JP2018513678A - Fviiiおよびfix用の最適化された肝臓特異的発現系 - Google Patents
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Abstract
Description
昇が治療上の利益のために必要であり、正常レベルの1%を超えるレベルで、特発出血および長期関節症の発生率の著しい低下を達成できる。
ことを示している(非特許文献52)。
が、免疫原性が低くなり、ウイルスベクターよりも潜在的に安全であり得る。非ウイルス遺伝子導入法は単純であるが、効率性は、大部分のウイルスベクター媒介遺伝子導入アプローチと比較して一般的に低い。非ウイルスベクターの効率的なインビボでの遺伝子送達はボトルネックのままである。通常、肝臓遺伝子送達のために、プラスミドは流体力学的注射によって投与される。この場合、対象の遺伝子を肝臓に送達するために、大量のDNA液を循環系に急速注射することによって、流体力学的圧力が生じる(非特許文献59)。遺伝子導入のための局所的な流体力学的圧力を維持しながら注射量を減少させることにより、流体力学的注射を臨床的に意義のある様式に適合させる努力がなされている。ターゲティング可能なナノ粒子をベースとする代替のアプローチが、肝実質細胞へのFIXの標的特異的送達を達成するために探索されている。発現は、長期発現を妨げる細菌のバックボーン配列(すなわち、ミニサークルDNA)を除去することによって延長され得る。最後に、非ウイルストランスフェクション後のFIX発現の安定性を高めるために、安定なゲノム導入遺伝子の組み込みをもたらすトランスポゾンを使用し得る。我々およびその他の者は、インビボでの遺伝子治療後に安定な凝固因子発現を得るために、トランスポゾンを使用し得ることを示した(非特許文献60;61,62;63;64)。
Vをベースとするベクターおよび核酸発現カセットは、前例のない、生理的レベルを超えるFVIII発現レベルをもたらした(国際公開第2014/064277号参照)。本発明者らは、Serpinエンハンサーの3コピーと天然TTRエンハンサーとの特定の組み合わせと、最小トランスサイレチンプロモーターから駆動されるコドン最適化Bドメイン欠失FVIII導入遺伝子またはコドン最適化padua変異FIX導入遺伝子とが、天然TTRエンハンサーおよび最小トランスサイレチンプロモーターから駆動されるコドン最適化Bドメイン欠失FVIII導入遺伝子またはコドン最適化padua変異FIX導入遺伝子を含む発現カセットと比べて、FVIIIまたはFIX発現レベルに対して相乗効果を与える。
態様1 プロモーターおよび導入遺伝子、好ましくはコドン最適化導入遺伝子に動作可能に連結された、配列番号5により定義される核酸断片、または前記配列と95%以上の同一性を有する配列を含んでなる、またはからなる肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくは、配列番号5により定義される核酸断片、または前記配列と95%以上の同一性を有する配列を含んでなる、またはからなる150ヌクレオチド以下の肝臓特異的核酸調節エレメントのトリプルリピート、好ましくはタンデムリピート、より好ましくは、配列番号11により定義される調節エレメント(3×SERP)を含んでなる核酸発現カセットであって、前記プロモーターが肝臓特異的プロモーターである、前記核酸発現カセット。
ことを含んでなる、哺乳類対象における血友病Aの治療方法。
本発明を、特定の実施形態に関して、特定の図面を参照して説明するが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲中の参照符号は、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。記載の図面は、概略的なものに過ぎず、限定的ではない。図面において、一部の要素のサイズは、説明のために誇張されており、縮尺通りに描かれていない場合がある。
」が使用される場合、これは、何か他のことが具体的に述べられていない限り、その名詞の複数形を含む。
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989);およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)に特に向けられる。
には、肝臓特異的転写因子のための1つ以上の結合部位を含んでなる。典型的には、本明細書中で使用される調節エレメントは、調節エレメントのないプロモーター単独からの遺伝子の転写と比較したときに、プロモーター駆動遺伝子発現を増加または増強する。したがって、調節エレメントは、具体的には、エンハンサー配列を含んでなるが、転写を増強する調節エレメントは、典型的な遠い上流のエンハンサー配列に限定されず、それらが調節する遺伝子の任意の距離で生じ得ることを理解されたい。実際、転写を調節する配列は、それらがインビボで調節する遺伝子の上流(例えば、プロモーター領域)または下流(例えば、3’UTR)のいずれかに位置し得、前記遺伝子のすぐ近く、または前記遺伝子から離れて位置し得ることが当該技術分野で公知となっている。本明細書に開示されている調節エレメントは、典型的には天然に存在する配列であるが、そのような調節エレメント(の一部)の組み合わせ、または調節エレメントの数コピー、すなわち天然に存在しない配列も、それ自体調節エレメントとして想定されることに注目されたい。本明細書で使用される調節エレメントは、転写制御に関与するより大きな配列の一部、例えばプロモーター配列の一部であり得る。しかし、調節エレメントのみでは、転写を開始するには通常十分ではないが、この目的を達成するためにプロモーターが必要である。
レオチド、50ヌクレオチド、55ヌクレオチド、60ヌクレオチド、65ヌクレオチド、または70ヌクレオチドの最小長を有することを理解されたい。好ましい実施形態では、本明細書で開示される核酸発現カセットおよびベクター中の1つ以上の調節エレメントは、SERPINA1調節エレメント、すなわちインビボでのSERPINA1遺伝子の発現を制御する調節エレメントからの配列を含んでなる。前記調節エレメントは、配列番号5で定義される配列、前記配列と85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、例えば96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片、を含んでなる、から本質的になる、またはからなることが、好ましい。前記調節エレメントは、最大長が、150ヌクレオチド以下、好ましくは100ヌクレオチド以下であり、配列番号5により定義される配列、前記配列と85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、例えば96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片、を含んでなる、から本質的になる、またはからなることも好ましい。配列番号5からなる肝臓特異的核酸調節エレメントは、本明細書において、「Serpinエンハンサー」、「SerpEnh」、または「Serp」と呼ばれる。
FVIII導入遺伝子の予想外に増強された肝臓特異的発現をもたらしたことが、本明細書で示されている。
、かつ/または他の組織における発現の漏出を避けるためである。他の特定の実施形態において、肝臓特異的プロモーターは、トランスサイレチン(TTR)遺伝子由来、またはアルファ−1−抗トリプシン(AAT)遺伝子由来である。なおさらなる特定の実施形態において、TTRプロモーターは、(本明細書でTTRmまたはTRRminとも呼ばれる)最小プロモーター、最も具体的には、配列番号6により定義される最小TTRプロモーターである。なおさらなる特定の実施形態において、AATプロモーターは、配列番号64で定義されるものである。
異的発現の特定の形態と見なされ得る肝実質細胞特異的発現および肝芽細胞特異的発現についても、必要な変更を加えれば同様である。この出願全体にわたり、発現において肝臓特異的が言及されている場合、肝実質細胞特異的発現および肝芽細胞特異的発現も明確に想定される。
ば点変異の導入によって行うことができる。このアプローチにより、インビトロでの活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ(APPT)(Chang et al., 1998)において野生型ヒトFIXと比較して3倍増加した凝固活性を示し、変異FIX遺伝子を導入された血友病Bマウスにおいて2〜6倍高い比活性を示す過活動性R338A変異体が報告された(Schuettrumpf et al., 2005)。より高い凝固活性を有する他の例示的なFIX点変異体またはドメイン交換変異体:EGF−1ドメインがFVII由来のEGF−1ドメインで置換された、単独の、またはR338A点変異と組み合わされたFIX(Brunetti-Pierri et al., 2009)、V86A/E277A/R338Aトリプル変異体(Lin et al., 2010)、Y259F、K265T、および/またはY345Tシングル、ダブル、またはトリプル変異体(Milanov, et al., 2012)、ならびにG190V点変異体(Kao et al., 2010)が記載されており、これらは、全て、本明細書の一部を構成するものとして援用される。特に好ましい実施形態では、FIX変異体は、2009年にSimioniらによって記載されたものであり、X連鎖性血栓形成傾向を引き起こす「第IX因子Padua」変異体と名付けられている。前記突然変異第IX因子は、過活動性であり、R338Lアミノ酸置換を保有する。本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の核酸発現カセットおよび発現ベクターに使用されるFIX導入遺伝子は、ヒトFIXタンパク質をコードし、最も好ましくは、FIX導入遺伝子は、ヒトFIXタンパク質のPadua変異体をコードする。したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、導入遺伝子は、配列番号9(すなわち、ヒトFIXタンパク質のPadua変異体をコードするコドン最適化導入遺伝子)を有する。
」は、核のスプライシング器官によって認識されスプライシングされるのに十分な大きさのイントロン全体のいろいろな部分を包含する。典型的には、発現カセットの構築および操作を容易にする、可能な限り小さい発現カセットのサイズを保つために、短い機能性のイントロン配列が好ましい。いくつかの実施形態では、イントロンは、発現カセット内のコード配列がコードするタンパク質をコードする遺伝子から得られる。イントロンは、コード配列の5’側、コード配列の3’側、またはコード配列内に位置することができる。イントロンをコード配列の5’に配置する利点は、イントロンがポリアデニル化シグナルの機能を妨害する可能性を最小にすることである。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される核酸発現カセットは、イントロンをさらに含んでなる。好適なイントロンの非限定的な例は、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン、ベータ−グロビンイントロン(ベータIVS−II)、第IX因子(FIX)イントロンA、シミアンウイルス40(SV40)スモール−tイントロン、およびβ−アクチンイントロンである。イントロンは、MVMイントロンであることが、好ましく、配列番号8により定義されるMVMミニイントロンであることが、より好ましい。本明細書に記載の核酸発現カセットへのMVMイントロンのクローニングは、それに動作可能に連結された導入遺伝子の予想外に高い発現レベルをもたらすことが示された。
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(例えば配列番号5)の3つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号11を含んでなる調節エレメント、および配列番号12により定義されるトランスサイレチンエンハンサー(TTRe)、
−肝臓特異的プロモーター、ならびに
−導入遺伝子
を含んでなる。
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(例えば配列番号5)の3つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号11を含んでなる調節エレメント、および配列番号12により定義されるトランスサイレチンエンハンサー(TTRe)、
−(例えば配列番号6により定義される)肝臓特異的TTRmプロモーター、ならびに
−導入遺伝子、を含んでなり、TTReおよびTTRm核酸の組み合わせが、配列番号69により定義されることが好ましい。
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(例えば配列番
号5)の3つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号11を含んでなる調節エレメント、および配列番号12により定義されるトランスサイレチンエンハンサー(TTRe)、
−例えば配列番号6により定義される、肝臓特異的TTRmプロモーター、
−イントロン、好ましくは、例えば配列番号8により定義される、MVMイントロン、ならびに
−導入遺伝子、を含んでなり、TTReおよびTTRm核酸の組み合わせが、配列番号69により定義されることが好ましい。
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(例えば配列番号5)の3つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号11を含んでなる調節エレメント、および配列番号12により定義されるトランスサイレチンエンハンサー(TTRe)、
−例えば配列番号6により定義される、肝臓特異的TTRmプロモーター、
−イントロン、好ましくは、例えば配列番号8により定義される、MVMイントロン、ならびに
−導入遺伝子、好ましくは本明細書の別のところで定義されているFIXまたはFVIII導入遺伝子、および本明細書の別のところで定義されている任意の転写ターミネーター、を含んでなり、TTReおよびTTRm核酸の組み合わせが、配列番号69により定義されることが好ましい。
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(例えば配列番号5)の3つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号11を含んでなる調節エレメント、および配列番号12により定義されるトランスサイレチンエンハンサー(TTRe)、
−例えば配列番号64により定義される、肝臓特異的AATプロモーター、ならびに
−導入遺伝子
を含んでなる。
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(例えば配列番号5)の3つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号11を含んでなる調節エレメント、および配列番号12により定義されるトランスサイレチンエンハンサー(TTRe)、
−例えば配列番号64により定義される、肝臓特異的AATプロモーター、ならびに
−イントロン、好ましくは、例えば配列番号8により定義される、MVMイントロン、ならびに
−導入遺伝子
を含んでなる。
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(例えば配列番号5)の3つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号11を含んでなる調節エレメント、および配列番号12により定義されるトランスサイレチンエンハンサー(TTRe)、
−例えば配列番号64により定義される、肝臓特異的AATプロモーター、ならびに
−イントロン、好ましくは、例えば配列番号8により定義される、MVMイントロン、ならびに
−導入遺伝子、好ましくは本明細書の別のところで定義されているFIXまたはFVIII導入遺伝子、および本明細書の別のところで定義されている任意の転写ターミネータ
を含んでなる。
−肝特異的調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(配列番号5)の3つのタンデムリピート、例えば、配列番号11により定義される調節エレメント、
−プロモーター、好ましくは最小TTRプロモーター、
−イントロン、好ましくはMVMイントロン、
−導入遺伝子、好ましくはコドン最適化第IX因子cDNA、さらにより好ましくはコドン最適化第IX因子Padua cDNA、
−転写ターミネーター、好ましくは、例えば配列番号10により定義されるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(BGHpA)、または配列番号56により定義される合成ポリA部位などのポリアデニル化シグナル、
を含んでなる。
−プロモーター、好ましくは最小TTRプロモーター、
−イントロン、好ましくはMVMイントロン、
−(導入)遺伝子、好ましくはコドン最適化第IX因子cDNA、さらにより好ましくはコドン最適化第IX因子Padua cDNA、
−転写ターミネーター、好ましくは、例えばウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(BGHpA)、または配列番号56により定義される合成ポリA部位などのポリアデニル化シグナル、
を含んでなる。
−プロモーター、好ましくは最小TTRプロモーター、
−イントロン、好ましくはMVMイントロン、
−(導入)遺伝子、好ましくはコドン最適化第VIII因子cDNA、さらにより好ましくはコドン最適化Bドメイン欠失第VIII因子cDNA、
−転写ターミネーター、好ましくはシミアン空胞形成ウイルス40またはシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化シグナル、または配列番号56により定義される合成ポリA部位などのポリアデニル化シグナル
を含んでなる。
−プロモーター、好ましくは配列番号64により定義されるプロモーターなどのAATプロモーター、
−イントロン、好ましくは、配列番号8により定義されるMVMイントロンなどのMVMイントロン、ならびに
−(導入)遺伝子、好ましくはコドン最適化第IX因子cDNA、さらにより好ましくはコドン最適化第IX因子Padua cDNA、
−転写ターミネーター、好ましくは、配列番号10により定義されるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(BGHpA)、または配列番号56により定義される合成ポリA部位などのポリアデニル化シグナル、
を含んでなる。非限定的な例として、このようなベクターは、配列番号65により定義される(図25参照)。
−プロモーター、好ましくは配列番号64により定義されるプロモーターなどのAATプロモーター、
−イントロン、好ましくは、配列番号8により定義されるMVMイントロンなどのMVMイントロン、
−(導入)遺伝子、好ましくはコドン最適化第IX因子cDNA、さらにより好ましくはコドン最適化第IX因子Padua cDNA、
−転写ターミネーター、好ましくは、配列番号10により定義されるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(BGHpA)、または配列番号56により定義される合成ポリA部位などのポリアデニル化シグナル、
を含んでなる。非限定的な例として、このようなベクターは、配列番号66により定義される(図25参照)。
−プロモーター、好ましくは配列番号64により定義されるプロモーターなどのAATプロモーター、
−イントロン、好ましくは、配列番号8により定義されるMVMイントロンなどのMVMイントロン、ならびに
−(導入)遺伝子、好ましくはコドン最適化第IX因子cDNA、さらにより好ましくはコドン最適化第IX因子Padua cDNA、
−転写ターミネーター、好ましくは、配列番号10により定義されるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(BGHpA)、または配列番号56により定義される合成ポリA部位などのポリアデニル化シグナル、
を含んでなる。非限定的な例として、このようなベクターは、配列番号68により定義される(図25参照)。
ーも与える。
ことができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。これらの特徴により、AAVは、ベクターのクローニング能力が比較的限られているにもかかわらず、遺伝子治療のためのウイルスベクターを作製するための非常に魅力的な候補となる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、使用されるベクターは、アデノ随伴ウイルスに由来する(すなわち、AAVベクター)。
−変異されていてもよい逆方向末端リピート配列(ITR)、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(「Serp」または「SerpEnh」)の3つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント(例えば配列番号11により定義される核酸断片を含んでなる調節エレメント)、
−プロモーター、好ましくは最小TTRプロモーター(TTRm)、
−イントロン、好ましくはMVMイントロン、
−(導入)遺伝子、好ましくはコドン最適化第IX因子cDNA、さらにより好ましくはコドン最適化第IX因子Padua cDNA、
−転写ターミネーター、好ましくは、BGHpA、または配列番号56により定義される合成ポリA部位などのポリアデニル化シグナル、
−逆方向末端リピート配列(ITR)
を含んでなる(図6参照)。
−変異されていてもよい逆方向末端リピート配列(ITR)、
−肝特異的調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(「Serp」または「SerpEnh」)の3つのタンデムリピート、およびトランスサイレチンエンハンサー(TTRe)を含んでなる調節エレメント(例えば、配列番号13を含んでなる、好ましくは配列番号57を含んでなる調節エレメント)、
−プロモーター、好ましくは最小TTRプロモーター(TTRm)、
−イントロン、好ましくはMVMイントロン、
−(導入)遺伝子、好ましくはコドン最適化第IX因子cDNA、さらにより好ましくは
コドン最適化第IX因子Padua cDNA、
−転写ターミネーター、好ましくは、BGHpA、または配列番号56により定義される合成ポリA部位などのポリアデニル化シグナル、ならびに
−逆方向末端リピート配列(ITR)、
を含んでなる(図8および図16参照)。
−変異されていてもよい逆方向末端リピート配列(ITR)、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサーの3つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント(例えば配列番号11を含んでなる調節エレメント)、
−プロモーター、好ましくは最小TTRプロモーター、
−イントロン、好ましくはMVMイントロン、
−(導入)遺伝子、好ましくはコドン最適化第VIII因子cDNA、さらにより好ましくはコドン最適化Bドメイン欠失第VIII因子cDNA、
−転写ターミネーター、好ましくはシミアン空胞形成ウイルス40またはシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化シグナル、または配列番号56により定義される合成ポリA部位などのポリアデニル化シグナル、および
−逆方向末端リピート配列(ITR)、
を含んでなる(図11、17、または18参照)。
−変異されていてもよい逆方向末端リピート配列(ITR)、
−肝特異的調節エレメント、好ましくはSerpinエンハンサー(「Serp」または「SerpEnh」)の3つのタンデムリピート、およびトランスサイレチンエンハンサー(TTRe)を含んでなる調節エレメント(例えば、配列番号13を含んでなる、好ましくは配列番号57を含んでなる調節エレメント)、
−プロモーター、好ましくは最小TTRプロモーター、
−イントロン、好ましくはMVMイントロン、
−(導入)遺伝子、好ましくはコドン最適化第VIII因子cDNA、さらにより好ましくはコドン最適化Bドメイン欠失第VIII因子cDNA、
−転写ターミネーター、好ましくはシミアン空胞形成ウイルス40またはシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化シグナル、または配列番号56により定義される合成ポリA部位などのポリアデニル化シグナル、および
−逆方向末端リピート配列(ITR)、
を含んでなる(図19または20参照)。
発現レベルをもたらした。ベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)由来ベクターであることが好ましく、一本鎖AAVベクターであることがより好ましく、一本鎖AAV血清型8ベクター、例えば配列番号22または配列番号23により定義されるベクターであることがさらにより好ましい。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−TTRm−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−TTRm−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−TTRm−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−TTRm−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−TTRm−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−CRM8−TTRe−TTRm−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−AAT−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−AAT−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−AAT−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−AAT−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−AAT−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
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pAAVsc−CRM8−TTRe−KHKp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−CRM8−TTRe−KHKp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−HPXp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−HPXp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−HPXp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−HPXp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−HPXp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−CRM8−TTRe−HPXp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−NNMTp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−NNMTp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−NNMTp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−NNMTp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−NNMTp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−CRM8−TTRe−NNMTp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−CES1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−CES1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−CES1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−CES1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−CES1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−CRM8−TTRe−CES1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−PROCp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−PROCp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−PROCp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−PROCp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−PROCp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−CRM8−TTRe−PROCp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−APOC3p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−APOC3p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−APOC3p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−APOC3p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−APOC3p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−CRM8−TTRe−APOC3p−MVM−FVIIIcodeltaB−sv40pA,
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−MASP2p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−MASP2p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−MASP2p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−MASP2p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−MASP2p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−CRM8−TTRe−MASP2p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−SERPINC1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−SERPINC1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−SERPINC1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−SERPINC1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−SERPINC1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−CRM8−TTRe−SERPINC1p−MVM−FVIIIcodeltaB−sv40pA,
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−HAMPp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−HAMPp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−HAMPp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−HAMPp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
pAAVsc−CRM8−TTRe−HAMPp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−HAMPp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA。
al., 1993)。
al., 1992; Chowdhury et al., 1991)。インビボ標的化は、DNAまたはウイルスベクターを肝実質、肝動脈、または門脈に注射することにより、および転写標的化を介することにより、行われている(Kuriyama et al., 1991; Kistner et al., 1996)。最近の方法には、裸のDNAの門脈内送達(Budker et al., 1996))および流体力学的尾静脈トランスフェクション(Liu et al., 1999; Zhang et al., 1999)も含まれる。
い用量のベクターを投与することによってさえも得ることができる。したがって、当該用語は、治療される血友病の症状の緩和を含む、研究者、獣医師、医師、または他の臨床家が求めている組織、系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘発する化合物または医薬組成物の量を表す。特に、これらの用語は、血友病、特に血友病Bまたは血友病Aに関連する臨床的障害、症状、または合併症を予防、治癒、寛解、または少なくとも最小化するために必要な本発明に係る化合物または医薬組成物の単回または複数回投与での量を表す。
含んでなる製剤である。本明細書で使用される用語「薬剤的に許容できる」は、当該技術分野と矛盾がなく、医薬組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではないことを意味する。本明細書で使用される用語「薬剤に許容できる塩」は、塩酸塩、硫酸塩、およびリン酸塩などの無機酸付加塩、または酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、およびクエン酸塩などの有機酸付加塩を意味する。薬剤的に許容できる金属塩の例は、ナトリウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、ならびに亜鉛塩である。薬剤的に許容できるアンモニウム塩の例は、アンモニウム塩およびテトラメチルアンモニウム塩である。薬剤的に許容できる有機アミン付加塩の例は、モルホリンおよびピペリジンとの塩である。薬剤的に許容できるアミノ酸付加塩の例は、リシン、グリシン、およびフェニルアラニンとの塩である。本発明に係る医薬組成物は、例えば、丸剤、錠剤、ラッカー錠剤(lacquered tablet)、糖衣錠、顆粒剤、硬質および軟質ゼラチンカプセル剤、水性、アルコール性、もしくは油性溶液、シロップ、エマルジョン、もしくは懸濁液の形態で経口投与することができ、または直腸に、例えば坐剤の形態で投与することができる。注射または注入のための溶液の形態で非経口的に、例えば皮下、筋肉内、または静脈内に投与を行うこともできる。他の好適な投与形態は、例えば、経皮もしくは局所投与、例えば、軟膏、チンキ、スプレー、もしくは経皮治療システムの形態、または鼻噴霧もしくはエアロゾル混合物の形態の吸入投与、または例えばマイクロカプセル 、インプラント、またはロッドである。医薬組成物は、当業者にそれ自体公知の方法で調製することができる。この目的のために、本明細書で定義されている核酸発現カセットまたは発現ベクター、1種以上の固体または液体の薬剤的に許容できる賦形剤を、必要に応じて他の薬剤的に活性な化合物と組み合わせて、ヒトの医学または獣医学における医薬品として使用することができる適当な投与形態または剤形にする。
自己相補的(sc)二本鎖アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターのデザインを図1に示す。最小トランスサイレチンプロモーター(TTRm)は、高活性化、血栓形成傾向FIX変異(R338L)を含むヒトコドン最適化第IX因子(co−FIX−R338L)の発現を駆動している。最小TTRプロモーター(TTRm)は、Serpinエンハンサー(SERP)、Serpinエンハンサーのトリプルリピート(3×SERP)、天
然TTRエンハンサー(TTRe)、またはSerpinエンハンサーのトリプルリピートおよび天然TTRエンハンサーの組み合わせ(3×SERP−TTRe)のいずれかと共に使用される。マウス微小ウイルスイントロン(MVM)、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位(BGHpA)または合成ポリアデニル化部位(Synt.pA)、および逆方向末端リピート(ITR)が示されており、3×SerpEnhは、このエレメントがTTRmの上流のトリプルリピートとしてクローン化されたことを意味する。ベクターサイズ(両方のITRのサイズを含む)が示されている。
クローニング法
FIXコンストラクト:基本的なAAVsc−SerpEnh−TTRm−MVM−co−FIX−R338L−BGHpAプラスミド(Nair et al. Blood, 2014)を使用して、他のAAV−FIXコンストラクトを作製した。このプラスミドは、Serpエンハンサー(SerpEnh)、肝臓特異的トランスサイレチン(TTRm)プロモーター、マウス微小ウイルス(MVM)小イントロン、R338L変異を含むコドン最適化ヒトFIX導入遺伝子、およびウシ成長ホルモンポリA(BGHpA)を含む。GeneArt(ライフテクノロジーズ、ドイツ、レーゲンスブルク)によって3×SerpEnh−TTRm−MVM配列を合成し、AscIおよびNheIを用いる基本コンストラクトにクローン化し、それによりSerpEnh−TTRm−MVMを置換し、pAAVsc−3×SerpEnh−TTRm−MVM−co−FIX−R338L−BGHpAを作製した。このプラスミドに、3×SerpEnh配列をTTRエンハンサー(TTREnh)または(GeneArtで構築した)3×SerpEnh−TTREnhで置換し、それにより、pAAVsc−TTREnh−TTRm−MVM−co−FIX−R338L−BGHpAおよびpAAVsc−3×SerpEnh−TTREnh−TTRm−MVM−co−FIX−R338L−BGHpAをそれぞれ作製した。
TTREnh−TTRm−MVM−FVIIIcopt−Sv40pAを作製した。pAAVss−3×SerpEnh−TTREnh−TTRm−MVM−cohFVIIIデルタB−SV40pA(5493bp)を得るために、pAAVss−TTREnh−TTRm−MVM−cohFVIIIデルタB−SV40pA(ベクター)をNotI−Acc65Iで制限酵素切断した。NotI/Acc65Iに挟まれる3×Serpを有する断片をGenArtにより合成し、制限酵素切断したベクターに連結した。
AAVベクターを、先に記載したように(VandenDriessche et al, 2007, VandenDriessche et al; 2007, J. Thromb. Haemost. JTH 5:16-24)、AAV−293ヒト胚性腎臓癌細胞(ストラタジーン、カリフォルニア州カールスバッド,カタログ番号240073)を、対象のpAAVプラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、およびAAV2
Rep遺伝子をAAV8またはAAV9 Cap遺伝子とともに送達するキメラパッケージングコンストラクトで、リン酸カルシウム(インビトロジェン、カルフォルニア州カールスバッド)同時トランスフェクションすることにより製造した。AAV−FIXベクターについては、AAV9血清型を使用し、AAV−FVIIIベクターについては、AAV8血清型を使用した。AAV−293細胞は、PCRによりマイコプラズマの検出について判定される微生物汚染がないものである。簡潔に述べると、トランスフェクションの2日後、細胞を採取し、等密度遠心法を用いてベクター粒子を精製した。採取した細胞を、連続した凍結/融解サイクルおよび超音波処理によって溶解し、ベンゾナーゼ(benzonase)(ノバジェン、ウィスコンシン州マディソン)およびデオキシコール酸(シグマアルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)で処理し、続いて塩化セシウム(インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド)の2回連続の密度勾配超遠心に付した。AAVベクターを含む画分を集め、ダルベッコ(Dulbecco)のリン酸緩衝食塩水(PBS)(Gibco、BRL)中の1mM MgCl2中で濃縮し、−80℃で保存した。ベクター力価(ウイルスゲノム中(vg)/ml)を、特異的プライマーを用いた定量的リアルタイムPCRによって測定した。FIXベクターについては、ウシ成長ホルモンポリA配列に特異的なプライマーを使用した。用いたフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ5’−GCCTTCTAGTTGCCAGCCAT−3’(配列番号60)および5’−GGCACCTTCCAGGGTCAAG−3’(配列番号61)であった。FVIIIベクターについては、FVIII遺伝子配列に特異的なプライマーを使用した。用いたフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ5’−AACGGCTACGTGAACAGAAG −3’(配列番号62)および5’−GATAGGGCTGATTTCCAGGC−3’(配列番号63)であった。反応は、ABI 7500 Real−Time PCR System(アプライド バイオシステムズ、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ)でSybrGreen PCR Master Mix(アプライド バイオシステムズ、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ)で行った。適切なcDNAを保有する対応するAAVベクターを生じさせるために使用されたそれぞれのベクタープラスミドの既知のコピー数(102〜107)を用いて標準曲線を作成した。
AAVベクターの投与は、以下に詳述するように、成体C57B6マウスに対して、マウス1匹当たり1×109(低用量)および5×109(高用量)のベクターゲノム(vg)という2つの異なる用量で尾静脈注射によって行う。FIX/FVIII遺伝子発現を評価するために、遺伝子導入後の様々な時点でマウスを採血した。pAAVss−TTREnh−TTRm−MVM−co−hFVIII−デルタB−SV40pAおよびpAAVss−3XSerpEnh−TTREnh−TTRm−MVM−co−hFVIII−デルタB−SV40pAプラスミドコンストラクトを、C57BL/6マウスへの流体力学的送達によって、マウス1匹あたり300ngの用量で投与した。イソフルランを用
いて動物を麻酔し、眼窩後方出血により血液試料をクエン酸三ナトリウム上に採取した。4℃で14000rpmで3分間遠心分離することにより、採血直後に血漿を調製した。さらなる分析のために、血漿をすぐに−80℃で保存した。
クエン酸処理した血漿中のhFIX抗原の濃度を、製造業者のプロトコル(ダイアグノスティカ スターゴ、フランス)を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって測定した。hFIX標準(キットで入手可能)を希釈緩衝液を用いて連続的に希釈し、較正に使用した。ここで標準の100%は、5000ngのFIXタンパク質に相当する。血漿試料のアリコートを解凍し、希釈して、それらの読み取り値が標準の直線範囲内に入るようにした。次に、標準および試料を、一次抗ヒトFIX抗体でプレコートした96ウェルプレートに加えた。室温で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼに結合した二次抗体を含む溶液を添加し、続いて室温でさらに1時間インキュベートした。インキュベーション後、ペルオキシダーゼ基質TMB(発色溶液)を加え、発色させた。正確に5分間のインキュベーションの後、1M H2SO4を全てのウェルに添加して反応を停止させた。15分のインキュベーション後、マイクロプレートリーダーを用いて450nmで吸光度を測定した。得られた標準曲線を用いて、FIXレベルを決定した。
クエン酸処理した血漿中のhFVIII抗原の濃度を、製造業者のプロトコル(ダイアグノスティカ スターゴ、フランス)を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって測定した。hFVIII標準(キットで入手可能)を希釈緩衝液を用いて連続的に希釈し、較正に使用した。ここで標準の100%は、200ngのFVIIIタンパク質に相当する。血漿試料のアリコートを解凍し、希釈して、それらの読み取り値が標準の直線範囲内に入るようにした。次に、標準および試料を、一次抗ヒトFVIII抗体でプレコートした96ウェルプレートに加えた。室温で2時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼに結合した二次抗体を含む溶液を添加し、続いて室温でさらに2時間インキュベートした。インキュベーション後、ペルオキシダーゼ基質TMB(発色溶液)を加え、発色させた。正確に5分間のインキュベーションの後、1M H2SO4を全てのウェルに添加して反応を停止させた。15分のインキュベーション後、マイクロプレートリーダーを用いて450nmで吸光度を測定した。得られた標準曲線を用いて、FIXレベルを決定した。
データを、Microsoft Excel Statisticsパッケージを使用して分析した。図3および図4に示す値は、平均+SEMである。有意性値を、t検定を用いた比較によって得た。
オス成体C57BL/6マウス(18〜20グラム)に、1×109vg/マウスおよび5×109vg/マウスの用量で尾静脈注射により、AAV9 FIXベクター(以下の表参照)を投与した。
オス成体C57BL/6マウス(22〜24グラム)に、それぞれのプラスミド(以下の表を参照)を300ngの用量での流体力学的尾静脈注射によって、投与した。
第IX因子:
天然TTReエンハンサーと結合しており、TTRmプロモーターと組み合わされた3コピーのSerpエンハンサーを有する3×SerpEnh−TTREnh−TTRmを含むAAVベクターは、AAVベクター注射後少なくとも39日までの4つの時点で、他の発現カセットのいずれかと比較して最高のFIXレベルをもたらした。FIX発現は経時的に連続的な増加を示した。
3コピーのSerpエンハンサーを有する3×SerpEnh−TTRmを含むAAVベクターは、AAVベクター注射後少なくとも40日まで、他の発現カセットのいずれか
と比較して最も高いFVIIIレベルをもたらした。FVIII発現は経時的に連続的な増加を示した。
pAAVss−TTRm−MVM−coFVIIIデルタB−Sv40pA(配列番号14);
pAAVss−3xSerpEnh−TTRm−MVM−coFVIIIデルタB−Sv40pA(配列番号16);
pAAVss−TTRe−TTRm−MVM−coFVIIIデルタB−Sv40pA(配列番号17);および
pAAVss−3xSerpEnh−TTRe−TTRm−MVM−coFVIIIデルタB−Sv40pA(配列番号:22)。
マウスモデル:18〜20グラムのCB17−SCIDオス成体マウス
用量:150ngプラスミド/マウス
分析時点:1日目に血液収集
マウスの数:条件当り3
デザイン:以下の表を参照
マウスモデル:18〜20グラムのCB17−SCIDオス成体マウス
用量:150ngプラスミド/マウス
分析時点:1日目に血液収集
マウスの数:条件当り3
デザイン:以下の表を参照
追加は、FVIII発現を17倍に増強する。3×SERPのTTRe−TTRmコンストラクトへの添加は、FVIII発現を13倍に増強する。さらに、TTReの3×SERP−TTRmコンストラクトへの追加は、FVIII発現を4倍に増強する。
pAAVss−3xSerpEnh−TTRe−AAT−MVM−co−FIX−R338L−BGHpA(配列番号65);
pAAVss−3xSerpEnh−AAT−MVM−co−FIX−R338L−BGHpA(配列番号66);
pAAVss−TTRe−AAT−MVM−co−FIX−R338L−BGHpA(配列番号67);および
pAAVss−TTRe−3xSerpEnh−AAT−MVM−co−FIX−R338L−BGHpA(配列番号68)。
試験された全てのコンストラクトは、AATプロモーター(配列番号64)を使用する。
用量:1μgおよび2μgプラスミド/マウス
分析時点:D1、D2に血液収集
マウスの数:条件当り3
デザイン:以下の表を参照
pAAVss−CRM8−TTRe−AAT−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA.
pAAVss−3×CRM8−AAT−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA.
pAAVss−3×CRM8−TTRe−AAT−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pAおよび
pAAVss−TTRe−3×CRM8−AAT−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−ALBp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−ALBp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−ALBp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−ALBp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−ALBp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−ALBp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−APOA1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−APOA1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−APOA1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−APOA1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
pAAVsc−CRM8−TTRe−APOA1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−APOA1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−CFBp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−CFBp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−CFBp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−CFBp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−CFBp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−CFBp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−KHKp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−KHKp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−KHKp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−KHKp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−KHKp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−KHKp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−HPXp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−HPXp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−HPXp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−HPXp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−HPXp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−HPXp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−NNMTp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−NNMTp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−NNMTp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−NNMTp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−NNMTp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−NNMTp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−CES1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−CES1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−CES1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−CES1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−CES1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−CES1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−PROCp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−PROCp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−PROCp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−PROCp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−PROCp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−PROCp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−APOC3p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−APOC3p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−APOC3p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−APOC3p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−APOC3p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−APOC3p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−MASP2p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−MASP2p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−MASP2p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−MASP2p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−MASP2p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−MASP2p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−SERPINC1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−SERPINC1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−SERPINC1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−SERPINC1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−SERPINC1p−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−SERPINC1p−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
を包含する。
pAAVsc−3×CRM8−TTRe−HAMPp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−3×CRM8−TTRe−HAMPp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
pAAVsc−TTRe−3×CRM8−HAMPp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,
pAAVss−TTRe−3×CRM8−HAMPp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA,
pAAVsc−CRM8−TTRe−HAMPp−MVM−FIXcoR338L−BGHpA,または
pAAVss−CRM8−TTRe−HAMPp−MVM−FVIIIcoデルタB−sv40pA
包含する。
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Claims (17)
- 肝臓特異的プロモーターおよび導入遺伝子に動作可能に連結された、
配列番号5により定義される核酸断片、または前記配列と95%以上の同一性を有する配列を含んでなる、またはからなる肝臓特異的核酸調節エレメントの好ましくはタンデムに配置されたトリプルリピート、および
配列番号12により定義される核酸断片、または前記配列と95%以上の同一性を有する配列を含んでなる、またはからなる核酸調節エレメント
を含んでなる、核酸発現カセット。 - 前記肝臓特異的プロモーターが、最小TTRプロモーター(TTRm)、AATプロモーター、アルブミン(ALB)プロモーターまたは最小プロモーター、アポリポタンパク質A1(APOA1)プロモーターまたは最小プロモーター、補体因子B(CFB)プロモーター、ケトヘキソキナーゼ(KHK)プロモーター、ヘモペキシン(HPX)プロモーターまたは最小プロモーター、ニコチンアミドN−メチルトランスフェラーゼ(NNMT)プロモーターまたは最小プロモーター、(肝臓)カルボキシルエステラーゼ1(CES1)プロモーターまたは最小プロモーター、プロテインC(PROC)プロモーターまたは最小プロモーター、アポリポタンパク質C3(APOC3)プロモーターまたは最小プロモーター、マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ2(MASP2)プロモーターまたは最小プロモーター、ヘプシジン抗菌ペプチド(HAMP)プロモーターまたは最小プロモーター、またはSerpinペプチダーゼ阻害因子、クレードC(アンチトロンビン)、メンバー1(SERPINC1)プロモーターまたは最小プロモーターを含んでなる群から選択される、請求項1に記載の核酸発現カセット。
- 前記肝臓特異的プロモーターが、配列番号6により定義される最小TTRプロモーター(TTRm)である、請求項1または2に記載の核酸発現カセット。
- 前記肝臓特異的プロモーターが、配列番号64により定義されるAATプロモーターである、請求項1または2に記載の核酸発現カセット。
- 前記トリプルリピートが、配列番号11により定義される核酸断片または前記配列と95%以上の同一性を有する配列からなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- 導入遺伝子に動作可能に連結された配列番号13により定義される調節エレメント、より好ましくは、プロモーターおよび導入遺伝子に動作可能に連結された配列番号57により定義される調節エレメントを含んでなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- 前記導入遺伝子が凝固第IX因子(FIX)をコードし、好ましくは、前記導入遺伝子がコドン最適化凝固因子FIXであるか、または前記凝固因子FIXが高活性化変異を含み、好ましくは、前記高活性化変異がR338Lアミノ酸置換に相当し、より好ましくは凝固因子FIXをコードする前記導入遺伝子が配列番号9により定義される塩基配列を有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- 前記導入遺伝子が凝固第VIII因子(FVIII)をコードし、好ましくは、前記導入遺伝子がコドン最適化凝固因子FVIIIであるか、または前記凝固第VIII因子がBドメインの欠失を有し、好ましくは、前記FVIIIのBドメインが配列番号59により定義されるリンカーで置換されており、より好ましくは凝固第VIII因子をコードする前記導入遺伝子が配列番号18により定義される塩基配列を有する、請求項1〜7のい
ずれか一項に記載の核酸発現カセット。 - 前記プロモーターがトランスサイレチン(TTR)プロモーターであり、配列番号69により定義されるTTReおよびTTRm核酸の組合せを含んでなる、請求項1〜3および5〜8のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- マウス微小ウイルス(MVM)イントロン、好ましくは配列番号8により定義されるMVMイントロンをさらに含んでなる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(BGHpA)、好ましくは配列番号10により定義されるBGHpAに由来する、もしくはシミアンウイルス40ポリアデニル化シグナル(SV40pA)、好ましくは配列番号19により定義されるSV40pAに由来する転写終結シグナル、または配列番号56により定義される合成ポリアデニル化シグナルをさらに含んでなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の核酸発現カセットを含んでなるベクターであって、好ましくは、前記ベクターがウイルスベクターであり、より好ましくは、前記ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来する、ベクター。
- 血友病Aの治療に使用するためのFVIII導入遺伝子を含んでなる、請求項12に記載のベクター、または血友病Bの治療に使用するためのFIX導入遺伝子を含んでなる、請求項12に記載のベクター。
- 請求項12に記載のベクターの対象への形質導入またはトランスフェクション後に、前記対象における10mU/ml血漿の治療閾値濃度以上の血漿中の第IX因子またはFVIIIのレベルが得られる、請求項13に記載の使用のためのベクター。
- 前記対象への前記ウイルスベクターの前記形質導入が、2×1011vg/kg未満の用量で行われる、請求項14に記載の使用のためのベクター。
- 前記対象への前記ウイルスベクターの前記形質導入が、6×1011vg/kg以下の用量で行われ、100mU/mlの治療濃度以上の血漿中の第IX因子もしくはFVIIIのレベルが前記対象において得られる、または、
前記対象への前記ウイルスベクターの前記形質導入が、6×1011vg/kg以下の用量で行われ、50mU/mlの治療濃度以上の血漿中の第IX因子もしくはFVIIIのレベルが、前記対象において得られる、または、
前記対象への前記ウイルスベクターの前記形質導入が、2×1012vg/kg以下の用量で行われ、200mU/mlの治療濃度以上の血漿中の第IX因子もしくはFVIIIのレベルが、前記対象において得られる、または、
前記対象への前記ウイルスベクターの前記形質導入が、2×1012vg/kg以下の用量で行われ、150mU/mlの治療濃度以上の血漿中の第IX因子もしくはFVIIIのレベルが、前記対象において得られる、
請求項15に記載の使用のためのベクター。 - 前記ベクター中の前記導入遺伝子がFVIIIである場合に、血友病Aを治療するための活性成分を任意でさらに含んでなり、または、
前記ベクター中の前記導入遺伝子がFIXである場合に、血友病Bを治療するための活性成分を任意でさらに含んでなる、
請求項12に記載のベクターと、薬剤的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物。
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