JP2006131591A - 医薬組成物及び該組成物による遺伝子治療方法 - Google Patents

Abstract

【課題】無菌保証され、患者へ即投与が可能な、非ウイルスベクターを使用した医薬組成物を提供する。
【解決手段】分子中にカチオン性ブロック鎖及び非イオン性ブロック鎖を有する高分子化合物と核酸を親水性溶液中で混合することで得られる医薬組成物であって、前記高分子化合物が、多官能性化合物を核とし該核から複数の高分子鎖が結合していることを特徴とする分子構造を利用したことで、無菌保証された状態で、生体内に直接投与が可能となった。生体内では多臓器で遺伝子の発現が確認され、遺伝子治療用の医薬組成物として有用であることが確認された。
【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子治療など動物の疾病の治療や細胞の形質転換、指標タンパク導入、ＧＦＰ動物の作成など動物の疾病の診断、予防、治療法研究に使用する医薬組成物と、この医薬組成物を用いた遺伝子治療方法に関する。

近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、幹細胞移植や遺伝子治療研究がますます重要視されている。幹細胞移植の研究では、移植した宿主内における細胞の由来を追跡するためにＬａｃＺやＧＦＰなどの遺伝子を導入するマイグレーションが盛んに行われており、簡便に安定して幹細胞へ遺伝子を導入する技術が重要となる。

また、遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。

一般に細胞への外来ＤＮＡの導入のためにはベクターが利用されるが、ベクターとしてはレトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのウイルスベクターのほかにジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムなどのカチオン性脂質又はポリエチレンイミンなどの合成高分子からなる非ウイルスベクターが存在する。このうち、現在、遺伝子治療の臨床応用に主として検討されているのはウイルスベクターである。

遺伝子治療の臨床研究において、非ウイルスベクターでなく、感染などの副作用の危険性が高く、また実際に死亡事故があったウイルスベクターが現在も主流で検討されている理由としては、ウイルスベクターの遺伝子導入効率が高いことの他に、非ウイルスベクターの経時的安定性の問題が挙げられる。

一般に、試験管内で細胞への遺伝子導入のために利用されている非ウイルスベクター、いわゆるトランスフェクション試薬は、遺伝子と混合するだけで遺伝子複合体を形成するものであり、この遺伝子複合体を細胞と接触させることでエンドシトーシス現象により細胞内へ取り込まれ、導入遺伝子が発現されるとされている。非ウイルスベクターには増殖能もなく、感染の危険性もないため、閉じ込め施設などを必要とせずに遺伝子複合体の調製や細胞への遺伝子導入操作が行える利点がある。

しかしながら、これら非ウイルスベクターと遺伝子の複合体の安定性は一般に低く、経時性に凝集して失活するという問題があるため、ベクターと細胞とを接触させる直前遺伝子複合体を調製することが原則となる。

その一方、ベクターを生体へ投与する医薬組成物として使用する場合には、投与しようとする遺伝子複合体は無菌状態であることが必須であるか又は望ましく、遺伝子複合体の調製を無菌的に行うことは勿論、無菌保証を行うことが望ましい。無菌保証とは、医薬組成物が生体に使用される時点で該組成物が無菌であることを保証するもので、日本薬局方で規定されている無菌試験、発熱性物質試験などの基準を満足させることで行えるが、これら試験は判定結果を得るのに約２週間の時間が必要であり、生体へ無菌保証された医薬組成物を投与するには、医薬組成物の経時的安定性が最低でも２週間以上必要ということになる。また、ベクターと遺伝子の混合を臨床の場で行うことは、菌や異物などのコンタミネーションの危険性があるし、投与量（ドーズ数）に誤差が生じる危険性もある。

本発明は、無菌保証された状態で医療施設やバイオ研究施設へデリバリーが可能で、臨床の場において患者へ即投与が可能で、遺伝子治療や疾病の診断、予防、治療法研究に使用可能な医薬組成物と、この医薬組成物を用いた遺伝子治療方法を提供する。

本発明（請求項１）の医薬組成物は、分子中にカチオン性ブロック鎖及び非イオン性ブロック鎖を有する高分子化合物と核酸を水溶液中で混合することで得られる医薬組成物であって、前記高分子化合物が、多官能性化合物を核とし該核から複数の高分子鎖が結合していることを特徴とする。

請求項２の医薬組成物は、請求項１の医薬組成物をさらに凍結乾燥させたことを特徴とする。

請求項３の医薬組成物は、請求項１または２において、多官能性化合物が芳香族環を有するものであることを特徴とする。

請求項４の医薬組成物は、請求項３において、芳香族環がベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレン、ビフェニル、ビフェニレン、フラン、ピリジン、チオフェン、ピロール、ピロリドン及びジフェニルエーテルからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする。

請求項５の医薬組成物は、請求項１ないし４のいずれか１項において、カチオン性ポリマー鎖が、アミノアルキルアクリルアミド、アミノアルキルメタ（ア）クリレート、アミノスチレン、モノアルキルアミノアルキルアクリルアミド、モノアルキルアミノアルキルメタ（ア）クリレート、モノアルキルアミノスチレン、ジアルキルアミノアルキルアクリルアミド、ジアルキルアミノアルキルメタ（ア）クリレート及びジアルキルアミノスチレンからなる群から選択される１種又は２種以上の重合体であることを特徴とする。

請求項６の医薬組成物は、請求項１ないし５のいずれか１項において、非イオン性ポリマー鎖が、エチレングリコール、プロピレングリコール、ビニルピロリドン、酢酸ビニル鹸化物、グリシドール開環付加体、アクリルアミド、モノアルキルアクリルアミド、ジアルキルアクリルアミド、ヒドロキシアルキルメタ（ア）クリレート及びアルコキシアルキルメタ（ア）クリレートからなる群から選択される１種又は２種以上の重合体であることを特徴とする。

請求項７の医薬組成物は、請求項１ないし６のいずれか１項において、カチオン性ポリマー鎖の分子量が５０００〜１００，０００で、非イオン性ポリマー鎖の分子量が５０００〜１００，０００であることを特徴とする。

請求項８の医薬組成物は、請求項１ないし７のいずれか１項において、核酸がＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子、ＦＧＦ遺伝子、ＥＧＦ遺伝子、ｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイ、ｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、リナマラーゼ遺伝子、ｐ５３癌抑制遺伝子、アポプチン遺伝子、ＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−１β遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−１２遺伝子、ｂｃｌ２遺伝子、ｇｐ−１００癌抗原ペプチド遺伝子、ＭＡＲＴ−１癌抗原ペプチド遺伝子、ＭＡＧＥ−１癌抗原ペプチド遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子、ボツリヌス毒素遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子及びルシフェラーゼ遺伝子からなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする。

請求項９の医薬組成物は、請求項１ないし８のいずれか１項において、水溶液がｐＨ５．２〜ｐＨ８．５の範囲の緩衝溶液であることを特徴とする。

請求項１０の医薬組成物は、請求項９において、緩衝溶液が乳酸バッファー、リン酸バッファー、重炭酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、グッドバッファー、及びＨＥＰＥＳからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする。

請求項１１の医薬組成物は、請求項１ないし１０のいずれか１項において、親水性溶液中での高分子化合物の終濃度が０．００１〜５０，０００μｇ／ｍＬであり、核酸の終濃度が０．００１〜５０，０００μｇ／ｍＬであることを特徴とする。

本発明（請求項１２）の遺伝子治療方法は、請求項１ないし１１のいずれか１項の医薬組成物を生体内へ投与することを特徴とする。

請求項１３の遺伝子治療方法は、請求項１２において、生体内投与が経口、血管内、筋肉、皮下、腹腔、脈管内、粘膜、骨髄、歯髄、肺胞、鼻腔、口腔又は表皮へ投与するものであることを特徴とする。

本発明によると、非ウイルスベクターと遺伝子の複合体で、無菌保証された状態で生体へ投与可能な医薬組成物と、これを用いた遺伝子治療方法が提供される。

以下に本発明の医薬組成物及び該組成物による遺伝子治療方法の実施の形態を詳細に説明する。

本発明の医薬組成物の第一の形態は、分子中にカチオン性ブロック鎖及び非イオン性ブロック鎖を有する高分子化合物と核酸を親水性溶液中で混合することで得られる医薬組成物であって、前記高分子化合物が、多官能性化合物を核とし該核から複数の高分子鎖が結合していることを特徴とする医薬組成物である。

分子中にカチオン性ブロック鎖及び非イオン性ブロック鎖を有する高分子化合物は、多官能性化合物を核として複数の高分子鎖が伸延する構造を有するものであり、一般に当業者にはスターポリマーと呼ばれている。このような高分子化合物は電荷バランスとしてはカチオン性であるため、アニオン性の核酸と親水性溶液中で混合することで遺伝子複合体が形成される。本発明はこの遺伝子複合体を薬効物質とする医薬組成物である。

核から伸延する、カチオン性ブロックと非イオン性ブロックを有する高分子鎖は、ランダムポリマーでもブロックポリマーのいずれでも良いが、好ましい配置は、カチオン性ブロックを核近傍の内側に、非イオン性ブロックをカチオン性ブロックの先端から、接ぎ木するように外側に配置した分子構造である。

このような配置にすることにより、形成される遺伝子複合体の安定性も増加し、生体内へ投与した際に遺伝子複合体が凝集するのを抑制したり、陽電荷刺激による血液凝固因子の活性化を抑制する効果が期待できる。

カチオン性ブロックとしては、アミノアルキルアクリルアミド、アミノアルキルメタ（ア）クリレート、アミノスチレン、モノアルキルアミノアルキルアクリルアミド、モノアルキルアミノアルキルメタ（ア）クリレート、モノアルキルアミノスチレン、ジアルキルアミノアルキルアクリルアミド、ジアルキルアミノアルキルメタ（ア）クリレート及びジアルキルアミノスチレンからなる群から選択される１種又は２種以上のポリマー鎖が使用可能であり、非イオン性ブロックとしては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ビニルピロリドン、酢酸ビニル鹸化物、グリシドール開環付加体、アクリルアミド、モノアルキルアクリルアミド、ジアルキルアクリルアミド、ヒドロキシアルキルメタ（ア）クリレート及びアルコキシアルキルメタ（ア）クリレートからなる群から選択される１種又は２種以上の重合体が使用可能であるが、これらはいずれも当業者に周知のものであり、本発明のブロック鎖の種類も何らこの例示された範囲に限定されるものではない。

カチオン性ポリマー鎖の分子量が５，０００〜１００，０００で、非イオン性ポリマー鎖の分子量が５，０００〜１００，０００であると遺伝子複合体の安定性が高く、遺伝子導入効率も高いため好ましい。

核とする多官能性化合物としては、芳香族環を有するものが好適であり、具体的には、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレン、ビフェニル、ビフェニレン、フラン、ピリジン、チオフェン、ピロール、ピロリドン及びジフェニルエーテルからなる郡から選択される１種又は２種以上が使用可能である。

本発明の医薬組成物に使用する核酸の好ましい例としては、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子、ＦＧＦ遺伝子、ＥＧＦ遺伝子、ｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイ、ｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、リナマラーゼ遺伝子、ｐ５３癌抑制遺伝子、アポプチン遺伝子、ＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−１β遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−１２遺伝子、ｂｃｌ２遺伝子、ｇｐ−１００癌抗原ペプチド遺伝子、ＭＡＲＴ−１癌抗原ペプチド遺伝子、ＭＡＧＥ−１癌抗原ペプチド遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子、ボツリヌス毒素遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子、及びルシフェラーゼ遺伝子からなる群から選択される１種又は２種以上が例示可能であるが、遺伝子治療や疾病の診断、予防、治療法研究に利用できるものであればこの限りではない。また、ここでいう遺伝子治療とは、腫瘍細胞へ作用するＴＮＦαを腫瘍部位へ発現させるような直接的なものだけでなく、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を導入して抗ウイルス剤ガンシクロビルの効果により前立腺ガンを治療する方法のように間接的に効果を狙うものも包含されることは当業者には周知のことである。

また、使用する核酸は、単にペプチドやタンパクをコードするものでなく、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いることが好ましい。例えばＤＮＡの場合、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されていることが好ましい。また、所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。

本発明において、高分子化合物と核酸とを混合する際に使用する水溶液としては、緩衝溶液が好ましく、該緩衝溶液のｐＨとしては、核酸及び高分子化合物の電荷状態を複合体が形成しやすい状態とし、得られた複合体を血中に投与することを考慮すれば５．２〜８．５の範囲が好ましく、このような緩衝溶液としては乳酸バッファー、リン酸バッファー、重炭酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、グッドバッファー、ＨＥＰＥＳなどが例示されるが、Ｔｒｉｓバッファーが好ましい。さらに、医薬組成物の浸透圧は、症例、投与部位、患者の状態、遺伝子の種類などを考慮して、当業者によって適宜設定されれば良いが、生理的に等張であることが好ましく、遺伝子の種類や高分子化合物の分子量などに応じて適宜低級アルコールなどを添加することで遺伝子複合体の経時的安定性をより高めることが可能な場合がある。本発明でいう親水性溶液とは、これら低級アルコール以外にも親水性有機化合物を添加できることを意味する。

遺伝子と高分子化合物の終濃度は、そのまま投与量、すなわちドーズ数となるため、症例、治療方針、患者状態、体重などを考慮して当業者によって適宜選択されば良いが、典型的には、親水性溶液中での高分子の終濃度は０．００１〜５０，０００μｇ／ｍＬであり、核酸の終濃度は０．００１〜５０，０００μｇ／ｍＬの範囲である。また、遺伝子と高分子化合物の混合比は、高分子化合物のカチオン性官能基の数と遺伝子のアニオン性官能基の数から計算して決定される、当業者に周知のＣ／Ａ比で、０．０１〜１，０００．０の範囲が好適に使用可能である。

本発明の医薬組成物は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍及び乳癌等などの悪性新生物、エイズ、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎及び日本住血吸虫等の感染症、ＡＤＡ欠損症、嚢胞性線維症、α１−アンチトリプシン欠損症及びGaucher病などの単一遺伝病、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の血管病変による循環器疾患、糖尿病による四肢末端組織の壊死、ｂｃｌ２遺伝子による損傷神経細胞の再生などが挙げられるが、この限りではない。

本発明の医薬組成物の投与方法としては、血管内、筋肉、皮下、腹腔、脈管内、粘膜、骨髄、歯髄、肺胞、鼻腔、口腔、舌下又は表皮へ注射器、血管内カテーテルを利用した注入したり輸液へ混注することや方法や、内視鏡、貼付基材などを使用して注入噴霧や塗布により投与する方法を例示できる。

本発明の医薬組成物が親水性溶液の形態である場合は、汎用の注射液のようにプラスチックやガラス製のアンプル管へ無菌的に充填された状態で医療施設にデリバリーが可能である。

本発明の第二の実施形態は、上記した親水性溶液である医薬組成物をさらに凍結乾燥させたことを特徴とする。である。汎用の注射用粉末薬剤のようにベッドサイドやナースステーションにて生理食塩水などに溶解して投与することや、凍結乾燥したものを種々の賦形剤と混合して、粉末、錠剤、カプセルとして経口投与する方法や、ｌ−メントールなどと配合して貼付材とし、経皮吸収させる疣、魚の目、ホクロ、火傷跡などの表皮の遺伝子治療用医薬組成物として使用可能である。

実施例１（核の合成）
Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム三水和物（関東化学、特級試薬）６．０グラムをエタノール５０ｍＬへ溶解し溶液へ攪拌下で１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼン１．０グラムを加えて分散懸濁させた。遮光下、室温下で５日間攪拌を継続し、濾過して沈殿物を回収した。沈殿物をメタノール中へ分散させて攪拌し、濾過することを繰り返して洗浄し、上澄から臭素が確認されなくなるまで洗浄した。減圧下でメタノールを除去して得た粉末をクロロホルムで再結晶して白色固体の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを得た。収率は約８０％であった。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ３）は、σ７．４８ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、Ａｒ−Ｈ）、σ４．５７ｐｐｍ（ｓ、８Ｈ、Ａｒ−ＣＨ _２ Ｓ）、σ４．０６ｐｐｍ〜３．９９ｐｐｍ（ｑ、8Ｈ、Ｎ−ＣＨ _２ −）、σ３．７５ｐｐｍ〜３．６９ｐｐｍ（ｑ、８Ｈ、Ｎ−ＣＨ _２ −）、σ１．３０ｐｐｍ（ｔ、２４Ｈ、−ＣＨ_２−ＣＨ _３ ）と帰属された。

実施例２（分子中にカチオン性ブロック鎖を有する高分子化合物の合成）
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン１８ｍｇを４００μＬのクロロホルムへ溶解し、１．１グラムのジメチルアミノプロピルアクリルアミドを混合し、メタノールで全量を２０ｍＬとした。高純度窒素ガスでバブリングを行って溶存酸素を除去し、攪拌、窒素ガスバブリングを継続しながら低圧水銀ランプにて照度約１ｍＷ／ｃｍ^２〜３ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線照射を３０分間行った。生成した反応溶液をエバポレーターで濃縮し、残渣を４００ｍＬのジエチルエーテル中へ滴下して反応生成物を析出させた。溶液をデカンテーションにて除去し、オイル状の生成物を得た。オイル状物質を水に溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後に凍結乾燥して白色固体を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）は、σ７．７８〜７．４０ｐｐｍ（ｂｒ、１Ｈ、−ＮＨ−）、σ３．４０〜３．００ｐｐｍ（ｂｒ、2Ｈ、ＮＨ−ＣＨ _２ −）、σ２．４０〜２．２０ｐｐｍ（ｂｒ、２Ｈ、−ＣＨ _２ −Ｎ（ＣＨ_３）_２）、σ２．０４ｐｐｍ（ｂｒ、６Ｈ、Ｎ（ＣＨ _３ ）_２）、σ１．８０〜１．５２ｐｐｍ（ｂｒ、２Ｈ、−ＣＨ_２−ＣＨ _２ −ＣＨ_２−）と帰属された。分子量は、ＧＰＣ（カラム：Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌα３０００＋ＴＳＫｇｅｌα５０００の連結、移動相：３０ｍＭ臭化リチウムを含むＤＭＦ、流速：０．５ｍＬ／分、カラム温度：４０℃）にて約５０，０００（Ｍｎ）と測定された。

実施例３（分子中にカチオン性ブロック鎖及び非イオン性ブロック鎖を有する高分子化合物の合成）
実施例２で合成したポリ（３−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）鎖を有するポリマー６３ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド２５０ｍｇへ溶解し、メタノールで希釈して全量を２０ｍＬとした。高純度窒素ガスでバブリングを行って溶存酸素を除去し、攪拌、窒素ガスバブリングを継続しながら低圧水銀ランプにて照度約１ｍＷ／ｃｍ^２〜３ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線照射を３０分間行った。生成した反応溶液をエバポレーターで濃縮し、残渣を４００ｍＬのジエチルエーテル中へ滴下して反応生成物を析出させた。溶液をデカンテーションにて除去し、オイル状の生成物を得た。オイル状物質を水に溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後に凍結乾燥して白色固体を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）は、σ３．００ｐｐｍ（ｂｒ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ _２ −）、σ２．９１〜２．７９ｐｐｍ（ｂｒ、６Ｈ、−ＣＯ−Ｎ（ＣＨ _３ ）_２）、σ２．２５ｐｐｍ（ｂｒ、２Ｈ、−ＣＨ _２ −Ｎ（ＣＨ_３）_２）、σ２．１０ｐｐｍ（ｂｒ、６Ｈ、−ＣＨ_２−Ｎ−（ＣＨ _３ ）_２）、σ１．５６ｐｐｍ（ｂｒ、２Ｈ、−ＣＨ_２−ＣＨ _２ −ＣＨ_２−）と帰属された。分子量は約８０，０００（Ｍｎ）と測定された。

実施例４（医薬組成物の調製）
実施例３で合成した分子中にカチオン性ブロック鎖及び非イオン性ブロック鎖を有する高分子化合物を１０ｍＭトリス・ＨＣＬバッファー（ｐＨ＝７．４）へ溶解し、１．２ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。同様にしてＬａｃＺ遺伝子を１０ｍＭトリス・ＨＣＬバッファー（ｐＨ＝７．４）へ溶解し、５μｇ／ｍＬの溶液を調製した。室温下で、これらＬａｃＺ遺伝子溶液５μＬと高分子化合物５ｍＬを混合し、１０分間静置した後に０．２μｍフィルターで濾過した。これをガラス製アンプル管へ充填し、常法により封管して本発明の医薬組成物を得た。

続いて、日本薬局方一般試験法に記載されている無菌試験方法の直接法に準拠して試験を行った。培地にはソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地を使用し、培地の性能試験はBacillus subtilis（ＡＴＣＣ６６３３株）を用いて行った。無菌試験より、ガラス製アンプル管へ充填された本発明の医薬組成物は、調製から１７日後に無菌状態であることが確認された。ＬＡＬ法、ウサギによる発熱性物質試験も陰性であった。

実施例５（遺伝子導入実験）
実施例４で調製し、室温下で１７日間保存された発明の医薬組成物をマウス頚部静脈から投与し、飼育をした。飼料はオリエンタル酵母社製ＣＲ−ＬＰＦで、水は自由給水をした。ドーズ数は、遺伝子換算でマウス１匹あたりに２５μｇであり、遺伝子はＬａｃＺ又はＧＦＰを使用した。いずれの遺伝子を投与した群でも、注入から９２時間後に犠牲死させ、脾臓、腎臓、肺、肝臓を摘出してマクロ所見及び、組織の蛍光顕微鏡による観察を行った。結果、脾臓、腎臓、肺、肝臓でＬａｃＺに由来する着色が確認された（図１、図２、図３及び図４参照）。また、蛍光顕微鏡による観察では、脾臓、腎臓、肺、肝臓でＧＦＰに由来する蛍光が確認された（図５及び図６参照）。

以上より、本発明の医薬組成物を投与することで、多臓器において遺伝子が発現され、遺伝子治療が行えることが確認された。

比較例（従来の非ウイルスベクターの遺伝子治療への応用）
実施例と同様にして、ベクターにポリエチレンイミン系の合成高分子（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ＥｘＧｅｎ５００）を使用してＬａｃＺ遺伝子複合体を調製し、０．２μｍフィルターで濾過を行ってからガラス製アンプル管へ充填して封管し、室温で１７日間保存した。実施例４の記載と同様に無菌試験、発熱性物質試験を行った結果、無菌状態、エンドトキシンフリーであることが確認された。しかしながら、ガラス管の底面に白色の沈殿物が確認され、遺伝子複合体が凝集していることが確認された。これを振盪攪拌して白色沈殿物を分散させてからマウス頚部静脈へ投与すると、投与した血管内で即時に血栓が発生し、血管梗塞を惹起した。血管梗塞によりマウスが死亡したため、臓器での遺伝子発現性は評価できなかったため、遺伝子発現性は以下のようにインビトロで確認した。フィブロネクチンをコーティングした２４ＷｅｌｌプレートへＣＯＳ−１細胞を播種し、培地を加えて２４時間培養した。播種密度は約６×１０⁴ＥＡ／Ｗｅｌｌであった。ここにポリエチレンイミン系の合成ベクターで調製した遺伝子複合体を添加し、追加培養３日目にＧＦＰ発現を測定したが、ＧＦＰ由来の蛍光はまったく観察されなかった。

頚静脈投与９２時間後に犠牲死させたマウスの脾臓の外観写真である。 頚静脈投与９２時間後に犠牲死させたマウスの腎臓の外観写真である。 頚静脈投与９２時間後に犠牲死させたマウスの肺の外観写真である。 頚静脈投与９２時間後に犠牲死させたマウスの肝臓の外観写真である。 頚静脈投与９２時間後に犠牲死させたマウスの腎臓の組織蛍光顕微鏡写真である。 頚静脈投与９２時間後に犠牲死させたマウスの肝臓の組織蛍光顕微鏡写真である。

Claims (13)

1. 分子中にカチオン性ブロック鎖及び非イオン性ブロック鎖を有する高分子化合物と核酸を水溶液中で混合することで得られる医薬組成物であって、前記高分子化合物が、多官能性化合物を核とし該核から複数の高分子鎖が結合していることを特徴とする医薬組成物。
2. 請求項１の医薬組成物をさらに凍結乾燥させたことを特徴とする医薬組成物。
3. 請求項１または２において、多官能性化合物が芳香族環を有するものである医薬組成物。
4. 請求項３において、芳香族環がベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレン、ビフェニル、ビフェニレン、フラン、ピリジン、チオフェン、ピロール、ピロリドン及びジフェニルエーテルからなる群から選択される１種又は２種以上である医薬組成物。
5. 請求項１ないし４のいずれか１項において、カチオン性ポリマー鎖が、アミノアルキルアクリルアミド、アミノアルキルメタ（ア）クリレート、アミノスチレン、モノアルキルアミノアルキルアクリルアミド、モノアルキルアミノアルキルメタ（ア）クリレート、モノアルキルアミノスチレン、ジアルキルアミノアルキルアクリルアミド、ジアルキルアミノアルキルメタ（ア）クリレート及びジアルキルアミノスチレンからなる群から選択される１種又は２種以上の重合体である医薬組成物。
6. 請求項１ないし５のいずれか１項において、非イオン性ポリマー鎖が、エチレングリコール、プロピレングリコール、ビニルピロリドン、酢酸ビニル鹸化物、グリシドール開環付加体、アクリルアミド、モノアルキルアクリルアミド、ジアルキルアクリルアミド、ヒドロキシアルキルメタ（ア）クリレート及びアルコキシアルキルメタ（ア）クリレートからなる群から選択される１種又は２種以上の重合体である医薬組成物。
7. 請求項１ないし６のいずれか１項において、カチオン性ポリマー鎖の分子量が５０００〜１００，０００で、非イオン性ポリマー鎖の分子量が５０００〜１００，０００であることを特徴とする医薬組成物。
8. 請求項１ないし７のいずれか１項において、核酸がＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子、ＦＧＦ遺伝子、ＥＧＦ遺伝子、ｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイ、ｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、リナマラーゼ遺伝子、ｐ５３癌抑制遺伝子、アポプチン遺伝子、ＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−１β遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−１２遺伝子、ｂｃｌ２遺伝子、ｇｐ−１００癌抗原ペプチド遺伝子、ＭＡＲＴ−１癌抗原ペプチド遺伝子、ＭＡＧＥ−１癌抗原ペプチド遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子、ボツリヌス毒素遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子及びルシフェラーゼ遺伝子からなる群から選択される１種又は２種以上である医薬組成物。
9. 請求項１ないし８のいずれか１項において、水溶液がｐＨ５．２〜ｐＨ８．５の範囲の緩衝溶液である医薬組成物。
10. 請求項９において、緩衝溶液が乳酸バッファー、リン酸バッファー、重炭酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、グッドバッファー、及びＨＥＰＥＳからなる群から選択される１種又は２種以上である医薬組成物。
11. 請求項１ないし１０のいずれか１項において、親水性溶液中での高分子化合物の終濃度が０．００１〜５０，０００μｇ／ｍＬであり、核酸の終濃度が０．００１〜５０，０００μｇ／ｍＬであることを特徴とする医薬組成物。
12. 請求項１ないし１１のいずれか１項の医薬組成物を生体内へ投与する遺伝子治療方法。
13. 請求項１２において、生体内投与が経口、血管内、筋肉、皮下、腹腔、脈管内、粘膜、骨髄、歯髄、肺胞、鼻腔、口腔又は表皮へ投与するものである遺伝子治療方法。

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