ES2566008T3 - Antagonistas de complementos y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un oligómero antisentido de cadena sencilla de 10 a 50 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de nucleobases contigua con por lo menos 80% de identidad de secuencia con una región complementaria de un ácido nucleico que codifica la secuencia de COMPONENTE DE COMPLEMENTO 6 (C6) representada por la SEQ ID NO: 1; el oligómero comprende por lo menos un análogo de nucleótido y es capaz de reducir el nivel de expresión de mARN de C6 en un mamífero mediante por lo menos 20% según se determina por un ensayo qPCR, en donde el oligómero se dirige a los nucleótidos 112-152, 433-473, 546-586, 706-746, o 1015- 1055 del sitio de inicio de ATG de la SEQ ID NO: 1.

Description

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En una realización de los oligómeros anteriores, la secuencia de nucleobase contigua incluye no más de aproximadamente 3, tal como no más de aproximadamente 1 o aproximadamente 2 emparejamientos erróneos con respecto a la región correspondiente de un ácido nucleico que codifica el C6 de mamífero de interés, particularmente la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, la secuencia de nucleobase contigua puede incluir no más de un solo emparejamiento erróneo a la región correspondiente de un ácido nucleico que codifica el C6 de mamífero de interés. Alternativamente, la secuencia de nucleobase contigua no incluye emparejamientos erróneos, (por ejemplo, es completamente complementaria a) con la región correspondiente de un ácido nucleico que codifica el C6 de mamífero de interés. En otra realización, la secuencia de nucleobase del oligómero consiste de la secuencia nucleobase contigua.
La práctica de la invención es compatible con un amplio rango de secuencias de C6 de mamífero que incluyen aquellas secuencias de humano, rata y ratón especificadas aquí. Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de dichas proteínas están disponibles en el Centro Nacional de Información de Biotecnología Estadounidense ((NCBI) -Banco de Datos de Secuencias Genéticas (GenBank). En particular, se pueden obtener los listados de secuencias del GenBank en la Biblioteca Nacional de Medicina, 38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, Md. 20894. El GenBank también está disponible en Internet. Generalmente, véase Benson, D. A. et al. (1997) Nud. Acids. Res. 25: 1 para descripción del GenBank. Las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos no referenciados específicamente se pueden encontrar en GenBank u otras fuentes descritas aquí. Véase, por ejemplo (NM_176074) que describe una secuencia C6 de rata, (NM_016704), que describe una secuencia C6 de ratón.
Otras realizaciones de oligómeros están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, y en una realización, la secuencia de nucleobase contigua del oligómero incluye una subsecuencia contigua de por lo menos 6, por ejemplo, aproximadamente 7, 8, 9, 10, 11, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o aproximadamente 30 a 32 residuos de nucleobases que, cuando se forman en un dúplex con el ARN objetivo de C6 de humano, rata o ratón complementaria, por ejemplo, es capaz de incorporar RNasaH. Por «incorporar Rnasa H» se entiende que la enzima hace contacto con el complejo como se determina por uno o una combinación de ensayos que pueden detectar y cuantificar la actividad de la enzima. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que divide la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Por lo tanto, la activación de la RNasa H, resulta en la división del objetivo de ARN, con lo cual se mejora en gran medida la eficiencia de inhibición del oligonucleótido de la expresión génica. La división del objetivo de ARN se puede detectar de forma rutinaria mediante electroforesis en gel.
Por lo tanto, en una realización, la secuencia de nucleobases contigua del oligómero puede incluir una subsecuencia contigua de por lo menos 7, tal como por lo menos 8, por lo menos 9 o por lo menos 10 residuos de nucleobases que, cuando se forman en un dúplex con el objetivo C6 de mamífero complementario son capaces de incorporar Rnasa H.
En otra realización, la subsecuencia contigua tiene por lo menos 9 o por lo menos 10 nucleobases de longitud, tal como por lo menos 12 nucleobases o por lo menos 14 nucleobases de longitud, tal como 14, 15 o 16 residuos de nucleobases que, cuando se forman en un dúplex con el ARN objetivo C6 de mamífero complementario son capaces de incorporar RNasaH.
Los oligómeros adicionalmente preferidos para uso con la invención serán de una longitud adecuada para el uso pretendido. Por lo tanto, en una realización, el oligómero tiene una longitud de entre aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 10 a aproximadamente 35 nucleobases, aproximadamente 10 a aproximadamente 22 nucleobases, por ejemplo, aproximadamente 12 a aproximadamente 18 nucleobases, aproximadamente 14, aproximadamente 15 o aproximadamente 16 nucleobases, aproximadamente 10, 11, 12, 13 o aproximadamente 14 nucleobases.
Como se apreciará, un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen adicionalmente un grupo fosfato ligado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato se puede ligar a la unidad estructural 2’, 3’ o 5’ hidroxilo del azúcar. En los oligonucleótidos de formación, los grupos fosfato ligan covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. En cambio los respectivos extremos de esta estructura polimérica lineal adicionalmente se pueden unir para formar una estructura circular, sin embargo, generalmente se prefieren las estructuras lineales abiertas. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, los grupos fosfato se denominan comúnmente como la formación de la estructura principal de internucleósido del oligonucleótido. El enlace normal o estructura principal de ARN y ADN es un enlace 3’ a 5’ fosfodiéster.
Aunque se prefieren los oligómeros anteriores para ciertas aplicaciones, a menudo se preferirá el uso de oligómeros con uno o más análogos de oligonucleótidos (a veces denominados aquí como «miméticos o derivados» de oligonucleótido). Por lo tanto, los oligómeros de la invención incluirán uno o más compuestos no nucleobases solos o en combinación con cadenas principales modificadas o enlaces de internucleósido no naturales en los mismos. Como se define en esta especificación, los oligonucleótidos que tienen cadenas principales modificadas incluyen aquellos que conservan un átomo de fósforo en la estructura principal y los que no tienen un átomo de fósforo en la estructura principal. Para los propósitos de esta especificación, y como a veces se hace referencia en el campo, los oligonucleótidos modificados que
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no tienen un átomo de fósforo en su estructura principal de internucleósido también se pueden considerar oligonucleósidos.
Las cadenas principales de oligonucleótidos modificados ilustrativos incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros fosfonatos de alquilo que incluyen fosfonatos de 3’-alquileno, fosfonatos de 5’-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen fosforamidato de 3’-amino y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquil-fosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen 3’-5’ enlaces normales, análogos de 2’-5’ ligados de estos, y aquellos que tienen en polaridad invertida en donde uno o más enlaces de internucleótidos es un enlace 3’ a 3’, 5’ a 5’ o 2’ a 2’. Los oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden un único enlace 3’ a 3’ en el enlace más internucleótido 3’ es decir un residuo de nucleósidos invertido único que puede ser abásico (la nucleobase está pérdida o tiene un grupo hidroxilo en lugar de la misma). También se incluyen diversas sales, sales mezcladas y formas de ácidos libres. Véase por ejemplo Patentes Estadounidenses Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,422,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,572,899; 5,721,218; 5,672,697; 7,335,764 y 5,625,050, para descripción que se relaciona con elaborar y utilizar dichas composiciones.
Por lo tanto en una realización de la invención, un oligómero de la invención tiene una estructura principal que es completamente fosforotiolada.
Las cadenas principales de oligonucleótidos modificados adicionales que no incluyen un átomo de fósforo allí tienen cadenas principales que se forman por enlaces de internucleósido de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroátomos mezclados y enlaces de internucleósido de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces de internucleósido heteroatómicos o heterocíclicos. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y cadenas principales de tioformacetilo; cadenas principales de riboacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenoimino y cadenas principales de metilenohidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen partes de componente de mezcladas N, O S y CH2. Véase por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046;’ 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269, 7,335,764, y’5,677,439, para descripción que se relaciona con elaborar y utilizar dichas composiciones.
En otros análogos de oligonucleótidos, tanto el azúcar como el enlace de internucleósido, es decir, la estructura principal, de las unidades de nucleótidos se reemplazan con otros grupos. Las unidades base se mantienen para hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Uno compuesto oligomérico se denomina como un ácido nucleico de péptido (PNA). En compuestos de PNA, la estructura principal de azúcar del oligonucleótido se reemplaza con una amida que contiene la estructura principal, en particular una estructura principal de aminoetoxivinilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la estructura principal. Véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,539,082; 5,714,331; 5,719,262, y Nielsen et al., Science, 1991,254, 1497-1500.
Las realizaciones adicionales de la invención son oligómeros con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleósidos con cadenas principales de heteroátomos, y en particular --CH2--NH--O--CH2--, --CH2--N(CH3)--O-CH2--[conocida como una estructura principal de metileno (metilimino) o MMI], --CH2--O--N(CH3)—CH2--, --CH2-N(CH3)--N(CH3)—CH2--y –O--N(CH3)--CH2--CH2--[en donde la estructura principal de fosfodiéster nativa se representa como --O--P--O--CH2--] de la Patente Estadounidense No. 5,489,677 mencionada anteriormente, y las cadenas principales de amida de la Patente Estadounidense No. 5,602,240 mencionada anteriormente. Los oligonucleótidos adicionales que tienen estructuras de estructura principal de morfolino de la Patente estadounidense No. 5,034,506 mencionada anteriormente, por ejemplo.
Los oligómeros modificados de acuerdo con la invención también pueden contener una o más unidades estructurales de azúcar sustituidas. Los oligonucleótidos ilustrativos comprenden uno de los siguientes en la posición 2’; OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S-o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquinilo y alquinilo C2 a C10 sustituido o no sustituido. Particularmente se prefieren O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m son desde 1 hasta aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2’: alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de división de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2’-metoxietoxi (2’-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2’-O--(2-metoxietilo) o 2’-MOE) (Martin et
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al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir un grupo alcoxialcoxi. Una modificación preferida adicional incluye 2’dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2’-DMAOE, como se describe en los ejemplos adelante, y 2’-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2’-O-dimetilaminoetoxietilo o 2’-DMAEOE), es decir, 2’-O--CH2--O—CH2--N(CH2)2,· también se describe en los ejemplos adelante.
Una modificación preferida incluye Ácidos Nucleicos Bloqueados (LNA) en la que el grupo 2’-hidroxilo se liga al átomo de carbono 3’ o 4’ del anillo de azúcar formando así una unidad estructural de azúcar bicíclica. El enlace es, por ejemplo, un grupo metileno (--CH2--)n que puentea el átomo de oxígeno 2’ y el átomo de carbono 4’ en donde n es 1 o 2. Los LNA y la preparación de los mismos se describe en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
Los monómeros de LNA adicionalmente adecuados (a veces llamados “monómero de ácido nucleico bloqueado”, “residuo de ácido nucleico bloqueado”, “monómero de LNA” o “residuo de LNA”) se refieren a un análogo de nucleótido bicíclico como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475, la Publicación de Patente de Estadounidense No. 2007/0191294, WO 03/095467, Patente de Estadounidense Nos. 6,670,461, 6,794,499, 7,034,133, 7,053,207 (L-Ribo-LNA), 7,060,809, y 7,084,125 (Xylo-LNA). El monómero de LNA también se puede definir con respecto a su fórmula química Por lo tanto, un ejemplo de un
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en donde, X se selecciona del grupo que consiste de O, S y NRH --, donde RH es H o alquilo, tal como alquilo C1-C6; Y es (--CH2)r, donde r es un entero 1-6; con la condición de que cuando X=O entonces r no es 2. Z y Z* están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste de un grupo de enlace internucleósido, un grupo terminal y un grupo de protección; y B es una nucleobase. En una realización, r=1 y X es O y cada uno de Z, Z* está independientemente ausente o se selecciona del grupo que consiste de un grupo de enlace de internucleósido, grupo terminal y un grupo de protección y B es una nucleobase. Los monómeros de LNA anteriores pueden estar en la forma beta-D, forma alfa-L como se describe, por ejemplo, en la Publicación de Patente Estadounidense 2007/0191294.
También se incluyen dentro de la expresión “monómero de LNA” oligómeros en los que uno o más nucleótidos se sustituyen por amino-LNA, tio-LNA o ambos. Por «amino-LNA” y “tio-LNA» se entiende el monómero de LNA mostrado en la fórmula anterior en el que el átomo de oxígeno del anillo de pentosa se reemplaza con un átomo de nitrógeno o de azufre, respectivamente. Los métodos para elaborar y utilizar dichos monómeros de LNA se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 7,060,809; 7,034,133; 6,794,499; 6,670,461; y las referencias citadas en las mismas. Una sustitución particular es C-o T-amino-LNA; o C o T-tio LNA. Ciertos análogos de amino-LNA y tio-LNA están disponibles de Ribotask A/S.
La expresión “alquilo C1-6” significa una cadena de hidrocarburos lineal o ramificada saturada en donde las cadenas más largas tienen de uno a seis átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, secbutilo, tert-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo y hexilo. Una cadena de hidrocarburo ramificada significa un alquilo C1-6 sustituido en cualquier carbono con una cadena de hidrocarburo.
Ejemplos específicos de grupos terminales incluyen grupos terminales seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, Prot-O--, Act-O--, mercapto, Prot-S--, Act-S--, alquiltio C1-6, amino, Prot-N (RH)--, Act-N(RH)--, mono-o di (alquilo C1-6) amino, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alqueniloxi C2-6 opcionalmente sustituido, monofosfato que incluye monofosfato protegido, monotiofosfato que incluye monotiofosfato protegid, difosfato que incluye difosfato protegido, ditiofosfato que incluye ditiofosfato protegido, trifosfato que incluye trifosfato protegido, tritiofosfato que incluye tritiofosfato protegido, donde Prot es un grupo de protección para --OH, --SH y --NH (RH), y Actividad es un de activación para -OH, -SH y -NH (RH), y RH es hidrógeno o alquilo C1-6.
En el presente contexto, el término “alquilo C1-4” significa una cadena hidrocarburo saturado lineal o ramificada en donde las cadenas más largas tienen de uno a cuatro a átomos, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y tert-butilo una cadena ramificada de hidrocarburo significa un alquilo C1-4 sustituido en cualquier carbono con una cadena de hidrocarburo.
Cuando se utiliza aquí el término “alcoxi C1-6” significa alquilo C1-6 -oxi, tal como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, nbutoxi, isobutoxi, secuencia-butoxi, tert-butoxi, pentoxi, isopentoxi, neopentoxi y hexoxi
En el presente contexto, el término “alquenilo C2-6” significa un grupo de hidrocarburo lineal o, ramificado que tiene desde dos hasta seis átomos de carbono y que contiene uno o más enlaces dobles. Ejemplos ilustrativos de grupos de
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La práctica de la invención es compatible con el uso de uno o una combinación de diferentes oligómeros como se describe aquí. Por ejemplo, y en una realización, una invención se hibrida con un ácido nucleico C6 de mamífero correspondiente (por ejemplo, mARN) con una Tm de por lo menos 40° C, tal como de por lo menos 50° C. En una realización particular, el oligómero se hibrida con un ácido nucleico C6 de mamífero correspondiente (por ejemplo, mARN) con una Tm no mayor de 90° C, tal como no mayor de 80° C.
En la mayoría de realizaciones de la invención, se prefieren generalmente los oligómeros con cadenas principales modificadas como se describió anteriormente, especialmente para uso in vivo. En una realización, los enlaces de internucleósido se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: fosfodiéster, fosforotioato y boranofosfato. En un ejemplo particular, el oligómero incluye por lo menos un enlace de fosforotioato internucleósido. Los enlaces de internucleósido que pueden estar adyacente a o entre unidades de ADN o ARN, o dentro de la región B (como se describió anteriormente) son enlaces de fosforotioato. En un ejemplo de un oligómero de la invención, por lo menos un par de análogos de nucleótidos consecutivos es un enlace de fosfodiéster. En algunas realizaciones, todos los enlaces entre los análogos de nucleótidos consecutivos serán preferiblemente enlaces de fosfodiéster, por ejemplo, todos los enlaces de internucleósido pueden ser enlaces de fosforotioato.
Los oligómeros más específicos para uso de la invención incluyen aquellos dirigidos a los sitios objetivo preferidos mostrados en las Tablas. 4A-4E y Tablas 5A-5F y mencionados anteriormente. Dichos oligómeros consistirán generalmente de entre aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nucleótidos, tal como aproximadamente 12 a aproximadamente 18 nucleótidos, en los que la estructura principal está completamente o parcialmente fosfotiolada. Adicionalmente los oligómeros preferidos incluirán además entre aproximadamente uno a aproximadamente seis (6) monómeros de LNA preferiblemente colocados en los extremos 5’ y 3’ de los oligómeros. Los oligómeros más específicos incluirán aproximadamente 2 o 3 de dichos monómeros de LNA posicionados en cada uno de los extremos (es decir., wíngmeros o gápmeros).
También se prevé que cualquiera de los anteriores oligómeros en los que por lo menos una unidad estructural no nucleótida o no polinucleótida se une covalentemente a dicho compuesto. Ejemplos incluyen los grupos mencionados anteriormente.
Los oligómeros adicionales de la invención se proporcionan a continuación en los Ejemplos y Tablas.
Compuestos de doble cadena
Como se mencionó, la invención también contempla un compuesto de cadena doble que comprende una cadena clonada y una cadena antisentido dirigida a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína del complemento de componente 6 (C6) de mamífero, tales como secuencias de humano, rata y ratón proporcionados en esta. En una realización, cada cadena comprende desde entre aproximadamente 12 hasta aproximadamente 35 nucleobases, preferiblemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 30 nucleótidos, más preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 25 nucleótidos con aproximadamente 15 a aproximadamente 20 nucleótidos (por ejemplo, 18 o 19 nucleótidos), que se prefieren para muchas aplicaciones. Preferiblemente, la cadena antisentido consiste de una secuencia de nucleobases contiguas a por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% hasta aproximadamente 100% de identidad de secuencia con una región correspondiente de un ácido nucleico que codifica la secuencia de COMPONENTE DE COMPLEMENTO 6 secuencia (C6) representada por la SEQ ID NOs: 1 (humano), 402 (rata) o 403 (ratón) o una variante alélica de origen natural de la misma. El oligómero incluye por lo menos un análogo de oligonucleótido, tal como un monómero de LNA.
Los compuestos de doble cadena preferidos para uso de la invención se pueden hacer utilizando uno o una combinación de aquellos oligómeros descritos aquí. Los oligómeros más preferidos se diseñan para dirigir a los sitios objetivo ya discutidos en relación con las Tablas 4A-4E y las Tablas 5A-5F, por ejemplo. Los oligómeros adicionalmente preferidos para uso con el compuesto de doble cadena serán esencialmente no tóxicos según se determina por las pruebas con animales descritas aquí y en particularmente en la sección de Ejemplos. Dichos oligómeros pueden mostrar adicionalmente una buena capacidad para disminuir la expresión de mARN de C6 de acuerdo con el ensayo.
Una o ambas de la cadena clonada y la cadena antisentido comprenden por lo menos un enlace de internucleósido modificado como se describió previamente (estructuras principales de oligonucleótidos), tales como un enlace de fosforotioato. En un ejemplo particular, todos los enlaces de internucleósido de la cadena clonada y la cadena antisentido son enlaces de fosforotioato. Normalmente, la cadena clonada incluirá adicionalmente por lo menos un monómero de LNA, por ejemplo, entre aproximadamente 1 a aproximadamente 10 monómeros de LNA (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 9 monómeros de LNA). En un ejemplo, el por lo menos un monómero de LNA se ubica en el extremo 5’ de la cadena clonada, por ejemplo, por lo menos dos monómeros de LNA se ubican en el extremo 5’ de la cadena clonada. Alternativa o adicionalmente por lo menos un monómero de LNA se ubica en el extremo 3’ de la cadena clonada, por ejemplo, por lo menos dos monómeros de LNA se ubican en el extremo 3’ de la cadena clonada. Ejemplos adicionales del compuesto de doble cadena incluyen construcciones en las que la cadena antisentido comprende por lo menos un monómero de LNA, por ejemplo, entre aproximadamente 1 a aproximadamente 10 monómeros de LNA (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 9 monómeros de LNA). En un ejemplo de la invención, por lo menos el monómero de LNA del compuesto se ubica en el extremo 3’ de la cadena antisentido tal como las realizaciones en las que por lo menos dos
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monómeros de LNA se ubican en el extremo 3’ de la cadena antisentido, por ejemplo, por lo menos tres monómeros de LNA se ubican en el extremo 3’ de la cadena antisentido. Sin embargo, en otros ejemplos, puede ser útil tener 1 o no tener monómero (0) de LNA ubicado en el extremo 5’ de la cadena antisentido. Los compuestos de doble cadena para uso de la invención incluyen aquellas construcciones en las que la cadena clonada comprende por lo menos un LNA y la cadena antisentido comprende por lo menos un monómero de LNA, por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente. 10 monómeros de LNA (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 9 monómeros de LNA) y la cadena antisentido comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 10 monómeros de LNA (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 9 monómeros de LNA).
En un ejemplo del compuesto de doble cadena anterior que comprende el primer oligómero (cadena clonada) y el segundo oligómero (cadena antisentido), la cadena clonada comprende por lo menos un monómero de LNA en el extremo 5’ (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 monómeros de LNA) y por lo menos un monómero de LNA en el extremo 3’ (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 monómeros de LNA) tal como el ejemplo en el que la cadena antisentido comprende por lo menos un monómero de LNA en el extremo 3’. Como un ejemplo, la cadena clonada comprende por lo menos un monómero de LNA en el extremo 5’ (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 monómeros de LNA) y por lo menos un monómero de LNA en el extremo 3’ (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 monómeros de LNA). En un ejemplo particular, la cadena antisentido comprende por lo menos dos monómeros de LNA en el extremo 3. En determinados ejemplos, la cadena clonada comprende por lo menos dos monómeros de LNA en el extremo 5’ y por lo menos dos monómeros de LNA en el extremo 3’, por ejemplo, la cadena antisentido puede incluir por lo menos dos monómeros de LNA en el extremo 3’. Por lo tanto, en un ejemplo de la invención particular, la cadena clonada comprende por lo menos dos monómeros de LNA en el extremo 5’ y por lo menos dos monómeros de LNA en el extremo 3’, y, por ejemplo, la cadena antisentido comprende por lo menos tres monómeros de LNA en el extremo 3’. Sin embargo, en determinados ejemplos de la invención será útil tener 1 o no tener (0) monómeros de LNA ubicados en el extremo 5’ de la cadena antisentido.
En un ejemplo preferido, T en la composición se reemplaza por U (T => U). Sin embargo, para algunos o preferiblemente todos los monómeros de LNA, T no se sustituirá por U es decir., T = T.
Las composiciones de doble cadena más específicas están dentro del alcance de la presente invención incluyendo aquellas en las que la cadena clonada comprende por lo menos un monómero de LNA en por lo menos una de las posiciones 9 a 13 contadas, secuencialmente, desde el extremo 5’. Alternativa o adicionalmente, la cadena clonada puede incluir un monómero de LNA en la posición 10 contada, secuencialmente, desde el extremo 5’. Alternativa o adicionalmente la cadena clonada puede incluir un monómero de LNA en la posición 11 y/o posición 12 en la misma.
En determinados ejemplos del compuesto de doble cadena, el primer y el segundo oligómeros del mismo (cadenas clonada y antisentido) cada uno incluyen entre aproximadamente 17 a aproximadamente 25 nucleótidos, tales como 18 a aproximadamente 24 nucleótidos, aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos, y aproximadamente 20 a aproximadamente 22 nucleótidos.
Si se desea lograr un objetivo de la invención, cada una de las cadenas clonadas y antisentido pueden incluir, independientemente, una saliente 3’. Alternativa o adicionalmente el compuesto puede incluir por lo menos un nucleósido acíclico (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5) ubicado situada en el mismo por ejemplo, seco-ARN-timidina, secoARN-citosina, seco-ARN-adenina y seco-ARN-guanina). En un ejemplo, el nucleótido acílico se ubica en la cadena clonada. En otro ejemplo, el nucleótido acílico se ubica en la cadena antisentido del compuesto.
En un ejemplo de la invención, las nucleobases del primer oligómero, el segundo oligómero, o ambas se hibridarán diseñadas para dirigir ejemplificadas por las SEQ ID Nos: 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, y 249 (véanse Tablas 4A-4E) y el ARN y versiones de complemento inverso de las mismas se muestran inmediatamente debajo de cada objetivo. Se espera que el C6 de rata y ratón C6 tenga sitios objetivos idénticos o muy similares. Incluidos dentro del grupo de dichos oligómeros específicos para uso como constituyentes de los compuestos de doble cadena son derivados de estas secuencias en las que se ha modificado uno o más del grupo de azúcar, nucleobase, o enlace de internucleósido, por ejemplo, como se describe aquí. Las modificaciones particulares incluirán modificar la secuencia para incluir o consistir esencialmente en enlaces fosforotioato y por lo menos un monómero de LNA.
En consecuencia, y en un ejemplo, el compuesto de doble cadena cuenta con todos los enlaces de fosforotioato y aproximadamente uno, dos o tres monómeros de LNA en el extremo 3’ de la cadena antisentido, por ejemplo, dos de los mismos. En un ejemplo, la cadena clonada incluye uno, dos, o tres monómeros de LNA en el extremo 5’ de la cadena clonada, por ejemplo, dos de los mismos.
En algunos ejemplos de la invención, puede ser útil tener más sustitución con monómero de LNA tal como cuando es deseable hibridación más fuerte entre cadenas. Por lo tanto, en un ejemplo, el compuesto de doble cadena cuenta con todos los enlaces de fosforotioato y aproximadamente uno, dos o tres monómeros de LNA en el extremo 3’ de la cadena antisentido, por ejemplo, dos de los mismos. La cadena clonada incluye uno, dos, o tres monómeros de LNA en el extremo 5’ de la cadena clonada, por ejemplo, dos de los mismos. Sin embargo, en un ejemplo, la cadena clonada incluye uno, dos, tres, cuatro o cinco monómeros de LNA adicionales entre el extremo 3’ y 5’ de la cadena clonada, tales como en la posición 3, 9, 13, y 15 en relación con el extremo 5’ (posición 1) posiciones de saliente 3’.
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secoguanina (secuencia-ARN-guanina). En un ejemplo, la cadena antisentido incluye 1 nucleótido acíclico, preferiblemente posicionado entre los extremos 3’ y 5’, por ejemplo, entre desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 20 nucleótidos desde el extremo 3’, preferiblemente entre desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 19 nucleótidos desde el extremo 3’ En un ejemplo, la cadena antisentido incluye adicionalmente uno, dos, o tres monómeros de LNA, por ejemplo, dos iguales posicionados en el extremo 3’’. La cadena clonada, en un ejemplo, incluye uno, dos o tres nucleótidos acíclicos en el extremo 3’, preferiblemente uno del mismo.
En un ejemplo, el siguiente compuesto es posible (L negrilla, subrayado = LNA, r=ARN, S cursiva subrayado = Seco):
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en el que el compuesto puede incluir por lo menos un fosforotioato opcional, por ejemplo, puede ser completamente fosforotiolado. Los compuestos adicionales, cuando está presente un residuo C, pueden incluir un C metilo opcional para reducir o eliminar una respuesta inmunitaria cuando se utilizan para aplicaciones in vivo. Otras modificaciones, como se discute aquí son posibles.
Por lo tanto, en un ejemplo, el siguiente compuesto está dentro del alcance de la invención en el que el texto
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Los compuestos de la invención particular se denominarán algunas veces aquí como “SiLNA” para denotar ampliamente un compuesto con por lo menos un monómero de LNA. Como se utiliza aquí, el término “siARN” se relaciona con un tramo de cadena doble de ARN o monómeros de ARN modificados. En un compuesto de siARN típico, las dos cadenas usualmente tienen 19 nucleótidos complementarios entre sí creando de esta manera una doble cadena que es de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud y cada cadena tiene un extremo 3’ de dos nucleótidos salientes. Se apreciará que un siARN de la invención puede ser ligeramente más largo o más corto, y con o sin salientes. La elección de una construcción de siARN particular dependerá de parámetros reconocidos tales como el uso destinado. En el siARN, una cadena de oligómero es la guía y es complementaria al ARN objetivo (cadena antisentido), y la otra cadena de oligómero (cadena clonada) tiene la misma secuencia que el ARN objetivo y por lo tanto es complementaria a la cadena de guía/antisentido. Aquí, los ARN reguladores tales como “micro ARN” (“miARN”) y “ARN corto” (“shARN”) y un variedad de ARN estructurales como tARN, snARN, scARN, rARN se utilizan de forma intercambiable con el término “siARN”. El término “mARN” significa la transcripción de mARN conocido en la actualidad de un gen objetivo y cualesquier transcripciones adicionales, que se puedan identificar.
Dichos compuestos de doble cadena para uso de la invención se pueden conjugar (es decir unir covalentemente) a por lo menos una unidad estructural de no nucleótido o no polinucleótido. Los ejemplos incluyen aquellos descritos anteriormente.
Como se apreciará, para ser estable in vitro o in vivo, la secuencia de un compuesto de SiLNA o, siARN no necesita ser 100% complementaria a su ácido nucleico objetivo. Los términos “complementario” y “específicamente hibridable” implican de esta manera que el compuesto SiLNA o siARN se une suficientemente fuerte y específico pa la molécula objetivo para proporcionar la interferencia deseada con la función normal del objetivo al mismo tiempo dejar la función de mARNs no objetivo no afectada.
Complejos de ARN de cadena discontinua
En otro aspecto, la presente invención contempla una composición que comprende un complejo de ácido nucleico, que normalmente comprende o consiste de ARN o uno o más análogos de oligonucleótidos de los mismos, y preferiblemente un diluyente, portador, o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, el complejo incluye una región de doble cadena de núcleo que incluye una cadena antisentido que consiste de una secuencia de nucleobases contigua con por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, hasta aproximadamente 100% de identidad de secuencia con una región correspondiente de un ácido nucleico que codifica la secuencia de componente de complemento 6 (C6) representada por SEQ ID NOs: 1 (humano), 402 (rata) o 403 (ratón) o una variante alélica de origen natural de la misma. Los complejos preferidos incluyen por lo menos un análogo de oligonucleótido, el complejo ARN comprende adicionalmente una cadena clonada discontinua que normalmente se hibrida con la cadena antisentido. Para la mayoría de aplicaciones, la cadena clonada discontinua incluye una discontinuidad tal como una nick o espacio o un ligador u otra dicha interrupción como se describe aquí.
En un ejemplo de lo anterior, el complejo de ARN es generalmente capaz de mediar las modificaciones de ácido nucleico de un ácido nucleico objetivo correspondiente. Preferiblemente, la modificación de ácido nucleico se selecciona
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menos un análogo de nucleótido tal como entre 2 y 10 análogos de nucleótidos. Alternativa o adicionalmente, la primera molécula de ARN de la cadena clonada comprende uno o más análogos de nucleótidos, tales como por lo menos 2 análogos de nucleótidos. Alternativa o adicionalmente, la segunda molécula de ARN de la cadena clonada comprende uno o más análogo de nucleótido tal como por lo menos 2 análogos de nucleótidos.
En los ejemplos en los que un complejo de ARN incluye un análogo de nucleótido, la localización del análogo está preferiblemente dentro de los tres unidades de nucleobases terminales (5’ o 3’ respectivamente) de la primera y/o segunda molécula de ARN. Alternativa o adicionalmente, por lo menos una de las moléculas de ARN adicionales de la cadena clonada comprende por lo menos un análogo de nucleótido. Por ejemplo, cada molécula de ARN adicional que forma parte de la cadena clonada discontinua comprende por lo menos un análogo de nucleótido tal como en las posiciones 10 y 12 desde el extremo 5’ de la cadena clonada. En un ejemplo, cada molécula de ARN que forma parte de la cadena clonada discontinua y comprende por lo menos un análogo de nucleótido, tal como por lo menos dos análogos de nucleótidos.
En un ejemplo, la cadena clonada incluye uno, dos, tres, cuatro o cinco monómeros de LNA adicionales entre el extremo 3’ y 5’ de la cadena clonada tal como en la posición 3, 9, 13, y 15 con respecto al extremo 5’ (posición 1) y las posiciones de saliente 3’. Sin embargo, en este ejemplo de la invención, la cadena clonada se rompe en dos partes, por ejemplo, entre las posiciones 10 y 11. Por lo tanto, en un ejemplo, cada porción de la cadena clonada incluye por lo menos un monómero de LNA, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de los mismos, más preferiblemente cinco o seis de los mismos en los que uno, dos, o tres, o cuatro monómeros de LNA se posicionan en una de las cadenas clonadas y los monómeros restantes se posicionan en la otra cadena.
A menudo será útil elaborar y utilizar un complejo de ARN que tiene propiedades de temperatura de fusión deseables. Por lo tanto, en un ejemplo, la temperatura de fusión (Tm) para cada uno de la primera, segunda y opcionalmente moléculas de ARN adicionales que forman la cadena clonada discontinua, cuando se forma en un dúplex con una molécula de ARN complementario con enlaces de fosfodiéster es de por lo menos 40° C.
Las longitudes preferidas de los complejos de ARN de la invención serán guiadas por el uso destinado. Por lo tanto, en un ejemplo, la longitud de cada una de la primera, segunda y opcionalmente moléculas de ARN adicionales que forman la cadena clonada discontinua tiene por lo menos tres unidades de nucleobases. En un ejemplo, la cadena antisentido comprende por lo menos 1 análogo de nucleótido tal como el ejemplo donde la cadena antisentido comprende por lo menos 1 análogo de nucleótido dentro de la región de dúplex formada con la cadena clonada discontinua. Alternativa o adicionalmente, la cadena antisentido comprende por lo menos un análogo de nucleótido en una posición que está dentro de 4 nucleobases contadas a partir del extremo 3’ de la cadena antisentido. En un ejemplo, por lo menos una de las nucleobases presente en aproximadamente las 9 5’ unidades de nucleobases más hacia 5’ de la cadena antisentido es un análogo de nucleótido. En otro ejemplo, por lo menos una de las nucleobases presentes en la región dentro de 4 a 10 nucleobases desde el extremo 3’ 10 de la cadena antisentido es un análogo de nucleótido. En aún otro ejemplo, la cadena antisentido tiene un análogo de nucleótido en la posición 11 desde el extremo 5’ de la cadena antisentido. En aún otro ejemplo, la cadena antisentido tiene nucleótidos de ARN en la posición 10 y 12 a desde el extremo 5’ de la cadena antisentido. En otro ejemplo, las unidades de nucleobases más hacia 5’ de la cadena antisentido es una unidad de nucleótido de ARN. Alternativa o adicionalmente, la cadena antisentido comprende por lo menos 2 análogos de nucleótidos.
Una amplia variedad de análogos de nucleótido son compatibles con la invención. Normalmente los análogos adecuados son aquellos que son o se sospecha son compatibles con la formación de una forma A o A/B para conformación del complejo de ARN. Los análogos ilustrativos incluyen el grupo que consiste de: monómeros de 2’-Oalquilo-ARN, monómeros de 2’-amino-ADN, monómeros de 2’-fluoro-ADN, monómeros de LNA, monómeros de ácido nucleico arabino (ANA), monómeros de 2’ fluoro-ANA, monómeros de HNA, monómeros de INA. Un análogo de nucleótido preferido está presente en la cadena clonada discontinua y/o cadena antisentido y consiste de por lo menos un monómero de LNA tal como aquellos ya descritos aquí. Alternativa o adicionalmente, los análogos de nucleótidos presentes en la cadena clonada discontinua y/o cadena antisentido incluyen por lo menos una unidad de 2’-MOE-ARN (2’-O-metoxietil-ARN) o unidades de ADN 2’-Fluoro.
Como se menciona, a menudo será útil tener un complejo de ARN en las que por lo menos un nucleótido se sustituya con por lo menos una unidad de LNA. En un ejemplo, la unidad o unidades de LNA se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, y amino-LNA, en cualquiera de las configuraciones D-β y L-α o combinaciones de las mismas. Si se desea, los análogos de nucleótidos presentes en la cadena antisentido incluyen por lo menos una unidad LNA y/o análogos de nucleótido presentes en la cadena clonada incluyen por lo menos una unidad de LNA. En un ejemplo, los análogos de nucleótidos presentes en las unidades de las cadenas antisentido con unidades de LNA. Alternativa o adicionalmente, todos los análogos de nucleótidos presentes en cadena clonada son unidades de LNA. Anteriormente se han descrito diversos monómeros de LNA.
En muchos ejemplos del complejo de ARN descrito aquí, por lo menos uno de los análogos de nucleótidos presentes en las cadenas clonadas discontinuas forman un par base con un análogo de nucleótidos complementario presente en la cadena antisentido. En un ejemplo, la cadena clonada no comprende análogos de nucleótidos y/o en otro ejemplo, la cadena antisentido no comprende análogos de nucleótidos. En otro ejemplo, la cadena antisentido y cadena discontinua
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forman un dúplex complementario de entre aproximadamente 18 a aproximadamente 22 pares bases. En un ejemplo, el dúplex puede comprender un emparejamiento erróneo.
En un ejemplo el número de análogos de nucleótidos presentes en la cadena antisentido o cadena clonada (o ambas, ya sea como entidades separadas o como una combinación total de análogos de nucleótidos dentro del complejo de ARN) se selecciona del grupo que consiste de: por lo menos un análogo de nucleótido, tal como por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11, por lo menos 12 , por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19 o por lo menos 20, por lo menos 21, por lo menos 22, por lo menos 23, por lo menos 24 y por lo menos 25 análogos de nucleótidos. De forma adecuada, el número de análogos de nucleótidos puede ser menor de 20, tal como menor de 18, tal como menor de 16, tal como menor de 14, tal como menor de 12, tal como menor de 10.
En un ejemplo los análogos de nucleótidos presentes en la cadena clonada discontinua (o cadena antisentido, o ambas cosas, ya sea como entidades separadas una combinación total combinado de análogos de nucleótidos en el complejo de ARN) incluyen por lo menos un monómero de 2’-O-alquilo-ARN (tal como 2’OME), tal como 1,2, 3, 4, 5, 6 ,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 monómeros de 2’-O-alquilo-ARN (tales como 2’OME). También se prevén los complejos que comprenden o consisten de 2’OME y LNA.
En un ejemplo, que puede ser el mismo o diferente, los análogos de nucleótidos presentes en cadenas clonadas discontinuas (o cadenas antisentido, o ambas cosas, ya sea como entidades separadas o como una combinación total de análogos de nucleótidos dentro del complejo de ARN) incluyen por lo menos un monómero de 2’-fluoro-ADN, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 de monómeros de 2’-fluoro-ADN.
Para muchas aplicaciones de la invención por lo general se preferirá tener por lo menos un monómero de LNA presente en la cadena clonada discontinua. En un ejemplo, que puede ser el mismo o diferente, los análogos de nucleótidos presentes en la cadena clonada discontinua (o cadena antisentido, o ambas cosas, ya sea como entidades separadas o como una combinación total de análogos de nucleótidos en el complejo de ARN) incluyen por lo menos un monómero de LNA, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 monómeros de LNA.
En un ejemplo la unidad o unidades de LNA se seleccionan independientemente del grupo que consiste de oxi-LNA, tio-LNA, y amino-LNA, en cualquiera de las configuraciones D-β y L-α o combinaciones de las mismas. En un ejemplo los análogos de nucleótidos presentes en la cadena antisentido incluyen por lo menos una unidad de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), tal como por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, en menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19 o por lo menos 20 unidades de LNA. De forma adecuada, el número de unidades de LNA puede ser menor de 20, tal como menor de 18, tal como menor de 16, tal como menor de 14, tal como menor de 12, tal como menor de 10. En un ejemplo todos los análogos de nucleótidos presentes en la cadena antisentido son unidades de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA).
En otro ejemplo, la cadena antisentido solamente comprende unas pocas unidades de análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA. Normalmente se prefiere las unidades de nucleótidos presentes en la cadena antisentido una posicionada dentro de la mitad de 3’ de la cadena antisentido tal como entre las posiciones 1 y 9 de la cadena antisentido, tales como la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de la cadena antisentido, tal como dentro de la región de una saliente 3, o dentro de la primera 3, segunda o tercera posiciones de nucleobases del dúplex según se mide a partir del extremo 3’ de la cadena antisentido.
En un ejemplo los análogos de nucleótidos presentes en la cadena clonada (o cadena antisentido, o ambas, ya sea como entidades separadas o como una combinación total de análogos de nucleótidos dentro de del complejo de ARN) incluyen por lo menos una unidad LNA tal como por lo menos 2, en menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19 o por lo menos 20 unidades de LNA. De forma adecuada el número de unidades de LNA puede ser menor de 20, tal como menor de 18, tal como menor de 16, tal como menor de 14, tal como menor de 12, tal como menor de 10. En un ejemplo todos los análogos de nucleótidos presentes en la cadena clonada son monómeros de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA) (unidades).
En un ejemplo, por lo menos uno de los análogos de nucleótidos presentes en los la cadena clonada discontinua un par base con un análogo de nucleótido complementario presente en la cadena antisentido.
En un ejemplo todos los análogos de nucleótidos presentes en cadena clonada discontinua forman un par base con un análogo de nucleótido complementario presente en la cadena antisentido, diferente de aquellos análogos de nucleótido presentes en la saliente 3’ (si está presente).
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