JP2004509838A - 樹状細胞の活性化誘導のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
ウイルス、RNA、DNA、プラスミドDNAもしくはこれらの誘導体のようなポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのアルキルエーテルのブロックコポリマーを含む組成物は、樹状細胞の活性化を誘導する。本発明はさらに、該ブロックコポリマーがプルロニックF127およびL61である、樹状細胞の活性化誘導のための組成物にも関する。より詳細には、該組成物はブロックコポリマープルロニックF127/プルロニックL61を含む。本発明はさらに、本発明の組成物を投与することを含む、動物における樹状細胞の活性化の誘導方法にも関する。加えて本発明は、本発明の組成物を投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法にも関する。
Description
【0001】
発明の分野
本発明は、ウイルス、RNA、DNAもしくはこれらの誘導体のようなポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのアルキルエーテルのブロックコポリマーを含む組成物および、該組成物を投与することによる樹状細胞の活性化方法に関する。
【0002】
発明の背景
ワクチン投与は、感染症による死あるいは障害を予防するのに有効な方法である。感染症分野におけるこの方法の成功によって、腫瘍性疾患の治療あるいは予防におけるワクチン投与の利用に対する関心もまた刺激されている。しかしながら、これらの成功はワクチンの利用によって達成されたにもかかわらず、ワクチン開発の分野においてはいまだ多くの問題がある。非経口投与経路、必要とされる種々のワクチン投与の数、および追加免疫の必要性とその頻度、これらが全て努力あるいは疾患の撲滅の障害となっている。
【0003】
このような問題の一つは免疫抗原性の欠如である。すなわち抗原が、病原体に対する効果的な免疫応答を促進することができないのである。加えて、ある種の抗原は、特定のタイプの免疫応答、例えば、細胞が仲介するあるいは体液性の応答しか誘発しない。アジュバントは、免疫応答を高め、促進し、増強する物質であり、そしてある場合には、一種の免疫応答を別の応答よりも促進させるのに用いられうる。多くのワクチンアジュバントが知られているが、アルミニウム塩が、安全性の心配なくヒトに広く使用されている唯一のアジュバントである。
【0004】
今では、免疫系が悪性細胞や感染性因子を認識し、ある場合には破壊することができるという確証がある。さらに、T細胞、特にCD8+の細胞障害性Tリンパ球(CTLs)が、抗腫瘍および抗感染症免疫の主要な作用因子であるらしい。T細胞の活性化は、樹状細胞によるものであることが知られている。樹状細胞(DC)は、免疫学的に未熟なT細胞に対する強い活性化能により、抗原提示細胞(APC)の中でも独特である(Steinman, 1991)。DCは、応答しているT細胞との生体相互作用を媒介し、T細胞に活性化シグナルを伝達する種々の分子を恒常的、あるいは成熟後に発現している。これらはクラスIおよびクラスIIMHC分子を含む。CDSO(B7−1)およびCD86(B7−2);CD40;CD11a/CD18(LFA−1);およびCD54(ICAM−1)(Steinman, 1991; Steinman et al. 1995)。抗原を提示し、CD4+およびCD8+の未熟および記憶T細胞を活性化するという樹状細胞の独特な能力によれば、これらのT細胞を用いて特定の抗腫瘍免疫を引き起こせる可能性が提供される。したがって、樹状細胞を選択的に誘導し、免疫応答を刺激する能力を増強させることができる物質は大いに重要である。多くの研究によって、動物モデルにおいては、樹状細胞に基づいたワクチンの腫瘍免疫療法に対する高い有効性が証明され、ヒトの腫瘍に対しても、臨床試験において実施されているものもある。ヒトの腫瘍は、細胞障害性リンパ球(CTL)によって認識されうる多くのタンパク質抗原を発現しており、これにより癌の免疫療法の潜在的な標的が提供されている。
【0005】
樹状細胞(DCs)は、T細胞に対して抗原を提示する能力が特に高い、稀な白血球であり、この特性により、近年、治療用癌ワクチンへの適用が促進されつつある。マクロファージやB細胞のような他の細胞もまた、抗原を提示できることが知られている。しかしながら、マクロファージは可溶性抗原を効率よく取り込めず、一方、未熟な樹状細胞は、マクロピノサイトーシスにより細胞外液から大量の抗原を取り込むことができる。
【0006】
これに対し、B細胞は、細胞表面の免疫グロブリンを通じて、特定の可溶性分子に結合するのに特に適している。B細胞は、自身の免疫グロブリン受容体に結合した可溶性抗原を吸収し、そしてこれら抗原のペプチド断片をペプチド:MHCクラスII複合体として提示する。B細胞の問題は、同時刺激活性を恒常的に発現しているわけではないということである。B細胞は可溶性タンパク質を効率よく提示するけれども、同時刺激活性がないと強力なCTL応答を開始しないと考えられる。結果として、その抗原は未熟なT細胞を活性化できないだけでなく、それらのT細胞をアネルギー性、つまり非応答性にしてしまう。
【0007】
生体外で腫瘍抗原と混合され、細胞ワクチンとして投与される単離DCは、実験動物において保護的および治療的な抗腫瘍免疫を誘導しているということが知られている。非ホジキン性白血病および黒色腫の患者に対するDCワクチン投与の予備臨床試験において、抗腫瘍免疫応答の誘導および腫瘍の退縮が観察された。Timmerman et al., Annal, Rev Med 1999, 50:507−29; Tarte et al., Leukemia, 13:653−663 (1999)。種々のヒト癌に対するDCワクチン投与の更なる試験が進行中であり、生体内におけるDCの腫瘍抗原への指向化方法もまた模索されている。DCの抗原提示能の利用により、有効な癌の免疫療法の開発の新たな可能性が提供されている。したがって、DCは細胞ワクチンとして利用可能であるが、DNAワクチンと組み合わせることにより、免疫調節因子としてもまた用いられうる。DNAワクチン投与後に、DCはワクチンによりコードされる抗原を効率よく提示する。Casares et al., J. Exp. Med., 186(9):1481−6 (1997)。プラスミドDNAは、DCの成熟およびリンパ組織への移行を促進するアジュバント作用を有している。しかしながら、プラスミドDNAの直接注入では、たいていごく少数のDCしかトランスフェクトされず、ごく少数のDCしか注入部位へ移行しない。Lane et al., Immunology, 11:308−313 (1999)。直接トランスフェクトされたDCによる抗原の発現は2週間で検出されなくなる。しかし、CD4+T細胞の記憶の維持における、持続性抗原の役割は疑わしいものの、記憶CD4+T細胞の応答は40週以上維持される。細菌性DNA(CpGモチーフ)は、ランゲルハンス細胞および、骨髄由来の未熟なDCの成熟を誘導する。細菌由来のリポ多糖(LPS)は、DCの活性化剤として長い間知られている。Th1型応答が起こると、炎症性T細胞は、マクロファージを活性化するために感染部位に集合するだけでなく、ケモカインを分泌することによって好中球を感染部位へと誘引する。
【0008】
プラスミドDNAワクチンを裸のDNAとともに投与した際、GM−CSFアジュバントおよび糖タンパク質D抗原を一緒にデリバリーすることによって、免疫応答が増強される。Flo et al., Vaccine, 18(28): 3242−53 (2000)。ポリ(α−4−アミノブチルグリコール酸)複合体とともに、サイトカインをコードするプラスミドDNAを用いることにより、サイトカイン(インターロイキン−12)を発現させるために遺伝子のデリバリーが利用されている。Maheshwari et al., Mol. Ther., 2(2): 121−130. (2000)。腫瘍のサプレッサー(抗原)p53およびインターロイキン−12(さらにはTNF−αおよびIFNγ)は、サイトカイン応答を開始し、腫瘍の成長を阻害するために、“LPD”と名づけられた遺伝子デリバリーシステムにおける遺伝子のデリバリーによって投与される。Whitmore et al., Gene Ther., 6(11) 1867−75 (1999)。ヒトFLT−3リガンドをコードするプラスミドを静脈内注射することで、機能性およびナチュラルキラー細胞(NK)の数を増加させる。He et al., Hum. Gene Ther., 11(4): 547−54 (2000)。レトロウイルス媒介遺伝子療法の際、多くの研究者が遺伝子発現を増強させるためにFLT−3を用いている。Murray et al., Hum. Gene Ther., 10(11): 1743−52 (1999) and Goerner et al., Blood, 94(7): 2287−92 (1999)。レトロウイルス媒介遺伝子ワクチン療法の際に、樹状細胞の発達を誘導し、遺伝子発現を増強させるために、FLT−3、さらにはGM−CSFが用いられている。Mach et al., Cancer Res., 60(12): 3239−46 (2000)。CD4OおよびFLT−3リガンドは、レトロウイルス媒介遺伝子ワクチン療法の際に、樹状細胞を誘導し、遺伝子発現を増強する。Borges et al., J. Immunol. 163(3) 1289−97 (1999)。
【0009】
本発明は、プラスミドDNA、DNA、RNA、ウイルスもしくはベクターのようなポリヌクレオチドおよび、上記DNA、特にプラスミドDNAによってコードされる遺伝子産物の発現に応答して、DCの高レベルの産生および浸潤を誘導する、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む組成物に関する。このことによって、コードされた外来抗原(導入遺伝子)に対する、より高い免疫応答が得られ、よりよい体液性および細胞性免疫応答が達成される。本発明の組成物は、in vitroおよびin vivoの両方において、大量の樹状細胞を産生させることにもまた用いることができる。従来のDCの産生、刺激および成熟方法は、極めて困難で時間がかかるが、一方、本発明はその過程を著しく容易にした。
【0010】
筋肉内あるいは皮内への、裸のプラスミドDNAの直接注入では、DNAワクチンによってコードされる抗原に対する、強力な、長期にわたる免疫応答が誘導される。両経路の免疫処置によって、特定の抗体が産生され、MHCクラスIにより制御される抗原特異的CTLおよび、Th1型サイトカインを分泌するMHCクラスIIにより制御されるTh細胞の両方が活性化される。(Genetic vaccines, Scientific Amer., July 1999, pp. 50−57)。プラスミドDNAワクチンはこれらの特性から、タンパク質、生弱毒化ウイルスもしくは死滅全生物体を用いる公知の免疫処置の魅力的な代替手段となっている。結果として、DNAワクチンは、感染症、アレルギーおよび癌など多様な分野における治療法もしくは予防手段として活発に研究がなされている。この免疫処置方法に対する熱烈な関心にもかかわらず、DNAワクチンはタンパク質を発現する能力が限られている。有効な免疫処置は遺伝子発現に依存しており、このことは、DNAワクチンがタンパク質を発現しなければならないことを意味する。
【0011】
平滑筋、骨格筋および心筋の特性により、筋肉内投与に有効なポリヌクレオチド組成物の開発およびその投与に対して多くの問題が提起されている。等張生理食塩水中の精製プラスミド(“裸のDNA”)の筋肉への直接注入により、様々な種の平滑筋、骨格筋および心筋において、DNAの取り込みおよび遺伝子の発現が起こることが発見された。Rolland A., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Begell House, 143 (1998)。筋組織の独特な細胞構造特性が、ポリヌクレオチドを取り込む原因となっていると信じられている。なぜなら、骨格筋および心筋細胞は、ほかのタイプの組織よりも、注入された外来DNAベクターを取り込み、発現させるのにより適していると思われるためである。Dowty & Wolff, Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer, Birkhauser, Boston, p.182 (1994)。しかしながら、この方法により得られる比較的低い発現レベルにより、その用途が制限されている。Aihara and Miyazaki, Nature Biotechnology, 16:867 (1998)を参照。さらに、ほかの組織における遺伝子発現を増強させるために一般に提唱されている、ポリカチオン、カチオン性リポソームおよび脂質のような伝統的な遺伝子デリバリーシステムでは、たいてい、骨格筋および心筋において遺伝子の発現が阻害されてしまう。Dowty & Wolff, loc. cit., p. 82 (1994)。
【0012】
たとえ筋肉が、ウイルスベクター非存在下でプラスミドDNAを効果的に取り込み発現する唯一の組織であると知られているとしても、筋肉が抗原提示部位であると考えられてはいない。なぜなら筋肉は樹状細胞、マクロファージおよびリンパ球を、たとえあったとしてもほとんど有していないからである。皮膚および粘膜は、ほとんどの外来抗原が普通に出会う解剖学上の部位である。皮膚に関連したリンパ組織は、免疫応答を高める分化細胞を含有している。Raz et al., PNAS, 91: 9519−9523 (1994)。
【0013】
硫酸デキストリンやサケDNAのようなアニオン性ポリマーは、筋肉において遺伝子の発現を減少させることができる。Rolland A., Loc. cit.。種々の非縮合性相互作用ポリマーが使用され、横紋筋における遺伝子発現を修飾することに部分的には成功している。ポリ(ビニルピロリドン)ポリ(ビニルアルコール)のような非イオン性ポリマーは、水素結合を通して、プラスミドと相互作用する。Id.。これらのポリマーは、筋細胞においてポリヌクレオチドの取り込みを容易にし、10倍もの遺伝子発現の上昇を引き起こす。しかしながら、遺伝子発現の著しい増加を達成するためには、高濃度のポリマー(約5%かそれ以上)を投与する必要がある。Mumper et al., Pharmacol. Res., 13, 701−709 (1996); March et al., Human Gene Therapy, 6(1), 41−53 (1995)。遺伝子発現を改善するために必要とされるこの高濃度のポリ(ビニルピロリドン)ポリ(ビニルアルコール)は、筋組織における毒性、炎症および他の副作用に関連している可能性がある。筋肉において遺伝子発現を改善するため、あるいは、その後の治療用途のために筋肉の生理機能を修飾するために、ブロックコポリマーが用いられている。米国特許第5,552,309号;第5,470,568号;第5,605,687号;および第5,824,322号を参照。例えば、脈管系において遺伝子の導入をおこなうために用いられるウイルス粒子を調剤する目的で、ブロックコポリマーをゲル様の形状(1%を超えるブロックコポリマー)で使用することができる。同様の範囲のブロックコポリマー濃度(1〜10%)で、ブロックコポリマーを用いて、損傷を受けた筋組織(放射線および電気的損傷、および凍傷)の透過性を修飾することができる。さらに、ブロックコポリマーを用いて膜を易透過化した後、DNA分子を細胞に組み込むことができる。これらの適用では、ブロックコポリマーは、ゲル様構造および粘性デリバリーシステムを提供できるような濃度で使用されていた。しかしながら、これらのシステムでは筋肉に注入されたDNAは拡散できるようにならず、したがって筋原繊維へのDNAの注入は制限されていた。
【0014】
こうして、患者、特に筋肉や皮膚へ投与した際の、ポリヌクレオチドの発現効率を増加させる組成物および方法が必要とされている。また、ポリヌクレオチドの細胞へのデリバリー効率を増加させる方法も必要とされている。
【0015】
筋肉及び皮膚においては遺伝子の発現を改善させる必要があるのに対し、遺伝的障害がある、および/または遺伝子の異常な過発現がある、および/または正常な遺伝子が欠如している状況では体内の他の組織は遺伝子の移入により恩恵を被る。
【0016】
RNA、DNA、ウイルスおよびリボザイムのような種々のポリヌクレオチドは、遺伝子治療の目的で用いることができる。しかしながら、遺伝子治療の成功は、下記のような多くの問題と出くわしている。
【0017】
遺伝的疾患、細胞変異(変異を生じさせるまたは増加させる癌を含む)およびウイルス感染を治療するためのアンチセンスポリヌクレオチドの利用が広く注目を集めている。この治療手段は、一面では、治療すべき病変部位の発生に関与していると考えられているタンパク質をコードしているmRNAの“センス”鎖に結合し、その結果、mRNAが不要なタンパク質へ翻訳されるのを停止あるいは阻害することによって機能すると考えられている。また別の一面では、例えば転写を阻害するために、ゲノムDNAがアンチセンスポリヌクレオチド結合(三重らせんを形成)の標的とされる。Helene, Anti−Cancer Drug Design, 6:569 (1991)。ひとたび結合すべきmRNAの配列がわかれば、ワトソン−クリック塩基結合則によってセンス鎖に結合し、DNA二重らせんに類似した二量体構造を形成するようなアンチセンス分子をデザインすることができる。Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA, Erikson and lxzant, eds., Raven Press, New York, 1991; Helene, Anti−Cancer Drug Design, 6:569 (1991); Crooke, Anti−Cancer Drug Design, 6:609 (1991)。この技術を十分に利用することに対する深刻な障壁としては、標的のmRNAの翻訳もしくはDNAの機能を効率よく妨げるために、十分な数のアンチセンス分子を細胞に効率よく導入するという問題がある。
【0018】
発明の要約
本発明は、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのアルキルエーテルのブロックコポリマーを含む、樹状細胞の活性化誘導のための組成物に関する。さらに、本発明は、ウイルス、RNA、DNA、プラスミドDNAまたはこれらの誘導体のようなポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを投与、特に筋肉内および皮内投与することを含む、樹状細胞の活性化のための方法に関する。特定の実施形態において、該ブロックコポリマーは、ゲル形成には不十分な量で存在する。本発明はまた、ブロックコポリマーが約15%(wt/vol)未満の濃度で存在する、少なくとも一つのポリヌクレオチドもしくはその誘導体および、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む使用方法および組成物にも関する。さらに特定の実施形態においては、該組成物はさらにポリカチオンを含む。該組成物はまたブロックコポリマーの混合物をも含む。本発明はまた、該組成物が、以下に制限されないが、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体、または他のタイプの分子凝集体などの、分子溶液またはコロイド分散を形成する組成物にも関する。これらの組成物は、該組成物中に存在するポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現に応答して、DCの産生および浸潤レベルを上昇させるのに有用である。該組成物はまた、免疫応答を増強し、大量の樹状細胞をin vitroおよびin vivoにおいて産生させるのにも有用である。本発明はさらに、上記組成物を細胞に投与することを含む、ポリヌクレオチドの細胞へのデリバリー方法にも関する。
【0019】
本発明は一部分、多くの予想外の驚くべき発見に基づいている。一つは、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む組成物に細胞を前もって暴露しておくことで、in vitroにおける樹状細胞の浸潤および活性化が著しく増強されるということである。もう一つは、ポリヌクレオチド分子(例えばプラスミドDNAおよびウイルス)を単独もしくは組み合わせたブロックコポリマーと配合すると、免疫が増強されるということである。また一つは、ブロックコポリマー、“ポロキサマー”とも呼ばれるが、が用いられると、免疫応答を得るために必要とされるポリヌクレオチド分子がより少なくなり、応答を生じさせるための時間が短縮され、追加注入の必要がなくなるということである。結果として、より少ないポリヌクレオチド分子を使用することによって、ポリヌクレオチドが宿主生物の染色体に組み込まれる可能性が減少するであろう。さらに、より少ないポリヌクレオチド分子を使用することによって、全身性エリテマトーデスのような、しかしこれに限定されない疾患に関連している抗ポリヌクレオチド(もしくは抗DNA)抗体が発現する可能性が減少するであろう。
【0020】
発明の詳細な説明
定義
ここで用いられているように、下記の語句は以下の意味を有する:
主鎖: グラフトコポリマー命名の際に用いられ、その上にグラフトが形成される鎖を表す。
ブロックコポリマー: 構造的もしくは配座的に異なる性質の二以上の鎖の組み合わせ。
分枝状ポリマー: お互いに連結された二以上の鎖の組み合わせであり、少なくとも一つの鎖の末端が、別の鎖のある点に結合している。
鎖: モノマー単位の共有結合により形成されるポリマー分子。
立体配置: ポリマー鎖に沿った原子構成であり、主化学結合を破壊し、再構成することによってのみ、相互転換可能である。
配座: 単結合の回転によって生じる、ポリマー鎖の原子および置換基の配置。
コポリマー: 2種以上のモノマーからなるポリマー。
架橋: 2以上の鎖にともに結合している構造。
デンドリマー: 分枝が一つ以上の中心から開始する、規則正しい分枝状ポリマー。
分散: 分散媒中に分布している微粒子状物質。
グラフトコポリマー: 構造的もしくは配座的に異なる性質の2つ以上の鎖の組み合わせであり、一つの鎖が主鎖をなし、少なくとも一つの鎖が主鎖に沿った幾つかの点で結合し、側鎖を形成している。
ホモポリマー: 一種のモノマーからなるポリマー。
連結: 二つの原子間の共有化学結合であり、二つのモノマー単位間もしくは二つのポリマー鎖間の結合を含む。
ポリマーブレンド: 構造的もしくは配座的に異なる性質の2つ以上のポリマー鎖の均質な組み合わせであり、お互いに結合はしていない。
ポリマーフラグメント(もしくはポリマーセグメント): モノマー単位が、隣接部分が有していない構造的もしくは配座的な性質を少なくとも一つ有している、ポリマー分子の一部分。
ポリヌクレオチド: 天然もしくは人工の核酸配列。
反復単位: ポリマー鎖に連結するモノマー単位。
側鎖: グラフトコポリマーにおける、グラフト鎖。
スターブロックコポリマー: 中心部分の一端で一緒に連結する、構造的もしくは配座的に異なる性質を有する三以上の鎖。
スターポリマー: 中心部分の一端で一緒に連結する、三以上の鎖。
サーファクタント: 界面で吸着している界面活性物質。
ウイルスベクター: ウイルス由来の、遺伝子移入に用いられる構築物。
【0021】
組成物
本発明は、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む、樹状細胞の活性化のための組成物ならびに少なくとも一つのポリヌクレオチドまたはその誘導体および少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物に関する。本発明はまた、該組成物を投与することによって、樹状細胞の活性化を誘導するおよび動物の免疫応答を増強する方法にも関する。
【0022】
好ましい実施形態には、ポリヌクレオチドおよびカチオン性セグメントを有するブロックコポリマーを含む組成物ならびにポリヌクレオチドおよび非イオン性ポリエーテルブロックコポリマーを含む組成物とが含まれる。特に筋肉内および皮内投与に有用な一つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)のブロックコポリマーと配合される。本発明の好ましい組成物は、さらにポリカチオンを含む。
【0023】
本発明の組成物は、ポリヌクレオチドの細胞への導入、ポリヌクレオチドの体液中における分解からの保護、生体膜および生物学的関門(例えば血液脳関門、血管脳脊髄液関門、および腸関門)を通過するポリヌクレオチドの輸送、ポリヌクレオチドの体内における生体内分布の改変ならびにヒトまたは動物の体内の様々な組織および臓器における選択的な遺伝子発現を含む遺伝子発現の増強、に効率のよい媒体を提供する。
【0024】
本発明はさらに、本発明の組成物を利用してポリヌクレオチドを細胞に挿入またはデリバリーする方法、および、ヒトおよび動物にこれらの組成物を投与することを含む治療方法に関する。
【0025】
好ましい実施形態において、ブロックコポリマーは、以下の式:
【0026】
【化7】
【0027】
式中、AおよびA’はA型直鎖状ポリマーセグメントであり、BおよびB’はB型直鎖状ポリマーセグメントであり、R1,R2,R3およびR4はそれぞれ式(I)、(II)もしくは(III)のブロックコポリマーまたは水素原子であり、Lは連結基であり、ただしR1、R2、R3またはR4のうち水素原子は2つ以下である、
の一つに従っている。
【0028】
他の実施形態において、ブロックコポリマーはポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)鎖セグメントである。さらに他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド組成物は、カチオン性反復単位を複数有するポリカチオン性ポリマーを含有する。この場合、該ポリヌクレオチドはポリカチオンと複合体化され、複合体中で安定化されてもよい。これらの組成物は、細胞膜を通過する透過性の増加を示し、細胞に核酸をデリバリーするための媒体としての使用によく適している。
【0029】
他の実施形態において、本発明は:
(a)ポリヌクレオチドまたはその誘導体;
(b)ポリエーテルセグメントおよびポリカチオンセグメントを有し、該ポリエーテルセグメントは少なくともA型ブロックを含み、該ポリカチオンセグメントはカチオン性反復単位を複数有するブロックコポリマー
を有するポリヌクレオチド組成物に関する。
【0030】
第二の好ましい実施形態において、コポリマーは、式:
【0031】
【化8】
【0032】
で示されるポリマーに関し、式中、A、A’およびBは上記と同様であり、RおよびR’はカチオン性反復単位を複数含むポリマーセグメントであり、セグメント中の各カチオン性反復単位は該セグメント中の他の単位と同一または異なっている。この実施形態のポリマーは、“ポリ非イオン性/ポリカチオン性”ポリマーと称してもよい。好ましいポリ非イオン性/ポリカチオン性ポリマーは、非イオン性ポリマーセグメントに共有結合しているポリカチオンを含み、該非イオン性ポリマーセグメントは、アクリルアミド、グリセロール、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、ビニルピリジン、ビニルピリジンN−オキサイド、オキサゾリンもしくはアクロイルモルフォリン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一つのモノマーのホモポリマーもしくはコポリマーである。これは例えば、ポリアクリルアミド、ポリグリセロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジンN−オキサイド、ビニルピリジンN−オキサイドとビニルピリジンのコポリマー、ポリオキサゾリン、ポリアクロイルモルフォリン、またはこれらの誘導体を含む。ビニルモノマーの重合産物を含む非イオン性セグメントもまた好ましい。RおよびR’ブロックは、「R型」ポリマーセグメントまたはブロックと称してもよい。この実施形態のポリヌクレオチド組成物は、細胞にポリヌクレオチドを導入するのに効率のよい媒体を提供する。
【0033】
したがって、本発明はさらに、本発明の組成物を利用してポリヌクレオチドを細胞に挿入する方法に関する。
【0034】
さらに他の実施形態において、本発明は、ポリエーテルはA型ポリエーテルセグメントを含む、ポリヌクレオチドセグメントを含むポリヌクレオチド誘導体およびポリヌクレオチドの5’末端および3’末端のうち一つまたは両方に付着したポリエーテルセグメントを含むポリヌクレオチド組成物に関する。
【0035】
第三の好ましい実施形態において、誘導体は、式:
【0036】
【表1】
【0037】
を有するブロックコポリマーを含み:式中、pNは、5’から3’への方向を有するポリヌクレオチドを表し、ならびにA、A’およびBは上記のポリエーテルセグメントである。他の第三の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド複合体はポリカチオン性ポリマーを含む。式(IX)〜(XIII)のポリヌクレオチド成分(pN)は、好ましくは約5〜約1,000,000塩基、より好ましくは約5〜約100,000塩基、さらにより好ましくは約10〜約10,000塩基を有する。
【0038】
ポリヌクレオチド組成物は、ポリヌクレオチドを細胞に導入するのに効率のよい媒体を提供する。したがって、本発明はまた、本発明の組成物を用いてポリヌクレオチドを細胞に挿入する方法に関する。他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドはポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)のブロックコポリマーに共有結合している。
【0039】
本発明の他の実施形態は、ポリマー、ポリエーテルセグメント、および式−NH−R0を有するカチオン性反復単位を複数含むポリカチオン性セグメントを含むポリエーテルポリカチオンコポリマーに関し、ここでR0は炭素原子数2〜6の、置換されていてもよい直鎖脂肪族基であり、該ポリエーテルセグメントは少なくとも一つのB型セグメントのA型を含む。他の好ましい実施形態において、ポリカチオンポリマーは、以下の式:
【0040】
【化9】
【0041】
で示されるポリマーを含む。式中、A、A’およびBは上記と同様であり、RおよびR’は、式−NH−R0−を有するカチオン性反復単位を複数含むポリマーセグメントであり、ここでR0は炭素原子数2〜6の、置換されていてもよい直鎖脂肪族基である。R型セグメント中の各−NH−R0−反復単位は、該セグメント中の他の−NH−R0−反復単位と同一または異なっていてもよい。
【0042】
さらに他の実施形態において、本発明は、式:
【0043】
【化10】
【0044】
を有する反復単位を複数含むポリカチオン性ポリマーを提供する。
【0045】
式中、R8は:
(1)−(CH2)n−CH(R13)−であり、ここでnは0〜約5の整数であり、R13は水素、炭素原子3〜8のシクロアルキル、炭素原子1〜6のアルキル、または、(CH2)mR14であり、ここでmは0〜約12の整数であり、R14は炭素原子6〜20の親油性の置換基である;
(2)環の炭素原子が3〜8の炭素環式化合物基であり、ここで該基は例えばシクロアルキルまたは芳香族基であり、これらは、炭素原子1〜6のアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子1〜6のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロ、またはクロロ置換基を含んでいてもよい;または(3)環の原子が3〜8の複素環式化合物基であり、これとしては酸素原子、窒素原子、硫黄原子およびこれらの混合物からなる群より選択されるヘテロ原子1〜4を含むヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基が挙げられ、これらは、さらに炭素原子1〜6のアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子1〜6のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロまたはクロロ置換基を含んでいてもよい、である。
【0046】
R9は炭素原子1〜12の直鎖脂肪族基であり、R10、R11、およびR12は独立して水素、炭素原子1〜4のアルキル基である。R9は好ましくは炭素原子2〜10,より好ましくは炭素原子3〜8である。R14は好ましくは、挿入基(intercalating group)を含み,これは好ましくはアクリジンまたはエチジウムブロミド基である。該ポリマー中の反復単位数は、好ましくは約3〜50、より好ましくは約5〜20の範囲である。このポリマーの構造は、R型セグメントまたはポリカチオン性ポリマーとして、本発明の他の実施形態に組み込むこともできる。このポリマーの末端は脂質の置換基でさらに改変されていてもよい。
【0047】
この実施形態のポリマーを合成するために用いるモノマーは、下記のような、DNAシンセサイザーへ供給されるモノマーとして用いるのに適している。したがって、ポリマーは非常に特異的に合成されうる。加えて、ポリヌクレオチド配列、ポリエーテルブロックおよび親油性置換基をさらに組み込むことは、ポリヌクレオチド合成のために開発された最先端の自動化装置を用いてなされうる。この実施形態はまた、ポリカチオン性ポリマーの合成方法も含んでいる。
【0048】
さらに他の実施形態において、本発明は、共有結合したポリマーセグメントを複数含むポリマーに関し、ここで該セグメントは、以下の(a)および(b)を有する:
(a)少なくとも一つのポリカチオンセグメント、ここで該セグメントは、少なくとも三つのアミノアルキレンモノマーを含むカチオン性ホモポリマー、コポリマーまたはブロックコポリマーであり、該モノマーは以下の(i)および(ii)からなる群より選択される;
(i)式:
【0049】
【化11】
【0050】
を有する少なくとも一つの第3級アミノモノマー、および該第3級アミノモノマーの第4級塩、ならびに
(ii)式:
【0051】
【化12】
【0052】
で示される少なくとも一つの第2級アミノモノマー、および該第2級アミノモノマーの酸付加第4級塩であり、式中、
R1は水素、炭素原子2〜8のアルキル、AモノマーまたはBモノマーであり、R2およびR3は、それぞれ互いに独立して、下記式を有する同一もしくは異なる直鎖もしくは分岐状鎖のアルカンジイル基であり:
【0053】
【化13】
【0054】
式中、zは2〜8の値であり;R4は対になるように結合しているように描かれた炭素原子の一つの結合を満たす水素原子であり;R5は水素原子、炭素原子2〜8のアルキル、Aモノマー、またはBモノマーであり;R6は水素、炭素原子2〜8のアルキル、Aモノマー、またはBモノマーであり;R7は下記式を有する直鎖または分岐状鎖のアルカンジイル基であり:
【0055】
【化14】
【0056】
式中、zは2〜8の値であり;R8は水素、炭素原子2〜8のアルキル、Aモノマー、またはBモノマーである;ならびに
(b)少なくとも一つの、約5〜約400のモノマー単位を含む直鎖または分岐状鎖のポリエーテルセグメント、これは
(i)第1のアルキレンオキシモノマー−OCnH2n−のホモポリマー、または
(ii)該第一アルキレンオキシモノマーおよび、異なる第二のアルキレンオキシモノマー−OCmH2m−とのコポリマーもしくはブロックコポリマー
であり、式中、nは2または3の値であり、mは2〜4の値である。
【0057】
式(I)、(II)、(III)または(IV)で示されるポリマーはまた、細胞の内部にポリヌクレオチドをデリバリーするのに効率のよい媒体を提供するために、互いに混合されてもよく、または、式(V−aまたはb)、(VI−aまたはb)、(VII−aまたはb)および(VIII−aまたはb)で示される一以上のポリマー、および/または、式(IX−a,b,cまたはd)、(X−a,b,c,d,eまたはf)、(XI)、(XII)または(XIII)で示されるポリヌクレオチド誘導体と追加してもしくは代わりに混合されることもできる。
【0058】
式(I)〜(XIII)の親水性(A型)ブロックまたは疎水性(B型)ブロックの重合度は、好ましくは約5〜約400であり得る。該重合度はより好ましくは約5〜約200、さらにより好ましくは約5〜約80であり得る。R型ポリカチオンブロックの重合度は、好ましくは約2〜約300であり得る。該重合度はより好ましくは約5〜約180であり、さらにより好ましくは約5〜約60であり得る。ポリカチオン性ポリマーの重合度は、好ましくは約10〜約10,000であり得る。該重合度はより好ましくは約10〜約1,000であり、さらにより好ましくは約10〜約100であり得る。
【0059】
A型、B型およびR型ブロックを含む反復単位は、一般的に、約30〜約500、好ましくは約30〜約100、より好ましくは約30〜約60の分子量を有するであろう。一般的には、A型またはB型ブロックのそれぞれにおいて、反復単位間の結合の少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95%がエーテル結合であろう。本願の目的のためには、エーテル結合はグリコシド結合(すなわち糖結合)を含む。しかしながら一面においては、単純なエーテル結合が好ましい。
【0060】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明の組成物は遺伝子治療の目的に有用であり、これらは、遺伝子置換または除去治療、および遺伝子付加治療、ワクチン投与、ならびに、体内またはin vitroでポリペプチドが発現またはダウンレギュレートされるべき任意の治療条件を含む。本発明の一つの観点において、ポリヌクレオチド組成物は、ヒトまたは動物の平滑筋、骨格筋および心筋を含むがこれらに限定されない筋組織における遺伝子治療に用いられる。筋肉内投与用の組成物は、ポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)のブロックコポリマーを含むことが好ましい。
【0061】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明は、オキシエチレン含有量が50%以下の、少なくとも一つのポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)のブロックコポリマー、およびオキシエチレン含有量が50%以上の、少なくとも一つのポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)のブロックコポリマー、およびポリヌクレオチドを含む組成物に関する。オキシエチレン含有量が50%以下のブロックコポリマーの、オキシエチレン含有量が50%以上のブロックコポリマーに対する質量比は、好ましくは1:2、より好ましくは1:5である。
【0062】
本発明の組成物はゲルを形成しないことが好ましい。該組成物は分子溶液またはコロイド分散を形成することが好ましい。サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体または他のタイプの分子凝集体を含むコロイド分散が特に好ましい。一つの観点において、ポリヌクレオチド組成物におけるポリマーおよびブロックコポリマーの濃度は、10%未満、好ましくは1%未満、より好ましくは0.5%未満、さらにより好ましくは0.1%未満である。
【0063】
ブロックコポリマーは、最も簡単には少なくとも二つの異なるポリマーセグメントの結合体(conjugates)として定義される(Tirrel, M., Interactions of Surfactants with Polymers and Proteins, Goddard E.D. and Ananthapadmanabhan, K.P. (eds.), CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, pp. 59−122, (1992))。最も簡単なブロックコポリマーの構造は、二つのセグメントがそれらの末端で結合したものを含み、A−B型ジブロックを形成する。二つ超のセグメントがそれらの末端で連続して結合することにより、A−B−A型トリブロック、A−B−A−B型マルチブロックを得ることができ、さらにはマルチセグメントA−B−C構造も得られる。ブロックコポリマーにおいて、一種または数種の反復単位が異なるポリマーセグメントに結合すると主鎖が定義されうる場合、コポリマーは例えばA(B)n型のグラフト構造を有する。より複雑な構造は、単一の中心に2つ超のポリマーセグメントが連結してなる(AB)nまたはAnBmスターブロックを含む。本発明の式XVIII〜XXIIIは、ジブロックおよびトリブロックである。同時に、式XVIIのポリエーテル末端へのポリカチオンセグメントの結合により、スターブロック(例えば、(ABC)4型)が得られる。加えて、実施例13〜15(下記)のポリスペルミンは分岐状である。ポリ(エチレンオキサイド)を有するこのようなポリカチオンの改変により、グラフト化ブロックコポリマーおよびスターブロックの混合物を得ることができる。本発明によれば、これらの構造すべてはポリヌクレオチドのデリバリーに有用である。
【0064】
米国特許第5,783,178号の全開示が、ここに参照することにより引用される。
【0065】
他の観点において、本発明は、ポリヌクレオチドおよびポリエーテルブロックコポリマーのポリヌクレオチド複合体を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチド複合体はさらにポリカチオン性ポリマーを含む。組成物はさらに、適切な標的分子およびサーファクタントを含む。他の観点において、本発明は、ポリヌクレオチドならびにポリエーテルブロックおよびポリカチオンブロックを含むブロックコポリマーのポリヌクレオチド複合体を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、ポリエーテルポリマーセグメントを付着させるために5’または3’末端で共有結合的に改変されたポリヌクレオチドを提供する。
【0066】
ポリカチオン 好ましいポリカチオンポリマー、およびコポリマーのポリカチオンセグメントとは、ポリアミン(例えばスペルミン、ポリスペルミン、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミン、ポリペンチレンイミン、ポリヘキシレンイミンおよびそれらのコポリマー)、第3級アミンおよび第2級アミンのコポリマー、部分的なまたは完全な第4級アミン、ポリビニルピリジン、ならびに、これらポリカチオンセグメントの第4級アンモニウム塩を含むがこれらに限定されない。これら好ましいポリカチオンフラグメントはまた、脂肪族、ヘテロ環、または芳香族イオネン(ionenes)を含む。Rembaum et al., Polymer Letters, 6:159 (1968); Tsutsui, T., Development in Ionic Polymers−2, Wilson A.D. and Prosser, H.J. (Eds.) Applied Science Publishers, London, New York, vol. 2, pp. 167−187, (1986)。
【0067】
ポリカチオン性ポリマーおよびR型ブロックは、陽性にイオン化し得る数種の基および、生理学的なpHで正味の正電荷を有する。式(V)〜(VIII)のポリエーテル/ポリカチオンポリマーはまた、ポリカチオン性ポリマーとして機能し得る。好ましくは、ポリカチオンセグメントは生理学的なpHで少なくとも約3個、より好ましくは少なくとも約6個、さらにより好ましくは少なくとも約12個の正電荷を有する。生理学的なpHで、電荷間の距離が約2Å〜約10Åである正電荷を供与できるポリマーまたはセグメントもまた好ましい。エチレンイミン、アミノプロピレン、アミノブチレン、アミノペンチレンおよびアミノヘキシレンの反復単位、またはこれらの基の少なくとも二つの混合物によって確立される距離が最も好ましい。(NCH2CH2)、(NCH2CH2CH2)、(NCH2CH2CH2CH2)、(NCH2CH2CH2CH2CH2)および(NCH2CH2CH2CH2CH2CH2)の反復単位、またはこれらの混合物を利用したポリカチオン性セグメントが好ましい。
【0068】
本発明の好ましい組成物において、ポリカチオンポリマーおよびポリエーテル/ポリカチオンコポリマーは、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーと混合される。オリゴアミン、および、オリゴアミンのポリエーテルとの結合体は、オリゴアミンのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとの結合体を含み、本発明においてポリカチオン性分子として、特にポリオキシエチレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーとの混合物において用いられ得る。本発明において有用なオリゴアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、および他のDNA縮合剤を含むがこれらに限定されない。ジエチレントリアミンおよびペンタエチレンヘキサミンのようなエチレンイミンオリゴアミン、N−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパン−ジアミンおよびN,N’−ビス(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンのようなプロピレンイミンオリゴアミン、ブチレンイミンオリゴアミン、ペンチレンイミンオリゴアミン、ヘキシレンイミンオリゴアミン、ヘプチレンイミンオリゴアミン、およびその誘導体が、本発明において特に有用である。
【0069】
−N−R0−反復単位を有するポリカチオンセグメントもまた好ましい。R0は、好ましくはエチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレンまたはヘキシレン鎖であり、これらは改変されてもよい。好ましい実施形態において、反復単位の少なくとも一つにおいては、R0は、エチジウムブロミド基のようなDNA挿入基を含む。このような挿入基は、核酸に対するポリマーの親和性を増すことができる。R0上の好ましい置換基は、炭素原子1〜6のアルキル、ヒドロキシ、アルキルが炭素原子1〜6であるヒドロキシアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子2〜7のアルキルカルボニル基、アルコキシが炭素原子1〜6を有するアルコキシカルボニル、アルコキシおよびアルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するアルコキシカルボニルアルキル、各アルキル基がそれぞれ炭素原子1〜6を有するアルキルカルボキシアルキル、アルキル基が炭素原子1〜6を有するアミノアルキル、各アルキル基が独立して炭素原子1〜6を有するアルキルアミノまたはジアルキルアミノ、各アルキルが独立して炭素原子1〜6を有するモノ−またはジ−アルキルアミノアルキル、クロロ、またはアルキルが炭素原子1〜6を有するクロロアルキル、フルオロ、またはアルキルが炭素原子1〜6を有するフルオロアルキル、シアノ、またはアルキルが炭素原子1〜6であるシアノアルキル、または、カルボキシル基である。より好ましくは、R0はエチレン、プロピレンまたはブチレンである。
【0070】
本発明のコポリマー中のポリカチオンポリマーおよびポリカチオンセグメントは分岐状であってもよい。例えば、ポリスペルミンに基づくコポリマーは分岐状である。これらコポリマーのカチオン性セグメントは、1,4−ジブロモブタンおよびN−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンの縮合によって合成された。この反応により、第1級、第2級および第3級アミンを含む高度分岐状ポリマー産物が得られる。
【0071】
分岐状ポリカチオンの例としては、少なくとも2個の窒素原子を含むポリアミンおよび、少なくとも2個のハロゲン原子(臭素または塩素を含む)を含むハロゲン化アルキルの縮合反応の産物がある。特に、分岐状ポリカチオンは、重縮合の結果製造される。この反応の例としては、ポリスペルミンを製造する、N−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンおよび1,4−ジブロモブタンの反応がある。この型の分岐状ポリカチオンポリマーは、式:
【0072】
【化15】
【0073】
で示すことができる。
【0074】
分岐状ポリカチオンの他の例は、式:
【0075】
【化16】
【0076】
で示されるポリエチレンイミンである。
【0077】
加えて、カチオン性デンドリマー、例えばポリアミドアミンもまた、遺伝子移入用ブロックコポリマーのポリカチオンセグメントとして用いられ得る。Tomalia et al., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 29, 138(1990)。
【0078】
好ましい実施形態において、ポリカチオンは、非イオン性ポリマーセグメントに共有結合している。非イオン性ポリマーセグメントは、非毒性および非免疫原性の水溶性ポリマーを含むことが好ましい。このようなポリマーの好ましい一つの例は、ポリ(オキシエチレン)、ポリ(オキシプロピレン)、ポリ(オキシエチレン)/ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーおよびポリ(オキシエチレン)/ポリ(オキシプロピレン)ランダムコポリマーを含む、エチレンオキシモノマー(−OCH2CH2−)およびプロピレンオキシモノマー(−OCH(CH3)CH2−)のホモポリマーおよびコポリマーであるポリエーテルポリマーである。本発明において用いられる非イオン性ポリマーセグメントの別の好ましい例は、アクリルアミド、グリセロール、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、ビニルピリジン、ビニルピリジンN−オキサイド、オキサゾリンもしくはアクロイルモルフォリン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一つのモノマーのホモポリマーもしくはコポリマーである。これは例えば、ポリアクリルアミド、ポリグリセロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジンN−オキサイド、ビニルピリジンN−オキサイドおよびビニルピリジンのコポリマー、ポリオキサゾリン、ポリアクロイルモルフォリン、もしくはこれらの誘導体を含む。ビニルモノマーの重合産物を含む非イオン性セグメントもまた好ましく、下記の非イオン性セグメントおよびその誘導体も含むが、これに限定されない:
【0079】
【化17】
【0080】
式中、mは約3〜約10,000の値である。
【0081】
式(V)〜(VIII)で示される有用なポリマーの例は、以下の式:
【0082】
【化18】
【0083】
のポリ(オキシエチレン)−ポリ−L−リジン)ジブロックコポリマーを含む。式中、iは約5〜約100の整数であり、jは約4〜約100の整数である。
【0084】
第二の例は、以下の式:
【0085】
【化19】
【0086】
のポリ(オキシエチレン)−ポリ−(L−アラニン−L−リジン)ジブロックコポリマーである。式中、iは約5〜約100の整数であり、jは約4〜約100の整数である。
【0087】
第三の例は、以下の式:
【0088】
【化20】
【0089】
のポリ(オキシエチレン)−ポリ(プロピレンイミン/ブチレンイミン)ジブロックコポリマーである。式中、iは約5〜約200の整数であり、jは1〜約10の整数である。
【0090】
第四の例は、式:
【0091】
【化21】
【0092】
のポリ(オキシエチレン)−ポリ(N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド)(「pOE−pEVP−Br」)である。式中、iは約5〜約100の整数であり、jは約10〜約500の整数である。さらに他の例は、式:
【0093】
【化22】
【0094】
のポリマーである。式中、iは約10〜約200の整数であり、jは約1〜約8の整数であり、kは約10〜約200の整数である。さらに他の例は、式:
【0095】
【化23】
【0096】
のポリマーである。式中、「G」は−(NH(CH2)3)3−CH2NH2−を含み、iおよびjは式(XVIII)で定義されたとおりであり、mは約1〜約8の整数である。
【0097】
非イオン性ポリエーテルブロックコポリマーおよびポリエーテルセグメントは、式:
【0098】
【化24】
【0099】
を有するブロックコポリマーによって例示される。式中、x、y、z、iおよびjは約2〜約800、好ましくは約5〜約200、より好ましくは約5〜約80の値であり、R1、R2の対のそれぞれについては、一方が水素原子でありかつ他方がメチル基である。式(XXIV)〜(XXVI)は過剰に簡略化されており、実際にはBブロック内のイソプロピレンラジカルの配向はランダムであろう。このランダムな配向は、式(XXVII)および(XXVIII)で示されており、これらはより完全である。このようなポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーは、Santon, Am. Perfumer Cosmet., 72(4):54−58 (1958); Schmolka, Loc. cit. 82(7):25−30 (1967); Non−ionic Surfactants, Schick, ed. (Dekker, N.Y., 1967), pp. 300−371.によって説明されている。多くのこのような化合物は、「リポロキサマー(lipoloxamer)」、「ポロキサマー(poloxamer)」、「プルロニック(Pluronic(登録商標))」および「シンペロニクス(synperonics)」という一般的な商品名で市販されている。B−A−B型のポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ポリマーは、しばしば「リバースド(reversed)」プルロニック(Pluronic(登録商標))、「プルロニック−R(Pluronic−R(登録商標))」または「メロキサポール(meroxapol)」と称される。
【0100】
式(XXVII)の「ポロキサミン」ポリマーは、テトロニック(Tetronic(登録商標))という商品名でBASF社(Wyandotte, MI)から市販されている。式(XXVII)で示されるポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンブロックの順序は逆でもよく、この場合には式(XXVIII)のテトロニック−R(Tetronic−R(登録商標))となり、これもまたBASF社から市販されている。Schmolka, J. Am. Oil. Soc., 59:110 (1979)を参照。ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーはまた、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイド反復単位のランダムな混合を含む親水性ブロックを用いて設計され得る。ブロックの親水特性を維持するためには、エチレンオキサイドを多く含ませるであろう。同様に、疎水性ブロックは、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイド反復単位の混合物であり得る。このようなブロックコポリマーは、プルラドットTM(PluradotTM)という商品名でBASF社より市販されている。
【0101】
プルロニックの多くは、以下の式:
【0102】
【化25】
【0103】
に適合するように設計されている。
【0104】
mおよびnの値は通常、統計的な平均で表され、与えられた分子の第一ブロックの反復単位数は通常、第三ブロックの反復単位数に正確に一致するわけではない。多くのブロックコポリマーの特徴は、式(XXIX)を引用して説明すれば、以下のようである。
【0105】
【表2】
【0106】
オキシエチレンおよびオキシプロピレン単位の平均数は、業者より提供された平均分子量(MW)を用いて計算された。コポリマーの親水性−親油性バランス(HLB)は、業者(BASF社)により決定された。臨界ミセル濃度(CMC)は、Kabanov et al., Macromolecules 28: 2303−2314 (1995)記載の表面張力法により決定された。
【0107】
本発明に関する他の特異的なポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーには以下を含むものもある。
【0108】
【表3】
【0109】
【0110】
好ましい実施形態において、組成物は、ポリヌクレオチドまたはその誘導体、および、少なくともひとつのブロックコポリマーを含み、該ブロックコポリマーはプルロニック(登録商標)F127およびL61である。他の実施形態において組成物は、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのブロックコポリマーを含み、該ブロックコポリマーはプルロニック(登録商標)P85である。
【0111】
式(XXVII)で示されるジアミン結合ブロックコポリマーもまた、以下の式:
【0112】
【化26】
【0113】
で示されるジアミン結合ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマーファミリーの一つであり得る。式中、破線は第二の窒素に続いているポリエーテルの対称的なコピーを表しており、R*は炭素原子が約2〜約6のアルキレン、炭素原子が約5〜約8のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、R1およびR2は(a)両方とも水素原子、または(b)一方は水素原子であり他方はメチル、のいずれかであり、R3およびR4は(a)両方とも水素原子、または(b)一方は水素原子であり他方はメチルのいずれかである。ここでR3およびR4の両方が水素原子の場合、R5およびR6の一つは水素原子であり他方はメチルであり、R3およびR4の一つがメチルの場合、R5およびR6の両方が水素原子である。
【0114】
あるブロックコポリマーの疎水性/親水性特性は、オキシプロピレン基の数に対するオキシプロピレン基の数の比に依存する。例えば、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)の単一のブロックコポリマーを含む組成物において、この関係は、中心の疎水性ブロックおよび末端の親水性ブロックの分子量を考慮すれば、以下のように表される。
【0115】
【数3】
【0116】
式中、Hはオキシプロピレン単位の数であり、Lはオキシエチレン単位の数である。疎水性のB型セグメントおよび親水性のA型セグメントを含むブロックコポリマーのような一般的な場合において、疎水性−親水性特性およびミセル形成特性は、以下のように定義されるn値に関連する。
【0117】
【数4】
【0118】
適切なn値を有するブロックコポリマーの選択は、特異的な物質の疎水性/親水性特性または、配合される物質の混合物の混合疎水性/親水性特性に依存する。典型的には、nは約0.2〜約9.0、より好ましくは約0.25〜約1.5の範囲の値をとりうる。この範囲は、数値的な臨界としてではなく、主に親水性であるポリ(オキシエチレン)ブロックおよび主に疎水性であるポリ(オキシプロピレン)ブロック間の最適な疎水性/親水性バランスを表しているとしてみなされるべきである。
【0119】
本発明の重要な観点は、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)の異なるブロックコポリマーの混合物を用い、適切な粒子径を保持しつつ、あるサイトカインまたはいくつかのサイトカインの混合物に適当な、より特異的な疎水性−親水性バランスを得ることである。例えば、第一のブロックコポリマーにおいてnは1.0であり、一方第二のブロックコポリマーにおいてnは1.5である。ここでnが1.3である材料を所望する場合、1質量部の第一のブロックコポリマーおよび1.5質量部の第二のブロックコポリマーを用いればよい。
【0120】
従って、このような混合物のより一般的な関係は以下のように示される。
【0121】
【数5】
【0122】
式中、H1およびH2はそれぞれ第一および第二のブロックコポリマーにおけるオキシプロピレン単位の数であり、L1は第一のブロックコポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり;L2は第二のブロックコポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり;m1は第一のブロックコポリマーの質量比であり;およびm2は第二ブロックコポリマーの質量比である。一般的に、Nは約0.2〜約9.0、より好ましくは約0.25〜約1.5の範囲の値をとるであろう。
【0123】
疎水性B型ブロックコポリマーおよび親水性A型ブロックコポリマーを含むK個のブロックコポリマーの混合物という、さらにより一般的な場合の場合、N値は以下のように表される。
【0124】
【数6】
【0125】
一種のポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーのみが用いられている場合、Nはnに等しいであろう。類似した関係が、二つ以上のポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーを用いている組成物に適用される。
【0126】
ブロックコポリマーの混合物が使用されている場合、N値が用いられ、この値は、構成するコポリマーの質量比に基づいて平均された、関与している各コポリマーそれぞれについてのnの加重平均であろう。N値は、コポリマー混合物のミセル形成特性を概算するのに用いられる。ブロックコポリマー混合物を使用すると溶解度が増し、血清タンパク質存在下でより疎水性のブロックコポリマーが凝集することを妨げる。特に、エチレンオキサイド含有量が50%を超過するポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーは、エチレンオキサイド含有量が50%以下である疎水性ブロックコポリマーを可溶化する。好ましくは、ブロックコポリマーの混合物は、70%以上のオキシエチレン含有量を有するブロックコポリマーおよび、オキシエチレン含有量が50%以下である少なくとも一つのブロックコポリマーを含む。より特異的には、プルロニック(登録商標)F127が好ましい。このような混合物において、疎水性および親水性コポリマーの好ましい比は少なくとも2:1(w/w)、好ましくは少なくとも5:1(w/w)、さらにより好ましくは少なくとも8:1(w/w)である。ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー以外のコポリマーが用いられる場合、あるポリマークラスの一つのポリマーの疎水性/親水性特性を、他のクラスのものの特性に関連させることに同様のアプローチが応用されうる。
【0127】
上記パラメータを用いて、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)の一つ以上のブロックコポリマーを、N値が約0.1〜約9、より好ましくは約0.25〜約1.5になるように結合させる。結合したコポリマーはミセルを形成し、N値はこのようにして形成されたミセルのサイズにある程度影響を及ぼす。この範囲は広く変化し得るが、典型的には、ミセルは約10〜約25nmの平均直径を持つ。得られた調製物の平均直径のほとんどは、準弾性光散乱技術によって簡単に測定できる。
【0128】
本発明の一実施形態によれば、組成物は、ポリヌクレオチドまたはその誘導体、および、ブロックコポリマーが分子溶液またはコロイド分散(コロイド分散は、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体または他のタイプの分子凝集体または分子種を含むがこれらに限定されない)である少なくとも一つのポリエチレン−ポリプロピレンブロックコポリマーを含む。分子溶液またはコロイド分散において、ブロックコポリマーにより形成された分子種のサイズは、本発明の組成物の有用性を決定する一つの主要なパラメータである。体内へ投与した後、大きい粒子は網内皮系組織で除去され、容易に病変部位に輸送され得ない(例えばKabanov et al., J. Contr. Release, 22, 141 (1992); Volkheimer. Pathologe 14:247 (1993); Kwon and Kataoka, Adv. Drug. Del. Rev. 16:295 (1995)を参照)。また、大きい粒子の細胞中の輸送および細胞内の運搬は、制限されるかまたはわずかである。例えばLabhasetwar et al. Adv. Drug Del. Res. 24:63 (1997)を参照。300nm〜1μm超のサイズを有する凝集したカチオン性分子種は、細胞のトランスフェクションに有効ではない。Kabanov et al., Self−Assembling Complexes for Gene Delivery. From Laboratory to Clinical Trial, Kabanov et al. (eds.), John Wiley, Chichester (1998)および引用文献を参照。大きい粒子、特に正に荷電しているものは、一部肝臓や塞栓症への悪影響のため体内で高い毒性を示す。例えばVolkheimer, Pathologe 14:247 (1993); Khopade et al Pharmazie 51:558 (1996); Yamashita et al., Vet. Hum. Toxicol., 39:71 (1997)を参照。小さいポリマー分子種は非毒性であり、体内の細い毛細血管に入り、体内で病変部位に輸送され、生物学的関門(血液脳関門、腸上皮を含むがこれらに限定されない)を通過して、細胞内小胞に吸収されて細胞膜を通過し、細胞内の標的部位へ輸送される。このサイズ範囲の粒子は、より大きいサイズの微粒子に比べてより効果的に動脈壁を通過すると考えられている。Labhasetwar et al., Adv. Drug Del. Res. 24:63 (1997)を参照。特定の理論に制限されることを望むわけではないが、体積に対する高い表面積比により、標的分子を用いたこのような粒子の良好な標的化には、小さなサイズは必須であるとも考えられる。本発明の組成物中で形成される分子種の好ましい範囲は、約300nm未満、より好ましくは約100nm未満、さらにより好ましくは約50nm未満である。
【0129】
他の観点において本発明は、式(I)〜(XIII)で示される少なくとも一つのブロックコポリマーを含むポリヌクレオチド複合体に関し、ここでA型およびB型ブロックは大体は式−0−R9の反復単位で構成され、式中、R9は:
(1)−(CH2)n−CH(R6)であり、ここでnは0〜約5の整数であり、R6は水素、炭素原子3〜8のシクロアルキル、炭素原子1〜6のアルキル、フェニル、アルキルが炭素原子1〜6を有するアルキルフェニル、ヒドロキシ、アルキルが炭素原子1〜6を有するヒドロキシアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子2〜7のアルキルカルボニル基、アルコキシが炭素原子1〜6を有するアルコキシカルボニル、アルコキシおよびアルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するアルコキシカルボニルアルキル、各アルキルが炭素原子1〜6を有するアルキルカルボキシアルキル、アルキル基が炭素原子1〜6を有するアミノアルキル、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するアルキルアミンまたはジアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するモノ−またはジ−アルキルアミノアルキル、クロロ、またはアルキルが炭素原子1〜6を有するクロロアルキル、フルオロ、アルキルが炭素原子1〜6を有するフルオロアルキル、シアノ、またはアルキルが炭素原子1〜6を有するシアノアルキル、またはカルボキシル;(2)環炭素原子3〜8の炭素環式化合物基であり、ここで該基は例えばシクロアルキルまたは芳香族基であり、これは炭素原子1〜6のアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子1〜6のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロ、または、クロロ置換基を含んでいてもよい;または(3)環原子3〜8の複素環式化合物基であり、これはヘテロシクロアルキルまたはヘテロ芳香族基を含んでいてもよく、これらは酸素原子、窒素原子、硫黄原子およびこれらの混合物からなる群より選択されるヘテロ原子を1〜4含んでいてもよく、これらは、炭素原子1〜6のアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子1〜6のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロまたはクロロ置換基を含んでいてもよい、である。
【0130】
好ましくは、nは1〜3の整数である。R5を含む炭素環式化合物基または複素環式化合物基は、好ましくは環原子が4〜7、より好ましくは環原子が5〜6である。ヘテロ環は好ましくは1〜2のヘテロ原子を含み、より好ましくは該ヘテロ環は一つのヘテロ原子を有する。好ましくは、該ヘテロ環は炭化水素または炭化水素類似体である。これらのポリヌクレオチドを生成するのに必要なモノマーは合成によって得られることは、当業者であれば理解するであろう。本技術の当業者であればわかるように、いくつかの場合において、モノマーの重合は適切な保護基の使用が必要であろう。一般的に、A型およびB型ブロックは、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、さらにより好ましくは少なくとも約95%が−OR5−で示される反復単位である。
【0131】
他の観点において、本発明は、式(I)〜(XIII)のうち一つのブロックコポリマーを含むポリヌクレオチド複合体に関し、ここで、A型およびB型ブロックは−O−R5で示される反復単位を必須として有し、式中、R7は炭素−炭素のアルキル基(C to C alkyl group)である。
【0132】
本発明で用いられるブロックコポリマーは一般的に、特定の環境下で直径約10nm〜約100nmのミセルを形成する。ミセルは、水溶液中において両親媒性物質の非極性部分のミクロ相分離によって形成される、特定の両親媒性分子の超分子複合体である。ミセルは、特定の温度で、両親媒性物質の濃度が該両親媒性物質固有の臨界ミセル濃度(「CMC」)に達した場合に形成される。このようなミセルは一般的に、約10〜約300のブロックコポリマーを含む。ブロックコポリマーの親水性および疎水性部分の大きさを変えることにより、生理学的な状況でのコポリマーのミセル形成傾向を変えることができる。ミセルは、Bブロックの水不溶性反復単位で形成された高密度コア(dense core)、荷電が中和された核酸(charge−neutralized nucleic acids)、および、Aブロックで形成された親水性殻を有する。ミセルは、溶液中において並進および回転の自由を有しており、ミセルを含む溶液は水同様の低い粘度を有する。ミセル形成は、一般的に約0.001〜5%(w/v)のコポリマー濃度で起こる。一般的に、ポリカチオン性ポリマーおよびポリ核酸の濃度は、ポリヌクレオチド組成物中のコポリマーの濃度より低く、好ましくは少なくとも約10倍未満、より好ましくは少なくとも約50倍未満である。
【0133】
本発明で用いられるブロックコポリマーのいくつかは、高濃度でゲルを形成するであろう。これらのゲルは、コポリマー分子の並進および回転の自由がコポリマー分子間の相互作用の連続したネットワークにより顕著に強制される粘性系である。ゲル中においてBブロック反復単位のミクロ分離は、生じるかもしれないし、生じないかもしれない。ゲルの形成を防ぐために、ポリマー濃度(ブロックコポリマーおよびポリエーテル/ポリカチオンポリマーの両方に関する)は好ましくは約15%(w/v)未満、より好ましくは約10%未満、さらにより好ましくは約5%未満であろう。本発明の第一の実施形態において、ゲルは回避されることがより好ましい。
【0134】
ポリヌクレオチド組成物がカチオン性成分を含む場合、該カチオンはポリヌクレオチドのリン酸基と会合し、リン酸基の荷電を中和し、ポリヌクレオチド成分をより疎水性化させる。この中和は、好ましくはR型ポリマーセグメントまたはポリカチオン性ポリマー上のカチオンによってなされる。しかしながら、リン酸の電荷は、化学的な改変によって、または、N−[l−(2,3−ジオレイルオキシ)−プロピル]−N,N,N,−トリメチルアンモニウムクロライド]のような疎水性カチオンとの会合によっても中和され得る。水溶液中において、電荷が中和されたポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド複合体」と称される超分子ミセル様粒子を形成して沈殿する。疎水性核または複合体は、電荷が中和されたポリヌクレオチドおよびB型コポリマーブロックを含む。親水性殻は、A型コポリマーブロックを含む。複合体の大きさは、一般的に直径が約10nm〜約100nmの範囲で変化する。ある環境においては、組み込まれなかった成分から複合体を分離することが実用的である。これは例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーによって分離され得る。
【0135】
ポリヌクレオチド組成物の成分比は、組成物中のポリヌクレオチドの効果的な膜間透過性を最適化するのに重要な要素である。この比は比φとみなすことができ、これは、生理学的なpHで、組成物中の正に荷電した基の、負に荷電した基に対する比である。φ<1の場合、複合体は、ポリヌクレオチドにより中和されていないリン酸塩を含む。中和されていない電荷に隣接したポリヌクレオチド部分は、ポリヌクレオチド複合体のシェルの一部になると考えられる。同様に、φ>1の場合、ポリカチオン性ポリマーまたはR型セグメントは中和されていない電荷を有し、中和されていない部分は複合体のシェルの一部を形成するために折り畳まれるであろう。一般的に、φは約0(この場合、カチオン性の基は存在しない)〜約100の範囲で変化し、好ましくはφは約0.01〜約50、より好ましくは約0.1〜約20の範囲で変化するであろう。φは、膜間輸送の効率を上げるために変えてもよいし、組成物がポリヌクレオチド複合体を含む場合には、複合体の安定性を上げるために変えてもよい。φの多様性はまた、動物に投与された後の複合体の生体内分布に影響を与え得る。最適なφは、特に(1)ポリヌクレオチド複合体が用いられている環境、(2)用いられている特異的なポリマーおよびオリゴヌクレオチド、(3)標的化された細胞または組織、および(4)投与方法、に依存するであろう。
【0136】
界面活性剤を含むポリヌクレオチド組成物 本発明はまた、ポリヌクレオチド、カチオン性コポリマーおよび適切な界面活性剤の組成物も含む。界面活性剤は、(i)カチオン性(様々なトランスフェクションカクテルにおいて用いられるものを含む)、(ii)非イオン性(例えばプルロニックまたはテトロニック)、または(iii)両性イオン(ベタインおよびリン脂質を含む)である。これらの界面活性剤は複合体の溶解度を増し、組成物の生物学的活性を増す。
【0137】
適切なカチオン性界面活性剤としては、第1級アミン、第2級アミン、第3級アミン(例えばN,N’,N’−ポリオキシエチレン(10)−N−タロウ−1,3−ジアミノプロパン)、第4級アミンの塩(例えばドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、混合されたアルキルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、メチルベンゼトニウムクロライド、デカメトニウムクロライド、メチルが混合されたトリアルキルアンモニウムクロライド、メチルトリオクチルアンモニウムクロライド、N,N−ジメチル−N−[2−(2−メチル−4−(1,1,3,3−テトラメチルブチル)−フェノキシエトキシ)エチル]−ベンゼンメタンアミニウムクロライド(N,N−dimethyl−N−[2−(2−methyl−4−(1,1,3,3−tetramethyl−butyl)−phenoxy)−ethoxy]ethyl)−benzenemethanaminium chloride)(DEBDA)、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)−プロピル]−N,N,N,−トリメチルアンモニウムクロライド、1,2−ジアシル−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(アシル基=ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル)、1,2−ジアシル−3−(ジメチルアンモニオ)プロパン(アシル基=ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル)、1,2−ジオレオイル−3−(4’−トリメチルアンモニオ)ブタノイル−syn−グリセロール、1,2−ジオレオイル−3−スクシニル−syn−グリセロールコリンエステル、コレステリル(4’−トリメチルアンモニオ)ブタノエート)、N−アルキルピリジニウム塩(例えば、セチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロライド)、N−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラフォーム電解質(dicationic bolaform electrolytes)(C12Me6;C12Bu6)、ジアルキルグリセリルホスホリルコリン、リゾレシチン、L−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン(例えば、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン(DPPES)、リポポリ−L(またはD)−リジン(LPLL,LPDL)、N−グルタリルホスファチジルエタノールアミンに結合したポリ(L(またはD)−リジン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタメートエステル(C12GluPhCnN+)、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタメートエステル(C14GluCnN+)、コレステロールのカチオン性誘導体(例えば、コレステリル−3β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−3β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−3β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−3β−カルボキシルアミドエチレンジメチルアミン、3β[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン−カルボモイル)コレステロール])を含む。
【0138】
適切な非イオン性界面活性剤としては、n−アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、n−アルキルポリオキシエチレンエーテル(例えばトリトンTM)、ソルビタンエステル(例えば、スパンTM)、ポリグリコールエーテル界面活性剤(テルギトールTM)、ポリオキシエチレンソルビタン(例えばトゥイーンTM)、ポリソルベート、ポリオキシエチル化グリコールモノエーテル(例えばBrijTM、ポリオキシエチレン9ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン10エーテル、ポリオキシエチレン10トリデシルエーテル)、ルブロール、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイドのコポリマー(例えばプルロニックTM、プルロニックRTM、テロニックTM、プルラドットTM)、アルキルアリールポリエーテルアルコール(チロキサポールTM)、パーフルオロアルキルポリオキシ化アミド、N,N−ビス[3−D−グルコンアミドプロピル]コラミド、デカノイル−N−メチルグルカミド、n−デシル−α−D−グルコピラノジド、n−デシル−β−D−グルコピラノジド、n−デシル−β−D−マルトピラノジド、n−ドデシル−β−D−グルコピラノジド、n−ウンデシル−β−D−グルコピラノジド、n−ヘプチル−β−D−グルコピラノジド、n−ヘプチル−β−D−チオグルコピラノジド、n−ヘキシル−β−D−グルコピラノジド、n−ノナノイル−β−D−グルコピラノジド1−モノオレイル−rac−グリセロール、ノナノイル−N−メチルグルカミド、n−ドデシル−α−D−マルトシド、n−ドデシル−β−D−マルトシド、N,N−ビス[3−グルコンアミドプロピル]デオキシコラミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ジギトニン、ヘプタノイル−N−メチルグルカミド、ヘプタノイル−N−メチルグルカミド、オクタノイル−N−メチルグルカミド、n−オクチル−β−D−グルコピラノジド、n−オクチル−α−D−グルコピラノシド、n−オクチル−β−D−チオガラクトピラノジド、n−オクチル−β−D−チオグルコピラノジド、を含む。
【0139】
適切な両性イオン性界面活性剤としては、ベタイン(R1R2R3N+R’CO2 −、式中、R1R2R3R’は炭化水素鎖であり、R1が最も長い)、スルホベタイン(R1R2R3N+R’SO3 −)、リン脂質(例えば、ジアルキルホスファチジルコリン)、3−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート、3−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホネート、N−デシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、N−ドデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、N−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、N−オクタデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、N−オクチル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、N−テトラデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、およびジアルキルホスファチジルエタノールアミンを含む。
【0140】
ポリヌクレオチド/核酸 広範多種のポリヌクレオチドまたは核酸分子が組成物のポリヌクレオチド成分になり得る。これらは、ウイルス、天然および合成のDNAまたはRNA分子、それらの類似体、またはこれらの誘導体、ならびに、(親油性基、光誘導性架橋基、アルキル化基、有機金属化合物基、挿入基、親油性基、ビオチン、蛍光性、および放射性基、ならびに、リン酸主鎖を改変する基、を含む基を組み込むために)共有結合で改変されている核酸分子、を含む。このような核酸分子は、アンチセンス核酸分子、ウイルス、ウイルスベクター、遺伝子をコードしたDNA(通常、適切なプロモータ配列を含む)、リボザイム、アプタマー、抗原核酸、オリゴヌクレオチドα−アノマー、エチルホスホトリエステル類似体、アルキルホスホメート、ホスホロチオネートおよびホスホロジチオネートオリゴヌクレオチドおよびこれら様のものを含むがこれらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、分泌性もしくは非分泌性タンパク質またはペプチド、ワクチンまたは抗原をコードする核酸分子であり得る。実際には、核酸成分は、動物に投与した後、より高効率で細胞に輸送されるのに有利であり、分解過程に対して安定であり、または、その生体内分布が改善されるような任意の核酸であり得る。
【0141】
標的分子 場合によっては、非共有結合的な会合により標的分子を組み込むことが望ましい。例えば、Kabanov et al., J. Controlled Release, 22:141 (1992)を参照、この内容はここに参照されることにより組み込まれる。組成物に会合され得る標的分子は、一般的に細胞の部位および疎水性基に対して親和性がある標的基を有する。標的分子は、自発的にポリヌクレオチド複合体と会合し、疎水性基を介してそこで「アンカー」になるであろう。組成物中においてこれらの標的付加体は、一般的に約10%以下のコポリマーを含むであろう。
【0142】
標的分子において、疎水性基は、特に脂肪族アシル基のような脂質基であり得る。あるいは、それはブロックコポリマーまたは他の天然合成ポリマーであり得る。標的分子の標的基はしばしば、一般的にはある細胞表面の抗原に対して特異性を有する抗体を含む。それはまた、例えば細胞表面受容体との特異的な相互作用を有するホルモン、または細胞表面受容体を有する薬剤であり得る。例えば、糖脂質は、多糖の受容体を標的化するのに機能する。標的分子は、R型ポリマーブロックを含むここで挙げられた任意のポリマーブロックおよびポリカチオン性ポリマーに結合され得る。例えば、標的分子は、本発明のブロックコポリマーのポリエーテルセグメントの、自由末端基に共有結合され得る。このような標的分子は、式XVIII、XIX、XXおよびXXIで示されるポリマーの−OH末端基、および、式XVIII(好ましくは末端のリジン残基のε−アミノ基)、XXまたはXXIIIで示されるポリマーの−NH2末端基、または、式XVIIIおよびXIXで示されるポリマーの−COOH末端基に共有結合し得る。標的分子は、例えばSoukchareun et al., Bioconjugate Chem., 6:43 (1995), or Arar et al., Bioconjugate Chem., 6:43 (1995)に記載されているように紡錘菌由来のペプチド(fusogenic peptides)を、核型ペプチド(caryotypic peptides)を、または細胞への部位指向的輸送(特に、エンドソーム性の小胞から細胞質への移動、または、核への運搬)を提供する生物学的に特異的な他の基を標的分子として用いて、ポリヌクレオチド組成物の細胞内輸送、例えば核への輸送、を促進するために用いられ得る。
【0143】
組成物のポリヌクレオチド成分は、任意のポリヌクレオチドであり得るが、好ましくは少なくとも3個、より好ましくは少なくとも5個の塩基を有するポリヌクレオチドである。さらにより好ましくは少なくとも10個の塩基である。ウイルスのゲノムおよびウイルス(脂質またはタンパク質のウイルス外殻を含む)も適切なポリヌクレオチドに含まれる。これは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス−ウイルス、またはポックスウイルスを含むがこれらに限定されないウイルスベクターを含む。本発明に用いられる他の適切なウイルスベクターは、当業者には明白であろう。「ポリ(核酸)」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ここでは同じ意味で使用されている。オリゴヌクレオチドとは、DNAおよびRNAのようなポリヌクレオチドである。
【0144】
ポリヌクレオチド誘導体は、一以上の部分を有するポリヌクレオチドであり、(i)該部分は、結果生じる物質がポリヌクレオチドとして機能できるように、開裂され、不活性化され、そうでなければ改変される、または(ii)該部分は、誘導体がポリヌクレオチドとして機能することを妨害しない。
【0145】
治療用途 本発明の組成物は、様々な治療に用いられ得る。好ましい実施形態において、該組成物は樹状細胞の活性化もしくは増殖を誘導するため、および、上記記載の組成物を投与することにより、動物における免疫応答を増強させるために用いられる。好ましくは、樹状細胞活性化誘導のための該組成物は、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む。より好ましくは、該ブロックコポリマーは、プルロニックF127およびL61である。さらにより好ましい実施形態においては、該ブロックコポリマーは約2%(w/v)のF127および約0.025%のL61の混合物である。他の特異的な実施形態においては、該ブロックコポリマーはプルロニックF127/プルロニックL61の10倍希釈物であり、他の実施形態においては、該ブロックコポリマーはプルロニックF127/プルロニックL61の100倍希釈物である。別の特異的な実施形態においては、該ブロックコポリマーは、プルロニックF127およびL61の8:1の混合物である。
【0146】
例えば、組成物は、遺伝子置換または除去治療、および遺伝子付加治療を含む遺伝子治療に用いられ得る(B. Huber, Gene therapy for neoplastic diseases; B.E. Huber and J.S. Lazo Eds., The New York Academy of Sciences, N.Y., N.Y., 1994, pp. 6−11)。また、アンチセンス治療は、細胞の核および/または細胞質中の遺伝子を標的とする結果、それらを阻害する(Stein and Cheng, Science 261:1004 (1993); De Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res., 28:366 (1995))。アプタマー核酸薬剤は、細胞内および細胞外両方のタンパク質、ペプチドおよび小分子を標的にする。Ellington and Szostak, Nature (London), 346:818 (1990)を参照。抗原核酸化合物は、核中の二重鎖DNAを標的とするのに用いられ得る。Helene and Tolume, Biochim, Biophys., Acta 1049:99 (1990)を参照。触媒性ポリヌクレオチドは、核および/または細胞質中のmRNAを標的とする。Cech, Curr. Opp. Struct. Biol., 2:605 (1992)。
【0147】
置換、阻害および/または付加された遺伝子の例としては、治療用分泌タンパク質、非分泌タンパク質、ワクチンおよび抗原、アデノシンデアミナーゼ、腫瘍壊死因子、細胞成長因子、IX因子、インターフェロン(例えばα−、β−およびγ−インターフェロン)、インターロイキン(例えばインターロイキン2,4,6および12)、HLA−B7、HSV−TK、CFTR、HIV−1、β−2、ミクログロブリン、レトロウイルス遺伝子(例えばgag、pol、env、taxおよびrex)、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス遺伝子(例えば単純疱疹ウイルスタイプIおよびII遺伝子ICP27/UL54、ICP22/US1、ICP/IE175、プロテインキナーゼおよびエキソヌクレアーゼ/UL13、プロテインキナーゼ/US3、リボヌクレアーゼレダクターゼICP6/UL39、かなり初期の(IE)mRNA IE3/IE175/ICP4,1E4/ICP22/US1,IE5/ICP47,IE110、DNAポリメラーゼ/UL30、UL13)、ヒト多剤耐性遺伝子(例えばmdrl)、腫瘍遺伝子(例えばH−c−ras、c−myb、c−myb、bcl−2、bcr/abl)、ガン抑制遺伝子p53、ヒトMHC遺伝子(例えばクラス1MHC)、免疫グロブリン(例えばIgG、IgM、IgE、IgA)、ヘモグロビンαおよびβ鎖、酵素(例えば炭酸脱水素酵素、トリオースホスフェートイソメラーゼ、GTP−シクロヒドロラーゼI、フェニルアラニンヒドロラーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、グルコセロブロシダーゼ、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ)、ダイソトロピン、フィブロネクチン、アポリタンパク質E、嚢胞性繊維症の膜間コンダクタンスタンパク質、c−srcタンパク質、V(D)J組換え活性化タンパク質、免疫遺伝子、ペプチドおよびタンパク質抗原(「DNAワクチン」)、およびこれら様のものを含む。
【0148】
本発明によれば、二以上のプラスミドもしくは遺伝子が発現しうる。これは、抗原を発現する少なくとも一つの遺伝子、および、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞を活性化し、それによって抗原提示の増強および免疫応答の誘導のためのアジュバントとして機能できる分子;例えばサイトカイン、を発現する少なくとも一つの遺伝子を含んでもよい。このようなアジュバントの例としては、インターロイキン−12、Flt3リガンド、GM−CSF、CD4Oリガンドのようなインターロイキンを含むがこれらに限定されない。抗原には、免疫応答が生じるどのような産物でもなりうる。加えて、抗原もしくはアジュバントタンパク質を遺伝子治療と併用してもよい。例えば、FLT−3リガンドを、抗原をコードするプラスミドもしくはレトロウイルスとともに体内に注入することができる。
【0149】
プルロニックF127/プルロニックL61混合物は、樹状細胞の浸潤を誘導するサイトカインおよびケモカイン様と知られている、NF−κB誘導性遺伝子を誘導することができる。下記に示すように、SP1O17はプロモーター依存性を有し、転写因子NF−κBの活性化を助けるようである。CMVプロモーターもしくはNF−κB感受性エレメントカセットにより誘導されるDNA構築物は、SV−40プロモーターもしくはAP−1感受性カセットによる構築物と比較して、プルロニックF127/プルロニックL61のキャリア作用に対してかなり応答性であることが研究により証明されており、プルロニックF127/プルロニックL61は、デリバリー作用に加えて、導入遺伝子発現の転写調節を妨げることにより生物学的応答調節剤として機能しているということが示唆されている。
【0150】
NF−κBのp65サブユニット(RelA、NFκB3、およびNF−κB p65サブユニットとしても知られている)は、p50、cRel、p52およびRelBを含む、Rel/NF−κB転写因子ファミリーの一員である。NF−κB p65サブユニットははじめ、保存ドメインを癌原遺伝子cRelに渡すためのプローブとして用いたJurkatT細胞から単離され(Ruben et al., Science, 1991, 251, 1490−1493)、それ以来、自然発生的な転換によるタンパク質の変異体が存在することが示されている(Narayanan et al., Science, 1992, 256, 367−370)。加えて、NF−κB結合DNA配列が多くの遺伝子において発見され、それが遺伝子の機能の発現に、実際に重要であることが示されている。NF−κB結合配列(κBモチーフ)は、G(グアニン)クラスターで始まり、C(シトシン)クラスターで終わる共通配列を有する約10塩基からなる。(コンセンサス配列 5’−GGGRNNYCCC−3’)。しかしながら、炎症性タンパク質として知られているインターロイキン−1(以下、IL−1と称することもある)および腫瘍壊死因子(以下、TNFと称することもある)の遺伝子上に、DNA結合タンパク質が結合しうる多くの配列が存在しており、NF−κB結合配列はここにも存在していることが知られている(Clark, B. D. et al., Nuci. Acids Res., 14, 7898, 1984; Nedospasov, S. A. et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 51, 611, 1986)。NF−κBの結合により、mRNAへの転写が阻害されることが報告されている(Hiscott, J. et al., Mol. Cell. Biol., 13, 6231, 1993; Collart, M. A. et al., Mol. Cell. Biol., 10, 1498, 1990)。
【0151】
遺伝病もまた、該組成物により治療することができる。このような疾患は、リウマチ、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、α−サラセミア、β−サラセミア、カルボニックアンヒドラーゼII欠損症、トリオースリン酸イソメラーゼ欠損症、テトラヒドロビオプテリン欠損性高フェニルアラニン血症、古典的フェニルケトン尿症、Duchenne筋ジストロフィーのような筋ジストロフィー、高サルコシン血症、腺腫性腸ポリポーシス、アデノシンデアミナーゼ欠損症、悪性黒色腫、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、動脈硬化症および高コレステロール血症、Gaucher病、嚢胞性線維症、大理石骨病、自然発生腫瘍の増加、TおよびB細胞免疫不全、高コレステロール、慢性関節リウマチを含む関節炎、緑内障、アルコール中毒症およびこれらに類似した症状、を含む。
【0152】
該組成物は、乳癌(例えば、胸部、膵臓、胃、前立腺、結腸直腸、肺、卵巣)、リンパ腫(ホジキン及び非ホジキンリンパ腫)、黒色腫及び悪性黒色腫、進行癌血友病B、腎細胞癌、膠芽腫、星状細胞腫、神経膠腫、AMLおよびCMLなどの症状を含むがこれらに限定されない腫瘍性疾患の治療にも用いることができる。
【0153】
さらに該組成物は、(i)脳卒中、Duchenne筋ジストロフィーに関連した心筋症、心筋虚血、再狭窄およびこれらに類似した症状を含むがこれらに限定されない心血管性疾患、(ii)肝炎、HIV感染およびAIDS、ヘルペス、CMVおよびCMVrenitisのような関連疾患、のような感染性疾患、(iii)腎移植の拒絶反応およびこれに類似した症状のような移植関連障害、の治療に用いることができ、(iv)黒色腫ワクチン、HIVワクチン、マラリア、結核およびこれらに類似したワクチンを含むがこれらに限定されないワクチン療法および免疫処置療法において有用である。ポリヌクレオチドおよびウイルスがワクチンおよび免疫処置に用いられる全ての適用において、該組成物は有用である。
【0154】
標的細胞 本発明はまた、本発明の組成物を投与することからなる、ポリヌクレオチドを細胞にデリバリーする方法にも関する。一つの実施形態において、細胞にポリヌクレオチドをデリバリーする方法は、ブロックコポリマーはゲルを形成するには不十分な量で存在する、ポリヌクレオチドまたはその誘導体および少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを含む。他の実施形態において、該ブロックコポリマーは約15%(w/v)未満の濃度で存在し、より好ましくは約10%(w/v)未満の濃度で存在し、最も好ましくは約5%(w/v)未満の濃度で存在する。更なる実施形態は、該組成物は分子溶液またはコロイド分散を形成し、より好ましくは、該コロイド分散は、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体、または他のタイプの分子凝集体である
ポリヌクレオチド組成物のデリバリーのための標的細胞は、樹状細胞、原核もしくは真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞であるが、これに限定されない。細胞標的は生体外および/または生体内であり、TおよびB細胞、原発性慢性骨髄性白血病、腫瘍浸潤リンパ球、腫瘍細胞、白血病細胞(HL−60、ML−3、KG−1およびこれらの類似体など)、皮膚線維芽細胞、筋芽細胞、一次ニューロンを含む中枢神経系の細胞、肝細胞、癌腫(Bladder癌腫T24、ヒト結腸癌腫Caco−2など)、黒色腫、CD34+リンパ球、NK細胞、マクロファージ、造血細胞、神経芽腫(LAN−5およびこの類似体など)、神経膠腫、リンパ腫(バーキットリンパ腫ST486など)、JD38)、T細胞ハイブリドーマ、一次平滑筋のような筋細胞、およびこれらの類似体を含む。
【0155】
使用方法 本発明のポリヌクレオチド組成物は例えば、ニワトリ、ブタ、雌ウシ、ネコ、イヌ、ウマ、魚、小エビ、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを含むがこれらに限定されない、動物の治療に用いることができる。本発明のポリヌクレオチド組成物は、経口で、局所的で、経直腸で、経膣で、エアロゾルを用いて経肺的に、もしくは非経口的に、すなわち、筋肉内に、皮内に、皮下に、腹腔内にまたは静脈内に投与することができる。樹状細胞の活性化を誘導し、動物における免疫応答を増強するために、好ましい投与経路は、静脈内、経口、皮内、筋肉内、皮下もしくは腹腔内を含むがこれに限定されない。好ましくは、該投与経路は腫瘍への直接注入である。該ポリヌクレオチド組成物は単独で、もしくは、標準的な調剤実務にしたがって、調剤的に許容できるキャリアーもしくは賦形剤と組み合わせて投与することができる。経口投与のために、該ポリヌクレオチド組成物は、錠剤、カプセル、舐剤、トローチ、散剤、シロップ、エリキシル、水溶液、およびサスペンジョン、およびこれらの類似体として用いられることができる。錠剤の場合には、使用されるキャリアーは乳糖、クエン酸ナトリウムおよびリン酸塩を含む。デンプンのような様々な崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような滑沢剤が、錠剤において通常用いられる。カプセルの形状で経口投与するために、有用な希釈剤は、乳糖および高分子量のポリエチレングリコールである。経口使用のため水性懸濁液が必要な際には、ポリヌクレオチド組成物を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせることができる。必要とあらば、甘味剤および/または矯味剤を加えることができる。非経口使用のためには、結合体(conjugate)の滅菌液が通常調製され、該溶液のpHは適当に調節され緩衝化される。静脈内使用のためには、調製液を等張化するために、溶質の総濃度を調節すべきである。目に投与するためには、綿棒や点眼器のような技術として知られている眼のデリバリーシステム(ocular delivery systems)により、軟膏や滴下可能な液体を導入してもよい。このような組成物はヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはポリ(ビニルアルコール)のような粘膜模擬剤(mucomimetics)、ソルビン酸、EDTAもしくは塩化ベンジルクロニウムのような防腐剤、および通常量の希釈剤および/またはキャリアーを含むことができる。経肺的投与のためには、エアロゾルが形成できるよう適当に希釈剤および/またはキャリアーを選択する。
【0156】
筋肉内投与のためには、裸のポリヌクレオチド自体は、ポリカチオンを含まないデリバリーシステムによって筋肉内に移行し発現できるため、ポリヌクレオチドの配合物にポリカチオン性成分があってはならない。筋肉は以下の特徴を有する:独特な細胞構造、筋管あたり複数の核、特異的ポリヌクレオチド結合タンパク質(トリアジン)および独特の核−細胞質輸送。上記のどの特徴が筋肉において裸のポリヌクレオチドの取り込みおよび発現に関与しているのかについては、現在において、まだ明らかではない。ポリヌクレオチドのカチオン性複合体が、ほとんど全ての型の組織において取り込みおよび遺伝子発現を増強することが示されているが、驚くべきことに、同じ複合体が、筋肉においてはよりよい取り込みおよび遺伝子発現に貢献しないのである。実際、ポリヌクレオチドのカチオン性複合体形成は筋肉において取り込みおよび遺伝子発現を阻害し、いくつかの研究所により報告がされている。したがって、ポリヌクレオチドを筋肉内注入するためには、ポリヌクレオチドの複合体化は避けるべきである。本発明は、ポリヌクレオチドの筋肉内導入には非イオン性ブロックコポリマーを用いる。in vitroおよびin vivoにおいて、遺伝物質を細胞内に移行させるのにブロックコポリマー単独では全く不十分である(実施例42参照)。さらに、ポリカチオン含有ブロックコポリマーとは異なり上述の非イオン性ブロックコポリマーは、肺、肝、腎のような末梢器官における遺伝子発現を増加させない。
【0157】
以下の例は、本発明の特徴をより代表して表すのに有用であろうが、それらの範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【0158】
実施例1
形質移入効率
この実験においては、プラスミドpβ−Galを、マウス乳腺癌系のNIH3T3細胞に導入した。プラスミドpβ−Galは、真核生物の転写単位および大腸菌(E. coli)のβ−ガラクトシダーゼのハイブリッドが組み込まれているプラスミドpUC19(the Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciencesより入手)を含む。このプラスミドを用いて、処置された細胞から得られるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより、細胞の取り込み効率を測定することができる。用いられたコポリマーは、xとzとの和は51であり、yは39である式(XIV)のトリブロックコポリマー(以下、「プルロニックA」)であった。用いられたポリカチオンは、ポリ(N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド)(「pEVP−Br」)であった。10μg/mlのpβ−Gal(大多数がスーパーコイル)溶液は、10mg/mlのプルロニックAおよび45μg/mlのpEVP−Brを含むPBS溶液中で調製された。これらの量は、ポリカチオン塩基のプラスミドリン酸基に対する比が約10になるように計算された。プルロニックAのDNAに対する比は約104であった。このストック調製物はろ過滅菌され、その一部分が無血清ダルベッコ改変イーグル培地(「DMEM」)で10倍に希釈され、pβ−Galの濃度を1μg/mlとした。この溶液を、「プルロニックA形質移入培地」とした。
【0159】
NIH3T3細胞を、37℃、5%CO2のもとで、2mMグルタミンおよび10%ウシ胎児血清(「FCS」)を含むDMEM培地を用いて単層培養で成長させた。単層培養で成長させた細胞は回収され、新鮮な培地で3回洗浄することにより処理プロセス用(transaction process)に調製された。
【0160】
本発明の方法により形質転換される、洗浄された細胞の一部は、プルロニックA形質移入培地に106細胞/mlの濃度で懸濁された。懸濁された細胞は、37℃、5%CO2のもとで2時間インキュベートされた。次に細胞は新鮮な培地で洗浄され、再び平板培養された。
【0161】
リン酸カルシウム沈殿により形質移入される細胞の一部は、Promega of Madison, Wisconsin, in their manuscript Profection Mammalian Transfection Systems, Technical Manual, 1990によって推奨される方法によって形質移入された。詳細には、pβ−Galは、0.25MのCaCl2と混合された。その混合物は、等量の2×HBS(ハンクスバッファーソルト(Hanks Buffer Salt)、GIBCO, Grand Island, NYより入手)と混合され、1μg/mLのpβ−Galを含む混合物を作製した。不透明な混合物は室温で10分間インキュベートされ、その後細胞に添加された。懸濁された細胞は37℃、5%CO2のもとで2時間でインキュベートされた。その細胞は新鮮な培地で洗浄され、再び平板培養された。
【0162】
継代した細胞(repeated cells)は、10%FCSを含むDMEM培地で48時間インキュベートされた。インキュベート中、16時間で培地は新鮮な培地と交換された。48時間インキュベートした後、各インキュベートした細胞は掻きとって回収され、PBSで洗浄され、0.2Mトリス−HCL(pH7.4)100μlに再懸濁された。その細胞は、数回の凍結/融解サイクルにより溶解され、6,000×/g超で遠心分離された。上清50μlが各溶解産物チューブから分取され、0.1mMの4−メチル−ウンベリフェリル−β−D−ガラクトピラニシド(基質)と0.1Mリン酸ナトリウム(pH7.4)の溶液50μlと混合された。各混合物は37℃で20分インキュベートされ、存在するすべてのβ−ガラクトシダーゼを基質に作用させた。β−ガラクトシダーゼ反応を終結させるためにpH10.5の0.4Mグリシン50μlが加えられた。β−ガラクトシダーゼ活性はメチルベリフェロン(methylbelliferon)の存在により表され、蛍光分光器(λex=365nm,λ=450nm)によって測定できる。結果を以下に示す。
【0163】
【表4】
【0164】
実施例2
形質移入効率
これらの実験において、MDCK細胞(イヌ腎臓由来)を用いた形質移入効率が試験された。上記のように、pβ−Galが標識ポリヌクレオチドとされた。ポリヌクレオチドのポリカチオン成分は、N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミドおよびN−セチル−4−ビニルピリジニウムブロミドがそれぞれ97:3のモル比で結合しているコポリマー(以下、「pEVP−co−pCVP−Br」)を含んでいた。ブロックコポリマーは、x+zが18であり、yが23である式(XIV)のトリブロックコポリマー(以下、「プルロニックB」)を含んでいた。1μg/mlのpβ−Gal、3μg/mlのPEVP−co−pCVP−Brおよび1%(w/v)のプルロニックBのプルロニックB形質移入溶液は、実施例1で調製されたものであった。ポリカチオン塩基のヌクレオチドリン酸に対する比は約7であった。プルロニックBのpβ−Galに対する質量比は、約5×103であった。
【0165】
MDCK細胞が、90mmプレート上でプレート当り8−105細胞で平板培養され、血清含有成長培地で一晩インキュベートされた。次いで血清含有培地は無血清培地と交換され、細胞は37℃、5%CO2のもとで24時間インキュベートされた。次いで、細胞をポリヌクレオチド複合体で処置するために、培地が5mlプルロニックB形質移入溶液で交換された。細胞は、穏やかな振盪で、37℃、5%CO2のもとでインキュベートされた。対照実験において、細胞はポリヌクレオチド複合体で形質移入され、培地はプルロニックB形質移入溶液5mlで交換された。細胞は、穏やかな振盪で、37℃、5%CO2のもとで2時間インキュベートされた。対照実験において、細胞は、(懸濁された細胞でなく、平板培養された細胞が形質移入されたことを除いて)上記したのと同様のリン酸カルシウム法を用いて形質移入された。
【0166】
プルロニックB形質移入溶液またはリン酸カルシウムで処置した後、細胞は5〜6回新鮮な培地で洗浄された。次いでそれらは、10%FCSを含むDMEMで、37℃、5%CO2のもとで48時間インキュベートされた。インキュベートして初めの16時間後に培地は交換された。インキュベート後、細胞はPBSで洗浄され、トリプシン処理によってそれらのプレートから分離され、再びPBSで洗浄された。β−ガラクトシダーゼが実施例1と同様に測定された。結果を以下に示す。
【0167】
【表5】
【0168】
実施例3
形質移入実験
これらの実験においては、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞を用いた形質移入効率が試験された。ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチド成分はpβ−Galであった。ポリカチオン成分はpEVP−Brを含んでいた。ブロックコポリマーは、iが10であり、jが12である式(XVII)のオクタブロックコポリマー(以下、「プルロニックC」、BASFより入手)を含んでいた。1μg/mlのpβ−Gal、4μg/mlのpEVP−Brおよび1%(w/v)のプルロニックCのプルロニックC形質移入溶液は、実施例1と同様に調製された。塩基性基のヌクレオチドリン酸に対する比は10であった。プルロニックCのpβ−Galに対する質量比は103であった。形質移入手順は実施例2で用いられたのと同様であった。結果を以下に示す。
【0169】
【表6】
【0170】
実施例4
細菌の形質転換
これらの実験において、バシラス サチリス(Bacillus subtilis)のMC5株を用いた形質転換効率が試験された。ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチド成分は、テトラサイクリン耐性をコードしたプラスミドであるプラスミドpBC16であった。式(VI)で示されるブロックコポリマーが用いられた。特に、該ブロックコポリマーは、iは44、jは20である式(XXI)で表されるポリ(オキシエチレン)−ポリ((N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド)であった。第二の実施形態のポリヌクレオチド複合体のストック溶液は、上記の形質移入溶液と同様に調製された。溶液中のコポリマー塩基性基のDNAリン酸に対する比は0.2であった。細菌は、形質転換培地(Spizizen, F.N.A.S., U.S.A. 44:1072 (1958)を参照)であるスピジゼン11(Spizizen 11)中に懸濁され、細胞の一部は、ポリヌクレオチド複合体または単独のpBC16いずれかの様々な濃度中でインキュベートされた。細胞は複合体または単独のDNAとともに、37℃で1時間インキュベートされた。インキュベートの後、細胞は10mg/mlのテトラサイクリンを含む寒天培地で平板培養された。各実験条件下で生産されたテトラサイクリン耐性コロニーの数により測定された結果を以下に示す。
【0171】
【表7】
【0172】
実施例5
ヌクレアーゼからの保護
この実施例においては、プラスミドpTZ19および、iが44であり、jが20である式(XXI)で示されるジブロックコポリマー(ポリ(オキシエチレン)−ポリ((N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド)の複合体が形成された。PBSに溶解されたポリヌクレオチド複合体の溶液は、約4μg/mlのプラスミドおよび20μg/mlのジブロックコポリマーを含んでいた。これらの量により、ポリカチオンブロックにおける塩基性基の、DNAリン酸基に対する比が5であった。対照のインキュベーションとして、等量の単独プラスミドが緩衝液に溶解された。単独DNAまたはポリヌクレオチド複合体を含む溶液サンプルにPVUIIヌクレアーゼが加えられ、様々な消化時間の後に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、未消化の環状プラスミドDNAの量が測定された。Kabanov et al., Biopolymers, 31:1437−1443 (1991)を参照。結果を以下に示す。
【0173】
【表8】
【0174】
実施例6
オリゴヌクレオチドの安定化
この実施例においては、HIV−1tat遺伝子の転写開始部位と相補的なオリゴヌクレオチド(GGCTCCATTTCTTGCTCを含む「アンチ−tat」)を含む複合体が、式(XIX)で表されるジブロックコポリマー(iが44であり、jが8であるポリオキシエチレン−ポリ(L−アラニン−L−リジン))を用いて調製された。オリゴヌクレオチド複合体は、PBS緩衝液(pH7.0)中で、オリゴヌクレオチド濃度が0.75OD260/μlになるように調製された。ポリカチオンのイミノおよびアミノ基の、ポリヌクレオチドリン酸基に対する比は約50であった。その混合物は室温で1時間インキュベートされ、複合体を形成させた。次いでその複合体は、溶出液として0.05MのNaClを用いたセファデックスG−25のゲルろ過クロマトグラフィーにより精製された。得られた複合体溶液は、0.11OD260/μlのオリゴヌクレオチドの濃度を示した。非複合体オリゴヌクレオチドの比較溶液が調製された。マウス血漿の一部(10μl)が、等量のオリゴヌクレオチド複合体溶液または単独オリゴヌクレオチド溶液と混合された。サンプルは37℃で、様々な時間インキュベートされた。血漿中の酵素とオリゴヌクレオチドとの反応を止めるために、サンプルが水で希釈され、フェノール:クロロホルム(1:1)の水飽和混合物で抽出された。抽出物の水相が分離され、3%過塩素酸リチウムを用いてその中のオリゴヌクレオチドを沈殿させた。その沈殿はアセトンで洗浄され、次いで水100μlに溶解された。未分解のオリゴヌクレオチドの存在は、C18−シラソーブカラム(4×90mm、Gilson, France)を用い、溶出液として0.05Mトリエチル−アンモニウムアセテート(pH7.0)中のアセトニトリル勾配を用いて、高速液体クロマトグラフィーにより測定された。結果を以下に示す。
【0175】
【表9】
【0176】
実施例7
オリゴヌクレオチドの安定化
この実験においては、式(XX)のジブロックコポリマー(ポリオキシエチレン−ポリ−プロピレンイミン/ブチレンイミン、ここでiは44であり、jは4〜8である)と複合体化された際の、実施例6に記載のオリゴヌクレオチドの安定性が試験された。オリゴヌクレオチド濃度が約0.13OD260/μlであったこと以外は、実施例6で適用されたのと同じ方法がこの実施例でも適用された。結果を以下に示す。
【0177】
【表10】
【0178】
実施例8
アンチセンスの細胞取り込み効率
この実験においては、SKVLB細胞において多剤耐性を逆転する際の、「アンチ−MDR」、すなわち、MDR1遺伝子産物をコードしたmRNAの422〜438位に相補的な配列CCTTCAAGATCCATCCCの17鎖のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子、の効率を試験した。SKVLB細胞は、卵巣ガン細胞系由来の多剤耐性細胞である。MDR1遺伝子は、SKVLB細胞における多剤耐性に関与することがわかっている。Endicott and Ling, Ann. Rev. Biochem., 58:137 (1989)参照。特に、単独状態の場合と、本発明のポリヌクレオチド複合体中のアンチ−MDRオリゴヌクレオチドとの効率が比較された。対照として、上記の単独かつ完全な形態のアンチ−tatオリゴヌクレオチドもまた用いられた。ポリヌクレオチド複合体は、式(XX)で表されるジブロックコポリマー(ポリオキシエチレンポリプロピレンイミン/ブチレンイミン、ここでiは44であり、jは9〜10である)を用いて形成された。複合体は、実施例6に記載の方法によって調製された。複合体中のまたは単独状態のオリゴヌクレオチド濃度は0.17OD260/μlであった。コポリマーは、ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基のオリゴヌクレオチドリン酸基に対する比を10にするのに十分な濃度で存在していた。
【0179】
SKVLB細胞は、37℃、5%CO2のもとで3日間、単独または完全なオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド含有量に基づき20μMの濃度で)の存在下でインキュベートされた。単独または完全なオリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地が12時間毎に添加された。
【0180】
上記のように処置された細胞に関するダウノマイシン細胞毒性(IC50)が、Alley et. al., Cancer Res., 48:589−601の方法を用いて測定された。結果を以下に示す。
【0181】
【表11】
【0182】
実施例9
ヘルペスウイルスを阻害するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
この実験では12鎖のオリゴヌクレオチドを用い、それらはその5’末端をウンデシルリン酸置換基で、3’末端をアクリジン基で共有結合的に改変されていた。このオリゴヌクレオチド改変は、Cho−Chung et. al., Biochemistry Int., 25:767−773 (1991)に記載されている。用いられたオリゴヌクレオチド配列、CGTTCCTCCTGUは、単純性疱瘡ウイルス1(「HSV−1」)の983〜994位のスプライシング部位に相補的であった。対照として、インフルエンザウイルスによって生産されたRNAに相補的な、同様に改変された配列(AGCAAAAGCAGG)が用いられた。オリゴヌクレオチドは、複合体化した、または単独のいずれかの状態で、HSV−1感染細胞に添加された。複合体が用いられた場合、複合体は式(XIX)で表されるジブロックコポリマー(ポリオキシエチレン−ポリ(L−アラニン−L−リジン)、ここでiは44であり、jは8である)で形成された。オリゴヌクレオチド複合体は、実施例6に記載のように形成された。
【0183】
アフリカンマーモセットの腎臓細胞(「ベロ」細胞)を、Vinogradov et al., BBRC , 203:959 (1994)に記載のように、HSV−1ウイルス(L2株、Museum of Virus Strains, D.I. lvanovskii, Inst. of Virol., Russian Federationより入手)に感染させた。感染細胞はPBSで洗浄された。洗浄後、10%のウシ胎児血清および単独または複合体オリゴヌクレオチドを含む新鮮なRPMI−L640培地が細胞に添加された。次いでその細胞は、37℃、5%CO2のもとで24時間インキュベートされた。その後細胞培地のHSV−1感染性が、Virology, A Practical Approach, Mahy, Ed., IRL Press, Washington, D.C., 1985に記載されたパッチプロダクション法を用いて測定された。オリゴヌクレオチドの様々な濃度を用いた結果を以下に示す。
【0184】
【表12】
【0185】
実施例10
ヘルペスウイルスを阻害するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
特記されない限り、この実施例は実施例9で用いられたのと同じ方法を用いた。用いられた細胞はチャイニーズハムスター腎臓細胞系であるBHK細胞であった。オリゴヌクレオチドの複合体型が用いられた場合、その複合体は、式(XVII)で表されるジブロックコポリマー(ポリオキシエチレン−ポリ−L−リジン、ここでiは44であり、jは30である)で、実施例6に記載された方法を用いた。複合体のストック溶液の濃度は0.09OD260/μlであった。ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基の、オリゴヌクレオチドリン酸に対する比は10であった。複合体または単独型のオリゴヌクレオチドは、3.0μMの濃度で細胞に添加された。結果を以下に示す。
【0186】
【表13】
【0187】
実施例11
In vivo におけるHSVの阻害
式(XVII)で表されるブロックコポリマー(ポリオキシエチレン−ポリ−L−リジン、ここでiは44でありjは30である)並びに、アンチ−HSVおよびアンチ−インフルエンザオリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド複合体が、実施例9に記載された方法を用いて形成された。複合体のストック溶液の濃度は、0.9OD260/μlであった。ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基の、オリゴヌクレオチドリン酸に対する比は10であった。
【0188】
近交系の白色マウス(体重6〜7g)に、ウイルス懸濁液30μl(力価:10−7LD50/ml)を腹腔内注射することによりHSV−1(Cl株、Belorussian Res. Inst. of Epidemiol. & Microbiol., Minskより得た)を感染させた。
【0189】
アンチ−HSV複合体、アンチ−インフルエンザ複合体、単独アンチ−HSVまたは単独アンチ−インフルエンザのいずれかを、感染後2、12、24、48、または72時間のいずれかで、所定のマウスの尾静脈に注射した(10μl)。結果を以下に示す。
【0190】
【表14】
【0191】
実施例12
ポリヌクレオチド複合体の血漿中寿命
HIV−1 tat遺伝子の転写開始部位に相補的な、32Pで標識した17−mer(GGCTCCATTTCTTGCTC)が本実施例で用いられた。オリゴヌクレオチドは、Boutorin et al., Bioconjugate Chemistry, 2: 350−356 (1990)に記載されているように、その5’末端をコレステロールで改変された。オリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド結合体は、式(XX)で表されるブロックコポリマー、ポリオキシエチレン−ポリ(プロピレンイミン/ブチレンイミン)、ここでiは44であり、jは9〜10である)で形成された。複合体のストック溶液(PBSに溶解されたもの)の濃度は、0.18OD260/μlであった。ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基の、オリゴヌクレオチドリン酸に対する比は50であった。
【0192】
雄のC57/Bl/6マウス(体重:20〜24g;the Russian Research Center of molecular Diagnostics and Therapy, Moscowより得た)は、PBSに溶解された0.18OD260/μlのアンチ−HIV結合体または単独アンチ−HIV50μlの静脈注射を受けた。注射後の決められた時間に、血液サンプルが尾静脈から分取され、動物は殺された。血液または組織サンプル中の放射性物質の量は、(適切な可溶化後に)液体シンチレーション計数によって測定された。結果を以下に示す。
【0193】
【表15】
【0194】
実施例13
カチオン性ブロックコポリマーの合成
1,4−ジブロモブタン(5.4g,25ミリモル, Aldrich Co., Milwaukee, WIより得た)は、1,4−ジオキサン100mlに溶解されたN−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミン(6.55g,50ミリモル, Aldrich Co.より得た)の溶液に加えられた。この反応混合物は、20℃で16時間攪拌された。この反応産物は、臭化水素塩として溶液から自然に沈殿する。この沈殿した第一中間体が回収され、10%トリエチルアミンのメタノール溶液から、回転エバポレーションにより2回乾燥された。このエバポレーション方法は、臭化物塩を十分量除去するのに有効であった。第一中間体は50mlの1,4−ジオキサンに溶解され、2.7g(12.5ミリモル)の1,4−ジブロモブタンと反応させた。再び16時間、20℃で反応を進め、生じた第二中間体が回収され上記のように乾燥された。
【0195】
第二中間体は酢酸でpH7〜8に中和され、溶出液として水を用いたセファデックスG−25によるゲルろ過で精製された。3種の主要なポリミンのフラクションが得られ、それぞれ1060、700および500の見かけ分子量を有していた。
【0196】
ポリ(オキシエチレングリコール)(1.5g,分子量1500、Flukaより得た)は、1,4−ジオキサン8mlに溶解され、0.17g(1ミリモル)のN,N’−カルボニルイミダゾール(Aldrich Co.)と、20℃で3時間反応させた。この反応混合物は2分割された。それぞれの部分が、分子量1060または700のポリイミンフラクションのいずれかの10%(w/v)溶液、この溶液はさらに0.01N NaOHを含んでいたが、4mlと混合された。この混合物は16時間、20℃で攪拌された。この混合物より、式(XX)で表されかつ様々な分子量範囲のブロックコポリマーがゲルろ過により分離された。
【0197】
実施例14
カチオン性ブロックコポリマーの合成
メトキシ−PEGのスクシンイミジルカーボネート(分子量5000, Shearwater Polymers, Inc., USA)0.5gが、1,4−ジオキサンに溶解された。このジオキサン溶液は、上記の分子量1060のポリイミンポリマー0.2gを含む水溶液、この水溶液はさらに0.01N NaOHを含んでいたが、に加えられた。この反応混合物は20℃で16時間攪拌された。式(XXII)で表されるポリマーがゲルろ過により反応物より分離された。
【0198】
実施例15
カチオン性ブロックコポリマーの合成
1.5gのポリ(オキシエチレングリコール)(分子量8000,Fluka)が、8mlの1,4−ジオキサンに溶解された。0.34g(2ミリモル)のN,N’−カルボニルイミダゾール(Aldrich Co.)が溶液に加えられ、20℃で3時間反応させた。0.01N NaOHおよび15%(w/v)の、実施例13に記載された分子量500のポリイミンポリマーを含む水溶液8mlが、第一の反応混合物に加えられた。生じた混合物を20℃で16時間、攪拌しながら反応させた。式(XXIII)で表されるポリマーがゲルろ過により第二の反応混合物から分離された。
【0199】
実施例16
オリゴヌクレオチドとの結合体の合成
タイプ1の単純疱疹ウイルス(「HSV−1」)の初期のmRNAのスプライシング部位(ウイルスゲノムの983〜994位)に相補的な12−merのオリゴヌクレオチド、5’−CGTTCCTCCTGU(「オリゴA」)が、380B−02DNA−シンセサイザー(Applied Biosystems,CA)を用いて合成された。該シンセサイザーでは、ホスホアミダイトケミストリーおよび8分の合成サイクルを用いた。サイクル条件および粗産物の調製は、Applied Biosystemsによって推奨されるようになされた。この合成により得られた粗オリゴAを、アセトン(2ml)を含む1M LiCl溶液(0.5ml)より沈殿させた。沈殿物はトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液に溶解され、20mM TEAA緩衝液(pH8.5)中のアセトニトリル勾配により展開されたシラソーブC18カラム(9×250mm、Gilson、France)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーで精製された。
【0200】
精製されたオリゴAの3’−末端は過ヨウ素酸塩で酸化されてアルデヒドを生成し、還元的アルキル化によってヘキサメチレン−ジアミンリンカーと結合され、アミン誘導体を生成した。Che−Chung et al., Biochem. lntemat. , 25:767 (1991); Vinogradov et al., BBRC、203:959 (1994)を参照。式(XIV)(x=25、y=38、z=25)で表されるブロックコポリマー「プルロニックA」が同様に酸化され末端アルデヒドを生成した。このアミン誘導体(1mg)は100μlの0.1M ホウ酸塩緩衝液(pH9.0)に溶解され、2mgのプルロニックA誘導体と混合された。1.5mgの水素化シアノホウ素ナトリウム(sodium cyanoborohydride)がその混合物に加えられ、アミン基およびアルデヒド基の間で形成されたシッフ塩基が還元された。この反応を4℃で12時間進行させた。この反応のポリマー産物は、イソプロパノールの90%水溶液を溶出液として用いたセファデックスLH−20によるゲルろ過クロマトグラフィーで分離された。このようにして得られた結合体は、以降「オリゴA結合体」と称する。
【0201】
実施例17
ウイルス生産に対するオリゴA結合体の効果
オリゴAおよびオリゴA結合体が、RPMI 1640培地(ICN Biomedicals Inc.、Costa Mesa、CA)に最終濃度0.2mM(オリゴヌクレオチド吸光度に基づく)で別々に溶解された。次いでこれらのストック溶液が0.22μmフィルターを通してろ過され、可能な限りのすべての細菌またはカビの混入を排除した。
【0202】
ベロ細胞の単層が、様々な濃度のオリゴAまたはオリゴA結合体をともに含む無血清RPMI1640中で37℃で1時間インキュベートされた。次いで、HSV−1、L2株の培養細胞(the Museum of Virus Strains of the D.I. Ivanovskii Institute of Virology, Russian Academy of Sciences, Russian Federationより得た)あたり1プラーク形成単位を、まだオリゴヌクレオチドに曝露されている間にその単層に感染させた。この感染方法はVinogradov et al., BBRC、203:959 (1994)に記載されている。ウイルスおよびオリゴヌクレオチドに曝露して8時間後、細胞上の培地は10%FCSを含む新鮮な培地と交換された。細胞からの培地は、無効インキュベーション後22時間および39時間で回収され、回収された培地中のウイルス力価がVirology, A Practical Approach, Mahy, Ed., IRL Press, Oxford Univ. Press, Washington, D.C.(1985)に記載の方法により測定された。結果を以下に示す。
【0203】
【表16】
【0204】
実施例18
ホスホネートモノマーの合成
50mlの無水ピリジン(Aldrich)に溶解された40ミリモルのブタンジオール−1,3(Merck)を、20ミリモルの4,4’−ジメトキシトリチルクロライド(Sigma)と20℃で1.5時間反応させた。その反応は、シリカゲルプレート(Merck)上、クロロホルム:メタノール(95:5)で展開される薄層クロマトグラフィーを用いてモニターされた。生産物のRf値は0.6であった。その反応混合物は、200mlの8%炭酸水素ナトリウム水溶液に加えられ、生産物はクロロホルムで抽出された。クロロホルム抽出物は減圧で蒸発され、得られた油状の第一中間体が次の合成段階に用いられた。
【0205】
12ミリモルの第1の中間体が、3.14ml(18ミリモル)のジイソプロピルエチルアミン(Aldrich)を含む30mlの無水1,4−ジオキサンに溶解された。10mlの無水1,4−ジオキサンに溶解された18ミリモルのサリチルクロロホスファイト(Sigma)が不活性アルゴン雰囲気下で少量ずつジイソプロピルエチルアミン溶液に加えられた。その反応混合物は20℃で1時間インキュベートされた。その反応物は、上記の液層クロマトグラフィーによりモニターされた。生産物のRf値は0.05であった。10mlの水が反応混合物に加えられた。30分後、溶媒は蒸発された。その生産物は100mlのクロロホルムに溶解され、得られた溶液は(1)100mlの8%炭酸水素ナトリウム水溶液、(2)100mlの0.2Mトリエチルアンモニウムアセテート溶液(pH7.2)、および(3)100mlの水を用いて段階的に洗浄された。有機溶媒は蒸発され、ホスホネートモノマーを含む油状の残渣が、(1)クロロホルム、(2)クロロホルム中の3%メタノール、および(3)クロロホルム中の6%メタノールの段階的な勾配を用いて、シリカゲルカラムによるクロマトグラフィーにより精製された。モノマーの収率は4.1g(=7.3ミリモル,63%)であった。その生産物は以下の構造:
【0206】
【化27】
【0207】
式中、DMTはジメトキシトリチル基を表す、を有し、「ホスホネートモノマーA」と称することができる。
【0208】
実施例19
ポリカチオンBDPの合成
無水ピリジン:アセトニトリル混合物(1:1)中のホスホネートモノマーAの0.05M溶液が、DNAシンセサイザー(型番380−B02、Applied Biosystems、CA)の6位に置かれた。アセトニトリル:ピリジン(95:5)混合物中のアダマントイルクロライド(Sigma)の2%溶液が、縮合剤として用いられた。その合成は、H−ホスホネートサイクル用に改変されたプログラム(Sinha and Striepeke、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Eckstein Ed. IRL Press, Oxford, p.185 (1991))を用いて行われ、DMT基は合成終了後保存されていた。標準CPG−500固形担体に固定化されたアデノシン(4μモル)が、ポリマー合成中の第一単位として用いられた(Vinogradov et al. BBRC, 203, 959 (1994))。シンセサイザーは、ホスホネートモノマーA反復単位をアデノシンモノマーに添加するようにプログラムされた。すべての合成段階に従って、無水ピリジン:CCl4(5:1)混合物0.6ml中のヘキサメチレンジアミン(Sigma)104mgの溶液を20℃で15分添加することにより、固定された基質上のH−ホスホネート基は酸化され、次いで担体はピリジン:アセトニトリル混合物(1:1)で洗浄された。
【0209】
非ブロック化およびキャップ除去は、アンモニア分解によって達成された(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Eckstein Ed. IRL Press, Oxford, 1991)。その生産物は、アセトニトリル勾配(0〜80%)中のシラソーブCカラム(9×250mm、Gilson, France)を用いたHPLCによって精製された。ジメトキシトリチル化産物を含むピークが回収され、溶媒は蒸発され、残渣は80%酢酸(20分)で処理された。その酢酸は蒸発され、ポリカチオンは再びHPLCで精製された。15−merの収率(ホスホネートモノマーAに関して計算された)は、50%(2.2μモル)であった。これにより式Aによるポリマーが生成した。該ポリマーは、以降「BDP」と称する。
【0210】
実施例20
ジブロックコポリマーポリオキシエチレン−BDPの固相合成
ジメトキシトリチル−ポリエチレンオキサイド−H−ホスホネートが、ブタンジオール−1,3の代わりにポリエチレングリコール(1500分子量、Flukaより得た)を用いた以外は、実施例18に記載されたように合成された。BDPポリカチオンは、鎖伸長の最終段階でジメトキシトリチル−ポリエチレンオキサイド−H−ホスホネートを最終構築ブロックとして導入した以外は、実施例19に記載されたように合成された。ブロックコポリマーのH−ホスホネート基は、ヘキサメチレンジアミンの代わりにテトラメチレンジアミン(Sigma)を用いて、実施例19に記載されたように酸化され、その結果ジアミンおよびリン酸主鎖の間にホスホンアミド結合が形成された。
【0211】
実施例21
オリゴヌクレオチド−BDPジブロックコポリマーの固相合成
12−merオリゴヌクレオチド、すなわち5’−GGTTCCTCCTGU(タイプ1の単純疱疹ウイルス(HSV−1)の初期のmRNAのスプライシング領域に相補的なオリゴA(Vinogradov et al.、BBRC、203:959 (1994))および、BDPポリマーを含むジブロックコポリマーが、DNAシンセセイターにより合成された。まずBDPポリマーが、担体から除去されなかったこと以外は実施例19に記載されたように合成された。次いでオリゴヌクレオチド鎖が、Vinogradov et al, BBRC, 203, 959 (1994)に記載された標準的なホスホロアミダイトケミストリーを用いて、固相状態の担体に結合したBDPポリカチオン性ポリマー上に段階的に合成された。ジブロックコポリマーのH−ホスホネート基は、ヘキサメチレンジアミンの代わりにテトラメチレンジアミン(Sigma)を用いて、実施例19に記載されたように酸化された。
【0212】
実施例22
ウイルス成長に対するオリゴヌクレオチド−BDPジブロックコポリマーの効果
本実験は、(1)実施例21のオリゴヌクレオチド−BDPコポリマーが用いられ、(2)単一の濃度(4.4M)のオリゴヌクレオチド−BDPコポリマーが用いられたこと以外は、実施例17に記載されたように行われた。
【0213】
【表17】
【0214】
実施例23
分岐状ポリイミンポリカチオンの合成
A.ポリイミンポリカチオン(「ポリスペルミン」)が、実施例13に記載されるのと同様にしてN−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンおよび1,4−ジブロモブタンの段階的な重縮合によって得られ、ポリ(エチレングリコール)へ結合させることなく用いられた。
【0215】
B.Aで合成されたポリイミンポリカチオンが、蛍光ダンシル標識基質を得るためにダンシルクロライドによって改変され、薄層クロマトグラフィーで精製され、混合物の主成分(多くのバッチで75%超)が、正荷電モードのエレクトロスプレーマススペクトロメトリーによって分析された。その結果が、塩化ダンシルを用いて改変されたN−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンについて得られたマススペクトルと比較された。ダンシル標識N−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンは、M+1、M+2、M+3、およびM+4(667.6、668.5、669.6、および670.5)の4形態のピークを与えた。重縮合産物のスペクトルにおいて、2つのタイプの多重モードピーク、MおよびM+54が観察された。M−ピークについては、M/2H+およびM/H+を有し、それぞれ598.5および1195.6に等しい二つの異なる基が観察された。この分子質量は12個の窒素原子を有する直鎖ポリカチオンに非常に近いものであった(1221)。1249.8および652.5におけるM+54ピークは、CH2CH2CH2CH2架橋を有するポリカチオンに対応する。
【0216】
C.Aで合成され、DMSOに溶解されたポリイミンポリカチオンのサンプルについての1H−NMRスペクトルが得られた。三種のシグナルが、1.40〜1.80ppm(Ha)、1.80〜2.20ppm(Hb)、および2.35〜2.80ppm(Hc)において観察された。HaはCH2CH2CH2CH2プロトンに関し、HbはCH2CH2CH2プロトンに関し、Hcは−NHCH2およびプロトンに関していた。これら3種についての共鳴シグナルの積分により、Ha:Hb:Hc=1.00:0.75:1.20という比が得られた。12個の窒素原子を有する直鎖ポリカチオンの理論的な比は1.00:1.33:3.67である。Hb:HaおよびHc:Ha比の増加により、第1級、第2級および第3級アミンの混合物を有する分岐状構造の存在が示唆された。
【0217】
D.Aで合成されたポリイミンポリカチオン中の第1級アミノ基の濃度は、Weigele et al., J. Amer. Chem. Soc., 94:5927 (1972)に記載されたフルオレスカミン方法によって測定された。重縮合産物中の第1級、第2級、および第3級アミノ基の総量は、電位差滴定を用いて測定された。第1級、第2級、および第3級アミノ基の総量の、第1級アミノ基の量に対する比は2.7であった。マススペクトロメトリーを用いて測定された縮合産物の分子質量により、顕著な分岐、すなわち第3級アミンの存在がこの実験結果から示唆された。
【0218】
実施例24
直鎖ポリイミンポリカチオンの合成
ポリイミン型の直鎖ポリカチオンは、Aziz et al., J. Pharmac. Exper. Therapeutics, 274:181 (1995)に記載された改変還元型アミノ化法を用いて、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でジアミノアルキルおよびビス−アルデヒドの縮合により合成される。0.33gのマロンアルデヒドビス(ジメチルアセタール)が10mlの0.5N HClに加えられ、20℃で1時間攪拌されて遊離のビス−アルデヒドを得た。1.27gのN,N’−ビス[3−アミノプロピル]−1,4−ブタンジアミンがこの溶液に加えられ、pHが5.0に調節された。この混合物は37℃で1時間放置され、次いで1.27gのN,N’−ビス[3−アミノプロピル]−1,4−ブタンジアミンがそれに加えられ、pHは炭酸ナトリウム溶液を用いて7.0に調節された。その反応混合物は0.26gの水素化シアノホウ素ナトリウムで処理され、さらに37℃で1時間放置された。最終的なわずかに黄色い溶液は、セファデックスG−25カラムを用いたゲル透過クロマトグラフィーにより10%メタノールで脱塩され、ニンヒドリン試験により第1級アミノ基と判明した第1の高分子量のフラクションが凍結乾燥された。以下のポリイミンポリカチオンの収率は、0.43gであった。
【0219】
【化28】
【0220】
実施例25
カチオン性ブロックコポリマーの合成
1.5gのポリ(エチレングリコール)、メチルエステル、分子量5000(Sigma)が、無水アセトニトリル10ml中の1,1’−カルボニルジイミダゾール0.25gによって室温で3時間活性化された。真空中で溶媒は蒸発され、その残渣が水に再溶解され、3500Daのカットオフを有するメンブラ−セル(Membra−Cel)MD−25−03.5メンブレンで水に対して透析された。脱塩された溶液は、真空中で濃縮され、メタノール−水溶液中で、2倍超の分子量4000のポリ−L−リジンとの、室温での16〜24時間の反応に用いられた。得られた結合体は、水中でのセファデックス−50(微細)(Pharmacia)を用いたゲル透過カラムクロマトグラフィー、次いでアセトニトリル濃度勾配中での半調製カラム(Vydac C18 5u, 10mm×25cm)を用いた逆相クロマトグラフィーによって、精製された。収率は70%であった。アミノ基の含有量はフルオレスカミン法によって測定され、総窒素含有量は元素分析によって測定され、結合体の純度が評価された。通常、重量に基づいて約75〜90%であった。
【0221】
実施例26
カチオン性ブロックコポリマーの合成
2倍超のポリ−L−リジンを同じく過量のポリエチレンイミン、すなわち分子量2000の
【0222】
【化29】
【0223】
で置き換える以外は実施例25の方法に従って、0.4gのカチオン性ジブロックコポリマー:
【0224】
【化30】
【0225】
が得られた。
【0226】
実施例27
グラフトコポリマーの合成
A.分子量8000のポリ(エチレングリコール)(Aldrich Co.)24g(3ミリモル)が、減圧下での無水ピリジンとの共沸により乾燥され、50mlの無水アセトニトリル中に溶解された。次いで、無水ピリジン30ml中の4,4’−ジメトキシトリチルクロライド0.51g(1.5ミリモル)が、30分間連続攪拌のもとこの溶液に滴下して加えられた。その混合物はさらに室温で2時間放置され、次いで、溶媒が真空中で蒸発された。残渣はジクロロメタン50mlに溶解され、5%炭酸水素ナトリウム(2×30ml)で抽出され、シリカゲルカラム(3×45cm、40〜60μm)に添加された。ジクロロメタン−メタノール溶液を用いた段階的な溶出によって、わずかに黄色のポリ(エチレングリコール)のモノ−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体が収率約75〜85%で分離された。この反応の副産物(収率10〜15%)は、ポリ(エチレングリコール)のビス−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体であった。
【0227】
B.Aで得られたポリ(エチレングリコール)のモノ−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体1.5gが、無水アセトニトリル10ml中の1,1’−カルボニルジイミダゾール0.25gによって、室温で3時間活性化された。減圧下で溶媒は蒸発され、残渣を水に再溶解され、3500Daのカットオフを有するメンブラ−セルMD−25−03.5メンブレンで水に対して透析された。脱塩された溶液は真空中で濃縮され、次いでメタノール−水の溶液中で分子量19000のポリ−L−リジンと、室温で24時間、ポリ(エチレングリコール)の、ポリ−L−リジンの遊離アミノ基に対するモル比が0.7:1.0で反応させた。得られた結合体は、水中でセファデックス−50(微細)(Pharmacia)を用いたゲル透過カラムクロマトグラフィーによって、次いでアセトニトリル濃度勾配中で半調製カラム(Vydac C18 5u, 10mm×25cm)を用いた逆相クロマトグラフィーによって精製された。これにより、グラフト化ポリリジンコポリマーは収率35%で得られ、それにおいてフルオレスカミン法によって測定されたところ、遊離アミノ基の50%がポリ(エチレングリコール)で置換されていた。
【0228】
実施例28
グラフトコポリマーの合成
A.分子量8000のポリ(エチレングリコール)(Aldrich Co.)24g(3ミリモル)が、真空中で、無水ピリジンとの共沸によって乾燥され、無水アセトニトリル50ml中に溶解された。次いで無水ピリジン30ml中の4,4’−ジメトキシトリチルクロライド0.51g(1.5ミリモル)が30分間攪拌しながらこの溶液に滴下して加えられた。その混合物はさらに室温で2時間静置され、次いで溶媒が真空中で蒸発された。その残渣はジクロロメタン50mlに溶解され、5%炭酸水素ナトリウム(2×30ml)で抽出され、シリカゲルカラム(3×45cm、40〜60μm)に添加された。ジクロロメタン−メタノール溶液を用いた段階的な溶出により、わずかに黄色の、ポリ(エチレングリコール)のモノ−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体が、約75〜85%の収率で分離された。この反応の副産物(収率10〜15%)は、ポリ(エチレングリコール)のビス−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体であった。
【0229】
B.Aで得られたポリ(エチレングリコール)のモノ−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体1.5gが、無水アセトニトリル10ml中の1,1’−カルボニルジイミダゾール0.25gによって、室温で3時間活性化された。真空中で溶媒は蒸発され、残渣を水に再溶解され、3500Daのカットオフを有するメンブラ−セルMD−25−03.5メンブレンで水に対して透析された。脱塩された溶液は真空中で濃縮され、次いでメタノール−水の溶液中の分子量25000のポリエチレンイミンと、室温で24時間、ポリ(エチレングリコール)の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.7:1.0で反応させた。得られた結合体は、水中でセファデックス−50(微細)(Pharmacia)を用いたゲル透過カラムクロマトグラフィーによって、次いでアセトニトリル濃度勾配中で半調製カラム(Vydac C18 5u, 10mm×25cm)を用いた逆相クロマトグラフィーによって精製された。これにより、グラフト化ポリエチレンイミンブロックコポリマーは収率85%で得られ、それにおいてWeigele et al.(J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94:5927)に記載されたフルオレスカミン法によって測定されたところ、遊離アミノ基の45%がポリ(エチレングリコール)で置換されていた。
【0230】
実施例29
グラフトコポリマーの合成
活性化されたポリ(エチレングリコール)のポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.3:1.0であること以外は実施例28の方法に従って、80%の収率でグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーを得、それにおいて遊離アミノ基の24%がポリ(エチレングリコール)で置換されていた。
【0231】
実施例30
カチオン性ブロックコポリマーの合成
分子量20,000のポリエチレングリコール6.0gの代わりに、過量の分子量5,000のポリエチレングリコールを用いた以外は実施例26の方法に従って、カチオン性ブロックコポリマー:
【0232】
【化31】
【0233】
を6.0g得た。
【0234】
実施例31
カチオン性ブロックコポリマーの合成
A.分子量5,000のポリエチレングリコール1.5gの代わりに、分子量5,000のポリエチレングリコール(Aldrich Co.)2.4gを用いた以外は、実施例26の方法に従って、ポリエチレンイミンおよびポリエチレングリコール鎖セグメントを含むカチオン性ブロックコポリマー1.2gを得た。
【0235】
B.このブロックコポリマーの分子質量は、15アングルで作動し、He−Neレーザー(632.8nm)を備えたDAWNマルチアングルレーザーフォトメーター(Wyatt Technology、Santa Barbara、CA)を用いた静電気光散乱法(static light scattering method)によって測定された。ブロックコポリマーのサンプルは、3500Daのカットオフを有する膜で4.5×10−3g/ml NaClに対して透析され、次いで、光散乱実験で用いられたフローセルに直接ろ過された。重量平均分子質量は、4回の測定に基づき計算された。セル定数(Cell constant)は、異なる濃度のNaClを用いた校正によって決定された。特異的な屈折率の増加(dn/dc)は、Wyatt/Optilab 903 干渉分析屈折率測定器を用い、632.8nmで測定された。得られたサンプルの分子質量は16,000であり、このポリマーはおおよそ一つのポリエチレンイミンセグメントおよび、二つのポリエチレングリコールセグメントを含むということが示唆された。
【0236】
C.合成されたコポリマーサンプル中の第1級アミノ基の数は、Weigele et al. (J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94:5927)に記載されている改変方法を用いて測定された。pH9.5の20mMホウ酸ナトリウム中のサンプル1.5ml(アミノ基の濃度は100μMまで)に、アセトン中のフルオレスカミン溶液(0.024%、Sigma)0.25mlが加えられ、5分間ボルテックスされた。島津の分光蛍光計を用い、励起波長384nmおよび発光波長430〜510nmの範囲においてこの測定はなされた。発光475nmにおける減衰係数は1.58×106M−1と測定された。第1級アミノ基の特異的な量は0.69ミリモル/gであった。
【0237】
実施例32
グラフトコポリマーの合成
ポリ(エチレングリコール)24gの代わりに、同量のプルロニックL61(BASF Co.)を用い、活性化されたプルロニックL61の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.3:1.0であること以外は実施例28の方法に従って、収率22%でグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーが得られ、それにおいて、遊離のアミノ基のうち8%がプルロニックL61で置換されていた。
【0238】
実施例33
グラフトコポリマーの合成
ポリ(エチレングリコール)24gの代わりに、同量のプルロニックP85を用い、活性化されたプルロニックP85の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.3:1.0であること以外は、実施例28の方法に従って、収率70%のグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーが得られ、それにおいてポリエチレンイミンの遊離アミノ基のうち11%がプルロニックP85で置換されていた。
【0239】
実施例34
グラフトコポリマーの合成
ポリ(エチレングリコール)24gの代わりに、同量のプルロニックP123(BASF Co.)を用い、活性化されたプルロニックP123の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.3:1.0であること以外は実施例28の方法に従って、収率30%でグラフト化ポリリジンコポリマーが得られ、それにおいて、遊離アミノ基の9%がプルロニックP123で置換されていた。
【0240】
実施例35
グラフトコポリマーの合成
ポリ(エチレングリコール)24gの代わりに、同量のプルロニックF38(BASF Co.)用い、活性化されたプルロニックF38の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.3:1.0であること以外は、実施例28の方法に従って、グラフト化ポリリジンコポリマーを収率40%が得られ、それにおいて、遊離のアミノ基の9%がプルロニックF38で置換されていた。
【0241】
実施例36
マルチグラフトコポリマーの合成
ポリエチレンイミンの代わりに、実施例35で得られたプルロニックL123(BASF Co.)で改変されたポリエチレンイミンを用い、活性化されたポリ(エチレングリコール)の、改変されたポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.4:1.0であること以外は、実施例28の方法に従って、収率20%でグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーが得られ、それにおいて、9%の遊離アミノ基がプルロニックL123で置換され、および30%の基がポリ(エチレングリコール)で置換されていた。
【0242】
実施例37
オリゴヌクレオチドを有する複合体
A.モデルのホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチドPS−dT20が、ABI291DNAシンセサイザー(Applied Biosystems、San Diego、CA)を標準的な方法に従って合成された。アンモニア脱保護後、オリゴヌクレオチドはエタノールで2回沈殿させ、精製しないで次に用いられた。
【0243】
B.PS−dT20および実施例28で得られたポリエチレンイミン−ポリ(エチレングリコール)ブロックコポリマーの間で形成された複合体が、該ブロックコポリマーの第1級アミノ基の、PS−dT20のリン酸電荷に対する比が1.0になるように、pH7.4の10mMリン酸緩衝液中のこれらのポリマーの水溶液を混合することによって得られた。すべての溶液は二重蒸留水を用いて調製され、孔サイズ0.22μMのミリポアメンブレンを通して繰り返しろ過された。
【0244】
C.Bで合成された複合体の電気泳動移動度(EPM)および粒子径が測定された。EPMの測定は、25℃で、15〜18V/cmの電場強度(electrical field strength)で、635nmのレーザー波長で稼動させた15mV固体レーザーを有する「ゼータプラス」ゼータポテンシャルアナライザー(Brookhaven Instrument Co.)を用いて測定された。粒子のゼータ電位は、スモルコウスキ方程式(Smoluchowski equation)を用いてEPM値から計算された。有効な流体力学的径は、マルチアングルオプション(Multi Angle Option)を備えた同器具を用いて光子相関分光分析法(photon correlation spectroscopy)によって測定された。粒子径測定は、25℃、角度90°でなされた。このサンプルのゼータ電位はゼロに近く、これは粒子が電気的に中性であることを示唆している。粒子の平均直径は35nmであった。
【0245】
実施例38
ヌクレアーゼ消化に対する安定性
PS−dT20および、実施例39で得られたポリエチレンイミン−ポリ(エチレングリコール)ブロックコポリマーとの間で形成された複合体100μgが、ヘビ毒であるホスホジエステラーゼ(Crotalus adamanteusからのホスホジエステラーゼI、0.024ユニット/mg、Sigma)1mgで2および18時間、37℃で処理された。反応混合物は、消化されたPS−dT20についてゲル透過HPLCで分析された。該複合体中のPS−dT20の消化は5%未満であった。それに対し、同じ酵素濃度で、同じ時間間隔処置された単独PS−dT20は完全に消化されていた。
【0246】
実施例39
Caco−2単層におけるオリゴヌクレオチドの蓄積
A.5’−アミノヘキシルPS−dT20オリゴヌクレオチドが、ABI291DNAシンセサイザー(Applied Biosystems、San Diego、CA)を用いて、標準的な方法に従って合成された。アンモニア脱保護後、オリゴヌクレオチドはエタノールにより2回沈殿され、精製しないで次に用いられた。5’−アミノヘキシルPS−dT20は、業者の方法に従って、フルオレセインイソチオシアネート(Sigma)との反応により標識された。フルオレセインラベルされたPS−ODNは、ファルマシアPD−10サイズエクスクルージョンを用いて、未反応の蛍光体から分離された。
【0247】
B.フルオレセインラベルされたPS−dT20および、ポリエチレンイミン−ポリ(エチレングリコール)ブロックコポリマーの間で形成された複合体は、PS−dT20の代わりにフルオレセインラベルされたPS−dT20を用いた以外は、実施例37に記載のように合成された。
【0248】
C.ヒト結腸直腸の癌腫由来のCaco−2細胞(Fogh et al. J. Natl. Cancer Inst., 59:221−226, 1977)は、Borchardt R.T.(The University of Kansas, Lawrence, Kansas)により親切にも提供されたものである。その細胞は、Artursson (J. Pharm. Sci., 79:476−482, 1990)に記載された通り、10%の熱で不活性化されたウシ胎児血清(FBS)、1%の非必須アミノ酸、ベンジルペニシリン(100μg/ml)およびストレプトマイシン(10μg/ml)を含むダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium )(DMEM)中、90%空気および10%CO2の雰囲気下で維持された。すべての組織培養培地は、Gibco Life Technologies, Inc.(Grand Island, NY)より得た。細胞は、コラーゲン被覆ポリカーボネートフィルターチャンバーインサート (Transwell、Costar Brand Tissue Culture Products、Contd.; 孔サイズ0.4μm;直径24.5mm)上で育てられた。250,000個の細胞が各インサートに添加され、継代数が32〜45回の細胞が用いられた。その細胞は2日ごとに供給され、単層が以下の吸収実験に用いられるまでの14日間、単層を成長および分化させた。
【0249】
D.Caco−2細胞単層は、37℃で、塩化ナトリウム(122mM)、炭酸水素ナトリウム(25mM)、グルコース(10mM)、HEPES(10mM)、塩化カリウム(3mM)、硫酸マグネシウム(1.2mM)、塩化カルシウム(1.4mM)およびリン酸水素二カリウム(0.4mM)を含む分析用緩衝液を用いて30分プレインキュベートされた。この後、この緩衝液は除去され、細胞は、分析用緩衝液中の50μMのフルオレセインラベルされたPS−ODNまたはその複合体に90分、37℃で曝露された。その後、染色液が除去され、細胞の単層は氷冷したPBSで3回洗浄された。次に細胞は1.0%トリトンX−100中に溶解され、その一部(25μl)が分取され、島津RF5000分光蛍光計をλex=488nm、λem=520nmで用いて細胞の蛍光が定量された。サンプルはまた、ピアスBCA法を用いたタンパク質定量のためにも分取された。
【0250】
細胞によって吸収された、フルオレセインラベルされたPS−dT20の量を以下に示す。
【0251】
【表18】
【0252】
これにより、ブロックコポリマーを有する複合体中へのポリヌクレオチドの取り込みは、細胞のポリヌクレオチドの蓄積を3倍超に増加させることが示された。
【0253】
実施例40
Caco−2単層を通過するオリゴヌクレオチドの輸送
A.フィルターで成長したCaco−2単層は、完全成熟した後、すなわち、塗布後14日から、オリゴヌクレオチド透過性研究のために用いられた。フィルターは穏やかにウェルから引き離され、Crown Bio. Scientific, Inc.(Somerville、NJ)の並列拡散セル(Side−Bi−Side diffusion cell)に置かれ、37℃±0.1℃で維持された。このシステムは、薬剤の経口バイオアベイラビリティーを評価するためのヒト腸上皮のin vitroモデルとして用いられる(Pauletti et al., Pharm, Res., 14:11−17 (1977)。細胞単層は、37℃で、10%の、熱で不活性化されたウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸、ベンジルペニシリン(100μg/ml)およびストレプトマイシン(10μg/ml)を含む分析用緩衝液を用いて30分プレインキュベートされ、ドナーおよびレセプター両方のチャンバー(3ml)に加えられた。プレインキュベート後、レセプター容器中の分析用緩衝液は新鮮なものと交換され、一方、ドナー容器中の分析用緩衝液は、分析用緩衝液の、フルオレセインラベルされたPS−ODNまたはその複合体50μM溶液と交換された。単層の完全性を説明するために、ドナー容器中のR123溶液はまた、H3−ラベルされたマニトール、パラセルラーマーカー(Dawson, J. Membrane Biol., 77:213−233 (1977) DuPont Corp.(Boston、MA)より得られる)を含んでいた。120分のとき、島津RF5000蛍光分光光度計(λex=488nm、λem=520nm)を用いた、フルオレセインラベルされたPS−ODNの定量、および、液体シンチレーションカウンター(Hewlett Packard Instruments)を用いたH3−マニトール定量のためにレセプターチャンバー中の溶液が除去された。レセプターチャンバー中の溶液を回収した後すぐに、3mlの新鮮な分析用緩衝液がこのチャンバーに加えられた。フルオレセインラベルされたPS−ODN(またはマニトール)のCaco−2細胞単層を通過した輸送が、レセプターチャンバー中に蓄積されたフルオレセインラベルされたPS−ODN(またはマニトール)の総量の、ドナーチャンバー中のフルオレセインラベルされたPS−ODN(またはマニトール)の初期量に対する百分率として示されている。それぞれの膜の複数の時点における各薬剤組成物について、三つの異なる膜の最小値が解析された。結果を以下に示す。
【0254】
【表19】
【0255】
これにより、ブロックコポリマーを有する複合体中へのポリヌクレオチドの組み込みは、Caco−2単層を通過するこのポリヌクレオチドの輸送を7倍超に増加させ、その一方でパラセルラーマーカーの輸送が影響を受けないことが示された。
【0256】
実施例41
様々なブロックコポリマーに基づく配合物によるプラスミドDNAの
in vitro での形質移入
これらの実験はCos−7細胞で実施され、以下のように行われる;Cos−7細胞が用いられ、12−ウェルプレート(Costar)に、ウェルあたり7×105個播種され、形質移入前に24時間静置される(70%の濃度)。3μgのpGL3−LucSV40が、様々なN/P比で異なるポリヌクレオチドと配合される。形質移入混合物を以下のように調製する。1%Hepesが添加された100μlのDMEMを含むエッペンドルフチューブに、以下のものが加えられる;0.1mg/mlのDNA30μl、様々なN/P比を得るための様々な濃度の試験用ポリマー35μl。形質移入混合物は5分間インキュベートされ、完全DMEM(10%FBS、1%Hepes、1%ペニシリン−ストレプトマイシン)を用いて1mlにされる。ウェルあたり500□lの形質移入混合物が添加される。37℃および5%CO2の雰囲気下での4時間の形質移入の後、細胞はPBSでリンスされ、1mlの完全DMEM中で一晩静置され、ルシフェラーゼ分析を行うために、Promega Corporationの推奨に従って回収される。簡潔に言うと、細胞は氷上で30分溶解され、次いで13000gで2分間遠心分離される。上清は保存されルシフェラーゼ活性を分析される。分析は以下のように行われた。20□lの上清が、100□lのルシフェラーゼ基質を含む光測定用チューブに加えられる。発光はルミノメーター(Berthold)で5秒間測定される。データは秒あたりの相対的な光単位で報告され、BiCinchoninic Acid assay kit (Sigma)を用いてタンパク質に対して標準化される。結果は、PEIに結合したプルロニックP123は、PEI単独に比べて、CMV−Lucの形質移入を改善することを示し、これにより、ブロックコポリマー部分がより優れた形質移入に有利であることを示唆している。P123単独では細胞を形質移入せず、CMV−Luc単独のように全く役に立たない、ということに留意すること。この観察は、P123が筋肉内での遺伝子発現を促進させるために用いられている、実施例44に示されたデータと対照的である。
【0257】
【表20】
【0258】
実施例42
DNAの生体内分布の生物学的調節剤としてのブロックコポリマー
CMV−Luc(50μg)またはオリゴヌクレオチド(100μg)が、様々なブロックコポリマーに基づいた配合物を含むように200ulに再懸濁され、C57Bl/6雌マウス(6〜8週齢)に静脈内注射される。注射の24時間後、マウスは剖検され、ルシフェラーゼ活性が測定され、またはオリゴヌクレオチド蓄積が定量されるための様々な臓器が採取される。プラスミドDNAについては、すべての主要な臓器が、タンパク質分解酵素阻害剤を添加された細胞溶解用緩衝液(Promega Corporation)中で組織粉砕機(Kontes Glass Co.)を用いて迅速にホモジナイズされる。その抽出混合物は、氷上で30分静置され、最高速度で2分間遠心分離される。その上清は保存され、ルシフェラーゼ活性を分析される。分析は以下のように行われる:20μlの上清が、ルシフェラーゼ基質(Promega Corporation)100μlを含む光測定用チューブに加えられる。発光は、ルミノメーター(Berthold)で5秒間測定される。そのデータは、タンパク質1mgあたりのルシフェラーゼのpgとして報告される。オリゴヌクレオチドについては、主要な臓器がフェノール:クロロホルムで2回抽出され、エタノールで沈殿された後、定量される。この結果は、従来のリポソーム性配合物およびPEIを用いると遺伝子発現は肺に集中することを示し、このことは肺動脈塞栓症の危険を増加させると知られている因子の一つである。しかしながら、P123のような疎水性ブロックコポリマーに結合されたPEIと配合されると、遺伝子発現は肝臓の方へ転換される。加えて、P123が単独で用いられる場合、様々な臓器における遺伝子発現は、筋肉組織を除いて非常に低い。オリゴヌクレオチドについて、その蓄積は、疎水性キャリアー(PEGに結合されたPEI)が用いられる場合腎臓で観察され、疎水性キャリアー(P85−PEI/P85)が用いられる場合は肝臓の方へ転換される。体の様々な領域における遺伝子発現およびオリゴヌクレオチドの蓄積を転換し得る広範囲の疎水性および親水性バランスを付与するために、多種多様のブロックコポリマー混合物が調製され得る。
【0259】
【表21】
【0260】
実施例43
ブロックコポリマーを用いた筋肉内での形質移入
この実験においては、4匹のグループで飼育され自由にえさを与えられたC57Bl/6雌マウス(6〜7週齢)の筋肉(前脛骨筋)において遺伝子発現を促進するために、ブロックコポリマーが用いられる。ルシフェラーゼをコードするCMV誘導性プラスミドDNA5μgがブロックコポリマーと配合され、前脛骨筋に筋肉注射された。各筋肉注射の前に、マウスはケタミンおよびキシラジンの混合溶液を用いて麻酔される。筋肉注射5日後にマウスは殺され、注射された各筋肉は切除され、タンパク質分解酵素阻害剤を添加された細胞溶解用緩衝液(Promega Corporation)中で組織グラインダー(Kontes Glass Co.)を用いて迅速にホモジナイズされる。抽出混合物は氷上で30分間静置され、次いで最高速度で2分間遠心分離される。上清は保存され、ルシフェラーゼ活性が測定される。分析は以下のようになされる。20μlの上清が、100μlのルシフェラーゼ基質(Promega Corporation)を含む光測定用のチューブに加えられる。発光はルミノメーター(Berthold)で5秒間測定される。そのデータは、前脛骨筋あたりの相対的な光単位として報告される。下記の表に示すように、ブロックコポリマーは、注射して5日後に測定される遺伝子発現を促進する。カチオン性試薬の使用は遺伝子発現を改善せず阻害した。この改善の理由は、筋肉細胞の表面張力を変え、それによって筋管におけるプラスミドDNAの取り込みを増加させる、というブロックコポリマーの特性にあるのかもしれない。
【0261】
【表22】
【0262】
実施例44
筋肉中での遺伝子発現を改善するブロックコポリマーの濃度
これらの実験は、筋肉注射に用いられるブロックコポリマーの濃度が滴定されたこと以外は実施例43と同様に行われる。プラスミドDNAの筋肉内へ移入するために用いられるブロックコポリマーの濃度は低い。筋肉内注射のために用いられたブロックコポリマーの濃度はゲルを形成しない。ブロックコポリマーの溶液は、ブロックポリマーのミセルおよびユニマー中に存在する。筋肉内の遺伝子発現を改善する濃度は、以下に矢印で示されるように0.1%より低い。この濃度は、同じブロックコポリマーが静脈内注射された場合の最大許容量より約100倍低い。また、ブロックコポリマーの組み合わせには、さらに遺伝子発現を改善できるものもある。
【0263】
【表23】
【0264】
【表24】
【0265】
実施例45
ブロックコポリマーを用いた遺伝子発現の延長
この実験においては、筋肉が48時間および2週間後に採取された以外は実施例43と同様に、ルシフェラーゼをコードするプラスミドDNAがブロックコポリマーと配合された。以下の表に示すように、遺伝子発現はブロックコポリマーによって延長された。
【0266】
【表25】
【0267】
実施例46
ブロックコポリマーを用いた筋肉における遺伝子発現の速度論
動態実験は、筋肉が1、2、3、4、および7日目に採取された以外は実施例43に記載されたような条件でなされた。以下の表に示すように、遺伝子発現は、ブロックコポリマーを有するものでより早く始まっており、7日を越えて同じレベルで持続した。
【0268】
【表26】
【0269】
実施例47
筋肉内での遺伝子発現の種間比較
2つの異なる種、すなわちマウスとラットとに注射される以外は実施例43におけるように、ブロックコポリマーはプラスミドDNAを配合するために用いられた。6〜8週齢のマウスおよび3月齢のラットの前脛骨筋が、筋肉注射48時間後に採取された。以下に示される表より、二つの仮説が立てられる;(1)ブロックコポリマーは2以上の種に適用されることができ、ヒトのような異なる種に適用され得る、および(2)ブロックコポリマーは成長した動物において遺伝子発現を促進し、これは、ブロックコポリマーが成熟した筋原繊維の形質移入を容易にしていることを示唆している。
【0270】
【表27】
【0271】
実施例47A
プルロニック(登録商標)F127およびスペルミンの結合体
ポリ(エチレングリコール)24gの代わりに同量のプルロニック(登録商標)F127(BASF Co.)を用い、分子量.25,000のポリエチレンイミンの代わりにスペルミン(Sigma−Aldrich、St−Louis)を用い、さらに1,1’−カルボニルジイミダゾールによって活性化されたポリ(エチレングリコール)10gあたり、スペルミン10gを超過するモル量を用いたこと以外は実施例28の方法に従って、スペルミンに結合されたプルロニック(登録商標)F127が得られた。スペルミンが結合したプルロニック(登録商標)F127が15g、この方法により生成された。
【0272】
実施例47B
スペルミンに結合されたブロックコポリマーを用いた筋肉内形質移入
この実施例においては、プルロニック(登録商標)F127が実施例47Aに記載されたようにスペルミンに結合され、6〜8週齢のC57Bl/6マウスの前脛骨筋にプラスミドDNAを形質移入するのに用いられた。マウスは5匹のグループで飼育され、自由にえさを与えられた。ルシフェラーゼをコードするCMV誘導性プラスミドDNA5μgがスペルミンに結合されたF127と配合され、前脛骨筋に注射された。その他の方法は実施例43と同様である。データを下記の表に示す。このデータは、F127と結合され、DNAと配合されたスペルミンが、裸のDNAと比較して導入遺伝子の発現を増加させることを示している。
【0273】
【表28】
【0274】
実施例47C
スペルミンと混合されたブロックコポリマーを用いた筋肉内形質移入
この実施例においては、プルロニック(登録商標)F127はスペルミンと混合され、プラスミドDNAを6〜8週齢のC57Bl/6マウスの前脛骨筋に形質移入するために用いられた。マウスは5匹のグループで飼育され、自由にえさを与えられた。ルシフェラーゼをコードするCMV誘導性プラスミドDNA5μgが、スペルミンと混合されたF127と配合され、前脛骨筋に注射された。その他の方法は実施例43と同様である。データを下記の表に示す。このデータは、プルロニックブロックコポリマーと混合されたスペルミンは形質移入率を増加させることを示している。
【0275】
【表29】
【0276】
実施例48
ブロックコポリマーを用いた虚血性組織の治療
ウサギの片方の後肢で虚血が誘導されてから10日後に、500□gのphVEGF165(または、塩基性FGFのような、副行血管の形成を促進することが知られている成長因子をコードする、他のいずれかのDNAプラスミド)が0.1%w/vのブロックコポリマーと配合され、虚血の後肢筋肉に筋肉注射された(Tsurumi Y. et al., Circulation, 94:12, 3281−90 (1996))。30日後、副行血管を確認するために血管造影が行われ、毛細血管を確認するために組織学的分析が行われた。虚血性の骨格筋は、ブロックコポリマーと配合された裸のプラスミドDNAを用いた遺伝子治療のための有望な標的を象徴している。血管形成サイトカインをコードする遺伝子、特に損傷のない細胞により本来分泌される遺伝子の筋肉注射による形質移入は、広範な末梢血管疾患を有する患者のための代替治療方法となるかもしれない。
【0277】
実施例49
遺伝子に基づくワクチン投与に用いられるブロックコポリマー
ブロックコポリマーは、疾患(ガン、ウイルス感染、など)に関連する様々な抗原に対するすべての体液性および細胞性免疫応答を引き起こすために用いられ得る。以下の実施例は、HIVに焦点をあてているが、これに限定されない。HIVのgp120遺伝子にありサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターによって誘導されるプラスミドDNA構造を含むブロックコポリマー配合物が調製された。5μgのgp120プラスミドDNAおよび0.01%のブロックコポリマーを含む、50μlのブロックコポリマー配合物が調製され、前脛骨筋に注射された。注射より約2週間後、筋肉が注射した部位から切除され、実施例41の方法に従って細胞溶解物として調製され、ELISAキット(Abbot Labs、Chicago、IL)を用いてgp120の存在を検出する。プラスミドDNAをワクチン接種したマウス血清中に存在するgp120抗体のHIV感染防御能力は、HT4−6Cプラーク還元分析により以下のように測定される。HT4−6C細胞(CD4+HeLa細胞)がRPMI培地(BRL、Gaithersburg、Md.)中で培養される。次いで細胞群がバッチに分割される。いくつかのバッチは、約105〜106感染単位のHIVを、約107個のHT4−6C細胞に加えることによりHIV感染させる。その他のバッチは、HIVおよび、gp120プラスミドDNAをワクチン投与されたマウスの血清約50μlの両方を添加することにより、HIV感染に対するgp120免疫血清の防御効果を試験される。インキュベーション3日後、すべてのバッチの細胞は洗浄され、固定され、クリスタルバイオレットを用いて染色され、プラークの数が計測された。gp120プラスミドDNA−ワクチン投与されたマウスの血清およびHIVの両方で処置される細胞のバッチにおけるプラーク数の減少を、HIV単独で処置されたバッチの数と比較して、gp120免疫血清の防御効果が測定される。
【0278】
実施例50
ジストロフィーのマウス筋肉における In vivo でのジストロフィンの機能発現
完全なジストロフィンコード領域およびSV40ポリを含むXp21プラスミドから、ラウス肉腫ウイルスプロモーター制御下のジストロフィン遺伝子を含むプラスミドが調製される。ジストロフィン異常性デュシェンヌ/ベッヘ筋肉(Duchenne’s/Becher Muscular)0.1%ブロックコポリマー溶液100μl中の200μgのこのプラスミドが、ジストロフィン遺伝子産物を欠損した変異マウス系(MDXマウス;Jackson labs)の四頭筋(quadriceps)に注射される。Watkins et al.に記載された方法に従った、および同じ抗ジストロフィン抗体(蛍光性二次抗体を有する抗60kdの抗体)を用いた免疫組織化学によって機能性ジストロフィンの発現が注射後7日間モニターされる。ジストロフィーマウスにおけるジストロフィン遺伝子産物の機能発現は、注射された動物の四頭筋の断面図において観察される蛍光のパターンを正常な動物において観察される蛍光パターンと比較することによって検出される。Watkins S. C., Hoffman E. P., Slayter H. S., Kinkel L. M., Immunoelectron microscopic localization of dystrophin in myofibres, Nature, June 30, 1988; 333 (6176:863−6)。正常なジストロフィン発現は、筋線維の原形質膜の下に局在化しているため、四頭筋の断面図においては細胞を取り囲む蛍光パターンを示す。さらに、ジストロフィン発現は、精製された抗60kd抗体の親和性を用いたウエスタンブロット分析によって定量される。
【0279】
実施例51
ブロックコポリマーの組み合わせが、皮内投与に続く遺伝子発現を改善する
この実験においては、5匹のグループで飼育され自由にえさを与えられたC57B1/6雌マウス(6〜7週齢)の皮膚において遺伝子発現を促進するために、ブロックコポリマーが用いられる。5ugのプラスミドpCMV−Lucが、ブロックコポリマープルロニック(登録商標)F127/L61の組み合わせを含む溶液50ulと配合された。プラスミドpCMV−Lucは、ケベック大学、INRS−IAFのアルバート デスコトウ博士(Dr. Albert Descoteaux)からの寄贈であった。ブロックコポリマーは、最終濃度0.01%w:vで、w:w比が8:1(F127:L61)であった。この配合物は、少なくとも5匹のC57Bl/57マウスの尾の付け根に注射された。7日後、実施例42のように、注射した部位の周囲の皮膚および組織が回収され、抽出されて、ルシフェラーゼ活性をモニターした。ルシフェラーゼ活性は実施例42に記載されたように測定された。以下のデータが得られ、活性レベルは、生理的食塩水中の裸のDNAのみが与えられた対照マウスのレベルと比較された。
【0280】
この結果は、ブロックコポリマーを組み合わされて配合されたプラスミドDNAは、ブロックコポリマーなしで投与されたDNAと比べて20倍高いレベルのルシフェラーゼ遺伝子発現を示すということを示している。
【0281】
実施例52
ブロックコポリマーの組み合わせは、皮内注射されたDNA組成物に対する
体液性免疫応答を改善する
この実験において、ブロックコポリマーは、5匹のグループで飼育され、自由にえさを与えられたC57Bl/57雌マウス(6〜7週齢)に皮内注射されたDNA分子によってコードされるタンパク質に対する液性免疫応答を改善するために用いられる。C57B1/57マウスは、プルロニック(登録商標)F127/L61のブロックコポリマーの組み合わせを含むまたは含まないpCMV−Bgal(β−ガラクトシダーゼタンパク質をコードしている)の5ugを皮内注射された。その配合物は、実施例51に記載されたように調製された。血液サンプルは、注射から2および4週後に回収され、β−ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫反応をモニターした。特異的な抗β−ガラクトシダーゼ抗体の検出は、ELISAによって測定された。
【0282】
ELISAは、96−ウェルプレート中で一晩、β−ガラクトシダーゼを吸着させることによって行われた。一連の希釈された血清を加える前に、プレートはPBS−BSA1%で2時間ブロックされた。1時間のインキュベーションの後、血清は除去され、プレートはPBS−トゥイーン0.01%で2回リンスされ、二次抗体(ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗マウスIgG)がプレートに加えられた。ABTS基質の添加の前に、プレートはPBS−トゥイーン(登録商標)0.01%で2回リンスされた。
【0283】
データは、抗原に応答したマウスの百分率および応答したマウスの平均力価で表されている。すべての非配合pCMV−Bgalを注射されたマウスは抗原に応答しなかった。しかしながら、接種から2および4週間後、ブロックコポリマーと組み合わされて配合されたpCMV−Bgalを注射されたマウスのそれぞれ33%および66%が応答した。この実施例は、ブロックコポリマーはプラスミドによってコードされるタンパク質に対する免疫応答を増強させるということを示している。
【0284】
【表30】
【0285】
実施例53
ブロックコポリマーの組み合わせは、ブタ生殖および呼吸器症候群ウイルス
(PRRSV)の防御性表面抗原(ORF5)に対する体液性免疫反応を改善した
この実験において、ブロックコポリマーと組み合わされて配合され、皮内に注射されたプラスミドpCMV−ORF5は、コードされたタンパク質に対する免疫応答を改善した。4匹のグループで飼育されたBalb/Cマウス(6〜7週齢)は、ブロックコポリマーの組み合わせを含むまたは含まないプラスミドpCMV−ORF5(GP5タンパク質をコードしている)の5ugを皮内に注射された。その配合物は実施例51に記載されたように調製された。血液サンプルは接種から3および5週間後に回収され、GP5に特異的な液性免疫応答をモニターした。血液採取後のはじめの3週後に追加免疫がなされた。
【0286】
この結果は、抗−GP5抗体の平均力価が増加していることによって示されるように、ブロックコポリマーの組み合わせと配合されたpCMV−ORF5を注射されたマウスは、プラスミドDNA単独を投与されたマウスに比べてより強い液性免疫応答を引き起こすということを証明している。
【0287】
【表31】
【0288】
実施例54
単一のブロックコポリマーは、皮内投与されたDNA組成物に対する
体液性免疫反応を改善する
この実験においては、C57Bl/57マウス(6〜8週齢および、サンプルセットあたりマウス6匹)が、プルロニック(登録商標)85を最終濃度0.1%または0.01で含むまたは含まないpCMV−Bgalの5または50ugを皮内注射された。接種後2および4週間後に血液サンプルは回収され、β−ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫反応をモニターした。特異的な抗β−ガラクトシダーゼ抗体の検出は、実施例52のようにELISAによって測定された。
【0289】
データは、β−ガラクトシダーゼに応答したマウスの百分率、および応答したマウスの抗β−ガラクトシダーゼ抗体の平均力価として表される。この結果は、非配合のpCMV−Bgalを注射されたマウスのβ−ガラクトシダーゼに応答した数は、プルロニック(登録商標)P85と配合されたpCMV−Bgalを注射されたマウスに比べて少なかったということを示している。どちらの濃度のプラスミドDNAを投与されたマウスにおいてもこのような差が生じた。また、プルロニック(登録商標)P85と配合されたpCMV−Bgalを注射されたマウスにおける力価は、非配合のpCMV−Bgalを投与されたマウスよりも高かった。0.1%の濃度でプルロニックP85を用いた応答がより弱いのは、より低い遺伝子発現に起因するものであろう。0.01%のP85は、よりよい免疫応答を引き起こすより高い遺伝子発現をもたらすのに、より適切な濃度である。
【0290】
【表32】
【0291】
【表33】
【0292】
実施例55
単一のブロックコポリマーは、筋肉内投与されたDNA組成物に対する
体液性免疫反応を改善する
この実験において、C57B1/マウスは、DNA組成物を筋肉内注射したあとの免疫応答の改善を示した。C57Bl/57(6〜7週齢)雌マウスは、プルロニック(登録商標)85を含むまたは含まないpCMV−Bgalの5および50ugを筋肉内注射された。6匹のマウスが各サンプル配合物を注射された。この配合物は実施例51に記載されたように調製された。血液サンプルは接種後2および4週間後に回収され、□ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫反応をモニターした。特異的な抗β−ガラクトシダーゼ抗体の検出は、実施例52に記載されたようにELISAにより測定された。
【0293】
データは、抗原に応答したマウスの百分率、および応答したマウスの平均力価として表される。このデータは、2週間後、5ugのpCMV−Bgal単独を注射されたマウスのすべてが免疫応答を示さなかったということを示している。しかしながら、プルロニック(登録商標)85と配合されたpCMV−Bgalを注射されたマウスはすべて免疫反応を示した。プルロニック(登録商標)85と配合されたpCMV−Bgalを注射されたマウスの抗β−ガラクトシダーゼ抗体の力価は、pCMV−Bgal単独を注射されたマウスよりも常に高かった。
【0294】
【表34】
【0295】
【表35】
【0296】
実施例56
ブロックコポリマーの組み合わせは、筋肉内投与されたDNA組成物に対する
体液性免疫反応を改善する
この実験において、ブロックコポリマーは、7匹のグループで飼育されたC57B1/57(6〜7週齢)雌マウスの筋肉(前脛骨筋)における液性免疫応答を改善するために用いられる。C57Bl/57マウスは、ブロックコポリマーの組み合わせを含むまたは含まないpCMV−Bgalの5または50ugを筋肉内注射された。この配合物は実施例51に記載されたように調製された。2および4週間後に血液サンプルは回収され、□−ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫応答をモニターした。特異的な抗体の検出は、実施例52に記載されたようにELISAによって測定された。
【0297】
データは、抗原に応答したマウスの百分率、および応答したマウスの平均力価として表される。このデータは、マウスがブロックコポリマーと配合されたDNAを投与された場合:(1)追加の注射または追加免疫が必要ない、(2)マウスを免疫化するのにより少量のDNAしか必要としない、および(3)免疫反応が始まる時間がより短い、ということを示している。
【0298】
【表36】
【0299】
【表37】
【0300】
実施例57
ブロックコポリマーの組み合わせはブタおよびマウスにおいて
PRRSVウイルスの防御性表面抗原に対する体液性免疫反応を改善する
ブタおよびBalb/C、CD1マウス(少なくとも5匹の動物、すべて雌)は、ブロックコポリマーの組み合わせ(プルロニック(登録商標)F127/L61)を含むまたは含まない、PRRSVウイルスのORF5遺伝子(GP5タンパク質をコードする)を含むアデノウイルスを、0および21日に皮内注射された。この配合物は実施例51に記載されたように調製された。50日後、これらの動物はPRRSVウイルスで刺激された。刺激してから7日後に血液サンプルが回収され、GP5に特異的な体液性免疫応答をモニターした。
【0301】
この結果は、GP5に対するウエスタンブロットによって示されたように、プルロニック(登録商標)F127/L61を配合されたアデノウイルスを投与された動物のみが、免疫記憶を引き起こした。
【0302】
実施例58
ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーの
溶液挙動
ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーが、10μM、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に、またはウシ血清アルブミン(BSA)の2.5%PBS溶液中に、以下に示す濃度で溶解され、その混合物は、少なくとも1時間、22.5℃または37℃でインキュベートされた。次いで、これらの系において形成された凝集体の有効径が、Kabanov et al., Macromolecules 28:2303−2314 (1995)に記載された準弾性光散乱法により測定された。結果を以下に示す。
【0303】
【表38】
【0304】
【0305】
「ND」:検出不可
「LPS」:液相分離
(*) 光散乱測定には濁度が高すぎる
これらの結果は、(1)プロピレンオキサイド含有量が50%(w/v)以上である疎水性ポリ(エチレンオキサイド)−ポリ(プロピレンオキサイド)ブロックコポリマーが、生理的温度で、水溶液中で凝集する傾向を明らかに示す、(2)これらのコポリマーの凝集および相分離は、血清タンパク質の存在下で顕著に増強される、ということを示している。
【0306】
実施例59
疎水性プルロニックコポリマーの溶液挙動に対する
親水性プルロニックコポリマーの効果
二つの異なるポリ(エチレンオキサイド)−ポリ(プロピレンオキサイド)ブロックコポリマーの混合物の代わりに単一のコポリマーを用いたこと以外は、実施例58と同じ方法。結果を以下に示す。
【0307】
【表39】
【0308】
【0309】
「ND」:検出不可
(*) 光散乱測定には濁度が高すぎる
これらの結果は、(1)エチレンオキサイド含有量が50%(w/v)超の親水性ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーは、生理的温度において、プロピレンオキサイド含有量が50%(w/v)以上の疎水性親水性ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーの凝集を妨げる、(2)エチレンオキサイド含有量が50%(w/v)超の親水性ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーは、血清タンパク質の存在下で、プロピレンオキサイド含有量が50%以上の疎水性親水性ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーの凝集を妨げる、ことを示している。これらのデータはまた、ブロックコポリマーの混合物が用いられた場合、エチレンオキサイド含有量が70%以上の親水性ブロックコポリマーが好ましく、プルロニック(登録商標)F127が特に好ましいということを示している。
【0310】
実施例60
pCMV−βgal/プルロニックF127/プルロニックL61を注射した
筋肉からの浸潤細胞の単離
C57/Bl/6マウスが、50μL食塩水中の50μgのpCMV−βgal、またはプルロニックF127およびプルロニックL61の混合物を含む溶液50μL中の50μgのpCMV−βgalを筋肉内に投与された。プルロニックF127およびプルロニックL61の混合物は実施例51に記載されたように、ブロックコポリマー質量比が8:1(F127:L61)となるように調製された。注入5日後、筋肉は、スライスして免疫組織化学分析を行うために凍結、あるいは、浸潤細胞を機械的に単離するために回収された。次いで筋肉断片は、遺伝子発現および浸潤細胞の位置を特定し、その量を測定するために、x−galおよびヘマトキシリン−エオジンで染色された。その結果、pCMV−βgal/プルロニックF127/プルロニックL61を注入された筋肉は10倍高いx−gal染色を示し、配合されたDNAの場合、裸のpCMV−βgalと比較して、組織の導入遺伝子発現部位において、それに比例したより多くの浸潤白血球が確認された。次いで筋肉断片は、注射後の筋肉における浸潤白血球の細胞タイプを決定する目的で、免疫組織化学分析を行うために用いられた。さらに、浸潤細胞は筋肉から抽出され、フローサイトメトリー分析を行った。単離された細胞がT細胞かどうか決定するためにCD3、CD4、CD8およびCD11a分子マーカーに対する抗体が選択され、該細胞がB細胞かどうか決定するためにB220分子に対する抗体が選択され、該細胞がナチュラルキラー細胞かどうか決定するためにNK1.1分子に対する抗体が用いられ、該細胞が浸潤好中球かどうか決定するためにGr−1マーカーに対する抗体が用いられ、該細胞がマクロファージかどうか決定するためにMac−1分子に対する抗体が用いられた。これらの研究の結果、単離された細胞の大部分が、分析されたマーカー抗原をどれも発現していないということが判明した。上記の表面マーカーを発現していない(下記の結果参照)ことが知られている唯一の浸潤細胞は、未熟な樹状細胞である。
【0311】
【表40】
【0312】
pCMV−βgal/プルロニックF127/プルロニックL61を注射された筋肉中の浸潤細胞のフェノタイピング
実施例61
浸潤細胞のフェノタイプの同定
プルロニックF127/プルロニックL61単独、pCMVβgal、pCMVβgal/プルロニックF127/プルロニックL61、pCMV(空ベクター)および空ベクター/プルロニックF127/プルロニックL61を注射されたマウスの筋肉の細胞が単離され、樹状細胞の増殖に有利な条件で培養された。さらに明確には、上記の群の細胞が、等量、96−ウェルプレートにおいて平板培養された。GM−CSF(DCの分化を活性化すると知られている増殖因子)、GM−CSF+IL−4、およびLPS(同様にDCの刺激剤として知られている)を用いた恒常的な刺激のもとで7日後、pCMVβgal/プルロニックF127/プルロニックL61を注射された筋肉から単離された細胞のみが増殖し、樹状突起(スパイクおよびベール)を示していた(下記の結果参照)。
【0313】
【表41】
【0314】
実施例62
プルロニックF127/プルロニック61のプロモーター依存性効果
この実験において、プルロニックF127/プルロニック61は、4匹のグループで飼育され、自由に飼料を与えられた、C57B1/6(6〜7週齢)雌マウスの筋肉(前脛骨筋)における遺伝子発現(転写)に対するその効果を測定するために用いられた。5μgの、ルシフェラーゼをコードするCMV−、5V40−、AP−1、NF−κB−誘導性プラスミドDNAがプルロニックF127/プルロニック61と配合され、または配合されず、前脛骨筋に筋肉内注射される。各注射前に、ケタミンおよびキシラジンの混合液を用いてマウスは麻酔される。注入5日後にマウスは殺され、注射された各筋肉は切除され、タンパク質分解酵素阻害剤が添加された細胞溶解緩衝液(Promega Corporation)中のポリトロンを用いて迅速にホモジナイズされる。抽出物は氷上で30分間保存され、次いで、最大速度で2分間遠心分離される。上清は保存され、ルシフェラーゼ活性が測定される。測定は以下のように行われる:100μLのルシフェラーゼ基質(Promega Corporation)を含む光測定用チューブに、20μLの上清が加えられる。発光はルミノメーター(Berthold)を用いて5秒間測定される。データはまずは1秒あたり、前脛骨筋あたりの相対的な光単位であるが、次いで、裸のDNAに比較しての増加の百分率として報告される。下記の表に示されるように、プルロニックF127/プルロニック61はプロモーター依存性を有し、特異な転写を誘導する。
【0315】
【表42】
【0316】
実施例63
プルロニックF127/プルロニック61は浸潤細胞(樹状細胞)において
抗原の取り込みを増加させる
前脛骨筋は、注入5日後に回収され(50μg/筋)、切除され、2mLの完全RPMI中で機械的な力によって切り刻まれた。筋の小片の懸濁液は、磁石棒を用いて10分間かき混ぜられ、浸潤細胞が抽出された。抽出された細胞は、無菌のガラスウール栓を有する漏斗を通してろ過することで回収された。残った筋肉片は、2mLの完全培地を加え、上記の操作を繰り返すことによってもう2回抽出された。細胞懸濁液はプールされ、4℃、1200rpmで10分間遠心分離された。細胞のペレットは、エッペンドルフチューブあたり1×106細胞の細胞密度を得るように再懸濁された。細胞は次いで溶解緩衝液中で30分間抽出され、その後最大速度で2分間遠心分離される。上清は保存され、ルシフェラーゼ活性が測定される。測定は以下のように行われる:100μLのルシフェラーゼ基質(Promega Corporation)を含む光測定用チューブに、20μLの上清が加えられる。発光はルミノメーター(Berthold)を用いて5秒間測定される。データは1秒あたり、前脛骨筋あたりの相対的な光単位として報告される。
【0317】
【表43】
【0318】
当業者にとって明白である開示された本発明の様々な改変、改良および用途が存在するであろうし、本出願はこれらの実施形態を包含することを意図している。本発明は特定の好ましい実施形態において説明されたが、これらの全範囲は以下の特許請求の範囲を参照することによって判断されることを意図している。
【0319】
ここで引用された様々な刊行物、特許および特許出願は、それら全体を参照することによって組み込まれる。
発明の分野
本発明は、ウイルス、RNA、DNAもしくはこれらの誘導体のようなポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのアルキルエーテルのブロックコポリマーを含む組成物および、該組成物を投与することによる樹状細胞の活性化方法に関する。
【0002】
発明の背景
ワクチン投与は、感染症による死あるいは障害を予防するのに有効な方法である。感染症分野におけるこの方法の成功によって、腫瘍性疾患の治療あるいは予防におけるワクチン投与の利用に対する関心もまた刺激されている。しかしながら、これらの成功はワクチンの利用によって達成されたにもかかわらず、ワクチン開発の分野においてはいまだ多くの問題がある。非経口投与経路、必要とされる種々のワクチン投与の数、および追加免疫の必要性とその頻度、これらが全て努力あるいは疾患の撲滅の障害となっている。
【0003】
このような問題の一つは免疫抗原性の欠如である。すなわち抗原が、病原体に対する効果的な免疫応答を促進することができないのである。加えて、ある種の抗原は、特定のタイプの免疫応答、例えば、細胞が仲介するあるいは体液性の応答しか誘発しない。アジュバントは、免疫応答を高め、促進し、増強する物質であり、そしてある場合には、一種の免疫応答を別の応答よりも促進させるのに用いられうる。多くのワクチンアジュバントが知られているが、アルミニウム塩が、安全性の心配なくヒトに広く使用されている唯一のアジュバントである。
【0004】
今では、免疫系が悪性細胞や感染性因子を認識し、ある場合には破壊することができるという確証がある。さらに、T細胞、特にCD8+の細胞障害性Tリンパ球(CTLs)が、抗腫瘍および抗感染症免疫の主要な作用因子であるらしい。T細胞の活性化は、樹状細胞によるものであることが知られている。樹状細胞(DC)は、免疫学的に未熟なT細胞に対する強い活性化能により、抗原提示細胞(APC)の中でも独特である(Steinman, 1991)。DCは、応答しているT細胞との生体相互作用を媒介し、T細胞に活性化シグナルを伝達する種々の分子を恒常的、あるいは成熟後に発現している。これらはクラスIおよびクラスIIMHC分子を含む。CDSO(B7−1)およびCD86(B7−2);CD40;CD11a/CD18(LFA−1);およびCD54(ICAM−1)(Steinman, 1991; Steinman et al. 1995)。抗原を提示し、CD4+およびCD8+の未熟および記憶T細胞を活性化するという樹状細胞の独特な能力によれば、これらのT細胞を用いて特定の抗腫瘍免疫を引き起こせる可能性が提供される。したがって、樹状細胞を選択的に誘導し、免疫応答を刺激する能力を増強させることができる物質は大いに重要である。多くの研究によって、動物モデルにおいては、樹状細胞に基づいたワクチンの腫瘍免疫療法に対する高い有効性が証明され、ヒトの腫瘍に対しても、臨床試験において実施されているものもある。ヒトの腫瘍は、細胞障害性リンパ球(CTL)によって認識されうる多くのタンパク質抗原を発現しており、これにより癌の免疫療法の潜在的な標的が提供されている。
【0005】
樹状細胞(DCs)は、T細胞に対して抗原を提示する能力が特に高い、稀な白血球であり、この特性により、近年、治療用癌ワクチンへの適用が促進されつつある。マクロファージやB細胞のような他の細胞もまた、抗原を提示できることが知られている。しかしながら、マクロファージは可溶性抗原を効率よく取り込めず、一方、未熟な樹状細胞は、マクロピノサイトーシスにより細胞外液から大量の抗原を取り込むことができる。
【0006】
これに対し、B細胞は、細胞表面の免疫グロブリンを通じて、特定の可溶性分子に結合するのに特に適している。B細胞は、自身の免疫グロブリン受容体に結合した可溶性抗原を吸収し、そしてこれら抗原のペプチド断片をペプチド:MHCクラスII複合体として提示する。B細胞の問題は、同時刺激活性を恒常的に発現しているわけではないということである。B細胞は可溶性タンパク質を効率よく提示するけれども、同時刺激活性がないと強力なCTL応答を開始しないと考えられる。結果として、その抗原は未熟なT細胞を活性化できないだけでなく、それらのT細胞をアネルギー性、つまり非応答性にしてしまう。
【0007】
生体外で腫瘍抗原と混合され、細胞ワクチンとして投与される単離DCは、実験動物において保護的および治療的な抗腫瘍免疫を誘導しているということが知られている。非ホジキン性白血病および黒色腫の患者に対するDCワクチン投与の予備臨床試験において、抗腫瘍免疫応答の誘導および腫瘍の退縮が観察された。Timmerman et al., Annal, Rev Med 1999, 50:507−29; Tarte et al., Leukemia, 13:653−663 (1999)。種々のヒト癌に対するDCワクチン投与の更なる試験が進行中であり、生体内におけるDCの腫瘍抗原への指向化方法もまた模索されている。DCの抗原提示能の利用により、有効な癌の免疫療法の開発の新たな可能性が提供されている。したがって、DCは細胞ワクチンとして利用可能であるが、DNAワクチンと組み合わせることにより、免疫調節因子としてもまた用いられうる。DNAワクチン投与後に、DCはワクチンによりコードされる抗原を効率よく提示する。Casares et al., J. Exp. Med., 186(9):1481−6 (1997)。プラスミドDNAは、DCの成熟およびリンパ組織への移行を促進するアジュバント作用を有している。しかしながら、プラスミドDNAの直接注入では、たいていごく少数のDCしかトランスフェクトされず、ごく少数のDCしか注入部位へ移行しない。Lane et al., Immunology, 11:308−313 (1999)。直接トランスフェクトされたDCによる抗原の発現は2週間で検出されなくなる。しかし、CD4+T細胞の記憶の維持における、持続性抗原の役割は疑わしいものの、記憶CD4+T細胞の応答は40週以上維持される。細菌性DNA(CpGモチーフ)は、ランゲルハンス細胞および、骨髄由来の未熟なDCの成熟を誘導する。細菌由来のリポ多糖(LPS)は、DCの活性化剤として長い間知られている。Th1型応答が起こると、炎症性T細胞は、マクロファージを活性化するために感染部位に集合するだけでなく、ケモカインを分泌することによって好中球を感染部位へと誘引する。
【0008】
プラスミドDNAワクチンを裸のDNAとともに投与した際、GM−CSFアジュバントおよび糖タンパク質D抗原を一緒にデリバリーすることによって、免疫応答が増強される。Flo et al., Vaccine, 18(28): 3242−53 (2000)。ポリ(α−4−アミノブチルグリコール酸)複合体とともに、サイトカインをコードするプラスミドDNAを用いることにより、サイトカイン(インターロイキン−12)を発現させるために遺伝子のデリバリーが利用されている。Maheshwari et al., Mol. Ther., 2(2): 121−130. (2000)。腫瘍のサプレッサー(抗原)p53およびインターロイキン−12(さらにはTNF−αおよびIFNγ)は、サイトカイン応答を開始し、腫瘍の成長を阻害するために、“LPD”と名づけられた遺伝子デリバリーシステムにおける遺伝子のデリバリーによって投与される。Whitmore et al., Gene Ther., 6(11) 1867−75 (1999)。ヒトFLT−3リガンドをコードするプラスミドを静脈内注射することで、機能性およびナチュラルキラー細胞(NK)の数を増加させる。He et al., Hum. Gene Ther., 11(4): 547−54 (2000)。レトロウイルス媒介遺伝子療法の際、多くの研究者が遺伝子発現を増強させるためにFLT−3を用いている。Murray et al., Hum. Gene Ther., 10(11): 1743−52 (1999) and Goerner et al., Blood, 94(7): 2287−92 (1999)。レトロウイルス媒介遺伝子ワクチン療法の際に、樹状細胞の発達を誘導し、遺伝子発現を増強させるために、FLT−3、さらにはGM−CSFが用いられている。Mach et al., Cancer Res., 60(12): 3239−46 (2000)。CD4OおよびFLT−3リガンドは、レトロウイルス媒介遺伝子ワクチン療法の際に、樹状細胞を誘導し、遺伝子発現を増強する。Borges et al., J. Immunol. 163(3) 1289−97 (1999)。
【0009】
本発明は、プラスミドDNA、DNA、RNA、ウイルスもしくはベクターのようなポリヌクレオチドおよび、上記DNA、特にプラスミドDNAによってコードされる遺伝子産物の発現に応答して、DCの高レベルの産生および浸潤を誘導する、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む組成物に関する。このことによって、コードされた外来抗原(導入遺伝子)に対する、より高い免疫応答が得られ、よりよい体液性および細胞性免疫応答が達成される。本発明の組成物は、in vitroおよびin vivoの両方において、大量の樹状細胞を産生させることにもまた用いることができる。従来のDCの産生、刺激および成熟方法は、極めて困難で時間がかかるが、一方、本発明はその過程を著しく容易にした。
【0010】
筋肉内あるいは皮内への、裸のプラスミドDNAの直接注入では、DNAワクチンによってコードされる抗原に対する、強力な、長期にわたる免疫応答が誘導される。両経路の免疫処置によって、特定の抗体が産生され、MHCクラスIにより制御される抗原特異的CTLおよび、Th1型サイトカインを分泌するMHCクラスIIにより制御されるTh細胞の両方が活性化される。(Genetic vaccines, Scientific Amer., July 1999, pp. 50−57)。プラスミドDNAワクチンはこれらの特性から、タンパク質、生弱毒化ウイルスもしくは死滅全生物体を用いる公知の免疫処置の魅力的な代替手段となっている。結果として、DNAワクチンは、感染症、アレルギーおよび癌など多様な分野における治療法もしくは予防手段として活発に研究がなされている。この免疫処置方法に対する熱烈な関心にもかかわらず、DNAワクチンはタンパク質を発現する能力が限られている。有効な免疫処置は遺伝子発現に依存しており、このことは、DNAワクチンがタンパク質を発現しなければならないことを意味する。
【0011】
平滑筋、骨格筋および心筋の特性により、筋肉内投与に有効なポリヌクレオチド組成物の開発およびその投与に対して多くの問題が提起されている。等張生理食塩水中の精製プラスミド(“裸のDNA”)の筋肉への直接注入により、様々な種の平滑筋、骨格筋および心筋において、DNAの取り込みおよび遺伝子の発現が起こることが発見された。Rolland A., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Begell House, 143 (1998)。筋組織の独特な細胞構造特性が、ポリヌクレオチドを取り込む原因となっていると信じられている。なぜなら、骨格筋および心筋細胞は、ほかのタイプの組織よりも、注入された外来DNAベクターを取り込み、発現させるのにより適していると思われるためである。Dowty & Wolff, Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer, Birkhauser, Boston, p.182 (1994)。しかしながら、この方法により得られる比較的低い発現レベルにより、その用途が制限されている。Aihara and Miyazaki, Nature Biotechnology, 16:867 (1998)を参照。さらに、ほかの組織における遺伝子発現を増強させるために一般に提唱されている、ポリカチオン、カチオン性リポソームおよび脂質のような伝統的な遺伝子デリバリーシステムでは、たいてい、骨格筋および心筋において遺伝子の発現が阻害されてしまう。Dowty & Wolff, loc. cit., p. 82 (1994)。
【0012】
たとえ筋肉が、ウイルスベクター非存在下でプラスミドDNAを効果的に取り込み発現する唯一の組織であると知られているとしても、筋肉が抗原提示部位であると考えられてはいない。なぜなら筋肉は樹状細胞、マクロファージおよびリンパ球を、たとえあったとしてもほとんど有していないからである。皮膚および粘膜は、ほとんどの外来抗原が普通に出会う解剖学上の部位である。皮膚に関連したリンパ組織は、免疫応答を高める分化細胞を含有している。Raz et al., PNAS, 91: 9519−9523 (1994)。
【0013】
硫酸デキストリンやサケDNAのようなアニオン性ポリマーは、筋肉において遺伝子の発現を減少させることができる。Rolland A., Loc. cit.。種々の非縮合性相互作用ポリマーが使用され、横紋筋における遺伝子発現を修飾することに部分的には成功している。ポリ(ビニルピロリドン)ポリ(ビニルアルコール)のような非イオン性ポリマーは、水素結合を通して、プラスミドと相互作用する。Id.。これらのポリマーは、筋細胞においてポリヌクレオチドの取り込みを容易にし、10倍もの遺伝子発現の上昇を引き起こす。しかしながら、遺伝子発現の著しい増加を達成するためには、高濃度のポリマー(約5%かそれ以上)を投与する必要がある。Mumper et al., Pharmacol. Res., 13, 701−709 (1996); March et al., Human Gene Therapy, 6(1), 41−53 (1995)。遺伝子発現を改善するために必要とされるこの高濃度のポリ(ビニルピロリドン)ポリ(ビニルアルコール)は、筋組織における毒性、炎症および他の副作用に関連している可能性がある。筋肉において遺伝子発現を改善するため、あるいは、その後の治療用途のために筋肉の生理機能を修飾するために、ブロックコポリマーが用いられている。米国特許第5,552,309号;第5,470,568号;第5,605,687号;および第5,824,322号を参照。例えば、脈管系において遺伝子の導入をおこなうために用いられるウイルス粒子を調剤する目的で、ブロックコポリマーをゲル様の形状(1%を超えるブロックコポリマー)で使用することができる。同様の範囲のブロックコポリマー濃度(1〜10%)で、ブロックコポリマーを用いて、損傷を受けた筋組織(放射線および電気的損傷、および凍傷)の透過性を修飾することができる。さらに、ブロックコポリマーを用いて膜を易透過化した後、DNA分子を細胞に組み込むことができる。これらの適用では、ブロックコポリマーは、ゲル様構造および粘性デリバリーシステムを提供できるような濃度で使用されていた。しかしながら、これらのシステムでは筋肉に注入されたDNAは拡散できるようにならず、したがって筋原繊維へのDNAの注入は制限されていた。
【0014】
こうして、患者、特に筋肉や皮膚へ投与した際の、ポリヌクレオチドの発現効率を増加させる組成物および方法が必要とされている。また、ポリヌクレオチドの細胞へのデリバリー効率を増加させる方法も必要とされている。
【0015】
筋肉及び皮膚においては遺伝子の発現を改善させる必要があるのに対し、遺伝的障害がある、および/または遺伝子の異常な過発現がある、および/または正常な遺伝子が欠如している状況では体内の他の組織は遺伝子の移入により恩恵を被る。
【0016】
RNA、DNA、ウイルスおよびリボザイムのような種々のポリヌクレオチドは、遺伝子治療の目的で用いることができる。しかしながら、遺伝子治療の成功は、下記のような多くの問題と出くわしている。
【0017】
遺伝的疾患、細胞変異(変異を生じさせるまたは増加させる癌を含む)およびウイルス感染を治療するためのアンチセンスポリヌクレオチドの利用が広く注目を集めている。この治療手段は、一面では、治療すべき病変部位の発生に関与していると考えられているタンパク質をコードしているmRNAの“センス”鎖に結合し、その結果、mRNAが不要なタンパク質へ翻訳されるのを停止あるいは阻害することによって機能すると考えられている。また別の一面では、例えば転写を阻害するために、ゲノムDNAがアンチセンスポリヌクレオチド結合(三重らせんを形成)の標的とされる。Helene, Anti−Cancer Drug Design, 6:569 (1991)。ひとたび結合すべきmRNAの配列がわかれば、ワトソン−クリック塩基結合則によってセンス鎖に結合し、DNA二重らせんに類似した二量体構造を形成するようなアンチセンス分子をデザインすることができる。Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA, Erikson and lxzant, eds., Raven Press, New York, 1991; Helene, Anti−Cancer Drug Design, 6:569 (1991); Crooke, Anti−Cancer Drug Design, 6:609 (1991)。この技術を十分に利用することに対する深刻な障壁としては、標的のmRNAの翻訳もしくはDNAの機能を効率よく妨げるために、十分な数のアンチセンス分子を細胞に効率よく導入するという問題がある。
【0018】
発明の要約
本発明は、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのアルキルエーテルのブロックコポリマーを含む、樹状細胞の活性化誘導のための組成物に関する。さらに、本発明は、ウイルス、RNA、DNA、プラスミドDNAまたはこれらの誘導体のようなポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを投与、特に筋肉内および皮内投与することを含む、樹状細胞の活性化のための方法に関する。特定の実施形態において、該ブロックコポリマーは、ゲル形成には不十分な量で存在する。本発明はまた、ブロックコポリマーが約15%(wt/vol)未満の濃度で存在する、少なくとも一つのポリヌクレオチドもしくはその誘導体および、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む使用方法および組成物にも関する。さらに特定の実施形態においては、該組成物はさらにポリカチオンを含む。該組成物はまたブロックコポリマーの混合物をも含む。本発明はまた、該組成物が、以下に制限されないが、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体、または他のタイプの分子凝集体などの、分子溶液またはコロイド分散を形成する組成物にも関する。これらの組成物は、該組成物中に存在するポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現に応答して、DCの産生および浸潤レベルを上昇させるのに有用である。該組成物はまた、免疫応答を増強し、大量の樹状細胞をin vitroおよびin vivoにおいて産生させるのにも有用である。本発明はさらに、上記組成物を細胞に投与することを含む、ポリヌクレオチドの細胞へのデリバリー方法にも関する。
【0019】
本発明は一部分、多くの予想外の驚くべき発見に基づいている。一つは、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む組成物に細胞を前もって暴露しておくことで、in vitroにおける樹状細胞の浸潤および活性化が著しく増強されるということである。もう一つは、ポリヌクレオチド分子(例えばプラスミドDNAおよびウイルス)を単独もしくは組み合わせたブロックコポリマーと配合すると、免疫が増強されるということである。また一つは、ブロックコポリマー、“ポロキサマー”とも呼ばれるが、が用いられると、免疫応答を得るために必要とされるポリヌクレオチド分子がより少なくなり、応答を生じさせるための時間が短縮され、追加注入の必要がなくなるということである。結果として、より少ないポリヌクレオチド分子を使用することによって、ポリヌクレオチドが宿主生物の染色体に組み込まれる可能性が減少するであろう。さらに、より少ないポリヌクレオチド分子を使用することによって、全身性エリテマトーデスのような、しかしこれに限定されない疾患に関連している抗ポリヌクレオチド(もしくは抗DNA)抗体が発現する可能性が減少するであろう。
【0020】
発明の詳細な説明
定義
ここで用いられているように、下記の語句は以下の意味を有する:
主鎖: グラフトコポリマー命名の際に用いられ、その上にグラフトが形成される鎖を表す。
ブロックコポリマー: 構造的もしくは配座的に異なる性質の二以上の鎖の組み合わせ。
分枝状ポリマー: お互いに連結された二以上の鎖の組み合わせであり、少なくとも一つの鎖の末端が、別の鎖のある点に結合している。
鎖: モノマー単位の共有結合により形成されるポリマー分子。
立体配置: ポリマー鎖に沿った原子構成であり、主化学結合を破壊し、再構成することによってのみ、相互転換可能である。
配座: 単結合の回転によって生じる、ポリマー鎖の原子および置換基の配置。
コポリマー: 2種以上のモノマーからなるポリマー。
架橋: 2以上の鎖にともに結合している構造。
デンドリマー: 分枝が一つ以上の中心から開始する、規則正しい分枝状ポリマー。
分散: 分散媒中に分布している微粒子状物質。
グラフトコポリマー: 構造的もしくは配座的に異なる性質の2つ以上の鎖の組み合わせであり、一つの鎖が主鎖をなし、少なくとも一つの鎖が主鎖に沿った幾つかの点で結合し、側鎖を形成している。
ホモポリマー: 一種のモノマーからなるポリマー。
連結: 二つの原子間の共有化学結合であり、二つのモノマー単位間もしくは二つのポリマー鎖間の結合を含む。
ポリマーブレンド: 構造的もしくは配座的に異なる性質の2つ以上のポリマー鎖の均質な組み合わせであり、お互いに結合はしていない。
ポリマーフラグメント(もしくはポリマーセグメント): モノマー単位が、隣接部分が有していない構造的もしくは配座的な性質を少なくとも一つ有している、ポリマー分子の一部分。
ポリヌクレオチド: 天然もしくは人工の核酸配列。
反復単位: ポリマー鎖に連結するモノマー単位。
側鎖: グラフトコポリマーにおける、グラフト鎖。
スターブロックコポリマー: 中心部分の一端で一緒に連結する、構造的もしくは配座的に異なる性質を有する三以上の鎖。
スターポリマー: 中心部分の一端で一緒に連結する、三以上の鎖。
サーファクタント: 界面で吸着している界面活性物質。
ウイルスベクター: ウイルス由来の、遺伝子移入に用いられる構築物。
【0021】
組成物
本発明は、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む、樹状細胞の活性化のための組成物ならびに少なくとも一つのポリヌクレオチドまたはその誘導体および少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物に関する。本発明はまた、該組成物を投与することによって、樹状細胞の活性化を誘導するおよび動物の免疫応答を増強する方法にも関する。
【0022】
好ましい実施形態には、ポリヌクレオチドおよびカチオン性セグメントを有するブロックコポリマーを含む組成物ならびにポリヌクレオチドおよび非イオン性ポリエーテルブロックコポリマーを含む組成物とが含まれる。特に筋肉内および皮内投与に有用な一つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)のブロックコポリマーと配合される。本発明の好ましい組成物は、さらにポリカチオンを含む。
【0023】
本発明の組成物は、ポリヌクレオチドの細胞への導入、ポリヌクレオチドの体液中における分解からの保護、生体膜および生物学的関門(例えば血液脳関門、血管脳脊髄液関門、および腸関門)を通過するポリヌクレオチドの輸送、ポリヌクレオチドの体内における生体内分布の改変ならびにヒトまたは動物の体内の様々な組織および臓器における選択的な遺伝子発現を含む遺伝子発現の増強、に効率のよい媒体を提供する。
【0024】
本発明はさらに、本発明の組成物を利用してポリヌクレオチドを細胞に挿入またはデリバリーする方法、および、ヒトおよび動物にこれらの組成物を投与することを含む治療方法に関する。
【0025】
好ましい実施形態において、ブロックコポリマーは、以下の式:
【0026】
【化7】
【0027】
式中、AおよびA’はA型直鎖状ポリマーセグメントであり、BおよびB’はB型直鎖状ポリマーセグメントであり、R1,R2,R3およびR4はそれぞれ式(I)、(II)もしくは(III)のブロックコポリマーまたは水素原子であり、Lは連結基であり、ただしR1、R2、R3またはR4のうち水素原子は2つ以下である、
の一つに従っている。
【0028】
他の実施形態において、ブロックコポリマーはポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)鎖セグメントである。さらに他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド組成物は、カチオン性反復単位を複数有するポリカチオン性ポリマーを含有する。この場合、該ポリヌクレオチドはポリカチオンと複合体化され、複合体中で安定化されてもよい。これらの組成物は、細胞膜を通過する透過性の増加を示し、細胞に核酸をデリバリーするための媒体としての使用によく適している。
【0029】
他の実施形態において、本発明は:
(a)ポリヌクレオチドまたはその誘導体;
(b)ポリエーテルセグメントおよびポリカチオンセグメントを有し、該ポリエーテルセグメントは少なくともA型ブロックを含み、該ポリカチオンセグメントはカチオン性反復単位を複数有するブロックコポリマー
を有するポリヌクレオチド組成物に関する。
【0030】
第二の好ましい実施形態において、コポリマーは、式:
【0031】
【化8】
【0032】
で示されるポリマーに関し、式中、A、A’およびBは上記と同様であり、RおよびR’はカチオン性反復単位を複数含むポリマーセグメントであり、セグメント中の各カチオン性反復単位は該セグメント中の他の単位と同一または異なっている。この実施形態のポリマーは、“ポリ非イオン性/ポリカチオン性”ポリマーと称してもよい。好ましいポリ非イオン性/ポリカチオン性ポリマーは、非イオン性ポリマーセグメントに共有結合しているポリカチオンを含み、該非イオン性ポリマーセグメントは、アクリルアミド、グリセロール、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、ビニルピリジン、ビニルピリジンN−オキサイド、オキサゾリンもしくはアクロイルモルフォリン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一つのモノマーのホモポリマーもしくはコポリマーである。これは例えば、ポリアクリルアミド、ポリグリセロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジンN−オキサイド、ビニルピリジンN−オキサイドとビニルピリジンのコポリマー、ポリオキサゾリン、ポリアクロイルモルフォリン、またはこれらの誘導体を含む。ビニルモノマーの重合産物を含む非イオン性セグメントもまた好ましい。RおよびR’ブロックは、「R型」ポリマーセグメントまたはブロックと称してもよい。この実施形態のポリヌクレオチド組成物は、細胞にポリヌクレオチドを導入するのに効率のよい媒体を提供する。
【0033】
したがって、本発明はさらに、本発明の組成物を利用してポリヌクレオチドを細胞に挿入する方法に関する。
【0034】
さらに他の実施形態において、本発明は、ポリエーテルはA型ポリエーテルセグメントを含む、ポリヌクレオチドセグメントを含むポリヌクレオチド誘導体およびポリヌクレオチドの5’末端および3’末端のうち一つまたは両方に付着したポリエーテルセグメントを含むポリヌクレオチド組成物に関する。
【0035】
第三の好ましい実施形態において、誘導体は、式:
【0036】
【表1】
【0037】
を有するブロックコポリマーを含み:式中、pNは、5’から3’への方向を有するポリヌクレオチドを表し、ならびにA、A’およびBは上記のポリエーテルセグメントである。他の第三の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド複合体はポリカチオン性ポリマーを含む。式(IX)〜(XIII)のポリヌクレオチド成分(pN)は、好ましくは約5〜約1,000,000塩基、より好ましくは約5〜約100,000塩基、さらにより好ましくは約10〜約10,000塩基を有する。
【0038】
ポリヌクレオチド組成物は、ポリヌクレオチドを細胞に導入するのに効率のよい媒体を提供する。したがって、本発明はまた、本発明の組成物を用いてポリヌクレオチドを細胞に挿入する方法に関する。他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドはポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)のブロックコポリマーに共有結合している。
【0039】
本発明の他の実施形態は、ポリマー、ポリエーテルセグメント、および式−NH−R0を有するカチオン性反復単位を複数含むポリカチオン性セグメントを含むポリエーテルポリカチオンコポリマーに関し、ここでR0は炭素原子数2〜6の、置換されていてもよい直鎖脂肪族基であり、該ポリエーテルセグメントは少なくとも一つのB型セグメントのA型を含む。他の好ましい実施形態において、ポリカチオンポリマーは、以下の式:
【0040】
【化9】
【0041】
で示されるポリマーを含む。式中、A、A’およびBは上記と同様であり、RおよびR’は、式−NH−R0−を有するカチオン性反復単位を複数含むポリマーセグメントであり、ここでR0は炭素原子数2〜6の、置換されていてもよい直鎖脂肪族基である。R型セグメント中の各−NH−R0−反復単位は、該セグメント中の他の−NH−R0−反復単位と同一または異なっていてもよい。
【0042】
さらに他の実施形態において、本発明は、式:
【0043】
【化10】
【0044】
を有する反復単位を複数含むポリカチオン性ポリマーを提供する。
【0045】
式中、R8は:
(1)−(CH2)n−CH(R13)−であり、ここでnは0〜約5の整数であり、R13は水素、炭素原子3〜8のシクロアルキル、炭素原子1〜6のアルキル、または、(CH2)mR14であり、ここでmは0〜約12の整数であり、R14は炭素原子6〜20の親油性の置換基である;
(2)環の炭素原子が3〜8の炭素環式化合物基であり、ここで該基は例えばシクロアルキルまたは芳香族基であり、これらは、炭素原子1〜6のアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子1〜6のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロ、またはクロロ置換基を含んでいてもよい;または(3)環の原子が3〜8の複素環式化合物基であり、これとしては酸素原子、窒素原子、硫黄原子およびこれらの混合物からなる群より選択されるヘテロ原子1〜4を含むヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基が挙げられ、これらは、さらに炭素原子1〜6のアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子1〜6のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロまたはクロロ置換基を含んでいてもよい、である。
【0046】
R9は炭素原子1〜12の直鎖脂肪族基であり、R10、R11、およびR12は独立して水素、炭素原子1〜4のアルキル基である。R9は好ましくは炭素原子2〜10,より好ましくは炭素原子3〜8である。R14は好ましくは、挿入基(intercalating group)を含み,これは好ましくはアクリジンまたはエチジウムブロミド基である。該ポリマー中の反復単位数は、好ましくは約3〜50、より好ましくは約5〜20の範囲である。このポリマーの構造は、R型セグメントまたはポリカチオン性ポリマーとして、本発明の他の実施形態に組み込むこともできる。このポリマーの末端は脂質の置換基でさらに改変されていてもよい。
【0047】
この実施形態のポリマーを合成するために用いるモノマーは、下記のような、DNAシンセサイザーへ供給されるモノマーとして用いるのに適している。したがって、ポリマーは非常に特異的に合成されうる。加えて、ポリヌクレオチド配列、ポリエーテルブロックおよび親油性置換基をさらに組み込むことは、ポリヌクレオチド合成のために開発された最先端の自動化装置を用いてなされうる。この実施形態はまた、ポリカチオン性ポリマーの合成方法も含んでいる。
【0048】
さらに他の実施形態において、本発明は、共有結合したポリマーセグメントを複数含むポリマーに関し、ここで該セグメントは、以下の(a)および(b)を有する:
(a)少なくとも一つのポリカチオンセグメント、ここで該セグメントは、少なくとも三つのアミノアルキレンモノマーを含むカチオン性ホモポリマー、コポリマーまたはブロックコポリマーであり、該モノマーは以下の(i)および(ii)からなる群より選択される;
(i)式:
【0049】
【化11】
【0050】
を有する少なくとも一つの第3級アミノモノマー、および該第3級アミノモノマーの第4級塩、ならびに
(ii)式:
【0051】
【化12】
【0052】
で示される少なくとも一つの第2級アミノモノマー、および該第2級アミノモノマーの酸付加第4級塩であり、式中、
R1は水素、炭素原子2〜8のアルキル、AモノマーまたはBモノマーであり、R2およびR3は、それぞれ互いに独立して、下記式を有する同一もしくは異なる直鎖もしくは分岐状鎖のアルカンジイル基であり:
【0053】
【化13】
【0054】
式中、zは2〜8の値であり;R4は対になるように結合しているように描かれた炭素原子の一つの結合を満たす水素原子であり;R5は水素原子、炭素原子2〜8のアルキル、Aモノマー、またはBモノマーであり;R6は水素、炭素原子2〜8のアルキル、Aモノマー、またはBモノマーであり;R7は下記式を有する直鎖または分岐状鎖のアルカンジイル基であり:
【0055】
【化14】
【0056】
式中、zは2〜8の値であり;R8は水素、炭素原子2〜8のアルキル、Aモノマー、またはBモノマーである;ならびに
(b)少なくとも一つの、約5〜約400のモノマー単位を含む直鎖または分岐状鎖のポリエーテルセグメント、これは
(i)第1のアルキレンオキシモノマー−OCnH2n−のホモポリマー、または
(ii)該第一アルキレンオキシモノマーおよび、異なる第二のアルキレンオキシモノマー−OCmH2m−とのコポリマーもしくはブロックコポリマー
であり、式中、nは2または3の値であり、mは2〜4の値である。
【0057】
式(I)、(II)、(III)または(IV)で示されるポリマーはまた、細胞の内部にポリヌクレオチドをデリバリーするのに効率のよい媒体を提供するために、互いに混合されてもよく、または、式(V−aまたはb)、(VI−aまたはb)、(VII−aまたはb)および(VIII−aまたはb)で示される一以上のポリマー、および/または、式(IX−a,b,cまたはd)、(X−a,b,c,d,eまたはf)、(XI)、(XII)または(XIII)で示されるポリヌクレオチド誘導体と追加してもしくは代わりに混合されることもできる。
【0058】
式(I)〜(XIII)の親水性(A型)ブロックまたは疎水性(B型)ブロックの重合度は、好ましくは約5〜約400であり得る。該重合度はより好ましくは約5〜約200、さらにより好ましくは約5〜約80であり得る。R型ポリカチオンブロックの重合度は、好ましくは約2〜約300であり得る。該重合度はより好ましくは約5〜約180であり、さらにより好ましくは約5〜約60であり得る。ポリカチオン性ポリマーの重合度は、好ましくは約10〜約10,000であり得る。該重合度はより好ましくは約10〜約1,000であり、さらにより好ましくは約10〜約100であり得る。
【0059】
A型、B型およびR型ブロックを含む反復単位は、一般的に、約30〜約500、好ましくは約30〜約100、より好ましくは約30〜約60の分子量を有するであろう。一般的には、A型またはB型ブロックのそれぞれにおいて、反復単位間の結合の少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95%がエーテル結合であろう。本願の目的のためには、エーテル結合はグリコシド結合(すなわち糖結合)を含む。しかしながら一面においては、単純なエーテル結合が好ましい。
【0060】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明の組成物は遺伝子治療の目的に有用であり、これらは、遺伝子置換または除去治療、および遺伝子付加治療、ワクチン投与、ならびに、体内またはin vitroでポリペプチドが発現またはダウンレギュレートされるべき任意の治療条件を含む。本発明の一つの観点において、ポリヌクレオチド組成物は、ヒトまたは動物の平滑筋、骨格筋および心筋を含むがこれらに限定されない筋組織における遺伝子治療に用いられる。筋肉内投与用の組成物は、ポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)のブロックコポリマーを含むことが好ましい。
【0061】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明は、オキシエチレン含有量が50%以下の、少なくとも一つのポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)のブロックコポリマー、およびオキシエチレン含有量が50%以上の、少なくとも一つのポリ(オキシエチレン)およびポリ(オキシプロピレン)のブロックコポリマー、およびポリヌクレオチドを含む組成物に関する。オキシエチレン含有量が50%以下のブロックコポリマーの、オキシエチレン含有量が50%以上のブロックコポリマーに対する質量比は、好ましくは1:2、より好ましくは1:5である。
【0062】
本発明の組成物はゲルを形成しないことが好ましい。該組成物は分子溶液またはコロイド分散を形成することが好ましい。サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体または他のタイプの分子凝集体を含むコロイド分散が特に好ましい。一つの観点において、ポリヌクレオチド組成物におけるポリマーおよびブロックコポリマーの濃度は、10%未満、好ましくは1%未満、より好ましくは0.5%未満、さらにより好ましくは0.1%未満である。
【0063】
ブロックコポリマーは、最も簡単には少なくとも二つの異なるポリマーセグメントの結合体(conjugates)として定義される(Tirrel, M., Interactions of Surfactants with Polymers and Proteins, Goddard E.D. and Ananthapadmanabhan, K.P. (eds.), CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, pp. 59−122, (1992))。最も簡単なブロックコポリマーの構造は、二つのセグメントがそれらの末端で結合したものを含み、A−B型ジブロックを形成する。二つ超のセグメントがそれらの末端で連続して結合することにより、A−B−A型トリブロック、A−B−A−B型マルチブロックを得ることができ、さらにはマルチセグメントA−B−C構造も得られる。ブロックコポリマーにおいて、一種または数種の反復単位が異なるポリマーセグメントに結合すると主鎖が定義されうる場合、コポリマーは例えばA(B)n型のグラフト構造を有する。より複雑な構造は、単一の中心に2つ超のポリマーセグメントが連結してなる(AB)nまたはAnBmスターブロックを含む。本発明の式XVIII〜XXIIIは、ジブロックおよびトリブロックである。同時に、式XVIIのポリエーテル末端へのポリカチオンセグメントの結合により、スターブロック(例えば、(ABC)4型)が得られる。加えて、実施例13〜15(下記)のポリスペルミンは分岐状である。ポリ(エチレンオキサイド)を有するこのようなポリカチオンの改変により、グラフト化ブロックコポリマーおよびスターブロックの混合物を得ることができる。本発明によれば、これらの構造すべてはポリヌクレオチドのデリバリーに有用である。
【0064】
米国特許第5,783,178号の全開示が、ここに参照することにより引用される。
【0065】
他の観点において、本発明は、ポリヌクレオチドおよびポリエーテルブロックコポリマーのポリヌクレオチド複合体を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチド複合体はさらにポリカチオン性ポリマーを含む。組成物はさらに、適切な標的分子およびサーファクタントを含む。他の観点において、本発明は、ポリヌクレオチドならびにポリエーテルブロックおよびポリカチオンブロックを含むブロックコポリマーのポリヌクレオチド複合体を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、ポリエーテルポリマーセグメントを付着させるために5’または3’末端で共有結合的に改変されたポリヌクレオチドを提供する。
【0066】
ポリカチオン 好ましいポリカチオンポリマー、およびコポリマーのポリカチオンセグメントとは、ポリアミン(例えばスペルミン、ポリスペルミン、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミン、ポリペンチレンイミン、ポリヘキシレンイミンおよびそれらのコポリマー)、第3級アミンおよび第2級アミンのコポリマー、部分的なまたは完全な第4級アミン、ポリビニルピリジン、ならびに、これらポリカチオンセグメントの第4級アンモニウム塩を含むがこれらに限定されない。これら好ましいポリカチオンフラグメントはまた、脂肪族、ヘテロ環、または芳香族イオネン(ionenes)を含む。Rembaum et al., Polymer Letters, 6:159 (1968); Tsutsui, T., Development in Ionic Polymers−2, Wilson A.D. and Prosser, H.J. (Eds.) Applied Science Publishers, London, New York, vol. 2, pp. 167−187, (1986)。
【0067】
ポリカチオン性ポリマーおよびR型ブロックは、陽性にイオン化し得る数種の基および、生理学的なpHで正味の正電荷を有する。式(V)〜(VIII)のポリエーテル/ポリカチオンポリマーはまた、ポリカチオン性ポリマーとして機能し得る。好ましくは、ポリカチオンセグメントは生理学的なpHで少なくとも約3個、より好ましくは少なくとも約6個、さらにより好ましくは少なくとも約12個の正電荷を有する。生理学的なpHで、電荷間の距離が約2Å〜約10Åである正電荷を供与できるポリマーまたはセグメントもまた好ましい。エチレンイミン、アミノプロピレン、アミノブチレン、アミノペンチレンおよびアミノヘキシレンの反復単位、またはこれらの基の少なくとも二つの混合物によって確立される距離が最も好ましい。(NCH2CH2)、(NCH2CH2CH2)、(NCH2CH2CH2CH2)、(NCH2CH2CH2CH2CH2)および(NCH2CH2CH2CH2CH2CH2)の反復単位、またはこれらの混合物を利用したポリカチオン性セグメントが好ましい。
【0068】
本発明の好ましい組成物において、ポリカチオンポリマーおよびポリエーテル/ポリカチオンコポリマーは、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーと混合される。オリゴアミン、および、オリゴアミンのポリエーテルとの結合体は、オリゴアミンのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとの結合体を含み、本発明においてポリカチオン性分子として、特にポリオキシエチレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーとの混合物において用いられ得る。本発明において有用なオリゴアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、および他のDNA縮合剤を含むがこれらに限定されない。ジエチレントリアミンおよびペンタエチレンヘキサミンのようなエチレンイミンオリゴアミン、N−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパン−ジアミンおよびN,N’−ビス(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンのようなプロピレンイミンオリゴアミン、ブチレンイミンオリゴアミン、ペンチレンイミンオリゴアミン、ヘキシレンイミンオリゴアミン、ヘプチレンイミンオリゴアミン、およびその誘導体が、本発明において特に有用である。
【0069】
−N−R0−反復単位を有するポリカチオンセグメントもまた好ましい。R0は、好ましくはエチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレンまたはヘキシレン鎖であり、これらは改変されてもよい。好ましい実施形態において、反復単位の少なくとも一つにおいては、R0は、エチジウムブロミド基のようなDNA挿入基を含む。このような挿入基は、核酸に対するポリマーの親和性を増すことができる。R0上の好ましい置換基は、炭素原子1〜6のアルキル、ヒドロキシ、アルキルが炭素原子1〜6であるヒドロキシアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子2〜7のアルキルカルボニル基、アルコキシが炭素原子1〜6を有するアルコキシカルボニル、アルコキシおよびアルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するアルコキシカルボニルアルキル、各アルキル基がそれぞれ炭素原子1〜6を有するアルキルカルボキシアルキル、アルキル基が炭素原子1〜6を有するアミノアルキル、各アルキル基が独立して炭素原子1〜6を有するアルキルアミノまたはジアルキルアミノ、各アルキルが独立して炭素原子1〜6を有するモノ−またはジ−アルキルアミノアルキル、クロロ、またはアルキルが炭素原子1〜6を有するクロロアルキル、フルオロ、またはアルキルが炭素原子1〜6を有するフルオロアルキル、シアノ、またはアルキルが炭素原子1〜6であるシアノアルキル、または、カルボキシル基である。より好ましくは、R0はエチレン、プロピレンまたはブチレンである。
【0070】
本発明のコポリマー中のポリカチオンポリマーおよびポリカチオンセグメントは分岐状であってもよい。例えば、ポリスペルミンに基づくコポリマーは分岐状である。これらコポリマーのカチオン性セグメントは、1,4−ジブロモブタンおよびN−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンの縮合によって合成された。この反応により、第1級、第2級および第3級アミンを含む高度分岐状ポリマー産物が得られる。
【0071】
分岐状ポリカチオンの例としては、少なくとも2個の窒素原子を含むポリアミンおよび、少なくとも2個のハロゲン原子(臭素または塩素を含む)を含むハロゲン化アルキルの縮合反応の産物がある。特に、分岐状ポリカチオンは、重縮合の結果製造される。この反応の例としては、ポリスペルミンを製造する、N−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンおよび1,4−ジブロモブタンの反応がある。この型の分岐状ポリカチオンポリマーは、式:
【0072】
【化15】
【0073】
で示すことができる。
【0074】
分岐状ポリカチオンの他の例は、式:
【0075】
【化16】
【0076】
で示されるポリエチレンイミンである。
【0077】
加えて、カチオン性デンドリマー、例えばポリアミドアミンもまた、遺伝子移入用ブロックコポリマーのポリカチオンセグメントとして用いられ得る。Tomalia et al., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 29, 138(1990)。
【0078】
好ましい実施形態において、ポリカチオンは、非イオン性ポリマーセグメントに共有結合している。非イオン性ポリマーセグメントは、非毒性および非免疫原性の水溶性ポリマーを含むことが好ましい。このようなポリマーの好ましい一つの例は、ポリ(オキシエチレン)、ポリ(オキシプロピレン)、ポリ(オキシエチレン)/ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーおよびポリ(オキシエチレン)/ポリ(オキシプロピレン)ランダムコポリマーを含む、エチレンオキシモノマー(−OCH2CH2−)およびプロピレンオキシモノマー(−OCH(CH3)CH2−)のホモポリマーおよびコポリマーであるポリエーテルポリマーである。本発明において用いられる非イオン性ポリマーセグメントの別の好ましい例は、アクリルアミド、グリセロール、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、ビニルピリジン、ビニルピリジンN−オキサイド、オキサゾリンもしくはアクロイルモルフォリン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一つのモノマーのホモポリマーもしくはコポリマーである。これは例えば、ポリアクリルアミド、ポリグリセロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジンN−オキサイド、ビニルピリジンN−オキサイドおよびビニルピリジンのコポリマー、ポリオキサゾリン、ポリアクロイルモルフォリン、もしくはこれらの誘導体を含む。ビニルモノマーの重合産物を含む非イオン性セグメントもまた好ましく、下記の非イオン性セグメントおよびその誘導体も含むが、これに限定されない:
【0079】
【化17】
【0080】
式中、mは約3〜約10,000の値である。
【0081】
式(V)〜(VIII)で示される有用なポリマーの例は、以下の式:
【0082】
【化18】
【0083】
のポリ(オキシエチレン)−ポリ−L−リジン)ジブロックコポリマーを含む。式中、iは約5〜約100の整数であり、jは約4〜約100の整数である。
【0084】
第二の例は、以下の式:
【0085】
【化19】
【0086】
のポリ(オキシエチレン)−ポリ−(L−アラニン−L−リジン)ジブロックコポリマーである。式中、iは約5〜約100の整数であり、jは約4〜約100の整数である。
【0087】
第三の例は、以下の式:
【0088】
【化20】
【0089】
のポリ(オキシエチレン)−ポリ(プロピレンイミン/ブチレンイミン)ジブロックコポリマーである。式中、iは約5〜約200の整数であり、jは1〜約10の整数である。
【0090】
第四の例は、式:
【0091】
【化21】
【0092】
のポリ(オキシエチレン)−ポリ(N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド)(「pOE−pEVP−Br」)である。式中、iは約5〜約100の整数であり、jは約10〜約500の整数である。さらに他の例は、式:
【0093】
【化22】
【0094】
のポリマーである。式中、iは約10〜約200の整数であり、jは約1〜約8の整数であり、kは約10〜約200の整数である。さらに他の例は、式:
【0095】
【化23】
【0096】
のポリマーである。式中、「G」は−(NH(CH2)3)3−CH2NH2−を含み、iおよびjは式(XVIII)で定義されたとおりであり、mは約1〜約8の整数である。
【0097】
非イオン性ポリエーテルブロックコポリマーおよびポリエーテルセグメントは、式:
【0098】
【化24】
【0099】
を有するブロックコポリマーによって例示される。式中、x、y、z、iおよびjは約2〜約800、好ましくは約5〜約200、より好ましくは約5〜約80の値であり、R1、R2の対のそれぞれについては、一方が水素原子でありかつ他方がメチル基である。式(XXIV)〜(XXVI)は過剰に簡略化されており、実際にはBブロック内のイソプロピレンラジカルの配向はランダムであろう。このランダムな配向は、式(XXVII)および(XXVIII)で示されており、これらはより完全である。このようなポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーは、Santon, Am. Perfumer Cosmet., 72(4):54−58 (1958); Schmolka, Loc. cit. 82(7):25−30 (1967); Non−ionic Surfactants, Schick, ed. (Dekker, N.Y., 1967), pp. 300−371.によって説明されている。多くのこのような化合物は、「リポロキサマー(lipoloxamer)」、「ポロキサマー(poloxamer)」、「プルロニック(Pluronic(登録商標))」および「シンペロニクス(synperonics)」という一般的な商品名で市販されている。B−A−B型のポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ポリマーは、しばしば「リバースド(reversed)」プルロニック(Pluronic(登録商標))、「プルロニック−R(Pluronic−R(登録商標))」または「メロキサポール(meroxapol)」と称される。
【0100】
式(XXVII)の「ポロキサミン」ポリマーは、テトロニック(Tetronic(登録商標))という商品名でBASF社(Wyandotte, MI)から市販されている。式(XXVII)で示されるポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンブロックの順序は逆でもよく、この場合には式(XXVIII)のテトロニック−R(Tetronic−R(登録商標))となり、これもまたBASF社から市販されている。Schmolka, J. Am. Oil. Soc., 59:110 (1979)を参照。ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーはまた、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイド反復単位のランダムな混合を含む親水性ブロックを用いて設計され得る。ブロックの親水特性を維持するためには、エチレンオキサイドを多く含ませるであろう。同様に、疎水性ブロックは、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイド反復単位の混合物であり得る。このようなブロックコポリマーは、プルラドットTM(PluradotTM)という商品名でBASF社より市販されている。
【0101】
プルロニックの多くは、以下の式:
【0102】
【化25】
【0103】
に適合するように設計されている。
【0104】
mおよびnの値は通常、統計的な平均で表され、与えられた分子の第一ブロックの反復単位数は通常、第三ブロックの反復単位数に正確に一致するわけではない。多くのブロックコポリマーの特徴は、式(XXIX)を引用して説明すれば、以下のようである。
【0105】
【表2】
【0106】
オキシエチレンおよびオキシプロピレン単位の平均数は、業者より提供された平均分子量(MW)を用いて計算された。コポリマーの親水性−親油性バランス(HLB)は、業者(BASF社)により決定された。臨界ミセル濃度(CMC)は、Kabanov et al., Macromolecules 28: 2303−2314 (1995)記載の表面張力法により決定された。
【0107】
本発明に関する他の特異的なポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーには以下を含むものもある。
【0108】
【表3】
【0109】
【0110】
好ましい実施形態において、組成物は、ポリヌクレオチドまたはその誘導体、および、少なくともひとつのブロックコポリマーを含み、該ブロックコポリマーはプルロニック(登録商標)F127およびL61である。他の実施形態において組成物は、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのブロックコポリマーを含み、該ブロックコポリマーはプルロニック(登録商標)P85である。
【0111】
式(XXVII)で示されるジアミン結合ブロックコポリマーもまた、以下の式:
【0112】
【化26】
【0113】
で示されるジアミン結合ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマーファミリーの一つであり得る。式中、破線は第二の窒素に続いているポリエーテルの対称的なコピーを表しており、R*は炭素原子が約2〜約6のアルキレン、炭素原子が約5〜約8のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、R1およびR2は(a)両方とも水素原子、または(b)一方は水素原子であり他方はメチル、のいずれかであり、R3およびR4は(a)両方とも水素原子、または(b)一方は水素原子であり他方はメチルのいずれかである。ここでR3およびR4の両方が水素原子の場合、R5およびR6の一つは水素原子であり他方はメチルであり、R3およびR4の一つがメチルの場合、R5およびR6の両方が水素原子である。
【0114】
あるブロックコポリマーの疎水性/親水性特性は、オキシプロピレン基の数に対するオキシプロピレン基の数の比に依存する。例えば、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)の単一のブロックコポリマーを含む組成物において、この関係は、中心の疎水性ブロックおよび末端の親水性ブロックの分子量を考慮すれば、以下のように表される。
【0115】
【数3】
【0116】
式中、Hはオキシプロピレン単位の数であり、Lはオキシエチレン単位の数である。疎水性のB型セグメントおよび親水性のA型セグメントを含むブロックコポリマーのような一般的な場合において、疎水性−親水性特性およびミセル形成特性は、以下のように定義されるn値に関連する。
【0117】
【数4】
【0118】
適切なn値を有するブロックコポリマーの選択は、特異的な物質の疎水性/親水性特性または、配合される物質の混合物の混合疎水性/親水性特性に依存する。典型的には、nは約0.2〜約9.0、より好ましくは約0.25〜約1.5の範囲の値をとりうる。この範囲は、数値的な臨界としてではなく、主に親水性であるポリ(オキシエチレン)ブロックおよび主に疎水性であるポリ(オキシプロピレン)ブロック間の最適な疎水性/親水性バランスを表しているとしてみなされるべきである。
【0119】
本発明の重要な観点は、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)の異なるブロックコポリマーの混合物を用い、適切な粒子径を保持しつつ、あるサイトカインまたはいくつかのサイトカインの混合物に適当な、より特異的な疎水性−親水性バランスを得ることである。例えば、第一のブロックコポリマーにおいてnは1.0であり、一方第二のブロックコポリマーにおいてnは1.5である。ここでnが1.3である材料を所望する場合、1質量部の第一のブロックコポリマーおよび1.5質量部の第二のブロックコポリマーを用いればよい。
【0120】
従って、このような混合物のより一般的な関係は以下のように示される。
【0121】
【数5】
【0122】
式中、H1およびH2はそれぞれ第一および第二のブロックコポリマーにおけるオキシプロピレン単位の数であり、L1は第一のブロックコポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり;L2は第二のブロックコポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり;m1は第一のブロックコポリマーの質量比であり;およびm2は第二ブロックコポリマーの質量比である。一般的に、Nは約0.2〜約9.0、より好ましくは約0.25〜約1.5の範囲の値をとるであろう。
【0123】
疎水性B型ブロックコポリマーおよび親水性A型ブロックコポリマーを含むK個のブロックコポリマーの混合物という、さらにより一般的な場合の場合、N値は以下のように表される。
【0124】
【数6】
【0125】
一種のポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーのみが用いられている場合、Nはnに等しいであろう。類似した関係が、二つ以上のポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーを用いている組成物に適用される。
【0126】
ブロックコポリマーの混合物が使用されている場合、N値が用いられ、この値は、構成するコポリマーの質量比に基づいて平均された、関与している各コポリマーそれぞれについてのnの加重平均であろう。N値は、コポリマー混合物のミセル形成特性を概算するのに用いられる。ブロックコポリマー混合物を使用すると溶解度が増し、血清タンパク質存在下でより疎水性のブロックコポリマーが凝集することを妨げる。特に、エチレンオキサイド含有量が50%を超過するポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーは、エチレンオキサイド含有量が50%以下である疎水性ブロックコポリマーを可溶化する。好ましくは、ブロックコポリマーの混合物は、70%以上のオキシエチレン含有量を有するブロックコポリマーおよび、オキシエチレン含有量が50%以下である少なくとも一つのブロックコポリマーを含む。より特異的には、プルロニック(登録商標)F127が好ましい。このような混合物において、疎水性および親水性コポリマーの好ましい比は少なくとも2:1(w/w)、好ましくは少なくとも5:1(w/w)、さらにより好ましくは少なくとも8:1(w/w)である。ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー以外のコポリマーが用いられる場合、あるポリマークラスの一つのポリマーの疎水性/親水性特性を、他のクラスのものの特性に関連させることに同様のアプローチが応用されうる。
【0127】
上記パラメータを用いて、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)の一つ以上のブロックコポリマーを、N値が約0.1〜約9、より好ましくは約0.25〜約1.5になるように結合させる。結合したコポリマーはミセルを形成し、N値はこのようにして形成されたミセルのサイズにある程度影響を及ぼす。この範囲は広く変化し得るが、典型的には、ミセルは約10〜約25nmの平均直径を持つ。得られた調製物の平均直径のほとんどは、準弾性光散乱技術によって簡単に測定できる。
【0128】
本発明の一実施形態によれば、組成物は、ポリヌクレオチドまたはその誘導体、および、ブロックコポリマーが分子溶液またはコロイド分散(コロイド分散は、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体または他のタイプの分子凝集体または分子種を含むがこれらに限定されない)である少なくとも一つのポリエチレン−ポリプロピレンブロックコポリマーを含む。分子溶液またはコロイド分散において、ブロックコポリマーにより形成された分子種のサイズは、本発明の組成物の有用性を決定する一つの主要なパラメータである。体内へ投与した後、大きい粒子は網内皮系組織で除去され、容易に病変部位に輸送され得ない(例えばKabanov et al., J. Contr. Release, 22, 141 (1992); Volkheimer. Pathologe 14:247 (1993); Kwon and Kataoka, Adv. Drug. Del. Rev. 16:295 (1995)を参照)。また、大きい粒子の細胞中の輸送および細胞内の運搬は、制限されるかまたはわずかである。例えばLabhasetwar et al. Adv. Drug Del. Res. 24:63 (1997)を参照。300nm〜1μm超のサイズを有する凝集したカチオン性分子種は、細胞のトランスフェクションに有効ではない。Kabanov et al., Self−Assembling Complexes for Gene Delivery. From Laboratory to Clinical Trial, Kabanov et al. (eds.), John Wiley, Chichester (1998)および引用文献を参照。大きい粒子、特に正に荷電しているものは、一部肝臓や塞栓症への悪影響のため体内で高い毒性を示す。例えばVolkheimer, Pathologe 14:247 (1993); Khopade et al Pharmazie 51:558 (1996); Yamashita et al., Vet. Hum. Toxicol., 39:71 (1997)を参照。小さいポリマー分子種は非毒性であり、体内の細い毛細血管に入り、体内で病変部位に輸送され、生物学的関門(血液脳関門、腸上皮を含むがこれらに限定されない)を通過して、細胞内小胞に吸収されて細胞膜を通過し、細胞内の標的部位へ輸送される。このサイズ範囲の粒子は、より大きいサイズの微粒子に比べてより効果的に動脈壁を通過すると考えられている。Labhasetwar et al., Adv. Drug Del. Res. 24:63 (1997)を参照。特定の理論に制限されることを望むわけではないが、体積に対する高い表面積比により、標的分子を用いたこのような粒子の良好な標的化には、小さなサイズは必須であるとも考えられる。本発明の組成物中で形成される分子種の好ましい範囲は、約300nm未満、より好ましくは約100nm未満、さらにより好ましくは約50nm未満である。
【0129】
他の観点において本発明は、式(I)〜(XIII)で示される少なくとも一つのブロックコポリマーを含むポリヌクレオチド複合体に関し、ここでA型およびB型ブロックは大体は式−0−R9の反復単位で構成され、式中、R9は:
(1)−(CH2)n−CH(R6)であり、ここでnは0〜約5の整数であり、R6は水素、炭素原子3〜8のシクロアルキル、炭素原子1〜6のアルキル、フェニル、アルキルが炭素原子1〜6を有するアルキルフェニル、ヒドロキシ、アルキルが炭素原子1〜6を有するヒドロキシアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子2〜7のアルキルカルボニル基、アルコキシが炭素原子1〜6を有するアルコキシカルボニル、アルコキシおよびアルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するアルコキシカルボニルアルキル、各アルキルが炭素原子1〜6を有するアルキルカルボキシアルキル、アルキル基が炭素原子1〜6を有するアミノアルキル、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するアルキルアミンまたはジアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するモノ−またはジ−アルキルアミノアルキル、クロロ、またはアルキルが炭素原子1〜6を有するクロロアルキル、フルオロ、アルキルが炭素原子1〜6を有するフルオロアルキル、シアノ、またはアルキルが炭素原子1〜6を有するシアノアルキル、またはカルボキシル;(2)環炭素原子3〜8の炭素環式化合物基であり、ここで該基は例えばシクロアルキルまたは芳香族基であり、これは炭素原子1〜6のアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子1〜6のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロ、または、クロロ置換基を含んでいてもよい;または(3)環原子3〜8の複素環式化合物基であり、これはヘテロシクロアルキルまたはヘテロ芳香族基を含んでいてもよく、これらは酸素原子、窒素原子、硫黄原子およびこれらの混合物からなる群より選択されるヘテロ原子を1〜4含んでいてもよく、これらは、炭素原子1〜6のアルキル、炭素原子1〜6のアルコキシ、炭素原子1〜6のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子1〜6を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロまたはクロロ置換基を含んでいてもよい、である。
【0130】
好ましくは、nは1〜3の整数である。R5を含む炭素環式化合物基または複素環式化合物基は、好ましくは環原子が4〜7、より好ましくは環原子が5〜6である。ヘテロ環は好ましくは1〜2のヘテロ原子を含み、より好ましくは該ヘテロ環は一つのヘテロ原子を有する。好ましくは、該ヘテロ環は炭化水素または炭化水素類似体である。これらのポリヌクレオチドを生成するのに必要なモノマーは合成によって得られることは、当業者であれば理解するであろう。本技術の当業者であればわかるように、いくつかの場合において、モノマーの重合は適切な保護基の使用が必要であろう。一般的に、A型およびB型ブロックは、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、さらにより好ましくは少なくとも約95%が−OR5−で示される反復単位である。
【0131】
他の観点において、本発明は、式(I)〜(XIII)のうち一つのブロックコポリマーを含むポリヌクレオチド複合体に関し、ここで、A型およびB型ブロックは−O−R5で示される反復単位を必須として有し、式中、R7は炭素−炭素のアルキル基(C to C alkyl group)である。
【0132】
本発明で用いられるブロックコポリマーは一般的に、特定の環境下で直径約10nm〜約100nmのミセルを形成する。ミセルは、水溶液中において両親媒性物質の非極性部分のミクロ相分離によって形成される、特定の両親媒性分子の超分子複合体である。ミセルは、特定の温度で、両親媒性物質の濃度が該両親媒性物質固有の臨界ミセル濃度(「CMC」)に達した場合に形成される。このようなミセルは一般的に、約10〜約300のブロックコポリマーを含む。ブロックコポリマーの親水性および疎水性部分の大きさを変えることにより、生理学的な状況でのコポリマーのミセル形成傾向を変えることができる。ミセルは、Bブロックの水不溶性反復単位で形成された高密度コア(dense core)、荷電が中和された核酸(charge−neutralized nucleic acids)、および、Aブロックで形成された親水性殻を有する。ミセルは、溶液中において並進および回転の自由を有しており、ミセルを含む溶液は水同様の低い粘度を有する。ミセル形成は、一般的に約0.001〜5%(w/v)のコポリマー濃度で起こる。一般的に、ポリカチオン性ポリマーおよびポリ核酸の濃度は、ポリヌクレオチド組成物中のコポリマーの濃度より低く、好ましくは少なくとも約10倍未満、より好ましくは少なくとも約50倍未満である。
【0133】
本発明で用いられるブロックコポリマーのいくつかは、高濃度でゲルを形成するであろう。これらのゲルは、コポリマー分子の並進および回転の自由がコポリマー分子間の相互作用の連続したネットワークにより顕著に強制される粘性系である。ゲル中においてBブロック反復単位のミクロ分離は、生じるかもしれないし、生じないかもしれない。ゲルの形成を防ぐために、ポリマー濃度(ブロックコポリマーおよびポリエーテル/ポリカチオンポリマーの両方に関する)は好ましくは約15%(w/v)未満、より好ましくは約10%未満、さらにより好ましくは約5%未満であろう。本発明の第一の実施形態において、ゲルは回避されることがより好ましい。
【0134】
ポリヌクレオチド組成物がカチオン性成分を含む場合、該カチオンはポリヌクレオチドのリン酸基と会合し、リン酸基の荷電を中和し、ポリヌクレオチド成分をより疎水性化させる。この中和は、好ましくはR型ポリマーセグメントまたはポリカチオン性ポリマー上のカチオンによってなされる。しかしながら、リン酸の電荷は、化学的な改変によって、または、N−[l−(2,3−ジオレイルオキシ)−プロピル]−N,N,N,−トリメチルアンモニウムクロライド]のような疎水性カチオンとの会合によっても中和され得る。水溶液中において、電荷が中和されたポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド複合体」と称される超分子ミセル様粒子を形成して沈殿する。疎水性核または複合体は、電荷が中和されたポリヌクレオチドおよびB型コポリマーブロックを含む。親水性殻は、A型コポリマーブロックを含む。複合体の大きさは、一般的に直径が約10nm〜約100nmの範囲で変化する。ある環境においては、組み込まれなかった成分から複合体を分離することが実用的である。これは例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーによって分離され得る。
【0135】
ポリヌクレオチド組成物の成分比は、組成物中のポリヌクレオチドの効果的な膜間透過性を最適化するのに重要な要素である。この比は比φとみなすことができ、これは、生理学的なpHで、組成物中の正に荷電した基の、負に荷電した基に対する比である。φ<1の場合、複合体は、ポリヌクレオチドにより中和されていないリン酸塩を含む。中和されていない電荷に隣接したポリヌクレオチド部分は、ポリヌクレオチド複合体のシェルの一部になると考えられる。同様に、φ>1の場合、ポリカチオン性ポリマーまたはR型セグメントは中和されていない電荷を有し、中和されていない部分は複合体のシェルの一部を形成するために折り畳まれるであろう。一般的に、φは約0(この場合、カチオン性の基は存在しない)〜約100の範囲で変化し、好ましくはφは約0.01〜約50、より好ましくは約0.1〜約20の範囲で変化するであろう。φは、膜間輸送の効率を上げるために変えてもよいし、組成物がポリヌクレオチド複合体を含む場合には、複合体の安定性を上げるために変えてもよい。φの多様性はまた、動物に投与された後の複合体の生体内分布に影響を与え得る。最適なφは、特に(1)ポリヌクレオチド複合体が用いられている環境、(2)用いられている特異的なポリマーおよびオリゴヌクレオチド、(3)標的化された細胞または組織、および(4)投与方法、に依存するであろう。
【0136】
界面活性剤を含むポリヌクレオチド組成物 本発明はまた、ポリヌクレオチド、カチオン性コポリマーおよび適切な界面活性剤の組成物も含む。界面活性剤は、(i)カチオン性(様々なトランスフェクションカクテルにおいて用いられるものを含む)、(ii)非イオン性(例えばプルロニックまたはテトロニック)、または(iii)両性イオン(ベタインおよびリン脂質を含む)である。これらの界面活性剤は複合体の溶解度を増し、組成物の生物学的活性を増す。
【0137】
適切なカチオン性界面活性剤としては、第1級アミン、第2級アミン、第3級アミン(例えばN,N’,N’−ポリオキシエチレン(10)−N−タロウ−1,3−ジアミノプロパン)、第4級アミンの塩(例えばドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、混合されたアルキルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、メチルベンゼトニウムクロライド、デカメトニウムクロライド、メチルが混合されたトリアルキルアンモニウムクロライド、メチルトリオクチルアンモニウムクロライド、N,N−ジメチル−N−[2−(2−メチル−4−(1,1,3,3−テトラメチルブチル)−フェノキシエトキシ)エチル]−ベンゼンメタンアミニウムクロライド(N,N−dimethyl−N−[2−(2−methyl−4−(1,1,3,3−tetramethyl−butyl)−phenoxy)−ethoxy]ethyl)−benzenemethanaminium chloride)(DEBDA)、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)−プロピル]−N,N,N,−トリメチルアンモニウムクロライド、1,2−ジアシル−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(アシル基=ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル)、1,2−ジアシル−3−(ジメチルアンモニオ)プロパン(アシル基=ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル)、1,2−ジオレオイル−3−(4’−トリメチルアンモニオ)ブタノイル−syn−グリセロール、1,2−ジオレオイル−3−スクシニル−syn−グリセロールコリンエステル、コレステリル(4’−トリメチルアンモニオ)ブタノエート)、N−アルキルピリジニウム塩(例えば、セチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロライド)、N−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラフォーム電解質(dicationic bolaform electrolytes)(C12Me6;C12Bu6)、ジアルキルグリセリルホスホリルコリン、リゾレシチン、L−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン(例えば、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン(DPPES)、リポポリ−L(またはD)−リジン(LPLL,LPDL)、N−グルタリルホスファチジルエタノールアミンに結合したポリ(L(またはD)−リジン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタメートエステル(C12GluPhCnN+)、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタメートエステル(C14GluCnN+)、コレステロールのカチオン性誘導体(例えば、コレステリル−3β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−3β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−3β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−3β−カルボキシルアミドエチレンジメチルアミン、3β[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン−カルボモイル)コレステロール])を含む。
【0138】
適切な非イオン性界面活性剤としては、n−アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、n−アルキルポリオキシエチレンエーテル(例えばトリトンTM)、ソルビタンエステル(例えば、スパンTM)、ポリグリコールエーテル界面活性剤(テルギトールTM)、ポリオキシエチレンソルビタン(例えばトゥイーンTM)、ポリソルベート、ポリオキシエチル化グリコールモノエーテル(例えばBrijTM、ポリオキシエチレン9ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン10エーテル、ポリオキシエチレン10トリデシルエーテル)、ルブロール、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイドのコポリマー(例えばプルロニックTM、プルロニックRTM、テロニックTM、プルラドットTM)、アルキルアリールポリエーテルアルコール(チロキサポールTM)、パーフルオロアルキルポリオキシ化アミド、N,N−ビス[3−D−グルコンアミドプロピル]コラミド、デカノイル−N−メチルグルカミド、n−デシル−α−D−グルコピラノジド、n−デシル−β−D−グルコピラノジド、n−デシル−β−D−マルトピラノジド、n−ドデシル−β−D−グルコピラノジド、n−ウンデシル−β−D−グルコピラノジド、n−ヘプチル−β−D−グルコピラノジド、n−ヘプチル−β−D−チオグルコピラノジド、n−ヘキシル−β−D−グルコピラノジド、n−ノナノイル−β−D−グルコピラノジド1−モノオレイル−rac−グリセロール、ノナノイル−N−メチルグルカミド、n−ドデシル−α−D−マルトシド、n−ドデシル−β−D−マルトシド、N,N−ビス[3−グルコンアミドプロピル]デオキシコラミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ジギトニン、ヘプタノイル−N−メチルグルカミド、ヘプタノイル−N−メチルグルカミド、オクタノイル−N−メチルグルカミド、n−オクチル−β−D−グルコピラノジド、n−オクチル−α−D−グルコピラノシド、n−オクチル−β−D−チオガラクトピラノジド、n−オクチル−β−D−チオグルコピラノジド、を含む。
【0139】
適切な両性イオン性界面活性剤としては、ベタイン(R1R2R3N+R’CO2 −、式中、R1R2R3R’は炭化水素鎖であり、R1が最も長い)、スルホベタイン(R1R2R3N+R’SO3 −)、リン脂質(例えば、ジアルキルホスファチジルコリン)、3−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート、3−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホネート、N−デシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、N−ドデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、N−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、N−オクタデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、N−オクチル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、N−テトラデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、およびジアルキルホスファチジルエタノールアミンを含む。
【0140】
ポリヌクレオチド/核酸 広範多種のポリヌクレオチドまたは核酸分子が組成物のポリヌクレオチド成分になり得る。これらは、ウイルス、天然および合成のDNAまたはRNA分子、それらの類似体、またはこれらの誘導体、ならびに、(親油性基、光誘導性架橋基、アルキル化基、有機金属化合物基、挿入基、親油性基、ビオチン、蛍光性、および放射性基、ならびに、リン酸主鎖を改変する基、を含む基を組み込むために)共有結合で改変されている核酸分子、を含む。このような核酸分子は、アンチセンス核酸分子、ウイルス、ウイルスベクター、遺伝子をコードしたDNA(通常、適切なプロモータ配列を含む)、リボザイム、アプタマー、抗原核酸、オリゴヌクレオチドα−アノマー、エチルホスホトリエステル類似体、アルキルホスホメート、ホスホロチオネートおよびホスホロジチオネートオリゴヌクレオチドおよびこれら様のものを含むがこれらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、分泌性もしくは非分泌性タンパク質またはペプチド、ワクチンまたは抗原をコードする核酸分子であり得る。実際には、核酸成分は、動物に投与した後、より高効率で細胞に輸送されるのに有利であり、分解過程に対して安定であり、または、その生体内分布が改善されるような任意の核酸であり得る。
【0141】
標的分子 場合によっては、非共有結合的な会合により標的分子を組み込むことが望ましい。例えば、Kabanov et al., J. Controlled Release, 22:141 (1992)を参照、この内容はここに参照されることにより組み込まれる。組成物に会合され得る標的分子は、一般的に細胞の部位および疎水性基に対して親和性がある標的基を有する。標的分子は、自発的にポリヌクレオチド複合体と会合し、疎水性基を介してそこで「アンカー」になるであろう。組成物中においてこれらの標的付加体は、一般的に約10%以下のコポリマーを含むであろう。
【0142】
標的分子において、疎水性基は、特に脂肪族アシル基のような脂質基であり得る。あるいは、それはブロックコポリマーまたは他の天然合成ポリマーであり得る。標的分子の標的基はしばしば、一般的にはある細胞表面の抗原に対して特異性を有する抗体を含む。それはまた、例えば細胞表面受容体との特異的な相互作用を有するホルモン、または細胞表面受容体を有する薬剤であり得る。例えば、糖脂質は、多糖の受容体を標的化するのに機能する。標的分子は、R型ポリマーブロックを含むここで挙げられた任意のポリマーブロックおよびポリカチオン性ポリマーに結合され得る。例えば、標的分子は、本発明のブロックコポリマーのポリエーテルセグメントの、自由末端基に共有結合され得る。このような標的分子は、式XVIII、XIX、XXおよびXXIで示されるポリマーの−OH末端基、および、式XVIII(好ましくは末端のリジン残基のε−アミノ基)、XXまたはXXIIIで示されるポリマーの−NH2末端基、または、式XVIIIおよびXIXで示されるポリマーの−COOH末端基に共有結合し得る。標的分子は、例えばSoukchareun et al., Bioconjugate Chem., 6:43 (1995), or Arar et al., Bioconjugate Chem., 6:43 (1995)に記載されているように紡錘菌由来のペプチド(fusogenic peptides)を、核型ペプチド(caryotypic peptides)を、または細胞への部位指向的輸送(特に、エンドソーム性の小胞から細胞質への移動、または、核への運搬)を提供する生物学的に特異的な他の基を標的分子として用いて、ポリヌクレオチド組成物の細胞内輸送、例えば核への輸送、を促進するために用いられ得る。
【0143】
組成物のポリヌクレオチド成分は、任意のポリヌクレオチドであり得るが、好ましくは少なくとも3個、より好ましくは少なくとも5個の塩基を有するポリヌクレオチドである。さらにより好ましくは少なくとも10個の塩基である。ウイルスのゲノムおよびウイルス(脂質またはタンパク質のウイルス外殻を含む)も適切なポリヌクレオチドに含まれる。これは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス−ウイルス、またはポックスウイルスを含むがこれらに限定されないウイルスベクターを含む。本発明に用いられる他の適切なウイルスベクターは、当業者には明白であろう。「ポリ(核酸)」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ここでは同じ意味で使用されている。オリゴヌクレオチドとは、DNAおよびRNAのようなポリヌクレオチドである。
【0144】
ポリヌクレオチド誘導体は、一以上の部分を有するポリヌクレオチドであり、(i)該部分は、結果生じる物質がポリヌクレオチドとして機能できるように、開裂され、不活性化され、そうでなければ改変される、または(ii)該部分は、誘導体がポリヌクレオチドとして機能することを妨害しない。
【0145】
治療用途 本発明の組成物は、様々な治療に用いられ得る。好ましい実施形態において、該組成物は樹状細胞の活性化もしくは増殖を誘導するため、および、上記記載の組成物を投与することにより、動物における免疫応答を増強させるために用いられる。好ましくは、樹状細胞活性化誘導のための該組成物は、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む。より好ましくは、該ブロックコポリマーは、プルロニックF127およびL61である。さらにより好ましい実施形態においては、該ブロックコポリマーは約2%(w/v)のF127および約0.025%のL61の混合物である。他の特異的な実施形態においては、該ブロックコポリマーはプルロニックF127/プルロニックL61の10倍希釈物であり、他の実施形態においては、該ブロックコポリマーはプルロニックF127/プルロニックL61の100倍希釈物である。別の特異的な実施形態においては、該ブロックコポリマーは、プルロニックF127およびL61の8:1の混合物である。
【0146】
例えば、組成物は、遺伝子置換または除去治療、および遺伝子付加治療を含む遺伝子治療に用いられ得る(B. Huber, Gene therapy for neoplastic diseases; B.E. Huber and J.S. Lazo Eds., The New York Academy of Sciences, N.Y., N.Y., 1994, pp. 6−11)。また、アンチセンス治療は、細胞の核および/または細胞質中の遺伝子を標的とする結果、それらを阻害する(Stein and Cheng, Science 261:1004 (1993); De Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res., 28:366 (1995))。アプタマー核酸薬剤は、細胞内および細胞外両方のタンパク質、ペプチドおよび小分子を標的にする。Ellington and Szostak, Nature (London), 346:818 (1990)を参照。抗原核酸化合物は、核中の二重鎖DNAを標的とするのに用いられ得る。Helene and Tolume, Biochim, Biophys., Acta 1049:99 (1990)を参照。触媒性ポリヌクレオチドは、核および/または細胞質中のmRNAを標的とする。Cech, Curr. Opp. Struct. Biol., 2:605 (1992)。
【0147】
置換、阻害および/または付加された遺伝子の例としては、治療用分泌タンパク質、非分泌タンパク質、ワクチンおよび抗原、アデノシンデアミナーゼ、腫瘍壊死因子、細胞成長因子、IX因子、インターフェロン(例えばα−、β−およびγ−インターフェロン)、インターロイキン(例えばインターロイキン2,4,6および12)、HLA−B7、HSV−TK、CFTR、HIV−1、β−2、ミクログロブリン、レトロウイルス遺伝子(例えばgag、pol、env、taxおよびrex)、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス遺伝子(例えば単純疱疹ウイルスタイプIおよびII遺伝子ICP27/UL54、ICP22/US1、ICP/IE175、プロテインキナーゼおよびエキソヌクレアーゼ/UL13、プロテインキナーゼ/US3、リボヌクレアーゼレダクターゼICP6/UL39、かなり初期の(IE)mRNA IE3/IE175/ICP4,1E4/ICP22/US1,IE5/ICP47,IE110、DNAポリメラーゼ/UL30、UL13)、ヒト多剤耐性遺伝子(例えばmdrl)、腫瘍遺伝子(例えばH−c−ras、c−myb、c−myb、bcl−2、bcr/abl)、ガン抑制遺伝子p53、ヒトMHC遺伝子(例えばクラス1MHC)、免疫グロブリン(例えばIgG、IgM、IgE、IgA)、ヘモグロビンαおよびβ鎖、酵素(例えば炭酸脱水素酵素、トリオースホスフェートイソメラーゼ、GTP−シクロヒドロラーゼI、フェニルアラニンヒドロラーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、グルコセロブロシダーゼ、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ)、ダイソトロピン、フィブロネクチン、アポリタンパク質E、嚢胞性繊維症の膜間コンダクタンスタンパク質、c−srcタンパク質、V(D)J組換え活性化タンパク質、免疫遺伝子、ペプチドおよびタンパク質抗原(「DNAワクチン」)、およびこれら様のものを含む。
【0148】
本発明によれば、二以上のプラスミドもしくは遺伝子が発現しうる。これは、抗原を発現する少なくとも一つの遺伝子、および、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞を活性化し、それによって抗原提示の増強および免疫応答の誘導のためのアジュバントとして機能できる分子;例えばサイトカイン、を発現する少なくとも一つの遺伝子を含んでもよい。このようなアジュバントの例としては、インターロイキン−12、Flt3リガンド、GM−CSF、CD4Oリガンドのようなインターロイキンを含むがこれらに限定されない。抗原には、免疫応答が生じるどのような産物でもなりうる。加えて、抗原もしくはアジュバントタンパク質を遺伝子治療と併用してもよい。例えば、FLT−3リガンドを、抗原をコードするプラスミドもしくはレトロウイルスとともに体内に注入することができる。
【0149】
プルロニックF127/プルロニックL61混合物は、樹状細胞の浸潤を誘導するサイトカインおよびケモカイン様と知られている、NF−κB誘導性遺伝子を誘導することができる。下記に示すように、SP1O17はプロモーター依存性を有し、転写因子NF−κBの活性化を助けるようである。CMVプロモーターもしくはNF−κB感受性エレメントカセットにより誘導されるDNA構築物は、SV−40プロモーターもしくはAP−1感受性カセットによる構築物と比較して、プルロニックF127/プルロニックL61のキャリア作用に対してかなり応答性であることが研究により証明されており、プルロニックF127/プルロニックL61は、デリバリー作用に加えて、導入遺伝子発現の転写調節を妨げることにより生物学的応答調節剤として機能しているということが示唆されている。
【0150】
NF−κBのp65サブユニット(RelA、NFκB3、およびNF−κB p65サブユニットとしても知られている)は、p50、cRel、p52およびRelBを含む、Rel/NF−κB転写因子ファミリーの一員である。NF−κB p65サブユニットははじめ、保存ドメインを癌原遺伝子cRelに渡すためのプローブとして用いたJurkatT細胞から単離され(Ruben et al., Science, 1991, 251, 1490−1493)、それ以来、自然発生的な転換によるタンパク質の変異体が存在することが示されている(Narayanan et al., Science, 1992, 256, 367−370)。加えて、NF−κB結合DNA配列が多くの遺伝子において発見され、それが遺伝子の機能の発現に、実際に重要であることが示されている。NF−κB結合配列(κBモチーフ)は、G(グアニン)クラスターで始まり、C(シトシン)クラスターで終わる共通配列を有する約10塩基からなる。(コンセンサス配列 5’−GGGRNNYCCC−3’)。しかしながら、炎症性タンパク質として知られているインターロイキン−1(以下、IL−1と称することもある)および腫瘍壊死因子(以下、TNFと称することもある)の遺伝子上に、DNA結合タンパク質が結合しうる多くの配列が存在しており、NF−κB結合配列はここにも存在していることが知られている(Clark, B. D. et al., Nuci. Acids Res., 14, 7898, 1984; Nedospasov, S. A. et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 51, 611, 1986)。NF−κBの結合により、mRNAへの転写が阻害されることが報告されている(Hiscott, J. et al., Mol. Cell. Biol., 13, 6231, 1993; Collart, M. A. et al., Mol. Cell. Biol., 10, 1498, 1990)。
【0151】
遺伝病もまた、該組成物により治療することができる。このような疾患は、リウマチ、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、α−サラセミア、β−サラセミア、カルボニックアンヒドラーゼII欠損症、トリオースリン酸イソメラーゼ欠損症、テトラヒドロビオプテリン欠損性高フェニルアラニン血症、古典的フェニルケトン尿症、Duchenne筋ジストロフィーのような筋ジストロフィー、高サルコシン血症、腺腫性腸ポリポーシス、アデノシンデアミナーゼ欠損症、悪性黒色腫、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、動脈硬化症および高コレステロール血症、Gaucher病、嚢胞性線維症、大理石骨病、自然発生腫瘍の増加、TおよびB細胞免疫不全、高コレステロール、慢性関節リウマチを含む関節炎、緑内障、アルコール中毒症およびこれらに類似した症状、を含む。
【0152】
該組成物は、乳癌(例えば、胸部、膵臓、胃、前立腺、結腸直腸、肺、卵巣)、リンパ腫(ホジキン及び非ホジキンリンパ腫)、黒色腫及び悪性黒色腫、進行癌血友病B、腎細胞癌、膠芽腫、星状細胞腫、神経膠腫、AMLおよびCMLなどの症状を含むがこれらに限定されない腫瘍性疾患の治療にも用いることができる。
【0153】
さらに該組成物は、(i)脳卒中、Duchenne筋ジストロフィーに関連した心筋症、心筋虚血、再狭窄およびこれらに類似した症状を含むがこれらに限定されない心血管性疾患、(ii)肝炎、HIV感染およびAIDS、ヘルペス、CMVおよびCMVrenitisのような関連疾患、のような感染性疾患、(iii)腎移植の拒絶反応およびこれに類似した症状のような移植関連障害、の治療に用いることができ、(iv)黒色腫ワクチン、HIVワクチン、マラリア、結核およびこれらに類似したワクチンを含むがこれらに限定されないワクチン療法および免疫処置療法において有用である。ポリヌクレオチドおよびウイルスがワクチンおよび免疫処置に用いられる全ての適用において、該組成物は有用である。
【0154】
標的細胞 本発明はまた、本発明の組成物を投与することからなる、ポリヌクレオチドを細胞にデリバリーする方法にも関する。一つの実施形態において、細胞にポリヌクレオチドをデリバリーする方法は、ブロックコポリマーはゲルを形成するには不十分な量で存在する、ポリヌクレオチドまたはその誘導体および少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを含む。他の実施形態において、該ブロックコポリマーは約15%(w/v)未満の濃度で存在し、より好ましくは約10%(w/v)未満の濃度で存在し、最も好ましくは約5%(w/v)未満の濃度で存在する。更なる実施形態は、該組成物は分子溶液またはコロイド分散を形成し、より好ましくは、該コロイド分散は、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体、または他のタイプの分子凝集体である
ポリヌクレオチド組成物のデリバリーのための標的細胞は、樹状細胞、原核もしくは真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞であるが、これに限定されない。細胞標的は生体外および/または生体内であり、TおよびB細胞、原発性慢性骨髄性白血病、腫瘍浸潤リンパ球、腫瘍細胞、白血病細胞(HL−60、ML−3、KG−1およびこれらの類似体など)、皮膚線維芽細胞、筋芽細胞、一次ニューロンを含む中枢神経系の細胞、肝細胞、癌腫(Bladder癌腫T24、ヒト結腸癌腫Caco−2など)、黒色腫、CD34+リンパ球、NK細胞、マクロファージ、造血細胞、神経芽腫(LAN−5およびこの類似体など)、神経膠腫、リンパ腫(バーキットリンパ腫ST486など)、JD38)、T細胞ハイブリドーマ、一次平滑筋のような筋細胞、およびこれらの類似体を含む。
【0155】
使用方法 本発明のポリヌクレオチド組成物は例えば、ニワトリ、ブタ、雌ウシ、ネコ、イヌ、ウマ、魚、小エビ、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを含むがこれらに限定されない、動物の治療に用いることができる。本発明のポリヌクレオチド組成物は、経口で、局所的で、経直腸で、経膣で、エアロゾルを用いて経肺的に、もしくは非経口的に、すなわち、筋肉内に、皮内に、皮下に、腹腔内にまたは静脈内に投与することができる。樹状細胞の活性化を誘導し、動物における免疫応答を増強するために、好ましい投与経路は、静脈内、経口、皮内、筋肉内、皮下もしくは腹腔内を含むがこれに限定されない。好ましくは、該投与経路は腫瘍への直接注入である。該ポリヌクレオチド組成物は単独で、もしくは、標準的な調剤実務にしたがって、調剤的に許容できるキャリアーもしくは賦形剤と組み合わせて投与することができる。経口投与のために、該ポリヌクレオチド組成物は、錠剤、カプセル、舐剤、トローチ、散剤、シロップ、エリキシル、水溶液、およびサスペンジョン、およびこれらの類似体として用いられることができる。錠剤の場合には、使用されるキャリアーは乳糖、クエン酸ナトリウムおよびリン酸塩を含む。デンプンのような様々な崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような滑沢剤が、錠剤において通常用いられる。カプセルの形状で経口投与するために、有用な希釈剤は、乳糖および高分子量のポリエチレングリコールである。経口使用のため水性懸濁液が必要な際には、ポリヌクレオチド組成物を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせることができる。必要とあらば、甘味剤および/または矯味剤を加えることができる。非経口使用のためには、結合体(conjugate)の滅菌液が通常調製され、該溶液のpHは適当に調節され緩衝化される。静脈内使用のためには、調製液を等張化するために、溶質の総濃度を調節すべきである。目に投与するためには、綿棒や点眼器のような技術として知られている眼のデリバリーシステム(ocular delivery systems)により、軟膏や滴下可能な液体を導入してもよい。このような組成物はヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはポリ(ビニルアルコール)のような粘膜模擬剤(mucomimetics)、ソルビン酸、EDTAもしくは塩化ベンジルクロニウムのような防腐剤、および通常量の希釈剤および/またはキャリアーを含むことができる。経肺的投与のためには、エアロゾルが形成できるよう適当に希釈剤および/またはキャリアーを選択する。
【0156】
筋肉内投与のためには、裸のポリヌクレオチド自体は、ポリカチオンを含まないデリバリーシステムによって筋肉内に移行し発現できるため、ポリヌクレオチドの配合物にポリカチオン性成分があってはならない。筋肉は以下の特徴を有する:独特な細胞構造、筋管あたり複数の核、特異的ポリヌクレオチド結合タンパク質(トリアジン)および独特の核−細胞質輸送。上記のどの特徴が筋肉において裸のポリヌクレオチドの取り込みおよび発現に関与しているのかについては、現在において、まだ明らかではない。ポリヌクレオチドのカチオン性複合体が、ほとんど全ての型の組織において取り込みおよび遺伝子発現を増強することが示されているが、驚くべきことに、同じ複合体が、筋肉においてはよりよい取り込みおよび遺伝子発現に貢献しないのである。実際、ポリヌクレオチドのカチオン性複合体形成は筋肉において取り込みおよび遺伝子発現を阻害し、いくつかの研究所により報告がされている。したがって、ポリヌクレオチドを筋肉内注入するためには、ポリヌクレオチドの複合体化は避けるべきである。本発明は、ポリヌクレオチドの筋肉内導入には非イオン性ブロックコポリマーを用いる。in vitroおよびin vivoにおいて、遺伝物質を細胞内に移行させるのにブロックコポリマー単独では全く不十分である(実施例42参照)。さらに、ポリカチオン含有ブロックコポリマーとは異なり上述の非イオン性ブロックコポリマーは、肺、肝、腎のような末梢器官における遺伝子発現を増加させない。
【0157】
以下の例は、本発明の特徴をより代表して表すのに有用であろうが、それらの範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【0158】
実施例1
形質移入効率
この実験においては、プラスミドpβ−Galを、マウス乳腺癌系のNIH3T3細胞に導入した。プラスミドpβ−Galは、真核生物の転写単位および大腸菌(E. coli)のβ−ガラクトシダーゼのハイブリッドが組み込まれているプラスミドpUC19(the Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciencesより入手)を含む。このプラスミドを用いて、処置された細胞から得られるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより、細胞の取り込み効率を測定することができる。用いられたコポリマーは、xとzとの和は51であり、yは39である式(XIV)のトリブロックコポリマー(以下、「プルロニックA」)であった。用いられたポリカチオンは、ポリ(N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド)(「pEVP−Br」)であった。10μg/mlのpβ−Gal(大多数がスーパーコイル)溶液は、10mg/mlのプルロニックAおよび45μg/mlのpEVP−Brを含むPBS溶液中で調製された。これらの量は、ポリカチオン塩基のプラスミドリン酸基に対する比が約10になるように計算された。プルロニックAのDNAに対する比は約104であった。このストック調製物はろ過滅菌され、その一部分が無血清ダルベッコ改変イーグル培地(「DMEM」)で10倍に希釈され、pβ−Galの濃度を1μg/mlとした。この溶液を、「プルロニックA形質移入培地」とした。
【0159】
NIH3T3細胞を、37℃、5%CO2のもとで、2mMグルタミンおよび10%ウシ胎児血清(「FCS」)を含むDMEM培地を用いて単層培養で成長させた。単層培養で成長させた細胞は回収され、新鮮な培地で3回洗浄することにより処理プロセス用(transaction process)に調製された。
【0160】
本発明の方法により形質転換される、洗浄された細胞の一部は、プルロニックA形質移入培地に106細胞/mlの濃度で懸濁された。懸濁された細胞は、37℃、5%CO2のもとで2時間インキュベートされた。次に細胞は新鮮な培地で洗浄され、再び平板培養された。
【0161】
リン酸カルシウム沈殿により形質移入される細胞の一部は、Promega of Madison, Wisconsin, in their manuscript Profection Mammalian Transfection Systems, Technical Manual, 1990によって推奨される方法によって形質移入された。詳細には、pβ−Galは、0.25MのCaCl2と混合された。その混合物は、等量の2×HBS(ハンクスバッファーソルト(Hanks Buffer Salt)、GIBCO, Grand Island, NYより入手)と混合され、1μg/mLのpβ−Galを含む混合物を作製した。不透明な混合物は室温で10分間インキュベートされ、その後細胞に添加された。懸濁された細胞は37℃、5%CO2のもとで2時間でインキュベートされた。その細胞は新鮮な培地で洗浄され、再び平板培養された。
【0162】
継代した細胞(repeated cells)は、10%FCSを含むDMEM培地で48時間インキュベートされた。インキュベート中、16時間で培地は新鮮な培地と交換された。48時間インキュベートした後、各インキュベートした細胞は掻きとって回収され、PBSで洗浄され、0.2Mトリス−HCL(pH7.4)100μlに再懸濁された。その細胞は、数回の凍結/融解サイクルにより溶解され、6,000×/g超で遠心分離された。上清50μlが各溶解産物チューブから分取され、0.1mMの4−メチル−ウンベリフェリル−β−D−ガラクトピラニシド(基質)と0.1Mリン酸ナトリウム(pH7.4)の溶液50μlと混合された。各混合物は37℃で20分インキュベートされ、存在するすべてのβ−ガラクトシダーゼを基質に作用させた。β−ガラクトシダーゼ反応を終結させるためにpH10.5の0.4Mグリシン50μlが加えられた。β−ガラクトシダーゼ活性はメチルベリフェロン(methylbelliferon)の存在により表され、蛍光分光器(λex=365nm,λ=450nm)によって測定できる。結果を以下に示す。
【0163】
【表4】
【0164】
実施例2
形質移入効率
これらの実験において、MDCK細胞(イヌ腎臓由来)を用いた形質移入効率が試験された。上記のように、pβ−Galが標識ポリヌクレオチドとされた。ポリヌクレオチドのポリカチオン成分は、N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミドおよびN−セチル−4−ビニルピリジニウムブロミドがそれぞれ97:3のモル比で結合しているコポリマー(以下、「pEVP−co−pCVP−Br」)を含んでいた。ブロックコポリマーは、x+zが18であり、yが23である式(XIV)のトリブロックコポリマー(以下、「プルロニックB」)を含んでいた。1μg/mlのpβ−Gal、3μg/mlのPEVP−co−pCVP−Brおよび1%(w/v)のプルロニックBのプルロニックB形質移入溶液は、実施例1で調製されたものであった。ポリカチオン塩基のヌクレオチドリン酸に対する比は約7であった。プルロニックBのpβ−Galに対する質量比は、約5×103であった。
【0165】
MDCK細胞が、90mmプレート上でプレート当り8−105細胞で平板培養され、血清含有成長培地で一晩インキュベートされた。次いで血清含有培地は無血清培地と交換され、細胞は37℃、5%CO2のもとで24時間インキュベートされた。次いで、細胞をポリヌクレオチド複合体で処置するために、培地が5mlプルロニックB形質移入溶液で交換された。細胞は、穏やかな振盪で、37℃、5%CO2のもとでインキュベートされた。対照実験において、細胞はポリヌクレオチド複合体で形質移入され、培地はプルロニックB形質移入溶液5mlで交換された。細胞は、穏やかな振盪で、37℃、5%CO2のもとで2時間インキュベートされた。対照実験において、細胞は、(懸濁された細胞でなく、平板培養された細胞が形質移入されたことを除いて)上記したのと同様のリン酸カルシウム法を用いて形質移入された。
【0166】
プルロニックB形質移入溶液またはリン酸カルシウムで処置した後、細胞は5〜6回新鮮な培地で洗浄された。次いでそれらは、10%FCSを含むDMEMで、37℃、5%CO2のもとで48時間インキュベートされた。インキュベートして初めの16時間後に培地は交換された。インキュベート後、細胞はPBSで洗浄され、トリプシン処理によってそれらのプレートから分離され、再びPBSで洗浄された。β−ガラクトシダーゼが実施例1と同様に測定された。結果を以下に示す。
【0167】
【表5】
【0168】
実施例3
形質移入実験
これらの実験においては、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞を用いた形質移入効率が試験された。ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチド成分はpβ−Galであった。ポリカチオン成分はpEVP−Brを含んでいた。ブロックコポリマーは、iが10であり、jが12である式(XVII)のオクタブロックコポリマー(以下、「プルロニックC」、BASFより入手)を含んでいた。1μg/mlのpβ−Gal、4μg/mlのpEVP−Brおよび1%(w/v)のプルロニックCのプルロニックC形質移入溶液は、実施例1と同様に調製された。塩基性基のヌクレオチドリン酸に対する比は10であった。プルロニックCのpβ−Galに対する質量比は103であった。形質移入手順は実施例2で用いられたのと同様であった。結果を以下に示す。
【0169】
【表6】
【0170】
実施例4
細菌の形質転換
これらの実験において、バシラス サチリス(Bacillus subtilis)のMC5株を用いた形質転換効率が試験された。ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチド成分は、テトラサイクリン耐性をコードしたプラスミドであるプラスミドpBC16であった。式(VI)で示されるブロックコポリマーが用いられた。特に、該ブロックコポリマーは、iは44、jは20である式(XXI)で表されるポリ(オキシエチレン)−ポリ((N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド)であった。第二の実施形態のポリヌクレオチド複合体のストック溶液は、上記の形質移入溶液と同様に調製された。溶液中のコポリマー塩基性基のDNAリン酸に対する比は0.2であった。細菌は、形質転換培地(Spizizen, F.N.A.S., U.S.A. 44:1072 (1958)を参照)であるスピジゼン11(Spizizen 11)中に懸濁され、細胞の一部は、ポリヌクレオチド複合体または単独のpBC16いずれかの様々な濃度中でインキュベートされた。細胞は複合体または単独のDNAとともに、37℃で1時間インキュベートされた。インキュベートの後、細胞は10mg/mlのテトラサイクリンを含む寒天培地で平板培養された。各実験条件下で生産されたテトラサイクリン耐性コロニーの数により測定された結果を以下に示す。
【0171】
【表7】
【0172】
実施例5
ヌクレアーゼからの保護
この実施例においては、プラスミドpTZ19および、iが44であり、jが20である式(XXI)で示されるジブロックコポリマー(ポリ(オキシエチレン)−ポリ((N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド)の複合体が形成された。PBSに溶解されたポリヌクレオチド複合体の溶液は、約4μg/mlのプラスミドおよび20μg/mlのジブロックコポリマーを含んでいた。これらの量により、ポリカチオンブロックにおける塩基性基の、DNAリン酸基に対する比が5であった。対照のインキュベーションとして、等量の単独プラスミドが緩衝液に溶解された。単独DNAまたはポリヌクレオチド複合体を含む溶液サンプルにPVUIIヌクレアーゼが加えられ、様々な消化時間の後に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、未消化の環状プラスミドDNAの量が測定された。Kabanov et al., Biopolymers, 31:1437−1443 (1991)を参照。結果を以下に示す。
【0173】
【表8】
【0174】
実施例6
オリゴヌクレオチドの安定化
この実施例においては、HIV−1tat遺伝子の転写開始部位と相補的なオリゴヌクレオチド(GGCTCCATTTCTTGCTCを含む「アンチ−tat」)を含む複合体が、式(XIX)で表されるジブロックコポリマー(iが44であり、jが8であるポリオキシエチレン−ポリ(L−アラニン−L−リジン))を用いて調製された。オリゴヌクレオチド複合体は、PBS緩衝液(pH7.0)中で、オリゴヌクレオチド濃度が0.75OD260/μlになるように調製された。ポリカチオンのイミノおよびアミノ基の、ポリヌクレオチドリン酸基に対する比は約50であった。その混合物は室温で1時間インキュベートされ、複合体を形成させた。次いでその複合体は、溶出液として0.05MのNaClを用いたセファデックスG−25のゲルろ過クロマトグラフィーにより精製された。得られた複合体溶液は、0.11OD260/μlのオリゴヌクレオチドの濃度を示した。非複合体オリゴヌクレオチドの比較溶液が調製された。マウス血漿の一部(10μl)が、等量のオリゴヌクレオチド複合体溶液または単独オリゴヌクレオチド溶液と混合された。サンプルは37℃で、様々な時間インキュベートされた。血漿中の酵素とオリゴヌクレオチドとの反応を止めるために、サンプルが水で希釈され、フェノール:クロロホルム(1:1)の水飽和混合物で抽出された。抽出物の水相が分離され、3%過塩素酸リチウムを用いてその中のオリゴヌクレオチドを沈殿させた。その沈殿はアセトンで洗浄され、次いで水100μlに溶解された。未分解のオリゴヌクレオチドの存在は、C18−シラソーブカラム(4×90mm、Gilson, France)を用い、溶出液として0.05Mトリエチル−アンモニウムアセテート(pH7.0)中のアセトニトリル勾配を用いて、高速液体クロマトグラフィーにより測定された。結果を以下に示す。
【0175】
【表9】
【0176】
実施例7
オリゴヌクレオチドの安定化
この実験においては、式(XX)のジブロックコポリマー(ポリオキシエチレン−ポリ−プロピレンイミン/ブチレンイミン、ここでiは44であり、jは4〜8である)と複合体化された際の、実施例6に記載のオリゴヌクレオチドの安定性が試験された。オリゴヌクレオチド濃度が約0.13OD260/μlであったこと以外は、実施例6で適用されたのと同じ方法がこの実施例でも適用された。結果を以下に示す。
【0177】
【表10】
【0178】
実施例8
アンチセンスの細胞取り込み効率
この実験においては、SKVLB細胞において多剤耐性を逆転する際の、「アンチ−MDR」、すなわち、MDR1遺伝子産物をコードしたmRNAの422〜438位に相補的な配列CCTTCAAGATCCATCCCの17鎖のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子、の効率を試験した。SKVLB細胞は、卵巣ガン細胞系由来の多剤耐性細胞である。MDR1遺伝子は、SKVLB細胞における多剤耐性に関与することがわかっている。Endicott and Ling, Ann. Rev. Biochem., 58:137 (1989)参照。特に、単独状態の場合と、本発明のポリヌクレオチド複合体中のアンチ−MDRオリゴヌクレオチドとの効率が比較された。対照として、上記の単独かつ完全な形態のアンチ−tatオリゴヌクレオチドもまた用いられた。ポリヌクレオチド複合体は、式(XX)で表されるジブロックコポリマー(ポリオキシエチレンポリプロピレンイミン/ブチレンイミン、ここでiは44であり、jは9〜10である)を用いて形成された。複合体は、実施例6に記載の方法によって調製された。複合体中のまたは単独状態のオリゴヌクレオチド濃度は0.17OD260/μlであった。コポリマーは、ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基のオリゴヌクレオチドリン酸基に対する比を10にするのに十分な濃度で存在していた。
【0179】
SKVLB細胞は、37℃、5%CO2のもとで3日間、単独または完全なオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド含有量に基づき20μMの濃度で)の存在下でインキュベートされた。単独または完全なオリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地が12時間毎に添加された。
【0180】
上記のように処置された細胞に関するダウノマイシン細胞毒性(IC50)が、Alley et. al., Cancer Res., 48:589−601の方法を用いて測定された。結果を以下に示す。
【0181】
【表11】
【0182】
実施例9
ヘルペスウイルスを阻害するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
この実験では12鎖のオリゴヌクレオチドを用い、それらはその5’末端をウンデシルリン酸置換基で、3’末端をアクリジン基で共有結合的に改変されていた。このオリゴヌクレオチド改変は、Cho−Chung et. al., Biochemistry Int., 25:767−773 (1991)に記載されている。用いられたオリゴヌクレオチド配列、CGTTCCTCCTGUは、単純性疱瘡ウイルス1(「HSV−1」)の983〜994位のスプライシング部位に相補的であった。対照として、インフルエンザウイルスによって生産されたRNAに相補的な、同様に改変された配列(AGCAAAAGCAGG)が用いられた。オリゴヌクレオチドは、複合体化した、または単独のいずれかの状態で、HSV−1感染細胞に添加された。複合体が用いられた場合、複合体は式(XIX)で表されるジブロックコポリマー(ポリオキシエチレン−ポリ(L−アラニン−L−リジン)、ここでiは44であり、jは8である)で形成された。オリゴヌクレオチド複合体は、実施例6に記載のように形成された。
【0183】
アフリカンマーモセットの腎臓細胞(「ベロ」細胞)を、Vinogradov et al., BBRC , 203:959 (1994)に記載のように、HSV−1ウイルス(L2株、Museum of Virus Strains, D.I. lvanovskii, Inst. of Virol., Russian Federationより入手)に感染させた。感染細胞はPBSで洗浄された。洗浄後、10%のウシ胎児血清および単独または複合体オリゴヌクレオチドを含む新鮮なRPMI−L640培地が細胞に添加された。次いでその細胞は、37℃、5%CO2のもとで24時間インキュベートされた。その後細胞培地のHSV−1感染性が、Virology, A Practical Approach, Mahy, Ed., IRL Press, Washington, D.C., 1985に記載されたパッチプロダクション法を用いて測定された。オリゴヌクレオチドの様々な濃度を用いた結果を以下に示す。
【0184】
【表12】
【0185】
実施例10
ヘルペスウイルスを阻害するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
特記されない限り、この実施例は実施例9で用いられたのと同じ方法を用いた。用いられた細胞はチャイニーズハムスター腎臓細胞系であるBHK細胞であった。オリゴヌクレオチドの複合体型が用いられた場合、その複合体は、式(XVII)で表されるジブロックコポリマー(ポリオキシエチレン−ポリ−L−リジン、ここでiは44であり、jは30である)で、実施例6に記載された方法を用いた。複合体のストック溶液の濃度は0.09OD260/μlであった。ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基の、オリゴヌクレオチドリン酸に対する比は10であった。複合体または単独型のオリゴヌクレオチドは、3.0μMの濃度で細胞に添加された。結果を以下に示す。
【0186】
【表13】
【0187】
実施例11
In vivo におけるHSVの阻害
式(XVII)で表されるブロックコポリマー(ポリオキシエチレン−ポリ−L−リジン、ここでiは44でありjは30である)並びに、アンチ−HSVおよびアンチ−インフルエンザオリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド複合体が、実施例9に記載された方法を用いて形成された。複合体のストック溶液の濃度は、0.9OD260/μlであった。ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基の、オリゴヌクレオチドリン酸に対する比は10であった。
【0188】
近交系の白色マウス(体重6〜7g)に、ウイルス懸濁液30μl(力価:10−7LD50/ml)を腹腔内注射することによりHSV−1(Cl株、Belorussian Res. Inst. of Epidemiol. & Microbiol., Minskより得た)を感染させた。
【0189】
アンチ−HSV複合体、アンチ−インフルエンザ複合体、単独アンチ−HSVまたは単独アンチ−インフルエンザのいずれかを、感染後2、12、24、48、または72時間のいずれかで、所定のマウスの尾静脈に注射した(10μl)。結果を以下に示す。
【0190】
【表14】
【0191】
実施例12
ポリヌクレオチド複合体の血漿中寿命
HIV−1 tat遺伝子の転写開始部位に相補的な、32Pで標識した17−mer(GGCTCCATTTCTTGCTC)が本実施例で用いられた。オリゴヌクレオチドは、Boutorin et al., Bioconjugate Chemistry, 2: 350−356 (1990)に記載されているように、その5’末端をコレステロールで改変された。オリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド結合体は、式(XX)で表されるブロックコポリマー、ポリオキシエチレン−ポリ(プロピレンイミン/ブチレンイミン)、ここでiは44であり、jは9〜10である)で形成された。複合体のストック溶液(PBSに溶解されたもの)の濃度は、0.18OD260/μlであった。ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基の、オリゴヌクレオチドリン酸に対する比は50であった。
【0192】
雄のC57/Bl/6マウス(体重:20〜24g;the Russian Research Center of molecular Diagnostics and Therapy, Moscowより得た)は、PBSに溶解された0.18OD260/μlのアンチ−HIV結合体または単独アンチ−HIV50μlの静脈注射を受けた。注射後の決められた時間に、血液サンプルが尾静脈から分取され、動物は殺された。血液または組織サンプル中の放射性物質の量は、(適切な可溶化後に)液体シンチレーション計数によって測定された。結果を以下に示す。
【0193】
【表15】
【0194】
実施例13
カチオン性ブロックコポリマーの合成
1,4−ジブロモブタン(5.4g,25ミリモル, Aldrich Co., Milwaukee, WIより得た)は、1,4−ジオキサン100mlに溶解されたN−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミン(6.55g,50ミリモル, Aldrich Co.より得た)の溶液に加えられた。この反応混合物は、20℃で16時間攪拌された。この反応産物は、臭化水素塩として溶液から自然に沈殿する。この沈殿した第一中間体が回収され、10%トリエチルアミンのメタノール溶液から、回転エバポレーションにより2回乾燥された。このエバポレーション方法は、臭化物塩を十分量除去するのに有効であった。第一中間体は50mlの1,4−ジオキサンに溶解され、2.7g(12.5ミリモル)の1,4−ジブロモブタンと反応させた。再び16時間、20℃で反応を進め、生じた第二中間体が回収され上記のように乾燥された。
【0195】
第二中間体は酢酸でpH7〜8に中和され、溶出液として水を用いたセファデックスG−25によるゲルろ過で精製された。3種の主要なポリミンのフラクションが得られ、それぞれ1060、700および500の見かけ分子量を有していた。
【0196】
ポリ(オキシエチレングリコール)(1.5g,分子量1500、Flukaより得た)は、1,4−ジオキサン8mlに溶解され、0.17g(1ミリモル)のN,N’−カルボニルイミダゾール(Aldrich Co.)と、20℃で3時間反応させた。この反応混合物は2分割された。それぞれの部分が、分子量1060または700のポリイミンフラクションのいずれかの10%(w/v)溶液、この溶液はさらに0.01N NaOHを含んでいたが、4mlと混合された。この混合物は16時間、20℃で攪拌された。この混合物より、式(XX)で表されかつ様々な分子量範囲のブロックコポリマーがゲルろ過により分離された。
【0197】
実施例14
カチオン性ブロックコポリマーの合成
メトキシ−PEGのスクシンイミジルカーボネート(分子量5000, Shearwater Polymers, Inc., USA)0.5gが、1,4−ジオキサンに溶解された。このジオキサン溶液は、上記の分子量1060のポリイミンポリマー0.2gを含む水溶液、この水溶液はさらに0.01N NaOHを含んでいたが、に加えられた。この反応混合物は20℃で16時間攪拌された。式(XXII)で表されるポリマーがゲルろ過により反応物より分離された。
【0198】
実施例15
カチオン性ブロックコポリマーの合成
1.5gのポリ(オキシエチレングリコール)(分子量8000,Fluka)が、8mlの1,4−ジオキサンに溶解された。0.34g(2ミリモル)のN,N’−カルボニルイミダゾール(Aldrich Co.)が溶液に加えられ、20℃で3時間反応させた。0.01N NaOHおよび15%(w/v)の、実施例13に記載された分子量500のポリイミンポリマーを含む水溶液8mlが、第一の反応混合物に加えられた。生じた混合物を20℃で16時間、攪拌しながら反応させた。式(XXIII)で表されるポリマーがゲルろ過により第二の反応混合物から分離された。
【0199】
実施例16
オリゴヌクレオチドとの結合体の合成
タイプ1の単純疱疹ウイルス(「HSV−1」)の初期のmRNAのスプライシング部位(ウイルスゲノムの983〜994位)に相補的な12−merのオリゴヌクレオチド、5’−CGTTCCTCCTGU(「オリゴA」)が、380B−02DNA−シンセサイザー(Applied Biosystems,CA)を用いて合成された。該シンセサイザーでは、ホスホアミダイトケミストリーおよび8分の合成サイクルを用いた。サイクル条件および粗産物の調製は、Applied Biosystemsによって推奨されるようになされた。この合成により得られた粗オリゴAを、アセトン(2ml)を含む1M LiCl溶液(0.5ml)より沈殿させた。沈殿物はトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液に溶解され、20mM TEAA緩衝液(pH8.5)中のアセトニトリル勾配により展開されたシラソーブC18カラム(9×250mm、Gilson、France)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーで精製された。
【0200】
精製されたオリゴAの3’−末端は過ヨウ素酸塩で酸化されてアルデヒドを生成し、還元的アルキル化によってヘキサメチレン−ジアミンリンカーと結合され、アミン誘導体を生成した。Che−Chung et al., Biochem. lntemat. , 25:767 (1991); Vinogradov et al., BBRC、203:959 (1994)を参照。式(XIV)(x=25、y=38、z=25)で表されるブロックコポリマー「プルロニックA」が同様に酸化され末端アルデヒドを生成した。このアミン誘導体(1mg)は100μlの0.1M ホウ酸塩緩衝液(pH9.0)に溶解され、2mgのプルロニックA誘導体と混合された。1.5mgの水素化シアノホウ素ナトリウム(sodium cyanoborohydride)がその混合物に加えられ、アミン基およびアルデヒド基の間で形成されたシッフ塩基が還元された。この反応を4℃で12時間進行させた。この反応のポリマー産物は、イソプロパノールの90%水溶液を溶出液として用いたセファデックスLH−20によるゲルろ過クロマトグラフィーで分離された。このようにして得られた結合体は、以降「オリゴA結合体」と称する。
【0201】
実施例17
ウイルス生産に対するオリゴA結合体の効果
オリゴAおよびオリゴA結合体が、RPMI 1640培地(ICN Biomedicals Inc.、Costa Mesa、CA)に最終濃度0.2mM(オリゴヌクレオチド吸光度に基づく)で別々に溶解された。次いでこれらのストック溶液が0.22μmフィルターを通してろ過され、可能な限りのすべての細菌またはカビの混入を排除した。
【0202】
ベロ細胞の単層が、様々な濃度のオリゴAまたはオリゴA結合体をともに含む無血清RPMI1640中で37℃で1時間インキュベートされた。次いで、HSV−1、L2株の培養細胞(the Museum of Virus Strains of the D.I. Ivanovskii Institute of Virology, Russian Academy of Sciences, Russian Federationより得た)あたり1プラーク形成単位を、まだオリゴヌクレオチドに曝露されている間にその単層に感染させた。この感染方法はVinogradov et al., BBRC、203:959 (1994)に記載されている。ウイルスおよびオリゴヌクレオチドに曝露して8時間後、細胞上の培地は10%FCSを含む新鮮な培地と交換された。細胞からの培地は、無効インキュベーション後22時間および39時間で回収され、回収された培地中のウイルス力価がVirology, A Practical Approach, Mahy, Ed., IRL Press, Oxford Univ. Press, Washington, D.C.(1985)に記載の方法により測定された。結果を以下に示す。
【0203】
【表16】
【0204】
実施例18
ホスホネートモノマーの合成
50mlの無水ピリジン(Aldrich)に溶解された40ミリモルのブタンジオール−1,3(Merck)を、20ミリモルの4,4’−ジメトキシトリチルクロライド(Sigma)と20℃で1.5時間反応させた。その反応は、シリカゲルプレート(Merck)上、クロロホルム:メタノール(95:5)で展開される薄層クロマトグラフィーを用いてモニターされた。生産物のRf値は0.6であった。その反応混合物は、200mlの8%炭酸水素ナトリウム水溶液に加えられ、生産物はクロロホルムで抽出された。クロロホルム抽出物は減圧で蒸発され、得られた油状の第一中間体が次の合成段階に用いられた。
【0205】
12ミリモルの第1の中間体が、3.14ml(18ミリモル)のジイソプロピルエチルアミン(Aldrich)を含む30mlの無水1,4−ジオキサンに溶解された。10mlの無水1,4−ジオキサンに溶解された18ミリモルのサリチルクロロホスファイト(Sigma)が不活性アルゴン雰囲気下で少量ずつジイソプロピルエチルアミン溶液に加えられた。その反応混合物は20℃で1時間インキュベートされた。その反応物は、上記の液層クロマトグラフィーによりモニターされた。生産物のRf値は0.05であった。10mlの水が反応混合物に加えられた。30分後、溶媒は蒸発された。その生産物は100mlのクロロホルムに溶解され、得られた溶液は(1)100mlの8%炭酸水素ナトリウム水溶液、(2)100mlの0.2Mトリエチルアンモニウムアセテート溶液(pH7.2)、および(3)100mlの水を用いて段階的に洗浄された。有機溶媒は蒸発され、ホスホネートモノマーを含む油状の残渣が、(1)クロロホルム、(2)クロロホルム中の3%メタノール、および(3)クロロホルム中の6%メタノールの段階的な勾配を用いて、シリカゲルカラムによるクロマトグラフィーにより精製された。モノマーの収率は4.1g(=7.3ミリモル,63%)であった。その生産物は以下の構造:
【0206】
【化27】
【0207】
式中、DMTはジメトキシトリチル基を表す、を有し、「ホスホネートモノマーA」と称することができる。
【0208】
実施例19
ポリカチオンBDPの合成
無水ピリジン:アセトニトリル混合物(1:1)中のホスホネートモノマーAの0.05M溶液が、DNAシンセサイザー(型番380−B02、Applied Biosystems、CA)の6位に置かれた。アセトニトリル:ピリジン(95:5)混合物中のアダマントイルクロライド(Sigma)の2%溶液が、縮合剤として用いられた。その合成は、H−ホスホネートサイクル用に改変されたプログラム(Sinha and Striepeke、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Eckstein Ed. IRL Press, Oxford, p.185 (1991))を用いて行われ、DMT基は合成終了後保存されていた。標準CPG−500固形担体に固定化されたアデノシン(4μモル)が、ポリマー合成中の第一単位として用いられた(Vinogradov et al. BBRC, 203, 959 (1994))。シンセサイザーは、ホスホネートモノマーA反復単位をアデノシンモノマーに添加するようにプログラムされた。すべての合成段階に従って、無水ピリジン:CCl4(5:1)混合物0.6ml中のヘキサメチレンジアミン(Sigma)104mgの溶液を20℃で15分添加することにより、固定された基質上のH−ホスホネート基は酸化され、次いで担体はピリジン:アセトニトリル混合物(1:1)で洗浄された。
【0209】
非ブロック化およびキャップ除去は、アンモニア分解によって達成された(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Eckstein Ed. IRL Press, Oxford, 1991)。その生産物は、アセトニトリル勾配(0〜80%)中のシラソーブCカラム(9×250mm、Gilson, France)を用いたHPLCによって精製された。ジメトキシトリチル化産物を含むピークが回収され、溶媒は蒸発され、残渣は80%酢酸(20分)で処理された。その酢酸は蒸発され、ポリカチオンは再びHPLCで精製された。15−merの収率(ホスホネートモノマーAに関して計算された)は、50%(2.2μモル)であった。これにより式Aによるポリマーが生成した。該ポリマーは、以降「BDP」と称する。
【0210】
実施例20
ジブロックコポリマーポリオキシエチレン−BDPの固相合成
ジメトキシトリチル−ポリエチレンオキサイド−H−ホスホネートが、ブタンジオール−1,3の代わりにポリエチレングリコール(1500分子量、Flukaより得た)を用いた以外は、実施例18に記載されたように合成された。BDPポリカチオンは、鎖伸長の最終段階でジメトキシトリチル−ポリエチレンオキサイド−H−ホスホネートを最終構築ブロックとして導入した以外は、実施例19に記載されたように合成された。ブロックコポリマーのH−ホスホネート基は、ヘキサメチレンジアミンの代わりにテトラメチレンジアミン(Sigma)を用いて、実施例19に記載されたように酸化され、その結果ジアミンおよびリン酸主鎖の間にホスホンアミド結合が形成された。
【0211】
実施例21
オリゴヌクレオチド−BDPジブロックコポリマーの固相合成
12−merオリゴヌクレオチド、すなわち5’−GGTTCCTCCTGU(タイプ1の単純疱疹ウイルス(HSV−1)の初期のmRNAのスプライシング領域に相補的なオリゴA(Vinogradov et al.、BBRC、203:959 (1994))および、BDPポリマーを含むジブロックコポリマーが、DNAシンセセイターにより合成された。まずBDPポリマーが、担体から除去されなかったこと以外は実施例19に記載されたように合成された。次いでオリゴヌクレオチド鎖が、Vinogradov et al, BBRC, 203, 959 (1994)に記載された標準的なホスホロアミダイトケミストリーを用いて、固相状態の担体に結合したBDPポリカチオン性ポリマー上に段階的に合成された。ジブロックコポリマーのH−ホスホネート基は、ヘキサメチレンジアミンの代わりにテトラメチレンジアミン(Sigma)を用いて、実施例19に記載されたように酸化された。
【0212】
実施例22
ウイルス成長に対するオリゴヌクレオチド−BDPジブロックコポリマーの効果
本実験は、(1)実施例21のオリゴヌクレオチド−BDPコポリマーが用いられ、(2)単一の濃度(4.4M)のオリゴヌクレオチド−BDPコポリマーが用いられたこと以外は、実施例17に記載されたように行われた。
【0213】
【表17】
【0214】
実施例23
分岐状ポリイミンポリカチオンの合成
A.ポリイミンポリカチオン(「ポリスペルミン」)が、実施例13に記載されるのと同様にしてN−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンおよび1,4−ジブロモブタンの段階的な重縮合によって得られ、ポリ(エチレングリコール)へ結合させることなく用いられた。
【0215】
B.Aで合成されたポリイミンポリカチオンが、蛍光ダンシル標識基質を得るためにダンシルクロライドによって改変され、薄層クロマトグラフィーで精製され、混合物の主成分(多くのバッチで75%超)が、正荷電モードのエレクトロスプレーマススペクトロメトリーによって分析された。その結果が、塩化ダンシルを用いて改変されたN−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンについて得られたマススペクトルと比較された。ダンシル標識N−(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミンは、M+1、M+2、M+3、およびM+4(667.6、668.5、669.6、および670.5)の4形態のピークを与えた。重縮合産物のスペクトルにおいて、2つのタイプの多重モードピーク、MおよびM+54が観察された。M−ピークについては、M/2H+およびM/H+を有し、それぞれ598.5および1195.6に等しい二つの異なる基が観察された。この分子質量は12個の窒素原子を有する直鎖ポリカチオンに非常に近いものであった(1221)。1249.8および652.5におけるM+54ピークは、CH2CH2CH2CH2架橋を有するポリカチオンに対応する。
【0216】
C.Aで合成され、DMSOに溶解されたポリイミンポリカチオンのサンプルについての1H−NMRスペクトルが得られた。三種のシグナルが、1.40〜1.80ppm(Ha)、1.80〜2.20ppm(Hb)、および2.35〜2.80ppm(Hc)において観察された。HaはCH2CH2CH2CH2プロトンに関し、HbはCH2CH2CH2プロトンに関し、Hcは−NHCH2およびプロトンに関していた。これら3種についての共鳴シグナルの積分により、Ha:Hb:Hc=1.00:0.75:1.20という比が得られた。12個の窒素原子を有する直鎖ポリカチオンの理論的な比は1.00:1.33:3.67である。Hb:HaおよびHc:Ha比の増加により、第1級、第2級および第3級アミンの混合物を有する分岐状構造の存在が示唆された。
【0217】
D.Aで合成されたポリイミンポリカチオン中の第1級アミノ基の濃度は、Weigele et al., J. Amer. Chem. Soc., 94:5927 (1972)に記載されたフルオレスカミン方法によって測定された。重縮合産物中の第1級、第2級、および第3級アミノ基の総量は、電位差滴定を用いて測定された。第1級、第2級、および第3級アミノ基の総量の、第1級アミノ基の量に対する比は2.7であった。マススペクトロメトリーを用いて測定された縮合産物の分子質量により、顕著な分岐、すなわち第3級アミンの存在がこの実験結果から示唆された。
【0218】
実施例24
直鎖ポリイミンポリカチオンの合成
ポリイミン型の直鎖ポリカチオンは、Aziz et al., J. Pharmac. Exper. Therapeutics, 274:181 (1995)に記載された改変還元型アミノ化法を用いて、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でジアミノアルキルおよびビス−アルデヒドの縮合により合成される。0.33gのマロンアルデヒドビス(ジメチルアセタール)が10mlの0.5N HClに加えられ、20℃で1時間攪拌されて遊離のビス−アルデヒドを得た。1.27gのN,N’−ビス[3−アミノプロピル]−1,4−ブタンジアミンがこの溶液に加えられ、pHが5.0に調節された。この混合物は37℃で1時間放置され、次いで1.27gのN,N’−ビス[3−アミノプロピル]−1,4−ブタンジアミンがそれに加えられ、pHは炭酸ナトリウム溶液を用いて7.0に調節された。その反応混合物は0.26gの水素化シアノホウ素ナトリウムで処理され、さらに37℃で1時間放置された。最終的なわずかに黄色い溶液は、セファデックスG−25カラムを用いたゲル透過クロマトグラフィーにより10%メタノールで脱塩され、ニンヒドリン試験により第1級アミノ基と判明した第1の高分子量のフラクションが凍結乾燥された。以下のポリイミンポリカチオンの収率は、0.43gであった。
【0219】
【化28】
【0220】
実施例25
カチオン性ブロックコポリマーの合成
1.5gのポリ(エチレングリコール)、メチルエステル、分子量5000(Sigma)が、無水アセトニトリル10ml中の1,1’−カルボニルジイミダゾール0.25gによって室温で3時間活性化された。真空中で溶媒は蒸発され、その残渣が水に再溶解され、3500Daのカットオフを有するメンブラ−セル(Membra−Cel)MD−25−03.5メンブレンで水に対して透析された。脱塩された溶液は、真空中で濃縮され、メタノール−水溶液中で、2倍超の分子量4000のポリ−L−リジンとの、室温での16〜24時間の反応に用いられた。得られた結合体は、水中でのセファデックス−50(微細)(Pharmacia)を用いたゲル透過カラムクロマトグラフィー、次いでアセトニトリル濃度勾配中での半調製カラム(Vydac C18 5u, 10mm×25cm)を用いた逆相クロマトグラフィーによって、精製された。収率は70%であった。アミノ基の含有量はフルオレスカミン法によって測定され、総窒素含有量は元素分析によって測定され、結合体の純度が評価された。通常、重量に基づいて約75〜90%であった。
【0221】
実施例26
カチオン性ブロックコポリマーの合成
2倍超のポリ−L−リジンを同じく過量のポリエチレンイミン、すなわち分子量2000の
【0222】
【化29】
【0223】
で置き換える以外は実施例25の方法に従って、0.4gのカチオン性ジブロックコポリマー:
【0224】
【化30】
【0225】
が得られた。
【0226】
実施例27
グラフトコポリマーの合成
A.分子量8000のポリ(エチレングリコール)(Aldrich Co.)24g(3ミリモル)が、減圧下での無水ピリジンとの共沸により乾燥され、50mlの無水アセトニトリル中に溶解された。次いで、無水ピリジン30ml中の4,4’−ジメトキシトリチルクロライド0.51g(1.5ミリモル)が、30分間連続攪拌のもとこの溶液に滴下して加えられた。その混合物はさらに室温で2時間放置され、次いで、溶媒が真空中で蒸発された。残渣はジクロロメタン50mlに溶解され、5%炭酸水素ナトリウム(2×30ml)で抽出され、シリカゲルカラム(3×45cm、40〜60μm)に添加された。ジクロロメタン−メタノール溶液を用いた段階的な溶出によって、わずかに黄色のポリ(エチレングリコール)のモノ−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体が収率約75〜85%で分離された。この反応の副産物(収率10〜15%)は、ポリ(エチレングリコール)のビス−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体であった。
【0227】
B.Aで得られたポリ(エチレングリコール)のモノ−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体1.5gが、無水アセトニトリル10ml中の1,1’−カルボニルジイミダゾール0.25gによって、室温で3時間活性化された。減圧下で溶媒は蒸発され、残渣を水に再溶解され、3500Daのカットオフを有するメンブラ−セルMD−25−03.5メンブレンで水に対して透析された。脱塩された溶液は真空中で濃縮され、次いでメタノール−水の溶液中で分子量19000のポリ−L−リジンと、室温で24時間、ポリ(エチレングリコール)の、ポリ−L−リジンの遊離アミノ基に対するモル比が0.7:1.0で反応させた。得られた結合体は、水中でセファデックス−50(微細)(Pharmacia)を用いたゲル透過カラムクロマトグラフィーによって、次いでアセトニトリル濃度勾配中で半調製カラム(Vydac C18 5u, 10mm×25cm)を用いた逆相クロマトグラフィーによって精製された。これにより、グラフト化ポリリジンコポリマーは収率35%で得られ、それにおいてフルオレスカミン法によって測定されたところ、遊離アミノ基の50%がポリ(エチレングリコール)で置換されていた。
【0228】
実施例28
グラフトコポリマーの合成
A.分子量8000のポリ(エチレングリコール)(Aldrich Co.)24g(3ミリモル)が、真空中で、無水ピリジンとの共沸によって乾燥され、無水アセトニトリル50ml中に溶解された。次いで無水ピリジン30ml中の4,4’−ジメトキシトリチルクロライド0.51g(1.5ミリモル)が30分間攪拌しながらこの溶液に滴下して加えられた。その混合物はさらに室温で2時間静置され、次いで溶媒が真空中で蒸発された。その残渣はジクロロメタン50mlに溶解され、5%炭酸水素ナトリウム(2×30ml)で抽出され、シリカゲルカラム(3×45cm、40〜60μm)に添加された。ジクロロメタン−メタノール溶液を用いた段階的な溶出により、わずかに黄色の、ポリ(エチレングリコール)のモノ−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体が、約75〜85%の収率で分離された。この反応の副産物(収率10〜15%)は、ポリ(エチレングリコール)のビス−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体であった。
【0229】
B.Aで得られたポリ(エチレングリコール)のモノ−4,4’−ジメトキシトリチル誘導体1.5gが、無水アセトニトリル10ml中の1,1’−カルボニルジイミダゾール0.25gによって、室温で3時間活性化された。真空中で溶媒は蒸発され、残渣を水に再溶解され、3500Daのカットオフを有するメンブラ−セルMD−25−03.5メンブレンで水に対して透析された。脱塩された溶液は真空中で濃縮され、次いでメタノール−水の溶液中の分子量25000のポリエチレンイミンと、室温で24時間、ポリ(エチレングリコール)の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.7:1.0で反応させた。得られた結合体は、水中でセファデックス−50(微細)(Pharmacia)を用いたゲル透過カラムクロマトグラフィーによって、次いでアセトニトリル濃度勾配中で半調製カラム(Vydac C18 5u, 10mm×25cm)を用いた逆相クロマトグラフィーによって精製された。これにより、グラフト化ポリエチレンイミンブロックコポリマーは収率85%で得られ、それにおいてWeigele et al.(J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94:5927)に記載されたフルオレスカミン法によって測定されたところ、遊離アミノ基の45%がポリ(エチレングリコール)で置換されていた。
【0230】
実施例29
グラフトコポリマーの合成
活性化されたポリ(エチレングリコール)のポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.3:1.0であること以外は実施例28の方法に従って、80%の収率でグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーを得、それにおいて遊離アミノ基の24%がポリ(エチレングリコール)で置換されていた。
【0231】
実施例30
カチオン性ブロックコポリマーの合成
分子量20,000のポリエチレングリコール6.0gの代わりに、過量の分子量5,000のポリエチレングリコールを用いた以外は実施例26の方法に従って、カチオン性ブロックコポリマー:
【0232】
【化31】
【0233】
を6.0g得た。
【0234】
実施例31
カチオン性ブロックコポリマーの合成
A.分子量5,000のポリエチレングリコール1.5gの代わりに、分子量5,000のポリエチレングリコール(Aldrich Co.)2.4gを用いた以外は、実施例26の方法に従って、ポリエチレンイミンおよびポリエチレングリコール鎖セグメントを含むカチオン性ブロックコポリマー1.2gを得た。
【0235】
B.このブロックコポリマーの分子質量は、15アングルで作動し、He−Neレーザー(632.8nm)を備えたDAWNマルチアングルレーザーフォトメーター(Wyatt Technology、Santa Barbara、CA)を用いた静電気光散乱法(static light scattering method)によって測定された。ブロックコポリマーのサンプルは、3500Daのカットオフを有する膜で4.5×10−3g/ml NaClに対して透析され、次いで、光散乱実験で用いられたフローセルに直接ろ過された。重量平均分子質量は、4回の測定に基づき計算された。セル定数(Cell constant)は、異なる濃度のNaClを用いた校正によって決定された。特異的な屈折率の増加(dn/dc)は、Wyatt/Optilab 903 干渉分析屈折率測定器を用い、632.8nmで測定された。得られたサンプルの分子質量は16,000であり、このポリマーはおおよそ一つのポリエチレンイミンセグメントおよび、二つのポリエチレングリコールセグメントを含むということが示唆された。
【0236】
C.合成されたコポリマーサンプル中の第1級アミノ基の数は、Weigele et al. (J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94:5927)に記載されている改変方法を用いて測定された。pH9.5の20mMホウ酸ナトリウム中のサンプル1.5ml(アミノ基の濃度は100μMまで)に、アセトン中のフルオレスカミン溶液(0.024%、Sigma)0.25mlが加えられ、5分間ボルテックスされた。島津の分光蛍光計を用い、励起波長384nmおよび発光波長430〜510nmの範囲においてこの測定はなされた。発光475nmにおける減衰係数は1.58×106M−1と測定された。第1級アミノ基の特異的な量は0.69ミリモル/gであった。
【0237】
実施例32
グラフトコポリマーの合成
ポリ(エチレングリコール)24gの代わりに、同量のプルロニックL61(BASF Co.)を用い、活性化されたプルロニックL61の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.3:1.0であること以外は実施例28の方法に従って、収率22%でグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーが得られ、それにおいて、遊離のアミノ基のうち8%がプルロニックL61で置換されていた。
【0238】
実施例33
グラフトコポリマーの合成
ポリ(エチレングリコール)24gの代わりに、同量のプルロニックP85を用い、活性化されたプルロニックP85の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.3:1.0であること以外は、実施例28の方法に従って、収率70%のグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーが得られ、それにおいてポリエチレンイミンの遊離アミノ基のうち11%がプルロニックP85で置換されていた。
【0239】
実施例34
グラフトコポリマーの合成
ポリ(エチレングリコール)24gの代わりに、同量のプルロニックP123(BASF Co.)を用い、活性化されたプルロニックP123の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.3:1.0であること以外は実施例28の方法に従って、収率30%でグラフト化ポリリジンコポリマーが得られ、それにおいて、遊離アミノ基の9%がプルロニックP123で置換されていた。
【0240】
実施例35
グラフトコポリマーの合成
ポリ(エチレングリコール)24gの代わりに、同量のプルロニックF38(BASF Co.)用い、活性化されたプルロニックF38の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.3:1.0であること以外は、実施例28の方法に従って、グラフト化ポリリジンコポリマーを収率40%が得られ、それにおいて、遊離のアミノ基の9%がプルロニックF38で置換されていた。
【0241】
実施例36
マルチグラフトコポリマーの合成
ポリエチレンイミンの代わりに、実施例35で得られたプルロニックL123(BASF Co.)で改変されたポリエチレンイミンを用い、活性化されたポリ(エチレングリコール)の、改変されたポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が0.4:1.0であること以外は、実施例28の方法に従って、収率20%でグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーが得られ、それにおいて、9%の遊離アミノ基がプルロニックL123で置換され、および30%の基がポリ(エチレングリコール)で置換されていた。
【0242】
実施例37
オリゴヌクレオチドを有する複合体
A.モデルのホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチドPS−dT20が、ABI291DNAシンセサイザー(Applied Biosystems、San Diego、CA)を標準的な方法に従って合成された。アンモニア脱保護後、オリゴヌクレオチドはエタノールで2回沈殿させ、精製しないで次に用いられた。
【0243】
B.PS−dT20および実施例28で得られたポリエチレンイミン−ポリ(エチレングリコール)ブロックコポリマーの間で形成された複合体が、該ブロックコポリマーの第1級アミノ基の、PS−dT20のリン酸電荷に対する比が1.0になるように、pH7.4の10mMリン酸緩衝液中のこれらのポリマーの水溶液を混合することによって得られた。すべての溶液は二重蒸留水を用いて調製され、孔サイズ0.22μMのミリポアメンブレンを通して繰り返しろ過された。
【0244】
C.Bで合成された複合体の電気泳動移動度(EPM)および粒子径が測定された。EPMの測定は、25℃で、15〜18V/cmの電場強度(electrical field strength)で、635nmのレーザー波長で稼動させた15mV固体レーザーを有する「ゼータプラス」ゼータポテンシャルアナライザー(Brookhaven Instrument Co.)を用いて測定された。粒子のゼータ電位は、スモルコウスキ方程式(Smoluchowski equation)を用いてEPM値から計算された。有効な流体力学的径は、マルチアングルオプション(Multi Angle Option)を備えた同器具を用いて光子相関分光分析法(photon correlation spectroscopy)によって測定された。粒子径測定は、25℃、角度90°でなされた。このサンプルのゼータ電位はゼロに近く、これは粒子が電気的に中性であることを示唆している。粒子の平均直径は35nmであった。
【0245】
実施例38
ヌクレアーゼ消化に対する安定性
PS−dT20および、実施例39で得られたポリエチレンイミン−ポリ(エチレングリコール)ブロックコポリマーとの間で形成された複合体100μgが、ヘビ毒であるホスホジエステラーゼ(Crotalus adamanteusからのホスホジエステラーゼI、0.024ユニット/mg、Sigma)1mgで2および18時間、37℃で処理された。反応混合物は、消化されたPS−dT20についてゲル透過HPLCで分析された。該複合体中のPS−dT20の消化は5%未満であった。それに対し、同じ酵素濃度で、同じ時間間隔処置された単独PS−dT20は完全に消化されていた。
【0246】
実施例39
Caco−2単層におけるオリゴヌクレオチドの蓄積
A.5’−アミノヘキシルPS−dT20オリゴヌクレオチドが、ABI291DNAシンセサイザー(Applied Biosystems、San Diego、CA)を用いて、標準的な方法に従って合成された。アンモニア脱保護後、オリゴヌクレオチドはエタノールにより2回沈殿され、精製しないで次に用いられた。5’−アミノヘキシルPS−dT20は、業者の方法に従って、フルオレセインイソチオシアネート(Sigma)との反応により標識された。フルオレセインラベルされたPS−ODNは、ファルマシアPD−10サイズエクスクルージョンを用いて、未反応の蛍光体から分離された。
【0247】
B.フルオレセインラベルされたPS−dT20および、ポリエチレンイミン−ポリ(エチレングリコール)ブロックコポリマーの間で形成された複合体は、PS−dT20の代わりにフルオレセインラベルされたPS−dT20を用いた以外は、実施例37に記載のように合成された。
【0248】
C.ヒト結腸直腸の癌腫由来のCaco−2細胞(Fogh et al. J. Natl. Cancer Inst., 59:221−226, 1977)は、Borchardt R.T.(The University of Kansas, Lawrence, Kansas)により親切にも提供されたものである。その細胞は、Artursson (J. Pharm. Sci., 79:476−482, 1990)に記載された通り、10%の熱で不活性化されたウシ胎児血清(FBS)、1%の非必須アミノ酸、ベンジルペニシリン(100μg/ml)およびストレプトマイシン(10μg/ml)を含むダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium )(DMEM)中、90%空気および10%CO2の雰囲気下で維持された。すべての組織培養培地は、Gibco Life Technologies, Inc.(Grand Island, NY)より得た。細胞は、コラーゲン被覆ポリカーボネートフィルターチャンバーインサート (Transwell、Costar Brand Tissue Culture Products、Contd.; 孔サイズ0.4μm;直径24.5mm)上で育てられた。250,000個の細胞が各インサートに添加され、継代数が32〜45回の細胞が用いられた。その細胞は2日ごとに供給され、単層が以下の吸収実験に用いられるまでの14日間、単層を成長および分化させた。
【0249】
D.Caco−2細胞単層は、37℃で、塩化ナトリウム(122mM)、炭酸水素ナトリウム(25mM)、グルコース(10mM)、HEPES(10mM)、塩化カリウム(3mM)、硫酸マグネシウム(1.2mM)、塩化カルシウム(1.4mM)およびリン酸水素二カリウム(0.4mM)を含む分析用緩衝液を用いて30分プレインキュベートされた。この後、この緩衝液は除去され、細胞は、分析用緩衝液中の50μMのフルオレセインラベルされたPS−ODNまたはその複合体に90分、37℃で曝露された。その後、染色液が除去され、細胞の単層は氷冷したPBSで3回洗浄された。次に細胞は1.0%トリトンX−100中に溶解され、その一部(25μl)が分取され、島津RF5000分光蛍光計をλex=488nm、λem=520nmで用いて細胞の蛍光が定量された。サンプルはまた、ピアスBCA法を用いたタンパク質定量のためにも分取された。
【0250】
細胞によって吸収された、フルオレセインラベルされたPS−dT20の量を以下に示す。
【0251】
【表18】
【0252】
これにより、ブロックコポリマーを有する複合体中へのポリヌクレオチドの取り込みは、細胞のポリヌクレオチドの蓄積を3倍超に増加させることが示された。
【0253】
実施例40
Caco−2単層を通過するオリゴヌクレオチドの輸送
A.フィルターで成長したCaco−2単層は、完全成熟した後、すなわち、塗布後14日から、オリゴヌクレオチド透過性研究のために用いられた。フィルターは穏やかにウェルから引き離され、Crown Bio. Scientific, Inc.(Somerville、NJ)の並列拡散セル(Side−Bi−Side diffusion cell)に置かれ、37℃±0.1℃で維持された。このシステムは、薬剤の経口バイオアベイラビリティーを評価するためのヒト腸上皮のin vitroモデルとして用いられる(Pauletti et al., Pharm, Res., 14:11−17 (1977)。細胞単層は、37℃で、10%の、熱で不活性化されたウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸、ベンジルペニシリン(100μg/ml)およびストレプトマイシン(10μg/ml)を含む分析用緩衝液を用いて30分プレインキュベートされ、ドナーおよびレセプター両方のチャンバー(3ml)に加えられた。プレインキュベート後、レセプター容器中の分析用緩衝液は新鮮なものと交換され、一方、ドナー容器中の分析用緩衝液は、分析用緩衝液の、フルオレセインラベルされたPS−ODNまたはその複合体50μM溶液と交換された。単層の完全性を説明するために、ドナー容器中のR123溶液はまた、H3−ラベルされたマニトール、パラセルラーマーカー(Dawson, J. Membrane Biol., 77:213−233 (1977) DuPont Corp.(Boston、MA)より得られる)を含んでいた。120分のとき、島津RF5000蛍光分光光度計(λex=488nm、λem=520nm)を用いた、フルオレセインラベルされたPS−ODNの定量、および、液体シンチレーションカウンター(Hewlett Packard Instruments)を用いたH3−マニトール定量のためにレセプターチャンバー中の溶液が除去された。レセプターチャンバー中の溶液を回収した後すぐに、3mlの新鮮な分析用緩衝液がこのチャンバーに加えられた。フルオレセインラベルされたPS−ODN(またはマニトール)のCaco−2細胞単層を通過した輸送が、レセプターチャンバー中に蓄積されたフルオレセインラベルされたPS−ODN(またはマニトール)の総量の、ドナーチャンバー中のフルオレセインラベルされたPS−ODN(またはマニトール)の初期量に対する百分率として示されている。それぞれの膜の複数の時点における各薬剤組成物について、三つの異なる膜の最小値が解析された。結果を以下に示す。
【0254】
【表19】
【0255】
これにより、ブロックコポリマーを有する複合体中へのポリヌクレオチドの組み込みは、Caco−2単層を通過するこのポリヌクレオチドの輸送を7倍超に増加させ、その一方でパラセルラーマーカーの輸送が影響を受けないことが示された。
【0256】
実施例41
様々なブロックコポリマーに基づく配合物によるプラスミドDNAの
in vitro での形質移入
これらの実験はCos−7細胞で実施され、以下のように行われる;Cos−7細胞が用いられ、12−ウェルプレート(Costar)に、ウェルあたり7×105個播種され、形質移入前に24時間静置される(70%の濃度)。3μgのpGL3−LucSV40が、様々なN/P比で異なるポリヌクレオチドと配合される。形質移入混合物を以下のように調製する。1%Hepesが添加された100μlのDMEMを含むエッペンドルフチューブに、以下のものが加えられる;0.1mg/mlのDNA30μl、様々なN/P比を得るための様々な濃度の試験用ポリマー35μl。形質移入混合物は5分間インキュベートされ、完全DMEM(10%FBS、1%Hepes、1%ペニシリン−ストレプトマイシン)を用いて1mlにされる。ウェルあたり500□lの形質移入混合物が添加される。37℃および5%CO2の雰囲気下での4時間の形質移入の後、細胞はPBSでリンスされ、1mlの完全DMEM中で一晩静置され、ルシフェラーゼ分析を行うために、Promega Corporationの推奨に従って回収される。簡潔に言うと、細胞は氷上で30分溶解され、次いで13000gで2分間遠心分離される。上清は保存されルシフェラーゼ活性を分析される。分析は以下のように行われた。20□lの上清が、100□lのルシフェラーゼ基質を含む光測定用チューブに加えられる。発光はルミノメーター(Berthold)で5秒間測定される。データは秒あたりの相対的な光単位で報告され、BiCinchoninic Acid assay kit (Sigma)を用いてタンパク質に対して標準化される。結果は、PEIに結合したプルロニックP123は、PEI単独に比べて、CMV−Lucの形質移入を改善することを示し、これにより、ブロックコポリマー部分がより優れた形質移入に有利であることを示唆している。P123単独では細胞を形質移入せず、CMV−Luc単独のように全く役に立たない、ということに留意すること。この観察は、P123が筋肉内での遺伝子発現を促進させるために用いられている、実施例44に示されたデータと対照的である。
【0257】
【表20】
【0258】
実施例42
DNAの生体内分布の生物学的調節剤としてのブロックコポリマー
CMV−Luc(50μg)またはオリゴヌクレオチド(100μg)が、様々なブロックコポリマーに基づいた配合物を含むように200ulに再懸濁され、C57Bl/6雌マウス(6〜8週齢)に静脈内注射される。注射の24時間後、マウスは剖検され、ルシフェラーゼ活性が測定され、またはオリゴヌクレオチド蓄積が定量されるための様々な臓器が採取される。プラスミドDNAについては、すべての主要な臓器が、タンパク質分解酵素阻害剤を添加された細胞溶解用緩衝液(Promega Corporation)中で組織粉砕機(Kontes Glass Co.)を用いて迅速にホモジナイズされる。その抽出混合物は、氷上で30分静置され、最高速度で2分間遠心分離される。その上清は保存され、ルシフェラーゼ活性を分析される。分析は以下のように行われる:20μlの上清が、ルシフェラーゼ基質(Promega Corporation)100μlを含む光測定用チューブに加えられる。発光は、ルミノメーター(Berthold)で5秒間測定される。そのデータは、タンパク質1mgあたりのルシフェラーゼのpgとして報告される。オリゴヌクレオチドについては、主要な臓器がフェノール:クロロホルムで2回抽出され、エタノールで沈殿された後、定量される。この結果は、従来のリポソーム性配合物およびPEIを用いると遺伝子発現は肺に集中することを示し、このことは肺動脈塞栓症の危険を増加させると知られている因子の一つである。しかしながら、P123のような疎水性ブロックコポリマーに結合されたPEIと配合されると、遺伝子発現は肝臓の方へ転換される。加えて、P123が単独で用いられる場合、様々な臓器における遺伝子発現は、筋肉組織を除いて非常に低い。オリゴヌクレオチドについて、その蓄積は、疎水性キャリアー(PEGに結合されたPEI)が用いられる場合腎臓で観察され、疎水性キャリアー(P85−PEI/P85)が用いられる場合は肝臓の方へ転換される。体の様々な領域における遺伝子発現およびオリゴヌクレオチドの蓄積を転換し得る広範囲の疎水性および親水性バランスを付与するために、多種多様のブロックコポリマー混合物が調製され得る。
【0259】
【表21】
【0260】
実施例43
ブロックコポリマーを用いた筋肉内での形質移入
この実験においては、4匹のグループで飼育され自由にえさを与えられたC57Bl/6雌マウス(6〜7週齢)の筋肉(前脛骨筋)において遺伝子発現を促進するために、ブロックコポリマーが用いられる。ルシフェラーゼをコードするCMV誘導性プラスミドDNA5μgがブロックコポリマーと配合され、前脛骨筋に筋肉注射された。各筋肉注射の前に、マウスはケタミンおよびキシラジンの混合溶液を用いて麻酔される。筋肉注射5日後にマウスは殺され、注射された各筋肉は切除され、タンパク質分解酵素阻害剤を添加された細胞溶解用緩衝液(Promega Corporation)中で組織グラインダー(Kontes Glass Co.)を用いて迅速にホモジナイズされる。抽出混合物は氷上で30分間静置され、次いで最高速度で2分間遠心分離される。上清は保存され、ルシフェラーゼ活性が測定される。分析は以下のようになされる。20μlの上清が、100μlのルシフェラーゼ基質(Promega Corporation)を含む光測定用のチューブに加えられる。発光はルミノメーター(Berthold)で5秒間測定される。そのデータは、前脛骨筋あたりの相対的な光単位として報告される。下記の表に示すように、ブロックコポリマーは、注射して5日後に測定される遺伝子発現を促進する。カチオン性試薬の使用は遺伝子発現を改善せず阻害した。この改善の理由は、筋肉細胞の表面張力を変え、それによって筋管におけるプラスミドDNAの取り込みを増加させる、というブロックコポリマーの特性にあるのかもしれない。
【0261】
【表22】
【0262】
実施例44
筋肉中での遺伝子発現を改善するブロックコポリマーの濃度
これらの実験は、筋肉注射に用いられるブロックコポリマーの濃度が滴定されたこと以外は実施例43と同様に行われる。プラスミドDNAの筋肉内へ移入するために用いられるブロックコポリマーの濃度は低い。筋肉内注射のために用いられたブロックコポリマーの濃度はゲルを形成しない。ブロックコポリマーの溶液は、ブロックポリマーのミセルおよびユニマー中に存在する。筋肉内の遺伝子発現を改善する濃度は、以下に矢印で示されるように0.1%より低い。この濃度は、同じブロックコポリマーが静脈内注射された場合の最大許容量より約100倍低い。また、ブロックコポリマーの組み合わせには、さらに遺伝子発現を改善できるものもある。
【0263】
【表23】
【0264】
【表24】
【0265】
実施例45
ブロックコポリマーを用いた遺伝子発現の延長
この実験においては、筋肉が48時間および2週間後に採取された以外は実施例43と同様に、ルシフェラーゼをコードするプラスミドDNAがブロックコポリマーと配合された。以下の表に示すように、遺伝子発現はブロックコポリマーによって延長された。
【0266】
【表25】
【0267】
実施例46
ブロックコポリマーを用いた筋肉における遺伝子発現の速度論
動態実験は、筋肉が1、2、3、4、および7日目に採取された以外は実施例43に記載されたような条件でなされた。以下の表に示すように、遺伝子発現は、ブロックコポリマーを有するものでより早く始まっており、7日を越えて同じレベルで持続した。
【0268】
【表26】
【0269】
実施例47
筋肉内での遺伝子発現の種間比較
2つの異なる種、すなわちマウスとラットとに注射される以外は実施例43におけるように、ブロックコポリマーはプラスミドDNAを配合するために用いられた。6〜8週齢のマウスおよび3月齢のラットの前脛骨筋が、筋肉注射48時間後に採取された。以下に示される表より、二つの仮説が立てられる;(1)ブロックコポリマーは2以上の種に適用されることができ、ヒトのような異なる種に適用され得る、および(2)ブロックコポリマーは成長した動物において遺伝子発現を促進し、これは、ブロックコポリマーが成熟した筋原繊維の形質移入を容易にしていることを示唆している。
【0270】
【表27】
【0271】
実施例47A
プルロニック(登録商標)F127およびスペルミンの結合体
ポリ(エチレングリコール)24gの代わりに同量のプルロニック(登録商標)F127(BASF Co.)を用い、分子量.25,000のポリエチレンイミンの代わりにスペルミン(Sigma−Aldrich、St−Louis)を用い、さらに1,1’−カルボニルジイミダゾールによって活性化されたポリ(エチレングリコール)10gあたり、スペルミン10gを超過するモル量を用いたこと以外は実施例28の方法に従って、スペルミンに結合されたプルロニック(登録商標)F127が得られた。スペルミンが結合したプルロニック(登録商標)F127が15g、この方法により生成された。
【0272】
実施例47B
スペルミンに結合されたブロックコポリマーを用いた筋肉内形質移入
この実施例においては、プルロニック(登録商標)F127が実施例47Aに記載されたようにスペルミンに結合され、6〜8週齢のC57Bl/6マウスの前脛骨筋にプラスミドDNAを形質移入するのに用いられた。マウスは5匹のグループで飼育され、自由にえさを与えられた。ルシフェラーゼをコードするCMV誘導性プラスミドDNA5μgがスペルミンに結合されたF127と配合され、前脛骨筋に注射された。その他の方法は実施例43と同様である。データを下記の表に示す。このデータは、F127と結合され、DNAと配合されたスペルミンが、裸のDNAと比較して導入遺伝子の発現を増加させることを示している。
【0273】
【表28】
【0274】
実施例47C
スペルミンと混合されたブロックコポリマーを用いた筋肉内形質移入
この実施例においては、プルロニック(登録商標)F127はスペルミンと混合され、プラスミドDNAを6〜8週齢のC57Bl/6マウスの前脛骨筋に形質移入するために用いられた。マウスは5匹のグループで飼育され、自由にえさを与えられた。ルシフェラーゼをコードするCMV誘導性プラスミドDNA5μgが、スペルミンと混合されたF127と配合され、前脛骨筋に注射された。その他の方法は実施例43と同様である。データを下記の表に示す。このデータは、プルロニックブロックコポリマーと混合されたスペルミンは形質移入率を増加させることを示している。
【0275】
【表29】
【0276】
実施例48
ブロックコポリマーを用いた虚血性組織の治療
ウサギの片方の後肢で虚血が誘導されてから10日後に、500□gのphVEGF165(または、塩基性FGFのような、副行血管の形成を促進することが知られている成長因子をコードする、他のいずれかのDNAプラスミド)が0.1%w/vのブロックコポリマーと配合され、虚血の後肢筋肉に筋肉注射された(Tsurumi Y. et al., Circulation, 94:12, 3281−90 (1996))。30日後、副行血管を確認するために血管造影が行われ、毛細血管を確認するために組織学的分析が行われた。虚血性の骨格筋は、ブロックコポリマーと配合された裸のプラスミドDNAを用いた遺伝子治療のための有望な標的を象徴している。血管形成サイトカインをコードする遺伝子、特に損傷のない細胞により本来分泌される遺伝子の筋肉注射による形質移入は、広範な末梢血管疾患を有する患者のための代替治療方法となるかもしれない。
【0277】
実施例49
遺伝子に基づくワクチン投与に用いられるブロックコポリマー
ブロックコポリマーは、疾患(ガン、ウイルス感染、など)に関連する様々な抗原に対するすべての体液性および細胞性免疫応答を引き起こすために用いられ得る。以下の実施例は、HIVに焦点をあてているが、これに限定されない。HIVのgp120遺伝子にありサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターによって誘導されるプラスミドDNA構造を含むブロックコポリマー配合物が調製された。5μgのgp120プラスミドDNAおよび0.01%のブロックコポリマーを含む、50μlのブロックコポリマー配合物が調製され、前脛骨筋に注射された。注射より約2週間後、筋肉が注射した部位から切除され、実施例41の方法に従って細胞溶解物として調製され、ELISAキット(Abbot Labs、Chicago、IL)を用いてgp120の存在を検出する。プラスミドDNAをワクチン接種したマウス血清中に存在するgp120抗体のHIV感染防御能力は、HT4−6Cプラーク還元分析により以下のように測定される。HT4−6C細胞(CD4+HeLa細胞)がRPMI培地(BRL、Gaithersburg、Md.)中で培養される。次いで細胞群がバッチに分割される。いくつかのバッチは、約105〜106感染単位のHIVを、約107個のHT4−6C細胞に加えることによりHIV感染させる。その他のバッチは、HIVおよび、gp120プラスミドDNAをワクチン投与されたマウスの血清約50μlの両方を添加することにより、HIV感染に対するgp120免疫血清の防御効果を試験される。インキュベーション3日後、すべてのバッチの細胞は洗浄され、固定され、クリスタルバイオレットを用いて染色され、プラークの数が計測された。gp120プラスミドDNA−ワクチン投与されたマウスの血清およびHIVの両方で処置される細胞のバッチにおけるプラーク数の減少を、HIV単独で処置されたバッチの数と比較して、gp120免疫血清の防御効果が測定される。
【0278】
実施例50
ジストロフィーのマウス筋肉における In vivo でのジストロフィンの機能発現
完全なジストロフィンコード領域およびSV40ポリを含むXp21プラスミドから、ラウス肉腫ウイルスプロモーター制御下のジストロフィン遺伝子を含むプラスミドが調製される。ジストロフィン異常性デュシェンヌ/ベッヘ筋肉(Duchenne’s/Becher Muscular)0.1%ブロックコポリマー溶液100μl中の200μgのこのプラスミドが、ジストロフィン遺伝子産物を欠損した変異マウス系(MDXマウス;Jackson labs)の四頭筋(quadriceps)に注射される。Watkins et al.に記載された方法に従った、および同じ抗ジストロフィン抗体(蛍光性二次抗体を有する抗60kdの抗体)を用いた免疫組織化学によって機能性ジストロフィンの発現が注射後7日間モニターされる。ジストロフィーマウスにおけるジストロフィン遺伝子産物の機能発現は、注射された動物の四頭筋の断面図において観察される蛍光のパターンを正常な動物において観察される蛍光パターンと比較することによって検出される。Watkins S. C., Hoffman E. P., Slayter H. S., Kinkel L. M., Immunoelectron microscopic localization of dystrophin in myofibres, Nature, June 30, 1988; 333 (6176:863−6)。正常なジストロフィン発現は、筋線維の原形質膜の下に局在化しているため、四頭筋の断面図においては細胞を取り囲む蛍光パターンを示す。さらに、ジストロフィン発現は、精製された抗60kd抗体の親和性を用いたウエスタンブロット分析によって定量される。
【0279】
実施例51
ブロックコポリマーの組み合わせが、皮内投与に続く遺伝子発現を改善する
この実験においては、5匹のグループで飼育され自由にえさを与えられたC57B1/6雌マウス(6〜7週齢)の皮膚において遺伝子発現を促進するために、ブロックコポリマーが用いられる。5ugのプラスミドpCMV−Lucが、ブロックコポリマープルロニック(登録商標)F127/L61の組み合わせを含む溶液50ulと配合された。プラスミドpCMV−Lucは、ケベック大学、INRS−IAFのアルバート デスコトウ博士(Dr. Albert Descoteaux)からの寄贈であった。ブロックコポリマーは、最終濃度0.01%w:vで、w:w比が8:1(F127:L61)であった。この配合物は、少なくとも5匹のC57Bl/57マウスの尾の付け根に注射された。7日後、実施例42のように、注射した部位の周囲の皮膚および組織が回収され、抽出されて、ルシフェラーゼ活性をモニターした。ルシフェラーゼ活性は実施例42に記載されたように測定された。以下のデータが得られ、活性レベルは、生理的食塩水中の裸のDNAのみが与えられた対照マウスのレベルと比較された。
【0280】
この結果は、ブロックコポリマーを組み合わされて配合されたプラスミドDNAは、ブロックコポリマーなしで投与されたDNAと比べて20倍高いレベルのルシフェラーゼ遺伝子発現を示すということを示している。
【0281】
実施例52
ブロックコポリマーの組み合わせは、皮内注射されたDNA組成物に対する
体液性免疫応答を改善する
この実験において、ブロックコポリマーは、5匹のグループで飼育され、自由にえさを与えられたC57Bl/57雌マウス(6〜7週齢)に皮内注射されたDNA分子によってコードされるタンパク質に対する液性免疫応答を改善するために用いられる。C57B1/57マウスは、プルロニック(登録商標)F127/L61のブロックコポリマーの組み合わせを含むまたは含まないpCMV−Bgal(β−ガラクトシダーゼタンパク質をコードしている)の5ugを皮内注射された。その配合物は、実施例51に記載されたように調製された。血液サンプルは、注射から2および4週後に回収され、β−ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫反応をモニターした。特異的な抗β−ガラクトシダーゼ抗体の検出は、ELISAによって測定された。
【0282】
ELISAは、96−ウェルプレート中で一晩、β−ガラクトシダーゼを吸着させることによって行われた。一連の希釈された血清を加える前に、プレートはPBS−BSA1%で2時間ブロックされた。1時間のインキュベーションの後、血清は除去され、プレートはPBS−トゥイーン0.01%で2回リンスされ、二次抗体(ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗マウスIgG)がプレートに加えられた。ABTS基質の添加の前に、プレートはPBS−トゥイーン(登録商標)0.01%で2回リンスされた。
【0283】
データは、抗原に応答したマウスの百分率および応答したマウスの平均力価で表されている。すべての非配合pCMV−Bgalを注射されたマウスは抗原に応答しなかった。しかしながら、接種から2および4週間後、ブロックコポリマーと組み合わされて配合されたpCMV−Bgalを注射されたマウスのそれぞれ33%および66%が応答した。この実施例は、ブロックコポリマーはプラスミドによってコードされるタンパク質に対する免疫応答を増強させるということを示している。
【0284】
【表30】
【0285】
実施例53
ブロックコポリマーの組み合わせは、ブタ生殖および呼吸器症候群ウイルス
(PRRSV)の防御性表面抗原(ORF5)に対する体液性免疫反応を改善した
この実験において、ブロックコポリマーと組み合わされて配合され、皮内に注射されたプラスミドpCMV−ORF5は、コードされたタンパク質に対する免疫応答を改善した。4匹のグループで飼育されたBalb/Cマウス(6〜7週齢)は、ブロックコポリマーの組み合わせを含むまたは含まないプラスミドpCMV−ORF5(GP5タンパク質をコードしている)の5ugを皮内に注射された。その配合物は実施例51に記載されたように調製された。血液サンプルは接種から3および5週間後に回収され、GP5に特異的な液性免疫応答をモニターした。血液採取後のはじめの3週後に追加免疫がなされた。
【0286】
この結果は、抗−GP5抗体の平均力価が増加していることによって示されるように、ブロックコポリマーの組み合わせと配合されたpCMV−ORF5を注射されたマウスは、プラスミドDNA単独を投与されたマウスに比べてより強い液性免疫応答を引き起こすということを証明している。
【0287】
【表31】
【0288】
実施例54
単一のブロックコポリマーは、皮内投与されたDNA組成物に対する
体液性免疫反応を改善する
この実験においては、C57Bl/57マウス(6〜8週齢および、サンプルセットあたりマウス6匹)が、プルロニック(登録商標)85を最終濃度0.1%または0.01で含むまたは含まないpCMV−Bgalの5または50ugを皮内注射された。接種後2および4週間後に血液サンプルは回収され、β−ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫反応をモニターした。特異的な抗β−ガラクトシダーゼ抗体の検出は、実施例52のようにELISAによって測定された。
【0289】
データは、β−ガラクトシダーゼに応答したマウスの百分率、および応答したマウスの抗β−ガラクトシダーゼ抗体の平均力価として表される。この結果は、非配合のpCMV−Bgalを注射されたマウスのβ−ガラクトシダーゼに応答した数は、プルロニック(登録商標)P85と配合されたpCMV−Bgalを注射されたマウスに比べて少なかったということを示している。どちらの濃度のプラスミドDNAを投与されたマウスにおいてもこのような差が生じた。また、プルロニック(登録商標)P85と配合されたpCMV−Bgalを注射されたマウスにおける力価は、非配合のpCMV−Bgalを投与されたマウスよりも高かった。0.1%の濃度でプルロニックP85を用いた応答がより弱いのは、より低い遺伝子発現に起因するものであろう。0.01%のP85は、よりよい免疫応答を引き起こすより高い遺伝子発現をもたらすのに、より適切な濃度である。
【0290】
【表32】
【0291】
【表33】
【0292】
実施例55
単一のブロックコポリマーは、筋肉内投与されたDNA組成物に対する
体液性免疫反応を改善する
この実験において、C57B1/マウスは、DNA組成物を筋肉内注射したあとの免疫応答の改善を示した。C57Bl/57(6〜7週齢)雌マウスは、プルロニック(登録商標)85を含むまたは含まないpCMV−Bgalの5および50ugを筋肉内注射された。6匹のマウスが各サンプル配合物を注射された。この配合物は実施例51に記載されたように調製された。血液サンプルは接種後2および4週間後に回収され、□ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫反応をモニターした。特異的な抗β−ガラクトシダーゼ抗体の検出は、実施例52に記載されたようにELISAにより測定された。
【0293】
データは、抗原に応答したマウスの百分率、および応答したマウスの平均力価として表される。このデータは、2週間後、5ugのpCMV−Bgal単独を注射されたマウスのすべてが免疫応答を示さなかったということを示している。しかしながら、プルロニック(登録商標)85と配合されたpCMV−Bgalを注射されたマウスはすべて免疫反応を示した。プルロニック(登録商標)85と配合されたpCMV−Bgalを注射されたマウスの抗β−ガラクトシダーゼ抗体の力価は、pCMV−Bgal単独を注射されたマウスよりも常に高かった。
【0294】
【表34】
【0295】
【表35】
【0296】
実施例56
ブロックコポリマーの組み合わせは、筋肉内投与されたDNA組成物に対する
体液性免疫反応を改善する
この実験において、ブロックコポリマーは、7匹のグループで飼育されたC57B1/57(6〜7週齢)雌マウスの筋肉(前脛骨筋)における液性免疫応答を改善するために用いられる。C57Bl/57マウスは、ブロックコポリマーの組み合わせを含むまたは含まないpCMV−Bgalの5または50ugを筋肉内注射された。この配合物は実施例51に記載されたように調製された。2および4週間後に血液サンプルは回収され、□−ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫応答をモニターした。特異的な抗体の検出は、実施例52に記載されたようにELISAによって測定された。
【0297】
データは、抗原に応答したマウスの百分率、および応答したマウスの平均力価として表される。このデータは、マウスがブロックコポリマーと配合されたDNAを投与された場合:(1)追加の注射または追加免疫が必要ない、(2)マウスを免疫化するのにより少量のDNAしか必要としない、および(3)免疫反応が始まる時間がより短い、ということを示している。
【0298】
【表36】
【0299】
【表37】
【0300】
実施例57
ブロックコポリマーの組み合わせはブタおよびマウスにおいて
PRRSVウイルスの防御性表面抗原に対する体液性免疫反応を改善する
ブタおよびBalb/C、CD1マウス(少なくとも5匹の動物、すべて雌)は、ブロックコポリマーの組み合わせ(プルロニック(登録商標)F127/L61)を含むまたは含まない、PRRSVウイルスのORF5遺伝子(GP5タンパク質をコードする)を含むアデノウイルスを、0および21日に皮内注射された。この配合物は実施例51に記載されたように調製された。50日後、これらの動物はPRRSVウイルスで刺激された。刺激してから7日後に血液サンプルが回収され、GP5に特異的な体液性免疫応答をモニターした。
【0301】
この結果は、GP5に対するウエスタンブロットによって示されたように、プルロニック(登録商標)F127/L61を配合されたアデノウイルスを投与された動物のみが、免疫記憶を引き起こした。
【0302】
実施例58
ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーの
溶液挙動
ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーが、10μM、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に、またはウシ血清アルブミン(BSA)の2.5%PBS溶液中に、以下に示す濃度で溶解され、その混合物は、少なくとも1時間、22.5℃または37℃でインキュベートされた。次いで、これらの系において形成された凝集体の有効径が、Kabanov et al., Macromolecules 28:2303−2314 (1995)に記載された準弾性光散乱法により測定された。結果を以下に示す。
【0303】
【表38】
【0304】
【0305】
「ND」:検出不可
「LPS」:液相分離
(*) 光散乱測定には濁度が高すぎる
これらの結果は、(1)プロピレンオキサイド含有量が50%(w/v)以上である疎水性ポリ(エチレンオキサイド)−ポリ(プロピレンオキサイド)ブロックコポリマーが、生理的温度で、水溶液中で凝集する傾向を明らかに示す、(2)これらのコポリマーの凝集および相分離は、血清タンパク質の存在下で顕著に増強される、ということを示している。
【0306】
実施例59
疎水性プルロニックコポリマーの溶液挙動に対する
親水性プルロニックコポリマーの効果
二つの異なるポリ(エチレンオキサイド)−ポリ(プロピレンオキサイド)ブロックコポリマーの混合物の代わりに単一のコポリマーを用いたこと以外は、実施例58と同じ方法。結果を以下に示す。
【0307】
【表39】
【0308】
【0309】
「ND」:検出不可
(*) 光散乱測定には濁度が高すぎる
これらの結果は、(1)エチレンオキサイド含有量が50%(w/v)超の親水性ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーは、生理的温度において、プロピレンオキサイド含有量が50%(w/v)以上の疎水性親水性ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーの凝集を妨げる、(2)エチレンオキサイド含有量が50%(w/v)超の親水性ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーは、血清タンパク質の存在下で、プロピレンオキサイド含有量が50%以上の疎水性親水性ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマーの凝集を妨げる、ことを示している。これらのデータはまた、ブロックコポリマーの混合物が用いられた場合、エチレンオキサイド含有量が70%以上の親水性ブロックコポリマーが好ましく、プルロニック(登録商標)F127が特に好ましいということを示している。
【0310】
実施例60
pCMV−βgal/プルロニックF127/プルロニックL61を注射した
筋肉からの浸潤細胞の単離
C57/Bl/6マウスが、50μL食塩水中の50μgのpCMV−βgal、またはプルロニックF127およびプルロニックL61の混合物を含む溶液50μL中の50μgのpCMV−βgalを筋肉内に投与された。プルロニックF127およびプルロニックL61の混合物は実施例51に記載されたように、ブロックコポリマー質量比が8:1(F127:L61)となるように調製された。注入5日後、筋肉は、スライスして免疫組織化学分析を行うために凍結、あるいは、浸潤細胞を機械的に単離するために回収された。次いで筋肉断片は、遺伝子発現および浸潤細胞の位置を特定し、その量を測定するために、x−galおよびヘマトキシリン−エオジンで染色された。その結果、pCMV−βgal/プルロニックF127/プルロニックL61を注入された筋肉は10倍高いx−gal染色を示し、配合されたDNAの場合、裸のpCMV−βgalと比較して、組織の導入遺伝子発現部位において、それに比例したより多くの浸潤白血球が確認された。次いで筋肉断片は、注射後の筋肉における浸潤白血球の細胞タイプを決定する目的で、免疫組織化学分析を行うために用いられた。さらに、浸潤細胞は筋肉から抽出され、フローサイトメトリー分析を行った。単離された細胞がT細胞かどうか決定するためにCD3、CD4、CD8およびCD11a分子マーカーに対する抗体が選択され、該細胞がB細胞かどうか決定するためにB220分子に対する抗体が選択され、該細胞がナチュラルキラー細胞かどうか決定するためにNK1.1分子に対する抗体が用いられ、該細胞が浸潤好中球かどうか決定するためにGr−1マーカーに対する抗体が用いられ、該細胞がマクロファージかどうか決定するためにMac−1分子に対する抗体が用いられた。これらの研究の結果、単離された細胞の大部分が、分析されたマーカー抗原をどれも発現していないということが判明した。上記の表面マーカーを発現していない(下記の結果参照)ことが知られている唯一の浸潤細胞は、未熟な樹状細胞である。
【0311】
【表40】
【0312】
pCMV−βgal/プルロニックF127/プルロニックL61を注射された筋肉中の浸潤細胞のフェノタイピング
実施例61
浸潤細胞のフェノタイプの同定
プルロニックF127/プルロニックL61単独、pCMVβgal、pCMVβgal/プルロニックF127/プルロニックL61、pCMV(空ベクター)および空ベクター/プルロニックF127/プルロニックL61を注射されたマウスの筋肉の細胞が単離され、樹状細胞の増殖に有利な条件で培養された。さらに明確には、上記の群の細胞が、等量、96−ウェルプレートにおいて平板培養された。GM−CSF(DCの分化を活性化すると知られている増殖因子)、GM−CSF+IL−4、およびLPS(同様にDCの刺激剤として知られている)を用いた恒常的な刺激のもとで7日後、pCMVβgal/プルロニックF127/プルロニックL61を注射された筋肉から単離された細胞のみが増殖し、樹状突起(スパイクおよびベール)を示していた(下記の結果参照)。
【0313】
【表41】
【0314】
実施例62
プルロニックF127/プルロニック61のプロモーター依存性効果
この実験において、プルロニックF127/プルロニック61は、4匹のグループで飼育され、自由に飼料を与えられた、C57B1/6(6〜7週齢)雌マウスの筋肉(前脛骨筋)における遺伝子発現(転写)に対するその効果を測定するために用いられた。5μgの、ルシフェラーゼをコードするCMV−、5V40−、AP−1、NF−κB−誘導性プラスミドDNAがプルロニックF127/プルロニック61と配合され、または配合されず、前脛骨筋に筋肉内注射される。各注射前に、ケタミンおよびキシラジンの混合液を用いてマウスは麻酔される。注入5日後にマウスは殺され、注射された各筋肉は切除され、タンパク質分解酵素阻害剤が添加された細胞溶解緩衝液(Promega Corporation)中のポリトロンを用いて迅速にホモジナイズされる。抽出物は氷上で30分間保存され、次いで、最大速度で2分間遠心分離される。上清は保存され、ルシフェラーゼ活性が測定される。測定は以下のように行われる:100μLのルシフェラーゼ基質(Promega Corporation)を含む光測定用チューブに、20μLの上清が加えられる。発光はルミノメーター(Berthold)を用いて5秒間測定される。データはまずは1秒あたり、前脛骨筋あたりの相対的な光単位であるが、次いで、裸のDNAに比較しての増加の百分率として報告される。下記の表に示されるように、プルロニックF127/プルロニック61はプロモーター依存性を有し、特異な転写を誘導する。
【0315】
【表42】
【0316】
実施例63
プルロニックF127/プルロニック61は浸潤細胞(樹状細胞)において
抗原の取り込みを増加させる
前脛骨筋は、注入5日後に回収され(50μg/筋)、切除され、2mLの完全RPMI中で機械的な力によって切り刻まれた。筋の小片の懸濁液は、磁石棒を用いて10分間かき混ぜられ、浸潤細胞が抽出された。抽出された細胞は、無菌のガラスウール栓を有する漏斗を通してろ過することで回収された。残った筋肉片は、2mLの完全培地を加え、上記の操作を繰り返すことによってもう2回抽出された。細胞懸濁液はプールされ、4℃、1200rpmで10分間遠心分離された。細胞のペレットは、エッペンドルフチューブあたり1×106細胞の細胞密度を得るように再懸濁された。細胞は次いで溶解緩衝液中で30分間抽出され、その後最大速度で2分間遠心分離される。上清は保存され、ルシフェラーゼ活性が測定される。測定は以下のように行われる:100μLのルシフェラーゼ基質(Promega Corporation)を含む光測定用チューブに、20μLの上清が加えられる。発光はルミノメーター(Berthold)を用いて5秒間測定される。データは1秒あたり、前脛骨筋あたりの相対的な光単位として報告される。
【0317】
【表43】
【0318】
当業者にとって明白である開示された本発明の様々な改変、改良および用途が存在するであろうし、本出願はこれらの実施形態を包含することを意図している。本発明は特定の好ましい実施形態において説明されたが、これらの全範囲は以下の特許請求の範囲を参照することによって判断されることを意図している。
【0319】
ここで引用された様々な刊行物、特許および特許出願は、それら全体を参照することによって組み込まれる。
Claims (77)
- ポリヌクレオチド、ウイルスベクターまたはそのポリヌクレオチド誘導体、および少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む、樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
- さらにポリカチオンを含む、請求項1に記載の組成物。
- 該ポリカチオンはポリアミンポリマーである、請求項2に記載の組成物。
- 該ポリカチオンはオリゴアミンまたはオリゴアミン結合体である、請求項2に記載の組成物。
- ブロックコポリマーの混合物が存在する、請求項1に記載の組成物。
- 該ブロックコポリマーは、少なくとも一つのオキシエチレン含有量が50%以下のブロックコポリマーおよび、少なくとも一つのオキシエチレン含有量が50%以上のブロックコポリマーの混合物を含む、請求項5に記載の組成物。
- 該ブロックコポリマーは、オキシエチレン含有量が50%以下の第一のブロックコポリマー成分および、オキシエチレン含有量が50%以上の第二のブロックコポリマー成分の混合物を含み、該第一ブロックコポリマーに対する該第二ブロックコポリマーの質量比が少なくとも2:1である、請求項6に記載の組成物。
- 該ブロックコポリマーは、オキシエチレン含有量が50%以下の第一のブロックコポリマー成分および、オキシエチレン含有量が50%以上の第二のブロックコポリマー成分の混合物を含み、該第一ブロックコポリマーに対する該第二ブロックコポリマーの質量比が少なくとも5:1である、請求項6に記載の組成物。
- 該コポリマーは、少なくとも一つのブロックコポリマーが70%以上のオキシエチレン含有量を有し、少なくとも一つのブロックコポリマーが50%以下のオキシエチレン含有量を有する混合物を含む、請求項5に記載の組成物。
- 該混合物は、ブロックコポリマーのプルロニック(登録商標)F127を含む、請求項5に記載の組成物。
- 該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックF127およびL61を含む、請求項1に記載の組成物。
- プルロニックF127:L61の比が8:1である、請求項14に記載の組成物。
- プルロニックF127の量が約2%(w/v)であり、プルロニックL61の量が約0.025%(w/v)である、請求項14に記載の組成物。
- 該ブロックコポリマーは、ゲル形成には不十分な量で存在する、請求項1に記載の組成物。
- ブロックコポリマーは約15%(wt/vol)未満の濃度で存在する、ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
- 該ブロックコポリマーの濃度は約10%未満である、請求項18に記載の組成物。
- 該ブロックコポリマーの濃度は約5%未満である、請求項18に記載の組成物。
- 組成物は分子溶液またはコロイド分散を形成する、ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
- 該コロイド分散は、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体、または他のタイプの分子凝集体である、請求項21に記載の組成物。
- 該コロイド分散は約300nm未満の分子種を含む、請求項21に記載の組成物。
- 該コロイド分散は約100nm未満の分子種を含む、請求項21に記載の組成物。
- 該コロイド分散は約50nm未満の分子種を含む、請求項21に記載の組成物。
- 該ポリヌクレオチドは、RNA、DNA、プラスミドDNA、ウイルス、またはウイルスベクターである、請求項1に記載の組成物。
- 該ポリヌクレオチドは、分泌性もしくは非分泌性のタンパク質、ワクチン、または抗原をコードする、請求項1に記載の組成物
- 分泌性もしくは非分泌性のタンパク質、ワクチン、または抗原を発現する遺伝子および、抗原提示細胞を活性化し、抗原提示活性化に対する免疫応答を誘起するのに使用可能なアジュバント分子を発現する少なくとも一つの遺伝子を含む、請求項1に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを含む、樹状細胞の活性化を誘導する方法。
- 該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックF127およびL61を含む、請求項30に記載の方法。
- 該ブロックコポリマーは、ゲル形成には不十分な量で存在する、請求項30に記載の方法。
- ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとを含み、分子溶液またはコロイド分散を形成する組成物を投与することを有する、樹状細胞の活性化を誘導する方法。
- 該ブロックコポリマーは、プルロニックF127およびL61を含む、請求項32に記載の方法。
- 請求項1に記載の組成物を投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法。
- 該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックF127およびL61を含む、請求項34に記載の方法。
- 該組成物は、経口で、局所的で、経直腸で、経膣で、非経口的に、筋肉内に、皮内に、皮下に、腹腔内にまたは静脈内に投与されるものである、請求項34に記載の方法。
- 請求項1に記載の組成物を筋肉内に投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法。
- 該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックF127およびL61を含む、請求項37に記載の方法。
- 該組成物は、平滑筋、骨格筋および心筋の少なくとも一つに投与される、請求項37に記載の方法。
- 請求項1に記載の組成物を皮内に投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法。
- 少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む、樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
- さらにポリカチオンを含む、請求項41に記載の組成物。
- 該ポリカチオンはポリアミンポリマーである、請求項42に記載の組成物。
- 該ポリカチオンはオリゴアミンまたはオリゴアミン結合体である、請求項41に記載の組成物。
- ブロックコポリマーの混合物が存在する、請求項41に記載の組成物。
- 該ブロックコポリマーは、少なくとも一つのオキシエチレン含有量が50%以下のブロックコポリマーおよび、少なくとも一つのオキシエチレン含有量が50%以上のブロックコポリマーとの混合物を含む、請求項45に記載の組成物。
- オキシエチレン含有量が50%以上の該ブロックコポリマーに対するオキシエチレン含有量が50%以下の該ブロックコポリマーの質量比が、1:2である、請求項46に記載の組成物。
- オキシエチレン含有量が50%以上の該ブロックコポリマーに対するオキシエチレン含有量が50%以下の該ブロックコポリマーの質量比が、1:5である、請求項46に記載の組成物。
- 該コポリマーは、少なくとも一つの、オキシエチレン含有量が70%以上であるブロックコポリマーおよび、少なくとも一つの、オキシエチレン含有量が50%以下であるブロックコポリマーとの混合物を含む、請求項45に記載の組成物。
- 該混合物は、ブロックコポリマーのプルロニック(登録商標)F127を含む、請求項45に記載の組成物。
- 該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックF127およびL61を含む、請求項41に記載の組成物。
- 該ブロックコポリマーは、ゲル形成には不十分な量で存在する、請求項40に記載の組成物。
- 組成物は分子溶液またはコロイド分散を形成する、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
- 該コロイド分散は、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体、または他のタイプの分子凝集体である、請求項56に記載の組成物。
- 該コロイド分散は約300nm未満の分子種を含む、請求項56に記載の組成物。
- 該コロイド分散は約100nm未満の分子種を含む、請求項56に記載の組成物。
- 該コロイド分散は約50nm未満の分子種を含む、請求項56に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、カチオン性反復単位を複数有する少なくとも一つのポリカチオン性ポリマーを含む、樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
- 該ポリカチオン性ポリマーが、下記のフラグメントの1以上を含むカチオン性ホモポリマー、コポリマー、またはブロックコポリマーである、請求項61に記載のポリヌクレオチド組成物:
(a)少なくとも一つの、以下の群から選ばれるアミノアルキレンモノマー:
(i)式(A)で示される第3級アミンモノマー
(ii)式(B)で示される第2級アミンモノマー
R2、R3およびR7のそれぞれは相互に独立して、式−(CZH2Z)−を有する直鎖もしくは分枝状のアルカンジイルであり、この際、Zは2〜8の値である、
(b)カチオン性アミノ酸;
(c)(−OPO(NH−R9−NR10R11R12)O−R8−)
ここでR9は炭素原子数1〜12の直鎖脂肪族基であり、R8はnが0〜5の整数である−(CH2)n−CH(R13)−であり、R10、R11およびR12のそれぞれは相互に独立して、水素または炭素原子数1〜4のアルキル基であり、R13は水素、炭素原子数3〜8のシクロアルキル基または炭素原子数1〜2のアルキル基である。;および
(d)ビニルピリジンまたはその誘導体。 - ポリヌクレオチドおよび複数のセグメントを有するポリマーを含み、該ポリマーは、カチオン性ホモポリマー、コポリマーもしくはブロックコポリマーである少なくとも一つのポリカチオン性セグメント、またはこれらの第4級塩;および
(a)ポリエーテル性セグメントが以下のものである、5〜約400のモノマー単位を有する少なくとも一つの直鎖もしくは分枝状のポリエーテルセグメント:
(i)少なくとも一つのアルキレンオキシモノマー−OCnH2n−のホモポリマー、この際、nが2〜3である;もしくは
(ii)該第一アルキレンオキシモノマーおよび、第二の異なる、アルキレンオキシモノマー−OCmH2m−のコポリマーまたはブロックコポリマー、この際、nが2〜3であり、mが2〜4であるまたは
(b)アクリルアミド、グリセロール、ビニルアルコール、ビニルピロリジン、ビニルピリジン−N−オキサイド、オキサゾリン、モルフォリンアクリルアミドおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる、少なくとも一つのモノマーのホモポリマーまたはコポリマー
のいずれかを含む、請求項62に記載の組成物。 - 該第一アルキレンオキシモノマーがエチレンオキシ(−OCH2CH2−)であり、該第二アルキレンオキシモノマーがプロピレンオキシ(−OCH(CH3)CH2−)である、請求項63に記載の組成物。
- 生理的pHにおいて、該ポリカチオン性ポリマーが少なくとも6つのカチオン性基を含む、請求項63に記載の組成物。
- 生理的pHにおいて、該ポリカチオン性ポリマーが約3Å〜約12Åで区切られるカチオン性基を複数含む、請求項63に記載のポリヌクレオチド組成物。
- 該ポリエーテル性セグメントがそれぞれ約5〜約80のモノマー単位を有し、該ポリカチオン性セグメントは、2〜約180の同じもしくは異なる、式−NH−R0−を有するモノマー単位のホモポリマー、コポリマーもしくはブロックコポリマーであり、この際、R0は必要であれば置換されてもよい炭素原子数2〜6の直鎖脂肪族基である、請求項63に記載のポリヌクレオチド組成物。
- 該ポリカチオン性ポリマーが、少なくとも一つの非イオン性ポリマーセグメントと共有結合している、請求項69に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを含む、樹状細胞の活性化を誘導する方法。
- ブロックコポリマーがゲルを形成するには不十分な量で存在する、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを有する、樹状細胞の活性化を誘導する方法。
- 該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックF127およびL61を含む、請求項70に記載の方法。
- 組成物が分子溶液またはコロイド分散を形成する、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを含む樹状細胞の活性化を誘導する方法。
- 該ブロックコポリマーはプルロニックF127およびL61である、請求項72に記載の方法。
- 請求項72に記載の組成物を投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法。
- 該組成物は、経口で、局所的で、経直腸で、経膣で、非経口的に、筋肉内に、皮内に、皮下に、腹腔内にまたは静脈内に投与されるものである、請求項72に記載の方法。
- 該組成物は、平滑筋、骨格筋および心筋の少なくとも一つに投与される、請求項72に記載の方法。
- 請求項34に記載の組成物を皮内に投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法。
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