染性胃肠炎病毒免疫原、或禽传染性支气管炎病毒免疫原)。免疫原性多肽还可以是脊髓灰质炎免疫原、疱疹免疫原(例如CMV、EBV、HSV免疫原)、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、风疹免疫原、白喉毒素或其他白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等)免疫原、和/或本领域现在已知的或以后鉴定为免疫原的任何其他疫苗免疫原。
或者，免疫原性多肽可以是任何肿瘤或癌症细胞抗原。任选地，肿瘤或癌症抗原在癌症细胞的表面上表达。示例性癌症和肿瘤细胞抗原描述于S.A.Rosenberg(Immunity 10:281(1991))。其他示例性癌症和肿瘤抗原包括但不限于：BRCA1基因产物、BRCA2基因产物、gp100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、LAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、半胱天冬酶8、KIAA0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15、黑色素瘤肿瘤抗原(Kawakami等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3515；Kawakami等，(1994)J.Exp.Med.，180:347；Kawakami等，(1994)Cancer Res.54:3124)、MART-1、gp100 MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、TRP-1、TRP-2、P-15、酪氨酸酶(Brichard等，(1993)J.Exp.Med.178:489)；HER-2/neu基因产物(美国专利No.4968603)、CA 125、LK26、FB5(内皮唾液酸蛋白)、TAG 72、AFP、CA19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan-1、CA72-4、HCG、STN(唾液酰Tn抗原)、c-erbB-2蛋白、PSA、L-CanAg、雌激素受体、乳脂球蛋白、p53肿瘤阻抑蛋白(Levine，(1993)Ann.Rev.Biochem.62:623)；粘蛋白抗原(国际专利公开号WO 90/05142)；端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳头状瘤病毒抗原；和/或现在已知或后来发现的与以下癌症相关的抗原：黑色素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌以及目前已知或以后鉴定的任何其他癌症或恶性病症(参见例如，Rosenberg，(1996)Ann.Rev.Med.47:481-91)。
作为进一步的替代方案，异源核酸分子可以编码期望在体外、离体或在体内的细胞中产生的任何多肽、肽和/或表位。例如，可以将AAV单倍体载体引入经培养的细胞中，并从中分离表达的基因产物。
本领域技术人员将理解，感兴趣的异源核酸分子可以与适当的对照序列可操作地结合。例如，异源核酸分子可以与表达控制元件(例如转录/翻译控制信号、复制起点、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等)可操作地结合。
此外，感兴趣的异源核酸分子的调节表达可以在转录后水平上实现，例如，通过寡核苷酸、小分子和/或选择性阻断特定位点处的剪接活性的其他化合物(例如，如WO 2006/119137中所述，其通过引用并入本文)的存在或不存在来调节不同内含子的选择性剪接。
本领域技术人员将理解，根据期望的水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子元件。启动子/增强子可以是组成型或诱导型的，这取决于期望的表达模式。启动子/增强子可以是天然的或外来的，并且可以是天然序列或合成序列。外来是指在引入转录起始区的野生型宿主中未发现转录起始区。
在具体的实施方式中，启动子/增强子元件可以是对待处理的靶细胞或受试者而言天然的。在代表性实施方式中，启动子/增强子元件可以是对异源核酸序列而言天然的。在一些实施方式中，启动子序列或调控序列是CNS特异性启动子。在一些实施方式中，CNS特异性启动子公开于英国专利申请GB 2007539.6中，其通过引用整体并入本文。启动子/增强子元件通常被选择为使其在感兴趣的靶细胞(例如CNS组织，包括CNS或PNS中的神经元和非神经元细胞)中起作用。此外，在具体的实施方式中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型的或诱导型的。
诱导型表达控制元件在期望提供对异源核酸序列表达的调控的那些应用中通常是有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的(包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌特异性或优选的)、神经组织特异性或优选的(包括脑特异性或优选的)、眼特异性或优选的(包括视网膜特异性和角膜特异性)、肝特异性或优选的、骨髓特异性或优选的、胰腺特异性或优选的、脾脏特异性或优选的、以及肺特异性或优选的启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性的诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在异源核酸序列于靶细胞中转录然后翻译的实施方式中，通常包括特异性起始信号以有效翻译所插入的蛋白质编码序列。这些外源翻译控制序列可能包括ATG起始密码子和相邻序列，可以是多种来源的，包括天然的和合成的。
根据本发明的AAV单倍体载体提供了将异源核酸分子递送到广泛范围的细胞中的手段，包括分裂细胞和非分裂细胞。AAV单倍体载体可用于在体外将感兴趣的核酸分子递送到细胞，例如在体外产生多肽或用于离体或体内基因治疗。病毒载体额外地可用于将核酸递送至有需要的受试者的方法，例如表达免疫原性或治疗性多肽或功能性RNA。以这种方式，多肽或功能性RNA可以在受试者体内产生。受试者可能需要多肽，因为受试者缺乏多肽。
此外，该方法可被实践，因为受试者中的多肽或功能性RNA的产生可以赋予一些有益效果。
病毒载体也可用于在培养的细胞中或在受试者中产生感兴趣的多肽或功能性RNA(例如，将受试者用作生物反应器来产生多肽或观察功能性RNA对受试者的影响，例如，与筛选方法结合)。
通常，本发明的病毒载体可用于递送编码多肽或功能性RNA的异源核酸分子以治疗和/或预防任何紊乱或疾病状态，递送治疗性多肽或功能性RNA对于该紊乱或疾病状态是有利的。示例性疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)和其他肺部疾病、血友病A(因子VIII)、血友病B(因子IX)、地中海贫血(β-珠蛋白)、贫血(促红细胞生成素)和其他血液病、阿尔茨海默病(GDF；neprilysin)、多发性硬化症(β-干扰素)、帕金森病(神经胶质细胞系源性神经营养因子[GDNF])、亨廷顿病(RNAi以移除重复序列)、肌萎缩侧索硬化症、癫痫(甘丙肽、神经营养因子)和其他神经系统疾病、癌症(内皮抑素、血管抑素、TRAIL、FAS配体、包括干扰素在内的细胞因子；RNAi，包括针对VEGF或多重耐药基因产物的RNAi，mir-26a[例如，用于肝细胞癌])、糖尿病(胰岛素)、肌营养不良症(包括杜兴氏肌营养不良症(肌营养不良蛋白、小肌营养不良蛋白、胰岛素样生长因子I、肌聚糖[例如，α、β、γ]、针对肌生长抑制素的RNAi、肌生长抑制素前肽、卵泡抑素、激活素II型可溶性受体、抗炎多肽(如Ikappa B显性突变体)、sarcospan、肌营养不良蛋白相关蛋白、迷你肌营养不良蛋白相关蛋白、用以诱导外显子跳跃的针对肌营养不良蛋白基因中的剪接连接的反义链或RNAi[参见例如，WO 2003/095647]、用以诱导外显子跳跃的针对U7 snRNA的反义链[参见例如，WO2006/021724]、以及针对肌生长抑制素或肌生长抑制素前肽的抗体或抗体片段))和Becker病、戈谢病(葡萄糖脑苷脂酶)、Hurler病(α-L-艾杜糖醛酸酶)、腺苷脱氨酶缺乏症(腺苷脱氨酶)、糖原贮积症(例如，Fabry病[α-半乳糖苷酶]和庞贝病[溶酶体酸α-葡萄糖苷酶])和其他代谢紊乱、先天性肺气肿(α1-抗胰蛋白酶)、莱施-尼汉综合征(次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶)、尼曼匹克病(鞘磷脂酶)、泰萨二氏病(溶酶体己糖胺酶A)、枫浆尿病(支链酮酸脱氢酶)、视网膜退行性疾病(以及眼睛和视网膜的其他疾病；例如，用于黄斑变性的PDGF和/或vasohibin，或VEGF的其他抑制剂，或用于治疗/预防视网膜疾病(例如I型糖尿病)的其他血管生成抑制剂)；如下的实体器官的疾病，如大脑(包括帕金森病[GDNF]、星形细胞瘤[内皮抑素、血管抑素和/或针对VEGF的RNAi]、胶质母细胞瘤[内皮抑素、血管抑素和/或针对VEGF的RNAi])、肝、肾、心脏(包括充血性心力衰竭或外周动脉疾病(PAD))(例如，通过递送蛋白磷酸酶抑制剂I(I-1)及其片段(例如，I1C)、serca2a、调节受磷蛋白基因的锌指蛋白、Barkct、β2-肾上腺素能受体、β2-肾上腺素能受体激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、S100A1S100A1、小清白、6型腺苷酸环化酶(影响G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子，例如截短的组成型活化的bARKct；calsarcin、针对受磷蛋白的RNAi；受磷蛋白抑制性或显性失活分子，如受磷蛋白S16E等)、关节炎(胰岛素样生长因子)、关节疾病(胰岛素样生长因子1和/或胰岛素样生长因子2)、内膜增生(例如，通过递送enos、inos)、提高心脏移植的存活率(超氧化物歧化酶)、AIDS(可溶性CD4)、肌肉萎缩(胰岛素样生长因子I)、肾虚(促红细胞生成素)、贫血(促红细胞生成素)、关节炎(抗炎因子，例如IRAP和TNFα可溶性受体)、肝炎(α-干扰素)、LDL受体缺乏症(LDL受体)、高氨血症(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、Krabbe病(半乳糖脑苷脂酶)、Batten病、脊髓性脑共济失调(包括SCA1、SCA2和SCA3)、苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶)、自身免疫性疾病等。本发明还可以在器官移植后使用，以增加移植的成功率和/或减少器官移植或辅助治疗的负面副作用(例如，通过施用免疫阻抑剂或抑制性核酸来阻断细胞因子的产生)。作为另一个实例，骨形态发生蛋白(包括BNP 2、BNP 7等、RANKL和/或VEGF)可以与骨同种异体移植物一起施用，例如，在癌症患者的骨折或手术切除之后。
本发明还可用于生产诱导多能干细胞(iPS)。例如，本发明的AVV单倍体载体可用于将干细胞相关核酸递送到非多能干细胞，例如成体成纤维细胞、皮肤细胞、肝细胞、肾细胞、脂肪细胞、心脏细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞等。编码与干细胞相关的因子的核酸是本领域已知的。与干细胞和多能性相关的这些因子的非限制性实例包括Oct-3/4、SOX家族(例如SOX1、SOX2、SOX3和/或SOX15)、Klf家族(例如Klf1、Klf2、Klf4和/或Klf5)、Myc家族(例如C-Myc、L-Myc和/或N-Myc)、NANOG和/或LIN28。
本发明还可用于治疗和/或预防代谢紊乱，例如糖尿病(例如胰岛素)、血友病(例如因子IX或因子VIII)、溶酶体贮积症(例如粘多糖贮积症(例如，Sly综合征[β-葡萄糖醛酸酶]、Hurler综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、Scheie综合征[a-L-艾杜糖醛酸酶]、Huller-Scheie综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、Hunter综合征[艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、Sanfilippo综合征A[乙酰肝素硫酸胺酶]、Sanfilippo综合征B[N-乙酰氨基葡萄糖苷酶]、Sanfilippo综合征C[乙酰辅酶a：α-氨基葡糖苷乙酰转移酶]、Sanfilippo综合征D[N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶]、Morquio综合征A[半乳糖-6-硫酸酯酶]、B[β-半乳糖苷酶]、Maroteaux-Lamy综合征[N-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯酶]等))、Fabry病(α-半乳糖苷酶)、戈谢病(葡萄糖脑苷脂酶)或糖原贮积症(如庞贝病；溶酶体酸α-葡萄糖苷酶)。
基因转移对于理解疾病状态和提供治疗方面具有实质的潜在用途。存在许多的遗传性疾病，其中的缺陷基因是已知的并且已被克隆。一般来说，上述疾病状态分为两类：缺乏状态，通常是酶，其通常以隐性方式遗传；以及不平衡状态，其可能涉及调节或结构蛋白，并且其通常以显性方式遗传。对于缺乏状态疾病，基因转移可以用于将正常基因引入受影响的组织进行替代治疗，以及使用反义突变创建疾病的动物模型。对于不平衡的疾病状态，基因转移可以用于在模型系统中创建疾病状态，然后其可以用于对抗疾病状态。因此，根据本发明的AAV单倍体载体允许治疗和/或预防遗传性疾病。
根据本发明的AVV单倍体载体也可用于在体外或体内向细胞提供功能性RNA。例如，功能性RNA在细胞中的表达可以减少细胞对特定靶蛋白的表达。因此，可以施用功能性RNA以降低有需要的受试者中的特定蛋白质的表达。也可以在体外向细胞施用功能性RNA以调节基因表达和/或细胞生理，例如，用以优化细胞或组织培养系统或用于筛选方法。
此外，根据本发明的AAV单倍体载体可用于诊断和筛选方法，由此，感兴趣的核酸在细胞培养系统或转基因动物模型中瞬时或稳定表达。
本发明的AVV单倍体载体也可用于各种非治疗目的，包括但不限于用于评估基因靶向、清除、转录、翻译等的方案，这对本领域技术人员来说是显而易见的。AAV单倍体载体也可用于评估安全性(传播、毒性、免疫原性等)的目的。例如，在评估临床疗效之前，美国食品药品监督管理局将此类数据视为监管审批流程的一部分。
作为进一步的方面，本发明的AVV单倍体载体可用于在受试者中产生免疫应答。根据该实施方式，可以将包含编码免疫原性多肽的异源核酸序列的AAV单倍体载体施用至受试者，并且受试者针对免疫原性多肽产生主动免疫应答。免疫原性多肽如上文所述。在一些实施方式中，引发保护性免疫应答。
或者，可以将AVV单倍体载体离体施用至细胞，并将经改变的细胞施用至受试者。将包含异源核酸的AVV单倍体载体引入细胞中，并将细胞施用至受试者，其中编码免疫原的异源核酸可以在受试者中表达并诱导针对免疫原的免疫应答。在特定的实施方式中，所述细胞是抗原呈递细胞(例如，树突细胞)。
“主动免疫应答”或“主动免疫”的特征在于“宿主组织和细胞在遇到免疫原后参与。它涉及淋巴网状组织中的免疫活性细胞的分化和增殖，其引起抗体的合成或细胞介导的反应性的发展，或两者兼而有之”。Herbert B.Herscowitz，Immunophysiology:CellFunction and Cellular Interactions in Antibody Formation，IMMUNOLOGY:BASICPROCESSES117(Joseph A.Bellanti ed.，1985)。换句话说，宿主在通过感染或疫苗接种暴露于免疫原后产生主动免疫应答。主动免疫可以与被动免疫形成对比，被动免疫是通过“将预制的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物和白细胞介素-2)从主动免疫宿主转移到非免疫宿主而获得的”。
本文所用的“保护性”免疫应答或“保护性”免疫表明免疫应答对受试者赋予一定的益处，因为它预防或降低了疾病的发生率。或者，保护性免疫应答或保护性免疫可用于治疗和/或预防疾病，特别是癌症或肿瘤(例如，通过预防癌症或肿瘤形成，通过引起癌症或肿瘤消退和/或通过防止转移和/或防止转移性结节生长)。保护作用可以是完全的或部分的，只要治疗的益处超过其任何缺点。
在具体的实施方式中，包含异源核酸分子的AAV单倍体载体或细胞可以以免疫原性有效量施用，如下所述。
通过施用表达一种或多种癌症细胞抗原(或免疫学上相似的分子)的AAV单倍体载体、或产生针对癌症细胞的免疫应答的任何其他免疫原，可施用本发明的AAV单倍体载体以用于癌症免疫疗法。为了说明，可以通过施用包含编码癌症细胞抗原的异源核酸的AAV单倍体载体，在受试者中产生针对癌症细胞抗原的免疫应答，例如用于治疗患有癌症的患者和/或防止癌症在该受试者中发展。如本文所述的，可将AAV单倍体载体在体内或通过使用离体方法施用至受试者。或者，癌症抗原可以作为病毒衣壳的一部分表达或以其他方式与病毒衣壳相关联(例如，如上所述)。
作为另一替代方案，可以施用本领域已知的任何其他治疗性核酸(例如，RNAi)或多肽(例如，细胞因子)来治疗和/或预防癌症。
如本文所用，术语“癌症”涵盖形成肿瘤的癌症。
同样地，术语“癌性组织”涵盖肿瘤。“癌细胞抗原”涵盖肿瘤抗原。
术语“癌症”在本领域中具有其被理解的含义，例如，具有扩散到机体的远处部位(即，转移)的潜力的组织的不受控生长。示例性癌症包括但不限于黑色素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌以及目前已知或以后鉴定的任何其他癌症或恶性病症。在代表性的实施方式中，本发明提供了治疗和/或预防肿瘤形成癌症的方法。
术语“肿瘤”在本领域中也被理解为例如多细胞生物体内的未分化细胞的异常团块。肿瘤可以是恶性的或良性的。在代表性的实施方式中，本文公开的方法用于预防和治疗恶性肿瘤。
术语“治疗癌症”、“癌症的治疗”和等同的术语旨在降低或至少部分消除癌症的严重性和/或减缓和/或控制疾病进展和/或稳定疾病。在具体的实施方式中，这些术语表明癌症的转移被预防或减少或至少部分消除和/或转移性结节的生长被预防或降低或至少部分消除。
术语“癌症的预防”或“预防癌症”和等同的术语旨在使所述方法至少部分消除或减少和/或延迟癌症发作的发病率和/或严重性。换句话说，受试者中的癌症发作的可能性或概率可能降低和/或延迟。
在具体的实施方式中，可从患有癌症的受试者中移出细胞，并与本发明所述的表达癌症细胞抗原的AAV单倍体载体接触。然后，将经修饰的细胞施用至受试者，由此引发针对癌症细胞抗原的免疫应答。这种方法可以有利地用于不能在体内产生足够的免疫应答(即不能产生足够量的增强抗体)的免疫受损受试者。
本领域已知免疫应答可通过免疫调节细胞因子来增强，所述细胞因子例如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、rτ-干扰素、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白细胞介素-14、白细胞介素-18、B细胞生长因子、CD40配体、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、单核细胞趋化蛋白-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和淋巴毒素。因此，可将免疫调节细胞因子(优选CTL诱导的细胞因子)与AAV单倍体载体联合施用至受试者。
细胞因子可通过本领域已知的任何方法施用。可以将外源细胞因子施用至受试者，或者，可以使用合适的载体将编码细胞因子的核酸递送至受试者，并在体内产生细胞因子。
XI.受试者、药学制剂和施用方式
用于本文公开的施用方法的本文公开的AAV单倍体病毒载体和/或合理多倍体AAV载体可以与药学上可接受的赋形剂配制成药物组合物，即一种或多种药学上可接受的载体物质和/或添加剂，例如缓冲剂、载体、赋形剂、稳定剂等。药物组合物可以以试剂盒的形式提供。包含本文公开的用于本文公开的施用方法中的AAV单倍体病毒载体和/或合理多倍体AAV载体的药物组合物及其用途是本领域已知的。
因此，本发明的进一步方面提供了一种用于本文公开的施用方法中的药物组合物，该组合物包含本文公开的AAV单倍体载体。基于正在治疗的受试者的状况、大小和/或本体并进一步基于施用组合物的途径，根据本公开的药物组合物中的活性成分(例如本文公开的AAV单倍体病毒载体和/或合理多倍体AAV载体)、药学上可接受的赋形剂和/或任何附加成分的相对量可以变化。例如，该组合物可以包含0.1％(w/w)至99％(w/w)的活性成分。举例来说，所述组合物可包含0.1％(w/w)与100％(w/w)之间，例如5％(w/w)与50％(w/w)之间、1％(w/w)-30％(w/w)之间、5％(w/w)-80％(w/w)之间、至少80％(w/w)的活性成分。
药物组合物可以使用一种或多种赋形剂或稀释剂配制，以(1)增加稳定性、(2)增加细胞转染或转导、(3)允许持续或延迟释放有效载荷、(4)改变生物分布(例如，将病毒颗粒靶向至特定组织或细胞类型)、(5)增加编码蛋白质的翻译、(6)改变编码蛋白质的释放谱、和/或(7)允许本发明的有效载荷的可调节表达。在一些实施方式中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方式中，赋形剂被批准用于人类和兽医用途。在一些实施方式中，赋形剂可以由美国食品药品监督管理局批准。在一些实施方式中，赋形剂可以是药物级的。在一些实施方式中，赋形剂可以满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。本文所用的赋形剂包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，适合期望的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备该组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:TheScience and Practice of Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro，Lippincott，Williams andWilkins，Baltimore，MD，2006；通过引用将其整体并入本文)。常规赋形剂媒介的使用可在本公开的范围内考虑，除了可能与物质或其衍生物不相容的任何常规赋形剂媒介，例如通过产生任何不期望的生物效应、或以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用。
本文公开的用于本文公开的施用方法中的AAV单倍体病毒载体和/或合理多倍体AAV载体可与一种或多种其他治疗、预防、研究或诊断试剂组合使用。“组合”并不意味着试剂必须同时施用和/或被配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本发明的范围内。组合物可以与一种或多种其他的期望的治疗方法或医疗程序同时、之前或之后施用。在一些实施方式中，当第二种(例如，一种或多种治疗剂)的递送开始时，一种治疗(例如，基因治疗载体)的递送仍在发生，从而在施用方面存在重叠。这有时在本文中被称为“同步”或“同时递送”。在其他实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方式中，由于联合施用，治疗更有效。例如，第二治疗更有效，例如，比起在不存在第一治疗的情况下给予第二治疗或以第一治疗看到的类似情况，用较少的第二治疗看到等同的效果、或者第二治疗在更大程度上减轻症状。在一些实施方式中，递送使得与紊乱相关的症状或其他参数的减少大于在没有另一种治疗的情况下递送的一种治疗所观察到的减少。两种处理的效果可以是部分相加、完全相加或大于相加的。递送可以使得当递送第二治疗时，所递送的第一治疗的效果仍然是可检测的。本文所述的组合物和至少一种额外的治疗可以同时、以相同或分离开的组合物施用、或依次施用。对于连续施用，可以首先施用本文所述的基因治疗载体，并接着可以施用一种或多种治疗剂，或者可以颠倒施用顺序。基因治疗载体和一种或多种治疗剂可以在活跃性紊乱期间、或在疾病缓解或较不活跃的期间施用。基因治疗载体可以在另一次治疗之前、与治疗同时、治疗后或在紊乱缓解期间施用。
当组合施用时，用于本文公开的施用方法中的本文公开的AAV单倍体病毒载体和/或合理多倍体AAV载体与一种或多种治疗剂(例如，第二或第三治疗剂)、或全部可以以如下的量或剂量施用，所述量或剂量高于、低于或相同于单独使用(例如作为单一疗法)的各自的量或剂量。在某些实施方式中，用于本文公开的施用方法中的本文公开的AAV单倍体载体以及一种或多种治疗剂(例如，第二或第三药剂)、或全部的施用量或剂量比单独使用的各自的量或剂量更低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方式中，产生期望效果(例如，心血管疾病或心脏病的治疗)的用于本文公开的施用方法中的本文公开的AAV单倍体载体以及一种或多种治疗剂(例如，第二或第三药剂)、或全部的量或剂量低于(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)实现相同治疗效果各自所需的量或剂量。
在一些实施方式中，本文公开的AAV单倍体载体的施用方法可以单独递送本文公开的rAVV载体、或与附加试剂(例如本文公开的免疫调节剂)组合递送。
根据本发明的AAV单倍体载体、AAV颗粒和衣壳可用于兽医和医学应用。合适的受试者包括禽类和哺乳动物。本文中使用的术语“禽类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、雉鸡、鹦鹉、长尾鹦鹉等。本文中使用的术语“哺乳动物”包括但不限于人类、非人灵长类动物、牛科动物、绵羊、山羊、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔等。
人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年、成人和老年受试者。
在代表性的实施方式中，受试者“需要”本发明的方法。
在具体的实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，所述组合物包含处于药学上可接受的载体中的本发明的AAV单倍体病毒载体和/或合理多倍体AAV载体和/或者AAV单倍体颗粒，以及任选的其他药用试剂、药学试剂、稳定剂、缓冲剂、载体、辅助剂、稀释剂等。对于注射，载体通常是液体。对于其他施用方法，载体可以是固体或液体。对于吸入施用，载体将是可呼吸的，并且任选的可以是固体或液体颗粒形式。对于向受试者施用或对于其他药学用途，载体是无菌和/或生理学上相容的。
“药学上可接受的”是指无毒或不期望的材料，即，该材料可以在不引起任何不期望的生物效应的情况下而被施用至受试者。
本发明的一个方面是一种在体外将核酸分子转移到细胞的方法。可以根据适用于特定靶细胞的标准转导方法以适当的感染复数将AAV单倍体载体引入细胞中。待施用的AAV单倍体载体的滴度可以根据靶细胞类型和数量以及具体的AAV单倍体载体而变化，并且可以由本领域技术人员在无需过度实验的情况下确定。在代表性的实施方式中，将至少约103个感染单位、任选地至少约105个感染单位引入细胞。
向其中引入AAV单倍体载体的细胞可以是任何类型的，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞，如神经元和少突胶质细胞)、肺细胞、眼细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞和角膜细胞)、上皮细胞(例如肠道上皮细胞和呼吸道上皮细胞)、肌细胞(例如骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或膈肌细胞)、树突状细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等。在代表性的实施方式中，细胞可以是任何祖细胞。作为进一步的可能性，细胞可以是干细胞(例如，神经干细胞、肝干细胞)。作为进一步的替代方案，细胞可以是癌症或肿瘤细胞。此外，细胞可以来自任何来源的物种，如上所示。
为了将经修饰的细胞施用至受试者的目的，可将AAV单倍体载体在体外引入细胞中。在具体的实施方式中，从受试者中移除细胞，将AAV单倍体载体引入其中，然后将细胞施用回受试者。从受试者中移出细胞以用于离体操作、然后将其引导回受试者中的方法是本领域已知的(参见例如美国专利5399346)。或者，可以将重组AAV单倍体载体引入来自供体受试者的细胞、引入经培养的细胞或引入来自任何其他合适来源的细胞中，并将细胞施用至有需要的受试者(即“受体”受试者)。
用于离体核酸递送的合适细胞如上所述。向受试者施用的细胞的剂量将根据受试者的年龄、状况和物种、细胞类型、由细胞表达的核酸、施用方式等而变化。通常，在药学上可接受的载体中，每剂施用至少约102至约108个细胞或至少约103至约106个细胞。在具体的实施方式中，将用AAV单倍体载体转导的细胞以治疗有效量或预防有效量与药学载体组合施用至受试者。
在一些实施方式中，将AAV单倍体载体引入细胞中，并且可以将细胞施用至受试者以引发针对所递送的多肽(例如，表达为转基因或在衣壳中)的免疫原性应答。通常，施用一定量的表达免疫原性有效量的多肽的细胞与药学上可接受的载体的组合。“免疫原性有效量”是足以在施用药学制剂的受试者中引起针对多肽的主动免疫应答的经表达的多肽的量。在具体的实施方式中，所述剂量足以产生保护性免疫应答(如上所定义的)。
所赋予的保护程度不需要是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处大于其任何缺点即可。
本发明的进一步的方面是向受试者施用AAV单倍体载体和/或单倍体病毒衣壳的方法。本发明所述的AAV单倍体载体和/或衣壳可通过本领域已知的任何方式施用至有需要的人类受试者或动物。任选地，将AAV单倍体载体和/或单倍体衣壳在药学上可接受的载体中以治疗有效剂量或预防有效剂量递送。
本发明的AAV单倍体载体和/或单倍体衣壳可以进一步施用以引发免疫原性应答(例如，作为疫苗)。通常，本发明的免疫原性组合物包含与药学上可接受的载体组合的免疫原性有效量的AAV单倍体载体和/或衣壳。任选地，所述剂量足以产生保护性免疫应答(如上所定义的)。所赋予的保护程度不需要是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处大于其任何缺点即可。受试者和免疫原如上所述。
待施用至受试者的AAV合理多倍体(例如，单倍体)载体和/或衣壳的剂量取决于施用模式、待治疗和/或预防的疾病或病症、个体受试者的状况、特定的AAV单倍体载体或单倍体衣壳、以及待递送的核酸等，并且可以以常规方式确定。用于实现治疗效果的示例性剂量是至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015个转导单位、任选地约108至约1013个转导单位的滴度。
在一个实施方式中，所述群是至少1×104个病毒基因组(vg)/mL、至少1×105个病毒基因组(vg)/mL、至少1×106个病毒基因组(vg)/mL、至少1×107个病毒基因组(vg)/mL、至少1×108个病毒基因组(vg)/mL、至少1×109个病毒基因组(vg)/mL、至少1×1010个vg/mL、至少1×1011vg/mL、至少1×1012vg/mL。在一个实施方式中，所述群的范围为约1×105vg/mL至约1×1013vg/mL。
在一些实施方式中，在药学上可接受的载体中，每剂施用至少约1.6×1012vg/kg至约4.0×1012vg/kg。在进一步的实施方式中，待向受试者施用的本文公开的单倍体AAV载体的剂量取决于施用模式、待治疗和/或预防的疾病的严重性和类型、个体受试者的状况、年龄和性别、以及存在于多倍体AAV载体中的特定的VP3结构蛋白以及VP1和/或VP2结构蛋白、被递送的转基因、以及控制转基因表达的启动子等，并且可以以常规方式确定。用于实现治疗效果的示例性剂量是至少约1.5×1011vg/kg、或至少约1.5×1012vg/kg、或至少约4.0×1012vg/kg的滴度。其涵盖的是，还可通过如下来确定实现本文所公开的治疗效果的剂量：特定启动子(包括与编码转基因的核酸可操作地连接的脑和神经元启动子)的强度，以及任何信号序列的存在，以及细胞在从细胞中分泌时切割信号序列的能力。
在一些实施方式中，由于与由VP1或AAV VP2结构蛋白的亲代AAV亚型引发的体液应答相比，本文公开的多倍体AAV载体引发较少的体液免疫应答，因此多倍体AAV载体的剂量高于1.6×1012vg/kg、或高于约4.0×1012vg/kg。
在一些实施方式中，用于实现本文公开的多倍体AAV载体的治疗效果的示例性剂量处于1.0E9vg/kg至5.0E11vg/kg的范围内。在一些实施方式中，向受试者施用的剂量为至少约1.0E9vg/kg、至少约1.0E10vg/kg、至少约1.0E11vg/kg、至少约1.0E12vg/kg、约1.1E12vg/kg、约1.2E12vg/kg、约1.3E12vg/kg、约1.4E12vg/kg、约1.5E12vg/kg、约1.6E12vg/kg、约1.7E12vg/kg、约1.8E12vg/kg约1.9E12vg/kg、约2.0E12vg/kg、约3.0E12vg/kg、约4.0E12vg/kg、约5.0E12vg/kg、约6.0E12vg/kg、约7.0E12vg/kg、约8.0E12vg/kg、约9.0E12vg/kg、约1.0E13vg/kg、约1.2E13vg/kg、约1.2E13vg/kg、约1.2E13vg/kg、约1.3E13vg/kg、约1.4E13vg/kg、约1.5E13vg/kg、约1.6E13vg/kg、约1.7E13vg/kg、约1.8E13vg/kg、约1.9E13vg/kg、约2.0E13vg/kg、约3.0E13vg/kg、约4.0E13vg/kg、约5.0E13vg/kg。
在一些实施方式中，根据本文所公开的方法实现治疗效果的示例性剂量为如下的滴度：在1.2E12vg/kg与4.0E12vg/kg之间，例如至少约1.0E12vg/kg、约1.1E12vg/kg、约1.2E12vg/kg、约1.3E12vg/kg、约1.4E12vg/kg、约1.5E12vg/kg、约1.6E12vg/kg、约1.7E12vg/kg、约1.8E12vg/kg、约1.9E12vg/kg、约2.0E12vg/kg、约2.1E12vg/kg、约2.2E12vg/kg、约2.3E12vg/kg、约2.4E12vg/kg、约2.5E12vg/kg、约2.6E12vg/kg、约2.7E12vg/kg、约2.8E12vg/kg、约2.9E12vg/kg、约3.0E12vg/kg、约3.1E12vg/kg、约3.2E12vg/kg、约3.3E12vg/kg、约3.4E12vg/kg、约3.5E12vg/kg、约3.6E12vg/kg、约3.7E12vg/kg、约3.8E12vg/kg、约3.9E12vg/kg、约4.0E12vg/kg。
在一些实施方式中，本文公开的多倍体AAV载体可用于治疗脑或脊髓的疾病或紊乱、或神经元或神经退行性疾病的方法，实现治疗效果的示例性剂量是至少约1.0E12至4.0E12vg/kg、或约1.2E12至3.0E12vg/kg、或约1.2E12至2.5E12vg/kg、或约2.5E12vg/kg至4.0E12vg/kg的滴度。
在具体的实施方式中，可以采用多于一次的施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次等、或更多次施用)，以在不同间隔的时间段内(例如，每小时、每天、每周、每月、每年等)实现期望的基因表达水平。给药可以是单一剂量或累积的(连续给药)，并且可以由本领域技术人员容易地确定。例如，疾病或紊乱的治疗可以包括一次性施用有效剂量的本文公开的药物组合物AAV单倍体载体。或者，疾病或紊乱的治疗可以包括在一系列时间段内进行的有效剂量的AAV单倍体载体的多次施用，例如，每天一次、每天两次、每天三次、每隔几天一次或每周一次。施用的时机可能因个体而异，这取决于个体的症状的严重性等因素。例如，可以每六个月一次向个体施用本文公开的AAV单倍体载体的有效剂量不确定的时间段，或者直到个体不再需要治疗。本领域的技术人员将认识到，可以在整个治疗过程中监测个体的状况，并且可以相应地调整所施用的本文公开的AAV单倍体载体的有效量。
在一个实施方式中，AAV单倍体载体的施用周期为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。在进一步的实施方式中，停止施用的时间段为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。
示例性施用模式包括口服、直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如，通过气雾剂)、经颊(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌内[包括向骨骼肌、膈肌和/或心肌施用]、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、局部(例如，向皮肤和粘膜表面(包括气道表面)、以及透皮施用)、淋巴管内施用等，以及直接的组织或器官注射(例如，至肝脏、骨骼肌、心肌、膈肌或大脑)。也可以是向肿瘤(例如，在肿瘤或淋巴结中或附近)施用。在任何给定的情况下，最合适的途径将取决于正在治疗和/或预防的病症的性质和严重性，并取决于被使用的特定载体的性质。
注射剂可以以常规形式制备，如作为液体溶液或悬浮液、适用于在注射前于液体中溶解或悬浮的固体形式、或作为乳液。或者，可以以局部而非全身性方式(例如以长效制剂或缓释制剂)施用本发明的AAV单倍体载体和/或病毒衣壳。此外，AAV单倍体载体和/或病毒衣壳可以粘附到外科植入基质而递送(例如，如美国专利公开号US2004/0013645中所述)。本文公开的AAV单倍体载体和/或病毒衣壳可以通过任何合适的方式施用至受试者的肺，任选地通过施用由受试者吸入的AAV单倍体载体和/或者病毒衣壳组成的可吸入颗粒的气溶胶悬浮液。可吸入颗粒可以是液体或固体。包含AAV单倍体载体和/或病毒衣壳的液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的方式产生，例如用本领域技术人员已知的压力驱动的气溶胶喷雾器或超声喷雾器。参见例如，美国专利No.4501729。包含AAV单倍体载体和/或衣壳的固体颗粒的气雾剂同样地可以通过药学领域已知的技术用任何固体颗粒药物气雾剂发生器进行生产。
可将AAV单倍体载体和病毒衣壳施用至CNS的组织(例如，大脑、眼)，并且与在不存在本发明的情况下观察到的相比，可以有利地引起AAV单倍体载体或衣壳的更广泛分布。
在具体的实施方式中，可施用本发明的递送载体以治疗CNS疾病，包括遗传性疾病、神经退行性疾病、精神障碍和肿瘤。示例性的CNS疾病包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、Canavan病、利氏病、雷夫叙姆病、抽动秽语综合征、原发性侧索硬化症、肌萎缩侧索硬化症、进行性肌萎缩、皮克氏病、肌营养不良症、多发性硬化症、重症肌无力、宾斯旺格病、脊髓损伤或头部损伤引起的创伤、泰萨二氏病、莱施-尼汉综合征、癫痫、脑梗塞、精神障碍包括情绪障碍(例如抑郁症、双相情感障碍、持续性情感障碍、继发性情绪障碍)、精神分裂症、药物依赖(例如酗酒和其他物质依赖)、神经症(例如焦虑、强迫症、躯体形式障碍、分离性障碍、悲伤、产后抑郁症)、精神病(例如幻觉和妄想症)、痴呆症、偏执、注意力缺陷障碍、性心理障碍、睡眠障碍、疼痛障碍、饮食或体重障碍(例如肥胖、恶病质、神经性厌食症和贪食症(bulemia))以及CNS的癌症和肿瘤(例如垂体瘤)。
CNS紊乱包括涉及视网膜、后束和视神经的眼科紊乱(例如，视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变和其他的视网膜退行性疾病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、青光眼)。
大多数(如果不是全部的话)眼科疾病和紊乱与三种适应症中的一种或多种相关：(1)血管生成、(2)炎症、以及(3)变性。本发明的递送载体可用于递送：抗血管生成因子，抗炎因子，延缓细胞变性、促进细胞保存或促进细胞生长的因子以及上述的组合。
例如，糖尿病性视网膜病变的特征在于血管生成。糖尿病性视网膜病变可以通过在眼内(例如，在玻璃体中)或眼周(例如，在眼球筋膜囊区下)递送一种或多种抗血管生成因子来治疗。一种或多种神经营养因子也可以在眼内(例如，玻璃体内)或眼周共同递送。
葡萄膜炎涉及炎症。可以通过眼内(例如，玻璃体或前房)施用本发明的递送载体来施用一种或多种抗炎因子。
相比之下，视网膜色素变性的特征在于视网膜变性。在代表性实施方式中，视网膜色素变性可以通过眼内施用(例如，玻璃体施用)编码一种或多种神经营养因子的递送载体来治疗。
年龄相关性黄斑变性涉及血管生成和视网膜变性。这种紊乱可以通过在眼内(例如玻璃体)施用编码一种或多种神经营养因子的本发明的递送载体和/或在眼内或眼周(例如眼球筋膜囊区下)施用一种或多种抗血管生成因子的本发明的递送载体来治疗。
青光眼的特征在于眼压升高和视网膜神经节细胞丢失。青光眼的治疗包括使用本发明的递送载体施用一种或多种保护细胞免受兴奋性毒性损伤的神经保护剂。这类药剂包括眼内或任选地玻璃体内递送的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、细胞因子和神经营养因子。
在其他的实施方式中，本发明可用于治疗癫痫发作，例如，减少癫痫的发作、发生率或严重性。癫痫的治疗性处理的效果可以通过行为(例如，摇晃、眼睛或嘴巴的抽动)和/或电图手段来评估(大多数癫痫发作都具有特征性电图异常)。因此，本发明也可用于治疗癫痫，所述癫痫的特征是随着时间推移的多次癫痫发作。
在一个代表性实施方式中，使用本发明的递送载体向大脑施用生长抑素(或其活性片段)以治疗垂体瘤。根据该实施方式，编码生长抑素(或其活性片段)的递送载体通过微量输注施用到垂体中。同样地，这种治疗可以用于治疗肢端肥大症(垂体生长激素分泌异常)。生长抑素的核酸(例如，GenBank登录号J00306)和氨基酸(例如，GenBank登录号P01166；包含经加工的活性肽生长抑素-28和生长抑素-14)序列是本领域已知的。
在具体的实施方式中，载体可包含如美国专利No.7071172所述的分泌信号。
在本发明的代表性实施方式中，将AAV单倍体载体和/或病毒衣壳施用至CNS(例如，至大脑或眼)。可将AAV单倍体载体和/或衣壳引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体腺、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体，大脑包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶、皮层、基底神经节、海马体和门杏仁核)、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。AAV单倍体载体和/或衣壳也可以施用至眼的不同区域，例如视网膜、角膜和/或视神经。
AAV单倍体载体和/或衣壳可以被递送到脑脊液中(例如，通过腰椎穿刺)以更分散地施用递送载体。
在血脑屏障受到干扰的情况下(例如，脑瘤或脑梗死)，AAV单倍体载体和/或衣壳可进一步血管内施用至CNS。
可以通过本领域已知的任何途径将AAV单倍体载体和/或衣壳施用至CNS的期望区域，包括但不限于鞘内、眼内、脑内、脑室内、静脉内(例如，在如甘露醇的糖的存在下)、鼻内、耳内、眼内(例如，玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如，眼球筋膜囊区下)递送、以及伴随向运动神经元的逆行递送的肌内递送。
在具体的实施方式中，AAV单倍体载体和/或衣壳以液体制剂形式通过直接注射(例如，立体定向注射)而施用至CNS中的期望的区域或隔室。在其他实施方式中，AAV单倍体载体和/或衣壳可以通过局部施用到期望的区域或通过鼻内施用气雾剂制剂来提供。对眼的施用可以通过液滴的局部应用来进行。作为进一步的替代方案，AAV单倍体载体和/或衣壳可以作为固体缓释制剂施用(参见例如，美国专利No.7201898)。
在另外的实施方式中，AAV单倍体载体可用于逆行递送，以治疗和/或预防涉及运动神经元的疾病和紊乱(例如，肌萎缩侧索硬化症(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。例如，AAV单倍体载体可以被递送到肌肉组织，该载体从那里可以迁移到神经元中。
本说明书的各方面部分公开了部分地治疗患有疾病或紊乱的个体。如本文所用，术语“治疗”是指减少或消除个体的疾病或紊乱的临床症状；或者延缓或防止个体中疾病或紊乱的临床症状的发作。例如，术语“治疗”可以指将以疾病或紊乱为特征的病症的症状减少例如至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。与特定的疾病或紊乱相关的实际症状是众所周知的，并且可以由本领域技术人员通过考虑如下的因素来确定，这些因素包括但不限于疾病或紊乱的定位、疾病或紊乱的诱因、疾病或紊乱的严重性和/或受疾病或紊乱影响的组织或器官。本领域技术人员将知道与特定类型的疾病或紊乱相关的适当症状或指标，并且将知道如何确定个体是否为本文所公开的治疗的候选者。
在该实施方式的各方面中，本文公开的治疗有效量的AAV单倍体载体将与疾病或紊乱相关的症状减少例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在该实施方式的其他方面，本文公开的治疗有效量的AAV单倍体载体将与疾病或紊乱相关的症状减少例如至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多35％、至多40％、至多45％、至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％。在该实施方式的另一个方面中，本文公开的治疗有效量的AAV单倍体载体将与疾病或紊乱相关的症状减少例如约10％至约100％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约20％至约20％、约20％至约60％、约20％至约50％、约20％至约40％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约30％至约70％、约30％至约60％、或约30％至约50％
在一个实施方式中，与未接受相同治疗的患者相比，本文公开的AAV单倍体载体能够将向患者施用的AAV单倍体载体中编码的蛋白质的水平和/或量增加例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在该实施方式的其他方面中，与未接受相同治疗的患者相比，AAV单倍体载体能够将患有疾病或紊乱的个体个的疾病或紊乱的严重性降低例如约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约70％约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、或约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％、或约50％至约70％。
在该实施方式的各方面中，与未接受相同治疗的个体相比，本文公开的治疗有效量的AAV单倍体载体将个体中的AAV单倍体载体内编码的蛋白的量增加例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在该实施方式的其他方面中，本文公开的治疗有效量的AAV单倍体载体将个体中的疾病或紊乱的严重性降低或维持例如至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多35％、至多40％、至多45％、至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％。在该实施方式的其他方面中，本文公开的治疗有效量的AAV单倍体载体将个体中的疾病或紊乱的严重性降低或维持例如约10％至约100％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约20％至约20％、约20％至约60％、约20％至约50％、约20％至约40％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约30％至约70％、约30％至约60％、或约30％至约50％。
将AAV单倍体载体施用至个体或患者。个体或患者通常是人，但也可以是动物，包括但不限于狗、猫、鸟、牛、马、绵羊、山羊、爬行动物和其他动物，无论是否驯养。
在一个实施方式中，本发明的AAV单倍体载体可用于产生靶向特定组织的AAV，所述组织包括但不限于中枢神经系统、视网膜、心脏、肺、骨骼肌和肝脏。这些靶向AAV单倍体载体可用于治疗组织特异性的疾病，或用于生产在特定的正常组织中内源性产生的蛋白质，如因子IX(FIX)、因子VIII、FVIII和本领域已知的其他蛋白质。
X.免疫调节
在本文公开的方法和组合物的任何实施方式中，向施用了本文公开的rAAV载体或rAAV基因组的受试者还施用免疫阻抑剂。已知多种方法引起施用AAV的患者的免疫应答受到免疫阻抑。本领域已知的方法包括向患者施用免疫阻抑剂，例如蛋白酶体抑制剂。本领域已知的一种这样的蛋白酶体抑制剂是硼替佐米，例如在美国专利No.9169492和美国专利申请No.15/796137中公开的，将二者通过引用并入本文。在另一个实施方式中，免疫阻抑剂可以是抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体、scfv或其他抗体衍生的分子，其能够阻抑免疫应答，例如通过消除或阻抑抗体产生细胞。在进一步的实施方式中，免疫阻抑元件可以是短发夹RNA(shRNA)。在这样的实施方式中，shRNA的编码区被包含在rAAV盒中，并且通常位于poly-A尾部的3'的下游。shRNA可以被靶向以减少或消除免疫刺激剂的表达，如细胞因子、生长因子(包括转化生长因子β1和β2、TNF和公众已知的其他因子)。
在一些实施方式中，使用本文所述的AAV单倍体载体和AAV基因组的方法和组合物进一步包括施用免疫调节剂。在一些实施方式中，免疫调节剂可以在施用AAV单倍体载体时、施用rAAV单倍体载体之前或施用rAAV单倍体载体之后施用。
在一些实施方式中，免疫调节剂是免疫球蛋白降解酶，例如IdeS、IdeZ、IdeS/Z、Endo S或其功能变体。这种免疫球蛋白降解酶及其用途的参考文献的非限制性实例如US7666582、US 8133483、US 20180037962、US20180023070、US20170209550、US 8889128、WO2010/057626、US 9707279、US 8323908、US20190345533、US20190262434和WO2020/016318中所描述的，其各自通过引用整体并入。
在一些实施方式中，免疫调节剂是蛋白酶体抑制剂。在某些方面，蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。在实施方式的一些方面，免疫调节剂包括硼替佐米和抗CD20抗体、利妥昔单抗。在实施方式的其他方面，免疫调节剂包括硼替佐米、利妥昔单抗、甲氨蝶呤和静脉注射丙种球蛋白。这些参考文献的非限制性实例公开了蛋白酶体抑制剂及其与利妥昔单抗、甲氨蝶呤和静脉注射丙种球蛋白的组合，如US10028993、US 9592247和US 8809282中所述，将其各自通过引用整体并入。
在替代的实施方式中，免疫调节剂是NF-kB途径的抑制剂。在实施方式的某些方面，免疫调节剂是雷帕霉素或其功能性变体。公开雷帕霉素及其用途的参考文献的非限制性实例如US10071114、US 20160067228、US20160074531、US20160074532、US20190076458、US10046064所述，将它们以其整体并入。在实施方式的其他方面，免疫调节剂是包含免疫阻抑剂的合成纳米载体。免疫阻抑剂、偶联到合成的纳米载体的免疫阻抑剂、包含雷帕霉素的合成的纳米载体和/或耐受性合成的纳米载体、它们的剂量、施用和用途的参考文献的非限制性实例在如下中描述：US20150320728、US20180193482、US20190142974、US20150328333、US20160243253、US10039822、US20190076522、US 20160022650、US10441651、US10420835、US20150320870、US 2014035636、US10434088、US10335395、US20200069659、US10357483、US20140335186、US10668053、US10357482、US20160128986、US 20160128987、US20200038462、US20200038463中所述，其各自通过引用整体并入。
在一些实施方式中，免疫调节剂是包含雷帕霉素的合成的纳米载体(ImmTORTM纳米颗粒)(Kishimoto等，2016，Nat Nanotechnol，11(10):890-899；Maldonado等，2015，PNAS，112(2)：E156-165)，如US20200038463和美国专利9006254中所公开的，将其各自整体并入本文。在一些实施方式中，免疫调节剂是经工程化的细胞，例如已经使用WO2017192786中公开的SQZ技术进行修饰的免疫细胞，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，免疫调节剂选自于由如下所组成的组：poly-ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PEPTEL、载体系统、PLGA微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys和Aquila’s QS21stimulon。在另一个进一步的实施方式中，免疫调节剂或辅助剂是poly-ICLC。
在一些实施方式中，免疫调节剂是抑制细胞中的先天免疫应答的小分子，如氯喹(TLR信号传导抑制剂)和2-氨基嘌呤(PKR抑制剂)，也可与包含本文公开的至少一种rAAV的组合物联合施用。可商购的TLR信号传导抑制剂的一些非限制性实例包括BX795、氯喹、CLI-095、OxPAPC、多粘菌素B和雷帕霉素(均可从INVIVOGENTM购买)。此外，还可将模式识别受体(PRR)的抑制剂(参与先天免疫信号传导)(如2-氨基嘌呤、BX795、氯喹和H-89)用于包含本文公开的至少一种rAAV载体的组合物和方法中，以用于如本文所公开的体内蛋白质表达。
在一些实施方式中，AAV单倍体载体也可以编码先天免疫的负调节因子，如NLRX1。因此，在一些实施方式中，AAV单倍体载体还可以任选地编码NLRX1、NS1、NS3/4A或A46R中的一种或多种，或其任何组合。此外，在一些实施方式中，包含本文公开的至少一种AAV单倍体载体的组合物还可以包含先天免疫系统的合成的经修饰的RNA编码抑制剂，以避免由组织或受试者产生先天免疫应答。
在一些实施方式中，用于本文公开的施用方法中的免疫调节剂是免疫阻抑剂。如本文所用，术语“免疫阻抑药物或试剂”旨在包括抑制或干扰正常免疫功能的药学试剂。适用于本文公开的方法的免疫阻抑剂的实例包括抑制T细胞/B细胞共刺激通路的试剂，例如通过CTLA4和B7通路干扰T细胞和B细胞的偶联的试剂，如美国专利公开号2002/0182211中公开的。在一个实施方式中，免疫阻抑剂是环孢菌素A。其他实例包括霉酚酸酯(myophenylate mofetil)、雷帕霉素和抗胸腺细胞球蛋白。在一个实施方式中，免疫阻抑药物以包含如本文所公开的至少一种rAAV载体的组合物中施用，或者可以以分开的组合物施用，但根据如本文所公开的施用方法，在施用包含至少一个AAV单倍体载体的组合物的同时、之前或之后施用。免疫阻抑药物以与施用途径相容的制剂施用，并以足以达到期望的治疗效果的剂量施用至受试者。在一些实施方式中，瞬时施用免疫阻抑药物足够的时间以诱导对本文公开的rAAV载体的耐受性。
在本文公开的方法和组合物的任何实施方式中，向施用了本文公开的AAV单倍体载体或rAAV基因组的受试者还施用免疫阻抑剂。已知多种方法引起施用AAV的患者的免疫应答受到免疫阻抑。本领域已知的方法包括向患者施用免疫阻抑剂，例如蛋白酶体抑制剂。本领域已知的一种这样的蛋白酶体抑制剂是硼替佐米，例如在美国专利No.9169492和美国专利申请No.15/796137中公开的，将二者通过引用并入本文。在一些实施方式中，免疫阻抑剂可以是抗体，包括能够例如通过消除或阻抑抗体产生细胞来阻抑免疫应答的多克隆、单克隆、scfv或其他抗体衍生的分子。在进一步的实施方式中，免疫阻抑元件可以是短发夹RNA(shRNA)。在这样的实施方式中，shRNA的编码区被包含在rAAV盒中，并且通常位于poly-A尾部的3'下游。shRNA可被靶向以减少或消除免疫刺激剂的表达，如细胞因子、生长因子(包括转化生长因子β1和β2、TNF和其他已知的物质)。
这种免疫调节剂的使用促进了个人在数月和/或数年内使用多次给药(例如多次施用)的能力。这允许使用如下讨论的多种试剂、例如编码多个基因的AAV单倍体载体，或向受试者多次施用。
在一些实施方式中，本申请可以在以下的任何段落中定义：
1.适用于穿过血脑屏障的合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述合理多倍体AAV病毒粒子包含AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种和AAV VP3病毒结构蛋白；
其中，所述VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种各自来自任何AAV血清型，并且所述VP3病毒结构蛋白来自有效穿过所述血脑屏障、且不同于VP1或VP2中的至少一种的血清型的AAV血清型，并且
其中，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群能够穿过所述血脑屏障(BBB)和/或转导BBB的内皮细胞和/或在全身性施用或鞘内施用时穿过BBB的血液成分。
2.如段落1所述的群，其中，相对于缺乏穿过所述血脑屏障的能力的非合理多倍体AAV颗粒，所述群表现出增强的穿过所述血脑屏障(BBB)的转导活性。
3.如段落1-2中任一段所述的群，其中，所述VP3病毒结构蛋白是AAV恒河猴血清型。
4.如段落1-3中任一段所述的群，其中，所述VP3病毒结构蛋白来自有效穿过所述血脑屏障的血清型，所述血清型选自于由AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAVrh39和AAVrh43所组成的组。
5.如段落1-4中任一段所述的群，其中，相对于缺乏有效穿过所述血脑屏障的能力的非合理多倍体AAV颗粒，所述群对受试者的皮层、纹状体、丘脑、髓质、海马体、小脑和脊髓中的一个或多个具有增强的转导。
6.如段落1-5中任一段所述的群，其中，相对于AAV2，所述群在一个或多个CNS区域中具有增强的转导，所述CNS区域选自于由髓质、颈部、胸部、腰椎和脉络丛所组成的组。
7.如段落1-6中任一段所述的群，其中，相对于AAV8，所述群具有增强的与脑微血管内皮细胞(BMVEC)的结合。
8.如段落1-7中任一段所述的群，其中，所述群在CNS中具有生物分布。
9.如段落1-8中任一段所述的群，其中，所述群具有至少0.05vg/细胞、0.1vg/细胞、至少0.2vg/细胞、至少0.4vg/细胞、至少0.6vg/细胞、至少0.8vg/细胞、至少1vg/细胞、至少5vg/细胞、至少10vg/细胞、至少20vg/细胞、至少25vg/细胞或优选更多的CNS生物分布。
10.如段落1-9中任一段所述的群，其中，所述VP1或VP2中的至少一个选自穿过血脑屏障的AAV血清型。
11.如段落1-9中任一段所述的群，其中，所述VP1或VP2中的至少一个选自不穿过血脑屏障的AAV血清型。
12.如段落1-11中任一段所述的群，其中，所述VP1或VP2中的至少一个不选自AAV恒河猴血清型。
13.如段落1-11中任一段所述的群，其中，所述VP1或VP2中的至少一个选自AAV恒河猴血清型。
14.如段落1-13中任一段所述的群，其中，与由所述VP1或VP2结构蛋白亚型的亲代AAV载体引发的体液应答相比，当向受试者施用时，所述群引发较低的体液免疫应答。
15.如段落1-14中任一段所述的群，其中，所述群逃避针对AAV VP1、VP2或VP3病毒结构蛋白的亲代血清型的中和抗体。
16.一种穿过受试者的血脑屏障递送转基因的方法，所述方法包括向所述受试者施用段落1-15中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
17.一种向受试者重复给予AAV的方法，所述方法包括通过向所述受试者施用段落1-16中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群而进行的第一施用，以及通过向所述受试者施用VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种的亲代AAV血清型而进行的第二施用，其中，与由所述VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引发的体液应答相比，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群引发减少的体液应答，并且其中，所述VP2或VP1中的至少一个不来自恒河猴AAV血清型。
18.一种允许重复给药的合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述群包括：
合理多倍体AAV病毒粒子，所述病毒粒子包含AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种和AAV VP3病毒结构蛋白；其中，所述VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种各自来自任何AAV病毒血清型，并且所述VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAV血清型；其中，与由所述VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引发的体液应答相比，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群引发减少的体液应答；其中，所述VP1或VP2中的至少一个不来自恒河猴AAV血清型，并且其中，所述重复给药包括所述合理多倍体AAV病毒粒子的群的第一施用，以及所述VP1结构病毒蛋白或VP2结构病毒蛋白的亲代AAV血清型的第二施用。
19.一种合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述群包含：(a)选自AAV8病毒血清型的VP1和VP2 AAV病毒结构蛋白，以及(b)选自AAV恒河猴血清型AAV rh10或AAVrh74的VP3，其中，相对于由亲代AAV8血清型引发的相应的体液应答，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群在被施用至受试者时引发减少的体液应答。
20.一种重复给药的方法，包括对受试者进行第一AAV施用和第二AAV施用，该方法包括：通过向所述受试者施用来自段落1-16或18-19中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群进行所述第一施用，以及通过施用VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型进行所述第二施用，其中，与由所述VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引发的相应的体液应答相比，所述第一施用在所述受试者中引发减少的体液应答，并且其中，VP1或VP2不来自恒河猴AAV血清型。
21.如段落18-20中任一段所述的群，其中，所述群逃避针对AAV VP1、VP2或VP3病毒结构蛋白的亲代血清型的中和抗体。
22.一种穿过受试者的血脑屏障递送转基因的方法，所述方法包括向所述受试者施用段落18-21中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
23.如前述段落中任一段所述的群，其中，所述VP3蛋白是来自AAVrh10或AAVrh74血清型的突变的VP3蛋白。
24.如段落23所述的群，其中，所述突变的AAVrh74 VP3蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或为与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的蛋白，或其中所述突变的AAVrh74VP3包含SEQ ID NO:2的至少一种以下的修饰：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H、N736P。
25.如段落24所述的群，其中，所述突变的AAVrh10 VP3蛋白由SEQ ID NO:5的核酸编码，与SEQ ID NO:5的AAVrh10 VP3核酸相比，包含Q214N、S462N和D517E突变中的至少一个或多个；或包含与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性的核酸序列，包含选自Q214N、S462N和D517E中的至少一个突变。
26.如段落25所述的群，其中，所述VP3蛋白是包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的AAVrh74 VP3蛋白或者与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的蛋白，或包含SEQ ID NO:2的至少一种以下的氨基酸修饰：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H、N736P。
27.如段落1-26中任一段所述的实质上同类的病毒粒子的群，其中，所述群为至少101个病毒粒子。
28.一种核酸，所述核酸以5'至3'的方向包含：a.第一核酸，所述核酸编码与第一启动子可操作地连接的AAVrh10 VP3衣壳蛋白；b.第一poly A序列；c.第二核酸，所述核酸编码rep蛋白；d.第三核酸，所述核酸编码AAV8 VP1和VP2病毒结构蛋白，所述第三核酸序列不能表达AAV8 VP3病毒结构蛋白；以及e.第二poly A序列。
29.一种核酸，所述核酸以5'至3'的方向包含：a.第一核酸，所述核酸编码与第一启动子可操作地连接的AAVrh74 VP3衣壳蛋白；b.第一poly A序列；c.第二核酸，所述核酸编码rep蛋白；d.第三核酸，所述核酸编码AAV8 VP1和VP2病毒结构蛋白，所述第三核酸序列不能表达AAV8 VP3病毒结构蛋白；以及e.第二poly A序列。
30.一种病毒载体，所述病毒载体包含：a.AAV病毒粒子，所述病毒粒子来自前述段落中任一段所述的群；以及b.核酸，所述核酸包含至少一个末端重复序列和异源基因，其中，所述核酸通过所述AAV病毒粒子包封。
31.如前述段落中任一段所述的群，所述群包含嵌合或修饰的病毒结构蛋白，其中，所述修饰的病毒结构蛋白包含一个或多个氨基酸的插入、缺失或替换。
32.如段落27所述的实质上同类的群，其中，与包含亲代AAV血清型的实质上同类的病毒粒子的群相比，所述实质上同类的群在体内于血清中引发显著更少的针对VP1或VP2结构蛋白的亲代AAV血清型的抗AAV IgG抗体。
33.如段落32所述的实质上同类的群，其中，所述亲代AAV血清型是AAV8。
34.一种允许重复给药的合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述群包括：
AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种和AAV VP3病毒结构蛋白；
其中，所述VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自除恒河猴AAV血清型之外的任何AAV病毒血清型，并且所述VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAV血清型；
其中，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群逃避针对所述VP3病毒结构蛋白的亲代AAV恒河猴血清型的中和抗体，其中，所述重复给药包括所述VP3结构蛋白的亲代AAV恒河猴血清型的第一施用，以及所述合理多倍体AAV病毒粒子的群的第二施用，并且其中，所述合理多倍体病毒粒子的VP3结构蛋白是AAV恒河猴突变的病毒结构蛋白VP3。
35.如段落34所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述AAV恒河猴突变的病毒结构蛋白VP3来自突变的AAVrh10 VP3病毒结构蛋白或来自突变的AAVrh74 VP3病毒结构蛋白。
36.如段落34-35中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变的病毒结构蛋白VP3包含在对应于选自于由N263、G264、T265、S266T、G268、T270、T274和E533所组成的组中的氨基酸的氨基酸处的突变，其中，所有氨基酸位置对应于AAVrh10或AAVrh74的天然VP1序列编号。
37.如段落36所述的群，其中，所述突变选自于由N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H和E533K所组成的组。
38.如段落34-37中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变的病毒结构蛋白VP3进一步包含在对应于选自于由R727和N737所组成的组中的氨基酸的氨基酸处的突变，其中，所有氨基酸位置对应于AAVrh10的天然VP1序列编号。
39.如段落38所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变选自于由R727H和N737P所组成的组。
40.如段落34-37中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变的病毒结构蛋白VP3进一步包含在对应于选自于由R726和N736所组成的组中的氨基酸的氨基酸处的突变，其中，所有氨基酸位置对应于AAV rh74的天然VP1序列编号。
41.如段落40所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变选自于由R726H和N736P所组成的组。
42.如段落41所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变的病毒结构蛋白VP3进一步包含在对应于581处的W的氨基酸处的突变，其中，W被两个后随的V残基(VV)取代，并且其中所有氨基酸位置对应于AAVrh74的天然VP1序列编号。
43.如段落34-42中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述AAVVP1或VP2病毒结构蛋白是选自表1的任何AAV血清型。
44.如段落34-43中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述AAVVP1或VP2结构蛋白是AAV8。
45.合理多倍体AAV病毒粒子的群在制造用于穿过血脑屏障递送转基因的药物中的用途，所述药物包含段落1-15或18-19、21、23-27、31-44中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
46.如段落45所述的用途，其中，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群包含选自AAV8病毒血清型的VP1和VP2 AAV病毒结构蛋白、以及选自AAV恒河猴血清型AAVrh10或AAVrh74的VP3病毒结构蛋白。
47.如段落45所述的用途，其中，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群包含来自AAV8病毒血清型的VP1和VP2 AAV病毒结构蛋白、以及来自AAV恒河猴血清型AAVrh74的VP3结构蛋白。
48.如段落45所述的用途，其中，所述药物用于治疗脑部疾病或脑部紊乱或神经退行性疾病或神经系统疾病。
49.如段落45所述的用途，其中，所述药物用于治疗中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)的疾病。
50.如段落45所述的用途，其中，所述药物用于治疗患有脑癌或脑部癌症的受试者。
51.如段落45所述的用途，其中，所述药物用于治疗患有选自以下的疾病或紊乱的受试者：阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和多巴胺转运体缺乏综合征。
52.核酸在制备如下药物中的用途，所述药物包含用于递送转基因穿过血脑屏障的合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述核酸包含段落28或29中的任一段。
53.合理多倍体AAV病毒粒子的群在制备用于如下方法的第一药物和第二药物中的用途，所述方法用于第一药物的第一施用和第二药物的第二施用的重复给药，其中，所述重复给药包括第一药物的第一施用以及第二药物的第二施用，所述第一药物包含来自段落1-15或18-19中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子，所述第二药物包括VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种的亲代AAV血清型，
其中，与由所述VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种的亲代AAV血清型引发的体液应答相比，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群引发减少的体液应答，并且其中所述VP2或VP1不来自恒河猴AAV血清型。
54.合理多倍体AAV病毒粒子的群在制备用于逃避针对AAV VP1、VP2或VP3的亲代血清型的中和抗体的药物中的用途，所述药物包含段落1-15或18-19、21、23-27和31-44中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
55.合理多倍体AAV病毒粒子的群在制备用于将转基因递送至小肠的药物中的用途，所述药物包含段落1-15或18-19、21、23-27和31-44中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
56.合理多倍体AAV病毒粒子的群在制备用于治疗胃肠疾病或紊乱的药物中的用途，所述药物包含段落1-15或18-19、21、23-27和31-44中任一段所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
例如但不限于，申请人保留从本申请现在或将来修订的任何权利要求或由此衍生的任何专利中放弃以下的主题中的一个或多个的权利：
经修饰的病毒衣壳可以用作“衣壳媒介”，例如在美国专利No.5863541中所描述的。可以由经修饰的病毒衣壳包装并转移到细胞中的分子包括异源DNA、RNA、多肽、小的有机分子、金属或其组合。
实施例
材料和方法
细胞系
将Pro10细胞、HEK293细胞、Huh7细胞和C2C12细胞在37℃、5％ CO2下维持在具有10％胎牛血清和10％青霉素-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基中。
重组单倍体AAV8病毒生产
重组AAV通过三重质粒转染系统生产。将HEK293细胞的15cm培养皿用9μg AAV转基因质粒pTR/CBA-Luc、12μg AAV辅助质粒和15μg Ad辅助质粒XX680转染。为了产生AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74单倍体病毒粒子，将图1中所示的质粒进行共转染，该质粒包含用于产生AAV8-8-rh10的rh10 VP3核酸或用于产生AAV8-8-rh74单倍体的rh74VP3核酸。转染后60小时，收集HEK293细胞并裂解。使上清液经受CsCl梯度超离心。通过定量PCR测定病毒滴度。
在一些实施方式中，将rAAV基因组包装到单倍体AAV衣壳中以使用rAAV生产细胞系生成单倍体rAAV载体。仅为了证明rAAV载体构建的原理，所使用的衣壳是AAV8单倍体衣壳。
在rAAV生产细胞系中制备rAAV：将三重转染技术用于在悬浮rAAV生产细胞系中制造rAAV，其可被放大以制备临床级载体。或者，可以使用不同的质粒，例如，1)pXX680-ad辅助质粒，以及2)pXR3(Rep和Cap 3)和转基因质粒(ITR——转基因-ITR)。
使用rAAV生产细胞系产生rAVV多倍体(例如合理多倍体载体)的方法可以根据美国专利9441206中描述的方法进行，该专利通过引用整体并入本文。具体地，rAAV载体或rAAV病毒粒子使用如下方法产生，该方法包括：(a)提供rAAV生产细胞系，即AAV表达系统；(b)在产生AAV颗粒的条件下培养细胞；以及(c)任选地分离AAV颗粒。质粒的三重转染比例和转染混合物体积可以优化，用XX680、AAV rep/cap辅助质粒和TR质粒的不同质粒比例来确定rAAV载体生产的最佳质粒比例。
在某些情况下，将细胞在产生AAV8单倍体颗粒的条件下在悬浮液中培养。在另一个实施方式中，将细胞在无动物成分的条件下培养。无动物成分培养基可以是与rAAV生产细胞系相容的任何无动物成分的培养基(例如，无血清培养基)。实例包括但不限于SFM4Transfx-293(Hyclone)、Ex-Cell 293(JRH Biosciences)、LC-SFM(Invitrogen)和Pro10细胞或Pro293-S(Lonza)。足以复制和包装AAV颗粒的条件可以是例如AAV序列(例如，AAV rep序列和AAV cap序列)以及来自腺病毒和/或疱疹病毒的辅助序列的存在，所述AAV序列足以复制本文所述的rAAV基因组并包封到AAV衣壳中。
在重组AAV载体的制造过程中，来自质粒骨架的细菌DNA序列可以被包装到AAV8单倍体衣壳中，使得通过其与TLR9的相互作用激活先天免疫系统(Akira，2006；Chadeuf，2005；Wright，2014)。
在一些实施方式中，可以使用各种技术来消除重组AAV单倍体制剂中的质粒骨架序列，例如具有有限的可扩展性的小环(Schnodt，2016)。避免质粒骨架中的细菌DNA序列的另一种方法是使用封闭末端线性双链DNA，其包括一系列DNA复制技术，包括但不限于doggybone DNA(dbDNATM)，用于特异性地制造重组AAV载体。使用封闭末端线性双链DNA、如dbDNATM消除细菌骨架，并已被用于生产疫苗和慢病毒(Walters等，2014；Scott等，2015；Karda等，2019)，并被示出不能触发DNA疫苗开发物的TLR9应答。
因此，在替代的实施方式中，例如，用于本文公开的方法和组合物中的本文公开的rAAV合理多倍体载体(例如AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh10单倍体)的产生，可以使用封闭末端线性双链DNA进行，包括但不限于Doggybone技术(dbDNATM)，如在美国申请2018/0037943和Karbowniczek等，Bioinsights，2017中所公开的，将二者通过引用整体并入本文。简言之，使用封闭末端线性双链DNA技术生产AAV的质粒可以包括ITRs、启动子和感兴趣的基因，该基因侧接有56bp的回文原核端粒酶识别序列。在实施方式的一些方面中，ITR为145bp或更小。在实施方式的某些方面中，ITR为130bp。将质粒变性，并在Phi29 DNA聚合酶和适当引物的存在下，Phi29启动滚环扩增(RCA)，产生原始构建体的双链多联体重复序列。当加入原核端粒酶时，发生回文原核端粒酶识别序列的结合，并发生切割连接反应，以产生单体双链(ds)线性共价封闭的DNA构建体。添加常见的限制性内切酶移除了不期望的DNA质粒骨架序列并用核酸外切酶活性进行消化，产生杠铃形DNA，可进行大小分级以分离编码ITRs、启动子和感兴趣的基因的杠铃形DNA序列。使用包含杠铃形DNA的封闭末端线性双链DNA产生rAAV载体的示例性质粒以如下的5'至3'方向包含：5'-原核端粒酶RS、5'ITR、LSP启动子、hGAA、3'UTR、hGH poly(A)、3'ITR和3'-原核端粒酶RS(有义链)，其中，将有义链与用于链状(ds)线性共价封闭的DNA构建体的互补的反义链连接。使用封闭末端线性双链DNA、例如杠铃形DNA作为用于本文公开的方法和组合物中的制造AAV载体的起始材料，消除了用于繁殖含有AAV载体的质粒而使产物不能触发Toll样受体9(TLR9)应答的细菌骨架。
蛋白质和免疫印迹
根据病毒滴度，在每个泳道中装载相同量的病毒粒子，然后在NuPage 4-10％聚丙烯酰胺Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)上进行电泳，然后通过2干印迹系统(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)转移到PVDF膜。将膜与对AAV衣壳蛋白而言特异性的抗Cap抗体进行孵育。
如前所述进行天然免疫印迹测定。简而言之，通过使用真空斑点印迹仪器将经纯化的衣壳转移到Hybond-ECL膜(Amersham，Piscataway，N.J.)。将膜在10％牛奶PBS中封闭1小时，然后与单克隆抗体ADK8孵育。将膜与过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体孵育1小时。通过Amersham Imager 600(GE Healthcare Biosciences，Pittsburgh，Pa.)对蛋白质进行可视化。
体外转导测定
将Huh7、C2C12细胞和GM16095细胞在平底24孔板中用1×104vg/细胞的重组病毒转导。48小时后，收获细胞并通过荧光素酶测定系统(Promega，Madison，Wis.)进行评估。
动物研究
在本研究中实施的动物实验是用C57BL/6小鼠进行的。将这些小鼠按照UNC机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的NIH指南饲养。6或7周龄雌性C57BL/6小鼠通过尾静脉来静脉内(iv)注射5×1010vg/小鼠或2.5×1012vg/小鼠的合理单倍体载体AAV8-Luc(亲代对照)、AAV8-8-rh10-Luc、AAV8-8-rh74-Luc和AAVrh10-Luc(亲代对照)病毒(n＝4)。在各组中，将一只额外的经盐水注射的小鼠用作阴性对照(n＝7)。将载体在制剂缓冲液(FB；10mM磷酸盐、2.7mM KCl、350mM NaCl、5％山梨醇、0.001％pluronic F68，pH 7.4)中进行稀释。每组中包括接受溶媒(FB)的一只额外的小鼠作为阴性对照。
体内阶段处理：观察动物的一般状况、身体位置、相互作用的能力和对刺激物的应答。记录任何异常情况。在研究期间每周监测小鼠的体重(数据未显示)。在荧光素酶测量之前，通过腹膜内注射以75mg/kg氯胺酮和15mg/kg利多卡因(xylacine)的剂量混合的氯胺酮(100mg/mL，Richter Pharma AG)与利多卡因(20mg/mL，BayerAnimal Health GmbH)，将动物进行麻醉。
在D-荧光素底物(Nanolight Pinetop，Ariz.)的i.p.注射后，使用Xenogen IVISLumina(Caliper Lifesciences，Waltham，MA)注射后一周对荧光素酶表达进行成像。使用Living Image(PerkinElmer，Waltham，Mass.)分析生物发光图像。在指定的时间点对小鼠进行成像。
接下来，评估AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74单倍体病毒在小鼠脑、脊髓和小肠中的转导效率。还注射AAV8和AAVrh10病毒作为对照。通过尾静脉对C57BL/6小鼠注射3×1010vg重组病毒，并在AAV注射后第3天进行成像。
转基因表达
为了确定转基因表达，按照制造商的说明，用16LEV simplyRNA细胞/组织试剂盒(Promega)从组织中提取总RNA。然后，用DNase I处理RNA，并使用M-MLV逆转录酶和随机引物逆转录成cDNA。程序在C1000 Touch ThermalCycler(BioRad)中进行。
在CFX Connect实时系统中使用TaqMan Fast Advanced Master Mix通过逆转录(RT)-qPCR进行定量分析。cDNA通过实时qPCR进行定量，使用特异性测定法检测荧光素酶(Mr03987587_mr)或小鼠gapdh管家基因(Mm99999915_g1；两者均通过Askbio选择并购自Thermo Fisher Scientific)，并用作荧光素酶数据的归一化的参考基因。使用2-ΔCt方法进行相对定量。
统计分析
将数据表示为平均值±SD。使用学生t检验进行所有统计分析。P值<0.05被认为是统计显著性差异。
实施例1
使用合理设计方法产生单倍体AAV8病毒粒子-通过应用合理多倍体方法，将AAV8单倍体病毒粒子与来自AAV8载体的VP1/VP2和来自仅一种恒河猴AAV(AAVrh)血清型的VP3组装，从单倍体AAV8载体增强AAV转导。
实施例1是说明性实施例，其公开了处于任何顺序的分别来自AAV8和穿过BBB的任何血清型的VP1和VP3衣壳蛋白的示例性组合(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，以及任选地来自AAV8或穿过BBB的任何血清型的VP2衣壳蛋白(包括但不限于恒河猴AAV(AAVrh)血清型)。虽然AAVrh10和AAVrh74衣壳蛋白被显示为穿过BBB的示例性血清型(并且其也是AAVrh血清型)，但它们可以容易地被来自穿过BBB的任何其他血清型的VP3蛋白取代或替换(包括但不限于例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43或其他AAVrh血清型)。类似地，将AAV8显示为VP1和/或VP2蛋白的示例性血清型，但本文涵盖的是，来自AAV8的VP1和/或VP2蛋白可容易地被任何血清型取代或替换，例如，AAV2或本文表1中公开的任何其它血清型。
在本文中，本发明人证明了CNS(和/或PNS)中的增强的转导可以从具有如下的单倍体载体实现：来自AAV8载体衣壳的VP1/VP2，以及来自穿过BBB的替代性血清型(例如rhAAV10或rhAAV74)的VP3、或来自rhAAV10或rhAAV74的经修饰的VP3蛋白。
通过不同的AAV血清型产生VP1、VP2和VP3为产生这些不同的蛋白质提供了两种不同的策略。有趣的是，VP蛋白是从单个CAP核苷酸序列翻译而来的，具有VP1、VP2和VP3的重叠序列。
Cap基因编码3种蛋白质：VP1、VP2和VP3。VP1基因包含VP1、VP2和VP3蛋白，且VP2包含VP2和VP3蛋白。因此，Cap基因具有3个片段，VP1的起点——VP2的起点——VP3的起点——所有3种VP蛋白的终点。
在合理单倍体的实施方式中，Cap基因的来源可以来自两种不同的AAV血清型(指定为血清型X或Y(例如，对于选自表1的任何血清型，例如AAV8)和血清型Z(对于穿过BBB的AAV血清型，包括但不限于AAVrh))，存在三种Cap蛋白的6种可能的组合。在一种情况下，被鉴定为血清型AAV8(或嵌合的或其他非天然存在的AAV8)的VP1仅来自AAV8，而被鉴定为血清型Y的VP2/VP3仅来自血清型Y、并且是不同于VP1的血清型(或嵌合的或其他非天然存在的AAV)的血清型。在一种情况下，VP1和VP2都仅来自AAV8，而VP3仅来自血清型Z，其中，血清型Z是穿过BBB的AAV血清型和/或非人灵长类AAV血清型。在本文示出的实施例中公开了产生AAV8的VP1和血清型Z的VP2/VP3、或来自AAV8血清型的VP1/VP2和来自血清型Z的VP3。在一种情况下，VP1和VP3仅来自第一血清型，而VP2仅来自第二血清型。
表5：AAV8单倍体或AAV8多倍体载体的示例性组合，其中，血清型Z是穿过BBB的任何AAV血清型，或者，来自非人灵长类动物，包括恒河猴AAV血清型(AAVrh)，而血清型X为非AAV8或血清型Z的第三AAV血清型，并且其中，血清型X可以是作为恒河猴AAV血清型(AAVrh)的任何AAV血清型，或者可以为非AAV8或血清型Z的任何血清型或者嵌合或非天然存在的血清型。
VP1 VP2 VP3
AAV8 AAV8 血清型Z
AAV8 血清型Z 血清型Z
AAV8 血清型X 血清型Z
AAV8 血清型Z 血清型X
AAV8 血清型X 血清型X
在一些实施方式中，VP1不是AAV8，前提是AAV8单倍体包含来自AAV8的VP1、VP2或VP3中的至少一个，将以下的组合在表6中示出：
表6：示例性的AAV8单倍体载体，其中VP1不是AAV8，而是包含来自AAV8的VP1、VP2或VP3中的至少一种，并且其中血清型Z来自穿过BBB的任何血清型，或者可选地，来自任何恒河猴AAV血清型(AAVrh)，而不是AAV8，
VP1 VP2 VP3
AAV8 血清型Z 血清型Z
AAV8 血清型Z AAV8
AAV8 AAV8 血清型Z
血清型Z 血清型Z AAV8
血清型Z AAV8 血清型Z
血清型Z AAV8 AAV8
在一些实施方式中，Cap基因来源于三种不同的AAV血清型(指定为AAV8、X和Z)，其中存在三种Cap蛋白的6种可能的组合。在这种情况下，从AAV8鉴定的VP1(或AAV8的嵌合或其他非天然存在的AAV)不同于VP2和VP3的血清型；VP2被鉴定为血清型X，其是与VP1和VP3的血清型不同的血清型，并且来自第二血清型；并且，VP3的血清型被鉴定为血清型Z，其是不同于VP1的血清型和VP2的血清型的血清型，来自第三血清型。将产生第一血清型的VP1、第二血清型的VP2和第三血清型的VP3的方法公开于本文所示的实施例中。
表7：包含来自AAV8的至少一种VP蛋白的示例性AAV8单倍体载体，其中VP1、VP2或VP3各自来自不同的血清型，并且其中血清型Z是穿过BBB的任何AAV血清型和/或是非人灵长类AAV血清型并且不是AAV8，而血清型X可以是穿过BBB的任何AAV血清型和/或非人灵长类AAV血清型，或者可以为非AAV8或血清型Y的任何血清型或者嵌合或非天然存在的血清型。
VP1 VP2 VP3
AAV8 血清型X 血清型Z
AAV8 血清型Z 血清型X
血清型X AAV8 血清型Z
血清型X 血清型Z AAV8
血清型Z AAV8 血清型X
血清型Z 血清型X AAV8
在一个实施方式中，当VP1是AAV8，并且将VP2和VP3鉴定为第二血清型Z时，应当理解的是，在一个实施方式中，这意味着VP1仅来自AAV8，而VP2和VP3仅来自血清型Z，其中血清型Z来自穿过BBB的任何血清型。在另一个实施方式中，当VP1被鉴定为AAV8，VP2被鉴定为第二血清型X，且VP3被鉴定为第三血清型Z时，应当理解的是，在一个实施方式中，这将意味着VP1仅来自AAV8；VP2仅来自血清型X；并且VP3仅来自血清型Z。如以下实施例中将更详细描述的，在一个实施方式中，为了使用两种不同的血清型产生单倍体载体，可以包括仅表达来自AAV8的VP1的来自AAV8(或嵌合或其他非天然存在的AAV)的VP1核苷酸序列和仅来自第二血清型的VP2和/或VP3的第二核苷酸序列，以及仅来自第三血清型的VP3。在一个实施方式中，VP1/VP2仅来自AAV8血清型，而VP3仅来自第二血清型，例如，穿过BBB的血清型和/或非人灵长类AAV血清型而不是AAV8。
在3种不同的Cap基因的情况下，辅助质粒可以用来自三种AAV血清型的特定VP蛋白的核苷酸序列的完整拷贝来生成。单个Cap基因将产生与特定AAV血清型(指定为AAV8、X和Z)相关的VP蛋白。这些核苷酸序列可以用非功能性或失活的起始位点进行修饰，以仅允许优选的VP蛋白的表达，如本文实施例3-实施例4中所公开的。
表8：具有VP蛋白的核苷酸序列的单个构建体。
VP1 VP2 VP3
AAV8 血清型X 血清型Z
AAV8 血清型Z 血清型X
血清型X AAV8 血清型Z
血清型X 血清型Z AAV8
血清型Z AAV8 血清型X
血清型Z 血清型X AAV8
在一个实施方式中，当VP1被鉴定为AAV8，而VP2被鉴定为第二血清型X，且VP3被鉴定为第三血清型Z时，可以理解的是，在一个实施方式中，这意味着VP1仅来自AAV8；VP2仅来自血清型X，而VP3仅来自血清型Z。如在下面的实施例中更详细地描述的，产生这样的单倍体载体将包括：来自AAV8的VP1的核苷酸序列，其仅表达来自AAV8的VP1，而不表达来自AAV8的VP2或VP3；第二核苷酸序列，其表达血清型X的VP2而不表达血清型X的VP3；以及第三核苷酸序列，其表达血清型Z的VP3。
在某些实施方式中，单倍体病毒粒子仅包含VP1和VP3衣壳蛋白。在一些实施方式中，单倍体包含来自AAV8的VP1、和来自穿过BBB的任何血清型和/或非人灵长类AAV血清型且不是AAV8的VP3。在某些实施方式中，单倍体病毒粒子包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。在一些实施方式中，单倍体包含来自AAV8的VP1、来自穿过BBB的任何血清型和/或非人灵长类AAV血清型且不是AAV8的VP2和/或VP3。
应该注意的是，在形成单倍体AAV8病毒粒子的VP1与VP3的各种组合、或形成单倍体AAV8病毒粒子的VP1/VP2/VP3的各种血清型组合的这些实施方式的每一个中，表达衣壳蛋白的核苷酸序列可以从一个或多个载体(例如质粒)表达。在一个实施方式中，表达VP1、或VP2或VP3的核酸序列是经密码子优化的，使得核苷酸序列之间的重组显著减少，特别是当从一个载体(例如质粒等)表达时。
实施例2
具有来自AAV8的VP1/VP2、和来自穿过BBB的血清型和/或非人灵长类AAV血清型的VP3的合理多倍体(例如，合理多倍体载体)增强了AAV转导。
实施例2是说明性实施例，其公开了处于任何顺序的分别来自AAV8和穿过BBB的任何血清型的VP1和VP3衣壳蛋白的示例性组合(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，以及任选地来自AAV8或穿过BBB的任何血清型的VP2衣壳蛋白(包括但不限于恒河猴AAV(AAVrh)血清型)。虽然AAVrh10和AAVrh74衣壳蛋白被显示为穿过BBB的示例性血清型(并且其也是AAVrh血清型)，但它们可以容易地被来自穿过BBB的任何其他血清型的VP3蛋白取代或替换(包括但不限于例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43或其他AAVrh血清型)。类似地，将AAV8显示为VP1和/或VP2蛋白的示例性血清型，来自AAV8的VP1和/或VP2蛋白可容易地被本领域技术人员取代或替换为本文表1中公开的任何血清型。
为了阐明单个合理多倍体(例如单倍体AAV8载体)中的哪些AAV亚基比AAV8有助于更高的转导，制备了如下不同的构建体：AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74，它们仅表达AAV8VP1/VP2，并且仅从AAVrh10或AAVrh74表达VP3。将这些质粒用于生产单倍体AAV8载体。将示例性的质粒构建体在图1和图28中示出。
通过尾静脉注射而静脉内施用，每只小鼠注射5×1010vg的这些单倍体AAV8载体后，通过每周IVIS成像评估生物分布。单倍体AAV8-8-rh74载体诱导比AAV8或AAVrh10显著更高的全身性转导(参见图21A-21D)，与AAV8、AAVrh10相比，显示了出乎预料的穿过BBB的能力。
实施例3
从AAV8和第二血清型(例如，AAVrh10或AAVrh74)产生AAV8-8-Z合理多倍体衣壳以及起始密码子的突变
实施例3是说明性实施例，其公开了处于任何顺序的分别来自AAV8和穿过BBB的任何血清型的VP1和VP3衣壳蛋白的示例性组合(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，以及任选地来自AAV8或穿过BBB的任何血清型的VP2衣壳蛋白(包括但不限于恒河猴AAV(AAVrh)血清型)。虽然AAVrh10和AAVrh74衣壳蛋白被显示为穿过BBB的示例性血清型(并且其也是AAVrh血清型)，但它们可以容易地被来自穿过BBB的任何其他血清型的VP3蛋白取代或替换(包括但不限于例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43或其他AAVrh血清型)。类似地，将AAV8显示为VP1和/或VP2蛋白的示例性血清型，来自AAV8的VP1和/或VP2蛋白可容易地被本领域技术人员取代或替换为本文表1中公开的任何血清型。
在该实施例中，合理多倍体AAV8病毒粒子(例如，单倍体AAV8病毒粒子)由两种不同血清型的衣壳组装而成，如图1和图28所示。本实施例讨论了示例性AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体病毒粒子的生产。然而，本领域技术人员将能够容易地使用VP3，该VP3来自穿过BBB的任何AAV血清型和/或非人灵长类AAV血清型。此外，可以容易地将AAV8 VP2蛋白替换为穿过BBB的任何AAV血清型和/或非人灵长类AAV血清型，其可以是与用于VP3衣壳蛋白的血清型相同或不同的血清型。
在该实验中，将仅来自AAV8血清型的VP1、VP2和VP3的核苷酸序列连接到辅助质粒中，并且将仅来自第二AAV血清型(例如，穿过BBB和/或来自非人灵长类AAV血清型的AAV血清型)的VP3连接到相同或不同的辅助质粒中，使得辅助质粒包含来自两个不同血清型的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。在将编码VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的第一和第二血清型核苷酸序列连接到辅助质粒中之前或之后，对衣壳核苷酸序列进行改变以提供仅来自AAV8血清型的VP1和VP2以及仅来自第二血清型的VP3。在该实施例中，AAV8的VP3的两个ACG起始位点发生突变，使得这些起始密码子不能启动从AAV8血清型的VP3衣壳蛋白的核苷酸序列转录的RNA的翻译。特别地，在AAV8核苷酸序列中，两个ATG起始密码子变为GTG，以产生氨基酸取代M203V和M211V，这阻止了VP3 AAV8衣壳蛋白的翻译和表达。类似地，在一些实施方式中，辅助质粒仅包含其他血清型(例如，AAVrh10或AAVrh74)的VP3基因。在替代的实施方式中，VP1和VP2的ATG起始位点可以在编码第二血清型的衣壳蛋白(例如，AAVrh10或AAVrh74)的核苷酸序列中突变，使得这些密码子不能启动编码VP1和VP2的RNA的翻译，但是可以启动两个VP3的翻译。因此，在该实施例中，产生了单倍体AAV8病毒粒子，其包括仅来自AAV8血清型的VP1和VP2而非VP3、以及仅来自第二血清型(例如，AAVrh10或AAVrh74)的VP3而非VP1和VP2。
在应用通过起始密码子突变产生单倍体AAV8病毒粒子的这种合理方法学技术时，AAV8的VP3的起始密码子发生突变，如图5中所高亮示出的，使得VP1和VP2从图1和图6中所示的质粒转录的RNA进行翻译。因此，起始密码子的突变提供了敲除VP1、VP2和VP3中的一种或多种的表达的方法。因此，在该实施例中，产生了单倍体AAV8病毒粒子，其包含仅来自AAV8血清型的VP1和VP2而非VP3，以及仅来自第二AAV血清型(例如，AAVrh10或AAVrh74)的VP3而非VP1或VP2。代表性的单倍体AAV8载体可以是例如AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74。
从两种不同的血清型(AAV8和AAVrh10或AAVrh74)产生AAV8-Y-Z单倍体衣壳以及剪接受体位点的突变
在本实施例中，多倍体AAV病毒粒子由两种不同血清型的衣壳组装而成。将仅来自AAV8血清型的VP1、VP2和VP3的核苷酸序列连接到辅助质粒中，并且将仅来自第二AAV血清型(例如，AAVrh10或AAVrh74)的VP1、VP2和VP3连接到相同或不同的辅助质粒中，使得辅助质粒包括来自两种不同血清型的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。在将编码VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的第一和第二血清型核苷酸序列连接到辅助质粒之前或之后，对衣壳核苷酸序列进行改变以提供仅来自AAV8血清型的VP1和仅来自第二AAV血清型(例如，AAVrh10或AAVrh74)的VP2和VP3。在该实施例中，第一血清型的核苷酸序列已通过对A2剪接受体位点进行突变而改变，如图1所示。在本实施例中，通过对A2剪接受体位点进行突变，不会产生来自AAV8的VP2和VP3衣壳蛋白。类似地，通过对A1剪接受体位点进行突变，不会产生来自第二AAV血清型的VP1衣壳蛋白，而产生VP2和VP3衣壳蛋白。因此，在该实施例中，产生了单倍体AAV8病毒粒子，其包括仅来自AAV8血清型的VP1而非VP2或VP3，以及仅来自第二AAV血清型(例如，AAVrh10或AAVrh74)的VP2和VP3而非VP1。代表性的单倍体AAV8载体可以是例如AAV8-rh10-rh10和AAV8-rh74-rh74。
从三种不同的血清型(AAV8、由X和Y表示的血清型)产生AAV8-X-Y多倍体衣壳以及起始密码子和剪接受体位点的突变
在本实施例中，多倍体AAV病毒粒子由三种不同血清型的衣壳组装而成。构建辅助质粒，使得如下的核苷酸序列被连接至辅助质粒中，从而使辅助质粒包括来自三种不同血清型的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核酸序列：仅来自AAV8血清型的VP1、VP2和VP3，仅来自第二AAV血清型(称为“X”AAV血清型)的VP1、VP2和VP3，以及仅来自第三AAV血清型(称为“Z”AAV血清型，例如，穿过BBB的血清型，本文以AAVrh10或AAVrh10为例)的VP1、VP2和VP3。在将编码来自三种不同血清型中的每一种的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列连接到辅助质粒之前或之后，衣壳核苷酸序列被改变以提供仅来自AAV8血清型的VP1、仅来自X AAV血清型的VP2、以及仅来自Z血清型(例如，BBB血清型、AAVrh10或AAVrh74)的VP3。在本实施例中，AAV8血清型的VP1核苷酸序列已通过对VP2和VP3衣壳蛋白的起始密码子进行突变而改变。在该实施例中，VP2的ACG起始密码子和VP3的两个ATG起始密码子发生突变，使得这些密码子不能启动来自第一血清型的VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列转录的RNA的翻译。类似地，第二X血清型的VP1和VP3核苷酸序列已经通过对VP1和VP3衣壳蛋白的起始密码子进行突变而改变。在该实施例中，VP1的ATG起始位点和VP3的两个或三个ATG起始密码子发生突变，使得这些密码子不能启动从X血清型VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列转录的RNA的翻译。此外，第三Z血清型(例如，AAVrh10或AAVrh74)的VP1和VP2核苷酸序列已经通过对VP1和VP2衣壳蛋白的起始密码子进行突变而改变。在该实施例中，VP1的ATG起始密码子和VP2的ACG起始密码子发生突变，使得这些密码子不能启动从Z血清型(例如，穿过BBB的血清型，例如，示例性的血清型AAVrh10或AAVrh74)的VP1和VP2衣壳蛋白的核苷酸序列转录的RNA的翻译。或者，辅助质粒仅包含编码来自第三Z血清型(例如，AAVrh10或AAVrh74)的VP3的核酸。因此，在该实施例中，产生了多倍体AAV病毒粒子，其包括仅来自AAV8血清型的VP1而非VP2或VP3；仅来自第二Z血清型的VP2而非VP1或VP2；以及仅来自第三Z血清型(例如，AAVrh10或AAVrh74)的VP3而非VP1或VP2。通过该方法产生的代表性单倍体AAV8载体可以是例如AAV8-X-rh10和AAV8-X-rh74，其中X是来自任何AAV血清型的VP2蛋白，但特别是穿过BBB的AAV血清型和/或非人灵长类AAV血清型。
使用两种质粒从两种不同的血清型产生AAV8合理多倍体，例如AAV8单倍体衣壳
在该实施例中，使用两种质粒产生包含来自AAV8的VP1/VP2和来自AAVRh10或AAVrh74的VP3的单倍体AAV8病毒粒子。产生包含质粒骨架以及Ad Early Genes和Rep(例如，来自AAV2)的辅助质粒。该辅助质粒将仅编码来自AAV8的衣壳蛋白的核苷酸序列和仅编码AAVrh10或AAVrh74的衣壳蛋白的单独的核苷酸序列连接到其中。关于编码AAV8衣壳蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列具有被突变以防止VP3的翻译的VP3的起始密码子和/或被突变以防止剪接的A2剪接受体位点。关于编码AAVrh10或AAVrh74的衣壳蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列具有被突变以防止翻译的VP1和VP2的起始密码子和/或被突变以防止剪接的A1剪接受体位点，或仅包含编码VP3衣壳蛋白的核酸序列的一部分。将辅助质粒以及编码具有两个ITR的转基因的质粒一起转染到ATCC号PTA13274的HEK293细胞系中(参见例如，美国专利No.9441206)。从上清液中纯化病毒并进行表征。
使用三种质粒从两种不同的血清型产生单倍体衣壳
在该实施例中，使用三种质粒产生单倍体AAV8病毒粒子，该病毒粒子包含来自AAV8的VP1/VP2和来自AAVrh10或AAVth74的VP3。产生包含Ad Early基因的第一辅助质粒。产生包含质粒骨架和Rep(例如AAV2)的第二辅助质粒。该第二辅助质粒将仅编码来自AAV8的衣壳蛋白的核苷酸序列和仅编码AAVrh10或AAVrh74的衣壳蛋白的单独的核苷酸序列连接到其中。关于编码AAV8的衣壳蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列具有被突变以防止翻译的VP3的起始密码子和/或被突变以防止剪接的A2剪接受体位点。关于编码AAVrh10或AAVrh74的衣壳蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列具有被突变以防止翻译的VP1和VP2的起始密码子和/或被突变以防止剪接的A1剪接受体位点，或者该核苷酸序列仅编码AAVrh10或AAVrh74的VP3衣壳蛋白。将辅助质粒与编码具有两个ITR的转基因的质粒一起转染到ATCC号PTA 13274的HEK293细胞系中(参见例如，美国专利No.9441206)。
使用具有VP1、VP2或VP3中的任何一个或多个的ATG起始密码子的突变的一个、两个、三个或四个质粒，或使用DNA改组，用本文讨论的示例性的单倍体AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74产生AAV8单倍体(例如本文公开的AAV-8-X-Y或AAV8-Y-Y)的其他方法可以如美国专利10550405中所公开的那样使用，其通过引用整体并入本文。
实施例4
AAV8-8-Rh10和AAV8-8-rh74合理多倍体的生产、纯化和分析
实施例4是说明性实施例，其公开了分别来自AAV8和穿过BBB的任何血清型的VP1和VP3衣壳蛋白的示例性组合(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，以及任选地来自AAV8或穿过BBB的任何血清型的VP2衣壳蛋白(包括但不限于恒河猴AAV(AAVrh)血清型)。虽然AAVrh10和AAVrh74衣壳蛋白被显示为穿过BBB的示例性血清型(并且其也是AAVrh血清型)，但它们可以容易地被来自穿过BBB的任何其他血清型的VP3蛋白取代或替换(包括但不限于例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43或其他AAVrh血清型)。类似地，将AAV8显示为VP1和/或VP2蛋白的示例性血清型，尽管来自AAV8的VP1和/或VP2蛋白可容易地被本领域技术人员取代或替换为本文表1中公开的任何血清型。
与AAV8和AAVrh10病毒粒子的产量和生产相比，本发明人评估了AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体、包括其变体(例如AAV8-8-rh74vv、AAV8-8-rh10LP2、AAV8-8-rh74LP2、AAV8-8-rh74vvLP2)的产量。图6显示了通过蛋白质印迹从AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体检测到的VP1、VP2和VP3蛋白的表达。如通过qPCR和ELISA所确定的，通过细胞比生产率来评估生产，并证明AAV8-8-rh10的产率与AAV8和AAVrh10对照相当，而与AAV8-8-rh10和对照相比，AAV8-8-rh74处于较低的产率水平。平均值的比较在统计学上不显著(参见图8)。还显示了亲和层析和阴离子交换层析(AEX)结果(参见图9A-图9B)。
AAV8-8-rh10的生产和纯化与AAV8和AAVrh10对照类似，具有相当的回收特性(图10C)。与在下游单元操作中具有低回收率的AAV8和AAVrh10对照相比，上游生产中的AAV8-8-rh74的生产和纯化略低(参见图10D)。AAV8和AAVrh10对照按预期施行(图10A-图10B)。与AAV8-8-rh10LP2(6.11E+12vg/ml)相比，AAV8-8-rh74LP2具有显著更少的生产产量或生产滴度(5.02E+09vg/ml)。
使用AAV8最终载体材料得出CE-SDS方法的结果(参见图11B)。在数百次制备/分析中，6:2:1的比例与载体非常一致。然而，对于其他血清型，这些比例略有变化(AAV9接近9:1:1)(参见图12B)。这些比例被用作接受标准，但被局限于AAV8单倍体血清型。有趣的是，本发明人发现，这些AAV8-8-rh74和AAV8-8-rh10样品中的VP3蛋白迁移以覆盖小的前峰(其被称为VP3b)，而VP2和VP1与AAV8标准完全对准(参见图12A)。
实施例5
Rh74 VP3优化--AAV8-8-rh74vv的生产
实施例5是说明性实施例，其公开了处于任何顺序的分别来自AAV8和穿过BBB的任何血清型的VP1和VP3衣壳蛋白的示例性组合(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，以及任选地来自AAV8或穿过BBB的任何血清型的VP2衣壳蛋白(包括但不限于恒河猴AAV(AAVrh)血清型)。虽然AAVrh10和AAVrh74衣壳蛋白被显示为穿过BBB的示例性血清型(并且其也是AAVrh血清型)，但它们可以容易地被来自穿过BBB的任何其他血清型的VP3蛋白取代或替换(包括但不限于例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43或其他AAVrh血清型)。类似地，将AAV8显示为VP1和/或VP2蛋白的示例性血清型，但是来自AAV8的VP1和/或VP2蛋白可容易地被本领域技术人员取代或替换为本文表1中公开的任何血清型。
如先前的实施例1-实施例4所证明的，与亲代AAV8相比，或与AAV8-8-rh10单倍体相比，AAV8-8-rh74具有较低的产量，本发明人比较了AAVrh74和AAVrh10的VP3衣壳蛋白的序列。如图22所示，在AAVrh10(SEQ ID NO:1)和AAVrh74(SEQ ID NO：3)的VP3蛋白之间存在4个氨基酸的差异。具体地，将SEQ ID NO:1(AAVrh10 VP3)用作参考序列，存在以下的氨基酸变化：Q417N、VV581W、S665N和D720E，以将SEQ ID NO:1(AAVrh10-VP3)改变为SEQ ID NO:3，其为AAVrh74的VP3衣壳蛋白(即AAVrh74-VP3)的氨基酸序列(参见图23A-图23C和图28)。
由于AAV8-8-rh74单倍体载体比起AAV8-8-rh10具有显著更少的产量，本发明人单独评估了各突变。具体地，本发明人进行了单独的rh74至rh10(rh74>rh10)氨基酸修饰，并将AAV8-8-rh74载体改变为包含选自以下的一种修饰：SEQ ID NO:3中的N417Q修饰、W581VV修饰、N664S或E719D修饰(命名/编号使用来自AAVrh74的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列)，并将生产倍数与未修饰的AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74单倍体衣壳进行比较(参见图29A)。如图29A所示，将VP3 AAVrh74衣壳蛋白的氨基酸改变为具有-W581VV突变使产量显著增加4倍，类似于未修饰的AAV8-8-rh10的产量。也就是说，将SEQ ID NO:3的581位的W替换为VV显著增加了产量，而其他突变对增加AAV8-8-rh74单倍体衣壳的产量没有显著影响。为了证实这一点，本发明人在AAVrh10的VP3衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)中进行了相应的氨基酸取代(即，VP3rh10＞VP3rh74的单独修饰)，其中将VP3 AAVrh74的氨基酸差异引入AAVrh10的VP3衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)——特别是，将Q417N、V581del、V582W、S665N和D720E替换引入AAVrh10的VP3衣壳(SEQ ID NO:1)中。如图29B所示，只有V581del和V582W修饰显著降低了AAV8-8-rh10载体的产量。这通过DNase和蛋白酶K处理后的qPCR分析得到证实(参见图29C)。在一些替代的实施方式中，如本文所公开的合理多倍体的群包含经突变的AAVrh10 VP3蛋白，其中所述经突变的AAVrh10VP3包含VP3突变，其中VP3突变选自于由Q214N、S462N、D517E、V378del、V379W(编号基于AAVrh10VP3编号)所组成的组。在另一替代的实施方式中，所述合理多倍体的群包含经突变的AAVrh10 VP3蛋白，其中所述经突变的AAVrh10VP3包含VP3突变，其中所述VP3突变基本上由Q214N、S462N、D517E、V378del、V379W(编号基于AAVrh10VP3编号)中的全部组成。在一些实施方式中，所述合理多倍体的群包含经突变的AAVrh10 VP3蛋白，其中所述经突变的AAVrh10VP3包含VP3突变，其中VP3突变选自于由Q417N、S665N、D720E、V581del、V582W(编号基于AAVrh10VP1编号)所组成的组。在一些实施方式中，合理多倍体的群包含经突变的AAVrh10 VP3蛋白，其中经突变的AAVrh10VP3包含VP3突变，其中VP3突变基本上由Q417N、S665N、D720E、V581del、V582W(编号基于AAVrh10VP1编号)中的全部组成。
或者，本发明人进行了单独的rh74至rh10(rh74>rh10)氨基酸修饰，并改变了AAV8-8-rh74载体以包含选自以下的一种修饰：SEQ ID NO:3中的N214Q修饰、378-W379V(或378del-W379VV)修饰、N461S或E516D修饰(使得特定的氨基酸改变为与VP3 AAVrh10衣壳蛋白相似的氨基酸)，并将生产倍数与未修饰的AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74单倍体衣壳进行比较(参见图29A)。也就是说，将SEQ ID NO:3的378位的W替换为VV显著增加了产量，而其他突变对增加AAV8-8-rh74单倍体衣壳的产量没有显著影响。为了证实这一点，本发明人在AAVrh10的VP3衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)中进行了相应的氨基酸取代(即，VP3rh10＞VP3rh74的单独修饰)，其中将VP3 AAVrh74的氨基酸差异引入AAVrh10的VP3衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)——特别是，将Q214N、V378del、V379W、S462N和D517E替换引入AAVrh10的VP3衣壳(SEQID NO:1)中；此处的编号基于AAVrh10 VP3编号。只有V378del和V379W修饰显著降低了AAV8-8-rh10载体的产量。这通过DNase和蛋白酶K处理后的qPCR分析得到证实(参见图29C)。在一些替代的实施方式中，如本文所公开的合理多倍体的群包含经突变的AAVrh74VP3蛋白，其中所述经突变的AAVrh74 VP3包含VP3突变，其中VP3突变选自于由N214Q、N461S、E516D、W378VV(编号基于AAVrh74VP3编号)所组成的组。在另一替代的实施方式中，合理多倍体的群包括经突变的AAVrh74 VP3蛋白，其中经突变的AAVrh74 VP3包括VP3突变，其中VP3突变基本上由N214Q、N461S、E516D、W378VV(编号基于AAVrh74VP3编号)中的全部组成。在一些实施方式中，所述合理多倍体的群包含经突变的AAVrh74 VP3蛋白，其中所述经突变的AAVrh74 VP3包含VP3突变，其中VP3突变选自于由N417Q、N664S、E719D、W581VV(编号基于AAVrh74 VP1编号)所组成的组。在一些实施方式中，所述合理多倍体的群包含经突变的AAVrh74VP3蛋白，其中所述经突变的AAVrh74VP3包含VP3突变，其中VP3突变基本上由N417Q、N664S、E719D、W581VV(编号基于AAVrh74 VP1编号)中的全部组成。因此，本发明人发现，将SEQ ID NO:3(AAVrh74的VP3衣壳蛋白)的氨基酸位置581处的氨基酸W简单修饰为VV显著增加了产量，同时维持了增加的全身性的生物利用度和减少的体液应答和/或抗原性和/或在体内逃避AAV8中和抗体的能力。因此，在一些实施方式中，AAV8单倍体是AAV8-8-rh74vv单倍体，其中VP3蛋白包含对应于SEQ ID NO:2的VP3-AAVrh74衣壳蛋白(其中W581被VV取代)。在一些实施方式中，AAV8单倍体是AAV8-8-rh74vv LP2单倍体，其中所述VP3蛋白包含对应于SEQ ID NO:2的VP3-AAVrh74衣壳蛋白(其中AAV rh74的VP3包含W581被VV取代的以下突变以及所有的以下突变：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H、N736P(编号基于AAV rh74VP1编号)。在一些实施方式中，AAV8单倍体是AAV8-8-rh10 LP2单倍体，其中所述VP3蛋白包含对应于SEQ ID NO:5的VP3-AAVrh10衣壳蛋白(其中rh10的VP3包含以下突变：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R727H、N737P；编号基于AAVrh10VP1编号)。如表9所示，AAV8-8-rh74vv LP2的产量比AAV8-8-rh74 LP2提高，并且与AAV8-8-rh10LP2或AAV8-8-rh10的产量相当。
表9：AAV8-8-rh10LP2和AAV8-8-rh74LP2以及AAV8-8-rh74vv合理多倍体载体的产量。
合理多倍体载体 滴度(vg/ml)
AAV8-8-Rh10LP2 6.11×1012
AAV8-8-Rh74LP2 5.02×109
AAV8-8-Rh74VV 1.25×1013
AAV8-8-8 1.107×1013
因此，在一些实施方式中，本文公开的AAV单倍体包含rh74VP3衣壳蛋白，该衣壳蛋白是包含至少1个或多个氨基酸修饰的经修饰的VP3蛋白，例如，AAVrh74 VP3衣壳蛋白为包含W581VV修饰的经修饰的VP3蛋白，其中SEQ ID NO:3的氨基酸位置581处的色氨酸(W或Trp)被替换为两个缬氨酸(V或val)氨基酸。因此，在一些实施方式中，AAV单倍体载体是AAV8-8-rh74vv单倍体载体，其包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％序列同一性的氨基酸序列的VP3衣壳蛋白，其中SEQ ID NO:2是rh74vv-VP3衣壳蛋白的氨基酸，其包含W581VV修饰。
包含rh74vv-VP3衣壳蛋白的氨基酸的SEQ ID NO:2由SEQ ID NO:4的核酸序列编码。
实施例6
AAV8单倍体病毒的体外表征。
实施例6是说明性实施例，其公开了处于任何顺序的分别来自AAV8和穿过BBB的任何血清型的VP1和VP3衣壳蛋白的示例性组合(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，以及任选地来自AAV8或穿过BBB的任何血清型的VP2衣壳蛋白(包括但不限于恒河猴AAV(AAVrh)血清型)。虽然AAVrh10和AAVrh74衣壳蛋白被显示为穿过BBB的示例性血清型(并且其也是AAVrh血清型)，但它们可以容易地被来自穿过BBB的任何其他血清型的VP3蛋白取代或替换(包括但不限于例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43或其他AAVrh血清型)。类似地，将AAV8显示为VP1和/或VP2蛋白的示例性血清型，尽管来自AAV8的VP1和/或VP2蛋白可容易地被本领域技术人员取代或替换为本文表1中公开的任何血清型。
在Pro10细胞中评估了AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的转导效率，其显示出单倍体载体转导Pro10细胞的能力存在一些差异：经AAV8-8-Rh74单倍体转导的Pro10细胞与AAV8对照相似，而AAVrh10和AAV8-8-Rh10载体在该细胞系中的效率低于AAV8，与AAV8和AAVRh10相比，用AAV8-8-Rh10单倍体的效率显著降低(见图13B)。此外，评估了AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体转导GM16095细胞的效率(图17B)，并证明了比起AAV8或AAVrh10对照，经AAV8-8-Rh74单倍体转导的GM16095细胞明显更有效，而在该GM16095细胞系中AAVrh10比起AAV8更有效，并且AAV8-8-Rh10单倍体的效率显著低于AAV8和AAVRh10。
实施例7
AAV8单倍体病毒的体内表征显示出AAV8单倍体病毒增加的CNS转导。
实施例7是说明性实施例，其公开了处于任何顺序的分别来自AAV8和穿过BBB的任何血清型的VP1和VP3衣壳蛋白的示例性组合(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，以及任选地来自AAV8或穿过BBB的任何血清型的VP2衣壳蛋白(包括但不限于恒河猴AAV(AAVrh)血清型)。虽然AAVrh10和AAVrh74衣壳蛋白被显示为穿过BBB的示例性血清型(并且其也是AAVrh血清型)，但它们可以容易地被来自穿过BBB的任何其他血清型的VP3蛋白取代或替换(包括但不限于例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43或其他AAVrh血清型)。类似地，将AAV8显示为VP1和/或VP2蛋白的示例性血清型，尽管来自AAV8的VP1和/或VP2蛋白可容易地被本领域技术人员取代或替换为本文表1中公开的任何血清型。
如上所述，单倍体病毒AAV8-8-rh74单倍体在Pro10细胞或GM16095细胞系中的转导效率高于AAV亲代血清型的转导效率。接下来，研究了AAV8-8-rh74的体外高转导是否在体内转入小鼠中。将AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体和亲代载体(AAV8和AAVrh10)静脉内注射(通过尾静脉注射)到C57BL/6小鼠中。每只小鼠施用每种病毒共计5×1010vg的载体。与AAV8相比，在体内确定了AAV8-8-Rh74的显著分布，其大于AAV8或AAVrh10(图21A-图21D)。
此外，在小鼠脑中测量了AAV8-8-rh10、AAV8-8-rh74或AAV8基因组拷贝数(通过qPCR测量)，其中，所有病毒粒子都被全身性地使用并且所述结果显示出，8-8-rh10和8-8-rh74均具有显著的脑转导，而AAV8在脑中的转导最小。
在使用BBB hCEMC/D3内皮细胞的明确界定的系统中进行的体外的内皮细胞透性分析中，与AAV8相比，观察到AAV8-8-th10或AAV8-8-rh74的内皮细胞透性的显著增加。这些观察表明，比起AAV8，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74的合理多倍体(如合理单倍体)的群具有增高的穿过BBB的能力。为了进一步评估载体对CNS的转导效率，实施多个大脑区域、脊髓和视网膜的GFP免疫组织化学(IHC)和/或天然eGFP荧光。AAV8-8-rh74或AAV8-8-rh10在整个成人CNS中显示出高效转导。
在另一实例中，合理多倍体AAV2-2-9是按照国际专利申请PCT/US2018/022725和美国专利US10550405中描述的方法产生，将二者以引用的方式整体并入本文。在合理多倍体AAV2-2-9中，VP1和VP2来自不能穿过血脑屏障的AAV2血清型，而VP3来自能有效穿过血脑障碍的AAV9血清型。如结果所示，所得到的合理多倍体AAV2-2-9病毒粒子可以穿过血脑屏障。当与全身性施用两种病毒粒子的AAV2相比时，用AAV2-2-9在CNS区域(例如在脑区域)中获得增强的荧光素酶转导(通过成像分析测量)。此外，脑中的AAV2-2-9基因组拷贝数显著高于AAV2的拷贝数，证实当全身性施用两种病毒粒子时，AAV2-2-9在脑中具有比AAV2显著高的转导。在使用BBB hCEMC/D3内皮细胞的明确界定的系统中进行的体外的内皮细胞透性分析中，与AAV2相比，观察到AAV2-2-9的内皮细胞透性的显著增加。这些观察表明，比起AAV2，AAV2-2-9的合理多倍体(例如，合理单倍体)的群具有增强的穿过BBB的能力。为了进一步评估载体对CNS的转导效率，实施多个脑区、脊髓和视网膜的GFP免疫组织化学(IHC)和/或天然eGFP荧光。AAV2-2-9在整个成人CNS中显示出高效转导。
值得注意的是，鉴定出AAV8-8-Rh74在CNS区域(如大脑和脊髓)中的显著分布，如通过背视图和腹视图评估的分布所示出的(图21D；图21A-图21C的腹视图)。
为了进一步评估本文公开的合理单倍体AAV载体的体内生物分布，通过尾静脉对小鼠(n＝4只/组)以2.5E12vg/kg的剂量注射(图30A)。在载体注射后第28天在各种器官中于转录水平上评估转基因表达(图30A)。提取RNA后，通过RT-qPCR对转基因表达水平进行定量。
图30B显示出用AAV8处理的小鼠在大脑中几乎没有转录物，表明AAV8不会穿过BBB。相比之下，AAV8-8-Rh74产生在大脑中检测到的许多转录物。因为施用是静脉内的，数据表明用AAVRh74 VP3代替AAV8 VP3产生单倍体载体，该载体穿过BBB并靶向大脑，并且用于治疗如本文所公开的大脑的疾病或紊乱、或中枢神经系统(CNS)紊乱或神经系统疾病。Rh74也穿过BBB(数据未显示)。在脊髓中检测到类似的结果，其中图30C显示出AAV8不会靶向脊髓。然而，AAV8-8-Rh74确实靶向脊髓。因此，图30C显示出用AAVRh74 VP3替换AAV8 VP3产生对脊髓具有向性的单倍体载体，并且用于治疗脊髓的疾病或紊乱、或外周神经系统(PNS)紊乱。此外，图31显示出AAV8不靶向小肠，然而，AAV8-8-Rh74确实靶向小肠。因此，图31显示出用AAVRh74 VP3替换AAV8 VP3产生对小肠具有向性的单倍体载体，并且用于治疗胃肠紊乱或小肠紊乱。
在脑(图30B)、脊髓(图30C)和小肠(图31)中，与AAV8或AAVRh10亲代载体或生理盐水对照相比，以新的载体AAV8-8-Rh74实现显著性。与AAV8-8-Rh10和亲代载体AAV8或AAVRh10相比，AAV8-8-Rh74能够更有效地穿过BBB，并且在转导小肠方面更有效。
这些结果表明，AAV8-8-rh74单倍体病毒能够在静脉内(或全身性)施用后穿过BBB，并进一步支持由合理设计产生的多倍体或单倍体病毒粒子是一个构建体，其包含来自AAV8的VP1/VP2、以及来自AAVrh10或来自AAVrh74的VP3。
实施例8
单倍体病毒AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74逃避中和抗体的能力。
实施例8是说明性实施例，其公开了处于任何顺序的分别来自AAV8和穿过BBB的任何血清型的VP1和VP3衣壳蛋白的示例性组合(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，以及任选地来自AAV8或穿过BBB的任何血清型的VP2衣壳蛋白(包括但不限于恒河猴AAV(AAVrh)血清型)。虽然AAVrh10和AAVrh74衣壳蛋白被显示为穿过BBB的示例性血清型(并且其也是AAVrh血清型)，但它们可以容易地被来自穿过BBB的任何其他血清型的VP3蛋白取代或替换(包括但不限于例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43或其他AAVrh血清型)。类似地，将AAV8显示为VP1和/或VP2蛋白的示例性血清型，尽管来自AAV8的VP1和/或VP2蛋白可容易地被本领域技术人员取代或替换为本文表1中公开的任何血清型。
在临床试验中，使用腺相关病毒(AAV)载体在患有血液疾病和盲性紊乱的患者中取得了治疗效果。然而，如下两方面的关注点限制了拓展AAV载体的应用：AAV衣壳特异性细胞毒性T细胞(CTL)和中和抗体(Nabs)。用低剂量的AAV载体增强AAV转导将潜在地降低衣壳抗原负载，并有望在不损害转基因表达的情况下消除衣壳CTL介导的经AAV转导的靶细胞的清除。目前，由于其不同的组织向性和转导效率，已经探索了12种血清型和100多种变体或突变体用于基因递送。已经证明，AAV血清型之间存在衣壳的相容性，并且将一个血清型的特定氨基酸整合到另一个AAV衣壳中增强了AAV的转导。通过利用来自不同血清型的有效AAV转导的不同机制，使用镶嵌病毒实现了增强的AAV转导，其中AAV衣壳亚基在体外和体内来源于不同血清型。最近关于AAV载体与单克隆中和抗体的相互作用的结构研究表明，Nab与一个病毒粒子表面的多个不同亚基上的残基结合，这表明AAV病毒粒子亚基组装体的变化可能消除AAV Nab结合位点，然后逃避Nab活性。我们已经证明镶嵌AAV载体能够逃避Nab活性。这些结果表明，AAV衣壳亚基的替换具有增强AAV转导和中和抗体逃避能力的潜力。
在此，本发明人证明了这些AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74vv单倍体病毒在体外和体内增强了转导效率，并且甚至逃避了来自亲代载体免疫血清的中和。各单独的单倍体病毒的病毒粒子由来自不同的AAV血清型衣壳的60个亚基组成。将来自一种血清型的一些衣壳亚基插入来自不同血清型的其他衣壳亚基可能改变病毒粒子的表面结构。众所周知，大多数AAV单克隆抗体识别一个单一病毒粒子的不同亚基上的残基。
AAV8-8-rh74单倍体逃避Nab的能力。
腺相关病毒(AAV)载体已成功用于患有血友病和失明的患者的临床试验中。探索增强AAV转导和逃避中和抗体活性的有效策略仍然势在必行。先前的研究显示出来自AAV血清型的衣壳与位于一个病毒粒子的不同衣壳亚基上的AAV Nab的识别位点的兼容性。在本研究中，本发明人评估了AAV8-8-rh10和AAV8-8-rh74单倍体衣壳Nab逃避活性及后随的转导(参见例如，图14A-图16和图18A-图18B、图19A-图19B)。为了确定这些单倍体载体的向性在合理多倍体载体中是否改变，通过对人Pro10细胞和GM16095细胞系进行转导来分析单倍体病毒的转导功效(图13A-图13B和图17A-图17B)。
因此，本发明人分析了单倍体AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体病毒对来自经AAV免疫的小鼠的血清的免疫谱。将Nab滴度用于评估血清抑制载体转导的能力。在注射后第4周从用亲代病毒处理的小鼠中收集血清。
图18A-图18B证明AAV8-8-Rh74单倍体载体、而不是AAV8-8-rh10单倍体载体能够逃避抗AAV8 NAb，并且在存在和不存在Nab的情况下，在荧光素酶转基因表达中没有发现差异。此外，在1/100和1/200浓度的抗血清AAV8(aAAV8)的存在下，对Pro10细胞的体外转染进行评估，并证明AAV8-8-Rh74单倍体载体、而不是AAV8-8-rh10单倍体载体能够逃避抗AAV8NAb，并且在存在和不存在Nab的情况下，在荧光素酶转基因表达中没有发现差异(图19A-图19B)。
值得注意的是，无论AAV8衣壳掺入的量如何，经AAV8免疫的小鼠血清对AAV8和AAVrh10病毒具有相似的中和活性。
静脉内注射后，所有的单倍体病毒诱导的转导比亲代AAV载体更高(比AAV8或AAVrh10高2至9倍)，其中最高的是单倍体载体AAV8-8rh74(参见图21A-图21D)。值得注意的是，单倍体载体AAV8-8-rh74的全身性转导比AAV8高4倍以上。此外，单倍体病毒AAV8-8rh74能够逃避AAV8中和，并且与AAV8具有非常低的Nab交叉反应性。中和抗体分析表明，AAV8-8rh74单倍体载体能够从用亲代血清型免疫的小鼠血清中逃避中和抗体活性。这些结果表明，包含恒河猴AAV血清型(AAVrh)的AAV8单倍体病毒可能从亲代血清型中获得益处，以增强转导和逃避Nab识别。这一策略应在未来的中和抗体阳性患者的临床试验中进行探索。
AAV8-8-rh10LP2和AAV8-8-rh74LP2逃避NAb的能力
预期AAV8-8-rh10LP2和AAV8-8-rh74LP2或AAV8-8-rh74vvLP2可以有效地逃避AAVrh10或AAV rh74血清型的中和抗体识别。对小鼠静脉内注射包含引起CNS中的转基因表达的荧光素酶转基因的AAVrh10或AAVrh74。然后，对小鼠注射各自包含荧光素酶转基因的AAV8-8-rh10LP2、AAV8-8-rh74 LP2、AAV8-8-rh74vvLP2、AAVrh10或AAVrh74。在此重复施用中，仅AAV8-8-rh10LP2、AAV8-8-rh74 LP2或AAV8-8rh74vvLP2产生CNS中的成功的转导和荧光素酶表达，这支持了以下事实：只有AAV8-8-rh10LP2、AAV8-8-rh74LP2或AAV8-8-rh74vvLP2能够逃避针对rh10或rh74 AAV血清型的中和抗体而不是其他组。
具有减少的体液应答的AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74单倍体的能力
如图25所示，当用单倍体载体接种时，AAV8单倍体(例如AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74)的抗原性或能力通过测量小鼠中的IgG水平来评估。图25A显示出抗AAV8 IgG水平(1/1000血清稀释度)，并且图25B显示出抗AAV8 IgG水平(1/5000血清稀释度)，与注射有AAV8的小鼠相比，显示出显著减少的体液应答，例如，如通过在接种有两种单倍体载体的小鼠的血清中检测到的降低的抗AAV8 IgG水平所示的。在所测试的血清稀释度下，用来自接种有AAVrh10的小鼠的血清未发现对AAV8的交叉反应性。图25C显示出抗AAVrh10 IgG水平(1/1000血清稀释度)，并且图25D显示出抗AAVrh10 IgG水平(1/5000血清稀释度)，并显示出AAVrh10的免疫原性显著低于AAV8，并且在所测试的血清稀释度下，在接种有AAVrh10的小鼠和其余实验组之间的抗AAVrh10IgG水平方面没有观察到显著差异。
结果表明，具有来自Rh血清型的VP3的这些AAV8单倍体载体(例如，AAV8-8-rh10或AAV8-8-rh74)可用于在体内或临床应用，因为它们表现出较低的体液应答。
实施例9
疾病的治疗
在以下的用于治疗疾病(例如，中枢神经系统、心脏、肺、骨骼肌和肝脏的疾病；包括例如帕金森病、阿尔茨海默病、ALS)的实施例9的每一个中，本文所述的AAV8单倍体衣壳病毒粒子使用特定的AAV血清型产生，并使用实施例1的合理多倍体方法产生，以产生单倍体衣壳，其中VP1和VP2来自AAV8，且VP3仅来自穿过BBB的任何血清型，例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43或其他恒河猴AAV(AAVrh)血清型。不希望受限于理论，实施例9是说明性实施例，其公开了处于任何顺序的分别来自穿过BBB的AAV8的任何血清型的VP1和VP3衣壳蛋白的示例性组合(例如恒河猴AAV(AAVrh)血清型)，以及任选地来自AAV8或穿过BBB的任何血清型的VP2衣壳蛋白(包括但不限于恒河猴AAV(AAVrh)血清型)。虽然AAVrh10和AAVrh74衣壳蛋白被显示为穿过BBB的示例性血清型(并且其也是AAVrh血清型)，但它们可以容易地被来自穿过BBB的任何其他血清型的VP3蛋白取代或替换(包括但不限于例如AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAVrh39、rAAVrh43或其他AAVrh血清型)。类似地，AAV8显示为VP1和/或VP2蛋白的示例性血清型，但是可想到的是，来自AAV8的VP1和/或VP2蛋白可以被本文表1中公开的任何血清型取代或替换。
单倍体载体AAV8-8Rh10或AAV8-8-rh74的全身性转导
接下来，以每只小鼠5×1010vg AAV/luc的剂量静脉内注射来自实施例1的单倍体AAV。在注射后第3周，如图21A所示进行30秒的成像，如图21B所示进行1分钟的曝光，或如图21C所示进行自动曝光。图21D提供了来自IV注射后的4只小鼠的数据，具有与亲代AAV8或AAVrh10相比的通过转导计算出的转导的成倍增加。
单倍体载体的肝脏转导
在本实验中，将单倍体AAV8-8Rh10或AAV8-8-rh74载体通过眶后静脉以3×1010颗粒的剂量注射到C57BL6小鼠中。一周后进行成像。基于代表5只小鼠的平均值和标准差的数据，对肝转导进行定量。
嵌合衣壳蛋白和AAV单倍体病毒载体转导
如上文所解释的，AAV辅助质粒的一系列构建体是用衣壳ORF的起始密码子中的突变体制成的，其中将表达只有一种或两种病毒VP蛋白。还可以制备嵌合AAV辅助构建体，其中VP1/2蛋白来源于两种不同的血清型(AAV8和AAV9)。这些构建体可以产生一堆单倍体病毒载体，并评估它们在小鼠中的转导效率。当与仅AAV8和仅AAVrh10的载体相比时，发现具有来自血清型8的VP1/VP2和来自AAVrh10或rh74的VP3的单倍体载体实现了增强的转导。进一步评估由具有来自AAV8的N末端和来自AAV9的C末端以及来自AAVrh10或rh74的VP3的嵌合的VP1/VP2衣壳制成的AAV载体是否诱导远远更高的转导。这表明存在增强AAV的转导和进一步的AAV单倍体载体的简单且有效的方法。
最后，应当理解的是，尽管通过参考特定实施方式来强调本说明书的各方面，但本领域技术人员将容易理解，这些公开的实施方式仅说明本文公开的主题的原理。因此，应当理解的是，所公开的主题决不限于本文所描述的特定方法、方案和/或试剂等。就其而言，在不脱离本说明书的精神的情况下，可以根据本文的教导对所公开的主题进行各种修改或改变或替代性配置。最后，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制仅由权利要求限定的本发明的范围。因此，本发明不限于如图所示和所描述的那样。
本文描述了本发明的某些实施方式，包括本发明人已知的用于实施发明的最佳模式。当然，在阅读上述描述后，这些所描述的实施方式的变化对于本领域技术人员来说将变得显而易见。本发明人期望本领域技术人员在适当时采用这种变化，并且本发明人打算以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有指示或上下文明确矛盾，本发明涵盖上述实施方式的任何组合及其所有可能的变型。
本发明的替代性实施方式、要素或步骤的分组不应被解释为限制。各组成员可以单独地或与本文公开的其他组成员任意组合地被引用和要求保护。预期出于方便和/或可专利性的原因，可以将组的一个或多个成员包括在组中或从组中删除。当出现任何这样的包含或删除时，说明书被视为包含修改后的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示特征、项目、量、参数、性质、术语等的所有数字将被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。如本文所使用的，术语“约”是指如此限定的特征、项目、量、参数、性质或术语涵盖高于或低于所述特征、项目、量、参数、性质或术语的值加减百分之十的范围。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求中所示的数值参数是可变化的近似值。至少、而不是试图将等效原理的应用限制在权利要求的范围内，每个数字指示至少应根据所报告的有效数字的数量并通过应用普通舍入技术来解释。尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和值是近似值，但在具体实例中阐述的数值范围或值被尽可能精确地报告。然而，任何数值范围或值固有地都包含某些误差，这些误差必然是由它们各自测试测量中发现的标准偏差引起的。本文中的值的数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文中另有说明，否则数值范围的每个单独值被并入本说明书中，就好像其在本文中被单独引用一样。
除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾，本文中描述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有的实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不对另外要求保护的本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为指明对本发明的实践至关重要的任何未要求保护的要素。
本文公开的具体实施方式可以在权利要求中使用由或基本上由语言组成来进一步限定。当在权利要求中使用时，无论是提交的还是根据修改而添加的，过渡术语“由……组成”排除权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制为指明的材料或步骤以及那些不会实质上影响基本和新颖特征的材料或步骤。所要求保护的本发明的实施方式在本文中固有地或明确地描述和实现。
本说明书中引用和确认的所有专利、专利公开和其他出版物均单独且明确地通过引用整体并入本文用于描述和公开的目的，例如，可与本发明结合使用的这些出版物中描述的组合物和方法。这些出版物仅由于其公开内容早于本申请的提交日期而提供。在这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权凭借现有发明或任何其他原因将此类公开内容提早。有关这些文件的日期的所有表述或有关这些文件的内容的陈述均基于申请人可得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
表1:AAV血清型和示例性公开的相应的衣壳序列
序列表
<110> 阿斯克肋匹奥生物制药公司（ASKLEPIOS BIOPHARMACEUTICAL,INC.）
<120> 穿过血脑屏障并引起减弱的体液应答的合理多倍体AAV病毒粒子
<130> 046192-098020PL02
<140>
<141>
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 1
Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala
1 5 10 15
Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
20 25 30
Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro
35 40 45
Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly
65 70 75 80
Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp
85 90 95
Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn
100 105 110
Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly
115 120 125
Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr
130 135 140
Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly
145 150 155 160
Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly
165 170 175
Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe
180 185 190
Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn
195 200 205
Phe Glu Phe Ser Tyr Gln Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr
210 215 220
Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln
225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly
245 250 255
Thr Gln Gln Leu Leu Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala
260 265 270
Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val
275 280 285
Ser Thr Thr Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly
290 295 300
Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly
305 310 315 320
Val Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser
325 330 335
Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val
340 345 350
Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr
355 360 365
Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln
370 375 380
Gln Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala
385 390 395 400
Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro
405 410 415
Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro
420 425 430
Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile
435 440 445
Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala
450 455 460
Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val
465 470 475 480
Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro
485 490 495
Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe
500 505 510
Ala Val Asn Asp Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr
515 520 525
Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
530 535
<210> 2
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 2
Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala
1 5 10 15
Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
20 25 30
Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro
35 40 45
Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly
65 70 75 80
Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp
85 90 95
Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn
100 105 110
Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly
115 120 125
Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr
130 135 140
Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly
145 150 155 160
Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly
165 170 175
Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe
180 185 190
Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn
195 200 205
Phe Glu Phe Ser Tyr Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr
210 215 220
Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln
225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly
245 250 255
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Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val
275 280 285
Ser Thr Thr Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly
290 295 300
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325 330 335
Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val
340 345 350
Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr
355 360 365
Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln
370 375 380
Gln Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala
385 390 395 400
Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro
405 410 415
Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro
420 425 430
Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile
435 440 445
Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala
450 455 460
Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val
465 470 475 480
Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro
485 490 495
Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe
500 505 510
Ala Val Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr
515 520 525
Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
530 535
<210> 3
<211> 534
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述：wt-rh74-VP3序列
<400> 3
Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala
1 5 10 15
Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
20 25 30
Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro
35 40 45
Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly
65 70 75 80
Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp
85 90 95
Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn
100 105 110
Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly
115 120 125
Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr
130 135 140
Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly
145 150 155 160
Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly
165 170 175
Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe
180 185 190
Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn
195 200 205
Phe Glu Phe Ser Tyr Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr
210 215 220
Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln
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Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly
245 250 255
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260 265 270
Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val
275 280 285
Ser Thr Thr Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly
290 295 300
Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly
305 310 315 320
Val Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser
325 330 335
Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val
340 345 350
Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr
355 360 365
Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Trp Ala Asp Asn Leu Gln Gln
370 375 380
Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu
385 390 395 400
Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile
405 410 415
Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu
420 425 430
Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys
435 440 445
Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys
450 455 460
Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu
465 470 475 480
Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu
485 490 495
Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala
500 505 510
Val Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg
515 520 525
Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
530
<210> 4
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 4
atggctgctg gcggaggtgc ccctatggcc gataacaatg aaggtgctga tggcgtgggc 60
tccagcagcg gaaattggca ctgtgatagc acctggctgg gcgacagagt gatcaccacc 120
agcacaagaa catgggccct gcctacctac aacaaccacc tgtacaagca gatcagcaac 180
ggcacaagcg gcggctccac caacgataac acctactttg gctacagcac cccttggggc 240
tacttcgact tcaaccggtt ccactgccac ttcagcccca gagactggca gcggctgatc 300
aacaacaact ggggcttcag acccaagagg ctgaacttca agctgttcaa catccaagtg 360
aaagaagtga cccagaacga gggcaccaag acaatcgcca acaacctgac cagcaccatc 420
caggtgttca ccgacagcga gtaccagctg ccttatgtgc tgggatctgc ccaccaaggc 480
tgtctgcctc catttcctgc cgacgtgttc atgatccctc agtacggcta cctgacactg 540
aacaacggat ctcaggccgt gggcagaagc tccttctact gcctggaata cttccctagc 600
cagatgctgc ggaccggcaa caacttcgag ttcagctaca atttcgagga cgtgcccttc 660
cacagcagct acgcccactc tcaaagcctg gacagactga tgaaccctct gatcgaccag 720
tacctgtact acctgagcag aacccagagc acaggcggaa cagctggaac acagcaactg 780
ctgtttagcc aggctggccc caacaatatg agcgcccagg ccaaaaattg gctgcccgga 840
ccttgctaca gacagcagag agtgtctacc acactgagcc agaacaacaa cagcaacttt 900
gcctggaccg gcgccaccaa gtaccacctg aatggcagag acagcctggt caatcctggc 960
gtggccatgg ctacccacaa ggacgacgag gaaagattct tcccaagcag cggcgtgctg 1020
atgttcggaa agcaaggcgc cggaaaggac aacgtggact acagcagcgt gatgctgacc 1080
agcgaggaag agatcaagac caccaatcct gtggccaccg agcagtacgg agtggtggcc 1140
gataatctgc aacagcagaa cgccgctcct atcgtgggag ctgtgaattc tcaaggcgcc 1200
ctgcctggca tggtctggca gaatagagat gtgtacctgc aaggccccat ctgggccaag 1260
attccccaca ccgatggcaa ctttcacccc tctccactga tgggcggctt cggacttaaa 1320
caccctccac ctcagatcct gatcaagaat acccctgtgc ctgccgatcc tcctaccacc 1380
ttcaatcagg ccaaactggc cagcttcatc acccagtact ctaccggaca ggtgtccgtg 1440
gaaatcgagt gggaactcca gaaagaaaac agcaagcggt ggaaccccga gatccagtac 1500
accagcaact actacaagag caccaacgtc gacttcgccg tgaacaccga gggcacatac 1560
agcgagccta gacctatcgg cacccggtat ctgacccgga acctgtaatg a 1611
<210> 5
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 5
atggctgcag gaggaggtgc tccaatggca gacaataacg aaggcgccga cggagtgggt 60
agttcctcag gaaattggca ttgcgattcc acatggctgg gcgacagagt catcaccacc 120
agcacccgaa cctgggccct ccccacctac aacaaccacc tctacaagca aatctccaac 180
gggacttcgg gaggaagcac caacgacaac acctacttcg gctacagcac cccctggggg 240
tattttgact ttaacagatt ccactgccac ttctcaccac gtgactggca gcgactcatc 300
aacaacaact ggggattccg gcccaagaga ctcaacttca agctcttcaa catccaggtc 360
aaggaggtca cgcagaatga aggcaccaag accatcgcca ataaccttac cagcacgatt 420
caggtcttta cggactcgga ataccagctc ccgtacgtcc tcggctctgc gcaccagggc 480
tgcctgcctc cgttcccggc ggacgtcttc atgattcctc agtacgggta cctgactctg 540
aacaatggca gtcaggccgt gggccgttcc tccttctact gcctggagta ctttccttct 600
caaatgctga gaacgggcaa caactttgag ttcagctacc agtttgagga cgtgcctttt 660
cacagcagct acgcgcacag ccaaagcctg gaccggctga tgaaccccct catcgaccag 720
tacctgtact acctgtctcg gactcagtcc acgggaggta ccgcaggaac tcagcagttg 780
ctattttctc aggccgggcc taataacatg tcggctcagg ccaaaaactg gctacccggg 840
ccctgctacc ggcagcaacg cgtctccacg acactgtcgc aaaataacaa cagcaacttt 900
gcctggaccg gcgccaccaa gtatcatctg aatggcagag actctctggt aaatcccggt 960
gtcgctatgg caacccacaa ggacgacgaa gagcgatttt ttccgtccag cggagtctta 1020
atgtttggga aacagggagc tggaaaagac aacgtggact atagcagcgt tatgctaacc 1080
agtgaggaag aaattaaaac caccaaccca gtggccacag aacagtacgg cgtggtggcc 1140
gataacctgc aacagcaaaa cgccgctcct attgtagggg ccgtcaacag tcaaggagcc 1200
ttacctggca tggtctggca gaaccgggac gtgtacctgc agggtcctat ctgggccaag 1260
attcctcaca cggacggaaa ctttcatccc tcgccgctga tgggaggctt tggactgaaa 1320
cacccgcctc ctcagatcct gattaagaat acacctgttc ccgcggatcc tccaactacc 1380
ttcagtcaag ctaagctggc gtcgttcatc acgcagtaca gcaccggaca ggtcagcgtg 1440
gaaattgaat gggagctgca gaaagaaaac agcaaacgct ggaacccaga gattcaatac 1500
acttccaact actacaaatc tacaaatgtg gactttgctg ttaacacaga tggcacttat 1560
tctgagcctc gccccatcgg cacccgttac ctcacccgta atctgtaatg a 1611
<210> 6
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 6
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60
gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120
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aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240
cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300
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atctccaacg ggacatcggg aggagccacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 840
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gggatcctga tttttggcaa acaaaatgct gccagagaca atgcggatta cagcgatgtc 1680
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tgggccaaga ttcctcacac ggacggcaac ttccacccgt ctccgctgat gggcggcttt 1920
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atccagtaca cctccaacta ctacaaatct acaagtgtgg actttgctgt taatacagaa 2160
ggcgtgtact ctgaaccccg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217
<210> 7
<211> 738
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 7
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145 150 155 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165 170 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180 185 190
Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Val Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Gly Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210 215 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225 230 235 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245 250 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp
260 265 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275 280 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290 295 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
305 310 315 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325 330 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340 345 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355 360 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370 375 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385 390 395 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr
405 410 415
Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420 425 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435 440 445
Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly
450 455 460
Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp
465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly
485 490 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His
500 505 510
Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr
515 520 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile
530 535 540
Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val
545 550 555 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565 570 575
Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala
580 585 590
Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595 600 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610 615 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625 630 635 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645 650 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe
660 665 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675 680 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
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Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
705 710 715 720
Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
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Asn Leu
<210> 8
<211> 601
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 8
Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser
1 5 10 15
Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg
20 25 30
Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp
35 40 45
Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro
50 55 60
Asn Thr Val Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu
65 70 75 80
Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser
85 90 95
Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala
100 105 110
Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro
130 135 140
Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg
145 150 155 160
Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg
165 170 175
Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn
180 185 190
Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val
195 200 205
Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His
210 215 220
Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln
225 230 235 240
Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser
245 250 255
Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly
260 265 270
Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser
275 280 285
Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile
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Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr
305 310 315 320
Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met
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Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp
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Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe
385 390 395 400
Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp
405 410 415
Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys
420 425 430
Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn
435 440 445
Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln
450 455 460
Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln
465 470 475 480
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro
485 490 495
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
500 505 510
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn
515 520 525
Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
530 535 540
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
545 550 555 560
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val
565 570 575
Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
580 585 590
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
595 600
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<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 9
Val Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala
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Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
20 25 30
Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro
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65 70 75 80
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe
180 185 190
Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn
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210 215 220
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225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn
245 250 255
Thr Gln Thr Leu Gly Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn
260 265 270
Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val
275 280 285
Ser Thr Thr Thr Gly Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala
290 295 300
Gly Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly
305 310 315 320
Ile Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser
325 330 335
Asn Gly Ile Leu Ile Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala
340 345 350
Asp Tyr Ser Asp Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr
355 360 365
Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln
370 375 380
Gln Gln Asn Thr Ala Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala
385 390 395 400
Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro
405 410 415
Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro
420 425 430
Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile
435 440 445
Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser
450 455 460
Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val
465 470 475 480
Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro
485 490 495
Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe
500 505 510
Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr
515 520 525
Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
530 535
<210> 10
<211> 9690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 10
ggccgcgaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 60
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 120
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 180
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 240
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 300
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ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 480
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 540
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 600
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 660
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 720
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 780
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 840
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 900
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 960
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 1020
ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 1080
ttggtctgac agttattaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca atttattcat 1140
atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag gagaaaactc 1200
accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc cgactcgtcc 1260
aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa gtgagaaatc 1320
accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagt ttatgcattt ctttccagac 1380
ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa ccaaaccgtt 1440
attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga tcgctgttaa aaggacaatt 1500
acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc agcgcatcaa caatattttc 1560
acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt tttccgggga tcgcagtggt 1620
gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa 1680
ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca tcattggcaa cgctaccttt 1740
gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca tacaagcgat agattgtcgc 1800
acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca tataaatcag catccatgtt 1860
ggaatttaat cgcggcctcg acgtttcccg ttgaatatgg ctcatactct tcctttttca 1920
atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 1980
ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 2040
ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 2100
tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 2160
ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 2220
gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 2280
agtgcaccat aaaattgtaa acgttgtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg 2340
atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 2400
gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aataaccccg ccccgttgac 2460
gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 2520
ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagt 2580
cagtgggcct cggcggccaa gcttggcaat ccggtactgt tggtaaaact agtccaccat 2640
ggctgctggc ggaggtgccc ctatggccga taacaatgaa ggtgctgatg gcgtgggctc 2700
cagcagcgga aattggcact gtgatagcac ctggctgggc gacagagtga tcaccaccag 2760
cacaagaaca tgggccctgc ctacctacaa caaccacctg tacaagcaga tcagcaacgg 2820
cacaagcggc ggctccacca acgataacac ctactttggc tacagcaccc cttggggcta 2880
cttcgacttc aaccggttcc actgccactt cagccccaga gactggcagc ggctgatcaa 2940
caacaactgg ggcttcagac ccaagaggct gaacttcaag ctgttcaaca tccaagtgaa 3000
agaagtgacc cagaacgagg gcaccaagac aatcgccaac aacctgacca gcaccatcca 3060
ggtgttcacc gacagcgagt accagctgcc ttatgtgctg ggatctgccc accaaggctg 3120
tctgcctcca tttcctgccg acgtgttcat gatccctcag tacggctacc tgacactgaa 3180
caacggatct caggccgtgg gcagaagctc cttctactgc ctggaatact tccctagcca 3240
gatgctgcgg accggcaaca acttcgagtt cagctacaat ttcgaggacg tgcccttcca 3300
cagcagctac gcccactctc aaagcctgga cagactgatg aaccctctga tcgaccagta 3360
cctgtactac ctgagcagaa cccagagcac aggcggaaca gctggaacac agcaactgct 3420
gtttagccag gctggcccca acaatatgag cgcccaggcc aaaaattggc tgcccggacc 3480
ttgctacaga cagcagagag tgtctaccac actgagccag aacaacaaca gcaactttgc 3540
ctggaccggc gccaccaagt accacctgaa tggcagagac agcctggtca atcctggcgt 3600
ggccatggct acccacaagg acgacgagga aagattcttc ccaagcagcg gcgtgctgat 3660
gttcggaaag caaggcgccg gaaaggacaa cgtggactac agcagcgtga tgctgaccag 3720
cgaggaagag atcaagacca ccaatcctgt ggccaccgag cagtacggag tggtggccga 3780
taatctgcaa cagcagaacg ccgctcctat cgtgggagct gtgaattctc aaggcgccct 3840
gcctggcatg gtctggcaga atagagatgt gtacctgcaa ggccccatct gggccaagat 3900
tccccacacc gatggcaact ttcacccctc tccactgatg ggcggcttcg gacttaaaca 3960
ccctccacct cagatcctga tcaagaatac ccctgtgcct gccgatcctc ctaccacctt 4020
caatcaggcc aaactggcca gcttcatcac ccagtactct accggacagg tgtccgtgga 4080
aatcgagtgg gaactccaga aagaaaacag caagcggtgg aaccccgaga tccagtacac 4140
cagcaactac tacaagagca ccaacgtcga cttcgccgtg aacaccgagg gcacatacag 4200
cgagcctaga cctatcggca cccggtatct gacccggaac ctgtaatgac ttaagcctag 4260
gctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 4320
ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 4380
aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 4440
gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 4500
ggctctatgg aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 4560
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatattttgt 4620
taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg 4680
gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt 4740
ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct 4800
atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt 4860
gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa 4920
agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc 4980
tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc 5040
tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc 5100
gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt 5160
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aatacgactc actatagggc gaattgggta ccgggccccc cctcgatcga ggtcgacggt 5280
atcgggggag ctcgcagggt ctccattttg aagcgggagg tttgaacgcg cagccgccat 5340
gccggggttt tacgagattg tgattaaggt ccccagcgac cttgacgagc atctgcccgg 5400
catttctgac agctttgtga actgggtggc cgagaaggaa tgggagttgc cgccagattc 5460
tgacatggat ctgaatctga ttgagcaggc acccctgacc gtggccgaga agctgcagcg 5520
cgactttctg acggaatggc gccgtgtgag taaggccccg gaggcccttt tctttgtgca 5580
atttgagaag ggagagagct acttccacat gcacgtgctc gtggaaacca ccggggtgaa 5640
atccatggtt ttgggacgtt tcctgagtca gattcgcgaa aaactgattc agagaattta 5700
ccgcgggatc gagccgactt tgccaaactg gttcgcggtc acaaagacca gaaatggcgc 5760
cggaggcggg aacaaggtgg tggatgagtg ctacatcccc aattacttgc tccccaaaac 5820
ccagcctgag ctccagtggg cgtggactaa tatggaacag tatttaagcg cctgtttgaa 5880
tctcacggag cgtaaacggt tggtggcgca gcatctgacg cacgtgtcgc agacgcagga 5940
gcagaacaaa gagaatcaga atcccaattc tgatgcgccg gtgatcagat caaaaacttc 6000
agccaggtac atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca 6060
gtggatccag gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc 6120
ccaaatcaag gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc 6180
cgactacctg gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat 6240
tttggaacta aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac 6300
gaaaaagttc ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac 6360
caacatcgcg gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa 6420
tgagaacttt cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa 6480
gatgaccgcc aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt 6540
ggaccagaaa tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa 6600
caccaacatg tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt 6660
gcaagaccgg atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt 6720
caccaagcag gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga 6780
gcatgaattc tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga 6840
tataagtgag cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga 6900
agcttcgatc aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa 6960
tctgatgctg tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt 7020
cactcacgga cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc 7080
tgtcgtcaaa aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc 7140
agacgcttgc actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca 7200
ataaatgatt taaatcaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca 7260
acctctctga gggcattcgc gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag 7320
ccaaccagca aaagcaggac gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg 7380
gacccttcaa cggactcgac aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg 7440
agcacgacaa ggcctacgac cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata 7500
accacgccga cgccgagttt caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc 7560
tcgggcgagc agtcttccag gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg 7620
aaggcgctaa gacggctcct ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc 7680
cagactcctc tacgggcatc ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt 7740
ttggtcagac tggcgactca gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag 7800
cagcgccctc tggtgtggga cctaatacag tggctgcagg cggtggcgca ccagtggcag 7860
acaataacga aggcgccgac ggagtgggta gttcctcggg aaattggcat tgcgattcca 7920
catggctggg cgacagagtc atcaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca 7980
acaaccacct ctacaagcaa atctccaacg ggacatcggg aggagccacc aacgacaaca 8040
cctacttcgg ctacagcacc ccctgggggt attttgactt taacagattc cactgccact 8100
tttcaccacg tgactggcag cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagagac 8160
tcagcttcaa gctcttcaac atccaggtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga 8220
ccatcgccaa taacctcacc agcaccatcc aggtgtttac ggactcggag taccagctgc 8280
cgtacgttct cggctctgcc caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtgttca 8340
tgattcccca gtacggctac ctaacactca acaacggtag tcaggccgtg ggacgctcct 8400
ccttctactg cctggaatac tttccttcgc agatgctgag aaccggcaac aacttccagt 8460
ttacttacac cttcgaggac gtgcctttcc acagcagcta cgcccacagc cagagcttgg 8520
accggctgat gaatcctctg attgaccagt acctgtacta cttgtctcgg actcaaacaa 8580
caggaggcac ggcaaatacg cagactctgg gcttcagcca aggtgggcct aatacaatgg 8640
ccaatcaggc aaagaactgg ctgccaggac cctgttaccg ccaacaacgc gtctcaacga 8700
caaccgggca aaacaacaat agcaactttg cctggactgc tgggaccaaa taccatctga 8760
atggaagaaa ttcattggct aatcctggca tcgctatggc aacacacaaa gacgacgagg 8820
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atgcggatta cagcgatgtc atgctcacca gcgaggaaga aatcaaaacc actaaccctg 8940
tggctacaga ggaatacggt atcgtggcag ataacttgca gcagcaaaac acggctcctc 9000
aaattggaac tgtcaacagc cagggggcct tacccggtat ggtctggcag aaccgggacg 9060
tgtacctgca gggtcccatc tgggccaaga ttcctcacac ggacggcaac ttccacccgt 9120
ctccgctgat gggcggcttt ggcctgaaac atcctccgcc tcagatcctg atcaagaaca 9180
cgcctgtacc tgcggatcct ccgaccacct tcaaccagtc aaagctgaac tctttcatca 9240
cgcaatacag caccggacag gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaggaaaaca 9300
gcaagcgctg gaaccccgag atccagtaca cctccaacta ctacaaatct acaagtgtgg 9360
actttgctgt taatacagaa ggcgtgtact ctgaaccccg ccccattggc acccgttacc 9420
tcacccgtaa tctgtaattg cctgttaatc aataaaccgg ttgattcgtt tcagttgaac 9480
tttggtctct gcgaagggcg aattcgttta aacctgcagg actagaggtc ctgtattaga 9540
ggtcacgtga gtgttttgcg acattttgcg acaccatgtg gtcacgctgg gtatttaagc 9600
ccgagtgagc acgcagggtc tccattttga agcgggaggt ttgaacgcgc agccgccaag 9660
ccgaattctg cagatatcca tcacactggc 9690
<210> 11
<211> 7293
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 11
gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcactag aagctttatt 240
gcggtagttt atcacagtta aattgctaac gcagtcagtg ggcctcggcg gccaagcttg 300
gcaatccggt actgttggta aaactagtcc accatggctg ctggcggagg tgcccctatg 360
gccgataaca atgaaggtgc tgatggcgtg ggctccagca gcggaaattg gcactgtgat 420
agcacctggc tgggcgacag agtgatcacc accagcacaa gaacatgggc cctgcctacc 480
tacaacaacc acctgtacaa gcagatcagc aacggcacaa gcggcggctc caccaacgat 540
aacacctact ttggctacag caccccttgg ggctacttcg acttcaaccg gttccactgc 600
cacttcagcc ccagagactg gcagcggctg atcaacaaca actggggctt cagacccaag 660
aggctgaact tcaagctgtt caacatccaa gtgaaagaag tgacccagaa cgagggcacc 720
aagacaatcg ccaacaacct gaccagcacc atccaggtgt tcaccgacag cgagtaccag 780
ctgccttatg tgctgggatc tgcccaccaa ggctgtctgc ctccatttcc tgccgacgtg 840
ttcatgatcc ctcagtacgg ctacctgaca ctgaacaacg gatctcaggc cgtgggcaga 900
agctccttct actgcctgga atacttccct agccagatgc tgcggaccgg caacaacttc 960
gagttcagct acaatttcga ggacgtgccc ttccacagca gctacgccca ctctcaaagc 1020
ctggacagac tgatgaaccc tctgatcgac cagtacctgt actacctgag cagaacccag 1080
agcacaggcg gaacagctgg aacacagcaa ctgctgttta gccaggctgg ccccaacaat 1140
atgagcgccc aggccaaaaa ttggctgccc ggaccttgct acagacagca gagagtgtct 1200
accacactga gccagaacaa caacagcaac tttgcctgga ccggcgccac caagtaccac 1260
ctgaatggca gagacagcct ggtcaatcct ggcgtggcca tggctaccca caaggacgac 1320
gaggaaagat tcttcccaag cagcggcgtg ctgatgttcg gaaagcaagg cgccggaaag 1380
gacaacgtgg actacagcag cgtgatgctg accagcgagg aagagatcaa gaccaccaat 1440
cctgtggcca ccgagcagta cggagtggtg gccgataatc tgcaacagca gaacgccgct 1500
cctatcgtgg gagctgtgaa ttctcaaggc gccctgcctg gcatggtctg gcagaataga 1560
gatgtgtacc tgcaaggccc catctgggcc aagattcccc acaccgatgg caactttcac 1620
ccctctccac tgatgggcgg cttcggactt aaacaccctc cacctcagat cctgatcaag 1680
aatacccctg tgcctgccga tcctcctacc accttcaatc aggccaaact ggccagcttc 1740
atcacccagt actctaccgg acaggtgtcc gtggaaatcg agtgggaact ccagaaagaa 1800
aacagcaagc ggtggaaccc cgagatccag tacaccagca actactacaa gagcaccaac 1860
gtcgacttcg ccgtgaacac cgagggcaca tacagcgagc ctagacctat cggcacccgg 1920
tatctgaccc ggaacctgta atgacttaag cctaggctag agctcgctga tcagcctcga 1980
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 2040
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 2100
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 2160
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggaacgt taatattttg 2220
ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc 2280
ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta 2340
aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga 2400
atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa 2460
cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga 2520
accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc 2580
taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga 2640
agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg 2700
cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtccc attcgccatt 2760
caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 2820
ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 2880
acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt 2940
gggtaccggg ccccccctcg atcgaggtcg acggtatcgg gggagctcgc agggtctcca 3000
ttttgaagcg ggaggtttga acgcgcagcc gccatgccgg ggttttacga gattgtgatt 3060
aaggtcccca gcgaccttga cgagcatctg cccggcattt ctgacagctt tgtgaactgg 3120
gtggccgaga aggaatggga gttgccgcca gattctgaca tggatctgaa tctgattgag 3180
caggcacccc tgaccgtggc cgagaagctg cagcgcgact ttctgacgga atggcgccgt 3240
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cacatgcacg tgctcgtgga aaccaccggg gtgaaatcca tggttttggg acgtttcctg 3360
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gagtgctaca tccccaatta cttgctcccc aaaacccagc ctgagctcca gtgggcgtgg 3540
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gcgcagcatc tgacgcacgt gtcgcagacg caggagcaga acaaagagaa tcagaatccc 3660
aattctgatg cgccggtgat cagatcaaaa acttcagcca ggtacatgga gctggtcggg 3720
tggctcgtgg acaaggggat tacctcggag aagcagtgga tccaggagga ccaggcctca 3780
tacatctcct tcaatgcggc ctccaactcg cggtcccaaa tcaaggctgc cttggacaat 3840
gcgggaaaga ttatgagcct gactaaaacc gcccccgact acctggtggg ccagcagccc 3900
gtggaggaca tttccagcaa tcggatttat aaaattttgg aactaaacgg gtacgatccc 3960
caatatgcgg cttccgtctt tctgggatgg gccacgaaaa agttcggcaa gaggaacacc 4020
atctggctgt ttgggcctgc aactaccggg aagaccaaca tcgcggaggc catagcccac 4080
actgtgccct tctacgggtg cgtaaactgg accaatgaga actttccctt caacgactgt 4140
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag gggaagatga ccgccaaggt cgtggagtcg 4200
gccaaagcca ttctcggagg aagcaaggtg cgcgtggacc agaaatgcaa gtcctcggcc 4260
cagatagacc cgactcccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 4320
gggaactcaa cgaccttcga acaccagcag ccgttgcaag accggatgtt caaatttgaa 4380
ctcacccgcc gtctggatca tgactttggg aaggtcacca agcaggaagt caaagacttt 4440
ttccggtggg caaaggatca cgtggttgag gtggagcatg aattctacgt caaaaagggt 4500
ggagccaaga aaagacccgc ccccagtgac gcagatataa gtgagcccaa acgggtgcgc 4560
gagtcagttg cgcagccatc gacgtcagac gcggaagctt cgatcaacta cgcagacagg 4620
taccaaaaca aatgttctcg tcacgtgggc atgaatctga tgctgtttcc ctgcagacaa 4680
tgcgagagaa tgaatcagaa ttcaaatatc tgcttcactc acggacagaa agactgttta 4740
gagtgctttc ccgtgtcaga atctcaaccc gtttctgtcg tcaaaaaggc gtatcagaaa 4800
ctgtgctaca ttcatcatat catgggaaag gtgccagacg cttgcactgc ctgcgatctg 4860
gtcaatgtgg atttggatga ctgcatcttt gaacaataaa tgatttaaat caggtatggc 4920
tgccgatggt tatcttccag attggctcga ggacaacctc tctgagggca ttcgcgagtg 4980
gtgggcgctg aaacctggag ccccgaagcc caaagccaac cagcaaaagc aggacgacgg 5040
ccggggtctg gtgcttcctg gctacaagta cctcggaccc ttcaacggac tcgacaaggg 5100
ggagcccgtc aacgcggcgg acgcagcggc cctcgagcac gacaaggcct acgaccagca 5160
gctgcaggcg ggtgacaatc cgtacctgcg gtataaccac gccgacgccg agtttcagga 5220
gcgtctgcaa gaagatacgt cttttggggg caacctcggg cgagcagtct tccaggccaa 5280
gaagcgggtt ctcgaacctc tcggtctggt tgaggaaggc gctaagacgg ctcctggaaa 5340
gaagagaccg gtagagccat caccccagcg ttctccagac tcctctacgg gcatcggcaa 5400
gaaaggccaa cagcccgcca gaaaaagact caattttggt cagactggcg actcagagtc 5460
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tacagtggct gcaggcggtg gcgcaccagt ggcagacaat aacgaaggcg ccgacggagt 5580
gggtagttcc tcgggaaatt ggcattgcga ttccacatgg ctgggcgaca gagtcatcac 5640
caccagcacc cgaacctggg ccctgcccac ctacaacaac cacctctaca agcaaatctc 5700
caacgggaca tcgggaggag ccaccaacga caacacctac ttcggctaca gcaccccctg 5760
ggggtatttt gactttaaca gattccactg ccacttttca ccacgtgact ggcagcgact 5820
catcaacaac aactggggat tccggcccaa gagactcagc ttcaagctct tcaacatcca 5880
ggtcaaggag gtcacgcaga atgaaggcac caagaccatc gccaataacc tcaccagcac 5940
catccaggtg tttacggact cggagtacca gctgccgtac gttctcggct ctgcccacca 6000
gggctgcctg cctccgttcc cggcggacgt gttcatgatt ccccagtacg gctacctaac 6060
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ttcgcagatg ctgagaaccg gcaacaactt ccagtttact tacaccttcg aggacgtgcc 6180
tttccacagc agctacgccc acagccagag cttggaccgg ctgatgaatc ctctgattga 6240
ccagtacctg tactacttgt ctcggactca aacaacagga ggcacggcaa atacgcagac 6300
tctgggcttc agccaaggtg ggcctaatac aatggccaat caggcaaaga actggctgcc 6360
aggaccctgt taccgccaac aacgcgtctc aacgacaacc gggcaaaaca acaatagcaa 6420
ctttgcctgg actgctggga ccaaatacca tctgaatgga agaaattcat tggctaatcc 6480
tggcatcgct atggcaacac acaaagacga cgaggagcgt ttttttccca gtaacgggat 6540
cctgattttt ggcaaacaaa atgctgccag agacaatgcg gattacagcg atgtcatgct 6600
caccagcgag gaagaaatca aaaccactaa ccctgtggct acagaggaat acggtatcgt 6660
ggcagataac ttgcagcagc aaaacacggc tcctcaaatt ggaactgtca acagccaggg 6720
ggccttaccc ggtatggtct ggcagaaccg ggacgtgtac ctgcagggtc ccatctgggc 6780
caagattcct cacacggacg gcaacttcca cccgtctccg ctgatgggcg gctttggcct 6840
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caccttcaac cagtcaaagc tgaactcttt catcacgcaa tacagcaccg gacaggtcag 6960
cgtggaaatt gaatgggagc tgcagaagga aaacagcaag cgctggaacc ccgagatcca 7020
gtacacctcc aactactaca aatctacaag tgtggacttt gctgttaata cagaaggcgt 7080
gtactctgaa ccccgcccca ttggcacccg ttacctcacc cgtaatctgt aattgcctgt 7140
taatcaataa accggttgat tcgtttcagt tgaactttgg tctctgcgaa gggcgaattc 7200
gtttaaacct gcaggactag aggtcctgta ttagaggtca cgtgagtgtt ttgcgacatt 7260
ttgcgacacc atgtggtcac gctgggtatt taa 7293
<210> 12
<211> 9690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 12
ggccgcgaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 60
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 120
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 180
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 240
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 300
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 360
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 420
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 480
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 540
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 600
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 660
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 720
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 780
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 840
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gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 1020
ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 1080
ttggtctgac agttattaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca atttattcat 1140
atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag gagaaaactc 1200
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aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa gtgagaaatc 1320
accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagt ttatgcattt ctttccagac 1380
ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa ccaaaccgtt 1440
attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga tcgctgttaa aaggacaatt 1500
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acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt tttccgggga tcgcagtggt 1620
gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa 1680
ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca tcattggcaa cgctaccttt 1740
gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca tacaagcgat agattgtcgc 1800
acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca tataaatcag catccatgtt 1860
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ccgaattctg cagatatcca tcacactggc 9690
<210> 13
<211> 7293
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 13
gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
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<210> 14
<211> 534
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 14
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<210> 15
<211> 534
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 16
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aacaactggg gcttcagacc caagcggctg aacttcaagc tgttcaacat ccaagtgaaa 360
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gtgttcaccg acagcgagta ccagctgcct tacgtgctgg gatctgccca ccaaggatgc 480
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atgctgcgga ccggcaacaa cttcgagttc agctaccagt tcgaggacgt gcccttccac 660
agcagctatg cccactctca gagcctggac cggctgatga accctctgat cgaccagtac 720
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tttagccagg ctggccccaa caacatgtct gcccaggcca agaattggct gcccggacct 840
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<211> 1608
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 17
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<212> PRT
<213> 腺相关病毒1
<400> 18
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Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu
465 470 475 480
Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu
485 490 495
Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala
500 505 510
Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg
515 520 525
Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
530
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 26
Phe Val Phe Leu Pro
1 5
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 27
Arg Gly Asn Arg
1
<210> 28
<211> 60
<212> PRT
<213> 腺相关病毒1
<400> 28
Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala Pro Met
20 25 30
Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asn
35 40 45
Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
50 55 60
<210> 29
<211> 60
<212> PRT
<213> 腺相关病毒6
<400> 29
Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala Pro Met
20 25 30
Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asn
35 40 45
Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
50 55 60
<210> 30
<211> 60
<212> PRT
<213> 腺相关病毒2
<400> 30
Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly Ala Pro Met
20 25 30
Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn
35 40 45
Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val
50 55 60
<210> 31
<211> 60
<212> PRT
<213> 腺相关病毒3B
<400> 31
Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro Ala Ala Pro
1 5 10 15
Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala Pro Met
20 25 30
Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn
35 40 45
Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val
50 55 60
<210> 32
<211> 60
<212> PRT
<213> 腺相关病毒8
<400> 32
Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met
20 25 30
Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn
35 40 45
Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
50 55 60
<210> 33
<211> 60
<212> PRT
<213> 腺相关病毒
<400> 33
Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro Ala Gly Pro
1 5 10 15
Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met
20 25 30
Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn
35 40 45
Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
50 55 60
<210> 34
<211> 60
<212> PRT
<213> 腺相关病毒9
<400> 34
Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala Pro Val
20 25 30
Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn
35 40 45
Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val
50 55 60
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> 腺相关病毒8
<400> 35
tacaatggct gcaggcggtg gcgcaccaat ggcagac 37
<210> 36
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 36
tacagtggct gcaggcggtg gcgcaccagt ggcagac 37
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 腺相关病毒8
<400> 37
Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met Ala Asp
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 38
Thr Val Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Val Ala Asp
1 5 10
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 腺相关病毒8
<400> 39
Gln Trp Leu Gln Ala Val Ala His Gln Trp Gln
1 5 10
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 40
Gln Trp Leu Gln Ala Val Ala His Gln Trp Gln
1 5 10

Claims (56)

1.适用于穿过血脑屏障的合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述合理多倍体AAV病毒粒子包含AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种和AAV VP3病毒结构蛋白；
其中，所述VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种各自来自任何AAV血清型，并且所述VP3病毒结构蛋白来自有效穿过所述血脑屏障、且不同于VP1或VP2中的至少一种的血清型的AAV血清型，并且
其中，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群能够穿过所述血脑屏障(BBB)和/或转导BBB的内皮细胞和/或在全身性施用或鞘内施用时穿过BBB的血液成分。
2.如权利要求1所述的群，其中，相对于缺乏穿过所述血脑屏障的能力的非合理多倍体AAV颗粒，所述群表现出增强的穿过所述血脑屏障(BBB)的转导活性。
3.如权利要求1-2中任一项所述的群，其中，所述VP3病毒结构蛋白是AAV恒河猴血清型。
4.如权利要求1-3中任一项所述的群，其中，所述VP3病毒结构蛋白来自有效穿过所述血脑屏障的血清型，所述血清型选自于由AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAVrh39和AAVrh43所组成的组。
5.如权利要求1-4中任一项所述的群，其中，相对于缺乏有效穿过所述血脑屏障的能力的非合理多倍体AAV颗粒，所述群对受试者的皮层、纹状体、丘脑、髓质、海马体、小脑和脊髓中的一个或多个具有增强的转导。
6.如权利要求1-5中任一项所述的群，其中，相对于AAV2，所述群在一个或多个CNS区域中具有增强的转导，所述CNS区域选自于由髓质、颈部、胸部、腰椎和脉络丛所组成的组。
7.如权利要求1-6中任一项所述的群，其中，相对于AAV8，所述群具有增强的与脑微血管内皮细胞(BMVEC)的结合。
8.如权利要求1-7中任一项所述的群，其中，所述群在CNS中具有生物分布。
9.如权利要求1-8中任一项所述的群，其中，所述群具有至少0.05vg/细胞、0.1vg/细胞、至少0.2vg/细胞、至少0.4vg/细胞、至少0.6vg/细胞、至少0.8vg/细胞、至少1vg/细胞、至少5vg/细胞、至少10vg/细胞、至少20vg/细胞、至少25vg/细胞或优选更多的CNS生物分布。
10.如权利要求1-9中任一项所述的群，其中，所述VP1或VP2中的至少一个选自穿过血脑屏障的AAV血清型。
11.如权利要求1-9中任一项所述的群，其中，所述VP1或VP2中的至少一个选自不穿过血脑屏障的AAV血清型。
12.如权利要求1-11中任一项所述的群，其中，所述VP1或VP2中的至少一个不选自AAV恒河猴血清型。
13.如权利要求1-11中任一项所述的群，其中，所述VP1或VP2中的至少一个选自AAV恒河猴血清型。
14.如权利要求1-13中任一项所述的群，其中，与由所述VP1或VP2结构蛋白亚型的亲代AAV载体引发的体液应答相比，当向受试者施用时，所述群引发较低的体液免疫应答。
15.如权利要求1-14中任一项所述的群，其中，所述群逃避针对AAV VP1、VP2或VP3病毒结构蛋白的亲代血清型的中和抗体。
16.一种穿过受试者的血脑屏障递送转基因的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-15中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
17.一种向受试者重复给予AAV的方法，所述方法包括通过向所述受试者施用权利要求1-16中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群而进行的第一施用，以及通过向所述受试者施用VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种的亲代AAV血清型而进行的第二施用，
其中，与由所述VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引发的体液应答相比，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群引发减少的体液应答；并且
其中，所述VP1或VP2中的至少一个不来自恒河猴AAV血清型。
18.一种允许重复给药的合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述群包括：
合理多倍体AAV病毒粒子，所述病毒粒子包含AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种和AAV VP3病毒结构蛋白；
其中，所述VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种各自来自任何AAV病毒血清型，并且所述VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAV血清型；
其中，与由所述VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引发的体液应答相比，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群引发减少的体液应答；
其中，所述VP1或VP2中的至少一个不来自恒河猴AAV血清型，并且
其中，所述重复给药包括所述合理多倍体AAV病毒粒子的群的第一施用，以及所述VP1结构病毒蛋白或VP2结构病毒蛋白的亲代AAV血清型的第二施用。
19.一种合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述群包含：
a.选自AAV8病毒血清型的VP1和VP2 AAV病毒结构蛋白，以及
b.选自AAV恒河猴血清型AAVrh10或AAVrh74的VP3，
其中，相对于由亲代AAV8血清型引发的相应的体液应答，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群在被施用至受试者时引发减少的体液应答。
20.一种重复给药的方法，包括对受试者进行第一AAV施用和第二AAV施用，所述方法包括：
通过向所述受试者施用来自权利要求1-16或18-19中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群进行所述第一施用，以及
通过施用VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型进行所述第二施用，
其中，与由所述VP1或VP2病毒结构蛋白的亲代AAV血清型引发的相应的体液应答相比，所述第一施用在所述受试者中引发减少的体液应答，并且
其中，VP1或VP2不来自恒河猴AAV血清型。
21.如权利要求18-20中任一项所述的群，其中，所述群逃避针对AAV VP1、VP2或VP3病毒结构蛋白的亲代血清型的中和抗体。
22.一种穿过受试者的血脑屏障递送转基因的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求18-21中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
23.如前述权利要求中任一项所述的群，其中，所述VP3蛋白是来自AAVrh10或AAVrh74血清型的突变的VP3蛋白。
24.如权利要求23所述的群，其中，所述突变的AAVrh74 VP3蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或为与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的蛋白，或其中所述突变的AAVrh74VP3包含SEQ ID NO:2的至少一种以下的修饰：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H、N736P。
25.如权利要求24所述的群，其中，所述突变的AAVrh10 VP3蛋白由SEQ ID NO:5的核酸编码，与SEQ ID NO:5的AAVrh10_VP3核酸相比，包含Q214N、S462N和D517E突变中的至少一个或多个；或包含与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性的核酸序列，包含选自Q214N、S462N和D517E中的至少一个突变。
26.如权利要求25所述的群，其中，所述VP3蛋白是包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列的AAVrh74 VP3蛋白或者与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的蛋白，或包含SEQ ID NO:2的至少一种以下的氨基酸修饰：N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H、E533K、R726H、N736P。
27.如权利要求1-26中任一项所述的实质上同类的病毒粒子的群，其中，所述群为至少101个病毒粒子。
28.一种核酸，所述核酸以5'至3'的方向包含：
a.第一核酸，所述核酸编码与第一启动子可操作地连接的AAVrh10VP3衣壳蛋白；
b.第一poly A序列；
c.第二核酸，所述核酸编码rep蛋白；
d.第三核酸，所述核酸编码AAV8 VP1和VP2病毒结构蛋白，所述第三核酸序列不能表达AAV8 VP3病毒结构蛋白；以及
e.第二poly A序列。
29.一种核酸，所述核酸以5'至3'的方向包含：
a.第一核酸，所述核酸编码与第一启动子可操作地连接的AAVrh74VP3衣壳蛋白；
b.第一poly A序列；
c.第二核酸，所述核酸编码rep蛋白；
d.第三核酸，所述核酸编码AAV8 VP1和VP2病毒结构蛋白，所述第三核酸序列不能表达AAV8 VP3病毒结构蛋白；以及
e.第二poly A序列。
30.一种病毒载体，所述病毒载体包含：
a.AAV病毒粒子，所述病毒粒子来自前述权利要求中任一项所述的群；以及
b.核酸，所述核酸包含至少一个末端重复序列和异源基因，其中，所述核酸通过所述AAV病毒粒子包封。
31.如前述权利要求中任一项所述的群，所述群包含嵌合或修饰的病毒结构蛋白，其中，所述修饰的病毒结构蛋白包含一个或多个氨基酸的插入、缺失或替换。
32.如权利要求27所述的实质上同类的群，其中，与包含亲代AAV血清型的实质上同类的病毒粒子的群相比，所述实质上同类的群在体内于血清中引发显著更少的针对VP1或VP2结构蛋白的亲代AAV血清型的抗AAV IgG抗体。
33.如权利要求32所述的实质上同类的群，其中，所述亲代AAV血清型是AAV8。
34.一种允许重复给药的合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述群包括：
AAV VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种和AAV VP3病毒结构蛋白；
其中，所述VP1和VP2病毒结构蛋白各自来自除恒河猴AAV血清型之外的任何AAV病毒血清型，并且所述VP3病毒结构蛋白选自恒河猴AAV血清型；
其中，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群逃避针对所述VP3病毒结构蛋白的亲代AAV恒河猴血清型的中和抗体，
其中，所述重复给药包括所述VP3结构蛋白的亲代AAV恒河猴血清型的第一施用，以及所述合理多倍体AAV病毒粒子的群的第二施用，并且
其中，所述合理多倍体病毒粒子的VP3结构蛋白是AAV恒河猴突变的病毒结构蛋白VP3。
35.如权利要求34所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述AAV恒河猴突变的病毒结构蛋白VP3来自突变的AAVrh10 VP3病毒结构蛋白或来自突变的AAVrh74 VP3病毒结构蛋白。
36.如权利要求34-35中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变的病毒结构蛋白VP3包含在对应于选自于由N263、G264、T265、S266T、G268、T270、T274和E533所组成的组中的氨基酸的氨基酸处的突变，其中，所有氨基酸位置对应于AAVrh10或AAVrh74的天然VP1序列编号。
37.如权利要求36所述的群，其中，所述突变选自于由N263S、G264A、T265S、S266T、G268A、T270del、T274H和E533K所组成的组。
38.如权利要求34-37中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变的病毒结构蛋白VP3进一步包含在对应于选自于由R727和N737所组成的组中的氨基酸的氨基酸处的突变，其中，所有氨基酸位置对应于AAVrh10的天然VP1序列编号。
39.如权利要求38所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变选自于由R727H和N737P所组成的组。
40.如权利要求34-37中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变的病毒结构蛋白VP3进一步包含在对应于选自于由R726和N736所组成的组中的氨基酸的氨基酸处的突变，其中，所有氨基酸位置对应于AAV rh74的天然VP1序列编号。
41.如权利要求40所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变选自于由R726H和N736P所组成的组。
42.如权利要求41所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述突变的病毒结构蛋白VP3进一步包含在对应于581处的W的氨基酸处的突变，其中，W被两个后随的V残基(VV)取代，并且其中所有氨基酸位置对应于AAVrh74的天然VP1序列编号。
43.如权利要求34-42中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述AAVVP1或VP2病毒结构蛋白是选自表1的任何AAV血清型。
44.如权利要求34-43中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群，其中，所述AAVVP1或VP2结构蛋白是AAV8。
45.合理多倍体AAV病毒粒子的群在制造用于穿过血脑屏障递送转基因的药物中的用途，所述药物包含权利要求1-15或18-19、21、23-27、31-44中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
46.如权利要求45所述的用途，其中，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群包含选自AAV8病毒血清型的VP1和VP2 AAV病毒结构蛋白、以及选自AAV恒河猴血清型AAVrh10或AAVrh74的VP3病毒结构蛋白。
47.如权利要求45所述的用途，其中，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群包含来自AAV8病毒血清型的VP1和VP2 AAV病毒结构蛋白、以及来自AAV恒河猴血清型AAVrh74的VP3结构蛋白。
48.如权利要求45所述的用途，其中，所述药物用于治疗脑部疾病或脑部紊乱或神经退行性疾病或神经系统疾病。
49.如权利要求45所述的用途，其中，所述药物用于治疗中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)的疾病。
50.如权利要求45所述的用途，其中，所述药物用于治疗患有脑癌或脑部癌症的受试者。
51.如权利要求45所述的用途，其中，所述药物用于治疗患有选自以下的疾病或紊乱的受试者：阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和多巴胺转运体缺乏综合征。
52.核酸在制备如下药物中的用途，所述药物包含用于递送转基因穿过血脑屏障的合理多倍体AAV病毒粒子的群，所述核酸包含权利要求28或29中的任一项。
53.合理多倍体AAV病毒粒子的群在制备用于如下方法的第一药物和第二药物中的用途，所述方法用于第一药物的第一施用和第二药物的第二施用的重复给药，其中，所述重复给药包括第一药物的第一施用以及第二药物的第二施用，所述第一药物包含来自权利要求1-15或18-19中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子，所述第二药物包括VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种的亲代AAV血清型，
其中，与由所述VP1或VP2病毒结构蛋白中的至少一种的亲代AAV血清型引发的体液应答相比，所述合理多倍体AAV病毒粒子的群引发减少的体液应答，并且其中所述VP2或VP1不来自恒河猴AAV血清型。
54.合理多倍体AAV病毒粒子的群在制备用于逃避针对AAV VP1、VP2或VP3的亲代血清型的中和抗体的药物中的用途，所述药物包含权利要求1-15或18-19、21、23-27和31-44中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
55.合理多倍体AAV病毒粒子的群在制备用于将转基因递送至小肠的药物中的用途，所述药物包含权利要求1-15或18-19、21、23-27和31-44中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
56.合理多倍体AAV病毒粒子的群在制备用于治疗胃肠疾病或紊乱的药物中的用途，所述药物包含权利要求1-15或18-19、21、23-27和31-44中任一项所述的合理多倍体AAV病毒粒子的群。
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