KR20150035354A - 보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 ｃ5 항체 및 방법 - Google Patents

보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 ｃ5 항체 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150035354A
KR20150035354A KR1020140012235A KR20140012235A KR20150035354A KR 20150035354 A KR20150035354 A KR 20150035354A KR 1020140012235 A KR1020140012235 A KR 1020140012235A KR 20140012235 A KR20140012235 A KR 20140012235A KR 20150035354 A KR20150035354 A KR 20150035354A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
gly
val
leu
thr
Prior art date
Application number
KR1020140012235A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101638931B1 (ko
Inventor
정준호
김효리
이화경
양원준
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Publication of KR20150035354A publication Critical patent/KR20150035354A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101638931B1 publication Critical patent/KR101638931B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

본 발명은 C5에 대한 항체, 및 항체를 사용한 보체-관련 장애의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명의 C5에 대한 항체는 보체 활성화를 억제함으로써 보체-관련 장애의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 Ｃ5 항체 및 방법 {C5 ANTIBODIES AND METHODS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF COMPLEMENT-ASSOCIATED DISEASE}
본 발명은 C5에 대한 항체, 및 이러한 항체를 사용한 보체-관련 장애의 예방 및 치료에 관한 것이다.
보체계 (complement system) 는 선천성 면역의 첫 번째 단계를 담당하여, 감염원을 가장 빨리 인식하고 파괴하는 역할을 할 뿐만 아니라, 면역 세포들과의 상호작용을 통해 선천성 면역과 후천성 면역을 이어주는 중요한 역할을 담당하고 있다. 보체계는 고전경로, 대체경로, 렉틴경로라 불리는 세 가지 경로를 통하여 활성화되고, 뒤 이어 다양한 종류의 보체 단백질이 활성화된다. 보체 단백질들은 염증 물질의 분비를 활성화 시키고, 면역 세포들과 상호 작용을 하여 염증 반응을 조절하며, 감염원을 공격할 수 있는 물질을 만들어내는 등 외부 감염원을 효과적으로 제거한다. 보체계는 여러 종류의 보체 조절 단백질에 의하여 보체 활성이 지나치게 증가되는 것이 억제되고, 항상성을 유지하고 있으며, 염증반응과 면역반응의 다양한 단계에 걸쳐 핵심적인 역할을 담당하고 있기 때문에 보체 단백질과 보체 조절 단백질이 적절하게 조절되지 않을 경우 다양한 질환을 야기하는 것으로 알려져 있다.
고전경로, 대체경로, 렉틴경로에 의하여 보체계가 활성화되면 C5를 C5a 와 C5b 로 분해하는 C5 convertase 가 형성된다.
C5는 18개 잔기의 신호 서열 및 성숙 N-말단 베타쇄(β-chain)와 C-말단 알파쇄(α-chain) 사이에 위치하는 Arg-풍부 링커 서열 (RPRR)로 이루어진 1676개 아미노산의 단일 프로(pro)-C5 펩티드로서 세포내 발현된다. 성숙 C5는 약 190 kDa의 분자량을 가지며, 다이설피드 결합으로 연결된 2개의 폴리펩티드 쇄 (α, 115 kDa 및 β, 75 kDa)로 이루어진다. C5 전환효소는 C5를 알파쇄의 잔기 74 및 75 사이에서 절단하여 74개 아미노산의 C5a 펩티드, 및 이후에 막 공격 복합체 (MAC)로 혼입될 C5b 단편을 방출한다.
아나필라톡신인 C5a 는 백혈구와 혈소판을 직접적으로 활성화시키고, 호중구의 화학주성인자로 작용한다. C5b는 보체활성의 최종단계에서 C6, C7, C8, C9 과 함께 막 공격 복합체를 형성하여 세포용혈을 유발한다.
보체계가 과활성화 되면 비정상적인 면역반응이 나타나고, 정상세포의 손상이 발생하기 때문에 보체계의 비정상적인 활성은 자가면역질환, 보체관련질환 등과 연관되어있다. 혈구용혈질환은 유전적 결함에 의하여 혈구세포가 보체단백질의 공격으로부터 보호받지 못하여 발병하는 보체 관련 질환이다. 류마티스 관절염, 이식 등에서 나타나는 격렬한 면역반응과 조직파괴반응 또한 보체활성과 연관되어있고, 보체활성에 의하여 면역반응 뿐 아니라 조직손상에 의하여 VEGF와 같은 물질의 용출이 발생하여 신생혈관이 형성되고, 노인 황반 변성, 당뇨망막병증으로 이어지는 것으로 보고되어있다.
즉, 보체 시스템이 건강을 유지하는데 중요한 역할을 가지지만, 그것은 잠정적으로 질병을 일으키거나 질병에 기여하는 것이다. 따라서, 보체-관련 질환의 치료와 진단용으로 사용하기 위한 보체 시스템의 신규한 항체 등을 개발하는 것이 바람직하다.
보체 억제제를 포함하는 조성물, 보체-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법, 및 이의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 보체 C5-결합 분자 (예를 들어, C5-결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편), 이러한 분자를 포함하는 약학적 조성물, 이러한 분자 및 조성물의 제조 방법, 이러한 분자 및 조성물의 사용 방법 및 이러한 분자 및 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57로부터 선택되는 어느 하나에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 8, 18, 28, 38, 48 또는 58에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 C5-결합 분자 (예를 들어, C5 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 C5 결합 분자를 사용한 보체 관련 질환의 치료 또는 진단 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 C5 결합 분자; 및 용기를 포함하는 보체 관련 질환의 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 보체 관련 질환 치료용 약제의 제조를 위한 C5 결합 분자의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 보체 관련 질환 치료를 위한 C5 결합 분자의 용도를 제공한다.
본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본원 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C5 단백질에 특이적 결합을 통해서 보체 활성화를 억제함으로써, 보체 관련 질환의 예방 또는 치료가 가능하다.
본 발명의 "항체"는 온전한 항체 및 이의 임의의 항원 결합 부분 또는 단일쇄를 포함한다. 천연 발생 "항체"는 다이설피드 결합에 의해 상호 연결된, 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 보다 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지며, 이것들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C5의 베타쇄(β-chain)에 특이적으로 결합하며, 보다 구체적으로 C5-베타 쇄의 MG4 도메인에 결합하며, 보다 더 구체적으로, 베타쇄의 아미노산 서열을 기준으로 332 내지 398, 바람직하게 332 내지 378, 보다 바람직하게 332 내지 364, 보다 더 바람직하게 332 내지 348의 아미노산 잔기의 서열 및/또는 350 내지 420, 바람직하게 369 내지 409, 보다 바람직하게 379 내지 398, 보다 더 바람직하게 386 내지 392의 아미노산 잔기의 서열에 결합한다. 예를 들어, 결합 가능한 C5 단백질로, 인간 C5 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 61, 인간 C5 단백질의 베타쇄의 아미노산 서열은 서열번호 62 및 인간 C5 단백질의 베타쇄의 MG4 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 63에 제시되어 있다. 기타 종으로 토끼, 랫드, 원숭이 등과 종간 교차 반응성도 가진다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 1×107M-1, 1×108M-1, 1×109M-1, 1×1010M-1, 또는 1×1011M-1 의 친화도 상수(KA)를 가진다.
일부 실시 양태에서 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 표 1 내지 표 6에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 해당 서열에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 가지며 보체 억제 활성을 가지는 항체 역시 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 중쇄와 경쇄의 불변 영역에서 자명한 일부 변형의 경우, 동일 유사 보체 억제 활성을 가지는 범위에서 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 각각의 이들 항체는 C5에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열 (아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매치"되어 본 발명의 다른 C5-결합 항체를 생성할 수 있다.
표 1. C5 항체 ( HRA -06- H2 -1)
Figure pat00001
표 2. C5 항체 ( HRA -06- H2 -7)
Figure pat00002
표 3. C5 항체 ( HRA -06- H2 -18)
Figure pat00003
표 4. C5 항체 ( HRA -06- H2 -24)
Figure pat00004
표 5. C5 항체 ( HRA -06- H1 -9- H2 -7)
Figure pat00005
표 6. C5 항체 ( HRA -06- H1 -9- H2 -24)
Figure pat00006
본 발명에 있어서 항체는 상기 언급된 항체를 비롯하여, 표 1 내지 6에 기재된 항체와 상동성인 아미노산을 포함하는 항체; CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지고, 이들 CDR 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체 또는 이의 보존적 변형을 기초로 하는 특정 아미노산 서열을 가지며, 본 발명의 C5-결합 항체의 기능적 특성을 보유하는 항체; 표 1 내지 6에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본원에 제시된 1종 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조되고, 출발 항체로부터 일부 변경된 특성을 가지는 항체를 모두 포함한다.
또한 본 발명에 있어서 항체는 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 것을 포함한다.
또한, 본 발명에 있어서 항체는 C 5 단백질에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체일 수 있다. 이는 키메라 항체 등과 비교할 때, 인간 대상체에 투여되었을 때 더욱 감소된 항원성을 가질 수 있다. 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 면역글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정 배선 서열의 생성물이거나 이로부터 유도된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 사용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 면역글로불린 서열의 생성물이거나 이로부터 유도된 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 근접한 서열인 인간 배선 면역글로불린 서열을 선별함으로써 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 항체는 이중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 또는 인간화 단일클론 항체 또는 키메라 항체일 수 있으며, 본 발명의 항체는 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 단일쇄 항체일 수 있으며, 본 발명의 항체는 Fab 단편일 수 있으며, scFv(Single-chain variable fragment)일 수 있으며, IgG 이소형일 수 있다. 바람직한 IgG 이소형은 IgG2, IgG4 및/또는 IgG2/4이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 IgG 이소형은 IgG2/4이다. IgG2/4 하이브리드 불변 영역은 IgG2 의 CH1과 hinge 부위와 IgG4의 CH2와 CH3 부위가 융합된 형태일 수 있다.
단일클론항체는 통상의 단일클론 항체 방법에 의해 생성될 수 있으며, 합성된 항체 유전자를 항체 발현용 벡터, 바람직하게는 pcDNA, pCI, pCMV, pCEP4 등에 삽입하여 발현 및 정제할 수 있다. 또한, B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질 전환을 이용할 수 있으며, 뮤린 시스템을 이용하여 제조된 뮤린 단일클론 항체의 서열을 기초로 하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA를 뮤린 하이브리도마로부터 얻고 이와 함께 비-뮤린 면역글로불린 서열을 함유하게 할 수 있다. 또한, C5에 대한 인간 단일클론 항체는 마우스 면역계가 아닌 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 제조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 아미노산이 각각의 인간 VH 또는 VL 배선(germline) 서열로부터의 항체 프레임워크로 치환된 프레임워크를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 또는 52에 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 1개 이상의 상보성 결정 (CDR) 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 2, 3, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 또는 52와 동일한 1개 이상의 중쇄 상보성 결정 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4, 5 또는 6과 동일한 1개 이상의 경쇄 상보성 결정 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 11, 21, 31, 41 또는 51로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 CDR1, 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 또는 52로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 3, 13, 23, 33, 43 또는 53으로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 CDR3을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 6의 CDR3을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 가변 영역에 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8의 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 서열번호 8의 경쇄 가변 영역에 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 또는 59로부터 선택된 어느 하나의 중쇄를 포함하거나, 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 또는 59로부터 선택된 어느 하나의 중쇄에 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10의 경쇄를 포함하거나, 서열번호 10의 경쇄에 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 경쇄를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 62의 C5 단백질의 베타쇄 내 에피토프에 결합하는 것을 포함한다. 구체적으로, C5 단백질의 베타쇄 아미노산 서열을 기준으로 332 내지 398, 바람직하게 332 내지 378, 보다 바람직하게 332 내지 364, 보다 더 바람직하게 332 내지 348의 아미노산 잔기의 서열 및/또는 350 내지 420, 바람직하게 369 내지 409, 보다 바람직하게 379 내지 398, 보다 더 바람직하게 386 내지 392의 아미노산 잔기의 서열에 상응하는 에피토프일 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57로부터 선택되는 어느 하나에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 하기 표 7의 서열을 포함하거나, 어느 하나에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 가진다.
표 7. 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure pat00007
Figure pat00008
또한 본 발명은 서열번호 8에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 하기 표 8의 서열을 포함하거나, 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 가진다.
표 8. 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure pat00009
또한 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (1) 본 발명의 항체의 중쇄를 코딩하는 재조합 DNA 절편, 및 (2) 본 발명의 항체의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 절편을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 코딩하는 재조합 DNA 절편을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
C5-결합 항체, 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생성하기 위해 바이러스-기재 및 비-바이러스 발현 벡터 둘 다 사용될 수 있다. pcDNA, pCI, pCMV, pCEP4 등의 벡터와 HEK293, CHO, CHO-DG44 등의 숙주세포가 사용될 수 있다.
C5-결합 항체를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. E.Coli, 바람직하게, E.coli ER2738. HB2151, BL21 등일 수 있으며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키는데 유용한 원핵 숙주들이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주는 바실러스, 예를 들어 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내 박테리아, 예를 들어 살모넬라 (Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 본 발명의 C5-결합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 다른 미생물, 예를 들어 효모가 사용될 수 있으며, 바큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 C5-결합 폴리펩티드를 발현시키고 제조하는데 사용된다. 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 일 수 있다. 또한, 임의의 동물 또는 인간 세포로, 예를 들어, CHO 세포주, Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, HEK 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하여 면역글로불린을 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 HEK293, CHO, CHO-DG44가 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 C5-결합 분자 (예를 들어, C5 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 보체 관련 질환에 유용하다. 보체 관련 질환이란질환의 발병이 보체 시스템의 활성화의 이상, 예를 들면 보체 결핍과 관련이 있는 모든 질환 및 병리적 상태를 포함한다. 예컨대 염증성 및 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염(RA), 퇴행성 관절염, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 허혈 및 재관류 이후의 원거리 조직 손상, 심폐 우회술 동안 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 낭창성 신염, 사구체신염, 사구체혈관염, 심폐 바이패스, 심장마비-유도된 관상동맥 내피 기능 이상, 제II형 막증식성 사구체신염, 급성 신부전증, 항인지질 증후군, 황반 변성증, 안내염, 신혈관 질환, 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성 폐쇄성 폐 호흡곤란 증후군 (COPD), 천식, 야간 혈색소뇨증(PNH) 및 흡인성 폐렴을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 보체 관련 질환을 치료 또는 예방하기에 적합한 1종 이상의 다른 제제를 추가로 함유할 수 있다. 제약상 담체는 조성물을 향상시키거나 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 한다. 제약상 허용되는 담체는 생리적으로 상용가능한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항-박테리아제 및 항-진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라진다. 투여가 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하이거나, 표적 부위에 근접하게 투여되는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 안구 안으로 유리체내 투여될 수 있도록 제제화된다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
조성물은 멸균되고 유체여야 한다. 적당한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액제의 경우에는 필요한 입도의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 유도될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지되고 통상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000] 및 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NewYork, 1978]을 참조한다. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP 조건하에 제조된다. 전형적으로, C5-결합 항체의 치료 유효 용량 또는 효능 용량이 본 발명의 약학적 조성물에 사용된다. C5-결합 항체는 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화된다. 투약법은 원하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 아니면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약력학 인자, 예를 들어 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 처치 기간, 사용된 특정 조성물과 조합되어 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 기타 인자에 따라 달라진다.
치료 투여량은 안전성 및 효능이 최적화되도록 적정할 필요가 있다. 항체를 전신 투여하는 경우, 투여량 범위는 숙주 체중 1 kg 당 약 0.0001 내지 100 mg, 더욱 일반적으로는 0.01 내지 15 mg의 범위이다. 예시적인 치료법은 2주 당 1회, 또는 1개월 당 1회, 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다. 항체를 유리체내 투여하는 경우, 투여량은 약 0.0001 내지 약 10 mg의 범위이다. 예시적인 치료법은 2주 당 1회, 또는 1개월 당 1회, 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다.
전신 투여의 일부 방법에서, 투여량은 1 내지 1000 ㎍/mL, 일부 방법에서는 25 내지 500 ㎍/mL의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다. 대안적으로, 빈도를 덜하게 하여 투여하는 것이 요구되는 경우에는 항체를 지속 방출 제제로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 예방적 용도에서는 상대적으로 낮은 투여량을 장기간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격으로 투여한다.
또한 본 발명은 C5 결합 분자를 사용한 보체 관련 질환의 치료 또는 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 C5 결합 분자를 사용한 보체 관련 질환의 치료 방법은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이를 포함하는 조성물의 치료학적으로 유효한 양의 투여를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 "치료학적으로 유효한 양"이라는 용어는 보체 관련 질환의 예방 또는 치료에 유효한 본 발명의 C5 결합 분자 또는 이를 포함하는 조성물의 양을 나타낸다.
본 발명의 치료제로 C5 결합 분자 또는 이를 포함하는 조성물이 또다른 작용제와 함께 투여되는 경우, 이들 2가지 물질은 임의의 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. C5-결합 항체를 사용한 조합 치료에 적합한 작용제는 보체 성분의 활성을 조정할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 작용제를 포함한다. 예를 들어, 포스포네이트 에스테르, 폴리음이온 물질, 술포닐 플루오라이드, 폴리뉴클레오티드, 피마르산 , 여러가지 항-염증제 등이 있다. 1 이상의 치료제 등과 조합 요법은 부가적일 수도 있고, 상승작용의 결과를 야기할 수도 있다.
본 발명은 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 세포, 조직)에서 또는 보체 관련 질환을 앓고 있거나 발생할 위험이 있는 개체로부터 C5 단백질 및/또는 핵산 발현 및 C5 단백질 기능을 결정하는 진단 검정을 포함한다. 본 발명의 항체는 예를 들어 방사선면역검정, ELISA 및 방사상 확산 검정이 보체 분열 생성물의 검출에 이용가능하다. 또한, 진단 검정, 예후 검정, 약리유전학 및 임상 시험 모니터링을 예후 (예측) 목적으로 사용함으로써 개체를 예방적으로 치료하는데 사용할 수 있으며, 본 발명은 또한 개체가 보체 경로 활성의 조절이상과 관련이 있는 장애가 발병할 위험에 있는지의 여부를 결정하기 위한 예후 (또는 예측) 검정을 제공한다. 예를 들어, C5 유전자 내의 돌연변이를 생물학적 샘플에서 검정할 수 있다. 이러한 검정을 예후 또는 예측 목적으로 사용함으로써, C5 단백질, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 이와 관련이 있는 장애의 발병 전에 개체를 예방적으로 치료할 수 있다.
또한 본 발명은 C5 결합 분자; 및 용기를 포함하는 보체 관련 질환의 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 진단용 키트는 상기 언급된 C5 결합 분자의 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 용기는 고체 담체가 포함되며, C5 결합 분자는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.
또한 본 발명은 보체 관련 질환 치료용 약제의 제조를 위한 C5 결합 분자의 용도를 제공한다. 약제의 제조를 위한 본 발명의 C5 결합 분자 또는 이를 포함하는 조성물은 허용되는 담체 등을 혼합할 수 있으며, 다른 작용제들과 함께 복합 제제로 제조되어 활성 성분들의 상승 작용을 가질 수 있다.
또한 본 발명은 C5 결합 분자의 용도를 제공한다. 본 발명의 보체 관련 질환 치료를 위한 C5 결합 분자는 치료용 용도로 사용될 수 있으며, 보체 관련 질환을 앓고 있거나 발생할 위험이 있는 개체로부터 C5 단백질 및/또는 핵산 발현 및 또한 C5 단백질 기능을 결정하는 진단 검정의 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 용도, 조성물, 치료 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 C5 결합 분자는 보체-관련 질환의 진단, 예방 및 치료에 유용하다.
도 1은 본 발명 일실시예에 따른 토끼(A) 및 닭(B)의 면역 라이브러리를 이용한 바이오 패닝(Bio-panning) 후, 무작위로 선별된 40개 클론의 흡광도를 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명 일실시예에 따른 토끼 및 닭 면역 라이브러리로부터 선별된 5종의 항체와 대조 항체인 에쿨리주맙의 인간 C5에 대한 흡광도 측정 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 C5에 대한 결합력을 가진 다수 클론을 5종의 변이체 서브 라이브러리로부터 확보한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명 일실시예에 따른 인간화 클론인 HRA-06 클론을 주형으로 사용하여 제작한 친화도가 향상된 클론의 결합능을 비교한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명 일실시예에 따라 제조된 항체가 보체 의존적 세포 독성 검정법에서 높은 보체 의존적 세포 독성 억제능을 가지는 것을 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명 일실시예에 따라 제조된 항체가 C5a 생성 검정법에서 높은 C5a 생성 억제능을 보여주는 도이다.
도 7은 본 발명 일실시예에 따라 제조된 단일 클론 항체의 종간 교차 반응성을 나타내는 도이다.
도 8은 본 발명 일실시예에 따라 제조, 정제된 항체들의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 본 발명 일실시예에 따른 항체가 C5의 베타쇄에 결합함을 나타내는 도이다.
도 10은 본 발명 일실시예에 따른 항체가 C5의 베타쇄의 MG4 도메인에 결합함을 나타내는 도이다.
도 11은 본 발명 일실시예에 따른 항체가 베타쇄의 C-말단으로부터 1개 도메인씩 순차적으로 제거한 변이체 Fc 융합 단백질에서 MG4 도메인에 특이적으로 결합함을 확인해주는 도이다.
도 12는 본 발명 일실시예에 따른 항체가 MG4 도메인의 순차적 제거 변이체에서 immunoblot으로 확인한 바에 따라 베타쇄의 N-말단 332-348번째 아미노산 잔기에 결합 하는 것을 보여주는 도이다.
도 13은 본 발명 일실시예에 따른 항체가 ELISA로 확인한 바에 따라 베타쇄 N-말단의 379-398번째 아미노산 잔기에 결합하는 것을 보여주는 도이다.
도 14은 본 발명 일실시예에 따른 항체가 ELISA로 확인한 바에 따라 베타쇄 N-말단의 386-392(MG4 도메인 서열 기준: 55 -61 번째 아미노산 서열)번째 아미노산 잔기에 결합하는 것을 보여주는 도이다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본원에 기재된 다양한 실시예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 제조방법 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 실시예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 실시예" 또는 "실시예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 실시예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 실시예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현 "한 가지 실시예에서" 또는 "실시예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 실시예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
실시예 1. C5 면역 항체 라이브러리의 제작
인간 C5 단백질(Calbiochem) 5ug을 RIBI+MPL+TDM+CWS adjuvant(Sigma, St. Louis, Mo, USA)와 혼합하여 NZW 토끼와 닭 피하에 주사하고, 이를 2주 간격으로 토끼는 총 3회, 닭은 총 4회 수행하였다. 면역이 완료된 토끼로부터 지라 및 골수를 얻고 닭으로부터 지라, 비자 및 활액낭을 얻어, 이로부터 total RNA를 TRI 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA USA)을 사용하여 추출하고, 올리고-dT 프라이머 및 SuperScript™ III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 사용하여 First strand cDNA를 합성하였다. 면역글로불린의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에 특이적인 하기 표 9(토끼) 및 표 10(닭)의 프라이머를 이용하여 단일쇄 Fv 라이브러리를 제작하였다. 토끼의 scFv 라이브러리에 대해서는 VH의 4 프라이머 및 VL의 10(9 × Vκ 및 1 × Vλ) 조합이 코딩 서열 증폭을 위해 사용되었고, 닭에 대해서는 Vλ 및 VH에 대해 하나의 조합이 사용되었다.
표 9. 토끼 단일쇄 Fv 라이브러리의 Vκ, Vλ 및 VH 를 위한 프라이머
Figure pat00010
표 10. 닭 단일쇄 Fv 라이브러리의 Vλ 및 VH 를 위한 프라이머
Figure pat00011
각각의 반응에서, 1 ul의 cDNA는 각 프라이머의 60 pmol, 10 μl의 10 X 반응 버퍼, 8 μl의 2.5 mM dNTP, 0.5 μl의 Taq DNA 폴리머라이제 및 물과 혼합되었고 최종 부피를 100 ul로 하였다. PCR 반응은 하기 조건에 의해 수행되었다: 30 사이클 15 초 94 ℃, 30 초 56 ℃, 및 90 초 72 ℃, 이어서 최종 연장 10 분 72 ℃. 약 350 bp의 증폭된 절편은 1.5 % 아가로오스 젤에 로딩 및 러닝 후에 QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)로 정제되었다. 두 번째 PCR에서, 첫 번째 VL 및 VH 생성물은 중복 연장 PCR(Overlap extension PCR)에 의해 무작위적으로 결합되었다. 각각의 PCR 반응은 100 ng 의 정제된 VL 및 VH 생성물, 60 pmol의 각각의 프라이머, 10μl의 10 X 반응 버퍼, 8 μl의 2.5 mM dNTP 및 0.5 μl의 Taq DNA 폴리머라이제를 포함하는 100 ul의 혼합물로 수행되었다. PCR 반응은 하기 조건에서 수행되었다: 20 사이클 15 초 94 ℃, 30 초 56 ℃, 및 2 분 72 ℃, 이어서 최종 연장 10 분 72 ℃. 약 700 bp의 scFV 절편은 QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 정제되었다. scFv 절편 및 pComb3XSS 벡터는 Sfi I 제한 효소 (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA)에 의해 8시간 동안 50 ℃에서 절단되었다. 700 ng의 SfiI-절단된 scFv는 16 ℃에서 12시간동안 반응물의 배양에 의해 T4 DNA 리가아제를 사용하여 1400 ng의 pComb3X 벡터로 라이게이션되고, 이어서 에탄올 침전하였다. 라이게이션된 라이브러리는 E. coli ER2738로 electoporation에 의해 형질전환하였다. 세포는 37 ℃, 3 ml Super Broth(SB) 배지에서 혼합되었으며, 1 시간 동안 250 rpm으로 교반하며 배양되었고, 그 후 10 ml SB 배지 및 3 ul의 100 mg/ml 카베니실린이 배양액에 첨가되었다. 라이브러리 크기는 50 ug/ml 카베니실린을 함유하는 Luria broth 플레이트에서 배양액의 0.1, 1 및 10 ul 플레이팅에 의해 결정되었다. 1시간 동안 배양 후, 4.5 ul의 100 mg/ml 카베니실린이 첨가되었고 추가로 1시간 더 배양되었다. 배양액에 2 ml의 VCSM13 헬퍼 파지(> 1011cfu/ml), 183ml의 SB 배지 및 92.5μl의 100 mg/ml 카베니실린이 더해지고, 37 ℃에서 2 시간 동안 250 rpm으로 교반하며 배양되었다. 카나마이신 (280 ul)이 더해지고, 37 ℃ 및 250 rpm에서 밤샘 교반되었다. 다음날, 배양액은 3000 g에서 15분간 원심분리되었다. 박테리아 펠렛은 phagemid DNA 제조를 위해 저장되었고 상층액은 깨끗한 원심분리 병에 옮겨졌다. 8 g 폴리에틸렌 글리콜-8000(PEG-8000, Sigma) 및 6 g 염화나트륨(Merk)이 더해지고, 상층액은 30분간 얼음에 저장되었다. 상층액은 15,000 g, 4 ℃에서 15분간 원심분리되었다. 파지 펠렛은 1 % BSA를 함유하는 TBS에서 섞어주었다.
실시예 2. 바이오 패닝( bio - panning )
3 ug의 인간 C5 항체를 16 시간 동안 상온에서 1X107 자성 비드(Dynabeads® M270- Epoxy, Invitrogen)로 코팅하였다. 비드는 PBS로 세척되고 1시간 동안 상온에서 3% BSA를 함유하는 PBS로 블록킹되었다. 코팅된 비드를 세척한 후에, 2시간 동안 상온에서 Phage-displayed scFv와 함께 배양되었다. 비드는 결합되지 않은 phage를 제거하기 위해 0.5% TPBS로 세척되었다. 결합된 Phage는 100ul의 0.1M 글리신-HCl로 elute되었고 6 ul의 2M Tris-HCl (pH 9.0)로 중성화되었다. Elute된 파지는 E.coli ER2738에 감염되었고 밤샘 증폭을 위해 VCSM13 헬퍼 파지로 rescue되었다. Input 및 Output 파지 타이터는 카베니실린 50 ug/ml를 함유하는 LB 플레이트에서 파지가 감염된 박테리아를 플레이팅하여 37 ℃에서 배양에 의해 결정되었다. 다음날 파지는 실시예 1과 같이 PEG-8000 및 NaCl 첨가에 의해 침전되었다.
실시예 3. 파지 ELISA 에 의한 scFv 선택
바이오 패닝으로부터 선택된 클론을 분석하기 위하여 인간 C5에 대하여 파지 diplaying scFv를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 96-웰 플레이트는 100ng의 인간 C5 로 4 ℃에서 밤새 코팅되었고 3% BSA 함유 PBS로 블록킹되었다. 각각의 파지 배양액은 동일 양의 6% BSA 함유 PBS와 혼합된 후, 인간 C5-코팅 96-웰 플레이트에 첨가되었고, 37℃에서 2시간동안 배양되었다. 배양이 끝나고 세척을 수행한 후, HRP 결합된 항-M13 항체(Amersham, USA)로 배양되었다. 배양이 끝나고 세척을 수행한 후에 0.05 M 구연산 버퍼 내 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS, Amresco, OH, USA) 1ug/ml 및 0.1 % H2O2를 각각의 웰에 첨가하고 발색하여 405 nm에서 흡광도 측정을 수행하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 A는 토끼의 면역라이브러리를 나타내며, 도 1의 B는 닭의 면역라이브러리를 나타낸다. 인간 C5 에 대하여 흡광도 0.6 이상을 나타내는 clone 의 유전자서열을 분석한 결과, 토끼 면역라이브러리로부터 2종, 닭 면역라이브러리로부터 3종의 서로 다른 서열을 가진 scFv 클론을 확보하였다.
또한, 선택된 5 종의 scFv 클론에 대하여 C5에 대한 항-C5 scFv-Fc 융합 단백질의 ELISA를 수행하여 대조 항체인 에쿨리주맙과 결합능을 비교하였다. 상기 방법과 동일하게 HRP-결합된 항-인간 IgG를 이용하여 C5에 결합하는 항체의 양을 결정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 5 종의 선별된 scFv 클론 모두 에쿨리주맙보다 높은 흡광도를 나타내었다.
실시예 4. 친화도 성숙 및 인간화 항체의 제작
사람 보체 C5에 대하여 결합력과 활성화 억제능을 가진 scFv 항체 분절을 구성하는 6개 항원 상보성 결정 영역(CDR, complementarity determining region) (경쇄 항원 상보성 결정영역 [CDRL 1-3], 중쇄 항원 상보성 결정 영역 1-3 [CDRH1-3] 부분을 인간 배선(germline) kappa1/IGHV3-23/의 8개 프레임 워크 (FRL1-4, FRH1-4) 사이에 삽입하여, 인간화 항 보체 C5 scFv 유전자를 합성하였다(HRA-06, Genscript, Piscataway, NJ, USA).
변이체 서브 라이브러리를 생성하기 위하여, 동의 코돈(degenerate codons) NNK 또는 MNN(N=A, T, G 또는 C, K=G 또는 T, M=A 또는 C)을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 사용되었다. HRA-06 scFv 유전자는 template DNA로 사용되었다. 무작위 코돈은 PCR에 의해 CDRH3만을 제외하고 5개의 CDR에 도입되었다. 증폭된 scFv 절편은 QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN)에 의해 정제되었다. ScFV 및 pComb3XSS 벡터는 SfiⅠ 제한 효소(Roche Molecular Systems) 로 절단되었고 라이게이션 후 에탄올 침전하였다. 라이게이션된 라이브러리는 실시예 1과 같이 E. coli ER2738에 형질 주입되었고 파지 라이브러리를 제작하였다. 제작된 파지 라이브러리를 기반으로 실시예 2와 동일한 방법으로 항원을 선별하였다. 마지막으로 실시예 3과 동일한 방법으로 C5에 대한 결합력을 파지 ELISA 로 확인하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, C5에 대한 결합력을 가진 다수 클론을 5종의 변이체 서브 라이브러리로부터 확보하였다.
실시예 5. 재조합 항 C5 항체 및 대조군 에쿨리주맙 항체의 제작
1. 전장 IgG 벡터 및 scFcv - Fc 벡터로 항- C5 항체의 서브- 클로닝
HindⅢ(New England Biolabs) 및 XhoⅠ(New England Biolabs) 제한 효소에 의해 pCEP4 벡터(Invitrogen)로 IgG2 힌지(hinge) 및 IgG2/4 하이브리드 CH2-CH3을 코딩하는 유전자가 삽입되었다. 항-C5 scFv를 코딩하는 유전자는 두 SfiⅠ 제한 부위에 의해 Fc 영역의 5' 말단으로 서브클로닝되었다. 경쇄에 대하여, 인간 면역글로블린 Cκ 유전자는 포유류 발현 벡터로 서브클로닝되었다. 중쇄에 대하여, 인간 CH1 및 IgG2의 hinge부터 IgG2/4 하이브리드 CH2-CH3 영역까지 유전자는 포유류 발현 벡터로 서브클로닝되었다. 다양한 경쇄 및 중쇄는 전장 IgG 벡터로 서브클론되었다. 에쿨리주맙의 항체 서열은 일본 의약품 의료 기기 관리 기관 (PMDA)에 등록되어 있는 에쿨리주맙(제품명 Soliris)의 심사보고서에 명시된 항체서열을 근거로 하여 중쇄와 경쇄 유전자를 합성하였다.
2. 형질주입 및 단백질 정제
형질주입은 과발현 재조합 단백질에 대해 수행되었다. 배양 부피의 발현벡터 ml 당 2 ug의 포유류 발현 벡터와 4ug의 폴리에틸렌이민/ml(PEI, Polysciences, Warrington, PA, USA)는 배양 부피의 1/10에 해당하는 150mM 염화나트륨에 혼합되었고, 상온에서 15분간 방치하였다. 혼합물에 HEK 293F 세포(2X106 세포/ml)가 추가되었고 5일동안 100U/ml 페니실린(Invitrogen) 및 100U/ml 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 FreeStyleTM 293 발현 배양액, 37℃, 7% CO2 및 135rpm의 교반 조건하에 배양되었다. 세포 배약액의 상층액은 수거되었고 IgG 및 Fc 융합 단백질의 정제를 위하여 단백질 A 친화도 젤 크로마토그래피의 대상이 되었다.
실시예 6. 단일 클론 항체의 결합능 측정
실시예 5의 방법으로 생산된 항체의 보체 C5 결합능을 측정하고자 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 를 수행하였다. C5 를 코팅한 96-웰 플레이트에 항체를 농도별로 희석하고 첨가하여 반응을 시켰다. horseradish peroxidase가 표지된 항 사람 IgG 항체를 이차 항체로 사용하고 ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt)로 발색하여 흡광도를 상기 실시예 3과 동일하게 측정하였다.
실험에 사용된 단클론 항체의 종류는 친화도 성숙된 인간화 항 C5 항체 6종 (HRA-06-H2-1, HRA-06-H2-7, HRA-06-H2-18, HRA-06-H2-24, HRA-06-H1-9-H2-7, HRA-06-H1-9-H2-24)과 양성대조군 항체 에쿨리주맙, 음성대조군 항체 팔리비주맙이며, 실험 결과는 도 3에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 항 보체 C5 항체는 모두 C5에 대하여 결합력을 보였으며, 친화도 성숙된 인간화 항 C5 항체 6종은 에쿨리주맙 대비 높은 흡광도를 나타내었다.
실시예 7 : 시험관 내 보체 의존적 세포 독성 검정
CD-20 발현 인간 Burkitt's 림프종 세포주인 RaJi는 10% FBS(Invitrogen), 100 U/ml 페니실린(Invitrogen) 및 100 U/ml 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 RPMI 1640에서 유지되었다. 표적 세포는 세척후에 1X106 세포/ml의 농도로 섞였다. 항-CD20 인간 IgG인 리툭시맙(Roche)은 3 ug/ml의 농도로 CDC 용액에 희석되었다. 동일 부피의 표적 세포 및 민감성 항체는 96-웰 플레이트에 100ul/well의 부피를 만들도록 혼합되었고, 상온에서 5분간 방치되었다. 검정은 인간 보체 혈청 추가에 의해 시작되었고, 그 결과 각 웰당 150 ul의 최종 부피를 가졌으며 최종 농도는 4% 혈청이었다. 2시간 동안 배앙한 후에, 15 ul Tetrazolium 염(WST-1, Takara Bio, Japan)이 첨가되었고 플레이트는 2시간동안 더 배양되었다. 살아있는 세포는 450 nm의 OD에서 측정되었다. 항-C5 항체의 효과는 표적 세포 및 민감성 항체 혼합물 첨가전에 30분 동안 37℃에서 혈청과 선처리에 의해 평가되었다. 동일 농도의 팔리비주맙은 IgG 대조군으로 사용되었다. 세포 생존율의 퍼센트는 하기 식으로 계산되었다.
% 생존율=(테스트항체 - 배경)/(테스트항체없음 - 배경) X 100
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 친화도 성숙된 인간화 항 C5 항체는 CDC 억제능을 나타내었으며, 항체 모두가 에쿨리주맙과 대비하여 높은 세포생존력을 나타내었다.
실시예 8 : 시험관내 C5a 생성양 측정
표적 세포, 민감성 항체 및 혈청의 2시간 배양 후, 세포는 원심분리에 의해 펠렛화되었고 상층액은 제조사의 매뉴얼에 따라 BD OpiEIATM Human C5a ELISA Kit Ⅱ(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 C5a 양에 대해 검정되었다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 친화도 성숙된 인간화 항 C5 항체는 모두 C5a 생성 억제능을 나타내었으며, 친화도 성숙된 인간화 항 C5 항체 4종은 모두 에쿨리주맙과 대비하여 높은 억제력을 나타내었다.
실시예 9 : 단클론 항체의 종간교차반응성 측정
단클론 항체가 사람 외 다른 종의 보체 C5에 결합하는지 확인하기 위하여 immunoblot을 수행하였다. 사람 C5 단백질과 사람 (Sigma), rhesus 원숭이, BALB/c 마우스, Wistar 랫드, NZW 토끼의 혈청을 희석한 것을 각각 SDS-PAGE 하고, 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 본 발명에 따라 제조된 항 보체 C5 항체 HRA-06-H2-1를 이용하여 immunoblot을 수행하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 항 보체 C5 항체는 사람 (Sigma), rhesus 원숭이, Wistar 랫드, NZW 토끼의 C5에 결합력을 나타내었다.
실시예10 : Size - exclusion chromatography
정제한 항체를 Waters 2489 system(Waters Corporation, Milford, MA, USA) 과 Zenix-C 300 column (Sepax Technologies, Inc., Newark, DE, USA) 을 이용하여 size-exclusion chromatography (SEC) 분석을 수행하였다. 이동 상 조성물 (150 mM 인산 나트륨, pH 7.0) 및 유속(1.0 mL/분)이 유지되었으며, 단백질의 농도는 280 nm에서 컬럼 용출액의 흡광도를 모니터링하여 결정되었다. 분획의 농도는 피크 영역의 합에 의해 각각의 피크 영역을 나눔으로써 계산되었다.
그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8의 A 내지 D는 각각 A) HRA-06-H2-1, B) HRA-06-H2-7, C) HRA-06-H2-18, D) HRA-06-H2-24, E) HRA-06-H1-9-H2-7 및 F) HRA-06-H1-9-H2-24를 나타낸다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 항 보체 C5 항체의 물리 화학적 특성은 응집이 거의 생기지 않는 것으로 확인되었다.
실시예11 : Epitope mapping
1. C5 베타쇄에 항체의 결합 확인
보체 C5 단백질의 reducing을 수행한 것과 수행하지 않은 것 각각을 SDS-PAGE 하고, 항 보체 C5 항체로 immunoblot함으로써, 베타쇄 결합 여부를 확인하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9의 A는 에쿨리주맙을 항체로 사용하여 결합을 확인한 것이며, 도 9의 B는 본 발명에 따른 HRA-06-H2-1을 항체로 사용한 결과이다. 알려진 바처럼 에쿨리주맙은 C5(보체 단백질 전체)에 결합하였으며, Reducing을 수행한 2 lane에서 알파쇄에 결합하는 것을 확인하였다. 한편, 본 발명에 따른 HRA-06-H2-1 항체는 C5(보체 단백질 전체)에 결합하였으며, Reducing을 수행한 2 lane에서 베타쇄에 결합하는 것을 확인하였다.
2. Fc 융합 단백질로 C5 베타쇄 변이 도메인의 제조 및 결합 부위 확인
베타쇄의 순차적 제거 변이체 및 C5의 베타쇄를 구성하는 여섯 개 도메인이 cDNA로부터 증폭되었다. 프라이머는 5' 및 3' 말단에서 SfiⅠ 제한 위치에 첨가되도록 디자인되었다 (표 11). 베타쇄의 순차적 제거 변이체는 표 12에 기재된 바와 같은 프라이머 조합에 의해 증폭되었다. 증폭된 PCR 절편들은 SfiⅠ으로 절단되고 클로닝 위치의 3' 부분에서 인간 IgG1의 hinge 부위 및CH2-CH3 도메인을 함유하도록 변형된 pCEP4 벡터로 클로닝되었다. 이러한 클론들은 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 형질주입되고 Fc 융합 단백질은 정제되었다.
표 11. 베타쇄 도메인의 증폭을 위한 프라이머 서열
Figure pat00012
표 12. 베타쇄 도메인 및 베타쇄 제거 변이체 제조를 위한 프라이머 조합
Figure pat00013
각각의 도메인을 포함하는 단백질들에 대하여 각각 SDS-PAGE를 수행하고, 항 보체 C5 항체(HRA-06-H2-1)로 immunoblot을 수행하여, 그 결과를 도 10 및 도11에 나타내었다.
도 10의 A는 C5 베타쇄 및 제조된 Fc 융합 단백질의 구조를 모식도로 나타내고 있으며, 도 10의 B는 immunoblot 결과를 나타낸다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 HRA-06-H2-1 항체는 MG4 도메인을 가지는 Fc 융합 단백질에 대해 결합하는 것을 확인하였다.
도 11의 A는 C5 베타쇄 및 제조된 Fc 융합 단백질의 구조를 모식도로 나타내고 있으며, 도 11의 B는 immunoblot 결과를 나타낸다. 도 11에 나타낸 바와 같이, MG4 도메인을 포함하는 Fc 융합단백질에서만 HRA-06-H2-1 항체와 결합이 이루어지는 것을 확인하였다.
3. Fc 융합 단백질로 MG4 도메인의 제조 및 결합 부위 확인
베타쇄의 MG4 도메인과 MG4 도메인의 N-말단부터 순차적으로 제거한 5종의 변이체들을 클로닝하였다. 프라이머는 5' 및 3' 말단 모두에 SfiⅠ 제한 위치가 첨가되도록 디자인되었다(표 13). 증폭된 PCR 절편들은 SfiⅠ으로 절단되고 클로닝 위치의 3' 부분에서 인간 IgG1의 hinge 부위 및 CH2-CH3 도메인을 함유하도록 변형된 pCEP4 벡터로 클로닝되었다. 이러한 클론들은 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 형질주입되고 Fc 융합 단백질은 정제되었다. 정제된 Fc 융합 단백질에 대하여 SDS-PAGE 후, immunoblot을 상기와 같이 수행하였다.
표 13. MG4 도메인의 증폭을 위한 프라이머 서열
Figure pat00014
그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12의 A는 MG4 도메인 및 순차적으로 제거되어 제조된 Fc 융합 단백질을 나타내며, 도 12의 B는 HRA-06-H2-1 항체로 immunoblot을 수행한 결과를 나타낸다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 베타쇄의 N-말단으로부터 332-348번째 서열이 제거된 변이체들에 대해서, 결합이 이루어지지 않음을 확인할 수 있었는 바, 베타쇄의 MG4 도메인 내 332-348번째 아미노산 잔기 서열이 항체 결합 가능성이 높은 서열임을 알 수 있었다.
4. 인간/마우스 하이브리드 MG4 도메인으로부터 항체 결합 부위 확인
C5 베타쇄의 인간/마우스 하이브리드 MG4 도메인이 중복 연장 PCR에 의해 제조되었다. 프라이머는 5' 및 3' 말단 모두에 SfiⅠ 제한 위치가 첨가되도록 디자인되었다(표 14). PCR 절편은 SfiⅠ으로 절단되었고 SfiⅠ 절단된 pComb3X 벡터로 클로닝되었다. 이러한 클론들은 E.coli ER 2738로 형질주입되었다. 각각의 인간/마우스 MG4 하이브리드로부터 단일 콜로니는 600 nm에서 흡광도가 1.0에 이를 때까지 배양되었다. 파지 감염은 VCSM13 헬퍼 파지(1011 pfu/ml)의 첨가에 의해 수행되었고 37 ℃에서 2시간동안 배양되었다. 카나마이신(25 ug/ml)는 첨가되었고 배양은 일정한 교반하에 37 ℃에서 밤샘으로 이루어졌다. 박테리아는 3000g에서 15분간 원심분리에 의해 제거되었다.
표 14. 인간/마우스 하이브리드 MG4 도메인의 증폭을 위한 프라이머 서열
Figure pat00015
Figure pat00016
파지 ELISA는 다음과 같이 수행되었다. 항-C5 IgG2/4인 HRA-06-H2-7은 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 8.6)에서 희석되었고 항체 100 ng은 4 ℃에서 밤새 96-웰 플레이트에 코팅되었다. 각각의 웰은 100 ul의 트윈 20을 0.05 % 함유한 TBS 내 5 % 스킴 밀크 첨가에 의해 블록킹되었고 1시간 동안 37 ℃에서 배양되었다. 파지는 6% BSA/PBS에서 2배로 희석되었고 희석된 50 ul 파지는 각각에 웰에 첨가되었고 37 ℃에서 2시간동안 배양되었다. 플레이트는 세척되고, 50 ul의 희석된 HRP-결합된 항-M13 항체 (1:5000)가 첨가되었으며 1시간동안 37 ℃에서 배양되었다. 플레이트를 세척한 후에 50 ul ABTS 기질 용액이 각 웰에 첨가되었고 흡광도는 405 nm에서 측정되었다.
그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 13의 A는 인간/마우스 하이브리드 MG4 도메인을 보여주고 있으며, 도 13의 B는 ELISA 결과를 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, HRA-06-H2-7 항체는 베타쇄 서열을 기준으로 379 - 398의 아미노산 잔기 서열이 사람의 서열인 경우에 결합하였으며, 이는 항체의 해당 부분에 대한 결합 가능성을 보여준다.
도 14는 서열 결합 부위를 더 구체적으로 확인한 결과이다. 도 14의 A는 인간/마우스 하이브리드 MG4 도메인을 보여주고 있으며, 도 14의 B는 ELISA 결과를 나타낸다. 도 14에 나타낸 바와 같이, HRA-06-H2-7 항체는 베타쇄 서열을 기준으로 386 - 392의 아미노산 잔기 서열(MG4 도메인 서열 기준: 55-61 번째 아미노산 서열)이 사람의 서열인 경우에 결합하였으며, 이는 항체의 해당 부분에 대한 결합 가능성을 보여준다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> C5 ANTIBODIES AND METHODS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF COMPLEMENT-ASSOCIATED DISEASE <130> P13042-SNU <150> US 61/759015 <151> 2013-01-31 <150> US 61/862248 <151> 2013-08-05 <160> 145 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg Tyr Trp Ile Gln 1 5 10 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Val Trp Pro Gly Ile Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln Leu Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly Trp Asp Tyr Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Val Trp Pro Gly Ile Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Val Trp Pro Gly Ile Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 10 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg Tyr Trp Ile Gln 1 5 10 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Gly Trp Pro Gly Ala Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln Leu Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly Trp Asp Tyr Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Gly Trp Pro Gly Ala Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Gly Trp Pro Gly Ala Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 20 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg Tyr Trp Ile Gln 1 5 10 <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ser Ser Ser Leu Arg Gly Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln Leu Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly Trp Asp Tyr Gly 1 5 10 <210> 27 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ser Ser Leu Arg Gly Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ser Ser Leu Arg Gly Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 30 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg Tyr Trp Ile Gln 1 5 10 <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ser Val Trp Pro Gly Phe Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln Leu Ser 1 5 10 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly Trp Asp Tyr Gly 1 5 10 <210> 37 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Val Trp Pro Gly Phe Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 39 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Val Trp Pro Gly Phe Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 40 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gly Phe Ser Leu Ser Gly Arg Tyr Trp Ile Gln 1 5 10 <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ser Gly Trp Pro Gly Ala Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln Leu Ser 1 5 10 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly Trp Asp Tyr Gly 1 5 10 <210> 47 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Gly Trp Pro Gly Ala Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 49 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Gly Trp Pro Gly Ala Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 50 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gly Phe Ser Leu Ser Gly Arg Tyr Trp Ile Gln 1 5 10 <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Ser Val Trp Pro Gly Phe Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln Leu Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly Trp Asp Tyr Gly 1 5 10 <210> 57 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Val Trp Pro Gly Phe Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 58 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 59 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Tyr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Val Trp Pro Gly Phe Thr Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Val Ala Trp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 60 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Trp Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 61 <211> 1676 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30 Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe 50 55 60 Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80 Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln 85 90 95 Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg 130 135 140 Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val 145 150 155 160 Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu 165 170 175 Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 180 185 190 Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp 195 200 205 Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu 210 215 220 Pro His Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr 225 230 235 240 Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr 245 250 255 Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg 260 265 270 Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln 275 280 285 Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu 290 295 300 Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn 305 310 315 320 Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335 Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr 340 345 350 Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro 355 360 365 Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly 370 375 380 Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu 385 390 395 400 Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly 405 410 415 Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu 420 425 430 Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala 435 440 445 Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr 450 455 460 Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu 465 470 475 480 His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 485 490 495 Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe 500 505 510 Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile 515 520 525 Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr 530 535 540 Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp 545 550 555 560 Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser 565 570 575 Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met 580 585 590 Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala 595 600 605 Val Tyr Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe 610 615 620 Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 625 630 635 640 Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn 645 650 655 Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile 660 665 670 Leu Arg Pro Arg Arg Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala 675 680 685 Lys Tyr Lys His Ser Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys 690 695 700 Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu 705 710 715 720 Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser 725 730 735 Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu 740 745 750 His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr 755 760 765 Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys 770 775 780 Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln 785 790 795 800 Gly Val Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys 805 810 815 Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser 820 825 830 Val Val Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr 835 840 845 Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly 850 855 860 Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser 865 870 875 880 Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val 885 890 895 Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe 900 905 910 Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg 915 920 925 Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu 930 935 940 Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro 945 950 955 960 Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile 965 970 975 Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu 980 985 990 Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005 Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His Tyr 1010 1015 1020 Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro Leu Ile 1025 1030 1035 1040 Glu Lys Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Leu Ser Ile 1045 1050 1055 Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val Trp Lys Gly Gly 1060 1065 1070 Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu Arg Val Leu Gly Gln 1075 1080 1085 Val Asn Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn Ser Ile Cys Asn Ser Leu 1090 1095 1100 Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu 1105 1110 1115 1120 Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu 1125 1130 1135 Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile 1140 1145 1150 Arg Lys Ala Phe Asp Ile Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu 1155 1160 1165 Ile Lys Ala Asp Asn Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser 1170 1175 1180 Thr Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys 1185 1190 1195 1200 Thr His Pro Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala 1205 1210 1215 Leu Val Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu 1220 1225 1230 Gln His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val 1235 1240 1245 Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp Ile 1250 1255 1260 Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln Arg Tyr 1265 1270 1275 1280 Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala Ile Glu Gly 1285 1290 1295 Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg Leu Ser Met Asp 1300 1305 1310 Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu His Asn Tyr Lys Met 1315 1320 1325 Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val Glu Val Leu Leu Asn Asp 1330 1335 1340 Asp Leu Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val His 1345 1350 1355 1360 Val Thr Thr Val Val His Lys Thr Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser 1365 1370 1375 Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg 1380 1385 1390 Gly Tyr Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr 1395 1400 1405 Lys Pro Ser Arg Glu Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met 1410 1415 1420 Asp Ile Ser Leu Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys 1425 1430 1435 1440 Ala Leu Val Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys 1445 1450 1455 Asp Gly His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe 1460 1465 1470 Leu Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu 1475 1480 1485 Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys Gln 1490 1495 1500 Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys Val Cys 1505 1510 1515 1520 Glu Gly Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly Gln Met Gln 1525 1530 1535 Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg Lys Gln Thr Ala 1540 1545 1550 Cys Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val Ser Ile Thr Ser Ile 1555 1560 1565 Thr Val Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys Ala Thr Leu Leu Asp Ile 1570 1575 1580 Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe 1585 1590 1595 1600 Ile Lys Lys Val Thr Cys Thr Asn Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln 1605 1610 1615 Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser 1620 1625 1630 Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp 1635 1640 1645 Pro Arg Asp Thr Thr Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu 1650 1655 1660 Asp Glu Phe Ala Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys 1665 1670 1675 <210> 62 <211> 673 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30 Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe 50 55 60 Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80 Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln 85 90 95 Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg 130 135 140 Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val 145 150 155 160 Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu 165 170 175 Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 180 185 190 Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp 195 200 205 Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu 210 215 220 Pro His Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr 225 230 235 240 Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr 245 250 255 Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg 260 265 270 Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln 275 280 285 Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu 290 295 300 Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn 305 310 315 320 Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335 Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr 340 345 350 Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro 355 360 365 Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly 370 375 380 Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu 385 390 395 400 Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly 405 410 415 Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu 420 425 430 Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala 435 440 445 Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr 450 455 460 Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu 465 470 475 480 His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 485 490 495 Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe 500 505 510 Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile 515 520 525 Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr 530 535 540 Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp 545 550 555 560 Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser 565 570 575 Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met 580 585 590 Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala 595 600 605 Val Tyr Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe 610 615 620 Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 625 630 635 640 Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn 645 650 655 Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile 660 665 670 Leu <210> 63 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ser Pro Tyr Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro 1 5 10 15 Gly Ile Pro Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln 20 25 30 Leu Val Gly Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val 35 40 45 Asn Gln Glu Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val 50 55 60 Asp Asp Gly Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr 65 70 75 80 Val Leu Glu Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu 85 90 95 Asn Gln Ala Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser 100 105 110 Gln Ser Tyr Leu Tyr Ile Asp Trp 115 120 <210> 64 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggatt ctccttcagt ggcaggtact ggatacaatg ggtgcggcag 120 gcccctggca agggcctcga gtgggtggcc tctgtgtggc ctggtattac tggtgacact 180 aactacgcga actgggcgaa aggccggttc accatctccc gggacgactc caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 gaacctgttg cctggggtgg cggcttggac ttgtggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 65 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggatt ctccttcagt ggcaggtact ggatacaatg ggtgcggcag 120 gcccctggca agggcctcga gtgggtggcc agtggttggc cgggggcgac tggtgacact 180 aactacgcga actgggcgaa aggccggttc accatctccc gggacgactc caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 gaacctgttg cctggggtgg cggcttggac ttgtggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 66 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggatt ctccttcagt ggcaggtact ggatacaatg ggtgcggcag 120 gcccctggca agggcctcga gtgggtggcc agttctagtt tgcgggggac tggtgacact 180 aactacgcga actgggcgaa aggccggttc accatctccc gggacgactc caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 gaacctgttg cctggggtgg cggcttggac ttgtggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 67 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggatt ctccttcagt ggcaggtact ggatacaatg ggtgcggcag 120 gcccctggca agggcctcga gtgggtggcc tcggtgtggc cggggtttac tggtgacact 180 aactacgcga actgggcgaa aggccggttc accatctccc gggacgactc caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 gaacctgttg cctggggtgg cggcttggac ttgtggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 68 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggatt ctccctcagt ggcaggtact ggatacaatg ggtgcggcag 120 gcccctggca agggcctcga gtgggtggcc agtggttggc cgggggcgac tggtgacact 180 aactacgcga actgggcgaa aggccggttc accatctccc gggacgactc caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 gaacctgttg cctggggtgg cggcttggac ttgtggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 69 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggatt ctccctcagt ggcaggtact ggatacaatg ggtgcggcag 120 gcccctggca agggcctcga gtgggtggcc tcggtgtggc cggggtttac tggtgacact 180 aactacgcga actgggcgaa aggccggttc accatctccc gggacgactc caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 gaacctgttg cctggggtgg cggcttggac ttgtggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 70 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgcc aggccagtca gagcattaac aaccaactat cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagctgct gatctactat gcatccactc tggcatctgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccaaggc agttattata gtggtggttg ggactatggt 300 ttcggccagg gtaccaaggt ggagatcaag 330 <210> 71 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vk 5' Sense Primers - RSCVK1 <400> 71 gggcccaggc ggccgagctc gtgmtgaccc agactcca 38 <210> 72 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vk 5' Sense Primers - RSCVK2 <400> 72 gggcccaggc ggccgagctc gatmtgaccc agactcca 38 <210> 73 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vk 5' Sense Primers - RSCVK3 <400> 73 gggcccaggc ggccgagctc gtgatgaccc agactgaa 38 <210> 74 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vk 3' Reverse Primers, LongLinker - RKB9J1o-BL <400> 74 ggaagatcta gaggaaccac ccccaccacc gcccgagcca ccgccaccag aggataggat 60 ctccagctcg gtccc 75 <210> 75 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vk 3' Reverse Primers, LongLinker - RKB9Jo-BL <400> 75 ggaagatcta gaggaaccac ccccaccacc gcccgagcca ccgccaccag aggataggat 60 ctccagctcg gtccc 75 <210> 76 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vk 3' Reverse Primers, LongLinker - RKB42Jo-BL <400> 76 ggaagatcta gaggaaccac ccccaccacc gcccgagcca ccgccaccag aggatttgac 60 saccacctcg gtccc 75 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V lamda 5'Sense Primer - RSC lamda 1 <400> 77 gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc agtcgccctc 40 <210> 78 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V lamda 3'Reverse Primer, LongLinker - RJ lamda o-BL <400> 78 ggaagatcta gaggaaccac ccccaccacc gcccgagcca ccgccaccag aggagcctgt 60 gacggtcagc tgggtccc 78 <210> 79 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH5'Sense Primers - RSCVH1 <400> 79 ggtggttcct ctagatcttc ccagtcggtg gaggagtccr gg 42 <210> 80 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH5'Sense Primers - RSCVH2 <400> 80 ggtggttcct ctagatcttc ccagtcggtg aaggagtccg ag 42 <210> 81 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH5'Sense Primers - RSCVH3 <400> 81 ggtggttcct ctagatcttc ccagtcgytg gaggagtccg gg 42 <210> 82 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH5'Sense Primers - RSCVH4 <400> 82 ggtggttcct ctagatcttc ccagsagcag ctgrtggagt ccgg 44 <210> 83 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH3'Reverse Primers -RSCG-B <400> 83 cctggccggc ctggccacta gtgactgayg gagccttagg ttgccc 46 <210> 84 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlap Extension Primers - RSC-F (sense) <400> 84 gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgagct c 41 <210> 85 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlap Extension Primers - RSC-B (reverse) <400> 85 gaggaggagg aggaggagcc tggccggcct ggccactagt g 41 <210> 86 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V lamda Primers - CSCVK (sense) <400> 86 gtggcccagg cggccctgac tcagccgtcc tcggtgtc 38 <210> 87 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V lamda Primers - CKJo-B (reverse) <400> 87 ggaagatcta gaggactgac ctaggacggt cagg 34 <210> 88 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHPrimers - CSCVHo-FL (sense) <400> 88 ggtcagtcct ctagatcttc cggcggtggt ggcagctccg gtggtggcgg ttccgccgtg 60 acgttggacg ag 72 <210> 89 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHPrimers - CSCG-B (reverse) <400> 89 ctggccggcc tggccactag tggaggagac gatgacttcg gtcc 44 <210> 90 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlap Extension Primers - CSC-F (sense) <400> 90 gaggaggagg aggaggaggt ggcccaggcg gccctgactc ag 42 <210> 91 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlap Extension Primers - CSC-B (reverse) <400> 91 gaggaggagg aggaggagga gctggccggc ctggccacta gtggagg 47 <210> 92 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers - MG1-F <400> 92 ggcccaggcg gccatgggcc ttttgggaat actttg 36 <210> 93 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers - MG2-F <400> 93 ggcccaggcg gccaatggat ttctcttcat tcatac 36 <210> 94 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers - MG3-F <400> 94 ggcccaggcg gccccacatt tttctgtctc aatc 34 <210> 95 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers - MG4-F <400> 95 ggcccaggcg gcctctccct acaaactgaa tttg 34 <210> 96 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers- MG5-F <400> 96 ggcccaggcg gccactgata accataaggc tttg 34 <210> 97 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers- Linker-F <400> 97 ggcccaggcg gcctcctggg tggcattagc 30 <210> 98 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primers - MG1-R <400> 98 ggccggcctg gccgtcatag gttattggca ttct 34 <210> 99 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primers - MG2-R <400> 99 ggccggcctg gcccaagaca tattctttaa cttc 34 <210> 100 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primers - MG3-R <400> 100 ggccggcctg gccgaggaca tatttgatgc cag 33 <210> 101 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primers - MG4-R <400> 101 ggccggcctg gccccaatca atataaaggt aactttg 37 <210> 102 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primers - MG5-R <400> 102 ggccggcctg gccatccatt ccagttgcca tatta 35 <210> 103 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primers - Linker-R <400> 103 ggccggcctg gccgagaatt tctttacaag gttc 34 <210> 104 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers - hMG4-F <400> 104 ggcccaggcg gcctctccct acaaactgaa tttg 34 <210> 105 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers- d332-348_F <400> 105 ggcccaggcg gccattccat atcccatcaa gg 32 <210> 106 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers- d332-378-F <400> 106 ggcccaggcg gccgtaaacc aagagacatc tgac 34 <210> 107 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers - d332-396-F <400> 107 ggcccaggcg gccgatggag tagcttcctt tg 32 <210> 108 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primers - d332-424-F <400> 108 ggcccaggcg gccccagaag aaaatcaggc c 31 <210> 109 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primers - hMG4-R <400> 109 ggccggcctg gccccaatca atataaaggt aactttg 37 <210> 110 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construction of hMG4-m332-348 - m332-348F <400> 110 ggcccaggcg gcctctccct acacactgaa tttggtcgct actcctcttt tcgtgaagcc 60 cgggattcca tatcccatca aggtgc 86 <210> 111 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construction of hMG4-m332-348 - hMG4_R <400> 111 ggcccaggcg gcctctccct acaaactgaa tttg 34 <210> 112 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mMG4_F (Mouse MG4 N-terminal) <400> 112 tctccctaca cactgaattt gg 22 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - m332-359_R (Mouse MG4 N-terminal) <400> 113 gtcaagcgaa tctttaacct gtgccttg 28 <210> 114 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - m332-368_R (Mouse MG4 N-terminal) <400> 114 tgttactggg acccctccta ccgcctg 27 <210> 115 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - m332-378_R (Mouse MG4 N-terminal) <400> 115 ttggtttaca tcgactgttt gtgccatc 28 <210> 116 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - m332-385_R (Mouse MG4 N-terminal) <400> 116 tggatccaag tcagatgtct cttgattcac 30 <210> 117 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - m332-392_R (Mouse MG4 N-terminal) <400> 117 aacacgtgtg atgctcctct ttgtttcc 28 <210> 118 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - m332-398_R (Mouse MG4 N-terminal) <400> 118 ggaagctact ccatcagtgt catgagtg 28 <210> 119 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - m332-409_R (Mouse MG4 N-terminal) <400> 119 caccgtcaca tttgatggga ggttcagc 28 <210> 120 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - m332-359_F (Human MG4 C-terminal) <400> 120 gttaaagatt cgcttgacca gttggtag 28 <210> 121 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - m332-368_F (Human MG4 C-terminal) <400> 121 ggaggggtcc cagtaacact gaatgcac 28 <210> 122 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer -m332-378_F (Human MG4 C-terminal) <400> 122 acagtcgatg taaaccaaga gacatctgac 30 <210> 123 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer -m332-385_F (Human MG4 C-terminal) <400> 123 acatctgact tggatccaag caaaagtgt 29 <210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer -m332-392_F (Human MG4 C-terminal) <400> 124 aggagcatca cacgtgttga tgatggagta 30 <210> 125 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer -m332-398_F (Human MG4 C-terminal) <400> 125 actgatggag tagcttcctt tgtgcttaat c 31 <210> 126 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer -m332-409_F (Human MG4 C-terminal) <400> 126 ccatcaaatg tgacggtgct ggagttta 28 <210> 127 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - hMG4_R (Human MG4 C-terminal) <400> 127 ggcccaggcg gcctctccct acaaactgaa tttg 34 <210> 128 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construction of mMG4-h332-348 - h332-348_F <400> 128 ggcccaggcg gcctctccct acaaactgaa tttggttgct actcctcttt tcctgaagcc 60 tgggattcca ttttccatca ag 82 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construction of mMG4-h332-348 - mMG4_R <400> 129 ccaagcgatg taaatgtaac 20 <210> 130 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - hMG4-F (Human MG4 N-terminal) <400> 130 ggcccaggcg gcctctccct acaaactgaa tttg 34 <210> 131 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - h332-359_R (Human MG4 N-terminal) <400> 131 ctcgagtgaa tctttaacct gcaccttga 29 <210> 132 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - h332-368_R (Human MG4 N-terminal) <400> 132 agttactggg actcctccta ccaactg 27 <210> 133 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - h332-378_R (Human MG4 N-terminal) <400> 133 ttgattcaca tcaattgttt gtgcattcag 30 <210> 134 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - h332-385_R (Human MG4 N-terminal) <400> 134 tgtttccaag tcagatgtct cttggtttac 30 <210> 135 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - h332-392_R (Human MG4 N-terminal) <400> 135 gtcatgagtt acacttttgc ttggatcca 29 <210> 136 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - h332-398_R (Human MG4 N-terminal) <400> 136 cacagctact ccatcatcaa cacgtgttac 30 <210> 137 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - h332-409_R (Human MG4 N-terminal) <400> 137 caccgtcact ccagatggga gattaagcac 30 <210> 138 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - h332-359_F (Mouse MG4 C-terminal) <400> 138 gttaaagatt cactcgagca ggcggt 26 <210> 139 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - h332-368_F (Mouse MG4 C-terminal) <400> 139 ggaggagtcc cagtaactct gatggcac 28 <210> 140 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - h332-378_F (Mouse MG4 C-terminal) <400> 140 acaattgatg tgaatcaaga gacatctgac 30 <210> 141 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - h332-385_F (Mouse MG4 C-terminal) <400> 141 acatctgact tggaaacaaa gaggagcatc 30 <210> 142 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - h332-392_F (Mouse MG4 C-terminal) <400> 142 caaaagtgta actcatgaca ctgatggag 29 <210> 143 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - h332-398_F(Mouse MG4 C-terminal) <400> 143 gatgatggag tagctgtgtt tgtgctgaac 30 <210> 144 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - h332-409_F (Mouse MG4 C-terminal) <400> 144 ccatctggag tgacggtgct aaagtttg 28 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - mMG4_R (Mouse MG4 C-terminal) <400> 145 ccaagcgatg taaatgtaac 20

Claims (24)

  1. 보체 C5 단백질 베타쇄의 MG 4 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 보체 C5 단백질 베타쇄의 에피토프는 보체 C5 단백질 베타쇄의 332 내지 348번째 아미노산 잔기 서열 및/또는 386 내지 392번째 아미노산 잔기 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 보체 C5 단백질 베타쇄의 에피토프는 보체 C5 단백질 베타쇄의 332 내지 398번째 아미노산 잔기 서열 및/또는 350 내지 420번째 아미노산 잔기 서열에 포함되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 표 1 내지 6에 기재된 항체 중 어느 하나와 동일한 에피토프를 가지는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 항체는 단일클론 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 항체는 인간 또는 인간화 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 항체는 IgG 이소형인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 항체는 IgG2의 힌지(hinge)와 IgG4의 Fc의 융합단백질을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 서열번호 1, 11, 21, 31, 41 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 1, 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 2, 및 서열번호 3의 중쇄 상보성 결정 영역 3을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정 영역 1, 서열번호 5의 경쇄 상보성 결정 영역 2 및 서열번호 6의 경쇄 상보성 결정 영역 3을 추가로 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 서열번호 8로 제시된 아미노산 서열에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 또는 59 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 서열번호 10으로 제시된 아미노산 서열에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제11항에 있어서, 서열번호 8로 제시된 아미노산 서열에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제13항에 있어서, 서열번호 10으로 제시된 아미노산 서열에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 추가로 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 보체 관련 질환 치료용 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 보체 관련 질환은 류마티스성 관절염(RA), 퇴행성 관절염, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 허혈 및 재관류 이후의 원거리 조직 손상, 심폐 우회술 동안 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 낭창성 신염, 사구체신염, 사구체혈관염, 심폐 바이패스, 심장마비-유도된 관상동맥 내피 기능 이상, 제II형 막증식성 사구체신염, 급성 신부전증, 항인지질 증후군, 황반 변성증, 안내염, 신혈관 질환, 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성 폐쇄성 폐 호흡곤란 증후군 (COPD), 천식, 야간 혈색소뇨증(PNH) 및 흡인성 폐렴으로부터 선택되는 보체 관련 질환 치료용 약학적 조성물.
  19. 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  20. 서열번호 8로 제시된 아미노산 서열에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  21. 제19항 또는 제20항으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터.
  22. 제21항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  23. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 용기를 포함하는 보체 관련 질환의 진단용 키트.
  24. 제23항에 있어서, 상기 보체 관련 질환은 류마티스성 관절염(RA), 퇴행성 관절염, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 허혈 및 재관류 이후의 원거리 조직 손상, 심폐 우회술 동안 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 낭창성 신염, 사구체신염, 사구체혈관염, 심폐 바이패스, 심장마비-유도된 관상동맥 내피 기능 이상, 제II형 막증식성 사구체신염, 급성 신부전증, 항인지질 증후군, 황반 변성증, 안내염, 신혈관 질환, 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성 폐쇄성 폐 호흡곤란 증후군 (COPD), 천식, 야간 혈색소뇨증(PNH) 및 흡인성 폐렴으로부터 선택되는 보체 관련 질환의 진단용 키트.
KR1020140012235A 2013-01-31 2014-02-03 보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 ｃ5 항체 및 방법 KR101638931B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361759015P 2013-01-31 2013-01-31
US61/759,015 2013-01-31
US201361862248P 2013-08-05 2013-08-05
US61/862,248 2013-08-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150035354A true KR20150035354A (ko) 2015-04-06
KR101638931B1 KR101638931B1 (ko) 2016-07-12

Family

ID=51262613

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140012235A KR101638931B1 (ko) 2013-01-31 2014-02-03 보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 ｃ5 항체 및 방법

Country Status (10)

Country Link
US (2) US10280215B2 (ko)
EP (1) EP2975055A4 (ko)
JP (2) JP6608702B2 (ko)
KR (1) KR101638931B1 (ko)
CN (1) CN105143261B (ko)
AU (2) AU2014213147B2 (ko)
BR (1) BR112015018438A2 (ko)
CA (1) CA2899589C (ko)
RU (2) RU2018125515A (ko)
WO (1) WO2014119969A1 (ko)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
JP5334319B2 (ja) 2007-09-26 2013-11-06 中外製薬株式会社 Ｃｄｒのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
KR20220162801A (ko) 2008-04-11 2022-12-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
RU2018125515A (ru) * 2013-01-31 2018-10-29 СЕУЛ НЭШНЛ ЮНИВЕРСИТИ Ар энд ДиБи ФАУНДЕЙШН Антитело против c5 и способ предупреждения и лечения обусловленных комплементом заболеваний
KR102515796B1 (ko) * 2014-12-19 2023-03-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-c5 항체 및 그의 사용 방법
EP3280440B1 (en) 2015-04-06 2022-11-16 Bioverativ USA Inc. Humanized anti-c1s antibodies and methods of use thereof
PE20181402A1 (es) * 2015-12-18 2018-09-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-c5 y metodos de uso
WO2017164678A2 (ko) * 2016-03-23 2017-09-28 서울대학교산학협력단 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 외막 당단백질에 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2017212375A1 (en) * 2016-06-07 2017-12-14 Novartis Ag Anti-c5 antibody for treating patients with complement c5 polymorphism
AU2017283470B2 (en) 2016-06-14 2024-03-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-C5 antibodies and uses thereof
MX2018015030A (es) * 2016-06-17 2019-04-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-c5 y metodos de uso.
US11053308B2 (en) 2016-08-05 2021-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating IL-8-related diseases
AR110677A1 (es) * 2016-10-12 2019-04-24 Bioverativ Usa Inc Anticuerpos anti-c1s y métodos para usarlos
CN110603054B (zh) * 2017-03-06 2024-05-10 宾夕法尼亚大学理事会 抗c5抗体及其用途
JP2021506241A (ja) 2017-12-13 2021-02-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗ｃ５抗体組み合わせ物およびその使用
KR20200033225A (ko) * 2018-08-01 2020-03-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 C5-관련 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물 및 c5-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법
CN111234016B (zh) * 2020-02-23 2021-09-07 北京康普美特创新医药科技有限责任公司 一种抗补体c5分子的全人源单克隆抗体及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080100388A (ko) * 2006-03-08 2008-11-17 아케믹스 코포레이션 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제
KR20110038173A (ko) * 2008-08-05 2011-04-13 노파르티스 아게 보체 단백질 ｃ５를 표적으로 하는 항체의 조성물 및 방법
JP2013543380A (ja) * 2010-10-01 2013-12-05 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ヒト補体成分ｃ５に結合するポリペプチド

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6074642A (en) * 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5853975A (en) * 1994-08-23 1998-12-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying compositions for the treatment of body weight disorders, including obesity
WO2002030985A2 (en) * 2000-10-10 2002-04-18 Tanox, Inc. Inhibition of complement c5 activation for the treatment and prevention of delayed xenograft or acute vascular rejection
US20040185040A1 (en) * 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
NZ567483A (en) * 2005-11-04 2012-04-27 Genentech Inc Use of complement pathway inhibitors to treat ocular diseases
US7776573B2 (en) * 2006-06-01 2010-08-17 Genentech, Inc. Crystal structure of CRIg and C3b:CRIg complex
US20100166748A1 (en) * 2007-03-22 2010-07-01 Novartis Ag C5 Antigens and Uses Thereof
US20100267934A1 (en) * 2007-05-31 2010-10-21 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
WO2008153963A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Structure of compstatin-c3 complex and use for rational drug design
BRPI0921237A2 (pt) * 2008-11-10 2015-09-22 Alexion Pharma Inc métodos e composições para o tratamento de distúrbios associados ao complemento
KR20130009784A (ko) * 2010-03-01 2013-01-23 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 악성 위축성 구진증을 치료하는 방법 및 조성물
AU2013211824B2 (en) * 2012-01-27 2017-06-01 Gliknik Inc. Fusion proteins comprising IgG2 hinge domains
RU2018125515A (ru) 2013-01-31 2018-10-29 СЕУЛ НЭШНЛ ЮНИВЕРСИТИ Ар энд ДиБи ФАУНДЕЙШН Антитело против c5 и способ предупреждения и лечения обусловленных комплементом заболеваний

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080100388A (ko) * 2006-03-08 2008-11-17 아케믹스 코포레이션 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제
KR20110038173A (ko) * 2008-08-05 2011-04-13 노파르티스 아게 보체 단백질 ｃ５를 표적으로 하는 항체의 조성물 및 방법
JP2013543380A (ja) * 2010-10-01 2013-12-05 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ヒト補体成分ｃ５に結合するポリペプチド

Also Published As

Publication number Publication date
CA2899589A1 (en) 2014-08-07
AU2019202606A1 (en) 2019-05-02
AU2019202606B2 (en) 2021-04-15
JP2020031650A (ja) 2020-03-05
CN105143261B (zh) 2021-04-09
US20160068592A1 (en) 2016-03-10
US20190382472A1 (en) 2019-12-19
JP6608702B2 (ja) 2019-11-20
RU2018125515A3 (ko) 2021-11-19
WO2014119969A1 (ko) 2014-08-07
CA2899589C (en) 2022-02-22
RU2018125515A (ru) 2018-10-29
CN105143261A (zh) 2015-12-09
EP2975055A1 (en) 2016-01-20
JP7019198B2 (ja) 2022-02-15
US11339210B2 (en) 2022-05-24
RU2663349C2 (ru) 2018-08-03
AU2014213147A1 (en) 2015-08-20
AU2014213147B2 (en) 2019-01-17
JP2016513088A (ja) 2016-05-12
EP2975055A4 (en) 2016-11-02
BR112015018438A2 (pt) 2017-07-18
KR101638931B1 (ko) 2016-07-12
RU2015136078A (ru) 2017-03-07
US10280215B2 (en) 2019-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101638931B1 (ko) 보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 ｃ5 항체 및 방법
AU2019250213B2 (en) A novel il33 form, mutated forms of il33, antibodies, assays and methods of using the same
CA2597717C (en) Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof
WO2015085847A1 (zh) Pd-1抗体、其抗原结合片段及其医药用途
JP7179743B2 (ja) 抗ＳＩＲＰｇ抗体の新規の使用
WO2019091436A1 (zh) 4-1bb抗体及其制备方法和应用
CN107428838B (zh) 结合tfpi的新型抗体以及包含所述抗体的组合物
KR20200119846A (ko) 항 비7 에이치4 항체, 그의 항원 결합 단편 및 그의 약학적 용도
US11230602B2 (en) Non-antagonistic antibodies directed against the alpha chain of the IL7 receptor extracellular domain and use thereof in cancer treatment
CN112969714B (zh) 抗cd40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
US20230192861A1 (en) Anti-pd-l1/anti-b7-h3 multispecific antibodies and uses thereof
AU2022263683A1 (en) Anti-masp2 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
JP2021534204A (ja) 抗ＳＩＲＰｇ化合物
KR101804988B1 (ko) 신규 항-tfpi 항체 및 이를 포함하는 조성물
WO2022141378A1 (zh) 一种抗pd-1的单域抗体
RU2792748C2 (ru) Антитело к b7-h4, его антигенсвязывающий фрагмент и его фармацевтическое применение
CN117355540A (zh) 抗cd137抗体和使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190429

Year of fee payment: 4