JP7366273B2 - 肝臓特異的プロモータ及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は遺伝子治療の分野に属し、より具体的には、肝臓特異的プロモータ及びその使用に関する。
遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）とは外来性正常遺伝子を標的細胞に導入して、遺伝子欠陥又は異常による疾患を修正又は補償し、最終的に治療目的を実現することを指す。１９８９年に人間に対する最初の遺伝子治療プログラムが臨床試験に入ってから、すでに３０年以上が経過した。過程は非常にでこぼこであるが、ベクターウィルス、送達機序の最適化に伴い、近年、遺伝子治療は急速に発展し、癌、希少疾患の治療において将来性が期待できる。２０１７年だけでも、遺伝子治療は多くの画期的な進歩を遂げており、米国ＦＤＡは相次いでＣＡＲ－Ｔ療法（ＫｙｍｒｉａｈとＹｅｓｃａｒｔａ）と最初の「遺伝学的眼疾患突然変異を標的とする」遺伝子療法（Ｌｕｘｔｕｒｎａ）とを承認し、２０１７年は遺伝子療法にとって非常に重要な１年といえる。
アデノウイルス随伴ウィルス（ＡＡＶ）はパルボウィルス科に属し、ウィルス粒子が小さく、コピー欠陥があり、エンベロープがないウィルスであり、今まで野生型ＡＡＶが人体に疾患を引き起こすことはまだ発見されていない。人工的に改変した組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は安全性が良く、免疫原性が低く、組織の好性が広く、宿主細胞のゲノムに組み込まないなどの利点を備えており、近年、ｒＡＡＶを遺伝子治療のベクターとすることは遺伝子治療の研究の焦点になっている。２０１２年、欧州医薬品監督管理庁は最初の遺伝子治療薬であるｒＡＡＶベクターに基づくリポタンパク質エステラーゼ遺伝子治療薬Ｇｌｙｂｅｒａを承認し、２０１７年１２月１９日に、米国ＦＤＡは、ｒＡＡＶを遺伝子治療ベクターとした、アルストレーム－オルセン症候群（ＲＰＥ６５遺伝子の突然変異によるもの）の治療用として最初の希少疾患用遺伝子治療薬Ｌｕｘｔｕｒｎａを承認し、２０１９年５月２４日には、米国ＦＤＡはノバルティス社製の重症筋萎縮症Ｉ型（ＳＭＡ Ｉ）治療用の希少疾患遺用伝子治療薬であるＺｏｌｇｅｎｓｍａを承認した。２０１９年１１月までに、ｒＡＡＶをベクターとして使用する２００を超える遺伝子治療の臨床試験プログラムがＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖに登録されている。
組み換えＡＡＶは遺伝子治療ベクターとしても明らかな欠点が存在し、その外来遺伝子の担持量が小さく、一本鎖ゲノムＡＡＶの外来遺伝子担持の上限は４．７ｋｂであり、外来遺伝子の担持長さは更に増加し、ウイルス粒子パッケージングの完全性はそれに伴って低下する。担持量の制限のため、いくつかの大きな遺伝子はｒＡＡＶベクターを用いて送達するのに適しておらず、例えば血友病Ａの原因遺伝子凝固因子ＶＩＩＩが挙げられ、そのｃＤＮＡの大きさは７０５６ｂｐで、２３５１ａａのＦＶＩＩＩ前駆体タンパク質をコードし、これらは、ｒＡＡＶの担持量をはるかに超えている。
血友病（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）は凝固因子欠乏による遺伝性凝固機能障害疾患であり、よく見られるタイプは血友病Ａ（ＨＡ）と血友病Ｂ（ＨＢ）を含む。血友病の発病率を５～１０／１０万と見積もると、現在、中国では、血友病患者数は約１０万人、世界では約１００万人と予測されている。
ＨＡはＸ染色体上に位置するＦＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の突然変異による凝固因子８の欠乏又は機能欠陥によるものであり、全血友病の約８０％を占めている。ＨＢは凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）の欠乏として表現され、血友病患者全体の約２０％を占め、Ｘ染色体上に位置するＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子の突然変異によって引き起こされる。
現在、血友病を治療する主な方法は代替治療である。代替治療は外因性組換え凝固因子の輸血により出血合併症を緩和し、機能喪失を防止することである。しかし、凝固因子ＶＩＩＩの半減期が短い（８～１２ｈ）ため、毎週２～３回注射する必要があり、頻繁な治療は患者の生活の質に深刻な影響を与える。一方、遺伝子治療は血友病やその他の単遺伝子遺伝病の治療に新しい手段を提供した。血友病の遺伝子治療は凝固因子を正常にコードする外来性遺伝子を患者の体内に導入し、細胞内で治療レベルの凝固因子を発現して分泌することにより、血友病を完治する目的を実現する。凝固因子ＶＩＩＩは正常レベルまで補充して機能を発揮する必要はなく、正常レベルの５％まで回復すれば出血予防効果を達成でき、このため、血友病Ａは非常に良い遺伝子治療適応症になる。
凝固因子ＶＩＩＩ遺伝子が大きいことやＡＡＶベクターの遺伝子担持量が制限を受けるなどの特徴に対して、Lind P.,et alは１４個のアミノ酸のアダプターペプチド（ＳＱ配列）で凝固因子ＶＩＩＩのＢドメイン（７６０～１６６７ａａ）を置換することにより、この遺伝子の大きさを元の４０％である４．４ｋｂ（Lind P et al.,Eur.J.Biochem.232:19-27,1995）まで減少させ、このＢ ｄｏｍａｉｎ ｄｅｌｅｔｅｄ ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）は現在ＦＶＩＩＩタンパク質の発現によく採用されているバージョンであり、Jenny McIntosh.,et alは、ＳＱ配列の途中に６つのグリコシル化部位を含む１７ａａ短ペプチドＶ３（Ｖ３－ＦＶＩＩＩ）を挿入することにより、ｉｎｖｉｖｏでのこのタンパク質の発現を増強した（Jenny McIntosh et al., BLOOD. 121(17),2013）。しかし、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩもＶ３－ＦＶＩＩＩも、そのサイズがｒＡＡＶの担持の上限に近づいており、目的遺伝子の発現を調節する調節エレメント（プロモータ、Ｐｏｌｙ Ａ）には約３００ｂｐしか残されていない。
ＦＶＩＩＩの主な合成場所は肝細胞と肝洞内皮細胞であり、現在、ｒＡＡＶを用いた血友病Ａの遺伝子治療の策略は目的遺伝子ＦＶＩＩＩを縮小すると同時に、小さなサイズの肝臓特異的プロモータを用いて、プロモータ、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩやＶ３－ＦＶＩＩＩ、ｐｏｌｙＡを同一のＡＡＶベクターの限られた空間に集合することであり、例えばＢＩＯＭＡＲＩＮ社製のＢＭＮ２７０の発現クラスターはＨＬＰ－ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ－ｓＰＡ（ClinicalTrials.gov number, NCT02576795）であり、ＳＰＡＲＫ社製のＳＰＫ－８０１１の発現クラスターはＴＴＲｍ－ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ－Ｒａｂｂｉｔ ｂｅｔａ ｇｌｏｂｉｎ ｐｏｌｙ Ａ（ClinicalTrials.gov number, NCT03003533）であり、両者はいずれも小さなサイズの肝臓特異的プロモータを用いて目的遺伝子の発現を駆動するものであり、Ｉ／ＩＩ相臨床試験は一定の効果を遂げており（Rangarajan S et al., The New England journal of medicine. 2017 ; Lindsey A.G et al., Blood.130:604, 2017）、そのうちＢＩＯＭＡＲＩＮ社製の血友病Ａ遺伝子治療薬ＢＭＮ２７０は既にＥＭＡに発売申請を提出している。しかし、プロモータのサイズの制約により、その開始強度は、一部の大きなサイズのプロモータとはまだ少なからぬ差が存在している。
本発明の効率的なプロモータは、目的遺伝子の発現を高強度で持続的に開始することができ、治療効果を達成するために必要な用量を低減し、投与回数を低減することができ、これにより、治療コスト及び生体の免疫反応を大幅に低減することができる。しかし、ｒＡＡＶ担持量の制限により、凝固因子ＶＩＩＩなどの比較的に大きい遺伝子を担持する場合、プロモータの長さを縮小しなければならず、それに対応して、削除された配列に含まれる重要な発現調節エレメントも失われ、目的遺伝子の発現強度と特異性もその分低下する。どのようにプロモータのサイズを最大限に縮小しながら、プロモータの目的遺伝子を開始する強度と特異性を維持するかは、ｒＡＡＶをベクターとして大きな遺伝子を送達する際に解決すべき重要な課題である。
従来技術の上記の欠陥又は改良に対する要件に対して、本発明は、肝臓特異的プロモータ及びその使用を提供し、小さく強力なプロモータを構築し、大きな外因性遺伝子（例えばＦＶＩＩＩ凝固因子遺伝子）の発現の駆動に用いることで、従来の遺伝子治療に使用されるｒＡＡＶベクターに存在する担持量が限られるという技術的課題を解決することを目的とする。
上記の目的を達成させるために、本発明の一態様によれば、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列を有する第１ポリヌクレオチドと、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレオチドと、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるヌクレオチド配列を有する第３ポリヌクレオチドとを含み、
（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）が隣接してこの順で、５’－３’に連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での転写を促進することができる、核酸分子を提供する。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列を有する第１ポリヌクレオチドと、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレオチドと、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるヌクレオチド配列を有する第３ポリヌクレオチドとを含み、
（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）が隣接してこの順で、５’－３’に連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での転写を促進することができる、核酸分子を提供する。
本発明の別の態様によれば、肝臓特異的プロモータとしての前記核酸分子の使用（ヒトでの使用を除く）を提供する。
好ましくは、前記肝臓特異的プロモータは、ＦＶＩＩＩ凝固因子遺伝子の肝臓での発現を促進することに用いられる。
本発明の別の態様によれば、前記核酸分子を含むことを特徴とする発現ベクターを提供する。
好ましくは、前記発現ベクターはプラスミド又はウイルスベクターである。
好ましくは、前記発現ベクターはｒＡＡＶである。
本発明の別の態様によれば、前記発現ベクターを含む哺乳類宿主細胞を提供する。
本発明の別の態様によれば、ゲノムが前記核酸分子又は前記発現ベクターを含むヒトを除いた哺乳類を提供する。
要するに、本発明に係る以上の技術的解決手段によれば、従来技術に比べて、以下の有益な効果が得られる。
本発明は、小さくて強力なプロモータを構築し、血友病ＡのｒＡＡＶ遺伝子治療に用いることを目的とする。本発明は、肝臓系での遺伝子の特異的な高発現を調節する小さなサイズの組換え核酸配列を提供する。前記組換え調節配列断片は、今まで報告した類似のサイズの他の配列に比べて、レポーター遺伝子及びヒト凝固因子ＦＶＩＩＩの肝臓系での発現を駆動する能力が明らかに向上し、組換えアデノウイルス関連ウイルス（ｒＡＡＶ）が媒介する遺伝子治療に適している。
本発明の目的、技術的解決手段及び利点をより明確にするために、以下、図面及び実施例を参照して、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、ここで説明する具体的な実施例は本発明を解釈するために過ぎず、本発明を限定するものではない。さらに、以下で説明する本発明の各実施形態に係る技術的特徴は、矛盾しない限り、互いに組み合わせられてもよい。
本発明は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列とは少なくとも８０％核酸配列同一性を有する第１ポリヌクレオチド、又は該第１ポリヌクレオチドの機能断片と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列とは少なくとも８０％核酸配列同一性を有する第２ポリヌクレオチド、又は該第２ポリヌクレオチドの機能断片 とを含み、
（ｂ）と（ａ）は５’－３’で連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での効率的な転写を促進することができる、核酸分子を提供する。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列とは少なくとも８０％核酸配列同一性を有する第１ポリヌクレオチド、又は該第１ポリヌクレオチドの機能断片と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列とは少なくとも８０％核酸配列同一性を有する第２ポリヌクレオチド、又は該第２ポリヌクレオチドの機能断片 とを含み、
（ｂ）と（ａ）は５’－３’で連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での効率的な転写を促進することができる、核酸分子を提供する。
いくつかの実施例では、前記核酸分子は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列を有する第１ポリヌクレオチド と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレオチドとを含み、
（ｂ）と（ａ）は５’－３’で連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での効率的な転写を促進することができる。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列を有する第１ポリヌクレオチド と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレオチドとを含み、
（ｂ）と（ａ）は５’－３’で連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での効率的な転写を促進することができる。
いくつかの実施例では、前記核酸分子は、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるヌクレオチド配列とは少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する第３ポリヌクレオチド、又は該第３ポリヌクレオチドの機能断片をさらに含み、
（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）は５’－３’で連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での効率的な転写を促進することができる。
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるヌクレオチド配列とは少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する第３ポリヌクレオチド、又は該第３ポリヌクレオチドの機能断片をさらに含み、
（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）は５’－３’で連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での効率的な転写を促進することができる。
別のいくつかの実施例では、前記核酸分子は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列を有する第１ポリヌクレオチドと、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレオチドと、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるヌクレオチド配列を有する第３ポリヌクレオチド とを含み、
（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）は５’－３’で連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での効率的な転写を促進することができる。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列を有する第１ポリヌクレオチドと、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレオチドと、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるヌクレオチド配列を有する第３ポリヌクレオチド とを含み、
（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）は５’－３’で連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での効率的な転写を促進することができる。
本発明はまた、肝臓特異的プロモータとしての前記核酸分子の使用を提供する。
いくつかの実施例では、前記プロモータは、ＦＶＩＩＩ凝固因子遺伝子の肝臓での発現を開始することに用いられるが、これに限定されるものではない。
本発明はまた、異種ポリヌクレオチドに操作可能に連結される本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
好ましい実施例では、発現ベクターはプラスミド又はウイルスベクターである。哺乳類発現ベクターの例には、アデノウイルスベクター、ｐＳＶ及びｐＣＭＶシリーズのプラスミドベクター、牛痘ベクターや逆転写ウイルスベクター、及びバキュロウイルスが含まれる。いくつかの実施形態では、発現ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターｒＡＡＶである。
発現ベクターは、コピー開始点、選択的マーカー及びマルチクローンサイトのエレメントのうちの１つ又は複数を含んでもよい。
本発明はまた、本発明の発現ベクターを含む哺乳類宿主細胞を提供する。発現ベクターは任意の適切な方法によって宿主細胞にトランスフェクションされてもよい。好ましくは、宿主細胞は哺乳類細胞（例えばヒト人細胞）、例えば上記したものであってもよい。これらの宿主細胞は分離細胞であってもよい。
核酸分子は、哺乳類細胞において操作可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することができる。好ましい哺乳類細胞は、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、猿細胞及びヒト細胞を含む。これらの細胞の例には、ＨＥＫ細胞及び誘導体（例えばＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ａ）、ＰｅｒＣ６細胞、９１１細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞及びＶＥＲＯ細胞；癌細胞例えばＨｅｐＧ２、Ａ５４９及びＭＣＦ７；ヒト又は動物から生検により分離した初代細胞；及び幹細胞（多能性細胞、例えば胚性幹細胞や人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞；及び多能性幹細胞、例えば造血幹細胞、間葉系幹細胞などを含む）が含まれる。
本発明はまた、ゲノムが本発明の核酸分子又は本発明の発現ベクターを含む哺乳類を提供する。好ましくは、本発明の核酸分子又は本発明の発現ベクターは、哺乳類のゲノムに挿入され、これにより、本発明の前記核酸分子が本発明の前記発現ベクターに操作可能に連結された又は操作可能に挿入させた異種ポリヌクレオチドは哺乳類の１つ又は複数の細胞で発現させる。好ましくは、哺乳類はマウス又はラットである。いくつかの実施形態では、哺乳類は非ヒト哺乳類である。
当業者が簡単に理解できるように、本発明で提供されるプロモータは、ＦＶＩＩＩ凝固因子遺伝子の肝臓での発現の開始だけでなく、非コードＲＮＡの発現、例えばｓｉＲＮＡ発現の開始にも適用できる。
以下は実施例を示す。
実施例１
組換えプロモータ断片
表１で同定された配列からなる組換えプロモータ断片を産生した。
第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、及び第３ポリヌクレオチド（存在する場合）は上記のプロモータ断片において連続して連結されている。
組換えプロモータ断片
表１で同定された配列からなる組換えプロモータ断片を産生した。
実施例２
様々なプロモータを含むｒＡＡＶ発現ベクターの構築
ヒトアンチトリプシンα１（ｈＡＡＴ：Ｈｕｍａｎ α１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子によりコードされて合成されるセリンプロテアーゼ阻害剤であり、主に肝臓により合成されて血液に分泌され、ｈＡＡＴプロモータは肝臓特異的プロモータとして、強力な開始能力を有し、その発現調節エレメントが１．３Ｋｂ（－１２００ｂｐ～＋４６ｂｐ）の範囲内であり（Perlino et al, 1987; Rong-Fong Shen et al.,1989;）、ＡＡＶベクターへの使用が大きなサイズにより制限されている。文献に記載の研究から明らかなように、ｈＡＡＴコアプロモータ領域が転写開始部位（ＴＳＳ）－１４２／＋４４ｂｐ領域にあり、この間にＨＮＦ１、ＨＮＦ４、ＣＥＢＰなどの転写因子結合部位が分布している。転写開始部位（ＴＳＳ）上流－２６１／－１８１ｂｐの遠隔エンハンサー領域（ＤＲＩ：Ｄｉｓｔａｌ ｒｅｇｉｎ）にも転写因子ＣＥＢＰ及びＨＮＦ３の結合部位が存在し、ｈＡＡＴの肝臓組織での高レベルの発現が調節される。
本発明はｈＡＡＴ プロモータ－１４２／＋４４ｂｐ領域（１８６ｂｐ， ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＧ＿００８２９０．１： ６９４８ｎｔ－７１３３ｎｔ）をｍｉｎｉ－ｈＡＡＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｈＡＡＴプロモータ－２６１／＋４４ｂｐ領域（３０５ｂｐ， ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＧ＿００８２９０．１： ６８２９ｎｔ－７１３３ｎｔ）をｈＡＡＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｈＡＡＴプロモータ－１４２／－６２ｂｐ領域（８１ｂｐ、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＧ＿００８２９０．１： ６９４８ｎｔ－７０２９ｎｔ， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３）をｔｒｕｎｃａｔｅｄ－ｈＡＡＴ ｈＡＡＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｈＡＡＴプロモータ－２６１／－２０８ｂｐ領域（５４ｂｐ， ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＧ＿００８２９０．１： ６８２９ｎｔ－６８８２ｎｔ， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）をｈＡＡＴ ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｈＡＡＴｅと命名する。
トランスサイレチン（ＴＴＲ：Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）は、甲状腺ホルモントランスポータであり、主に肝臓組織で合成されて血液に分泌されたり、脈絡叢上皮細胞で合成されて脳脊髄液に分泌されたりする。マウスＴＴＲの発現は、２００／＋１の近位調節領域（プロモータ領域）と－１．８６／－１．９６ ｋｂｐの遠位調節領域（エンハンサー領域）との２つの肝臓特異的領域により調節される。ＴＴＲプロモータは、小さなサイズ及び強力な開始効果により肝臓特異的プロモータとして遺伝子治療にも利用されている。マウスＴＴＲのエンハンサー及びプロモータ領域にはＡＰ１、ＣＥＢＰ、ＨＮＦ４、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３などの複数の転写因子結合部位が分布しており、ＴＴＲタンパク質の効率的な特異的発現が調節される。
本発明では、ｈＡＡＴプロモータとマウスＴＴＲプロモータとの重要な調節領域をキメラ化することにより、複数のキメラプロモータが得られ、これらのうち、後続の試験によりスクーリングした開始効果が高い５本のプロモータはそれぞれＡＴｈ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＡＴｈ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＡＴｈ３ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＡＴｈ４ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、及びＡＴｈ５ ｐｒｏｍｏｔｅｒと命名される。
それぞれのプロモータの開始強度を比較するために、本発明では、図１に示すように、上記のキメラプロモータを報告した上記の強力な肝臓特異的プロモータとともにＡＡＶベクターＰＦＤ－ｒＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍＣＨＥＲＲＹ－ｂＧＨｐＡに構築する。ｍＣＨＥＲＲＹ蛍光タンパク質の発現に対する開始を通じて、各プロモータの開始レベルを比較する。図１には、ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）は、長さ１４５ｂｐの逆方向末端反復配列であり、ＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｐｒｏｍｏｔｅｒは、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモータであり、ｍＣＨＥＲＲＹは、赤色のルシフェラーゼ遺伝子リーディングフレームであり、ＢＧＨ ｐｏｌｙＡは、牛成長ホルモンのポリアデニル化シグナルであり、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子リーディングフレームであり、ＧｍＲはハイグロマイシン耐性遺伝子リーディングフレームであり、Ｔｎ７Ｆ／ＲはＴｎ７トランスポゾンであり、ｏｒｉはコピー開始部位であり、ＸｈｏＩ、ＡｇｅＩ、ＳａｃＩは、制限エンドヌクレアーゼ部位である。具体的な構築手段は以下のとおりである。
１）ＰＦＤ－ｒＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍＣＨＥＲＲＹ－ｂＧＨｐＡについて制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＡｇｅＩを用いて二重消化を行うことで、線形化処理を行う。
２）プライマーを設計し、合成テンプレートで所望のプロモータ断片を増幅し、プライマーを設計する際に、線形化後のベクターと組換えを行うために制限エンドヌクレアーゼ部位及び１８ｂｐ程度の相同組換えアームを保留する。
３）所望の組換え断片の数に応じてＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅ社、Ｃ１１２）及びＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＭｕｌｔｉＳ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅ社、Ｃ１１３）を利用して、目的断片及びベクター骨格について相同組換えを行う。
４）相同組換え産物をＳＴＢＬ３コンピテントに形質転換し、ＬＢ平板に塗布して３７℃で一晩培養し、単一クローンを選択して同定を行い、同定の結果の正しいクローンを振とうしてプラスミドを抽出する。
具体的な配列の情報は以下のとおりである。
hAAT promoter(-261/+44bp): (NCBI Reference Sequence: NG_008290.1: 6829nt-7133nt)
mini-hAAT promoter(-142/+44bp):(NCBI Reference Sequence: NG_008290.1: 6948nt-7133nt)
mTTR promoter (NCBI Reference Sequence: NC_000084.6, 1961nt- 2164nt,-203/+1bp), SEQ ID NO. 1
mini-mTTR promoter (NCBI Reference Sequence: NC_000084.6, 2014nt- 2164nt,-150/+1bp),SEQ ID NO. 2
truncated-hAAT hAAT promoter(-142/-62bp):(NCBI Reference Sequence: NG_008290.1: 6948nt-7029nt), SEQ ID NO. 3
AAT enhancer(NCBI Reference Sequence: NG_008290.1: 6829nt-6882nt), SEQ ID NO. 4
mTTR enhancer (NCBI Reference Sequence: NC_000084.6, 286nt-405nt, -1878/-1758bp), SEQ ID NO. 5
ATh1 Promoter, SEQ ID NO. 6
ATh2 Promoter, SEQ ID NO. 7
ATh3 Promoter、SEQ ID NO. 8
ATh4 Promoter、SEQ ID NO. 9
ATh5 Promoter、SEQ ID NO. 10
Biomarin-HLP promoter, BIOMARIN社のBMN270フロシェクトにおけるフロモータ、ClinicalTrials.gov number, NCT02576795
SPARK-TTRm (NCBI Reference Sequence: NC_000084.6, 1961nt- 2183nt,-203bp/+20bp),ここで-136bp/-133bp TGTGはGACTApoE enhancerに突然変異(GenBank: U32510.1, 78nt-231nt)
HS-CRM8 enhancer(NCBI Reference Sequence: NM_000295.4, 163 nt- 93nt)
MVM intron(GenBank: NC_001510.1, 2312nt-2403nt)
様々なプロモータを含むｒＡＡＶ発現ベクターの構築
ヒトアンチトリプシンα１（ｈＡＡＴ：Ｈｕｍａｎ α１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子によりコードされて合成されるセリンプロテアーゼ阻害剤であり、主に肝臓により合成されて血液に分泌され、ｈＡＡＴプロモータは肝臓特異的プロモータとして、強力な開始能力を有し、その発現調節エレメントが１．３Ｋｂ（－１２００ｂｐ～＋４６ｂｐ）の範囲内であり（Perlino et al, 1987; Rong-Fong Shen et al.,1989;）、ＡＡＶベクターへの使用が大きなサイズにより制限されている。文献に記載の研究から明らかなように、ｈＡＡＴコアプロモータ領域が転写開始部位（ＴＳＳ）－１４２／＋４４ｂｐ領域にあり、この間にＨＮＦ１、ＨＮＦ４、ＣＥＢＰなどの転写因子結合部位が分布している。転写開始部位（ＴＳＳ）上流－２６１／－１８１ｂｐの遠隔エンハンサー領域（ＤＲＩ：Ｄｉｓｔａｌ ｒｅｇｉｎ）にも転写因子ＣＥＢＰ及びＨＮＦ３の結合部位が存在し、ｈＡＡＴの肝臓組織での高レベルの発現が調節される。
本発明はｈＡＡＴ プロモータ－１４２／＋４４ｂｐ領域（１８６ｂｐ， ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＧ＿００８２９０．１： ６９４８ｎｔ－７１３３ｎｔ）をｍｉｎｉ－ｈＡＡＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｈＡＡＴプロモータ－２６１／＋４４ｂｐ領域（３０５ｂｐ， ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＧ＿００８２９０．１： ６８２９ｎｔ－７１３３ｎｔ）をｈＡＡＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｈＡＡＴプロモータ－１４２／－６２ｂｐ領域（８１ｂｐ、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＧ＿００８２９０．１： ６９４８ｎｔ－７０２９ｎｔ， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３）をｔｒｕｎｃａｔｅｄ－ｈＡＡＴ ｈＡＡＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｈＡＡＴプロモータ－２６１／－２０８ｂｐ領域（５４ｂｐ， ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＧ＿００８２９０．１： ６８２９ｎｔ－６８８２ｎｔ， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）をｈＡＡＴ ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｈＡＡＴｅと命名する。
トランスサイレチン（ＴＴＲ：Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）は、甲状腺ホルモントランスポータであり、主に肝臓組織で合成されて血液に分泌されたり、脈絡叢上皮細胞で合成されて脳脊髄液に分泌されたりする。マウスＴＴＲの発現は、２００／＋１の近位調節領域（プロモータ領域）と－１．８６／－１．９６ ｋｂｐの遠位調節領域（エンハンサー領域）との２つの肝臓特異的領域により調節される。ＴＴＲプロモータは、小さなサイズ及び強力な開始効果により肝臓特異的プロモータとして遺伝子治療にも利用されている。マウスＴＴＲのエンハンサー及びプロモータ領域にはＡＰ１、ＣＥＢＰ、ＨＮＦ４、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３などの複数の転写因子結合部位が分布しており、ＴＴＲタンパク質の効率的な特異的発現が調節される。
本発明では、ｈＡＡＴプロモータとマウスＴＴＲプロモータとの重要な調節領域をキメラ化することにより、複数のキメラプロモータが得られ、これらのうち、後続の試験によりスクーリングした開始効果が高い５本のプロモータはそれぞれＡＴｈ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＡＴｈ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＡＴｈ３ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＡＴｈ４ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、及びＡＴｈ５ ｐｒｏｍｏｔｅｒと命名される。
それぞれのプロモータの開始強度を比較するために、本発明では、図１に示すように、上記のキメラプロモータを報告した上記の強力な肝臓特異的プロモータとともにＡＡＶベクターＰＦＤ－ｒＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍＣＨＥＲＲＹ－ｂＧＨｐＡに構築する。ｍＣＨＥＲＲＹ蛍光タンパク質の発現に対する開始を通じて、各プロモータの開始レベルを比較する。図１には、ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）は、長さ１４５ｂｐの逆方向末端反復配列であり、ＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｐｒｏｍｏｔｅｒは、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモータであり、ｍＣＨＥＲＲＹは、赤色のルシフェラーゼ遺伝子リーディングフレームであり、ＢＧＨ ｐｏｌｙＡは、牛成長ホルモンのポリアデニル化シグナルであり、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子リーディングフレームであり、ＧｍＲはハイグロマイシン耐性遺伝子リーディングフレームであり、Ｔｎ７Ｆ／ＲはＴｎ７トランスポゾンであり、ｏｒｉはコピー開始部位であり、ＸｈｏＩ、ＡｇｅＩ、ＳａｃＩは、制限エンドヌクレアーゼ部位である。具体的な構築手段は以下のとおりである。
１）ＰＦＤ－ｒＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍＣＨＥＲＲＹ－ｂＧＨｐＡについて制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＡｇｅＩを用いて二重消化を行うことで、線形化処理を行う。
２）プライマーを設計し、合成テンプレートで所望のプロモータ断片を増幅し、プライマーを設計する際に、線形化後のベクターと組換えを行うために制限エンドヌクレアーゼ部位及び１８ｂｐ程度の相同組換えアームを保留する。
３）所望の組換え断片の数に応じてＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅ社、Ｃ１１２）及びＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＭｕｌｔｉＳ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅ社、Ｃ１１３）を利用して、目的断片及びベクター骨格について相同組換えを行う。
４）相同組換え産物をＳＴＢＬ３コンピテントに形質転換し、ＬＢ平板に塗布して３７℃で一晩培養し、単一クローンを選択して同定を行い、同定の結果の正しいクローンを振とうしてプラスミドを抽出する。
具体的な配列の情報は以下のとおりである。
hAAT promoter(-261/+44bp): (NCBI Reference Sequence: NG_008290.1: 6829nt-7133nt)
mini-hAAT promoter(-142/+44bp):(NCBI Reference Sequence: NG_008290.1: 6948nt-7133nt)
mTTR promoter (NCBI Reference Sequence: NC_000084.6, 1961nt- 2164nt,-203/+1bp), SEQ ID NO. 1
mini-mTTR promoter (NCBI Reference Sequence: NC_000084.6, 2014nt- 2164nt,-150/+1bp),SEQ ID NO. 2
truncated-hAAT hAAT promoter(-142/-62bp):(NCBI Reference Sequence: NG_008290.1: 6948nt-7029nt), SEQ ID NO. 3
AAT enhancer(NCBI Reference Sequence: NG_008290.1: 6829nt-6882nt), SEQ ID NO. 4
mTTR enhancer (NCBI Reference Sequence: NC_000084.6, 286nt-405nt, -1878/-1758bp), SEQ ID NO. 5
ATh1 Promoter, SEQ ID NO. 6
ATh2 Promoter, SEQ ID NO. 7
ATh3 Promoter、SEQ ID NO. 8
ATh4 Promoter、SEQ ID NO. 9
ATh5 Promoter、SEQ ID NO. 10
Biomarin-HLP promoter, BIOMARIN社のBMN270フロシェクトにおけるフロモータ、ClinicalTrials.gov number, NCT02576795
SPARK-TTRm (NCBI Reference Sequence: NC_000084.6, 1961nt- 2183nt,-203bp/+20bp),ここで-136bp/-133bp TGTGはGACTApoE enhancerに突然変異(GenBank: U32510.1, 78nt-231nt)
HS-CRM8 enhancer(NCBI Reference Sequence: NM_000295.4, 163 nt- 93nt)
MVM intron(GenBank: NC_001510.1, 2312nt-2403nt)
実施例３
様々なプロモータによるｍＣＨＥＲＲＹ蛍光遺伝子の開始効果の比較
実施例２で構築したプロモータ、蛍光タンパク質ｍＣＨＥＲＲＹ、及びｂＧＨｐｏｌｙＡ ＡＡＶ発現ベクターを、２９３ ３プラスミドシステムによって上記のプラスミドをＡＡＶ２／８血清型ウイルスとしてパッケージングし、ウイルスをＰＥＧ８０００で沈殿させた後、イオジキサノールを用いて密度勾配超遠心分離によりＡＡＶウイルスを精製した。ウイルスの力価についてＲＴ－ＰＣＲ及び銀染色により定量化した。
様々なＡＡＶウイルスを同用量３Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで尾静脈注射によりＣ５７マウスの体内に注射し（ｎ＝３）、ウイルスを注射してから５週間後、生理食塩水及び４％パラホルムアルデヒドを用いて心臓灌流を行い、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、脳などを摘出して４％パラホルムアルデヒドで一晩浸漬した後、３０％スクロース溶液にて７２時間浸漬した。肝臓組織を低温で凍結して切片し、蛍光顕微鏡下で蛍光を観察した。
本発明で組換えを行われたプロモータＡＴｈ１ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６ ）及びＡＴｈ２ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ７）を、ｍｉｎｉ－ｈＡＡＴプロモータ、ｍＴＴＲプロモータ（ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １，マウスＴＴＲプロモータ領域）、ＴＢＧプロモータ（ＴＢＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ｈＡＡＴプロモータ、ＴＴＲｍプロモータ（ＳＰＡＲＫ社のｓｐａｒｋ－８０１１プロジェクトにおいて突然変異したＴＴＲプロモータ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｎｕｍｂｅｒ， ＮＣＴ０３００３５３３）、ＨＬＰプロモータ（ＢＩＯＭＡＲＩＮ社のＢＭＮ２７０プロジェクトにおけるプロモータ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｎｕｍｂｅｒ， ＮＣＴ０２５７６７９５）、ＴＴＲｅ／ＴＴＲｐ プロモータ（マウスＴＴＲエンハンサー領域及びプロモータ領域）、ＴＴＲｅ／ＴＴＲｐ／ＭＶＭ（マウスＴＴＲエンハンサー領域及びプロモータ領域の後にＭＶＭイントロンを追加）、及びＣＲＭ８／／ＴＴＲｐ／ＭＶＭ（マウスＴＴＲプロモータ領域の後にＭＶＭイントロンを追加し、プロモータ領域の前にＣＲＭ８強化配列を追加したもの、ｓａｎｇｏｍａ社のＳＢ５２５プロジェクトにおけるプロモータ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｎｕｍｂｅｒ， ＮＣＴ０３０６１２０１）と、ｍＣＨＥＲＲＹ蛍光の比較を行い、肝臓組織でのこれらの開始レベルを比較し、結果を図３及び図４に示す。
図３はさまざまなプロモータのマウスの肝臓組織でのｍＣＨＥＲＲＹ蛍光開始効果の比較である。様々な開始させたＡＡＶウイルスを同用量３Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで尾静脈注射によりＣ５７マウスに注射し（ｎ＝３）、ウイルスを注射してから５週間後、肝臓組織でのｍＣＨＥＲＲＹ蛍光強度を比較する。曝光時間は１０ｍｓ 左２０ 右５００とする。
図４は様々なプロモータによるマウスの肝臓組織での開始の場合のｍＣＨＥＲＲＹ蛍光効果の比較である。さまざまなプロモータのＡＡＶウイルスを同用量３Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで尾静脈注射によりＣ５７マウスに注射し（ｎ＝３）、ウイルスを注射してから５週間後、肝臓組織でのｍＣＨＥＲＲＹ蛍光強度を比較した。曝光時間は１０ｍｓ 左２０ 右４０００とした。
図５はさまざまなプロモータによるマウスの肝臓組織での開始の場合のｍＣＨＥＲＲＹ蛍光効果のグレースケール走査図である。ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いて図４におけるさまざまなプロモータのマウスの肝臓組織で発現させたｍＣＨＥＲＲＹの蛍光についてグレースケール走査を行い、走査によるグレースケール値はＨＬＰプロモータの相対強度に対応したものである。
本発明では、ｍＣＨＥＲＲＹ蛍光を比較した結果、肝臓組織では、組換えを行ったプロモータＡＴｈ１ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １ ）及びＡＴｈ２ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２）は、開始レベルが組換え前のｍｉｎｉ－ｈＡＡＴプロモータ及びｍＴＴＲプロモータよりもはるかに優れており、また、ＴＢＧプロモータ、ｈＡＡＴプロモータ、ＴＴＲｍプロモータ、ＨＬＰプロモータ、ＴＴＲｅ／ＴＴＲｐ プロモータ、ＴＴＲｅ／ＴＴＲｐ／ＭＶＭ、及びＣＲＭ８／／ＴＴＲｐ／ＭＶＭよりも優れていた。
様々なプロモータによるｍＣＨＥＲＲＹ蛍光遺伝子の開始効果の比較
実施例２で構築したプロモータ、蛍光タンパク質ｍＣＨＥＲＲＹ、及びｂＧＨｐｏｌｙＡ ＡＡＶ発現ベクターを、２９３ ３プラスミドシステムによって上記のプラスミドをＡＡＶ２／８血清型ウイルスとしてパッケージングし、ウイルスをＰＥＧ８０００で沈殿させた後、イオジキサノールを用いて密度勾配超遠心分離によりＡＡＶウイルスを精製した。ウイルスの力価についてＲＴ－ＰＣＲ及び銀染色により定量化した。
様々なＡＡＶウイルスを同用量３Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで尾静脈注射によりＣ５７マウスの体内に注射し（ｎ＝３）、ウイルスを注射してから５週間後、生理食塩水及び４％パラホルムアルデヒドを用いて心臓灌流を行い、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、脳などを摘出して４％パラホルムアルデヒドで一晩浸漬した後、３０％スクロース溶液にて７２時間浸漬した。肝臓組織を低温で凍結して切片し、蛍光顕微鏡下で蛍光を観察した。
本発明で組換えを行われたプロモータＡＴｈ１ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６ ）及びＡＴｈ２ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ７）を、ｍｉｎｉ－ｈＡＡＴプロモータ、ｍＴＴＲプロモータ（ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １，マウスＴＴＲプロモータ領域）、ＴＢＧプロモータ（ＴＢＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ｈＡＡＴプロモータ、ＴＴＲｍプロモータ（ＳＰＡＲＫ社のｓｐａｒｋ－８０１１プロジェクトにおいて突然変異したＴＴＲプロモータ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｎｕｍｂｅｒ， ＮＣＴ０３００３５３３）、ＨＬＰプロモータ（ＢＩＯＭＡＲＩＮ社のＢＭＮ２７０プロジェクトにおけるプロモータ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｎｕｍｂｅｒ， ＮＣＴ０２５７６７９５）、ＴＴＲｅ／ＴＴＲｐ プロモータ（マウスＴＴＲエンハンサー領域及びプロモータ領域）、ＴＴＲｅ／ＴＴＲｐ／ＭＶＭ（マウスＴＴＲエンハンサー領域及びプロモータ領域の後にＭＶＭイントロンを追加）、及びＣＲＭ８／／ＴＴＲｐ／ＭＶＭ（マウスＴＴＲプロモータ領域の後にＭＶＭイントロンを追加し、プロモータ領域の前にＣＲＭ８強化配列を追加したもの、ｓａｎｇｏｍａ社のＳＢ５２５プロジェクトにおけるプロモータ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｎｕｍｂｅｒ， ＮＣＴ０３０６１２０１）と、ｍＣＨＥＲＲＹ蛍光の比較を行い、肝臓組織でのこれらの開始レベルを比較し、結果を図３及び図４に示す。
図３はさまざまなプロモータのマウスの肝臓組織でのｍＣＨＥＲＲＹ蛍光開始効果の比較である。様々な開始させたＡＡＶウイルスを同用量３Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで尾静脈注射によりＣ５７マウスに注射し（ｎ＝３）、ウイルスを注射してから５週間後、肝臓組織でのｍＣＨＥＲＲＹ蛍光強度を比較する。曝光時間は１０ｍｓ 左２０ 右５００とする。
図４は様々なプロモータによるマウスの肝臓組織での開始の場合のｍＣＨＥＲＲＹ蛍光効果の比較である。さまざまなプロモータのＡＡＶウイルスを同用量３Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで尾静脈注射によりＣ５７マウスに注射し（ｎ＝３）、ウイルスを注射してから５週間後、肝臓組織でのｍＣＨＥＲＲＹ蛍光強度を比較した。曝光時間は１０ｍｓ 左２０ 右４０００とした。
図５はさまざまなプロモータによるマウスの肝臓組織での開始の場合のｍＣＨＥＲＲＹ蛍光効果のグレースケール走査図である。ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いて図４におけるさまざまなプロモータのマウスの肝臓組織で発現させたｍＣＨＥＲＲＹの蛍光についてグレースケール走査を行い、走査によるグレースケール値はＨＬＰプロモータの相対強度に対応したものである。
本発明では、ｍＣＨＥＲＲＹ蛍光を比較した結果、肝臓組織では、組換えを行ったプロモータＡＴｈ１ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １ ）及びＡＴｈ２ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２）は、開始レベルが組換え前のｍｉｎｉ－ｈＡＡＴプロモータ及びｍＴＴＲプロモータよりもはるかに優れており、また、ＴＢＧプロモータ、ｈＡＡＴプロモータ、ＴＴＲｍプロモータ、ＨＬＰプロモータ、ＴＴＲｅ／ＴＴＲｐ プロモータ、ＴＴＲｅ／ＴＴＲｐ／ＭＶＭ、及びＣＲＭ８／／ＴＴＲｐ／ＭＶＭよりも優れていた。
実施例４
さまざまなプロモータによるBDD-FVIII開始の場合のベクターの構築
ＡＴｈ１、ＡＴｈ２プロモータに備える強力な肝臓特異的開始レベルが下流に連結される遺伝子による影響を受けるか否か、及びＡＴｈ１、ＡＴｈ２の前に発現調節強化エレメント（ＡＴｈ３、ＡＴｈ４）を追加することにより目的遺伝子の発現をさらに強化できるか否かについてさらに検討し、また、ＡＴｈ１－４が大きな外因性遺伝子の発現を開始する場合に、ＡＡＶが正常にパッケージングできるか否かを検討するために、本実施例では、上記の実施例２における分子クローニング方法によって、さまざまなプロモータ、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ（Ｂ ｄｏｍａｉｎ ｄｅｌｅｔｅｄ ＦＶＩＩＩ）及びｓＰｏｌｙＡ発現フレームを、ＡＡＶベクターＰＦＤ－ｒＡＡＶ－ＨＬＰ－ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ－ｓｐｏｌｙＡ（図２）に構築し、ここでは、ＰＦＤ－ｒＡＡＶ－ＨＬＰ－ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ－ｓｐｏｌｙＡベクターについて制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＡｓｃＩを用いて二重消化を行うことで、線形化処理を行った。
図２はＰＦＤ－ｒＡＡＶ－ＨＬＰ－ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩｏｐｔ（ＷＪ）－ｓｐｏｌｙＡベクターの構造概略図である。ここで、ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）は長さ１４５ｂｐの逆方向末端反復配列であり、ＨＬＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒは、Ｂｉｏｍａｒｉｎ社により血友病Ａ治療プロジェクトＢＭＮ２７０に使用されるプロモータ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）であり、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩｏｐｔ（ＷＪ）は、コドンが最適化されたＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）であり、ｐｏｌｙＡはポリアデニルテーリングシグナルであり、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子リーディングフレームであり、ＧｍＲはハイグロマイシン耐性遺伝子リーディングフレームであり、Ｔｎ７Ｆ／ＲはＴｎ７トランスポゾンであり、ｏｒｉはコピー開始部位であり、ＸｈｏＩ、ＡｓｃＩは制限エンドヌクレアーゼ部位である。
図６はさまざまなＡＡＶウイルスＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲル銀染色図である。さまざまなプロモータ及びＦＶＩＩＩ遺伝子発現フレームを担持したＡＡＶウイルスについてポリアクリルアミドゲル電気泳動をした後銀染色を行い、ウイルスの純度及び力価の判断に供した。図７はＲＴ－ＰＣＲ方法による各ＡＡＶウイルスの力価の測定である。ＩＴＲの上流プライマーを用いてさまざまなプロモータでＦＶＩＩＩを発現させたＡＡＶウイルスについて絶対定量ＰＣＲを行い、ウイルスの力価を測定した。銀染色の結果及びＲＴ－ＰＣＲ定量の結果から見ると、上記のベクターは全て正常にパッケージングできる。
さまざまなプロモータによるBDD-FVIII開始の場合のベクターの構築
ＡＴｈ１、ＡＴｈ２プロモータに備える強力な肝臓特異的開始レベルが下流に連結される遺伝子による影響を受けるか否か、及びＡＴｈ１、ＡＴｈ２の前に発現調節強化エレメント（ＡＴｈ３、ＡＴｈ４）を追加することにより目的遺伝子の発現をさらに強化できるか否かについてさらに検討し、また、ＡＴｈ１－４が大きな外因性遺伝子の発現を開始する場合に、ＡＡＶが正常にパッケージングできるか否かを検討するために、本実施例では、上記の実施例２における分子クローニング方法によって、さまざまなプロモータ、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ（Ｂ ｄｏｍａｉｎ ｄｅｌｅｔｅｄ ＦＶＩＩＩ）及びｓＰｏｌｙＡ発現フレームを、ＡＡＶベクターＰＦＤ－ｒＡＡＶ－ＨＬＰ－ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ－ｓｐｏｌｙＡ（図２）に構築し、ここでは、ＰＦＤ－ｒＡＡＶ－ＨＬＰ－ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ－ｓｐｏｌｙＡベクターについて制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＡｓｃＩを用いて二重消化を行うことで、線形化処理を行った。
図２はＰＦＤ－ｒＡＡＶ－ＨＬＰ－ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩｏｐｔ（ＷＪ）－ｓｐｏｌｙＡベクターの構造概略図である。ここで、ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）は長さ１４５ｂｐの逆方向末端反復配列であり、ＨＬＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒは、Ｂｉｏｍａｒｉｎ社により血友病Ａ治療プロジェクトＢＭＮ２７０に使用されるプロモータ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）であり、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩｏｐｔ（ＷＪ）は、コドンが最適化されたＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）であり、ｐｏｌｙＡはポリアデニルテーリングシグナルであり、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子リーディングフレームであり、ＧｍＲはハイグロマイシン耐性遺伝子リーディングフレームであり、Ｔｎ７Ｆ／ＲはＴｎ７トランスポゾンであり、ｏｒｉはコピー開始部位であり、ＸｈｏＩ、ＡｓｃＩは制限エンドヌクレアーゼ部位である。
図６はさまざまなＡＡＶウイルスＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲル銀染色図である。さまざまなプロモータ及びＦＶＩＩＩ遺伝子発現フレームを担持したＡＡＶウイルスについてポリアクリルアミドゲル電気泳動をした後銀染色を行い、ウイルスの純度及び力価の判断に供した。図７はＲＴ－ＰＣＲ方法による各ＡＡＶウイルスの力価の測定である。ＩＴＲの上流プライマーを用いてさまざまなプロモータでＦＶＩＩＩを発現させたＡＡＶウイルスについて絶対定量ＰＣＲを行い、ウイルスの力価を測定した。銀染色の結果及びＲＴ－ＰＣＲ定量の結果から見ると、上記のベクターは全て正常にパッケージングできる。
実施例５
さまざまなプロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルの比較
ｓｆ９ Ｏｎｅ－ｂａｃシステムを用いて上記の実施例４で構築したプラスミドをＡＡＶ２／８血清型ウイルスとしてパッケージングした。さまざまなＡＡＶウイルスを同用量５Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇでＣ５７マウス（ｎ＝６）の体内に尾静脈注射し、ウイルスを注射してから２、５、８、１０週間後、眼窩静脈叢から採血してＥＬＩＳＡによりＦＶＩＩＩ発現レベルを検出した。使用されるＥＬＩＳＡ抗体ペアはＦ８Ｃ－ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であり、検量線の作成には緑十字社のヒト凝固因子ＶＩＩＩが使用され、凝固因子ＶＩＩＩにはＢｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＢＣＡタンパク質濃度キット（強化型）（製品番号：Ｐ００１０Ｓ）が使用されて、濃度測定を行った。
図８はＣ５７マウスにおけるさまざまなプロモータのＦＶＩＩＩ発現効果の比較である。さまざまなプロモータのＡＡＶウイルスを同用量５Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで尾静脈注射によりＣ５７マウスに注射し（ｎ＝６）、ウイルスを注射して２週間、５週間、８週間、１０週間後、それぞれマウスの血漿を採取し、ＥＬＩＳＡによって血漿中のＦＶＩＩＩ含有量を測定した。
検出結果から見ると、全体的には、ＡＡＶ発現の適時性により、２週目から５週目まで、各プロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルは増加し、五週目には発現レベルは最高になり、それ以降の２つの時間点では、程度が異なるが、発現量は全て低下する傾向が見られた。
全体的には、各時間点では、ＡＴｈ１、ＡＴｈ２、ＡＴｈ３、ＡＴｈ４は、ＦＶＩＩＩ開始能力がＳｐａｒｋ社製のＴＴＲｍ及びＢｉｏｍａｒｉｎ社製のＨＬＰプロモータよりもはるかに優れており、２週目には、この４つのプロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルは、ＴＴＲｍの２～３倍、ＨＬＰの１０倍以上であり、５週目には、この４つのプロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルは、ＴＴＲｍの１．５～２倍、ＨＬＰの３～４倍であり、８週目には、この４つのプロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルは、ＴＴＲｍの１．３～１．９倍、ＨＬＰの１．９～２．６倍であり、１０週目には、この４つのプロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルは、ＴＴＲｍの１．２～２．１倍、ＨＬＰの１．７～３倍であり、この４つのプロモータは、ＡｐｏＥ／ＴＴＲｐ／ＭＶＭ及びＣＲＭ８／ＴＴＲｐ／ＭＶＭプロモータよりも、各時間点では、ＦＶＩＩＩ発現レベルが１～２倍向上し、向上効果がｍＴＴＲ及びＨＬＰと比較する場合のように顕著ではないが、ＡＴｈ１、ＡＴｈ２は、サイズが８３～２１１ｂｐだけ短縮され、パッケージング容量が限られるＡＡＶに例えばＦＶＩＩＩなどのような大分子が担持される場合には、重要な意義がある。ＡＴｈ３、ＡＴｈ４は、ＡＴｈ１、ＡＴｈ２と比較すると、いくつかの発現強化エレメントを追加することにより、初期では発現効果には明らかな向上が認められなかったが、１０週目では、発現レベルは１．４～１．８倍向上し、発現持続性では優位性がある。
ただし、同じ構築手段により構築された組換えプロモータＡＴｈ５は、ＦＶＩＩＩ発現効果が本発明で提案されている他の４本の組換えプロモータよりも明らかに低く、このことから、各発現調節エレメントを組み合わせることにより相乗促進作用が果たされるとは限らず、また、転写因子を互いに競合することもあり、その原因としては、一方では、小さな空間において立体障害効果が存在し、一方の転写因子の結合により他の転写因子の付近部位への進入が阻害され、他方では、異なる転写調節因子同士が、ただ前後の関係だけではなく一定の相互作用を有し、このため、追加的に結合された調節因子により元の相互作用が損なわれ得るためと考えられる。
本発明は、構築した組換えプロモータ及び比較用の他の発現調節エレメントの塩基数を表２に示す。
上記の表から分かるように、本発明で提供される組換えプロモータＡＴｈ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、及びＡＴｈ２ ｐｒｏｍｏｔｅは、ＨＬＰ及びＴＴＲｍと類似のサイズ（ＡＴｈ１， ２３２ｂｐ； ＡＴｈ２， ２８４ｂｐ； ＨＬＰ， ２５２ｂｐ； ＴＴＲｍ， ２２３ｂｐ）で、ＦＶＩＩＩ発現量を１．２～１０倍向上させる効果を果たし、ＡｐｏＥ／ＴＴＲｐ／ＭＶＭ、及びＣＲＭ８／ＴＴＲｐ／ＭＶＭプロモータに比べて、ＦＶＩＩＩ発現レベルも１～２倍向上し、一方、サイズは８３～２１１ｂｐ短縮される。ＡＴｈ３、ＡＴｈ４（ＡＴｈ３， ２８６ｂｐ； ＡＴｈ４， ３３８ｂｐ）は、ＡＴｈ１、ＡＴｈ２に比べて、長さがわずかに増加するが、ＦＶＩＩＩの効率的な発現の持続時間が延びる。
さまざまなプロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルの比較
ｓｆ９ Ｏｎｅ－ｂａｃシステムを用いて上記の実施例４で構築したプラスミドをＡＡＶ２／８血清型ウイルスとしてパッケージングした。さまざまなＡＡＶウイルスを同用量５Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇでＣ５７マウス（ｎ＝６）の体内に尾静脈注射し、ウイルスを注射してから２、５、８、１０週間後、眼窩静脈叢から採血してＥＬＩＳＡによりＦＶＩＩＩ発現レベルを検出した。使用されるＥＬＩＳＡ抗体ペアはＦ８Ｃ－ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であり、検量線の作成には緑十字社のヒト凝固因子ＶＩＩＩが使用され、凝固因子ＶＩＩＩにはＢｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＢＣＡタンパク質濃度キット（強化型）（製品番号：Ｐ００１０Ｓ）が使用されて、濃度測定を行った。
図８はＣ５７マウスにおけるさまざまなプロモータのＦＶＩＩＩ発現効果の比較である。さまざまなプロモータのＡＡＶウイルスを同用量５Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで尾静脈注射によりＣ５７マウスに注射し（ｎ＝６）、ウイルスを注射して２週間、５週間、８週間、１０週間後、それぞれマウスの血漿を採取し、ＥＬＩＳＡによって血漿中のＦＶＩＩＩ含有量を測定した。
検出結果から見ると、全体的には、ＡＡＶ発現の適時性により、２週目から５週目まで、各プロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルは増加し、五週目には発現レベルは最高になり、それ以降の２つの時間点では、程度が異なるが、発現量は全て低下する傾向が見られた。
全体的には、各時間点では、ＡＴｈ１、ＡＴｈ２、ＡＴｈ３、ＡＴｈ４は、ＦＶＩＩＩ開始能力がＳｐａｒｋ社製のＴＴＲｍ及びＢｉｏｍａｒｉｎ社製のＨＬＰプロモータよりもはるかに優れており、２週目には、この４つのプロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルは、ＴＴＲｍの２～３倍、ＨＬＰの１０倍以上であり、５週目には、この４つのプロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルは、ＴＴＲｍの１．５～２倍、ＨＬＰの３～４倍であり、８週目には、この４つのプロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルは、ＴＴＲｍの１．３～１．９倍、ＨＬＰの１．９～２．６倍であり、１０週目には、この４つのプロモータのＦＶＩＩＩ発現レベルは、ＴＴＲｍの１．２～２．１倍、ＨＬＰの１．７～３倍であり、この４つのプロモータは、ＡｐｏＥ／ＴＴＲｐ／ＭＶＭ及びＣＲＭ８／ＴＴＲｐ／ＭＶＭプロモータよりも、各時間点では、ＦＶＩＩＩ発現レベルが１～２倍向上し、向上効果がｍＴＴＲ及びＨＬＰと比較する場合のように顕著ではないが、ＡＴｈ１、ＡＴｈ２は、サイズが８３～２１１ｂｐだけ短縮され、パッケージング容量が限られるＡＡＶに例えばＦＶＩＩＩなどのような大分子が担持される場合には、重要な意義がある。ＡＴｈ３、ＡＴｈ４は、ＡＴｈ１、ＡＴｈ２と比較すると、いくつかの発現強化エレメントを追加することにより、初期では発現効果には明らかな向上が認められなかったが、１０週目では、発現レベルは１．４～１．８倍向上し、発現持続性では優位性がある。
ただし、同じ構築手段により構築された組換えプロモータＡＴｈ５は、ＦＶＩＩＩ発現効果が本発明で提案されている他の４本の組換えプロモータよりも明らかに低く、このことから、各発現調節エレメントを組み合わせることにより相乗促進作用が果たされるとは限らず、また、転写因子を互いに競合することもあり、その原因としては、一方では、小さな空間において立体障害効果が存在し、一方の転写因子の結合により他の転写因子の付近部位への進入が阻害され、他方では、異なる転写調節因子同士が、ただ前後の関係だけではなく一定の相互作用を有し、このため、追加的に結合された調節因子により元の相互作用が損なわれ得るためと考えられる。
本発明は、構築した組換えプロモータ及び比較用の他の発現調節エレメントの塩基数を表２に示す。
当業者にとって明らかなように、以上は本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するものではなく、本発明の主旨や原則を逸脱することなく行う全ての修正、同等置換や改良などは本発明の特許範囲に含まれるものとする。
Claims (7)
- （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列を有する第１ポリヌクレオチドと、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレオチドと、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるヌクレオチド配列を有する第３ポリヌクレオチドとを含み、
（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）が隣接してこの順で、５’－３’に連結され、かつ、
異種ポリヌクレオチドの哺乳類の肝臓組織での転写を促進することができる、
ことを特徴とする核酸分子。 - 肝臓特異的プロモータとして遺伝子又は核酸断片の肝臓での発現を促進する、ことを特徴とする請求項１に記載の核酸分子の使用（ヒトでの使用を除く）。
- 前記肝臓特異的プロモータはＦＶＩＩＩ凝固因子遺伝子の肝臓での発現を促進することに用いられる、ことを特徴とする請求項２に記載の使用（ヒトでの使用を除く）。
- 請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ことを特徴とする発現ベクター。
- プラスミド又はウイルスベクターである、ことを特徴とする請求項４に記載の発現ベクター。
- 請求項４又は５に記載の発現ベクターを含む、哺乳類宿主細胞。
- ゲノムが請求項１に記載の核酸分子又は請求項４又は５に記載の発現ベクターを含む、ヒトを除いた哺乳類。
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