KR20110044983A - 보체 길항제 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

보체 6(C6)과 같은 포유류의 보체의 발현을 억제 또는 차단하도록 지정된 길항제에 대해 기재한다. 본 발명은 포유류에 급성 또는 만성의 신경 손상 후 신경 재생을 강화하는데 사용되는 약의 제조 용도를 포함하는 넓은 범위의 용도를 갖는다. 추가적 용도는 단독으로 또는 다른 약물과의 조합으로 다수의 경화증의 치료의 용도를 포함한다.

Description

보체 길항제 및 그 용도{COMPLEMENT ANTAGONISTS AND USES THEREOF}
(관련 출원의 상호 참조)
본 출원은 2008년 7월 10일에 출원된 미국 가출원 61/079,501의 연속이다. 본 출원은 각각이 2008년 7월 10일에 출원된 이하 미국 가출원 61/079,554, 61/079,497 및 61/079,488 뿐만 아니라 미국 가출원 61/079,501의 우선권을 주장한다. 미국 가출원 61/079,501, 61/079,554, 61/079,497 및 61/079,488 각각의 내용은 전체가 참조로서 인용된다.
본 발명은 조성물 및 예컨대 보체 성분 6(C6)의 발현을 조절하는 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명은 그 프로테인의 발현을 감소 또는 차단하는 길항제에 관한 것이다. 본 발명은 신경계에 급성 또는 만성 손상 후 포유류의 신경 재생을 증진시키는 용도를 포함하는 갖가지 적용을 포함한다.
보체계는 면역 반응의 중요한 부분이 되도록 인식되는 일부 삼십(30)의 프로테인기를 포함한다. 이 계는 고전적인(보통 항체-의존성) 또는 대체(보통 항체-의존성) 경로에 의해 활성화될 수 있다. 다른 경로를 통한 활성은 C5 전환 효소(convertase)라고도 하는 효소의 발생을 야기한다. 전환 효소는 다른 기능 사이에서 터미널 보체 경로라고도 하는 것을 개시하는 C5b라고 하는 프로테인의 형성을 돕는다. 이 경로의 목적은 침입한 병원균의 멤브레인 내에 막공격 복합체(MAC)를 형성하여 분해(lysis)를 야기하는 것이다. MAC은 일반적으로 보체 프로테인 C6, C7, C8 및 (C9)n과 함계 C5b의 순차 어셈블리에 의해 형성된다. 일반적으로 M.J. 2001. N. Engl . J. Med . 344: 1058-1066; 및 1140-1444를 참조한다.
보체계의 천연 및 합성 억제제가 보고되었다. 이들로는 예컨대, 소분자, 프로테인, 항체, 플라바노이드(flavanoid) 및 다당류(polysaccharides)를 들 수 있다. S. Bureeva et al. (2005) Drug Discovery Today 10: 1535를 참조한다.
신경 세포 변성(Neuronal degeneration)은 많은 급성 및 만성 신경병증(neuropathies)의 특징이 있다. 월러 변성(Wallerian Degeneration)(WD)이라고도 하는 축삭 변성(axonal degeneration)의 하나의 형태는 상처에서 먼 축삭의 부분이 죽는 매우 파괴적인 프로세스이다. 최초의 비정상적임은 하루 또는 이틀 후 가시적인 WB가 더욱 분명해지는 상처 후 몇 시간만큼 일찍 보여질 수 있다(Ballin RH and Thomas PK (1969) Acta Neuropathol (Berl) 14: 237). 예컨대, 미엘린 수초(myelin sheaths)는 셀을 소기(scavenging)함으로써 붕괴되고 에워싸이게 된다(Leonhard et al. (2002) Eur . J. Neurosci . 16: 1654). 이 프로세스는 궁극적인 신경 수복(nerve repair) 및 재생과 관련된다. 소정의 보체 성분은 미엘린 식세포 작용(phagocytosis)을 매개한다는 것이 보고되었다(Dailey et al. (2002) J. Neurosci 18: 6713; and Liu (1999) J. Peripher . Nerv . Syst . 4: 123). 어떤 보체 성분이 이러한 프로세스를 매개하는데 필요한지에 대해서 불확실하지만, MAC 형성은 빠른 WD에 대해 필수적으로 보고되어 왔다((Ramaglia, V. et al. (2007) J. Neurosci. 27: 7663).
다양한 핵산 길항제가 알려져 있다. 예컨대, 각종 안티센스 올리고머는 몇몇의 치료, 진단 및 예방 용도에 유용한 것으로 알려졌다(예컨대, Cheson, BD (2007) Ther Clin Risk Manag . 3(5):855-예컨대, 오블리머센(oblimersen)에 대한 유리한 임상 실험을 논하는 것- 참조). siRNA(Short interfering RNA), RNA 길항제 형태는 유용한 치료 및 연구 도구로 제안되어 왔다(McManus and Sharp, (2002) Nature Reviews Genetics 3: 737). 불연속적 패신저 가닥(discontinuous passenger strand)을 갖는 RISCs(RNAi-induced silencing complexes)와 같은 다른 RNA 길항제가 보고되어 왔다(Leuschner, et al. (2006) EMBO Reports 7:314).
예컨대 포유류의 보체 성분 6(C6) 프로테인의 활성을 차단 또는 억제하는 길항제를 갖는 것이 바람직하다. MAC의 형성에 관련된다고 알려지거나 의혹이 있는 신경병증의 격렬함을 예방하고, 치료하거나 줄이는데 사용될 수 있는 길항제를 갖는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 예컨대 포유류의 보체 성분 6(C6) 프로테인의 활성을 감소 또는 차단하는 길항제를 특징으로 한다. 실례가 되는 길항제는 막공격 복합체(MAC)의 형성과 관련된다고 알려지거나 의혹이 있는 신경병증의 격렬함을 예방하고, 치료하거나 또는 줄이는데 사용될 수 있다. 특히 길항제는 포유류의 보체 6 (C6) 프로테인의 발현을 차단 또는 감소하는 단독- 및 다수-가닥 핵산(일반적으로 약 하나, 둘 또는 약 세개의 가닥)을 특징으로 한다. 본 발명은 포유류의 이하 급성 또는 만성 신경 손상에 신경 재생을 증진시키는데 사용되는 것을 포함하는 갖가지 용도가 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 (인간), SEQ ID NO:402 (쥐) 또는 SEQ ID NO:403 (생쥐) 또는 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체(naturally occurring allelic variant)로 나타내는 보체 성분 6(COMPLEMENT COMPONENT 6) (C6)을 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 적어도 80%의 시퀀스 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오염기 시퀀스를 갖는 약 10 내지 50 뉴클레오티드 길이의 올리고머를 제공한다. 바람직한 올리고머는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 예컨대 PCR 분석에 의해 결정되는 적어도 약 20%에 의해 포유류의 C6 mRNA 발현 레벨을 감소시킬 수 있다.
간단함을 위해서, 달리 지정하지 않는다면 구절 <<포유류의 보체 성분 6 (C6)>>을 <<C6>>, <<포유류의 C6 프로테인>> 등으로 약기할 것이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 포유류의 C6 프로테인, 특히 인간, 쥐 및 생쥐 C6을 인코딩하는 핵산 분자를 표적으로 하는 것이 바람직한 제 1 올리고머(패신저 가닥) 및 제 2 올리고머(안티센스 가닥)을 포함하는 것이 바람직한 이중-가닥 핵산 화합물을 특징으로 한다. 하나의 실시형태에 있어서, 화학물의 각 가닥은 약 12 내지 약 35 뉴클레오염기를 포함하고, 이 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:1 (인간), SEQ ID NO:402 (쥐) 또는 SEQ ID NO:403 (생쥐) 또는 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체(naturally occurring allelic variant)로 나타내는 보체 성분 6(COMPLEMENT COMPONENT 6) (C6)으로 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 적어도 80%의 시퀀스 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오염기 시퀀스로 이루어진다. 바람직한 올리고머는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:1 (인간), SEQ ID NO:402 (쥐) 또는 SEQ ID NO:403 (생쥐) 또는 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체(naturally occurring allelic variant)로 나타내는 보체 성분 6(COMPLEMENT COMPONENT 6) (C6)으로 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 적어도 80%의 시퀀스 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오염기 시퀀스로 이루어진 안티센스 가닥을 포함하는, 코어 이중-가닥 부위를 갖는 RNA 복합체를 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 바람직하게는 올리고머는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 유사체를 포함하고, RNA 복합체는 안티센스 가닥에 혼성화되는 비연속적 패신저 가닥을 더 포함한다.
또한, 본 발명은 셀 또는 조직 내에 인간 C6과 같은 포유류의 C6의 발현을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, 방법은 셀 또는 조직과 셀 또는 조직 내에 C6 프로테인의 발현을 감소 또는 억제하는데 충분한 양으로 본 발명의 적어도 하나의 올리고머, 이중-가닥 화합물 또는 다른 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 보체계의 바람직하지 않은 활성 및 특히 바람직하지 않은 MAC의 형성에 의해 매개되는 장애의 증상을 치료, 예방 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, 방법은 포유류의 MAC 형성을 감소 또는 차단하는데 충분한 양으로 필요에 따라 포유류에 본 발명의 조성물을 투여하는(치료적으로 또는 예방적으로) 단계를 포함한다. 본 발명의 범위내에 바람직한 장애는 신경 재생이 부족하거나 달리 비정상적인 것이다.
또한, 본 발명은 포유류의 C6의 발현을 감소 또는 억제하고 신경 재생을 향상하는데 충분한 양의 본 발명의 하나 이상의 조성물을 투여하는(치료적으로 또는 예방적으로) 방법이다. 바람직하게는, MAC의 형성은 포유류에 있어서 감소 또는 억제된다.
본 발명의 실행은 중요한 이점을 제공한다.
예컨대, 간은 종종 핵산을 격리시키고, 간의 외부를 표적으로 하는 치료에 근거한 핵산의 활성을 감소시킬 수 있다. 그러나, 간은 보체 프로테인 합성의 주요 부위이다. 따라서, 본 발명 화합물의 격리는 C6 프로테인 발현을 유리하게 감소 또는 차단할 것이다.
또한, 본 발명 화합물은 단독으로 또는 다른 물질(적어도 하나의 다른 발명 조성물을 포함함)과의 조합으로 사용되어 급성 또는 만성 신경병증을 갖거나 또는 갖는다고 의혹이 있는 포유류에 MAC 형성을 감소 또는 억제할 수 있다. 상처의 전후 또는 당시에 본 발명의 용도는 포유류에 신경 재생의 증진을 도울 수 있다.
또한, 본 발명의 용도 및 이점이 다음에 설명된다.
도 1은 쥐에 보체 안티센스 LNA로 치료한 3일 후 C6 보체 mRNA 레벨을 나타내는 그래프이다. 배치 번호 (Y-axis)는 실시예 2에 설명된다.
도 2는 보체 프로테인 C6, C8a, 또는 C8b를 표적으로 하는 LNA-변형 올리고뉴클레오티드로 치료한 후 쥐 혈청에 막공격 복합체(MAC) 활성의 효능을 나타낸 그래프이다. 올리고뉴클레오티드는 한주 동안 투여된다.
도 2는 C6 mRNA의 보정된 레벨에 비해 쥐에 각 양의 올리고 1010 (SEQ ID NO. 413)을 투여를 나타내는 그래프이다. 또한 상응하는 siRNA 구조의 결과를 보여준다.
설명한 바와 같이, 본 발명은 예컨대 포유류의 C6의 활성의 차단 또는 억제가 바람직한 길항제를 특징으로 한다. 여기에 참조되는 <<핵산 길항제>>란 핵산, 바람직하게는 하나 이상의 핵산 유사체를 기재된 바와 같이 포함하거나 이루어진다. <<RNA 길항제>>는 의도된 기능의 핵산 길항제가 특정한 RNA(s)의 발현을 감소 또는 차단하는 것이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명은 생성되는 C6의 양을 감소하는데 바람직한 포유류의 C6을 인코딩하는 핵산 분자의 기능을 감소시키는데 사용하는 올리고머 화합물(올리고머)을 제공한다. 안티센스 화합물이 예이다. 예컨대, 포유류의 C6을 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 특이적으로 혼성화하는 안티센스 화합물을 제공함으로써 이 목표가 완성된다. 여기서 사용되는 "표적 핵산" 및 "C6을 인코딩하는 핵산"이란 포유류의 C6을 인코딩하는 DNA, 이러한 DNA로부터 전사된 포유류의 C6을 인코딩하는 RNA(pre-mRNA 및 mRNA을 포함함) 및 이러한 RNA로부터 유도된 cDNA도 포함한다. 관심 있는 특정 포유류 C6은 표 3에 나타낸 cDNA에 의해 인코딩되는 인간 보체 성분 6 (C6)이다(SEQ ID NO: 1). 관심 있는 다른 포유류 C6은 각각 SEQ ID Nos. 402 및 403으로 나타내는 쥐 및 생쥐 C6 시퀀스이다.
여기에 사용되는 "올리코뉴클레오티드"란 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 그 유사체의 올리고머 또는 폴리머와 같은 발명 화합물의 성분을 말한다. 이것은 자연스럽게 일어나지 않는 부분을 갖는 올리고머 뉴클레오티드 뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 뉴클레오염기, 당 및 공유 인터뉴클레오시드 (백본(backbone)로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 형질 전환 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 예컨대 뉴클레아제(nuclease)의 존재하에 세포성 취입(cellular uptake)을 향상시키고, 핵산 표적에 대한 친화성을 향상시키고, 안정성을 증가시키는 것과 같은 바람직한 특성 때문에 본래의 형태가 종종 바람직하다. 따라서, 복수의 형태를 포함하는 본 발명에 따른 <<올리고머>>는 하나 이상의 그 유사체를 포함하는 구조 뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 뉴클레오염기, 당 및 공유 백본 결합체(covalent backbone linkages)를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
본 맥락에 있어서, "뉴클레오티드"란 1개의 탄소가 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 구아닌(G) 또는 우라실(U)과 같은 질소성 염기에 결합되고, 5개의 탄소가 인터뉴클레오시드 연결기(이하에 기재된 바와 같음) 또는 터미널기(이하에 기재된 바와 같음)에 결합되는 2-데옥시리보오스(DNA) 유닛 또는 리보오스 (RNA) 유닛을 의미한다. 따라서, 여기에 사용된 "뉴클레오티드"는 1개의 탄소가 A, C, T, G 또는 U와 같은 질소성 염기에 결합되고, 5개의 탄소 원자가 포스페이트기 또는 터미널기에 결합되는 리보오스 유닛을 포함하는 RNA 유닛(또는 모노머)을 포함한다. 유사하게, "뉴클레오티드"는 또한 1개의 탄소가 A, C, T, G 또는 U와 같은 질소성 염기에 결합되고, 5개의 탄소 원자가 포스페이트기 또는 터미널기에 결합되는 2-데옥시리보오스 유닛을 포함하는 DNA 유닛(또는 모노머)을 포함한다. "뉴클레오티드"는 또한 이하에 기재되는 RNA 및 DNA 모노머의 이형 또는 유사체를 포함한다.
"뉴클레오시드"는 1개의 탄소가 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 구아닌(G) 또는 우라실(U)과 같은 질소성 염기에 결합되는 2-데옥시리보오스(DNA) 유닛 또는 리보오스(RNA)를 의미한다. 따라서, 여기에 사용되는 "뉴클레오시드"는 1개의 탄소가 A, C, T, G 또는 U와 같은 질소성 염기에 결합되는 리보오스를 포함하는 RNA 유닛(또는 모노머)을 포함한다. 유사하게, "뉴클레오시드"는 또한 1개의 탄소가 A, C, T, G 또는 U와 같은 질소성 염기에 결합되는 2-데옥시리보오스를 포함하는 DNA 유닛(또는 모노머)를 포함한다. "뉴클레오시드"는 또한 여기에 제공되는 RNA 및 DNA 모노머의 변이 또는 유사체를 포함한다. 개별적인 뉴클레오시드는 자연적으로 발생하는 것과 같은 인터뉴클레오시드 연결기 및 합성 결합체에 의해 함께 연결되는 것으로 이해될 수 있다.
안티센스 올리고머
이론에 구속되지 않고, 그 표적 핵산을 갖는 올리고머 화합물의 특정 혼성화는 핵산의 일반적인 기능을 간섭한다고 믿는다. 특이적으로 그것과 혼성화하는 화합물에 의한 표적 핵산의 기능 조절은 일반적으로 "안티센스"라고도 한다. 간섭되는 DNA의 기능은, 예컨대 복제(replication) 및 전사(transcription)를 포함한다. 간섭되는 RNA의 기능은 예컨대 프로테인 번역(translation) 부분에 RNA의 전좌(translocation), RNA로부터 프로테인의 번역, RNA를 스플라이싱(splicing)하여 하나 이상의 mRNA 종을 수득하고, RNA에 관련되거나 가능해질 수 있는 촉매 활성과 같은 적어도 일부의 필수적인 기능을 포함한다. 표적 핵산 기능의 이러한 간섭의 전체 효과는 포유류의 C6 프로테인의 발현의 조절이다. 본 발명의 맥락에 있어서, "조절(modulation)"은 올리고머의 부재시 발현과 같은 적합한 통제군에 대한 유전자의 발현이 증가(자극) 또는 감소(억제)되는 것을 의미한다. 본 발명의 맥락에 있어서, 억제는 유전자 발현의 조절의 바람직한 형태이고, mRNA는 하나의 표적이다.
여기에 사용되는 "혼성화"는 일반적으로 상보적인 누클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기 사이에서 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴의 수소 결합 또는 역후그스틴 수소 결합(reversed Hoogsteen hydrogen bonding)을 말한다. 예컨대, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 이루는 상보적인 뉴클레오염기이다. 여기서 사용되는 "상보적인(Complementary)"이란 2개의 뉴클레오티드 사이에 정확한 페어링 능력을 말한다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드의 소정의 위치에 뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA 분자의 동일한 위치에서 뉴클레오티드와 수소 결합할 수 있는 경우에는, 올리고튜클레오티드 및 DNA 또는 RNA는 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 간주된다. 올리고뉴클레오티드 및 DNA 또는 RNA는 충분한 수의 각 분자에 상응하는 위치는 서로 수소 결합될 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때 서로 상보적이다. 따라서, "특이적으로 혼성 가능한" 및 "상보적인"은 올리고뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA 표적 사이에서 안정하고 특이적 결합이 발생하도록 충분한 정도의 상보성 또는 정확한 페어링을 나타내는데 사용되는 용어이다.
발명 화합물의 시퀀스는 특이적으로 혼성 가능한 표적 핵산의 것과 100% 상보적일 필요는 없다고 이해된다. 예컨대, 안티센스 화합물은 이 화합물의 표적 DNA 또는 RNA 분자에 결합이 표적 DNA 또는 RNA의 일반적인 기능을 간섭하여 유용성의 상실을 야기할 때 특이적으로 혼성 가능하고, 특이적 결합이 바람직한 조건하에서, 즉 생체내 분석 또는 약물 치료 요법의 경우 및 생체외 분석의 경우의 생리적 조건하에서, 분석이 행해지는 조건 하에서 표적이 아닌 시퀀스에 안티센스 화합물의 비특이적 결합을 회피하는 충분한 상보성 정도가 있다.
본 발명의 바람직한 올리고머는 일반적으로 생체외 및/또는 생체내 시험의 일부 경우에 인실리코 디자인을 통해 확인된다. 바람직한 발명 시퀀스가 상보적인 표적 부위는 "활성 부위"라고도 하고, 따라서 표적의 바람직한 부위이다. 따라서 본 발명의 다른 실시형태는 이들 활성 부위를 혼성화하는 화합물을 포함한다.
예컨대, 안티센스 화합물로서 특정 올리고머를 사용하는 것이 본 발명의 목적이다. "표적화(Targeting)" 안티센스 또는 특정 핵산에 대한 다른 발명 화합물은 다단계 프로세스이다. 표적화 프로세스는 핵산 시퀀스의 기능이 조절되는 것을 확인하는 것에서 보통 시작한다. 이것은, 예컨대 발현이 특정 장애 또는 질병 상태와 관련되는 세포의 유전자(또는 유전자로부터 전사되는 mRNA) 또는 병원균의 핵산 분자이어도 좋다. 본 발명에 있어서, 표적은 포유류의 C6 프로테인, 특히 표 3에 나타내는 인간, 쥐 및 생쥐 C6 시퀀스(SEQ ID NOs.1, 402 및 403)를 인코딩하는 핵산 분자이다. 또한, 표적화 프로세스는 부위 또는 이것에 한정되지 않고 열거되는 프로테인 발현의 검출 또는 조절을 발생시키는 안티센스의 상호작용에 대한 유전자 내의 부위들을 결정하는 단계를 포함한다.
추가적인 고려 사항은 바람직하지 않은 표적과 교차-혼성화하는, 용액에 2차 구조가 어렵게 추정되는 감소된 능력을 갖는 올리고머를 선택하는 것을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 올리고머는 독성이 감소된(reduced toxic) miRNA 유사 시드 부위 모티프 및 패신저-가닥 매개-표적화(passenger-strand mediated off-targeting)에서 선택된다. 본 발명에 따른 더욱 바람직한 올리고머는 예컨대 표 4A-4E 및 표 5A-5F에 나타낸다.
표 4A-4E를 참조하여, SEQ ID Nos. 2, 24, 46, 68, 90, 112, 134, 156, 178, 200는 선호를 감소시키기 위해 각 올리고머를 즉시 나타내는 시퀀스를 갖는 표 3 (SEQ ID NO:1)으로 나타내는 인간 C6 시퀀스의 바람직한 표적이다. 따라서, SEQ ID NO: 2는 부위를 표적화하기 위해 선호를 감소시키는데 바람직한 SEQ ID Nos: 3-23으로 나타내는 올리고머를 갖는 인간 C6의 바람직한 표적이다. 표 4A-4E를 다시 참조하여, 추가적으로 바람직한 표적은 EQ ID Nos: 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 및 249로 나타내는 시퀀스 및 각 표적을 바로 이하에 나타내는 RNA 및 역보체 버전(reverse complement versions )을 포함한다. 쥐 및 생쥐 C6은 동일하거나 매우 유사한 표적 부위를 갖는 것으로 예상된다.
소정의 실시형태에 대한 추가적인 바람직한 올리고머는 인간, 쥐 및 생쥐 시퀀스 사이에서 100% 시퀀스 동일성을 나타낸다(예컨대, 표 5A-5F; SEQ ID NO: 292). 인식된 바와 같이 이러한 올리고머는 실질적인 불일치 문제 또는 각 포유류에 대해 고안되는 다수의 올리고머를 가질 필요 없이 인간, 쥐 및 생쥐에 사용될 수 있다.
본 발명의 더욱 특정한 올리고머는 표적에 충분히 상보적인, 즉 충분히 혼성되고 충분한 특이성을 가져 목적으로 하는 결과를 제공하는 것이다. 바람직하게는 바람직한 효과는 예컨대 프로테인을 모니터하는 항-C6 항체를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 및/또는 면역학적 접근에 의해 결정되는, 상응하는 C6 mRNA의 양의 감소 또는 총 억제를 나타내는, 인간, 쥐 또는 생쥐 C6 프로테인과 같은 포유류의 C6의 발현의 감소 또는 총 억제이다.
하나의 PCR 접근에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 관심 있는 기관으로부터 추출된 cDNA 또는 게놈의 DNA로부터 상응하는 DNA 시퀀스를 확대하는 PCR 반응에 사용을 위해 고안될 수 있다. 적합한 cDNA의 예로는 표 1에 나타낸 인간 C6 시퀀스이다(SEQ ID NO: 1). PCR 프라이머 및 PCR 복제로 고안된 방법은 일반적으로 기술로 알려져 있고, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.) 이하 "Sambrook"에 기재되었다. 또한 Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); 및 Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)를 참조한다. PCR의 공지된 방법은 그것에 한정되지 않지만 짝지어진 프라이머, 내포된 프라이머(nested primers), 단일 특정 프라미어, 퇴화한 프라이머(degenerate primers), 유전자-특이 프라이머, 벡터-특이 프라이머, 부분적-미스매치 프라이머(partially-mismatched primers) 등을 포함한다. qPCR을 행하는 방법을 실시예 부분에 기재한다.
필요에 따라, 특정 올리고머의 추가적인 기능성은 총 용혈((CH50) 분석)로 알려진 것을 사용하여 시험되고, 선택적으로 수량화될 수 있다. 이 접근에 있어서, 플라즈마, 혈액 또는 적합한 생물학적 샘플은 하나 이상의 올리고머를 투여해온 포유류로부터 분리된 것이다. 분석은 항적혈구 항체로 코팅된 양 적혈구의 표준 현탁액의 50%가 분해되는 시험 샘플의 능력을 측정한다. 총 보체 활성은 어느 보체가 결함이 있다면 비정상적이라고 한다. 예컨대, Kabat, E. A and Mayer, M. M. (1961) Complement and Complement Fixations. In: Experimental Immunochemistry, 2nd Edition, Charles C. Thomas, Springfield, IL. p.133-240를 참조한다.
다른 접근에 있어서, MAC 형성은 필요에 따라 Ramaglia, V. et al. (2007) J. Neurosci . 27:7663에 기재된 면역학적 접근을 사용하여 검출 및 수량화될 수 있다.
본 발명의 추가적인 바람직한 올리고머는 인간, 쥐 또는 마우스 C6을 인코딩하는 mRNA를 차단 또는 감소하는 우수한 능력을 보여줄 것이다. 더욱 구체적으로, 이러한 올리고머는 적합한 PCR 분석, 바람직하게는 qPCR에 의해 결정되는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%에서 약 100%까지 인간, 쥐 또는 생쥐와 같은 포유류의 특정 C6 mRNA의 레벨을 감소시킬 수 있다. 추가적인 바람직한 올리고머는 설치류와 같은 포유류 호스트에 실질적으로 무독성이다. 즉, 올리고머의 치료적 양이 적합한 기간(예컨대, 며칠 또는 몇주 동안 매일 약 1 내지 약 10mg/kg IP) 동안 포유류에 투여되고, 포유류로부터 간을 제거하여 핵산, 일반적으로 RNA의 원료로서 사용하는 분석의 코스에 걸쳐 그들은 포유류를 죽이지 않는다. 핵산은 표준 절차를 사용하여 간으로부터 제조되고, 제조자에 의해 추천된 Roche Lightcycler 480 및 universal probes를 사용하여 qPCR이 C6 mRNA 레벨을 측정한다. 실례가 되는 분석은 몇몇의 발명 올리고머가 상대적으로 비독성이고 적어도 약 20%, 30%, 40%, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 적어도 약 80% 이상 약 90%, 95%까지 약 99% 또는 100%까지 생쥐 C6 mRNA를 감소시킬 수 있는 실시예 1에 제공된다. <<올리고머 검증 시험>>에 참조는 무독성이고 생체내 C6 mRNA 발현을 억제하는 능력을 확인하는 특정 분석을 말한다.
올리고머의 바람직한 용도는 MAC의 형성과 관련된다고 알려진 또는 의혹이 있는 신경병증의 격렬함을 예방, 치료 또는 감소하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 적합한 올리고머 하나 또는 조합을 제공하지만, 일반적으로 바람직한 올리고머는 약 10 내지 약 50 뉴클레오염기의 길이, 예컨대 약 12 내지 약 45 뉴클레오염기의 길이, 약 15 내지 약 40 뉴클레오염기의 길이, 약 16 내지 약 35 뉴클레오염기의 길이와 많은 용도로 유용한 약 18 내지 약 30 뉴클레오염기의 길이의 것이다. 바람직하게는, 올리고머는 총 10-50 뉴클레오염기, 예컨대 약 12 내지 약 45 뉴클레오염기의 길이, 약 15 내지 약 40 뉴클레오염기의 길이, 약 16 내지 약 35 뉴클레오염기의 길이와 많은 용도에 유용한 약 18 내지 약 30 뉴클레오염기의 길이의 인접한 뉴클레오염기 시퀀스를 포함하고, 상기 인접한 뉴클레오염기는 관심 있는 포유류의 C6을 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 적어도 80% 시퀀스 동일성, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 시퀀스 동일성이 있다. 관심 있는 특정 시퀀스는 SEQ ID NO: 1로 나타내는 인간 C6, SEQ ID NO: 402로 나타내는 쥐 C6 및 SEQ ID NO: 403으로 나타내는 생쥐 C6이다(또한, SEQ ID Nos: 1, 402 및 403의 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체). <<자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체>>는 예컨대 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 및 여기에 설명되는 혼성화 기술과 같은 공지된 분자 생물학적 기술의 용도를 확인할 수 있다.
한쌍의 핵산 사이의 상동성의 exent는 전략 하나 또는 조합에 의해 결정될 수 있다. 하나의 접근에 있어서, 퍼센트 시퀀스 동일성은 관찰에 의해 결정된다. 비교용 시퀀스의 정렬 방법은 기술에 잘 알려져 있다. 따라서, 어떤 2개의 시퀀스 사이에 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 완료될 수 있다. 이러한 수학적 알고리즘의 한정되지 않는 예는 Myers and Miller의 the algorithm (1988) CABIOS 4:11-17; Smith et al.의 the local homology algorithm (1981) Adv. Appl . Math . 2:482; Needleman and Wunsch의 the homology alignment algorithm (1970) J. Mol . Biol . 48:443-453; Pearson and Lipman의 the search-for-similarity-method (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . 85:2444-2448; Karlin and Altschul의 the algorithm (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5877이다.
수학적 알고리즘의 컴퓨터 실행은 시퀀스의 비교에 사용되어 시퀀스 동일성을 결정할 수 있다. 이러한 실행은 그것에 한정되지 않지만 이하를 포함한다: CLUSTAL in the PC/Gene 프로그램 (available from Intelligenetics, Mountain View, Calif.); the ALIGN 프로그램 (Version 2.0); the ALIGN PLUS 프로그램 (버전 3.0, copyright 1997); 및 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package of Genetics Computer Group, 버전 10 (Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, Calif., 92121, USA로부터 이용됨). Wisconsin Genetics Software Package의 버전 10에 사용되는 측정 행렬(scoring matrix)은 BLOSUM62 (Henikoff and Henikoff (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915 참조)이다. 이 프로그램에 사용하는 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하여 행해질 수 있다. 다른 정렬의 고려는 당업자의 기술 내에서다. 또한, U.S. Pat No. 7,378,499를 참조하고 여기에 인용한다.
다른 언급이 없다면, 여기에 제공되는 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스 동일성/유사성 값은 디폴트 파라미터를 갖는 GAP 또는 어느 동등한 프로그램을 사용하여 얻어진 값을 말한다. "동등한 프로그램"에 의하면, 어느 시퀀스 비교 프로그램은 문제의 2개의 시퀀스에 대해 바람직한 프로그램에 의해 생성되는 대응 정렬과 비교할 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 매칭 및 동일한 퍼센트 시퀀스 동일성을 발생시키는 것을 의도한다. 더 많은 정보를 위해 Needleman and Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:443-453를 참조한다.
본 발명의 목적을 위해서, 여기에 기재되는 인간, 쥐 및 생쥐 C8에 대한 퍼센트 시퀀스 동일성의 결정에 대한 뉴클레오티드 또는 프로테인 시퀀스의 비교는 Wisconsin Genetics Software Package (버전 10 이후)의 GAP 프로그램 또는 어느 동등한 프로그램을 사용하여 만드는 것이 바람직하다. 뉴클레오티드 시퀀스의 GAP 분석에 대해서, 50의 GAP 중량 및 3의 길이가 사용되었다.
여기에 사용되는 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 시퀀스의 내용 중 "시퀀스 동일성" 또는 "동일성"은 특정 비교 윈도우에 대한 최대 대응성을 조정할 때 동일한 2개의 시퀀스의 잔기를 참조로 한다. 시퀀스 동일성의 퍼센트가 프로테인과 관련하여 사용되는 경우에는, 보존적 아미노산 치환에 의해 동일하지 않고 종종 다른 잔기 위치를 인식하고, 아미노산 잔기는 동일한 화학적 특성(예컨대, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기와 치환되어 분자의 관능적 특성은 변하지 않는다. 시퀀스가 보존적 치환과 다른 경우에는, 퍼센트 시퀀스 동일성은 치환의 보전적 특성을 정정하기 위해 보다 많게 조절되어도 좋다. 이러한 보존적 치환에 의해 다른 시퀀스는 "시퀀스 동일성" 또는 "동일성"을 갖는다고 한다. 이 조절을 만드는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일반적으로 이것은 모두 미스매치된 것보다 부분적으로 보전적 치환을 점수를 매겨 퍼센트 시퀀스 동일성을 증가시키는 것을 포함한다. 따라서, 예컨대 동일한 아미노산에 스코어 1을 주고, 비보존적 치환은 스코어 0을 주고, 보존적 치환은 스코어 0 내지 1을 준다. 보존적 치환의 스코어는 예컨대 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif.)으로 시행됨으로써 산출된다.
여기에 사용된 "시퀀스 동일성의 퍼센트"란 두개의 최적으로 정렬된 시퀀스와 비교 윈도우를 비교함으로써 결정된 값을 의미하고, 비교 윈도우의 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 부분은 2개의 시퀀스의 최적의 정렬된 참조 시퀀스(첨가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 첨가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함해도 좋다. 퍼센트는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 시퀀스 모두에 발생하는 위치의 수를 결정하여 매치된 위치의 수를 얻고, 매치된 위치의 수를 비교의 윈도우에서의 위치의 총수로 나누어, 그 결과를 100으로 곱하여 시퀀스 동일성의 퍼센트를 얻음으로써 산출된다.
뉴클레오티드 시퀀스가 실질적으로 동일한 다른 증거는 두개의 분자가 긴축된 조건(stringent conditions) 하에서 서로 혼성되는 것이다. 일반적으로 긴축된 조건은 이온 강도 및 pH가 확인된 특정 시퀀스에 대해 열용융점 (Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 그러나, 긴축된 조건은 여기에 다른 자격이 있는 바람직한 긴축도(degree of stringency)에 근거하여 약 1℃ 내지 약 20℃의 범위의 온도를 포함한다. 긴축된 조건 하에서 서로 혼성되지 않은 핵산은 그들이 인코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 경우에 여전히 실질적으로 동일하다. 이것은 예컨대 핵산의 복제가 유전자 코드에 의해 허용된 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 만들어진 경우에 발생해도 좋다. 2개의 핵산 시퀀스가 실질적으로 동일한 하나의 증거는 제 1 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드가 제 2 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 면역적으로 교차 반응성이 있는 경우이다.
앞선 올리고머의 하나의 실시형태에 있어서, 근접한 뉴클레오염기 시퀀스는 관심 있는 포유류의 C6, 특히 SEQ ID NO:1을 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 대하여 약 1 또는 약 2 미만으로 미스매치된 것과 같은 약 3 미만을 포함한다. 예컨대, 근접한 뉴클레오염기 시퀀스는 관심 있는 포유류를 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 단일 미만으로 미스매치되는 것을 포함할 수 있다. 또한, 근접한 뉴클레오염기 시퀀스는 관심 있는 포유류의 C6을 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 미스매치되지 않는(예컨대, 모두 상보적임) 것을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 올리고머의 뉴클레오염기 시퀀스는 근접한 뉴클레오염기 시퀀스로 이루어진다.
본 발명의 실행은 여기에 구체화되는 인간, 쥐 및 생쥐 시퀀스를 포함하는 포유류의 C6의 넓은 범위와 양립될 수 있다. 이러한 프로테인의 핵산 및 프로테인 시퀀스는 U.S. National Center for Biotechnology Information ((NCBI)-Genetic Sequence Data Bank (Genbank)의 제품이 이용 가능하다. 특히, 시퀀스 목록은 Genbank at the National Library of Medicine, 38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, Md. 20894로부터 얻을 수 있다. Genbank는 인터넷으로도 이용가능하다. Genbank의 상세에 대해 일반적으로 Benson, D. A. et al. (1997) Nucl . Acids . Res. 25: 1을 참조한다. 구체적으로 참조되지 않는 프로테인 및 핵산 시퀀스는 여기에 기재된 Genbank 또는 다른 소스에서 발견될 수 있다. 예컨대, 쥐 C6 시퀀스를 기재하고 있는 (NM_176074), 생쥐 C6 시퀀스를 기재하도 있는 (NM_016704)를 참조한다.
다른 올리고머 실시형태는 본 발명의 범위내에 있다. 예컨대, 하나의 실시형태에 있어서, 올리고머의 근접하는 뉴클레오염기 시퀀스는 상보적인 인간, 쥐 또는 생쥐 C6 표적 RNA가 이중으로 형성된 경우에, 예컨대 RNasaH를 리크루팅할 수 있는, 적어도 6, 예컨대 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 약 30-32 뉴클레오염기 잔기의 근접한 시퀀스를 포함한다. <<RNase H를 리쿠르팅함>>이란 효소가 효소의 활성을 검출 및 수량화할 수 있는 분석 하나 또는 조합에 의해 결정되는 복합체와 접촉하는 것을 의미한다. 실시예의 방법에 의해, RNase H는 RNA:DNA 이중의 RNA 가닥을 쪼개는 세포의 엔도뉴클레아제(cellular endonuclease)이다. RNase H의 활성은, 따라서 RNA 표적의 쪼갬의 결과이고, 그 때문에 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드의 효능의 억제를 매우 향상시킨다. RNA 표적의 쪼갬은 겔 전기 영동(gel electrophoresis)에 의해 일반적으로 검출될 수 있다.
따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 올리고머의 근접한 뉴클레오염기 시퀀스는 상보적인 포유류의 C6 표적이 이중으로 형성될 때 RNasaH를 리쿠르팅할 수 있는 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10 뉴클레오염기 잔기와 같은 적어도 7 인접한 서브시퀀스를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 근접한 서브시퀀스는 상보적인 포유류의 C6 표적이 이중으로 형성될 때 RNasaH를 리쿠르팅할 수 있는 적어도 12 뉴클레오염기 또는 적어도 14 뉴클레오염기의 길이와 같은, 14, 15 또는 16 뉴클레오염기 잔기와 같은 적어도 9 또는 적어도 10 뉴클레오염기의 길이이다.
본 발명에 사용되는 추가적인 바람직한 올리고머는 의도로 하는 용도에 적합한 길이일 것이다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 올리고머는 약 8 내지 약 50 뉴클레오염기, 약 9 내지 약 50 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드, 약 9 내지 약 40 뉴클레오염기, 약 10 내지 약 35 뉴클레오염기, 약 10 내지 약 22 뉴클레오염기, 예컨대 약 12 내지 약 18 뉴클레오염기, 약 14, 약 15 또는 약 16 뉴클레오염기, 약 10, 11, 12, 13 또는 약 14 뉴클레오염기의 길이를 갖는다.
설명된 바와 같이, 뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 일반적으로 헤테로환 염기이다. 이러한 헤테로환 염기의 2개의 가장 일반적인 종류는 푸린 및 피리미딘이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유 결합된 포스페이트기를 더 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 이들 뉴클레오시드에 대해서, 포스페이트기는 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 부위에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 형성에 있어서, 포스페이트기는 근접한 뉴클레오시드와 서로 공유 결합되어 직쇄상 중합성 화합물을 형성한다. 결과적으로 이 직쇄상 중합성 화합물의 상대적인 말단은 더 연결되어 원형 구조를 형성하지만, 오픈된 직쇄상 구조가 일반적으로 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 포스페이트기는 올리고뉴클레오티드의 인터뉴클레오시드 백본을 형성하는 것으로 일반적으로 언급된다. RNA 및 DNA의 보통의 연결 또는 백본은 3' 내지 5' 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합이다.
앞선 올리고머가 소정의 용도에 바람직하지만, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 유사체를 갖는 올리고머의 용도는 종종 바람직할 수 있다(여기서, 종종 올리고뉴클레오티드 <<모방체(mimetics) 또는 유도체>>라고 언급됨). 따라서, 하나의 발명의 실시형태에 있어서, 본 발명의 올리고머는 하나 이상의 비뉴클레오염기 화합물 단독 또는 변형된 백본 또는 비자연적 인터뉴클레오시드 결합을 갖는 그 조합을 포함할 것이다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 변형된 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드는 백본에 포스포러스 원자를 보유하는 것 및 백본에 포스포러스 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 이 명세서의 목적을 위해서, 및 이 분야에 참조된 바와 같이 인터뉴클레오시드의 포스포러스 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오시드로 간주될 수 있다.
실례적인 변형된 올리고뉴클레오티드 백본은 예컨대, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로-디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노알킬-포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 보통의 3'-5' 결합, 2'-5' 결합 유사체를 갖는 보라노포스페이트 및 하나 이상의 인터뉴클레오티드 결합이 3' 내지 3', 5' 내지 5' 또는 2' 내지 2' 결합인 반대 극성을 갖는 것을 들 수 있다. 반대 극성을 갖는 바람직한 올리고뉴클레오티드는 3' 최대 인터뉴클레오티드 결합에 단일 3' 내지 3' 결합, 즉 염기가 없어도 좋은 단일 반대 뉴클레오시드 잔기를 포함한다(뉴클레오염기를 잃거나 그 대신 히드록실기를 가짐). 각종 염, 혼합염 및 유리산 형태도 포함된다. 예컨대, 이 조성물을 제조 및 사용하는데 관련된 공보의 U.S. Pat. Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697, 7,335,764, 및 5,625,050을 참조한다.
따라서, 하나의 발명의 실시형태에 있어서, 본 발명의 올리고머는 전체가 포스포로티오릴에이트인 백본을 갖는다.
포스포러스 원자를 포함하지 않는 추가적인 변형된 올리고뉴클레오티드 백본은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 인터뉴클레오시드 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 인터뉴클레오시드 결합 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로환 인터뉴클레오시드 결합에 의해 형성된다. 이들은 모르폴리노 결합(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 것; 실록산 백본; 술피드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분부를 갖는 것을 포함한다. 예컨대, 이 조성물을 제조 및 사용하는데 관련된 공보의 U.S. Pat. Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269, 7,335,764, and 5,677,439를 참조한다.
다른 올리고뉴클레오티드 유사체에 있어서, 당과 인터뉴클레오시드 결합, 즉 뉴클레오티드 유닛의 백본은 다른 기로 대체된다. 염기 유닛은 적당한 핵산 표적 화합물로 혼성화가 유지된다. 이러한 올리고머 화합물은 펩티드 핵산(PNA)이라고도 한다. PNA 화합물에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 당-백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 뉴클레오염기는 백본의 아미드 부분의 아자질소 원자를 보유하고, 직접적으로 또는 간접적으로 바운드된다. 예컨대, U.S. Pat. Nos. 5,539,082; 5,714,331; 5,719,262, and Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500를 참조한다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고머 및 헤테로원자 백본을 갖는 올리고뉴클리오시드, 특히 상기 참조된 U.S. Pat. No. 5,489,677의 --CH2--NH--O--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2-- [메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로도 알려짐], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- and --O--N(CH3)--CH2--CH2-- [본래의 포스포디에스테르 백본은 --O--P--O--CH2--로 나타냄] 및 상기 참조된 U.S. Pat. No. 5,602,240의 아미드 백본이다. 또한, 예컨대 상기 참조된 U.S. Pat. No. 5,034,506의 모르폴리노 백본 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명에 따른 변형된 올리고머는 하나 이상의 치환된 당 부분을 포함할 수 있다. 실례가 되는 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 이하 중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 또는 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐이어도 좋다. 특히 바람직하게는 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, and O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2이고, 식 중 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 하나 이하 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기(cleaving group), 리포터기(reporter group), 인터칼레이터( intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 향상시키는 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 향상시키는 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O--CH2CH2OCH3, 2'-O--(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려짐) (Martin et al., Helv . Chim . Acta, 1995, 78, 486-504) 즉, 알콕시알콕시기를 들 수 있다. 더욱 바람직한 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 이하 실시예에 기재된 2'-DMAOE라고도 알려진 a O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로서 기술에 알려짐), 즉, 이하 실시예에 기재되는 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2를 들 수 있다.
바람직한 변형은 2'-히드록실기가 당 환의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어 이환성 당 부위를 형성하는 잠금 핵산(LNAs)을 포함한다. 결합은, 예컨대 n이 1 또는 2인 2' 산소원자 및 4' 탄소원자를 브릿징하는 메텔린 (--CH2--)n 이다. LNAs 및 그 제조는 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기재되었다.
추가적으로 적합한 LNA 모노머(때로 "잠금 핵산 모노머", "잠금 핵산 잔기", "LNA 모노머" 또는 "LNA 잔기"라고도 함)는 예컨대, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475, U.S. Patent Publication No. 2007/0191294, WO 03/095467, U.S. Pat. Nos. 6,670,461, 6,794,499, 7,034,133, 7,053,207 (L-Ribo-LNA), 7,060,809, and 7,084,125 (Xylo-LNA)에 기재된 이환성 뉴클레오티드 유사체를 말한다. LNA 모노머는 그 화학식에 대해 정의되어도 좋다. 따라서, 여기에 사용되는 "LNA 모노머"의 예는 이하 구조를 갖는다:
Figure pct00001

상기 식에서, X는 O, S and NRH--로 이루어진 군으로부터 선택되고, RH는 H 또는 C1 -6-알킬과 같은 알킬; Y는 (--CH2)r이고, r은 1-6의 정수이고; X=O일때 r은 2가 아닌 단서를 갖는다. Z 및 Z* 는 인터뉴클레오시드 결합기, 터미널기 및 보호기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 부재이거나 선택되고; B는 뉴클레오염기이다. 하나의 실시형태에 있어서, r=1 및 X는 0이고, 각각의 Z, Z* 는 인터뉴클레오시드 결합기, 터미널기 및 보호기로부터 독립적으로 부재이거나 선택되고, B는 뉴클레오염기이다. 앞선 LNA 모노머는 예컨대 U.S. Patent Publication 2007/0191294에 기재된 바와 같은 베타-D 형태, 알파-L-형태일 수 있다.
"LNA 모노머"에는 하나 이상의 뉴클레오티드가 아미노-LNA, 티오-LNA 또는 둘다로 치환된 올리고머들도 포함된다. <<아미노-LNA>> 및 <<티오-LNA>>에 의해 펜토오스환의 산소 원자가 각각 질소 또는 황원자로 대체되는 상기 식에 나타낸 LNA 모노머를 의미한다. 이러한 LNA 모노머를 제조 및 사용하는 방법은 , 예컨대 US Pat. Nos. 7,060,809; 7,034,133; 6,794,499; 6,670,461에 기재되고, 여기에 참조로 인용된다. 특정 치환은 C- 또는 T-아미노-LNA; 또는 C- 또는 T-티오 LNA이다. 소정의 아미노-LNA 및 티오-LNA 유사체는 리보테스크 A/S 제품이 유용하다.
"C1 -6-알킬"은 직쇄상 또는 분기상 포화 탄화수소쇄를 의미하고, 여기서 최장쇄는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸 및 헥실과 같은 1 내지 6의 탄소원자를 갖는다. 분기상 탄화수소쇄는 탄화수소쇄로 어느 탄소가 치환된 C1 -6-알킬을 의미하는 것이다.
터미널기의 구체예로는 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, Prot-O--, Act-O--, mercapto, Prot-S--, Act-S--, C1 -6-알킬티오, 아미노, Prot-N(RH)--, Act-N(RH)--, 모노- 또는 디(C1-6-알킬)아미노, 선택적으로 치환되는 C1 -6-알콕시, 선택적으로 치환되는 C1 -6-알킬, 선택적으로 치환되는 C2 -6-알케닐, 선택적으로 치환되는 C2 -6-알케닐옥시, 선택적으로 치환되는 C2 -6-알키닐, 선택적으로 치환되는 C2-6-알키닐옥시, 보호된 모노포스페이트를 포함하는 모노포스페이트, 보호된 모노티오포스페이트를 포함하는 모노티오포스페이트, 보호된 디포스페이트를 포함하는 디포스페이트, 보호된 디티오포스페이트를 포함하는 디티오포스페이트, 보호된 트리포스페이트를 포함하는 트리포스페이트, 보호된 트리티오포스페이트를 포함하는 트리티오포스페이트로 이루어진 기로부터 선택된 터미널기를 들 수 있고, Prot은 --OH, --SH and --NH(RH)에 대한 보호기이고, Act는 --OH, --SH, and --NH(RH)이고, RH는 수소 또는 C1 -6-알킬이다.
본 내용에 있어서, "C1 -4-알킬"이란 직쇄상 또는 분기상 포화 탄화수소쇄를 의미하는 것이고, 최장쇄는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸과 같은 1 내지 4의 탄소원자를 갖는다. 분기상 탄화수소쇄는 탄화수소쇄로 어느 탄소가 치환된 C1 -4-알킬을 의미한다.
여기서 사용되는 "C1 -6-알콕시"는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜톡시, 이소펜톡시, 네오펜톡시 및 헥옥시(hexoxy)와 같은 C1 -6-알킬-옥시를 의미하는 것이다.
본 발명의 내용에 있어서, "C2 -6-알케닐"은 2 내지 6 탄소 원자를 갖고, 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 직쇄상 또는 분기상 탄화수소기를 의미하는 것이다. C2-6-알케닐기의 실례로는 알릴, 호모-알릴, 비닐, 크로틸, 부테닐, 부타디에닐, 펜테닐, 펜타디에닐, 헥세닐 및 헥사디에닐을 들 수 있다. 불포화 위치(이중 결합)는 탄소쇄를 따라 어느 위치에 있어도 좋다.
본 발명의 내용에 있어서, "C2 -6-알키닐"은 2 내지 6의 탄소원자를 포함하고, 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 직쇄상 또는 분기상 탄화수소기를 의미하는 것이다. C2 -6-알키닐기의 실례로는 아세틸렌, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐 및 헥시닐을 들 수 있다. 불포화 위치(삼중 결합)는 탄소쇄를 따라 어느 위치에 있어도 좋다. 하나 이상의 결합은 불포화되어 당업자에 잘 알려진 바와 같이 "C2 -6-알키닐"은 디-인(di-yne) 또는 에네디-인(enedi-yne)이어도 좋다.
--OH 및 --SH기에 대한 보호기의 예로는 치환된 트리틸, 예컨대 4,4'-디메톡시트리틸옥시 (DMT), 4-모노메톡시트리틸옥시 (MMT); 트리틸옥시, 선택적으로 치환된 9-(9-페닐)크산테닐옥시(xanthenyloxy) (pixyl), 선택적으로 치환된 메톡시테트라히드로-피라닐옥시 (mthp); 실릴옥시, 예컨대 트리메틸실릴옥시 (TMS), 트리이소프로필실릴옥시 (TIPS), tert-부틸디메틸실릴옥시 (TBDMS), 트리에틸실릴옥시, 페닐디메틸실릴옥시; tert-부틸에테르; 아세탈 (2개의 히드록시기를 포함함); 아크릴옥시, 예컨대 아세틸 또는 할로겐-치환 아세틸, 예컨대 클로로아세틸옥시 또는 플루오로아세틸옥시, 이소부티릴옥시, 피발로일옥시, 벤조일옥시 및 치환 벤조일, ㅁ메톡시메틸옥시 (MOM), 벤질 에테르 또는 치환 벤질 에티르, 예컨대 2,6-디클로로벤질옥시 (2,6-Cl2Bzl)를 들 수 있다. 또한, Z 또는 Z*가 히드록실이면 그들은 선택적으로 연결기를 통해 고체 지지체에 부착됨으로써 보호되어도 좋다.
상기 기재된 바와 같이, 인터뉴클레오시드로 작용하는 Z 및 Z*는 화합물 내에 LNA 모노머의 실제 위치에 따라 인터뉴클레오시드 연결기, 터미널기 및 보호기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 부재이거나 또는 선택된다. 실시형태에 있어서, LNA 모노머는 3' 말단에 위치하고, Z는 터미널기이고, Z*는 인터뉴클레오시드 결합인 것으로 이해될 수 있다. 실시형태에 있어서, LNA 모노머는 5' 말단에 위치하고, Z는 부재이고, Z*는 터미널기이다. 실시형태에 있어서, LNA 모노머는 뉴클레오티드 시퀀스 내에 위치하고, Z는 부재이고, Z*는 인터뉴클레오시드 결합이다.
다른 적합한 터미널기, 보호기 및 본 발명에 사용되는데 적합한 특정 LNA 모노머의 예로는 예컨대 U.S. Pat. Publ. 2007/0191294에서 발견될 수 있고, 여기서 참조로 인용된다.
본 발명에 사용되는 다른 뉴클레오티드 유사체는 2'-메톡시 (2'-O--CH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴 (2'--CH2-CH=CH2), 2'--O-알릴 (2'-O--CH2-CH=CH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 들 수 있다. 2'-변형은 아라비노 (업) 위치 또는 리보 (다운) 위치이어도 좋다. 바람직한 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사한 변형은 올리고뉴클레오티드에 다른 위치, 특히 3' 터미널 뉴클레오티드 상에 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 내에 당의 3' 위치 및 5' 터미널 뉴클레오티드의 5' 위치에서 만들어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 펜토프라노실 당 대신에 시클로부틸 부위와 같은 당 모방체(당 유도체)를 가져도 좋다. 예컨대, 이러한 유사체를 제조 및 사용에 관련된 공보의 U.S. Pat. Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 7,335,764, 5,792,747; 및 5,700,920을 참조한다.
본 발명의 범위내에 올리고머는 하나 이상의 뉴클레오염기 변형, 치환, 및/또는 첨가를 갖는 것을 포함해도 좋다. 여기에 사용되는 "변형되지 않은" 또는 "본래의" 뉴클레오염기는 푸린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실(U)를 포함한다. 변형된 뉴클레오염기는 다른 합성 및 본래의 뉴클레오염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴(hypoxanthine), 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 피리미딘 염기의 5-프로피닐 (--C=C--CH3) 우라실 및 시토신 및 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (pseudouracil), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 들 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오염기는 삼환 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 페녹사진 시티딘 (예컨대, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도 [3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 들 수 있다. 변형된 뉴클레오염기는 푸린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로환, 예컨대 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 것을 들 수 있다. 또한, 뉴클레오염기는 U.S. Pat. No. 3,687,808, The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering에 기재된 것, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al.에 의해 기재된 것, Angewandte Chemie , International Edition, 1991, 30, 613, 및 Sanghvi, Y. S.에 의해 기재된 것, Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993에 기재된 것을 들 수 있다.
다수의 발명의 용도에 대해서, 뉴클레오시드 유사체가 적어도 메틸화 시토신을 포함하여 면역 시스템의 원하지 않는 자극을 제거 또는 차단하는 올리고머를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 범위내에서 추가적인 올리고머는 적어도 하나의 비환식(acyclic) 뉴클레오티드를 갖는 것을 포함하고(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4), 바람직하게는 3',4''-세코(seco) 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 Neilson, P. Et al. (1994) NAR 22:703; 및 Neilson, P. Et al. (1995) Bioorganic & Med . Chem . (1995) 19-28에 기재된 것을 들 수 있다. 이러한 비환식 뉴클레오티드의 더욱 구체예는 3',4'-세코티미딘 (seco-RNA-티미딘), 3',4'-세코시토신 (seco-RNA-시토신), 3',4'-세코아데닌 (seco-RNA-아데닌) 및 3',4'-세코구아닌 (seco-RNA-구아닌)을 들 수 있다. 3',4'-세코시토신 (seco-RNA-시토신)기의 구조는 이하에 제공된다:
Figure pct00002

3',4'-세코 핵산을 제조 및 사용하는 추가적인 물질은 Ribotask A/S (Odense, DK)로부터 입수했다. 이론에 한정되지 않고, 세코-RNA의 사용은 적어도 부분, siRNA와 같은 핵산의 효소적 부분에 따른 것을 포함하는 본 발명의 소정의 조성물의 이용의 도울 수 있다고 믿어진다.
소정의 앞선 뉴클레오염기는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 유용할 수 있다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 푸린을 들 수 있다. 5-메틸시토신 치환기는 0.6-1.2℃에서 핵산 2중 안정성이 증가되는 것을 보여주고(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 염기 치환기가 현재 바람직하고, 2'-O-메톡시에틸 당 및 LNA와 같이 여기에 기재된 소정의 다른 변형체와 결합되는 경우에 더욱 특히 바람직하다. 예컨대, U.S. Pat. Nos. 3,687,808, 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 7,335,764, 5,750,692 및 5,681,941를 참조한다.
주어진 용도로 앞선 발명의 올리고머의 하나 또는 조합을 사용하는 것이 바람직하지만, 이러한 조성물은 의도된 용도에 적합하도록 바람직하게 더 변형할 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 특정 올리고머는 하나 이상의 부위와 화학적으로 연결되거나 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분산 또는 세포성 취입을 향상시키는 콘쥬게이트할 수 있다. 본 발명의 화합물은 따라서, 1차 또는 2차 히드록실기와 같은 관능기와 공유 결합된 콘쥬게이트기를 포함해도 좋다. 본 발명의 콘쥬게이트기는 인터칼레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약동학적 특성을 향상시키는 기, 및 올리고머의 약력학적 특성을 향상시키는 기를 포함한다. 일반적인 콘쥬게이트기는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오로세인, 로다민, 쿠마린, 및 염료를 포함한다. 본 발명의 내용에 있어서, 약동학적 특성을 향상시키는 기는 올리고머 취입을 향상시키고, 분해에 대한 올리고머 저항을 향상시키고, 및/또는 RNA와 시퀀스-특이 혼성화를 강화하는 기를 포함한다. 본 발명의 내용에 있어서, 약력학적 특성을 향상시키는 기는 올리고머 취입, 분해, 대사 또는 배설을 향상시키는 기를 포함한다. 대표적인 콘쥬게이트기는 예컨대 국제 특허 출원 PCT/US92/09196에 기재된다. 콘쥬게이트 부위는 그것에 한정되지 않지만, 콜레스테롤 부위 (Letsinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜산 (Manoharan et al., Bioorg . Med . Chem . Let., 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르, 예컨대 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan et al., Ann . N.Y. Acad . Sci ., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg . Med . Chem. Let ., 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl . Acids Res ., 1992, 20, 533-538), 지방족 쇄, 예컨대 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질, 예컨대 디-헥사데실-렉-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-클리세로-3-H-포스포네이트 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett ., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl . Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌글리콜 쇄 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett ., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 부위 (Mishra et al., Biochim . Biophys . Acta , 1995, 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 부위 (Crooke et al., J. Pharmacol . Exp . Ther ., 1996, 277, 923-937)와 같은 지질 부위를 들 수 있다. 여기에 기재된 안티센스 화합물을 포함하는 본 발명의 화합물은 활성 약 물질, 예컨대 아스피린, 와파린 (warfarin), 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜 (suprofen), 펜부펜 (fenbufen), 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카프로펜, 단실라코신 (dansylsarcosine), 2,3,5-티오요오드벤조산, 플루페나미산(flufenamic acid), 폴린산(folinic acid), 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신(indomethicin), 항균성 또는 항생제에 콘쥬게이트되어도 좋다. 올리고뉴클레오티드-약물 콘쥬게이트 및 그 제조는 예컨대 U.S. patent application Ser. No. 09/334,130 (1999년 6월 15일에 출원)에 기재된다. 또한, 이러한 화합물의 제조 및 사용에 관련된 공보의 U.S. Pat. Nos. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928, 7,335,764 및 5,688,941을 참조한다.
평가될 바와 같이, 제공된 화합물의 모든 위치가 균일하게 변형되는 것이 항상 필요하거나 바람직한 것은 아니다. 하나 이상의 상기 변형은 올리고뉴클레오티드 내에 단일 화합물 심지어 단일 뉴클레오시드에 포함되어도 좋다. 또한, 본 발명은 키메라 화합물(chimeric compounds)인 올리고머를 포함한다. 본 발명의 내용에 있어서, "키메라" 올리고머 화합물은, 예컨대 또는 올리고머 "키메라"는 2개 이상의 화학적으로 분명한 부분을 포함하고, 각각은 적어도 하나의 모노머 유닛, 즉 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우에 뉴클레오티드 또는 유사체로 이루어진 안티센스 화합물과 같은 올리고뉴클레오티드이다. 이들 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 적어도 하나의 부분을 포함하고, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 분해에 저항을 증가시키고, 세포성 취입을 증가시키고, 및/또는 표적 핵산에 대한 결합 친화성을 증가시키는 올리고뉴클레오티드를 부여하기 위해 변형된다. 올리고뉴클레오티드의 추가적인 부분은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성체를 쪼갤 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 실시예의 방법에 의해서, RNase H 는 RNA:DNA 이중(duplex)의 RNA 가닥을 쪼개는 세포의 엔도뉴클레아제이다. RNase H의 활성은 따라서, RNA 표적을 쪼개어 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드 억제의 효율을 크게 향상시킨다. 따라서, 동일한 표적 부분에 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드 혼성화에 비해 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용되면 더 짧은 올리고뉴클레오티드로 필적할만한 결과를 얻을 수 있다. RNA 표적의 쪼개짐은 일반적으로 필요에 따라 기술에 알려진 핵산 혼성화 기술에 관련된 겔 전기 영동에 의해 검출될 수 있다.
여기에 사용된 "적어도 하나"란 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 등과 같은 1 이상의 정수를 포함한다.
본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기 기재된 바와 같이 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 복합 구조로 형성되어도 좋다. 이러한 화합물은 혼성체, 윙머(wingmers) 또는 갭머로서 기술에 언급되었다. 예컨대, U.S. Pat. Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 5,700,922, 7,335,764, 및 U.S. Pat. Publ. 2007/0191294을 참조한다.
본 발명에 따른 올리고머는 고체상 합성의 잘 알려진 기술을 통해 편리하고 일상적으로 제조될 수 있다. 이러한 합성 기기는 예컨대, Applied Biosystems (Foster City, Calif.)를 포함하는 몇몇의 판매 회사에서 판매한다. 기술에 알려진 이러한 합성의 다른 방법은 추가적으로 대체적으로 사용되어도 좋다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 유사한 기술을 사용하는 것이 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 본 발명의 올리고머는 생체외(in vitro)에서 합성되고, 생물학적 근원의 조성물 또는 이러한 조성물의 생체내(in vivo) 합성을 지시하도록 고안된 유전 벡터 구조물을 포함하지 않는다. 단일-가닥 올리고머는 많은 발명 용도에 바람직하다.
기재된 바와 같이, 일부 발명의 실시형태에 있어서, 그 표적에 대한 올리고머의 친화성을 향상시키는 것은 유용하다. 이것은 여기에 기재된 방법의 하나 또는 조합에 의해 행해질 수 있다. 하나의 접근에 있어서, 근접한 뉴클레오염기 시퀀스는 2'-MOE 및 LNA 모노머를 포함하는 여기에 기재된 것들과 같이 뉴클레오티드 유사체를 향상시키는 적어도 하나의 친화성을 포함한다. 뉴클레오티드 유사체를 향상시키는 적어도 하나의 친화성을 포함하는 올리고머의 하나의 실시형태에 있어서, 근접한 뉴클레오염기 시퀀스는 뉴클레오티드 유사체를 향상시키는 5 및 8 친화성과 같은 뉴클레오티트 유사체를 향상시키는 총 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 약 10 친화성을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 올리고머는 뉴클레오티드 유사체를 향상시키는 적어도 하나의 친화성을 포함하고, 잔류하는 뉴클레오염기는 여기에 기재된 바와 같이 DNA 뉴클레오티드 또는 RNA 뉴클레오티드 또는 비환식 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
앞선 올리고머의 더욱 구체적인 실시형태에 있어서, 올리고머는 5' 에서 3' 방향으로 식 A-B-C 및 선택적으로 식 A-B-C-D의 뉴클레오염기의 시퀀스를 포함한다:
<<A>>는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오티드 유사체와 같은 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 2, 3 또는 4 뉴클레오티드 유사체 또는 2, 3 또는 4 연속적 뉴클레오티드 유사체로 이루어지거나 포함한다;
<<B>>는 RNAseH를 리쿠르팅할 수 있는 적어도 5개의 연속적인 뉴클레오염기로 이루어지거나 포함한다(포유류의 C6 표적, 예컨대 SEQ ID NO. 1로 나타내는 인간 C6 핵산과 같은 상보적인 RNA 분자를 이중으로 형성할 경우). 하나의 실시형태에 있어서, 올리고머의 DNA 뉴클레오염기, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 연속적인 뉴클레오염기는 RNAseH를 리쿠르팅할 수 있고, 6 내지 10, 또는 7 내지 9, 예컨대 8 연속적인 뉴클레오염기는 RNAseH를 리쿠르팅할 수 있고, 또한;
<<C>>는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 뉴클레오티드 유사체와 같은 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체, 바람직하게는 2, 3 또는 4 뉴클레오티드 유사체와 같은 2-5 뉴클레오티드 유사체, 가장 바람직하게는 2, 3 또는 4 연속적인 뉴클레오티드 유사체로 이루어지거나 포함하고, 또한;
<<D>>는 존재시 1-3 또는 1-2 DNA 뉴클레오티드와 같은 하나 이상의 DNA 뉴클레오티드로 이루어지거나 포함하고, 바람직하게는 이루어진다.
앞선 조성물의 하나의 실시형태에 있어서, 올리고머는 적어도 하나의 A, B, C 또는 D에 적어도 하나, 바람직하게는 약 1 또는 약 2 비환식 뉴클레오티드와 같은 부분 B에 동일한 1, 2, 3 또는 4의 비환식 뉴클레오티드를 더 포함한다. 바람직하게는 비환식 뉴클레오티드는 상기 기재된 바와 같이 3',4'-세코티미딘 (세코-RNA-티미딘), 3',4'-세코시토신 (세코-RNA-시토신), 3'4'-세코아데닌 (세코-RNA-아데닌), 및 3',4'-세코구아닌 (세코-RNA-구아닌)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에 있어서, 부분 A는 2, 3 또는 4 연속적인 뉴클레오티드 유사체로 이루어지거나 포함한다. 추가적으로, B는 포유류의 C6 핵산 표적과 같은 상보적인 RNA를 이중으로 형성하는 경우에 RNAseH를 리쿠르팅할 수 있는 약 7, 8, 9 또는 10 연속적인 DNA 뉴클레오티드 또는 동등한 뉴클레오염기로 이루어지거나 또는 포함할 수 있다. 또한, 상기 올리고머에 C는 약 2, 3 또는 약 4 연속적인 뉴클레오티드 유사체로 이루어지거나 포함할 수 있다. 상기 제공된 바와 같이 부분 D는 존재시 하나 또는 2개의 DNA 뉴클레오티드로 이루어진다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 상기 기재된 바와 같이 부분 A는 3 근접한 뉴클레오티드 유사체로 이루어지거나 포함하고; 상기 기재된 바와 같이 B는 포유류의 C6 표적과 같은 상보적인 RNA를 이중으로 형성하는 경우에 RNAseH를 리쿠르팅할 수 있는 약 7, 8, 9 또는 약 10 근접한 DNA 뉴클레오티드 또는 동등한 뉴클레오염기로 이루어지거나 포함하고; 또한 상기 기재된 바와 같이 C는 약 3 근접한 뉴클레오티드 유사체로 이루어지거나 포함하고; 또한 부분 D는 존재시 하나 또는 2개의 DNA 뉴클레오티드로 이루어진다.
앞선 올리고머의 특정 실시형태에 있어서, 급접한 뉴클레오염기 시퀀스는 약 10, 11, 12, 13 또는 약 14 뉴클레오염기로 이루어지고; 부분 A는 약 1, 2 또는 약 3 근접한 뉴클레오티드 유사체로 이루어지고; 부분 B는 포유류의 C6 핵산 표적과 같은 상보적인 RNA를 이중으로 형성하는 경우에 RNAseH를 리쿠르팅할 수 있는 약 7, 8 또는 약 9 연속한 DNA 뉴클레오티드로 이루어지고; 부분 C는 약 1, 2 또는 약 3 근접한 뉴클레오티드 유사체로 이루어지고; 또한 부분 D는 존재시 하나의 DNA 뉴클레오티드로 이루어진다.
많은 발명의 용도를 위해서, 부분 B가 적어도 하나의 LNA 모노머 (뉴클레오염기)를 포함하는 올리고머를 갖는 것이 일반적으로 바람직하다. 예로서, 이러한 LNA는 알파-L-옥시 LNA와 같은 알파-L 배열일 수 있다. 추가적으로 적합한 뉴클레오티드 유사체(상기 기재된 바와 같이 부분 A, B, C 및 D 중 하나 또는 모두에)는 잠금 핵산(LNA) 유닛; 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로- DNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, 및 INA 유닛으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 또는 종합적으로 선택된다. 바람직한 발명의 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 유사체 LNA 모노머를 포함하고, 더욱 바람직하게는 이루어진다.
특정 올리고머는 적어도 하나의 LNA 모노머(때로 단위라고도 함), 2 내지 8 뉴클레오티드 LNA 유닛과 같은 일반적으로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. 8. 9 또는 10 LNA 유닛을 포함하는 발명의 실시형태는 유용하다. 다른 LNA 모노머는 베타-D 및 알파-L 배열 또는 그 조합에서 옥시-LNA, 티오-LNA, [베타]-D-옥시-LNA, 및 아미노-LNA로부터 선택된 것을 포함하는 소정의 발명의 용도에 유용하다. 하나의 실시형태에 있어서, 올리고머의 LNA 모노머 모두는 [베타]-D-옥시-LNA이다. 따라서 특정 발명의 실시형태에 있어서, 부분 A 및 C의 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오염기는 [베타]-D-옥시-LNA이다.
소정의 용도에 대해 말한 바와 같이, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오염기를 포함하는 올리고머를 갖는 것은 유용하다. 하나의 실시형태에 있어서, 변형된 뉴클레오염기는 5-메틸시토신, 이소시토신, 수도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노푸린, 2-아미노푸린, 이노신(inosine), 디아미노푸린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노푸린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실행은 여기에 기재된 다른 올리고머 하나 또는 조합의 용도에 필적할만 하다. 예컨대, 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명은 Tm 이 적어도 40℃, 예컨대 적어도 50℃인 상응하는 포유류의 C6 핵산(예컨대, mRNA)과 혼성화된다. 특정 실시형태에 있어서, 올리고머는 Tm 이 90℃ 미만, 예컨대 80℃ 미만인 상응하는 포유류의 C6 핵산(예컨대, mRNA)과 혼성화된다.
대부분 발명의 실시형태에 있어서, 이전에 기재된 바와 같이 변형된 백본을 갖는 올리고머는 일반적으로 바람직하고, 생체내 용도에 특히 바람직하다. 하나의 실시형태에 있어서, 인터뉴클레오시드 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시예에 있어서, 올리고머는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합을 포함한다. 인터뉴클레오시드 결합은 근접하거나 DNA 또는 RNA 유닛 사이일 수 있고, 또는 부분 B 내(상기 기재된 바와 같음)에는 포스포로티오에이트 결합이다. 발명의 올리고머의 하나의 실시예에 있어서, 적어도 한쌍의 연속적인 뉴클레오티드 유사체는 포스포디에스테르 결합이다. 일부 실시형태에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 유사체 사이의 모든 결합은 포스포디에스테르 결합이 바람직하고, 예컨대 모든 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합일 수 있다.
본 발명에 따른 더욱 구체적인 올리고머는 상기 언급된 표 4A-4E 및 표 5A-5F에 나타낸 바람직한 표적 부위에 표적이되는 것을 포함한다. 이러한 올리고머는 일반적으로 약 10 내지 약 20 뉴클레오티드, 예컨대 약 12 내지 약 18 뉴클레오티드로 일반적으로 이루어지고, 백본은 전체적으로 또는 부분적으로 포스포로티오화된다. 추가적으로 바람직한 올리고머는 바람직하게는 올리고머의 3' 및 5' 말단에 위치한 약 1 내지 약 6 (6) LNA 모노머를 더 포함한다. 더욱 구체적인 올리고머는 각 말단(즉, 윙머 또는 갭머)에 위치한 LNA 모노머의 약 2 또는 3을 포함한다.
또한, 적어도 하나의 비뉴클레오티드 또는 비폴리뉴클레오티드 부위가 상기 화합물에 공유 부착되는 앞선 올리고머 중 어느 것이 연상된다. 실시예는 상기 기재된 기들을 포함한다.
본 발명의 추가적인 올리고머는 이하 실시예 및 표에 제공된다.
이중-가닥 화합물( Double - stranded Compounds )
설명한 바와 같이, 본 발명은 여기세 제공된 인간, 쥐 및 생쥐 시퀀스와 같은 포유류의 보체 성분 6 (C6) 프로테인을 인코딩하는 핵산 분자에 표적이 되는 패신저 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중-가닥 화합물이다. 하나의 실시형태에 있어서, 각 가닥은 약 12 내지 약 35 뉴클레오염기, 바람직하게는 약 12 내지 약 30 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 14 내지 약 25 뉴클레오티드와 많은 용도에 바람직한 약 15 내지 약 20 뉴클레오티드(예컨대 18 또는 19 뉴클레오티드)를 포함한다. 바람직하게는 SEQ ID NOs: 1 (인간), 402 (쥐) 또는 403 (생쥐) 또는 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체에 의해 나타내는 보체 성분 6 (C6)을 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 까지 약 100%의 시퀀스 동일성을 갖는 근접한 뉴클레오염기 시퀀스로 이루어진다. 또한, 바람직하게, 올리고머는 LNA 모노머와 같은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 이중-가닥 화합물은 여기에 기재된 올리고머의 하나 또는 조합을 사용하여 제조될 수 있다. 보다 바람직한 올리고머는 예컨대 표 4A-4E 및 표 5A-5F에 관련되어 이미 언급된 바람직한 표적 부위에 표적으로 고안되었다. 추가적으로 바람직한 이중-가닥 화합물로 사용되는 올리고머는 여기에 특히 실시예 부분에 기재된 동물 시험에 의해 결정됨으로써 필수적으로 무독성이다. 이 올리고머는 분석에 따라 C6mRNA 발현을 감소시키는 우수한 능력을 보여준다.
이중-가닥 화합물의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥 및 안티센스 가닥의 하나 또는 모두는 포스포로티오에이트 결합과 같이 이전에 기재된(올리고뉴클레오티드 백본) 바와 같이 적어도 하나의 변형된 인터뉴클레오시드 결합을 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 패신저 가닥 및 안티센스 가닥의 인터뉴클레오시드 결합 모두는 포스포로티오에이트 결합이다. 일반적으로 패신저 가닥은 적어도 하나의 LNA 모노머, 예컨대 약 1 내지 약 10 LNA 모노머(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 9 LNA 모노머)를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 LNA 모노머는 패신저 가닥의 5' 말단에 위치하고, 예컨대 적어도 2개의 LNA 모노머는 패신저 가닥의 5' 말단에 위치한다. 대신에, 또는 추가로, 적어도 하나의 LNA 모노머는 패신저 3' 말단에 위치하고, 예컨대 적어도 2개의 LNA 모노머는 패신저 가닥의 3' 말단에 위치한다. 이중-가닥 화합물의 추가적인 실시형태는 적어도 하나의 LNA 모노머, 예컨대 약 1 내지 약 10 LNA 모노머(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 9 LNA 모노머)를 포함한다. 하나의 발명의 실시예에 있어서, 화합물의 적어도 하나의 LNA 모노머는 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치하고, 예컨대 적어도 2개의 LNA 모노머가 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치하고, 예컨대 적어도 3개의 LNA 모노머는 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치한다. 그러나, 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 5' 말단에 위치하는 LNA 모노머를 1 개 또는 갖지 않는 것이 유용할 수 있다. 본 발명의 이중-가닥 화합물은 패신저 가닥이 적어도 하나의 LNA를 포함하고, 안티센스 가닥은 적어도 하나의 LNA 모노머, 예컨대 약 1 내지 약 10 LNA 모노머(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 9 LNA 모노머)를 포함하고, 안티센스 가닥은 약 1 내지 약 10 LNA 모노머(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 9 LNA 모노머)를 포함하는 구조를 포함한다.
제 1 올리고머(패신저 가닥) 및 제 2 올리고머(안티센스 가닥)을 포함하는 앞선 이중-가닥 화합물의 하나의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥은 5' 말단에 적어도 하나의 LNA 모노머(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 LNA 모노머) 및 3' 말단에 적어도 하나의 LNA 모노머(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 LNA 모노머)를 포함하고, 예컨대 안티센스 가닥은 3' 말단에 적어도 하나의 LNA 모노머를 포함하는 실시형태이다. 실시예와 같이, 패신저 가닥은 5' 말단에 적어도 하나의 LNA 모노머(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 LNA 모노머) 및 3' 말단에 적어도 하나의 LNA 모노머(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 LNA 모노머)를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 3' 말단에 적어도 2개의 LNA 모너머를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥은 5' 말단에 적어도 2개의 LNA 모노머, 3' 말단에 적어도 2개의 LNA 모노머를 포함하고, 예컨대 안티센스 가닥은 3' 말단에 적어도 2개의 LNA 모노머를 포함할 수 있다. 따라서, 특정한 발명의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥은 5' 말단에 적어도 2개의 LNA 모노머 및 3' 말단에 적어도 2개의 LNA 모노머를 포함하고, 예컨대 안티센스 가닥은 3' 말단에 적어도 3개의 LNA 모노머를 포함한다. 그러나, 소정의 발명의 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 5' 말단에 위치하는 LNA 모노머를 하나 또는 갖지 않는 것이 유용하다.
바람직한 실시형태에 있어서, 조성물 중 T는 U로 대체된다(T=>U). 그러나, LNA 모노머의 일부 또는 바람직하게 모두는 T가 U로 대체되지 않고, 즉 T=T이다.
더욱 특정한 이중-가닥 조성물은 5' 말단으로부터 연속적으로 카운트되는 위치 9-13 중 적어도 하나에 적어도 하나의 LNA 모노머를 포함한다. 예컨대, 패신저 가닥은 5' 말단으로부터 연속적으로 카운트되는 위치 10에 LNA 모노머를 포함한다. 대신에, 또는 추가로 패신저 가닥은 위치 11 및/또는 위치 12에 LNA 모노머를 포함할 수 있다.
이중-가닥 화합물의 소정의 실시형태에 있어서, 제 1 및 제 2 올리고머 각각은 약 17 내지 약 25 뉴클레오티드, 예컨대 약 18 내지 약 24 뉴클레오티드, 약 19 내지 약 23 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 22 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 목적을 실행하기를 소망한다면, 패신저 및 안티센스 가닥의 각각은 3' 오버행(overhang)을 독립적으로 포함해도 좋다. 대신에 또는 추가로, 화합물은 여기에 위치된 적어도 하나의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5) 비환식 뉴클레오시드, 예컨대 세코-RNA-티미딘, 세코-RNA-시토신, 세코-RNA-아데닌, 및 세코-RNA-구아닌을 포함해도 좋다. 하나의 실시형태에 있어서, 비환식 뉴클레오티드는 패신저 가닥에 위치한다. 다른 실시형태에 있어서 비환식 뉴클레오티드는 화합물의 안티센스 가닥에 위치한다.
하나의 발명의 실시형태에 있어서, 제 1 올리고머, 제 2 올리고머의 뉴클레오염기 또는 모두는 SEQ ID Nos: 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 및 249 (표 4A-4E 참조)로 예시화된 표적 및 이하 각 표적에 나타내는 RNA 및 역보체 버전에 혼성화되도록 고안된다. 쥐 및 생쥐 C6은 동일한 또는 매우 유사한 표적 부위를 갖는다고 예측된다. 이중-가닥 화합물의 성분으로 사용되는 이러한 특정 올리고머의 기 내에 포함되는 것은 하나 이상의 당 기, 뉴클레오염기 또는 인터뉴클레오시드 결합은, 예컨대 여기에 기재된 바와 같이 변형되는 이들 시퀀스의 유도체이다. 특정 변형은 포스포로티오에이트 결합 및 적어도 하나의 LNA 모노머를 필수적으로 포함하거나 이루어진 시퀀스를 변형하는 것을 포함한다.
따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 이중-가닥 화합물은 모든 포스포로티오에이트 결합 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 약 1, 2 또는 3의 LNA 모노머, 예컨대 동일한 것의 2를 특징으로 한다. 하나의 실시형태에 있어서, 패신저 또는 패신저 가닥은 패신저 가닥의 5' 말단에 1, 2 또는 3 LNA 모노머, 예컨대 동일한 것의 2를 포함한다.
일부 발명의 실시형태에 있어서, 가닥 사이에서 더 강한 혼성화가 소망될 때와 같이 LNA 모노머에 더 많은 치환을 갖는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 이중-가닥 화합물은 모든 포스포로티오에이트 결합 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 약 1, 2 또는 3의 LNA 모노머, 예컨대 동일한 것의 2를 특징으로 한다. 패신저 가닥은 패신저 가닥의 5' 말단에 1, 2 또는 3 LNA 모노머, 예컨대 동일한 것의 2를 포함한다. 그러나, 하나의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥은 5' 말단(위치 1) 3' 오버행 위치에 비해 위치 3, 9, 13 및 15에서와 같이 패신저 가닥의 3' 내지 5' 말단에 추가적인 1, 2, 3, 4 또는 5의 LNA 모노머를 포함한다.
여기에 이미 기재된 이중-가닥 화합물의 다른 실시형태는 목적의 결과가 행해지도록 제공될 수 있다. 예컨대, 이중-가닥 화합물의 패신저 가닥 및 안티센스 가닥 모두는 포스포디에스테르 인터뉴클레오티드 결합을 포함하거나 또는 필수적으로 이루어질 수 있다. 그러나, 다른 실시형태에 있어서, 패신저 가닥 또는 안티센스 가닥 사이에 또른 모든 가닥에 적어도 하나의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합, 예컨대 약 1 내지 약 19 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7,8 , 9, 10 , 11, 12, 13 , 14 , 15, 16, 17 ,18, 또는 19 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합)을 갖는 것이 유용할 수 있다. 본 발명의 실시예에 있어서, 5' 말단으로부터 카운팅되는 패신저 가닥의 위치 9-10-11은 변형되지 않는다. 이중-가닥 화합물의 추가적인 실시형태는 패신저 가닥이 적어도 2에서 7까지 LNA 모노머를 포함하는, 예컨대 적어도 2의 LNA 모노머가 패신저 가닥의 3' 말단에 위치하는 구조를 포함한다. 대신에 또는 추가로, 적어도 하나의 LNA 모노머는 패신저 가닥의 5' 말단에 위치한다. 대신에 또는 추가로, 적어도 1에서 4까지 LNA 모노머는 패신저 가닥의 5' 말단으로부터 카운팅하는 위치 3, 9, 13 또는 15에 위치된다. 이중 가닥 화합물의 추가적인 실시형태는 안티센스 가닥이 적어도 하나의 LNA 모노머, 예컨대 약 1 내지 약 3 LNA 모노머(예컨대 2, 3, LNA 모노머)를 포함하는 구조를 포함한다. 하나의 발명의 실시형태에 있어서, 화합물의 적어도 하나의 LNA 모노머는 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치하고, 예컨대 적어도 2의 LNA 모노머는 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치하고, 예컨대 적어도 3의 LNA 모노머는 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치한다. 그러나, 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 5' 말단에 위치하는 LNA 모노머를 하나 또는 갖지 않는 것이 유용할 수 있다.
예컨대, 이하 구조는 가능하다(볼드체, 언더라인 L=LNA, r=RNA):
Figure pct00003

구조에 대해서, 화학물은 적어도 하나의 선택적인 포스포로티오에이트를 포함하고, 예컨대 그들은 모두 포스포로티오화 될 수 있다. C 잔기가 존재할 때, 추가적인 화합물은 선택적인 메틸 C를 포함하여 생체내 용도에 사용될 때 면역 반응을 감소 또는 제거할 수 있다. 여기에 기재된 바와 같이 다른 변형이 가능하다.
다른 특정한 발명의 실시형태에 있어서, LNA가 볼드체의 언더라인 텍스트로 표시되는 하기 구조가 가능하다.
5' CUGCAUUGCCAGAAAGUUA GA 3' 패신저
3' GC GACGUAACGGUCUUUCAAU 5' 안티센스
5' CU G CAUTG C CAG A A A GTUA GA 3' 패신저
3' GC GACGUAACGGUCUUUCAAU 5' 안티센스
다른 실시형태는 목적의 용도와 같은 파라미터에 따라 가능하다.
이론에 한정되지 않고, 일부 예에 있어서, 본 발명의 특정한 이중-가닥 화합물은 적어도 하나의 비환식 뉴클레오티드 유사체를, 바람직하게는 안티센스 및 패신저 가닥의 1, 2, 3 또는 4의 동일한 위치에 가짐으로써 유용할 수 있다. 바람직한 비환식 뉴클레오티드는 여기서 기재된 바와 같이 3',4'-세코 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 3',4'-세코티미딘(세코-RNA-티미딘), 3',4'-세코시토신(세코-RNA-시토신), 3',4'-세코아데닌(세코-RNA-아데닌) 및 3',4'-세코구아닌(세코-RNA-구아닌)이다. 하나의 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 1 비환식 뉴클레오티르, 바람직하게는 3' 내지 5' 말단에 위치한, 예컨대 3' 말단으로부터 약 3 내지 약 20 뉴클레오티드, 바람직하게는 3' 발단으로부터 약 5 내지 약 19 뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 안티센스는 1, 2, 또는 3의 LNA 모노머, 예컨대 3' 말단에 동일 위치된 2를 더 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥은 3' 말단에 1, 2 또는 3의 비환식 뉴클레오티드, 바람직하게는 동일한 것의 1을 포함한다.
하나의 실시형태에 있어서, 이하 화합물은 가능하다(볼드체, 언더라인 L=LNA, r=RNA, 언더라인 이탤릭체 S= seco):
5' rrrrrrrrrrrrrrrrrrrr S 3' 패신저
3' LL rrrrrrrrrrrrr S rrrrr 5' 안티센스
화합물은 적어도 하나의 선택적인 포스포로티오에이트를 포함할 수 있고, 예컨대 모두 포스포로티오화 될 수 있다. C 잔기가 존재할 때, 추가적인 화합물은 선택적인 메틸 C를 포함하여 생체내 용도에 사용될 때 면역 반응을 감소 또는 제거할 수 있다. 여기에 기재된 바와 같이 다른 변형이 가능하다.
따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 이하 구조는 본 발명의 범위내이고, 언더라인/이탤릭체 텍스트는 세코 유도체이고, 볼드체 및 언더라인 텍스트는 LNA이다:
5' CUGCAUUGCCAGAAAGUUAG A 3' 패신저
3' GC GACGUAACGGUCU U UCAAU 5' 안티센스
특정한 발명의 화합물은 "siLNA"라고도 하여 적어도 하나의 LNA 모노머를 갖는 화합물을 널리 의미한다. 여기서 사용된 "siRNA"는 RNA 또는 변형 RNA 모노머의 이중 가닥 스트레치을 말한다. 일반적인 siRNA 화합물에 있어서, 2개의 가닥은 일반적으로 서로 상보적인 약 19 뉴클레오티드를 갖고, 약 19 뉴클레오티드 길이이고, 각 가닥은 2 오버행인 뉴클레오티드의 3'- 말단을 갖는 이중 가닥을 만든다. 본 발명의 siRNA는 조금 길거나 짧고, 오버행을 갖거나 갖지 않는다고 평가된다. 특정 siRNA 구조의 선택은 의도된 용도와 같은 인식된 파라미터에 의존하다. siRNA에 있어서, 하나의 올리고머 가닥(안티센스 가닥)은 표적 RNA를 인도하고 상보적이고, 다른 올리고머 가닥(패신저 가닥)은 표적 RNA로서 동일한 시퀀스를 갖지므로 인도하는/안티센스 가닥에 상보적이다. 여기에, "micro RNA"("miRNA") 및 "short RNA"("shRNA")과 같은 규제 RNAs 및 tRNA, snRNA, scRNA, rRNA와 같은 다양한 구조의 RNAs는 "siRNA"로 상호교환하여 사용된다. "mRNA"는 표적 유전자의 현재 알려진 mRNA 전사물 및 확인될 수 있는 또 다른 전사물을 의미한다.
본 발명에 따른 이러한 이중-가닥 화합물은 적어도 하나의 비뉴클레오티드(non-nucleotide) 또는 비폴리뉴클레오티드 부위에 콘쥬게이트(즉, 공유 결합)될 수 있다. 예로는 이전에 기재된 것들을 들 수 있다.
평가될 바와 같이, siLNA 또는 siRNA 화합물의 시퀀스가 생체외 또는 생체내에서 안정해지기 위해서 그 표적 핵산에 100% 상보적일 필요는 없다. "상보적" 및 "구체적으로 혼성화 가능한"은 따라서 siLNA 또는 siRNA 화합물 결합은 충분히 강하고 표적 분자에 특이적이어서 표적의 보통의 기능에 소망하는 간섭을 제공하고 영향을 주지 않는 비표적 mRNAs의 기능을 남긴다.
불연속적인 가닥 RNA 복합체( Discontinuous Strand RNA Complexes )
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 핵산 복합체, 일반적으로 RNA 또는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 유사체를 포함하거나 이루어지고, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 희석제, 캐리어 또는 보조제를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, 복합체는 SEQ ID NOs: 1 (인간), 402 (쥐) 또는 403 (생쥐) 또는 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체로 나타내는 보체 성분 6 (C6) 시퀀스를 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 적어도 약 80% 시퀀스 동일성, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 98%, 99%에서 약 100%까지 시퀀스 동일성을 갖는 근접한 뉴클레오염기 시퀀스로 이루어진 안티센스 가닥을 포함하는 코어 이중-가닥 영역을 포함한다. 바람직한 복합체는 올리고뉴클레오티드 유사체를 포함하고, RNA 복합체는 일반적으로 안티센스 가닥과 혼성화되는 불연속적인 패신저 가닥을 더 포함한다. 최고 용도를 위해, 불연속적인 패신저 가닥은 닉(nick) 또는 갭(gap) 또는 링커(linker) 또는 여기에 기재된 바와 같은 다른 중단(interruption)과 같은 불연속을 포함한다.
앞선 실시형태에 있어서, RNA 복합체는 일반적으로 대응 표적 핵산의 핵산 변형을 조정할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 변형은 RNA 간섭, 유전자-침묵(gene-silencing), 유전자-억제(gene-suppression), 번역 저지(translation arrest), 번역 억제(translation inhibition), RNA 열화, RNA 쪼개짐(cleavage) 및 DNA 메틸화로 이루어진 하나 이상의 군으로부터 선택된다. 일반적인 RNA 복합체는 표적 RNA의 열화를 매개하거나 표적 RNA 또는 그 조합의 번역 억제를 매개한다.
본 발명의 특정 RNA 복합체에 있어서, 코어 이중-가닥 영역은 약 15 내지 약 40 염기쌍, 예컨대 18 염기쌍, 19 염기쌍, 20 염기쌍, 21 염기쌍, 22 염기쌍 및 23 염기쌍을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, RNA 복합체는 하나 이상의 오버행, 예컨대 하나 또는 2의 오버행을 포함한다. 오버행의 예로는 3'-오버행이다. 하나의 실시형태에 있어서, RNA 복합체의 패신저는 3'-오버행을 포함한다.
각종 오버행의 길이는 본 발명에서 호환되지만, 일반적으로 오버행의 길이는 약 1 내지 약 8 뉴클레오티드, 예컨대 1 뉴클레오티드, 2 뉴클레오티드 및 3 뉴클레오티드이다. 부합하는 RNA 복합체는 양 말단이 평활한 말단을 포함하는 적어도 하나의 평활 말단(blunt end)을 포함할 수 있다. RNA 복합체의 길이는 약 18 내지 약 22 염기쌍을 포함하여 목적의 결과를 얻기에 충분한 어느 길이일 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥 및 패신저 가닥 각각은 약 1 내지 약 3 뉴클레오티드의 3'-오버행을 포함한다.
설명한 바와 같이, 본 발명의 특정 RNA 복합체는 불연속적인 패신저 가닥을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 복합체는 불연속적인 패신저 가닥을 형성하는 하나 이상의 RNA 분자를 더 갖는 적어도 제 1 및 제 2 RNA-분자를 포함한다. 바람직하게, 제 1 RNA 분자는 안티센스 가닥의 다운스트림(downstream) 부분을 혼성화하고, 제 2 RNA 분자는 안티센스 가닥의 업스트림(upstream) 부분을 혼성화한다. 하나의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥은 불연속적인 패신저 가닥을 형성하는데 바람직한 제 1 및 제 2 RNA-분자를 갖는 약 1 내지 약 4 RNA 분자를 더 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 패신저 가닥은 제 1 및 제 2 RNA 분자만을 포함하고, 예컨대 다른 RNA 분자를 포함하지 않는다.
패신저 가닥의 불연속성은 예컨대, 적어도 제 1 및 제 2 RNA 분자, 및 선택적으로 패신저 가닥의 다른 RNA 분자가 분리되는 닉 또는 닉들에 의해 형성될 수 있다. 필요에 따라, 그러나 적어도 제 1 및 제 2 RNA 분자 및 선택적으로 패신저 가닥의 다른 RNA 분자는 갭 또는 선택적으로 갭들, 예컨대 1 뉴클레오티드 갭, 2 뉴클레오티드 갭, 3 뉴클레오티드 갭, 4 뉴클레오티드 갭, 5-뉴클레오티드 갭, 6-뉴클레오티드 갭, 7-뉴클레오티드 갭, 8-뉴클레오티드 갭, 9-뉴클레오티드 갭, 10-뉴클레오티드 갭, 11-뉴클레오티드 갭 및 12-뉴클레오티드 갭으로 이루어진 군으로부터 선택된 것에 의해 분리된다. 불연속성이 링커와 관련되는 실시형태에 있어서, 패신저 가닥의 제 1 RNA 분자는 링커에 의해 안티센스 가닥에 연결될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 링커는 패신저 가닥의 제 1 RNA 분자의 5' 말단에서 안티센스 가닥의 3' 말단으로 연결된다. 다른 실시형태에 있어서, 패신저 가닥의 제 2 RNA 분자는 링커에 의해 안티센스 가닥에 연결될 수 있다. 필요에 따라, 링커는 패신저 가닥의 제 2 RNA 분자의 3' 말단에서 안티센스 가닥의 5' 말단으로 연결할 수 있다. 패신저 가닥의 제 1 및 제 2 RNA 분자, 선택적으로 패신저 가닥의 다른 RNA 분자는 링커 또는 선택적으로 복수의 링커에 의해 연결될 수 있다. 다양한 링커는 단일 가닥 RNA 링커가 아닌 것과 같이 발명에 호환된다.
RNA 복합체의 일부 발명의 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 패신저 가닥에 공유 결합되지 않는다. 필요에 따라 불연속적인 패신저 가닥을 형성하는 RNA 분자는 불연속적인 패신저 가닥을 형성하는 어느 다른 RNA 분자에 공유 결합되지 않는다.
본 발명에 따른 소정의 RNA 복합체는 불연속적인 패신저 가닥을 함께 형성하는 3의 비결합 RNA 분자, 즉 안티센스 가닥, 제 1 및 제 2 RNA 분자를 특징으로 한다. 하나의 실시형태에 있어서, 불연속적인 패신저 가닥은 위치 3, 위치 4,, 위치 5, 위치 6, 위치 7, 위치 8, 위치 9, 위치 10, 위치 11, 위치 12, 위치 13, 위치 14, 위치 15, 위치 16, 위치 17, 위치 18, 위치 19, 위치 20, 위치 21, 위치 22, 위치 23, 위치 24, 위치 25로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 불연속성을 갖는다. 바람직하게 위치는 염기쌍인 패신저 가닥의 제 1 뉴클레오티드에서 패신저 가닥의 안티센스 가닥까지 5' 에서 3' 방향으로 산출된다.
일부 발명의 실시형태를 위해서, RNA 복합체의 5-말단은 인산화된 또는 인산화반응에 유용한 RNA 복합체를 갖는 것이 유용할 것이다. 하나의 실시형태에 있어서, 제 1 RNA 분자는 5'-말단 인산기 및 3'-말단 히드록시기를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 제 2 RNA 분자는 5'-말단 인산기 및 3'-말단 히드록시기를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 불연속적인 패신저 가닥을 형성하는 모든 RNA 분자는 각각 5'-말단 인산기 및 3'-말단 히드록시기를 포함한다.
여기에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체로 이루어진 일부 경우 또는 포함하는 RNA 복합체를 갖는 것이 유용하다. 하나의 실시형태에 있어서, RNA 복합체의 패신저 가닥은 2 내지 10 뉴클레오티드 유사체와 같은 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 대신에, 또는 추가로, 패신저 가닥의 제 1 RNA 분자는 적어도 2 뉴클레오티드 유사체와 같은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 대신에, 또는 추가로, 패신저 가닥의 제 2 RNA 분자는 적어도 2 뉴클레오티드 유사체와 같은 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
RNA 복합체가 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 실시형태에 있어서, 유사체의 위치는 제 1 및/또는 제 2 RNA 분자의 3 터미널(5' 또는 3' 각각) 뉴클레오염기 유닛 내인 것이 바람직하다. 대신에, 또는 추가로 패신저 가닥의 적어도 하나의 RNA 분자는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 예컨대, 불연속적인 패신저 가닥의 부분을 형성하는 각 RNA 분자는 패신저 가닥의 5' 말단으로부터 위치 10 및 12에서와 같이 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 각 RNA 분자는 불연속 패신저 가닥의 부분을 형성하고, 적어도 2의 뉴클레오티드 유사체와 같이 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
하나의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥은 5' 말단(위치 1) 및 3' 오버행 위치에 대해서 위치 3, 9, 13, 및 15와 같이 3' 내지 5' 말단에 추가적인 1, 2, 3, 4 또는 5 LNA 모노머를 포함한다. 그러나, 본 발명의 실시예에 있어서, 패신저 가닥은 두 부분, 예컨대 위치 10 내지 11에서 쪼개진다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥의 각 부분은 적어도 하나의 LNA 모노머, 예컨대 동일한 것의 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 더욱 바람직하게는 1, 2 또는 3 또는 4 LNA 모노머가 패신저 가닥의 하나 위에 위치하고 나머지 모노머가 다른 가닥에 위치하는 동일한 것의 5 또는 6을 포함한다.
바람직한 용융 온도 특성을 갖는 RNA를 제조 및 사용하는 것은 유용하다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 포스포디에스테르를 갖는 상보적인 RNA 분자를 2중으로 형성할 때 제 1, 제 2 및 불연속적인 패신저 가닥을 형성하는 선택적으로 다른 RNA 분자 각각의 용융 온도 (Tm)는 적어도 40℃이다.
본 발명의 RNA 복합체의 바람직한 길이는 목적의 용도에 의해 인도될 수 있다. 따라서 하나의 실시형태에 있어서, 제 1, 제 2 및 불연속적인 패신저 가닥을 형성하는 선택적으로 다른 RNA 분자 각각의 길이는 적어도 3 뉴클레오염기 유닛이다. 하나의 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 불연속적인 패신저 가닥을 형성하는 2중 영역 내에 적어도 1의 뉴클레오티드를 포함하는 예와 같이 안티센스는 적어도 1의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 대신에, 또는 추가로, 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 카운트되는 4 뉴클레오염기 내에 위치에 안티센스 가닥은 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 약 9 5' 대부분 뉴클레오염기 유닛에 존재하는 적어도 하나의 뉴클레오염기는 뉴클레오티드 유사체이다. 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 3' 말단 10으로부터 4-10 뉴클레오염기 영역내에 존자해는 적어도 하나의 뉴클레오염기는 뉴클레오티드 유사체이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 11에 뉴클레오티드 유사체를 갖는다. 또 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 10 및 12에 RNA 뉴클레오티드를 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 5' 대부분 뉴클레오염기 유닛은 RNA 뉴클레오티드 유닛이다. 대신에, 또는 추가로 안티센스 가닥은 적어도 2의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
갖가지 뉴클레오티드 유사체는 본 발명에 호환된다. 일반적으로 적합한 유사체는 RNA 복합체의 A-형태의 형성 또는 A/B 형태에 호환되거나 호환된다고 추정되는 것이다. 실례적인 유사체는 2'-O-알킬-RNA 모노머, 2'-아미노-DNA 모노머, 2'-플루오로-DNA 모노머, LNA 모노머, 아라비노 핵산 (ANA) 모노머, 2'-플루오로-ANA 모노머, HNA 모노머, INA 모노머로 이루어진 군을 포함한다. 바람직한 뉴클레오티드 유사체는 불연속적인 패신저 및/또는 안티센스 가닥에 존재하고, 이미 기재된 바와 같이 적어도 하나의 LNA 모노머로 이루어진다. 대신에 또는 추가로, 불연속적인 패신저 및/또는 안티센스 가닥에 존재하는 뉴클레오 유사체는 적어도 하나의 2'-MOE-RNA (2'-O-메톡시에틸-RNA) 유닛 또는 2'플루오로 DNA 유닛, 예컨대 2'-MOE-RNA (2'-O-메톡시에틸-RNA) 유닛 또는 2'플루오로 DNA 유닛으로부터 독립적으로 선택된 약 1 내지 약 25 유닛을 포함한다.
설명한 바와 같이, 적어도 하나의 뉴클레오티드가 적어도 하나의 LNA 유닛으로 치환되는 RNA 복합체를 갖는 것이 유용할 것이다. 하나의 실시형태에 있어서, LNA 유닛 또는 유닛들은 D-β 및 L-α 배열 또는 그 조합에 옥시-LNA, 티오-LNA 및 아미노-LNA로 이루어진 기로부터 독립적으로 선택된다. 필요에 따라, 안티센스 가닥에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 LNA 단위를 포함하고 및/또는 패신저 가닥에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 LNA 단위를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥에 존자해는 뉴클레오 유사체는 LNA 유닛이다. 대신에 또는 추가로, 패신저 가닥에 존재하는 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA 유닛이다. 각종 바람직한 LNA 모노머는 이하에 기재되었다.
여기에 기재된 RNA 복합체의 다수의 실시형태에 있어서, 불연속적인 패신저 가닥에 존재하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체는 안티센스 가닥에 존재하는 상보적인 뉴클레오티드 유사체를 갖는 염기쌍을 형성한다. 하나의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥은 어떤 뉴클레오티드 유사체를 포함하지 않고 및/또는 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 어떤 뉴클레오티드 유사체를 포함하지 않는다. 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥 및 불연속적 가닥은 약 18 내지 약 22 염기쌍의 상보적인 이중을 형성한다. 하나의 실시형태에 있어서, 이중은 미스매치를 포함해도 좋다.
하나의 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥 또는 패신저 가닥(또는 둘다, 분리된 독립체로서 또는 RNA 복합체 내에 조합된 총 뉴클레오티드 유사체로서)에 존재하는 뉴클레오티드 유사체의 수는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24 및 적어도 25 뉴클레오티드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 뉴클레오티드 유사체의 적합한 수는 20 미만, 예컨대 18 미만, 예컨대 16 미만, 예컨대 14 미만, 예컨대 12, 예컨대 10 미만일 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 불연속적인 패신저 가닥(또는 안티센스 가닥, 또는 둘다, 분리된 독립체로서 또는 RNA 복합체 내에 조합된 총 뉴클레오티드 유사체로서)에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 2'-O-알킬-RNA 모노머(예컨대 2'OME), 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 2'-O-알킬-RNA 모노머(예컨대 2'OME)를 포함한다. 2'OME 및 LNA를 포함하거나 이루어진 복합체는 또한 연상된다.
하나의 실시형태에 있어서, 같거나 달라도 좋은, 불연속적인 패신저 가닥(또는 안티센스 가닥, 또는 둘다, 분리된 독립체로서 또는 RNA 복합체 내에 조합된 총 뉴클레오티드 유사체로서)에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 2'-플루오로-DNA 모노머, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 2'-플루오로-DNA 모노머를 포함한다.
다수의 발명의 용도를 위해 불연속적인 패신저 가닥에 존재하는 적어도 하나의 LNA 모노머를 갖는 것이 일반적으로 바람직하다. 하나의 실시형태에 있어서, 같거나 달라도 좋은, 불연속적인 패신저 가닥(또는 안티센스 가닥, 또는 둘다, 분리된 독립체로서 또는 RNA 복합체 내에 조합된 총 뉴클레오티드 유사체로서)에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 LNA 모노머, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 LNA 모노머를 포함한다.
하나의 실시형태에 있어서, LNA 유닛 또는 유닛들은 D-β 및 L-α 배열 또는 그 조합에 옥시-LNA, 티오-LNA 및 아미노-LNA로 이루어진 기로부터 독립적으로 선택된다. 하나의 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 잠금 핵산(LNA) 유닛, 예컨대 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19 또는 적어도 20의 LNA 유닛을 포함한다. LNA 유닛의 적합한 수는 20 미만, 예컨대 18 미만, 예컨대 16 미만, 예컨대 14 미만, 예컨대 12 미만, 예컨대 10 미만일 수 있다. 하나의 실시형태에 따라서, 안티센스 가닥에 존재하는 모든 뉴클레오티드 유사체는 잠금 핵산 (LNA) 유닛이다.
다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 LNA 유닛과 같은 조금의 뉴클레오티드 유사체 유닛만을 포함한다. 일반적으로 안티센스 가닥의 3' 하프 내에 위치하는 안티센스 가닥에, 예컨대 안티센스 가닥의 위치 1 내지 9, 예컨대 안티센스 가닥의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9, 예컨대 3 오버행 영역내 또는 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 측정되는 2중의 제 1의 3, 즉 제 1, 제 2, 제 3 뉴클레오염기 위치내에 존재하는 뉴클레오티드가 바람직하다.
하나의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥(또는 안티센스 가닥, 또는 둘다, 분리된 독립체로서 또는 RNA 복합체 내에 조합된 총 뉴클레오티드 유사체로서)에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 LNA 유닛, 예컨대 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19 또는 적어도 20의 LNA 유닛을 포함한다. LNA 유닛의 적합한 수는 20 미만, 예컨대 18, 예컨대 16 미만, 예컨대 14 미만, 예컨대 12 미만, 예컨대 10 미만일 수 있다. 하나의 실시형태에 따라서, 패신저 가닥에 존재하는 모든 뉴클레오티드 유사체는 잠금 핵산 (LNA) 모노머(유닛)이다.
하나의 실시형태에 있어서, 불연속적인 패신저 가닥에 존재하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체는 안티센스 가닥에 존재하는 상보적인 뉴클레오티드 유사체를 갖는 염기쌍을 형성한다.
하나의 실시형태에 있어서, 불연속적인 패신저 가닥에 존재하는 모든 뉴클레오티드 유사체는 3' 오버행(존재한다면)에 존재하는 뉴클레오티드 유사체를 제외하고 안티센스 가닥에 존재하는 상보적인 뉴클레오티드 유사체를 갖는 염기쌍을 형성한다.
하나의 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥에 존재하는 모든 뉴클레오티드 유사체는 3' 오버행(존재한다면)에 존재하는 뉴클레오티드 유사체를 제외하고 불연속적인 패신저 가닥에 존재하는 상보적인 뉴클레오티드 유사체를 갖는 염기쌍을 형성한다. 하나의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥은 9-11 뉴클레오티드(뉴클레오염기) RNA 분자, 예컨대 1 내지 5의 뉴클레오티드 유사체를 갖는 10 뉴클레오티드 RNA 분자, 예컨대 LNA 유닛, 예컨대 2 유닛 및 11-13 뉴클레오티드 RNA 분자, 예컨대 1 내지 5의 뉴클레오티드 유사체 단위를 포함하는 12 뉴클레오티드 RNA 분자, 예컨대 3 LNA 잔기로 이루어지거나 포함한다.
실시예의 방법에 의해 한정되지 않지만 이하 특정 발명의 화합물은 하기 구조를 갖고, 식 중 볼드체 및 언더라인 텍스트는 LNA이다:
5' CU G CAUTG C C 3' 5' AG A A A GTUA GA 3' 패신저
3' GC GACGUAACGGUCUUUCAAU 5' 안티센스
본 발명의 RNA 복합체를 제조 및 사용하는데 관련된 또 다른 공보는 이하에서 발견될 수 있다: 이들 화합물을 제조 및 사용하는데 관련된 공보의 WO2007/107162 (PCT/DK2007/000146), PA 2006 00433 (DK), 및 PA 2006 01254 (DK) .
본 발명의 실행은 여기에 기재된 RNA 복합체의 하나 또는 조합에 의해 행해질 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, RNA 복합체는 비모듈식(non-modular) 패신저 가닥을 포함하는 본래의 RNA 복합체에 비해 오프-표적 효과(off-target effects)를 감소시킨다. 하나의 실시형태에 있어서, RNA 복합체는 비모듈식 패신저 가닥을 포함하는 본래의 RNA 복합체에 비해 감소된 면역 반응을 만든다. 다른 실시형태에 있어서, RNA 복합체는 비모듈식 패신저 가닥을 포함하는 RNA 복합체에 비해 표적 핵산에 대한 연장된 효과를 갖는다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, RNA 복합체는 비모듈식 패신저 가닥을 포함하는 RNA 복합체에 비해 표적 핵산에 대한 증가된 효과를 갖는다. 바람직한 표적 핵산은 SEQ ID NO: 1 (인간), SEQ ID NO:402 (쥐), 또는 SEQ ID NO: 403 (생쥐)과 같이 기재된 C6 시퀀스이다.
본 발명의 RNA 복합체는 방법 하나 또는 조합에 의해 제조될 수 있다. 하나의 접근에 있어서, 방법은 불연속적인 패신저 가닥을 형성하는 적어도 2의 RNA 분자를 갖는 안티센스 가닥, 및 코어 이중 가닥을 포함하는 RNA 복합체가 형성된 조건하에서 패신저 가닥의 선택적으로 또 다른 RNA 분자를 배양하는 단계를 포함한다. 바람직하게, RNA 복합체는 대응 세포의 RNA의 RNA 간섭을 매개할 수 있고, 약제학적으로 허용되는 희석제, 캐리어, 또는 첨가제 내에서 상기 배양을 발생시키거나 상기 RNA 복합체는 약제학적으로 허용되는 희석제, 캐리어, 또는 첨가제와 순차적으로 혼합된다.
앞선 RNA 복합체는 다양한 용도를 갖는다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명은 이하에 서명된 바와 같이 막공격 복합체 (MAC)의 바람직하지 않은 형성과 관련된 질병의 치료약의 제조에 대해 여기서 기재된 바와 같이 RNA 복합체의 용도를 특징으로 한다.
또한, 환자의 질병을 시작을 치료, 예방 또는 완화하는 방법, 바람직하게는 이하에 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 완충제, 첨가제 또는 운반체의 조합으로 여기에 기재된 하나 이상의 RNA 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은 유전자 발현을 조절하는데 충분한 여기에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 RNA 복합체로 셀 또는 기관을 접촉하는 단계를 포함하는 셀 또는 기관에 표적 RNA(또는 유전자 발현)의 레벨을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 바람직하게, RNA 복합체의 안티센스 가닥은 표적 RNA의 영역에 필수적으로 상보적이다.
설명한 바와 같이, 본 발명에 사용되는데 적합한 RNA 복합체는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 패신저 가닥의 제 1 RNA 분자는 5' 말단으로부터 위치 9에 2'-O-메틸 리보오스를 포함하지 않는다. 다른 실시형태에 있어서, 패신저 가닥의 제 1 RNA 분자는 5' 말단으로부터 위치 9에 2'-O-메틸 리보오스를 포함하지 않는다.
또한, 바람직하게는 적어도 하나의 단계 및 바람직하게는 모든 단계를 포함하는, 셀 또는 기관에 표적 핵산의 핵산 변형을 매개하는 방법이 본 발명에 제공된다:
a. 표적 특이 핵산 변형(target specific nucleic acid modification)이 발생하는 조건 하에서 기재된 바와 같은 RNA 복합체를 셀 또는 기관에 접촉하는 단계, 및
b. RNA 복합체의 안티센스 가닥에 의해 인도되는 표적 특이 핵산 변형을 매개하는 단계.
앞선 방법의 하나의 실시형태에 있어서, 핵산 변형을 매개하는 단계는 RNA 간섭, 유전자 침묵, RNA 열화, RNA 쪼개짐 및 DNA 메틸화로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 이하 단계를 포함하는 셀 또는 기관에 유전자의 기능을 시험하는 방법을 제공한다:
a. 셀 또는 기관에 열화 또는 침묵 또는 억제를 위한 mRNA 또는 다른 관능적 RNA와 같은 유전자에 의해 인코딩되는 RNA를 표적으로 하는 이하에 기재된 바와 같은 RNA 복합체를 도입하여 시험 셀 또는 시험 기관을 제조하는 단계,
b. 유전자에 의해 인코딩되는 RNA의 열화 또는 침묵 또는 억제가 발생되는 조건 하에서 시험 셀 또는 시험 기관을 유지하여, 유전자의 mRNA 레벨이 감소하는 시험 셀 또는 시험 기관을 제공하는 단계, 및
c. 단계 b에서 제조된 시험 셀 또는 기관의 표현형(phenotype)을 관찰하고, 적합한 통제 셀 또는 통제 기관의 표현형과 관찰된 표현형을 선택적으로 비교하여 유전자의 기능에 대한 정보를 제공하는 단계.
본 발명의 실행은 본 발명의 화합물(예컨대, 안티센스, siRNA, sisiRNA)이 LNA 모노머를 포함하는 실시형태에 있어서 특히 중요한 이점을 제공한다.
예컨대, 본 발명의 화합물이 LNA 모노머(예컨대, 안티센스, siRNA, sisiRNA)를 포함하는 실시형태의 하나의 이점은 혈청과 같이 생물학적 유체(biological fluids)에서의 안정성을 향상시키는 것이다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시형태는 생물학적 유체에서 생성된 siLNA 화합물 또는 안티센스 올리고머의 안정성을 증가시키는, 예컨대 뉴클레아제를 향한 저항을 증가시킴을 통해(엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제) 표준 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 LNA 모노머의 도입을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 LNA 모노머의 도입에 기인하여, 용융 온도를 증가시키고 및/또는 뉴클레아제 저항을 증가시키는 결과로서 증가된 순환 반감기를 보여줄 것이다. 안정성의 정도는 사용되는 LNA 모노머의 수, 올리고뉴크레오티드에서의 위치, 사용되는 LNA 모노머의 형태에 의존한다. DNA 및 포스포로티오에이트에 비해, 뉴클레오리틱(nucleolytic) 열화에 대항하여 올리고뉴클레오티드를 안정화하는 능력의 이하 순서는 확립될 수 있다: DNA<<포스포로티오에이트, LNA-포스포르디에스테르<LNA-포스포로티오에이트.
다수의 용도를 위해서, 본 발명에 따른 바람직한 화합물은 5시간 동안 37℃에서 생리적 식염수에서 10% 태아 혈청과 같은 혈청(예컨대, 인간, 소 또는 쥐 혈청)에서 배양될 때, 대응 ssDNA, ssRNA 또는 dsRNA 화합물보다 적게 열화되는 화합물을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 화합물의 초기량의 25% 미만은 5시간 후 열화되고, 더욱 바람직하게는 본 발명의 화합물의 초기량의 50% 미만은 5시간 후 열화되고, 보다 더욱 바람직하게는 본 발명의 화합물의 초기량의 75% 미만은 5시간 후 열화된다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물의 초기량의 25% 미만은 10시간 후 열화되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 본 발명의 화합물의 초기량의 50% 미만은 10시간 후 열화된다.
앞서 말함으로써 명백해진 바와 같이, 본 발명의 화합물은 자연적으로 발생하거나 뉴클레오티드 유사체인 뉴클레오티드 단독 또는 조합인 하나 이상의 LNA 모노머를 포함해도 좋다. 이런 다른 잔기는 여기에 설명된 잔기 중 어느 것이어도 좋고, 상기 "뉴클레오티드"의 정의와 연결되어 언급한 바와 같이 뉴클레오티드 변이체 및 유사체 뿐만 아니라 예컨대 본래의 RNA 모노머, 본래의 DNA 모노머를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이체 및 유사체의 구체예로는 2'-F, 2'-O-Me, 2'-O-메톡시에틸 (MOE), 2'-O-(3-아미노프로필) (AP), 헥시톨 핵산 (HNA), 2'-F-아라비노 핵산(arabino nucleic acid) (2'-F-ANA) 및 D-시클로핵세닐 뉴클레오시드 (CeNA)를 들 수 있다. 또한, 인터뉴클레오시드 결합은 상기 기재된 바와 같이 포스포로디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 N3'-P5' 포스포로아미데이트 인터뉴클레오시드 결합이어도 좋다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 개별적인 가닥은 가닥에 뉴클레오티드의 총 수에 따라 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15% 또는 적어도 약 20%의 LNA 모노머를 포함할 것이다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 가닥에 뉴클레오티드의 총 수에 따라 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 약 90%의 LNA 모노머를 포함할 것이다.
본 발명의 화합물은 U.S. Pat. Publication No. 2007/0191294 및 WO2007/107162에 의해 제공된 합성을 포함하여 기재된 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
약제학적 조성물 및 투여
본 발명의 화합물의 바람직한 용도는 급성 또는 만성 신경병증과 관련된 증상을 치료, 예방 및/또는 완화하는 약으로서일 것이다. 강력하고 안전한 약의 고안은 친화성/특이성, 생물학적 유체에의 안정성, 세포성 취입, 작용 모드, 약동학적 특성 및 독성과 같은 다양한 파라미터의 미세 조정이 종종 필요하다. 이들 및 다른 파라미터는 기술에 알려질 것이다.
따라서, 또 다른 실시형태에 있어서 본 발명은 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 캐리어 또는 첨가제에 관한 것이다.
특히 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 약으로서 사용되는 본 발명에 따른 화합물에 관한 것이다.
복용은 격렬함 및 치료될 신경병증의 민감성 및 며칠부터 몇달까지 또는 치료가 효과가 있거나 질병 상태의 감소가 이루어질 때까지 지속되는 치료의 코스에 의존한다. 최적의 복용 스케줄은 환자의 신체에 약물 축적의 측정으로부터 산출될 수 있다. 최적의 복용량은 개별적인 발명 화합물 및/또는 치료될 지시(이하 참조)의 상대적인 효력에 의존하여 변화할 수 있다. 일반적으로 생체외 및 생체내 동물 모델에 효과적이라고 발견되는 EC50s에 따라 추정될 수 있다. 일반적으로 복용량은 체중 kg 당 0.01마이크로그램 내지 1g이고, 하루, 일주, 한달 또는 일년에 한번 또는 그 이상 또는 매 2~10년에 한번 조차 또는 몇시간에서 몇달까지 지속적인 투입에 의해 주어져도 좋다. 복용의 반복률은 신체의 유체 또는 조직에 약물의 측정된 지속 시간 및 농도에 따라 추청될 수 있다. 이하 성공적인 치료는, 환자가 유지 요법을 겪어 질병 상태의 재발을 예방하는 것이 바람직할 수 있다.
평가될 바와 같이, 또한 본 발명은 활성 재료로서 본 발명의 적어도 하나의 화합물(예컨대, 안티센스 화합물, siLNA, siRNA, sisiLNA)을 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 선택적으로 약제학적 캐리어를 포함하고, 약제학적 조성물은 선택적으로 항염증성 화합물(예컨대, 비스테로이드 및 스테로이드 항염증성 제제) 및/또는 면역 조절(immuno-modulating) 화합물과 같은 화합물을 더 포함한다는 것으로 이해하는 것이 좋다.
본 발명의 화합물은 각종 약제학적으로 허용되는 염이 사용될 수 있다. 여기에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 여기에 정의된 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고, 최소의 바람직하지 않은 독소 효과를 보여주는 염을 말한다. 이러한 염의 한정되지 않는 예는 유기 아미노산 및 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴, 소듐, 포타슘 등과 같은 금속 양이온 또는 암모니아, N,N-디벤질에틸렌디아민, D-글루코사민, 테트라에틸암모늄 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 양이온으로 형성된 염기 부가염으로 형성될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 약물 전구체(pro-drug)의 형태일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 음전하를 띠는 이온 덕분이다. 셀 멤브레인의 친유성 특성에 기인하여, 뉴클레오티드의 세포성 취입은 본래의 또는 친유성 등가물에 비해 감소된다. 이 극성 "저해(hindrance)"는 역물 전구체 접근법을 사용하여 피할 수 있다(예컨대, Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140 참조). 이 접근에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 보호된 방법으로 제조되어 그것이 투여될 때 올리고는 중성이다. 이 보호기는 올리고가 세포에 의해 취입될 때 제거될 수 있는 방법으로 고안되었다. 이러한 보호기의 예는 S-아세틸테오에틸 (SATE) 또는 S-피발로일티오에틸 (t-부틸-SATE)이다. 이 보호기는 뉴클레아제 저항이고 세포내에서 선택적으로 제거된다.
약제학적으로 허용되는 결합제 및 첨가제는 약제(formulated drug)의 부분을 포하해도 좋다. 캡슐, 타블렛 및 필 등은 예컨대 이하 화합물을 포함해도 좋다: 바인더로서 미정질의 셀룰로오스, 검 또는 젤라틴; 부형제로서 전분 또는 락토오스; 윤활제로서 스테아레이트; 각종 감미료 또는 향미제. 캡슐을 위한 복용 단위는 지방유와 같은 액체 캐리어를 포함해도 좋다. 당 또는 장 제제의 코팅은 복용 단위의 부분이어도 좋다. 본 발명의 화합물은 활성 약제학적 재료와 미세포성 현탁액을 형성하는 지질의 현탁액이어도 좋다. 본 발명의 화합물은 바람직한 작용을 손상시키지 않는 어느 물질 또는 바람직한 작용을 추가하는 물질과 혼합해도 좋다. 이들은 다른 뉴클레오티드 화합물을 포함하는 다른 약물을 포함한다. 비경구, 피하, 피내 또는 국소투여에 대해 제형은 무균의 희석제, 완충제, 강장 및 항균성의 조절제를 포함해도 좋다. 활성 화합물은 통제된 해리 특성을 갖는 임플란트 또는 마이크로캡슐을 포함하는, 신체로부터 열화 또는 즉시 제거에 대항항 보호하는 캐리어로 제조될 수 있다. 정맥 투여에 대해서 바람직한 캐리어는 생리 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수이다.
바람직하게는, 본 발명의 화합물은 치료되는 환자에 심각한 부작용을 유발하지 않고 치료적으로 효과적인 양을 환자에게 전달하기 위해 충분한 양으로, 약제학적으로 허용되는 캐리어 또는 희석제와 같은 유닛 제형에 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소적 또는 전신 치료가 바람직한 지 및 치료되는 부분에 따라 많은 다른 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 (a) 경구 (b) 폐, 예컨대 분무기(nebulizer)를 포함하여 파우더 또는 에어로졸의 흡입제(inhalation) 또는 흡입제(insufflation)에 의해; 기관내, 비강내, (c) 상피, 경피, 눈을 포함하는 국소 및 질 및 직장 딜리버리를 포함하는 점액질 멤브레인까지; 또는 (d) 정맥, 동맥(intraarterial), 피하, 복강내(intraperitoneal) 또는 근육내를 포함하는 비경구 주사 또는 흡입; 또는 두개내(intracranial), 예컨대 척추 강내(intrathecal) 또는 심실내(intraventricular) 투여이어도 좋다. 하나의 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 IV, IP, 경구로, 국소적으로 또는 표적 기관에 급속 주사 또는 직접적으로 투여됨으로써 투여된다. 국소 투여에 대한 약제학적 조성물 및 제형은 경피 패치(transdermal patches), 연고, 로션, 크림, 겔, 방울, 스프레이, 좌약(suppositories), 액체 및 파우더를 포함해도 좋다. 종래의 약제학적 캐리어, 수성, 파우서 또는 유성 염기, 증점제 등은 필요하거나 바람직할 수 있다. 또한, 코팅된 콘돔, 장갑 등은 유용할 수 있다. 바람직한 국소적 제형은 본 발명의 화합물은 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제와 같은 국소적 딜리버리 제제와 혼합된다. 경구 투여용 조성물 및 제형은 그것에 제한되지 않지만 파우더 또는 분말, 마이크로미립자, 나노미립자, 현탁액 또는 수용액 또는 비수성 매체, 캡슐, 겔 캡슐, 봉지, 타블렛 또는 미니타블렛을 들 수 있다. 비경구, 척추 강내의 또는 심실내 투여의 조성물 및 제형은 소정의 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제, 예컨대 그것에 한정되지 않지만 침투기제(penetration enhancer), 캐리어 화합물 및 다른 약제학적으로 허용되는 캐리어 또는 첨가제를 포함해도 좋은 살균한 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그것에 한정되지 않지만 용액, 현탁액, 및 리포솜 함유 제형을 포함한다. 이 조성물은 그것에 한정되지 않지만 기존 액체(preformed liquid), 자가 에멀전화 고체(self-emulsifying solid) 및 자가 에멀전화 반고체를 포함하는 각종 성분으로부터 생성될 수 있다. 종양 조직에 약물의 딜리버리는 그것에 한정되지 않지만 양이온성 리포솜, 시클로덱스트린, 포르피린 유도체, 분기쇄 덴드리머, 폴리에틸렌이민 폴리머, 나노입자 및 마이크로스피어를 포함하는 캐리어-매개된 딜리버리에 의해 강화될 수 있다(Dass C R. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27). 유닛 복용 형태로 편리하게 존재되어도 좋은 본 발명의 약제학적 제형은 제약 산업에 잘 알려진 종래의 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 약제학적 캐리어 또는 첨가제를 갖는 활성 재료에 관련시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 제형은 액체 캐리어 또는 미세하게 분리된 고체 캐리어 또는 둘다 내에 활성 재료를 균일하게 상세하게 관련시키는 것에 의해 제조된 후 필요에 따라 생성물을 성형한다. 본 발명의 조성물은 그것에 한정되지 않지만 타블렛, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 소프트 겔 및 좌약과 같은 다수의 가능한 복용 형태로 제형될 수 있다. 본 발명의 조성물은 수용성, 비수용성 또는 혼합된 매체에 현탁액으로서 제형될 수 있다. 수 현탁액은 예컨대 소듐 카르복시메틸-셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물은 활성 약 물질, 예컨대 아스피린, 이부프로펜, 술파제, 당뇨병액, 항균제 또는 항생제에 콘쥬게이트될 수 있다. 다른 유용한 콘큐게이트는 상기에 기재되었다.
올리고뉴클레오티드가 설치류 또는 인간 환자와 같은 포유류에 경구로 이용가능하도록 희석제, 캐리어, 및 완충제가 본 발명의 범위내이다. 이러한 캐리어의 특정 실시예는 카프레이트 염, 예컨대 소듐 카프레이트이다. Tillman, LG et al. (2008) J. of Pharmaceutical Sciences, Jan. 97(1) 225; Gonzalez, FM et al. (2003) Eur . J. Pharm . Biopharm, Jan: 55(1): 19-26; Aouadi, M et al. (2009) Nature 458: 1180을 참조하고, 제형을 제조하는데 관련된 정보의 여기에 기재된 참조는 올리고뉴클레오티드를 경구로 투여하는데 적합하다.
본 발명의 특정 제형 또는 투여가 유일한 활성제로서 단일의 발명 화합물을 포함해도 좋다고 평가될 것이다. 그러나, 다른 발명의 실시형태에 있어서, 투여 제형 또는 투여는 2 이상의 발명 화합물, 예컨대 이들 화합물의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10을 포함한다. 일반적으로 사용되는 발명의 화합물의 수는 5 미만, 예컨대 1, 2 또는 3일 것이다. 예컨대, 이러한 제형 또는 투여는 제 1 핵산에 표적인 하나 이상의 siLNA 또는 sisiLNA 화합물, 제 2 핵산에 표적인 하나 이상의 추가적인 siLNA 또는 sisiLNA 화합물을 포함해도 좋다. 2 이상의 결합된 화합물은 함께 또는 연속적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 상기 나타낸 바와 같이 많은 치료적 용도로 유용하다. 일반적으로 본 발명의 치료적 방법은 포유류, 특히 인간에 바람직한 화합물(또는 하나 이상의 화합물, 예컨대 동일한 것의 1, 2, 3 또는 4)의 치료적인 유효량의 투여를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 (a) 본 발명의 하나 이상의 화합물, 및 (b) 하나 이상의 다른 제제, 예컨대 여기에 기재된 바와 같은 항염증성 제제 또는 보체 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 화합물을 사용할 때 이러한 조성물 및 제제는 개별적으로, 순차적으로 또는 급성 또는 만성 신경병증의 예방 또는 치료에 허용되는 것을 포함하는 다른 요법을 포함하는 하나 이상의 다른 조성물 및 제제와의 조합으로 사용되어도 좋다.
본 발명의 화합물은 진단, 치료 및 예방에 연구 시약으로서 사용될 수 있다. 연구에 있어서, 화합물은 셀 및 실험 동물에 표적 유전자의 합성을 구체적으로 억제하여 표적의 기능 분석 또는 치료 개입의 표적으로서 유용함의 평가를 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 올리고머, siRNA 및 sisiRNA 조성물은 노던 블로팅(Northern blotting), in-situ hybridisation 또는 유사한 기술에 의해 셀 및 조직에 표적 발현을 검출 및 수량화하는데 사용될 수 있다. 치료법에 대해서, 표적의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질병 또는 장애가 있다고 추정되는 동물 또는 인간은 본 발명에 따른 화합물을 투여함으로써 치료된다. 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 조성물의 치료적으로 또는 예방적으로 유효량을 투여함으로써 표적의 발현에 관련된 질병 또는 조건을 갖는다고 의심되거나 입증된 동물 특히 생쥐 및 쥐를 치료하고 인간을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
신경 재생
설명한 바와 같이 본 발명은 보체계의 바람직하지 않은 활성에 의해 매개되는 장애의 증상을 치료, 예방 또는 감소하는 방법을 더 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, 방법은 적어도 하나의 본 발명의 화합물, 특히 필요에 따라 포유류(예컨대 영장류 또는 비영장류 포유류, 특히 인간 환자)에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 구절 <<보체계의 바람직하지 않은 활성에 의해 매개되는 장애>>는 신경 재생에 불능 또는 불충분성에 의해 전체 또는 부분으로 나타낸 신경적 장애를 의미한다. 이러한 장애의 예로는 말초 신경계(peripheral nervous system)(PNS) 또는 중추 신경계(central nervous system)(CNS)에서 신경에 급성 또는 만성의 손상 후 신경 재생의 능력 또는 불충분이 나타나는 것을 포함한다. 신경을 재생하는데(또는 손상된 신경의 기능을 향상시키는데) 불능 또는 불충분함은 분야에 알려진 시험에 의해 검출되고 일부 케이스는 수량화될 수 있다. 예컨대 Ramaglia, V. et al. (2007) J. Neurosci . 27:7663 (다른 것들 사이에서, 쥐의 신경 퇴화 및 재생을 검출하고 선택적으로 수량화하는 분석을 기재함)); Wolf, SL (2001) Stroke 32:1635 (운동 기능 시험(motor function test)); S. Van Tuijl, et al. (2002) Spinal Cord 40:51 (운동 기능 시험); Sheikh, K et al. (1980) Rheumatology 19:83 (운동 기능 시험); Chan A.We et al. (2001) J. Neurol . Neurosurg . Psychology 55:56 (감각 기능 시험(sensory function test)) ; and Mayuko. W et al. (2005) J. Jap . Soc . For Surgery of the Hand (2005) 22:842 (다수의 감각 기능 시험); 및 여기에 인용된 참조문헌들을 참조한다.
축삭 재생에 향상을 모니터링하는 방법은 기재되어 왔고, 인간 환자에 행해질 수 있는 각종 기능 시험을 일반적으로 포함한다. Weinstein Enhanced Sensory Test (WEST), Semmes-Weinstein Monofilament Test (SWMT) 및 다른 것들과 같은 이러한 시험은 일반적으로 감각 및/또는 운동 기능의 회복을 모니터한다. WO2008/044928 (PCT/NL2007/050490), Ristic S, et al. (2000)　Clin Orthop Relat Res.　370:138, 신경 재생을 검출 및 모니터링하는 방법 및 각종 신경 손상을 분류하는 방법에 대해 인용된 참조문헌을 참조한다. 본 발명의 화합물의 적당한 복용량은 여기에 기재된 바와 같이 이들 또는 다른 허용되는 시험에 따라 축삭 재생을 증진시키는 것을 보여줄 수 있는 것이다. <<유효량>>, <<치료적 양>> 또는 관련 구절은 이들 또는 다른 허용되는 시험에 의해 결정된 바와 같이 바람직한 치료적 결과를 이루기에 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물 및 방법은 급성 또는 만성 신경 손상에 관련된 증상을 예방, 치료 또는 감소하는데 사용될 수 있다. 급성 또는 만성이든 축삭 재생을 필요로하는 조건은 예컨대 WO2007/044928 및 여기서 인용된 참조에 기재되었다. 말초 신경에 급성 외상은 총알 또는 다른 물체와 같이 관통하는 미사일로부터 총알 외상을 포함하는 상대적으로 일반적이다. 신경의 깨끗한 열상의 결과인 찔림(stab wound) 또는 이물(예컨대, 유리, 시트 금속)로부터의 손상은 척골 신경 신경차단 및 요골 신경 병변(radial nerve lesions)를 포함하는, 골절(bone fractures) 및 골절 탈구(fracture-dislocations)로부터 스테밍하는(stemming) 신경 손상으로 알려져 있다. 일반적으로, 급성 신경 손상은 이질통, 통증 한계점 및 과형성의 감소, 유해 자극에 대한 반응의 증가로도 나타내는, 오래 지속되는 신경병증을 형성한다. Colohan AR, et al. (1996) Injury to the peripheral nerves .　In: Feliciano DV, Moore EE, Mattox KL.　Trauma.　3rd ed.　Stamford, Conn:　Appleton & Lange;　1996:853을 참조한다.
본 발명의 범위 내에 급성 신경 손상은 TBI(traumatic brain injury) 및 척수(spinal cord) 및 말초/감각 신경의 급성 손상, 신경 인설트(insult)를 포함하는 각종 스포츠 손상을 들 수 있다. WO2007/044928 및 여기에 인용된 참조 문헌을 참조한다.
급성 신경 손상에 반응한 축삭 재생을 증진시키는 것이 바람직한 실시형태에 있어서, 인설트된 후 가능한 한 빨리, 예컨대 약 24, 12, 6, 3, 2, 1 또는 1시간 미만 내에, 바람직하게는 인설트 후 5, 10, 20, 30 또는 40분 내에 적어도 하나의 발명의 화합물(예컨대, 동일한 것의 1, 2 또는 3)을 투여하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 추가로, 적어도 하나의 본 발명의 화합물은 신경 손상의 위험과 관련된 의학 개입(예컨대, 수술) 전에 프로포락티컬리(propholactically)하게(예방 방법으로서) 투여될 수 있다. 본 발명의 실시형태에 있어서, 신경 재생은 양호하게 향상되고 회복 시간을 줄일 것이다.
설명된 바와 같이 본 발명은 신경계에 만성적인 손상에 관련된 증상을 치료, 예방 또는 감소하는데 유용하다. 한정되지 않는 예는 많은 만성적 말이집탈락성 신경병증(chronic demyelinating neuropathies) (CMT1 type), HMSN (CMT) 질병 타입 1A 및 1B, HNPP 및 다른 압박 마비(pressure palsies), 베틀렘 근육병, Limb-Geridle 근이 영양증(muscular dystrophy), Miyoshi myhopathy, 점성연골 이형성증(rhizomelic chondrodysplasia punctata), HMSN-Lom, PXE (pseudoxanthomatosis elastica), CCFDN (congential cataract facial dysmorphism and neuoropathy), 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병, 샤코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 다발성 경화증, 루게릭병 (ALS), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome) (GBS, 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로도 알려짐 또는 AIDP), 백질 변성증(leukodystrophy), 파킨슨병, 운동 뉴런증(motor neuron disease), 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathies), 말초 축삭병증(distal axonopathies), 예컨대 대사 또는 독성 뉴런 교란으로부터 생성된 것 (예컨대, 당뇨병, 신부전, 약물 또는 독소에 노출(예컨대, 항암제), 영양실조 또는 알콜중독), 단발성 신경병증(mononeuropathies), 신경근병증(radiculopathies) (예컨대, 뇌신경 VII; 안면 신경의), 한센병 (나병(leprosy)), 및 신경총병증(plexopathies), 예컨대 상완신경염(brachial neuritis); 및 국소 함정 신경병증(focal entrapment neuropathies ) (예컨대, 수근관 증후군(carpal tunnel syndrome))을 포함하는 WO2007/044928에 이미 기재된 것들을 들 수 있다.
치료 목적이 만성적인 신경 인설트를 치료하는 것인 실시형태에 있어서, 더욱 장기간 투여 프로토콜은 일반적으로 바람직하다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 발명의 화합물(예컨대, 동일한 것의 1, 2 또는 3)은 적어도 24시간 동안 바람직하게는 며칠, 몇주 또는 몇달에서 특정 지시에 관련된 증상을 치료 또는 감소하는데 필요한 몇년까지 여기에 설명한 어떤 허용되는 루트에 의해 투여될 수 있다.
설명한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 보체계의 바람직하지 않은 활성에 의해 매개되는 장애의 증상을 치료, 예방 또는 감소하는 다른 제제와의 조합으로 사용될 수 있다. 염증을 동반하거나 장애를 동반한다고 의심되는 하나의 실시형태에 있어서, 방법은 적어도 하나의 항염증 제제(예컨대, 동일한 것의 1, 2 또는 3) 및/또는 보체 억제제를 투여하는 단계를 포함할 것이다. 항염증 제제의 한정되지 않는 예는 스테로이드(예컨대 코르티코스테로이드) 또는 비스테로이드 항염증성 약물(NSAID)이다. 다른 적합한 스테로이드의 예로는 코르티손(cortisone), 히드로코르티손, 트리암시놀론(triamcinolone) (kenacort),메틸프레드니솔론(methylprednisolone) (medrol), 프레드니솔론 (prelone), 프레드니손(prednisone) 및 덱사메타손(dexamethasone) (decadron)을 들 수 있다. 실례적인 NSAIDs은 아세틸살리실산(아스피린, 에코트린(ecotrin)), 콜린 마그네슘 살리실레이트 (trilisate), Cox-2 억제제, 디클로페낙(diclofenac) (볼타렌(voltaren), 카타플람(cataflam), 콜타렌(coltaren)-XR), 디플루니살(diflunisal) (도로비드(dolobid)), 에토돌락(etodolac), (로딘(lodine)), 페노프로펜(fenoprofen) (날폰(nalfon)), 플루비프로펜(flurbiprofen) (안사이드(ansaid)), 이부프로펜, 인도메타신(indomethacin), (인도신(indocin), 인도신-SR), 케토프로펜(ketoprofen), 메클로페나메이트(meclofenamate), (메클로멘(meclomen)), 나부메톤(nabumetone), (레라펜(relafen)), 나프록센(naproxen), (나프로신(naprosyn), 나프레란(naprelan), 아나프록스(anaprox), 알레브(aleve)), 옥사프로진(oxaprozin), (다이프로(daypro)), 페닐부타존(phenylbutazone), (부타졸리딘), 피록시캠(piroxicam), (펠덴(feldene)), 살사레이트(salsalate), (디살시드(disalcid), 사플렉스(salflex)), 톨메틴(tolmetin), (토렉틴) 및 발데콕시브(valdecoxib), (벡스트라(bextra))를 들 수 있다.
본 발명의 조성물이 다발성 경화증에 관련된 증상을 예방, 치료 또는 감소하는데 사용되는 실시형태에 있어서, 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 승인된 약물, 예컨대 Rebif®(interferon beta-1a, Serono, Pfizer), Avonex®(interferon beta-1a, Biogen-Idec), Betaseron®(interferon beta-1b, Bayer Schering), Copaxone®(glatiramer acetate,Teva), Novantrone®(mitozantrone, Serono), 및 Tysabri®(natalizumab, Biogen-Idec)과의 조합이 사용되어도 좋다. 이하에 더 상세히 설명됨으로써 발명의 화합물의 동시-투여가 특정 기간에 걸쳐서 승인된 약물보다 적게 환자에 노출시켜 바람직하지 않은 부작용의 기회를 감소할 것이다.
휴약기( Drug Holiday )
설명된 바와 같이, 적어도 하나의 발명의 화합물을 투여함으로써 여기에 설명된 장애의 격렬함을 예방, 치료 또는 감소할 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 이끌기 위해서 피험자를 화합물에 계속적으로 노출시킬 필요는 없다는 것이 발견되었다. 즉, 화합물의 투여량을 감소시키고, 때로 충분히, "휴약기"라고도 하는 기간을 중지하는 것이 가능하다. 휴약기 동안, 보체 mRNAsms 본 발명의 화합물의 투여 후 며칠에 걸쳐, 몇주에 걸쳐 약 몇달까지 낮게 유지된다(qPCR을 사용하고 통제군에 비해 약 10% 미만, 20%, 30%, 40%, 50% 이상). 이하 조건 하에서 제조된 보체 mRNA의 양은 인코딩된 프로테인의 보통 레벨을 제조하는데 충분하다고 믿어진다. 발명의 화합물의 투여는 단독으로 또는 다른 약물과의 조합으로 이 기간에 걸쳐 필요하지 않다. 휴약기 후, 하나 이상의 발명의 화합물의 투여는 단독으로 또는 다른 약물과의 조합으로 재개될 수 있다.
본 발명의 실시형태의 실행은 중요한 이점을 제공한다.
예컨대, 본 발명의 용도는 인간 환자에게 외과적인 것, 고통스러운 것 및 반복적이고 비싼 치료 프로토콜로부터 맣은 사람들이 원하는 안정을 제공할 수 있다. 강력하게 심각한 부작용이 줄어들고, 지연되거나 일부 예에서 제거될 수 있다. 실시예의 방법에 의해, 구역, 감기 같은 증상, 주사 부위 반응, 탈모(alopecia), 감염, 폐렴(pneumonia), 월경 문제(menstruation problems), 우울증, 담석증(cholelithiasis), 및/또는 진행성다병소성백질뇌증(progressive multifocal leukoencephalopathy) (PNL)의 발전 위험은 다발성 경화증을 치료하기 위해 약물을 수여받는 일부 환자에 의해 보고되었다. 이들 및 다른 부작용은 본 발명의 실행에 의해 일부 경우에 감소되거나 제거할 수 있다.
추가로, 약물의 반복 및 빈번한 복용에 관련된 비용은 본 발명의 용도에 의해 감소될 수 있다. 실시예로서, 각각의 Rebif®, Avonex®, Betaseron® 및 Copaxone®는 다발성 경화증 환자에게 매주 한번 이상, 보통 고통스러운 주사에 의해 투여된다고 한다. 발명의 화합물의 동시-투여는 투여당 필요로 하는 약물이 적어진다고 믿어진다. 대신에 또는 추가로, 약물의 빈번한 복용량의 감소는 필요하다. 두 경우에 있어서, 환자 치료 비용은 낮아지고, 환자의 편안함은 향상된다. 다발성 경화증의 치료에 사용되는 다른 약물은 매달 환자에게 투여된다(예컨대, Novantrone® 및 Tysabri®). 이들 실시형태 조차도, 본 발명의 실행은 필요로하는 약물의 양을 줄이고, 빈번한 복용을 줄여 부작용의 위험을 줄이고 비용을 낮출 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 발명의 화합물의 투여를 단독으로 또는 잘 알려진 약물과의 조합으로 하여 휴약기를 줄이는, 여기에 설명된 장애의 증상을 예방, 치료 또는 감소하는 방법을 제공하는 것이다. 하나의 실시형태에 있어서, 약물의 투여는 휴약기 동안 완전히 제저한다. 휴약기 후 또는 때때로 동안에, 본 발명의 화합물, 공지 약물(또는 모두)은 포유류에 이전에 투여된 양으로부터 실질적으로 동일하거나 다른(예컨대, 적은) 양으로 다시 투여된다. 제 2 약물 투여는 필요에 따라 다른 휴약기에 이어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 특징은 각 휴약기가 적어도 하나의 발명의 화합물, 공지 약물(또는 둘다)의 양으로 투여되어 바람직한 치료 결과를 이룬 후가 바람직한 적어도 하나의 휴약기를 제공하는 것이다.
따라서, 특정 실시형태에 있어서, 발명의 화합물은 다발성 경화증으로 고통을 겪는(또는 고통을 겪는다고 추정되는) 인간 환자에게 투여된다. 본 발명의 화합물은 약제학적으로 효과가 있는 양으로 단독으로 또는 Rebif®, Avonex®, Betaseron®, Copaxone®, Novantrone® 또는 Tysabri®와 같은 공지의 다발성 경화증 약물과의 조합으로 투여될 수 있다. 휴약기 동안, 본 발명의 화합물 및/또는 다발성 경화증 약물의 투여가 실질적으로 감소하거나 제거될 수 있다. 방법은 필요에 따라 1, 2, 3, 또는 자주 반복되어 1, 2, 또는 이상의 휴약기를 특징으로 하는 최적 투약 방식(therapeutic regimen)을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법은 예컨대 며칠, 몇주, 몇달 내내에서 환자에게 다발성 경화증에 관련된 증상이 예방, 치료 또는 감소되는 생애 주기까지 필요에 따라 반복될 수 있다.
휴약기의 도입 전에, 본 발명의 화합물 또는 공지 약물의 양은 바람직하게는 초과하지 않고, 치료적으로 효과적인 것이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 통제 및 결정된, 예컨대 pPCR에 비해 보체 mRNA의 존재를 줄이는 것이 일반적으로 충분하다. 휴약기를 시작하기 위해, 본 발명의 화합물 또는 공지 약물의 양을 줄이거나 완전히 제거한다. 휴약기는 이전에 설명한 통제군보다 레벨이 낮은한 생체내 보체 mRNA의 어떤 특정한 레벨도 규정하지 않는다. 휴약기 후, 포유류는 적어도 하나의 발명의 화합물 단독 또는 여기에 설명되는 다발성 경화증의 치료에 사용되는 것과 같은 공지의 약물과의 조합을 더 투여하는 것을 포함하여 추가적인 요법을 행할 수 있다.
특정 휴약기 프로토콜의 용도는 환자의 일반적인 건강, 성, 장애의 격렬함, 투여되는 공지 약물의 형태 등과 같은 인식되는 파라미터에 의해 인도될 것이다.
본 발명은 포유류의 C6의 발현을 감소 또는 억제하기 충분하고 신경 재생을 향상하는 적어도 하나의 본 발명의 화합물의 양을 포유류에 투여하는(치료적으로 또는 예방적으로) 단계를 포함하는 포유류의 신경 재생을 향상하는 방법을 더 제공한다. 신경 재생 향상을 평가하는 방법은 운동 및 감각 신경 기능을 검출 및 선택적으로 수량화하는 각종 시험을 포함하여 기재한다.
필요에 따라, 여기에 설명된 하나 이상의 본 발명의 화합물은 명기된 발명자에 의해 동시-현안의 특허 출원에 기재된 하나 이상의 화합물과 조합될 수 있고, 출원은 Antagonists of Complement Component ( C8 - alpha ) and Uses Thereof; Antagonists of Complement Component ( C8 - beta ) and Uses Thereof ; 및 Antagonists of Complement Component ( C9 ) and Uses Thereof으로 명명되고; 각 출원은 현재 출원으로서 출원일이 동일하다. 이 실시형태에 있어서, 표적 다른 MAC 복합체 성분은 복합체의 발현을 줄일 수 있다.
여기에 참조 <<발명의 화합물>> 또는 <<본 발명의 조성물>> 또는 유사한 구절은 여기에 설명된 조성물을 의미한다.
다른 더욱 구체적인 실시형태는 본 발명의 범위내이다. 예컨대, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체로 나타내는 보체 성분 6 (C6)을 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 시퀀스 동일성을 갖는 근접한 뉴클레오염기 시퀀스를 갖는 약 10 내지 50 뉴클레오티드 실이의 올리고머를 제공하고, 상기 올리고머는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 바람직하게는 올리고머는 qPCR 분석에 의해 측정됨으로써 적어도 20% 포유류의 C6 mRNA 발현 레벨을 감소할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 올리고머는 변형된 인터뉴클레오시드 결합 및 변형된 뉴클레오염기를 더 포함한다. 실시예는 여기에 제공되고 2'-O-메톡시에틸 변형 당 부분, 2'-메톡시 변형 당 부분, 2'-O-알킬 변형 당 부분, 및 이환식 당 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 당 부분을 포함한다. 이 실시형태에 사용되는 일반적으로 바람직한 이환식 당부분은 LNA 모노머이다. 더욱 특정한 실시형태에 있어서, 올리고머는 올리고머의 각 3' 및 5' 말단에 2 또는 3 LNA 모노머를 포함하는 갭머이다. 하나의 실시예에 있어서, 올리고머는 5' 내지 3' 윙 세그먼트에 위치된 하나 이상의 2'-데옥시뉴클레오티드를 더 포함한다. 선택적으로, 갭머는 올리고머의 3' 말단, 5' 말단 또는 3' 및 5' 말단에 위치한 추가적인 2'-데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 앞선 발명의 실시예에 사용되는 일반적으로 유용한 변형된 인터뉴클레오티드 결합은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합이다. 변형된 뉴클레오염기는 5-메틸시토신일 수 있다. 더 적은 올리고머는 약 12 내지 약 20 뉴클레오티드, 더욱 구체적으로는 약 15 내지 약 18 뉴클레오티드의 길이, 예컨대 15, 16, 17, 18 도는 19 뉴클레오티드의 길이와 같이 유용하다.
본 발명의 실시형태에 일반적으로 유용한 올리고머는 SEQ ID NO: 1의 ATG 개시 부위("A"에서 개시)로부터 약 뉴클레오티드 1-332, 253-653, 266-766, 526-926, 853-1253, 특히 약 뉴클레오티드 32-232, 353-553, 466-666, 626-826 및 953-1153; 더욱 특히 약 뉴클레오티드 82-182, 403-503, 516-616, 676-776, 1003-1103; 보다 더욱 특히 약 뉴클레오티드 112-152, 433-473, 546-586, 706-746, 1015-1055; 예컨대 이하 표 1 및 2에 언급된 특이 표적 부위에 표적인 것이다. 평가됨으로써, 이러한 올리고머는 의도된 결과를 제공하는 SEQ ID NO: 1 로 나타내는 시퀀스를 갖는 100% 미만의 시퀀스 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 올리고머는 SEQ ID NO:1로 나타내는 보체 성분 C6 시퀀스에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5의 미스매치를 포함한다. 일반적으로 유용한 올리고머는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
여기에 기재되는 적어도 하나의 올리고머, 약제학적으로 허용되는 희석제, 캐리어, 염 또는 첨가제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 다수의 발명의 실시형태에 대해 경구로 허용되는 제형으로서 제공되는 올리고머는 유용하다.
생체내 셀 또는 조직에 보체 성분 6(C6)의 발현을 감소 또는 억제하는 방법을 추가적으로 제공하도, 상기 방법은 제 1 항의 올리고머와 상기 셀 또는 조직이 접촉하여 보체 성분 6(C6)의 발현이 감소 또는 억제되는 단계를 포함한다. 방법은 올리고머의 투여 후 적어도 하나의 보체 성분 6 (C6), 프로테인(예컨대 pPCR로)을 인코딩하는 mRNA 및 막공격 복합체(MAC, 예컨대, CH50 분석으로)를 측정하는 단계를 더 포함한다.
또한, 본 발명의 범위내에서 생체내 셀 또는 조직내 막공격 복합체(MAC)의 형성을 감소 또는 억제하는 방법이고, 이 방법은 제 1 항의 올리고머와 상기 셀 또는 조직이 접촉하여 MAC의 발현이 감소 또는 억제되는 단계를 포함한다. 방법은 올리고머의 투여 후 적어도 하나의 보체 성분 6 (C6), 프로테인(예컨대 pPCR로)을 인코딩하는 mRNA 및 막공격 복합체(MAC, 예컨대, CH50 분석으로)를 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 보체계의 바람직하지 않은 활성을 매개하는 장애의 증상을 치료, 예방 또는 감소하는 방법을 제공한다. 바람지하게는, 방법은 필요에 따라 포유류에 여기에 기재된 적어도 하나의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 장애는 다발성 경화증(예컨대, RRMS 형태)과 같은 만성 탈수초성 신경병증이다. 방법은 유연하고 사용될 수 있어 약제학적 조성물은 하나 이상의 발명의 화합물을 포함한다. 또한, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 Rebif®(interferon beta-1a), Avonex®(interferon beta-1a), Betaseron®(interferon beta-1b), Copaxone®(glatiramer acetate), Novantrone®(mitozantrone), 및 Tysabri®(natalizumab) (모두 다발성 경화증의 치료용)과 같은 공지 약물을 더 포함할 수 있다.
또한, 보체계의 바람직하지 않은 활성에 의해 매개되는 장애의 증상을 치료, 예방 또는 감소하는 방법을 제공하고, 이 방법은 필요에 따라 포유류에 여기에 성명된 적어도 하나의 약제학적 조성물을 투여하는 단계 및 하나 이상의 항염증성 제제 및 보체 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법이 유용한 특정 장애는 급성 또는 만성일 수 있는 신경 외상이다. 급성 신경 외상의 예로는 TBI(traumatic brain injury)이다.
또한, 축삭 재생에 요구되는 조건의 치료약의 제조에 사용되는 적어도 하나의 본 발명의 조성물(예컨대, 1, 2 또는 3)의 용도가 제공된다.
또한, 다발성 경화증과 같은 만성 수초성 질병의 치료약의 제조에 사용되는 적어도 하나의 본 발명의 조성물(예컨대, 1, 2 또는 3)의 용도가 제공된다.
이하 실시예는 본 발명을 완전히 이해시키기 위한 단지 설명의 목적으로 제공되었다. 이 실시예는 구체적으로 지시하지 않는 한 본 발명의 범위 내에 한정되지 않는다.
여기에 언급된 모든 참조의 상세는 여기에 참조로 인용되었다.
실시예 1: 간에서 보체 합성의 안티센스 억제제
보체 성분 C6은 간에서 주로 발현되고, 순환시 기관으로부터 분비된다. C6의 간 발현의 녹다운(Knockdown)은 MAC 복합체를 형성하는 능력이 실질적으로 감소되어 보체계의 효능이 감소한다. 많은 연구에서 조직적으로 투여되는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 간에서 효과적이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
보체 성분 C6에 대항하는 안티센스 올리고머는 설치류와 인간 사이에 높은 상동성을 가진 시퀀스에 대항하여 고안되었다(표 5A-5F. 3A-3F 참조). 안티센스 올리고뉴클레오티드(15-18mers)는 잠금 핵산(LNA)으로 화학적으로 변형되었다. LNA는 뉴클레아제에 대항하여 올리고를 보호하고, 보체 mRNA 시퀀스에 대한 친화성(Tm)을 증가시켜 높은 효능을 갖는 짧은 15-18mer 올리고뉴클레오티드의 사용을 가능하게 한다. 18 뉴클레오티드보다 짧은 올리고머는 긴 올리고머에 비해 선천성 면역 반응(innate immune responses)을 활성화하는 경향이 적다. 올리고뉴클레오티드는 갭머로 고안되었다. 이것은 올리고의 5' 말단에서 끝 위치 및 3' 말단에서 끝에서 두번째의 3위치는 LNA 부위를 포함하고, 중앙 및 3' 끝 위치는 DNA 유사체로 이루어진다는 것을 의미한다. 특징적인 갭머의 예는 이하로 나타낸다:
L=LNA, d=DNA
5'- LLLdddddddddLLLd -3'
또는
5'- LLLddddddddddLLL -3'
L= LNA 및 d=DNA이다. 모든 올리고는 포스포로티오화되어 신장 클리어런스(renal clearance)를 감소시키고, 생체내 순환 시간을 증가시킨다. 모든 C 자기는 메틸-C로 변환되어 면역 자극을 감소시킨다.
이하, 생쥐 C6에 대항하여 형성된 LNA 변형 안티센스 올리고뉴클레오티드의 구조를 나타낸다(표적 시퀀스 및 올리고 시퀀스는 생쥐이다).(볼드 및 대문자 텍스트=LNA, 작은 소문자 텍스트=DNA)
올리고머 SEQ ID NO: LNA 변형 올리고머 SEQ ID NO:
표적 위치 132
GAGCAGACAGAGACAA
 404 올리고5'3'T T G t c t c t g t c t g C T C
Batch No. 1008		 405
표적 위치 453
TATTCCCAGCAAGTTA
 406 Oligo5'3'T A A c t t g c t g g g a A T A
Batch No. 1009		 407
표적 위치 566
GTGTGCAGCTGATGGG
 408 Oligo5'3'C C C a t c a g c t g c a C A C
Batch No. 1010		 409
표적 위치 726
GGTACAAACTATAGAA
 410 Oligo5'3'T T C t a t a g t t t g t A C C
Batch No. 1011
 411
표적 위치 1035
GCCTTTAGAATACAAC
 412 Oligo5'3'G T T g t a t t c t a a a G G C
Batch No. 1012		 413
표 1에 나타낸 모든 LNA 변형 올리고머는 모두 포스포로티오화되었다.
모든 올리고머(ODN's)는 폴리스티렌 프라이머 지지체를 사용하여 130-185μmole에서 AKTA Oligopilot (GE Healthcare)에서 포스포라미디트 접근을 사용하여 합성했다. ODN's는 밀리포어 멤브레인을 사용하여 이온 교환(IEX) 및 탈염에 의해 정제했다. ODN's는 LC/MS(Agilent)에 의해 특징된다. ODN's의 분자 질량은 Biflex III MALDI (Brucker instruments, Leipzig, Germany)에서 MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry)로 점검하였다.
Figure pct00004
표 2는 LNA 모노머를 갖지 않는(SEQ ID Nos: 414, 416, 418, 420, 및 422) 또는 갖는(SEQ ID Nos. 415, 417, 419, 421, 및 423) 바람직한 대응 인간 올리고머와 함께 표 1에 나타낸 생쥐 올리고머를 나타낸다. LNA 치환기를 갖는 올리고머에 대해서, LNA 모노머는 볼드체 대문자 텍스트이고, DNA는 볼드체가 아니고, 소문자 텍스트이다.
생체내 올리고 효능 시험
배양 조직 내 셀 라인이 보체 프로테인을 나타내지 않으므로(또는 매우 낮은 레벨임), 올리고뉴클레오티드의 효능은 생체내에서 직접적으로 시험될 수 있다. 제 1 스크린의 목적은 생체내 효능이 있는 강력한 올리고의 세트를 최초의 디자인 리스트로부터 확인하는 것이다. 8~10주 생인 생쥐 NMRI 스트레인(Charles River, the Netherlands)은 PBS에 용해된 올리고 5mg/kg를 하루에 한번 주사했다(복막내 (IP) 또는 정맥내 (IV)). 통제하면서 우리는 제 1 스크리닝에만 PBS를 주사했다. 그룹 당 5마리 생쥐 각각에 치료를 했다. 치료 3일 후, 생쥐는 4일째 되는 날에 희생했다. 간 샘플을 꺼내 프로테인 레벨을 검출하고 mRNA 레벨의 정량을 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 사용하여 프로테인 성분의 녹다운 레벨을 결정하는데 사용했다.
웨스턴-면역 블롯(Western-immuno blot)은 mini-protean system(Biorad)을 사용하여 표준 조건하에서 아미드 전기 영동을 변성한 후 행해질 수 있다. 보체 프로테인은 시판중인 특정 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 사용하여 검출된다. 프로테인의 면역검출은 Lumi-Light enhanced chemi-luminescence kit (Roche) 및 LAS-3000 darkbox imaging system (FujiFilm, Tokyo, Japan)을 사용하여 행해진다. qPCR은 Lightcycler 480 system (Roche)에서 universal probes (Roche)를 사용하여 행한다.
잠재적 리드 후보자를 선택한 후, 통제군으로서 특정 미스매치 버전(최소 3 미스매치)를 고안할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 연장 투여(>4일)는 osmotic mini pumps (Alzet, Durect Co., Cupertino, Ca, USA)를 사용해서 행한다. 이 펌프는 제조자의 지시에 따라 등에(dorsally) 임플란트되었다. osmotic minipumps는 임플란트 후 꾸준한 딜리버리 속도에 빨리 도달하기 위해서 펌프를 시작하기 위한 임플란트 전에 37℃에서 20시간 PBS에서 배양된다. 이 펌프의 사용은 연장된 실험에서 동물이 받는 스트레스를 감소시키므로, 매일 주사는 필요하지 않다. 생체외 시험은 Alzet minipump가 24시간 내에 꾸준한 펌프 속도에 도달하는 것을 보여준다. osmotic minipump는 PBS에 용해된 올리고뉴클레오티드로 채워진다.
미니 톡스 스크린( Mini tox screen )
혈액 샘플 채취하여 혈청에서 ASAT(aspartate aminotransferase) 및 ALAT(alanine aminotransferase)를 측정한다. 혈청에서 ASAT 및 ALAT 레벨은 적당한 키트(Roche Diagnostics)와 H747 (Hitachi/Roche)를 사용하여 표준 진단 절차를 사용하여 결정되었다. 체중은 모니터되고 생쥐의 체온은 IPTT-200 transponder chips 및 a DAS 5002 chip reader (Biomedic Data Systems, Seaford, Dellaware, USA)을 사용하여 각 생쥐에 매일 측정했다.
실시예 2: 올리고뉴클레오티드로 치료한 3일 후 생체내 보체 mRNA 레벨
상기 표 1에 나타낸 LNA 올리고뉴클레오티드는 NMRI nu/nu 생쥐로 C6 mRNA 레벨을 감소시키는데 사용했다. 치료 그룹 당 4마리의 동물은 1마리의 PBS 통제쥐를 포함하여 사용했다(총 15마리 생쥐). 생쥐는 1, 2 및 3일에 각 올리고를 IP 주사했다(5mg/kg 동물). 생쥐는 5일에 희생되고 간이 절제되었다. RNA는 종래의 접근을 사용하여 제조했다. C6 mRNA는 제조자의 지시에 따라 Roche lightcycler 480 및 universal probes를 갖는 qPCR을 사용하여 수량화했다.
도 1은 보체 안티센스 LNA 올리고뉴클레오티드로 치료한 3일 후 생체내 mRNA 레벨을 나타낸다. 올리고 1008(SEQ ID NO: 405)은 2마리 동물이 3일에 죽고, 1마리 동물이 4일에 병들어 보일 만큼 독성이 있다.
실시예 3: CH50 분석 Balb /C 생쥐
보체 성분에 대항하는 안티센스 올리고머는 설치류와 인간 사이에 높은 상동성을 가진 시퀀스에 대항하여 고안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 잠금 핵산(LNA)으로 화학적으로 변형되었다. LNA는 뉴클레아제에 대항하여 올리고를 보호하고, 보체 mRNA 시퀀스에 대한 친화성(Tm)을 증가시켰다. 올리고뉴클레오티드는 갭머로 고안되었다. 이것은 올리고의 5' 말단에서 끝 위치 및 3' 말단에서 끝에서 두번째의 3위치는 LNA 부위를 포함하고, 중앙 및 3' 끝 위치는 DNA 유사체로 이루어진다는 것을 의미한다.
모든 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ODNs)는 시판되는 DNA 및 LNA 포스포라미디트(Exiqon A/S, Denmark)를 사용하여 자동 DNA 합성기에서 모든 포스포로티오에이트 유도체로서 합성된다. 모든 ODNs 5-메틸-C가 사용되었다. DMT-ON ODNs는 역상 HPLC (RP-HPLC)에 의해 정제되었다 (>95% 순도). DMT-그룹의 제거 후, ODNs는 AE-HPLC로 특성화되고, 예측하는 분자 질량은 ESI-MS 및 Biflex III MALDI (Brucker instruments, Leipzig, Germany)에서 MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry)에 의해 확인된다.
생쥐. 동물을 포함하는 모든 실험은 중앙 윤리 위원회에 의해 제제되고, 네덜란드 법에 모두 따랐다. 7-8주 생 암컷 Balb/C 생쥐(Harlan)는 피하로 임플란트되는 ALZET 1002 osmotic minipumps (Durect Corporation, Cupertino, CA, USA)를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 주었다. ODNs 및 siRNA은 PBS에 용해했다. 복용량은 도에 나타낸 바와 같다.
CH50 용혈 분석. 용혈 CH50 분석은 순환에서 막공격 복합체(MAC) 활성이 간에서 보체 녹다운에 효과를 결정하기 위해 사용된다. 이 분석은 혈청에서 MAC의 용혈 활성을 측정한다. 감응 적혈구는 분광 광도계를 사용하여 적혈구 분해의 양을 측정할 수 있다. 혈액을 생쥐로부터 빼내어 이것을 1시간 동안 얼음에서 응고시켰다. 그 후 혈청을 20㎕ 샘플로 부분적으로 분리하고, 액체 질소에서 즉시 냉동시켰다. CH50 분석은 생쥐 항토끼 적혈구 다클론성 항혈청(mouse anti Rabbit erythrocyte polyclonal antiserum)(Paul Morgan, Cardiff University)을 사용하여 토끼 감응 적혈구를 사용하여 행한다. 토끼 적혈구는 분석의 감도를 증가시키기 때문에 사용전 적어도 1개월 생의 것이다(그러나, 3개월 미만 생). 토끼 감응 적혈구(50㎕)는 37℃에서 생쥐 혈청의 10㎕의 존재하에서 베로날 완충 식염수 (40㎕)에서 배양된다. 100% 분해 값을 얻기 위해, 100㎕의 물을 첨가했다. 30-60분 후, 잔류하는 적혈구를 원심 분리(spun down)하고, 분광 광도계를 사용하여 OD405 nm를 측정했다.
도 2는 올리고 1009 (SEQ ID NO. 409)를 나타낸다. 올리고 1010 (SEQ ID NO. 413), 올리고 1014 (C8a application, SEQ ID NO. 327), 올리고 1018 (C8b application, SEQ ID NO. 336), 올리고 1019 (C8b application, SEQ ID NO. 338)는 2개의 대조군에 비해 MAC 형성이 억제된 능력을 나타냈다. 모든 올리고뉴클레오티드는 qPCR로 측정됨으로써 적어도 70%가 간에서 목적하는 표적의 녹다운을 매게했다. 2주 동안 복용량 5 mg/kg/day. 올리고 1614는 보체 레벨에 활성이 없는 스크램블된 올리고뉴클레오티드 통제군이다. MAC 활성은 상기 기재된 CH50 용혈 분석을 사용하여 측정했다. 데이터는 그룹±SEM 당 5 생쥐의 평균으로 설명된다.
실시예 4: siRNA 구조는 C6 mRNA 를 감소시킨다
상시에 설명된 절차로 올리고 1010 (SEQ ID NO. 413)을 제조하는데 사용된다. 0.5mg/kg 내지 5mg/kg를 상시 설명된 바와 같이 생쥐에 주사했다. qPCR은 이하와 같이 C6 발현을 측정하는데 사용된다: 동물은 희생되어 간 샘플을 저장 용액으로서 RNA later(Ambion)을 사용하여 채취했다. 간은 Magnalyzer and magnalyzer beads (Roche)를 사용하여 트리졸에서 균질화하고, RNA는 제조자 (Invitrogen)의 지시에 따라 트리졸을 사용하여 분리했다. cDNA는 oligodT 프라이머 및 SuperScriptII 효소 (Invitrogen)를 사용하여 제조했다. qPCR은 Universal probe primers (Roche) 및 Lightcycler 480 (Roche)를 사용하여 행했다. 모든 데이터는 항존 유전자(housekeeping gene)/로딩 통제로서 Hprt1 (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase 1)을 사용하여 정정했다. 모든 반응은 3번씩 행해지고, qPCR 조건은 제조자 (Roche)에 의해 추천된 표준으로서이다. 추가로, LNA 변형 RNA 상동체를 안티센스 올리고 올리고 1010 에 의해 표적이 된 시퀀스를 제조했다(SEQ ID NO. 413).
또한, 안티센스 올리고 올리고 1010에 의해 표적이 된 시퀀스에(SEQ ID NO. 413) LNA 변형 RNA 상동체를 고안했다. 이 siRNA는 모든 가닥의 3' 오버행에 LNA 변형 및 센스(패신저) 가닥의 5' 말단에 하나의 LNA를 갖는다.
LNA 변형 siRNA를 automated DNA/RNA synthesizer RNA synthesis cycle(1-5μmol 스케일)에서 합성되고, O2'-TBDMS 보호 RNA 포스포라미데이트 및 일반적인 시약은 사용되고 총 모노머의 단계적인 커플링 수율은>99%가 되었다. 변형된 뉴클레오티드의 도입에 대해서, 10분의 커플링 시간이 사용되었다. 탈보호, 정제 및 워크-업(work-up) 후, 얻어진 siRNA의 조성물 및 순도(>80%)는 MALDI-MS 분석 및 이온 교환 HPLC에 의해 확인되었다.
도 3은 Balb/C 생쥐에 투여되는 올리고 1010의 양과 C6 mRNA의 정정된 레벨 사이의 선형 상관을 나타낸다. 도는 siRNA 구조는 통제군에 비해 C6 mRNA가 감소된다는 것을 또한 보여준다. 특히, 올리고 101은 상동의 LNA 변형 siRNA 시퀀스로 치료된 효과와 비교하여 생체내 Balb/C 생쥐의 간에서 qPCR로 측정된다. 데이터는 그룹±SEM 당 5 생쥐의 평균으로 설명된다.
실시예 5: 신경 압좌 분석( nerve crush assay )
신경 압좌 분석은 압좌 손상 후 말초 신경의 회복에 조체 억게의 효과를 측정한다. 분석은 일반적으로 Ramaglia, V. et al. (2007) July 18: 27(29) 7663 및 여기에 기재된 참조에 기재된다. 간단히, 동물은 신경 압좌 손상을 받은 후에 통제군으로서 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PBS로 14일 동안 치료된다. 모든 외과 절차는 깊은 이소플루란 마취하에서(1.5　v/l 이소플루란 및 1.0　v/l O2) 무균으로 행해진다. 좌골 신경은 절개를 통해 위쪽에 노출된다. 신경은 부드러운 포셉(forcep)을 사용하여 좌골 절흔(sciatic notch )의 레벨에서 3×10s 기간 동안 압좌했다. 오른쪽 다리는 통제군으로 작용한다; 위장 수술(sham surgery)은 좌골 신경을 노출시키지만 건드리지 않는다. 근육 및 피부를 스티치로 닫는다. 생쥐는 수술후 회복 기간 동안 뮤통증 상태이다. 그들에게 손상 직전에 부프레노르핀(Temgesic® Schering-Plough, The Netherlands)의 1회 (0.05　mg/kg) 및 손상후 1일에 진통제의 2회로 치료했다. 감각 기능은 풋릭 시험(footflick test)을 사용하여 측정했다. 이 시험에 있어서, 가변전류(0.1-0.5 mA)를 2개의 자극 전극을 사용하여 족저부(foot sole)에 가한다. 반응은 동물이 발바닥을 움츠리는 경우에 포지티브로 스코어했다. 움츠림 반응을 끌어내는데 필요한 최소의 전류 (mA)가 기록되었다. 수치는 보통 기능의 퍼센트로 표현했다(오른쪽 통제 다리). 이 분석을 사용하여, 본 발명의 적어도 하나의 올리고머는 풋릭 시험에 상당한 활성을 나타냈다. 특히 적합한 캐리어에 올리고머를 수여받은 생쥐는 약 7일에 풋릭 분석에서 50% 회복을 나타냈다. 치료되지 않은 동물은 11일째쯤 동일한 회복을 보였다.
여기에 설명된 모든 참조의 공보(모든 특허 및 과학 문서를 포함함)는 여기서 참조로서 인용되었다. 본 발명은 바람직한 실시형태에 관하여 더 자세히 설명되어왔다. 그러나, 이 상세의 고려시 본 발명의 정신 및 범위내에서 변형 및 개선될 수 있다는 것은 당업자에게 널리 알려져 있다.
표 3
인간 보체 성분 6 (C6) mRNA를 인코딩하는 핵산 시퀀스(SEQ ID NO:1). ATG 개시 부위는 표시되었다.(Genbank Ref.NM_000065.2)
Figure pct00005

Figure pct00006

표 4A
선택된 C6 올리고뉴클레오티드, SEQ ID Nos: 2-67
Figure pct00007
Figure pct00008
표 4B
선택된 C6 올리고뉴클레오티드, SEQ ID Nos: 68-133
Figure pct00009
Figure pct00010
표 4C
선택된 C6 올리고뉴클레오티드, SEQ ID Nos: 134-199
Figure pct00011
Figure pct00012
표 4D
선택된 C6 올리고뉴클레오티드, SEQ ID Nos: 200-221
Figure pct00013

표 4E
선택된 C6 올리고뉴클레오티드, SEQ ID Nos: 222-251
Figure pct00014
표 5A-F
인간 (SEQ ID NO:1), 쥐 (SEQ ID NO: 402) 및 생쥐 (SEQ ID NO: 403) 보체 성분 6 (C6)의 시퀀스 . 또한, (음영 박스)는 인간, 쥐 및 생쥐로부터 선택된 올리고머 시퀀스(SEQ ID Nos: 252-401)를 나타낸다.
Figure pct00015

표 5B
Figure pct00016

표 5C
Figure pct00017

표 5D
Figure pct00018

표 5E
Figure pct00019

표 5F
Figure pct00020

Claims (30)

  1. SEQ ID NO:1 또는 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체(allelic variant)로 나타내는 보체 성분 6(COMPLEMENT COMPONENT 6) (C6)을 인코딩하는 핵산의 대응 영역에 적어도 95%의 시퀀스 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오염기 시퀀스를 갖는 약 10 내지 50 뉴클레오티드 길이의 올리고머로서:
    상기 올리고머는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, qPCR 분석에 의해 결정되는 적어도 20%에 의해 포유류의 C6 mRNA 발현 레벨을 감소시킬 수 있는 올리고머.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 올리고머가 적어도 하나의 변형 인터뉴클레오시드 결합 및 변형 뉴클레오염기를 더 포함하는 올리고머.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메톡시에틸 변형 당 부분, 2'-메톡시 변형 당 부분, 2'-O-알킬 변형 당 부분 및 이환 당 부분(bicyclic sugar moiety)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형 당 부분인 올리고머.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 이환 당 부분은 잠금 핵산(LNA) 모노머인 올리고머.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 올리고머는 올리고머의 3'말단 및 5'말단 각각에 2 또는 3 LNA 모노머를 포함하는 갭머(gapmer)인 올리고머.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 올리고머는 5' 내지 3' 윙 세그먼트, 선택적으로 올리고머의 5' 및 3' 말단의 하나 또는 모두에 위치된 2'-데옥시뉴클레오티드를 더 포함하는 올리고머.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 변형 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합인 올리고머.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 변형 뉴클레오염기는 5-메틸시토신인 올리고머.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 올리고머는 약 12 내지 약 20 뉴클레오티드 길이인 올리고머.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 올리고머는 약 15 내지 약 18 뉴클레오티드 길이인 올리고머.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 올리고머는 SEQ ID NO:1의 ATG 개시부("A"에서 개시됨)로부터 약 뉴클레오티드 1-332, 253-653, 266-766, 526-926, 853-1253을 표적으로 하는 올리고머.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 올리고머는 SEQ ID NO:1의 ATG 개시부로부터 약 뉴클레오티드 112-152, 433-473, 546-586, 706-746, 또는 1015-1055를 표적으로 하는 올리고머.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 올리고머는 SEQ ID NO:1로 나타내는 보체 성분 C6 시퀀스에 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 시퀀스 동일성을 갖는 올리고머.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 올리고머는 SEQ ID NO:1로 나타내는 보체 성분 C6 시퀀스에 대한 1개, 2개 또는 3개 미스매치를 포함하는 올리고머.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 올리고머는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)인 올리고머.
  16. 제1항의 올리고머 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 캐리어, 염 또는 보조제(adjuvant)를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 생체내 셀 또는 조직 내에서 보체 성분 6(C6)의 발현을 감소 또는 억제하는 방법으로:
    상기 방법은 상기 셀 또는 조직과 제1항의 올리고머를 접촉하여 보체 성분 6(C6)의 발현이 감소 또는 억제되는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 방법은 올리고머의 투여 후, 적어도 하나의 보체 성분 6(C6), 프로테인을 인코딩하는 mRNA 및 막공격 복합체(membrane attack complex)(MAC)를 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  19. 생체내 셀 또는 조직 내에서 막공격 복합체(MAC)의 생성을 감소 또는 억제하는 방법으로:
    상기 방법은 상기 셀 또는 조직과 제1항의 올리고머를 접촉하여 MAC의 발현이 감소 또는 억제되는 단계를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 방법은 상기 올리고머를 투여한 후, 적어도 하나의 MAC, 보체 성분 6(C6) 및 보체 성분 6을 인코딩하는 mRNA를 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  21. 보체계의 바람직하지 않은 활성에 의해 매개되는 장애의 증상을 치료, 예방 또는 감소시키는 방법으로:
    상기 방법은 필요에 따라 포유류에 제16항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 장애는 만성 탈수초성 신경병증(chronic demyelinating neuropathy)인 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 만성 탈수초성 신경병증은 다발성 경화증(multiple sclerosis)인 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 방법은 적어도 하나의 Rebif®(인터페론(interferon) 베타-1a), Avonex®(인터페론 베타-1a), Betaseron®(인터페론 베타-1b), Copaxone®(글라티라머(glatiramer) 아세테이트), Novantrone®(미토잔트론(mitozantrone)), 및 Tysabri®(나탈리주마브(natalizumab))를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  25. 보체계(complement system)의 바람직하지 않은 활성에 의해 매개되는 장애의 증상을 치료, 예방 또는 감소시키는 방법으로:
    상기 방법은 필요에 따라 포유류에 제16항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 항염증제 및 보체 억제제(complement inhibitor)를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  26. 제21항에 있어서,
    상기 장애는 신경적 외상(neuronal trauma)인 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 신경적 외상은 외상성 뇌손상(traumatic brain injury )(TBI)인 방법.
  28. 축색 재생(axonal regeneration)이 요구되는 조건의 치료약의 제조에 사용되는 제1항의 적어도 하나의 조성물의 용도.
  29. 만성 탈수초성 질환의 치료약의 제조에 사용되는 제1항의 적어도 하나의 조성물의 용도.
  30. 만성 탈수초성 질환은 다발성 경화증인 제27항의 용도.
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