JP5964004B2 - 眼科疾患を治療する方法 - Google Patents

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Description

本出願は、2007年3月9日に出願した米国仮出願第60/894,181号の利益を主張する2008年3月3日に出願した米国出願第12/041,581号の利益を主張するものであり、それらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれるものとする。
本発明は、加齢性黄斑変性症などの眼科疾患の治療および/または予防におけるばかりでなく、緑内障、糖尿病性網膜症(糖尿病性黄斑浮腫を含む)、脈絡膜新生血管膜(CNV)、ブドウ膜炎、近視性変性、眼腫瘍、網膜中心静脈閉塞症、ルベオーシス、眼新血管新生、中心性漿液性網膜症、ドライアイなどの眼表面円板、網膜中心動脈閉塞症、類嚢胞黄斑浮腫およびその他の網膜変性疾患などの他の眼病変において、アミロイド−βペプチドに対する抗体を用いる方法に関する。
米国において65歳を超える人における最良矯正視力低下の最も一般的な原因は、加齢性黄斑変性症(AMD)として知られている網膜障害である。AMDが進行するにつれて、この疾患は、鋭い中心視力の喪失を特徴とする。AMDによって影響を受ける眼の領域は、黄斑、すなわち、主に光受容体細胞からなる網膜の中心にある小さな領域である。いわゆる「萎縮型(dry)」AMD(「ジオグラフィックアトロフィー」とも呼ばれる)は、AMD患者の約85%〜90%を占め、眼の色素分布の変化、光受容体の喪失および細胞の全体的な萎縮による網膜機能の低下が関わっている。いわゆる「滲出型(wet)」AMDは、網膜下腔における血塊または瘢痕につながる異常な脈絡膜血管の増殖が関わっている。したがって、滲出型AMDの発症は、神経網膜の下での異常な脈絡膜新生血管網の形成(脈絡膜新血管新生、CNV)のために起こる。新たに形成された血管は、過度に漏出性である。このことは、視力の喪失につながる網膜下液および血液の蓄積につながる。最終的に、脈絡膜および網膜が関わる大きな円板状の瘢痕が形成するため、関係する領域における機能的網膜はすべて失われる。萎縮型AMD患者は、質的に低下した視力を維持することができるが、滲出型AMDは、失明をもたらすことが多い(HamdiおよびKenney、Age−related Macular degeneration−a new viewpoint、Frontiers in Bioscience、e305〜314、2003年5月)。CNVは、滲出型AMDにおいてばかりでなく、緑内障、糖尿病性網膜症(糖尿病性黄斑浮腫を含む)、ブルッフ膜における裂傷、近視性変性、眼腫瘍および他の関連する網膜変性疾患などの他の眼病変においても起きる。
AMDは、その病因が明らかに多因子性であり、その発症および進行において遺伝および環境要因が役割を果たす一般的障害である。実施された様々な研究は、喫煙、加齢、家族歴(Milton、Am J Ophthalmol 88、269(1979);Mitchell他、Ophthalmology 102、1450〜1460(1995);Smith他、Ophthalmology 108、697〜704(2001))性別(女性において7倍高い可能性:Klein他、Ophthalmology 99、933〜943(1992))および人種(白人は最も罹患しやすい)などのAMDのいくつかの危険因子を突き止めた。さらなる危険因子には、遠視(farsightedness)(遠視(hyperopia))および淡色の眼などの眼の特徴、ならびに心血管疾患および高血圧症が含まれることがある。この疾患の発症進行における遺伝の関与の証拠も立証されている(上記のHamdiおよびKenneyを参照)。
米国仮出願第60/894,181号 米国出願第12/041,581号 HamdiおよびKenney、Age−related Macular degeneration−a new viewpoint、Frontiers in Bioscience、e305〜314、2003年5月 Milton、Am J Ophthalmol 88、269(1979) Mitchell他、Ophthalmology 102、1450〜1460(1995) Smith他、Ophthalmology 108、697〜704(2001) Klein他、Ophthalmology 99、933〜943(1992) Malek他(PNAS 102、11900〜5(2005)) Eur.J.Immunol.(1999)29:2613〜2624 PCT出願第PCT/GB99/01441号 英国特許出願第9809951.8号 Yoshida,T.他、J.of Clin.Invest.、115(10):2793〜2800(2005) Anderson,D.他、Experimental Eye Research 78:243〜256(2004) Johnson,L.他、PNAS、99(18):11820〜11835(2002) McKinnon SJ、Front Biosci 8:1140〜56(2003) Tatton他、Surv Ophthalmol.48:S25〜37(2003) McGowan,E.他、Neuron 47:191〜199(2005) Kim,J.他、Neurobiology of Disease、27(3):627〜633(2007) WO2006036291 WO2006118959 Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Sambrook他、1989)Cold Spring Harbor Press Oligonucleotides Synthesis(M.J.Gatt編、1984) Methods in Molecular Biology、Humana Press Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編、1998)Academic Press Animal Cell Culture(R.I.Freshney編、1987) Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E.Roberts、1998)Plenum Press Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths、およびD.G.Newell編、1993〜1998)J.Wiley and Sons Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.) 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現在、AMDを研究するための一般的に許容できる動物モデルは存在しない。Malek他(PNAS 102、11900〜5(2005))による初期の研究は、組み合わされた場合に、ヒトAMDの形態学的特徴に近似している、3つの危険因子を有する動物モデルを作り出した。意味深いことに、このマウスモデルの開発は、AMDの新規な分子機構および治療標的をテストするための機会を提供した。加齢性黄斑変性症(滲出型と萎縮型の双方)、緑内障、糖尿病性網膜症(糖尿病性黄斑浮腫を含む)、脈絡膜新生血管膜(CNV)、ブドウ膜炎、近視性変性、眼腫瘍、網膜中心静脈閉塞症、ルベオーシス、眼新血管新生、中心性漿液性網膜症、ドライアイなどの眼表面円板、網膜中心動脈閉塞症、類嚢胞黄斑浮腫および他の網膜変性疾患などの眼科疾患を治療および/または予防することができる新規な標的および治療薬を同定する必要性が残っている。
本発明は、眼科疾患の病因に関与している新規な治療標的を開示する。特に、本発明は、眼科疾患を治療する方法であって、有効量の阻害薬β−アミロイド(Aβ)ペプチドを対象に投与することを含む方法を開示する。Aβ阻害薬は、加齢性黄斑変性症(滲出型「AMD」と萎縮型「AMD」の双方)、緑内障、糖尿病性網膜症(糖尿病性黄斑浮腫を含む)、脈絡膜新生血管膜(CNV)、ブドウ膜炎、近視性変性、眼腫瘍、網膜中心静脈閉塞症、ルベオーシス、眼新血管新生、中心性漿液性網膜症、ドライアイなどの眼表面円板、網膜中心動脈閉塞症、類嚢胞黄斑浮腫および他の網膜変性疾患などの眼科疾患に罹患している対象において投与することができる。一実施形態において、阻害薬は、抗体、アンチセンス分子、siRNA分子、リボザイム、または小分子化合物である。
一実施形態において、本発明は、加齢性黄斑変性症に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量のβ−アミロイド(Aβ)ペプチドの阻害薬を含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本発明の別の実施形態は、加齢性黄斑変性症(AMD)に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量のAβ阻害薬を含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
本発明の追加実施形態は、AMDに罹患している患者において回復を促進するための医薬品を調製するための治療有効量のAβ阻害薬の使用を提供する。この実施形態の一態様において、抗体は、エフェクター機能障害を有するFc領域を含む。この実施形態の他の態様において、疾患は、滲出型AMDと萎縮型AMDの双方を含むAMDである。
本発明は、Aβのアミロイド沈着を伴う疾患を治療または予防する方法であって、Aβペプチドまたは凝集形態のAβペプチドと特異的に結合する抗体を含む有効用量の医薬組成物を対象に投与することを含む方法も提供する。この実施形態の他の態様において、抗体は、天然に存在するFc領域からの変異のあるFc領域を含み、その変異は、エフェクター機能障害をもたらす。一部の実施形態において、抗体の投与は、変異のない抗体の投与よりも脳の微小出血を引き起こすことが少ない。
本発明の方法に使用される抗体およびポリペプチドは、Aβペプチドまたは凝集形態のAβペプチドと特異的に結合する。一実施形態において、抗体またはポリペプチドは、エフェクター機能障害を有する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、F(ab’)フラグメントではない。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Fabフラグメントではない。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、単鎖抗体scFvではない。
Aβペプチドまたは凝集形態のAβペプチドと特異的に結合し、エフェクター機能障害を有する重鎖定常領域を含むポリペプチドも、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかに使用することができる。一部の実施形態において、ポリペプチドは、表3または表8に示す抗体9TL、6Gまたはそれらの変異体に由来する配列(例えば、1個または複数のCDR)を含む。
一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、エフェクター機能障害を有する重鎖定常領域を含み、重鎖定常領域は、Fc領域を含む。一部の実施形態において、Fc領域におけるN−グリコシル化部位は、除去される。一部の実施形態において、Fc領域は、N−グリコシル化部位認識配列内の突然変異を含み、それによって、抗体またはポリペプチドのFc領域は、N−グリコシル化されない。一部の実施形態において、Fc領域は、ペグ化される。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドの重鎖定常領域は、以下の突然変異、すなわちA330P331からS330S331(野生型IgG2a配列に準拠したアミノ酸ナンバリング)を含有するヒト重鎖IgG2a定常領域である。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、以下の突然変異、すなわち、E233F234L235からP233V234A235を含むIgG4の定常領域を含む。
一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβペプチドの残基1〜16内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、AβペプチドのN末端と特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβペプチドの残基16〜28内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体は、アミノ酸25またはそれ以降から始まるエピトープなどの、AβペプチドのC末端側上のエピトープと特異的に結合する。抗体は、Aβペプチド1〜37、1〜38、1〜39、1〜40、1〜41、1〜42、1〜43のうちのいずれかと特異的に結合することができる。一部の実施形態において、抗体は、C末端切断型Aβペプチド、例えばAβ1〜37、1〜38、1〜39、1〜40、1〜41、1〜42、1〜43の遊離C末端アミノ酸と特異的に結合することができる。一実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜40ペプチド上のエピトープと特異的に結合する。この実施形態の他の態様において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜42ペプチド上のエピトープと特異的に結合する。この実施形態のさらに他の態様において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜43ペプチド上のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜40ペプチドの残基28〜40内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜42ペプチドの残基28〜42内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜43ペプチドの残基28〜43内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、完全長アミロイド前駆体タンパク質(APP)と結合することなくAβペプチドと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、可溶形態に結合することなく凝集形態のAβと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、凝集形態に結合することなく可溶形態のAβと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβの凝集形態と可溶形態の双方と特異的に結合する。
一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜40のC末端ペプチド33〜40と特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸35〜40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸36〜40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸39および/または40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜40と特異的に結合するが、Aβ1〜42および/またはAβ1〜43と特異的に結合しない。一部の実施形態において、抗体は、抗体9TLまたは本明細書に記載されている9TLに由来する抗体の可変領域を含む。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、抗体9TL、6Gおよび/または9TLまたは6Gに由来する抗体もしくはポリペプチドが、それぞれのAβペプチドに結合するのを競合的に阻害する。
一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、そのAβ1〜42およびAβ1〜43との結合よりも高い親和性でAβ1〜40と結合する。この実施形態の他の態様において、抗体は、抗体2294ではない。一部の実施形態において、抗体は、アミノ酸25〜34および40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと結合する。一部の実施形態において、抗体は、抗体6Gまたは本明細書に記載されている6Gに由来する抗体の可変領域を含む。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、抗体6Gおよび/または6Gに由来する抗体またはポリペプチドがAβペプチドに結合するのを競合的に阻害する。
一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、約100nM以下、または20nM以下、または2nM以下の結合親和性(K)でAβペプチドと結合する。この実施形態の一態様において、抗体またはポリペプチドは、約100nM以下、50nM以下、または2nM以下のKでAβ1〜40ペプチドと結合する。この実施形態の他の態様において、抗体またはポリペプチドは、約100nM以下、50nM以下、または2nM以下のKでAβ1〜42ペプチドとも結合する。
Aβペプチドと特異的に結合する抗体またはポリペプチドは、静脈内に、皮下に、吸入を介し、動脈内に、筋肉内に、心臓内に、室内に、非経口的に、髄腔内に、および腹腔内にを含む当技術分野で知られている任意の手段によって投与することができる。投与は、注射により、および/または全身的、例えば、静脈内に、または局所的であってよい。このことは、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドにも一般的に当てはまる。
本発明は、有効量の、Aβペプチドまたは凝集形態のAβペプチドと特異的に結合し、エフェクター機能障害を有する抗体またはポリペプチドのうちのいずれか、または抗体もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を投与することにより眼科疾患を治療する方法も提供する。
本発明は、有効量の、Aβペプチドまたは凝集形態のAβペプチドと特異的に結合する抗体もしくはポリペプチド、または抗体もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む組成物のうちのいずれか1個または複数を含むキットおよび組成物も提供する。これらのキットは、一般的に適当なパッケージング中にあって、適切な説明書が提供され、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかに有用である。
本発明は、ヒト対象の脳におけるAβペプチドのアミロイド沈着を伴う疾患を治療するための治療用ヒト化抗体を製造する方法であって、Aβペプチドと特異的に結合する第1のヒト化抗体を選択し、この抗体のFc領域を変異させて、第1のヒト化抗体と比べてエフェクター機能障害を有する治療用ヒト化抗体を提供することを含む方法も提供する。
本発明の別の実施形態は、対象において網膜機能を保護または回復するための方法であって、対象に、治療有効量のAβ阻害薬を含む医薬組成物を投与することを含む方法を対象とする。一実施形態において、阻害薬は、抗体、アンチセンス分子、siRNA分子、リボザイム、または小分子化合物である。
本発明の別の実施形態は、対象において視力を保存または回復するための方法であって、治療有効量のAβ阻害薬を投与することを含む方法を対象とする。
上記実施形態の一態様において、上記方法は、アルツハイマー病、ダウン症候群、または脳アミロイドアンギオパチーを治療されていない対象において使用される。
本発明の上述の方法には、抗体であるAβ阻害薬が含まれる。一態様において、本明細書に開示されている本発明は、Aβ1〜40ペプチド(表4に示す配列番号15)のC末端と結合する抗体に関する。したがって、一態様において、この方法は、ATCCアクセッション番号PTA−6124およびPTA−6125を有する発現ベクターによって製造される抗体9TL(同義的に「9TL」と呼ばれる)による治療を含む。9TLの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図1に示す。抗体9TLの相補性決定領域(CDR)(ChothiaおよびKabat CDRを含む)も図1に示す。当然のことながら、9TLの任意の部分または全領域への言及は、ATCCアクセッション番号PTA−6124およびPTA−6125を有する発現ベクターによって製造される配列、および/または図1に示す配列を包含する。
別の態様において、本発明は、表3に示すアミノ酸配列を持つ9TLの抗体変異体の投与を含む。
別の態様において、本発明は、抗体9TLまたは表3に示すその変異体のフラグメントまたは領域を含む抗体の投与を含む。一実施形態において、フラグメントは、抗体9TLの軽鎖である。別の実施形態において、フラグメントは、抗体9TLの重鎖である。さらに別の実施形態において、フラグメントは、抗体9TLの軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数の可変領域を含有する。さらに別の実施形態において、フラグメントは、図1に示す軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数の可変領域を含有する。さらに別の実施形態において、フラグメントは、抗体9TLの軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数のCDRを含有する。
別の態様において、本発明は、以下の、すなわち、a)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の1個または複数のCDR、b)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の重鎖由来のCDR H3、c)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の軽鎖由来のCDR L3、d)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の軽鎖由来の3個のCDR、e)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の重鎖由来の3個のCDR、f)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の軽鎖由来の3個のCDRおよび重鎖由来の3個のCDRのうちのいずれか1個または複数を含むポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)の投与を含む。本発明は、以下の、すなわち、a)抗体9TLまたは表3に示すその変異体に由来する1個または複数(1、2、3、4、5、または6個)のCDR、b)抗体9TLの重鎖由来のCDR H3に由来するCDR、および/またはc)抗体9TLの軽鎖由来のCDR L3に由来するCDRのうちのいずれか1個または複数を含むポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)の投与をさらに提供する。一部の実施形態において、CDRは、図1に示すCDRである。一部の実施形態において、抗体9TLまたは表3に示すその変異体に由来する1個または複数のCDRは、9TLまたはその変異体の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のCDRと、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%同一である。
別の態様において、本発明は、抗体6G(同義的に「6G」と呼ばれる)の投与を含む。6Gの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図8に示す。抗体6Gの相補性決定領域(CDR)(ChothiaおよびKabat CDRを含む)も図8に示す。
別の態様において、本発明は、表8に示すアミノ酸配列を持つ6Gの抗体変異体の投与を含む。
別の態様において、本発明は、抗体6Gまたは表8に示すその変異体のフラグメントまたは領域を含む抗体の投与を含む。一実施形態において、フラグメントは、抗体6Gの軽鎖である。別の実施形態において、フラグメントは、抗体6Gの重鎖である。さらに別の実施形態において、フラグメントは、抗体6Gの軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数の可変領域を含有する。さらに別の実施形態において、フラグメントは、図8に示す軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数の可変領域を含有する。さらに別の実施形態において、フラグメントは、抗体6Gの軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数のCDRを含有する。
別の態様において、本発明は、以下の、すなわち、a)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の1個または複数のCDR、b)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の重鎖由来のCDR H3、c)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の軽鎖由来のCDR L3、d)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の軽鎖由来の3個のCDR、e)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の重鎖由来の3個のCDR、f)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の軽鎖由来の3個のCDRおよび重鎖由来の3個のCDRのうちのいずれか1個または複数を含むポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)の投与を含む。本発明は、以下の、すなわち、a)抗体6Gまたは表8に示すその変異体に由来する1個または複数(1、2、3、4、5、または6個)のCDR、b)抗体6Gの重鎖由来のCDR H3に由来するCDR、および/またはc)抗体6Gの軽鎖由来のCDR L3に由来するCDRのうちのいずれか1個または複数を含むポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)の投与をさらに含む。一部の実施形態において、CDRは、図8に示すCDRである。一部の実施形態において、抗体6Gまたは表8に示すその変異体に由来する1個または複数のCDRは、6Gまたはその変異体の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のCDRと、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%同一である。
他の態様において、本発明は、配列番号26に示す抗体6G重鎖可変領域由来の3個のCDRを含む重鎖可変領域、および配列番号27に示す抗体6G軽鎖可変領域由来の3個のCDRを含む軽鎖可変領域を含む抗体の投与を含む。別の態様において、本発明は、配列番号28、配列番号29、および配列番号30に示す3個のCDRを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号31、配列番号32、および配列番号33に示す3個のCDRを含む軽鎖可変領域を含む抗体の投与を含む。さらに別の態様において、本発明は、配列番号26に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号27に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに別の態様において、本発明は、配列番号36に示す重鎖アミノ酸配列、および配列番号37に示す軽鎖アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、CDRは、Kabat CDRである。他の実施形態において、CDRは、Chothia CDRである。他の実施形態において、CDRは、Kabat CDRとChothia CDRの組合せである(「複合(combined)CDR」または「拡大(extended)CDR」とも呼ばれる)。換言すれば、2個以上のCDRを含有するいかなる所与の実施形態について、CDRは、Kabat、Chothia、および/または複合のうちのいずれであってもよい。
一部の実施形態において、ポリペプチド(抗体など)は、配列番号5に示すアミノ酸配列を含み、L1は、L、V、またはIであり、Y2は、YまたはWであり、S3は、S、T、またはGであり、L4は、L、R、A、V、S、T、Q、またはEであり、V6は、V、I、T、P、C、Q、S、N、またはFであり、Y7は、Y、H、F、W、S、I、VまたはAである。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、重鎖可変領域中のCDR3である。本明細書では便宜上、アミノ酸へのこの文脈または言及における「is」は、配列番号中の位置に関して所与の位置に関する1個または複数のアミノ酸の選択を指す。例えば、「L1は、L、V、またはIである(L1 is L、V、or I)」は、配列番号5中の1位におけるアミノ酸が、VまたはIで置換されていてもよいことを指す。
一部の実施形態において、ポリペプチド(抗体など)は、配列番号6に示すアミノ酸配列を含み、Y8は、Y、A、またはHであり、A11は、AまたはSであり、K12は、KまたはAである。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、軽鎖可変領域中のCDR1である。
一部の実施形態において、ポリペプチド(抗体など)は、配列番号8に示すアミノ酸配列を含み、L1は、L、M、N、C、F、V、K、S、Q、G、Sであり、G3は、G、S、またはTであり、T4は、TまたはSであり、H5は、HまたはLであり、Y6は、Y、P、A、W、Q、M、S、またはEであり、V8は、V、L、K、H、T、A、EまたはMであり、L9は、L、I、T、S、またはVである。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、軽鎖可変領域中のCDR3である。
一部の実施形態において、ポリペプチド(抗体など)は、(a)配列番号3に示すCDR1領域、(b)配列番号4に示すCDR2領域、および(c)配列番号5に示すCDR3領域を含む重鎖可変領域を含み、L1は、L、V、またはIであり、Y2は、YまたはWであり、S3は、S、T、またはGであり、L4は、L、R、A、V、S、T、Q、またはEであり、V6は、V、I、T、P、C、Q、S、N、またはFであり、Y7は、Y、H、F、W、S、I、V、またはAである。
一部の実施形態において、ポリペプチド(抗体など)は、(a)Y8が、Y、AまたはHであり、A11が、AまたはSであり、K12が、KまたはAである配列番号6に示すCDR1領域、(b)配列番号7に示すCDR2領域、および(c)L1が、L、M、N、C、F、V、K、S、Q、G、Sであり、G3が、G、S、またはTであり、T4が、TまたはSであり、H5が、HまたはLであり、Y6が、Y、P、A、W、Q、M、S、またはEであり、V8が、V、L、K、H、T、A、E、またはMであり、L9が、L、I、T、S、またはVである配列番号8に示すCDR3領域を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態において、本発明の抗体は、ヒト抗体である。他の実施形態において、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態において、抗体は、モノクローナルである。一部の実施形態において、抗体(またはポリペプチド)は、単離される。一部の実施形態において、抗体(またはポリペプチド)は、実質的に純粋である。
抗体の重鎖定常領域は、IgG、IgM、IgD、IgA、およびIgEなどの定常領域の任意のタイプ、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4などの任意のアイソタイプ由来であってよい。
一部の実施形態において、抗体は、免疫学的に不活性である(部分的に免疫学的に不活性が含まれ、用語「エフェクター機能障害を有する」と同義的に使用される)、例えば、補体媒介性溶解を誘発しない、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)を刺激しない、またはミクログリアを活性化しない定常領域などの改変された定常領域を含む。一部の実施形態において、定常領域は、Eur.J.Immunol.(1999)29:2613〜2624;PCT出願第PCT/GB99/01441号;および/または英国特許出願第9809951.8号に記載されているように改変される。他の実施形態において、抗体は、以下の突然変異、すなわち、A330P331からS330S331(野生型IgG2a配列に準拠したアミノ酸ナンバリング)を含むヒト重鎖IgG2a定常領域を含む。Eur.J.Immunol.(1999)29:2613〜2624。一部の実施形態において、抗体は、以下の突然変異、すなわち、E233F234L235からP233V234A235を含むIgG4の定常領域を含む。さらに他の実施形態において、定常領域は、N−結合型グリコシル化部についてアグリコシル化(aglycosylated)される。一部の実施形態において、定常領域は、定常領域中のN−グリコシル化部位認識配列の一部であるオリゴ糖付着残基(Asn297など)および/または隣接残基を突然変異させることによりN−結合型グリコシル化部についてアグリコシル化される。一部の実施形態において、定常領域は、N−結合型グリコシル化部についてアグリコシル化される。定常領域は、酵素的に、またはグリコシル化欠損宿主細胞における発現により、N−結合型グリコシル化部についてアグリコシル化されてもよい。
別の態様において、本発明は、抗体9TLもしくは6Gまたは表3および表8に示すそれらの変異体のフラグメントまたは領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド(単離されてもよい)を提供する。一実施形態において、フラグメントは、抗体9TLまたは6Gの軽鎖である。別の実施形態において、フラグメントは、抗体9TLまたは6Gの重鎖である。さらに別の実施形態において、フラグメントは、抗体9TLまたは6Gの軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数の可変領域を含有する。さらに別の実施形態において、フラグメントは、抗体9TLまたは6Gの軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数(1、2、3、4、5、または6個)の相補性決定領域(CDR)を含有する。
AMDのマウスモデルは、理論に束縛されることなく、脂質輸送調節不全およびアミロイド沈着が、加齢性黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症(黄斑浮腫を含む)および他の関連する網膜変性疾患で見られる観察された網膜変化の病因の一因となっているという仮説をテストする上で役立ってきた。Aβ沈着は、アルツハイマーで広く研究され、これまでの研究は、加齢性黄斑変性症(Yoshida,T.他、J.of Clin.Invest.、115(10):2793〜2800(2005);Anderson,D.他、Experimental Eye Research 78:243〜256(2004);Johnson,L.他、PNAS、99(18):11820〜11835(2002))および緑内障(McKinnon SJ、Front Biosci 8:1140〜56(2003);Tatton他、Surv Ophthalmol.48:S25〜37(2003))におけるAβの潜在的な役割を示した。しかしながら、Aβの阻害薬が、網膜の保護および/または回復を行うことにより黄斑変性症の治療において治療的有用性を提供することができるか否かに関してこれまでのところ論議されたことはない。さらに、Aβのアイソフォームのうちのどれが、差別的にAMDの病因の一因となるか否かに関して論議されたことはない。
上述のように、Aβは、アルツハイマー病で見出される神経突起プラークの主成分である。Aβは、βアミロイド前駆体タンパク質(βAPPまたはAPP)の切断産物である。APPは、大きな異所性N末端ドメイン、膜貫通ドメイン、および小さな細胞質内C末端尾部を含有するI型膜貫通糖タンパク質である。第21染色体上の単一APP遺伝子の転写産物の選択的スプライシングは、アミノ酸の数が異なるいくつかのアイソフォームをもたらす。アルツハイマー病におけるこれまでの研究は、Aβ1〜42アイソフォームが、アミロイド沈着に不可欠であり、Aβ1〜40ではなく、Aβ1〜42が、アルツハイマーの病因における開始分子である可能性があることを証明した(McGowan,E.他、Neuron 47:191〜199(2005))。さらに、アルツハイマー病における別の研究は、Aβ1〜40アイソフォームが、アミロイド沈着を実際に阻害すること、およびAβ1〜40の阻害薬が、アルツハイマー病の経過を悪化させることを示唆している(Kim,J.他、Neurobiology of Disease、27(3):627〜633(2007))。
本明細書に開示されている発明は、治療有効量の抗体9TL、もしくは6G、またはそれらに由来する抗体もしくはポリペプチドの投与により、個体における加齢性黄斑変性症(滲出型と萎縮型の双方)、緑内障、糖尿病性網膜症(糖尿病性黄斑浮腫を含む)、ブルッフ膜における裂傷、近視性変性、眼腫瘍および他の関連する網膜変性疾患などの眼科疾患を予防および/または治療するための方法を提供する。抗体9TLおよびその誘導体は、WO2006036291に記載されており、その開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれるものとする。開示方法において使用される抗体およびポリペプチドは、Aβ1〜40のC末端と結合する。抗体6Gおよびその誘導体は、WO2006036291およびWO2006118959に記載されており、それらの開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれるものとする。本発明の方法には、小分子化合物、ならびに抗体、アンチセンス分子、siRNA分子およびリボザイムなどの生物製剤を含むがこれらに限定されないAβのすべての阻害薬が含まれることが意図されている。
一般的技法
本発明の実施は、他に指示がない限り、当技術分野の技能の範囲内にある分子生物学(組み換え技法を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用いるであろう。そのような技法は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Sambrook他、1989)Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotides Synthesis(M.J.Gatt編、1984);Methods in Molecular Biology、Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編、1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney編、1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E.Roberts、1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths、およびD.G.Newell編、1993〜1998)J.Wiley and Sons;Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel他編、1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction、(Mullis他編、1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan他編、1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons、1999);Immunology(C.A.JanewayおよびP.Travers、1997);Antibodies(P.Finch、1997);Antibodies:a practical approach(D.Catty.編、IRL Press、1988〜1989);Monoclonal antibodies:a practical approach(P.ShepherdおよびC.Dean編、Oxford University Press、2000);Using antibodies:a laboratory manual(E.HarlowおよびD.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999);The Antibodies(M.ZanettiおよびJ.D.Capra編、Harwood Academic Publishers、1995)などの文献中に十分に説明されている。
定義
「Aβペプチドの阻害薬」は、Aβペプチドの産生および/または沈着を減少させることができる任意の薬剤である。Aβペプチドの阻害薬には、抗体、アンチセンス分子、siRNA分子、リボザイム、または小分子化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、Aβペプチドの阻害薬は、アミロイド前駆体タンパク質の生成物Aβペプチドへのタンパク質分解的切断を中断することができる任意の薬剤を含む、Aβペプチドと結合しAβプラーク沈着を減少させることができる任意の薬剤である。Aβペプチドの産生および沈着を阻害するための追加の標的には、例えば、β−セクレターゼ(BACE1またはメマプシン−2−とも呼ばれる)または最低限4つの個々のタンパク質、すなわち、プレセニリン、ニカストリン、前咽頭欠損(anterior pharynx−defective)1(APH−1)およびプレセニリンエンハンサー2(PEN−2)からなるγセクレターゼ複合体を阻害またはサイレンシングさせることができる小分子治療薬またはsiRNAが含まれるが、これらに限定されるものではない。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも1個の抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的と特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用するこの用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体ばかりでなく、それらのフラグメント(Fab、Fab’、F(ab’)、Fv)、単鎖(ScFv)、それらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のその他の改変された立体配置も包含する。抗体には、IgG、IgA、またはIgM(またはそれらのサブクラス)などの任意のクラスの抗体が含まれ、抗体は、任意の特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、様々なクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの5つの大きなクラス、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2にさらに分けられることがある。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は、よく知られている。
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在することがある可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象とする。さらに、通常は様々な決定基(エピトープ)を対象とする様々な抗体が含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基を対象とする。改変語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると見なされるべきではない。例えば、本発明に従って使用するべきモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein、1975、Nature、256:495によって初めて記載されたハイブリドーマ法によって製造することができ、または米国特許第4,816,567号に記載されているような組み換えDNA法によって製造することができる。モノクローナル抗体は、例えば、McCafferty他、1990、Nature、348:552〜554に記載されている技法を用いて作製されるファージライブラリーから単離することもできる。
本明細書で使用する「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含有する特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(抗体のFv、Fab、Fab’、F(ab’)または他の抗原結合性部分配列など)である非ヒト(例えば、マウス)抗体の形態を指す。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト動物種(ドナー抗体)のCDR由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。一部の場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも移入されたCDRおよびフレームワーク配列中にも見出されない残基を含むことがあるが、抗体性能をさらに精緻化および最適化することが含まれる。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのCDR領域が、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応しており、すべてまたは実質的にすべてのFR領域が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である少なくとも1個の、通常は2個の可変ドメインの実質的にすべてを含むであろう。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部、通常はヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含むことが好ましい。抗体は、WO99/58572に記載されているように改変されているFc領域を有することがある。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更され、元の抗体由来の1個または複数のCDR「に由来する」1個または複数のCDRとも呼ばれる1個または複数のCDR(1、2、3、4、5、6個)を有する。
本明細書で使用する「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するある抗体を意味し、および/または当技術分野において知られているまたは本明細書に開示されているヒト抗体を製造するための技法のうちのいずれかを用いて製造された。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも1個のヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも1個のヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。そのような一例は、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において知られている様々な技法を用いて製造することができる。一実施形態において、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、そのファージライブラリーは、ヒト抗体を発現する(Vaughan他、1996、Nature Biotechnology、14:309〜314;Sheets他、1998、PNAS、(USA)95:6157〜6162;HoogenboomおよびWinter、1991、J.Mol.Biol.、227:381;Marks他、1991、J.Mol.Biol.、222:581)。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによっても製造することができる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、および第5,661,016号に記載されている。代替方法として、ヒト抗体は、標的抗原を対象とする抗体を産生するヒトBリンパ球(そのようなBリンパ球は、個体から回収することができ、またはin vitroで免疫化することができる)を不死化することによって調製することができる。例えば、Cole他、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss、p.77(1985);Boerner他、1991、J.Immunol.、147(1):86〜95;および米国特許第5,750,373号を参照されたい。
本明細書で使用する用語「9TL」および「抗体9TL」は、同義的に使用され、ATCC PTA−6124およびATCC PTA−6125の寄託番号を有する発現ベクターによって産生される抗体を指す。重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図1に示す。抗体9TLのCDR部分(ChothiaおよびKabat CDRを含む)を図1に図式的に示す。重鎖および軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを、配列番号9および配列番号10に示す。9TLの特徴付けは、実施例に記載される。
本明細書で使用する用語「6G」および「抗体6G」は、同義的に使用され、配列番号36に示す重鎖アミノ酸配列および配列番号37に示す軽鎖アミノ酸配列を有する抗体を指す。重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図8に示す。抗体6GのCDR部分(ChothiaおよびKabat CDRを含む)を図8に図式的に示す。重鎖および軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを、配列番号38および配列番号39に示す。6Gの特徴付けは、実施例に記載される。
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において道義的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖または分岐であってよく、改変アミノ酸を含むことがあり、非アミノ酸によって中断されていることがある。この用語は、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合などのその他の操作もしくは改変により改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の1個または複数の類似体(例えば、非天然アミノ酸などを含む)を含有するポリペプチド、ならびに当技術分野において知られている他の改変形態もこの定義内に含まれる。当然のことながら、本発明のポリペプチドは、抗体をベースとしているため、ポリペプチドは、一本鎖または会合した鎖として存在することがある。
本明細書において同義的に使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドまたは塩基、および/またはそれらの類似体、またはDNAまたはRNAポリメラーゼによってポリマー中に組み入れることができる任意の基質であってよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの改変ヌクレオチドを含むことがある。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーの組立の前後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることがある。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などにより、重合後にさらに改変されることがある。改変の他のタイプには、例えば、「キャプス(caps)」、類似体による天然に存在するヌクレオシドの置換、例えば、非荷電性連結(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)および荷電性連結(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)による改変などのヌクレオチド間改変、例えば、タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リシンなど)などのペンダント部分を含有する改変、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラーレンなど)による改変、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など)を含有する改変、アルキル化剤を含有する改変、改変連結(例えば、αアノマーの核酸など)による改変、ならびに1種または複数のポリヌクレオチドの非改変形態が含まれる。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換える、標準的な保護基によって保護する、または活性化して追加のヌクレオチドに対する追加の連結を調製する、または固体支持体に結合させることができる。5’および3’末端OHは、リン酸化するか、またはアミンもしくは1〜20個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルも、標準的な保護基に誘導体化することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、2’−O−メチル、2’−O−アリル、2’−フルオロ−、または2’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマーの糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマーの糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含む当技術分野において一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含有することもできる。1個または複数のホスホジエステル連結部を、代替連結基によって置き換えることができる。これらの代替連結基には、ホスフェートが、P(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、「(O)NR(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、COまたはCH(「フォルムアセタール」)によって置き換えられ、各RまたはR’が、独立して、Hまたは場合によりエーテル(−O−)連結部を含有する置換もしくは非置換アルキル(1〜20C)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル(araldyl)である実施形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。ポリヌクレオチドにおけるすべての連結部が同一である必要はない。前記の説明は、RNAおよびDNAを含む本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
抗体の「可変領域」は、単独で、または合わせて、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域は、各々、超可変領域としても知られている3個の相補性決定領域(CDR)によって連結される4個のフレームワーク領域(FR)からなる。各鎖におけるCDRは、FRによって近接近につなぎ合わされており、他の鎖由来のCDRと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。CDRを決定するための少なくとも2つの技法、すなわち、(1)交差種間配列変動性に基づくアプローチ(すなわち、Kabat他 Sequences of Proteins of Immunological Interest、(第5版、1991、National Institutes of Health、Bethesda MD)、および(2)抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ(Al−lazikani他(1997)J.Molec.Biol.273:927〜948)が存在する。本明細書で使用するCDRは、どちらかのアプローチまたは両アプローチの組合せによって定義されるCDRを指すことがある。
抗体の「定常領域」は、単独で、または合わせて、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
抗体またはポリペプチドと「優先的に結合する」または「特異的に結合する」(本明細書では同義的に使用される)エピトープは、当技術分野においてよく理解されている用語であり、そのような特異的または優先的結合を決定する方法も、当技術分野においてよく知られている。ある分子は、その分子が、代わりの細胞または物質と反応または会合するのに比べてより高い頻度で、より速く、より長時間および/またはより高い親和性で特定の細胞または物質と反応または会合する場合に、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。ある抗体は、それが他の物質と結合するのに比べてより高い親和性、結合力で、より容易に、および/またはより長時間結合する場合に、ある標的に「特異的に結合」しまたは「優先的に結合」する。例えば、Aβ1〜40エピトープと特異的または優先的に結合する抗体は、その抗体が他のAβ1〜40エピトープまたは非Aβ1〜40エピトープと結合するのに比べてより高い親和性、結合力で、より容易に、および/またはより長時間このエピトープと結合する抗体である。この定義を読むことによっても、当然のことながら、例えば、第1の標的と特異的または優先的に結合する抗体(または部分もしくはエピトープ)は、第2の標的と特異的または優先的に結合しても結合しなくてもよい。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも(それも含まれてよいが)排他的な結合を必要としない。一般的に、結合への言及は、優先的結合を意味するが、必ずしもそうではない。
本明細書で使用する「実質的に純粋な」は、少なくとも50%純粋(すなわち、混入物を含まない)、より好ましくは少なくとも90%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、より好ましくは少なくとも98%純粋、より好ましくは少なくとも99%純粋である材料を指す。
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物を組み入れるための1種または複数のベクターのレシピエントとなり得るか、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれ、その子孫は、自然突然変異、偶発的突然変異、または意図的突然変異によって元の親細胞と必ずしも完全に同一(形態学的に、またはゲノムDNA相補体として)でなくてもよい。宿主細胞には、本発明の1種または複数のポリヌクレオチドをin vivoで形質移入した細胞が含まれる。
用語「Fc領域」は、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するのに使用される。「Fc領域」は、天然配列Fc領域または変異体Fc領域であってよい。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は、変わることがあるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Cys226位のアミノ酸残基、またはPro230から、そのカルボキシル末端に及ぶと定義される。Fc領域における残基のナンバリングは、KabatにおけるようなEUインデックスのナンバリングである。Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.、1991。一般的に、免疫グロブリンのFc領域は、2個の定常ドメイン、CH2およびCH3を含む。
本明細書で使用する「Fc受容体」および「FcR」は、抗体のFc領域と結合する受容体について記載する。好ましいFcRは、天然配列ヒトFcRである。さらに、好ましいFcRは、IgG抗体と結合するFcR(γ受容体)であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択スプライシングされた形態が含まれる。FcγRII受容体には、FcγRIIA(「活性化受容体」)およびFcγRIIB(「阻害性受容体」)が含まれ、これらは、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。FcRについては、RavetchおよびKinet、1991、Ann.Rev.Immunol.、9:457〜92;Capel他、1994、Immunomethods、4:25〜34;およびde Haas他、1995、J.Lab.Clin.Med.、126:330〜41に概説されている。「FcR」には、母体IgGの胎児への移動を担っている新生児受容体FcRnも含まれる(Guyer他、1976、J.Immunol.、117:587;およびKim他、1994、J.Immunol.、24:249)。
「補体依存性細胞障害」および「CDC」は、補体の存在下で標的を溶解することを指す。補体活性化経路は、補体系の第1成分(C1q)が、同種抗原と複合体を形成した分子(例えば、抗体)と結合することによって開始される。補体活性化を評価するため、CDCアッセイを、例えば、Gazzano−Santoro他、J.Immunol.Methods、202:163(1996)に記載されているように行うことができる。
「機能的Fc領域」は、天然配列Fc領域の少なくとも1つのエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」には、C1q結合、補体依存性細胞障害(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)、食作用、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体;BCR)のダウンレギュレーションが含まれる。一般的に、そのようなエフェクター機能は、結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わせられるFc領域を必要とし、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野において知られている様々なアッセイを用いて評価することができる。
「天然配列Fc領域」は、天然に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体Fc領域」は、少なくとも1個のアミノ酸改変によって天然配列Fc領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むが、天然配列Fc領域の少なくとも1つのエフェクター機能を保持する。変異体Fc領域は、天然配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域に比べて少なくとも1個のアミノ酸置換、例えば、天然配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域における約1〜約10個のアミノ酸置換、好ましくは約1〜約5個のアミノ酸置換を有することが好ましい。本明細書における変異体Fc領域は、天然配列Fc領域および/または親ポリペプチドのFc領域と少なくとも約80%の配列同一性、最も好ましくはそれらとの少なくとも約90%の配列同一性、より好ましくはそれらとの少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%の配列同一性を有することが好ましいであろう。
本明細書で使用する「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」および「ADCC」は、Fc受容体(FcR)を発現する非特異的細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。関心のある分子のADCC活性は、米国特許第5,500,362号または第5,821,337号に記載されているアッセイなどのin vitroADCCアッセイを用いて評価することができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびNK細胞が含まれる。代替方法として、またはさらに、関心のある分子のADCC活性は、例えば、Clynes他、1998、PNAS(USA)、95:652〜656に開示されているモデルなどの動物モデルにおいて、in vivoで評価することができる。
本明細書で使用する「有効用量の」または「有効量の」薬物、化合物、または医薬組成物は、有益な、または望ましい結果を得るのに十分な量である。予防的使用の場合、有益な、または望ましい結果には、疾患の生化学的、組織学的および/または行動的症状、疾患の発生中に現れる疾患の合併症および中間的な病理学的表現型を含む疾患の危険性を排除または低減すること、疾患の重症度を軽減すること、または疾患の発症を遅らせることなどの結果が含まれる。治療的使用の場合、有益な、または望ましい結果には、網膜機能の保護もしくは回復または視力の保存または回復などの臨床結果が含まれるが、これらに限定されるものではない。有効用量は、1回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的にとって、有効用量の薬物、化合物、または医薬組成物は、直接的か間接的のどちらかで予防的または治療的な治療を行うのに十分な量である。臨床的文脈において理解されるように、有効用量の薬物、化合物、または医薬組成物は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて得られても得られなくてもよい。したがって、「有効用量」は、1種または複数の治療剤を投与するという文脈において考慮されることがあり、単一の薬剤は、1種または複数の他の薬剤と併せて、望ましい結果が得られることがあるか、または得られる場合に、有効量で与えられたと見なすことができる。
本明細書で使用する「治療」または「治療すること」は、臨床結果を含む有益な、または望ましい結果を得るためのアプローチである。本発明の目的にとって、有益な、または望ましい結果には、網膜機能を回復すること、予防することまたは保護することが含まれるが、これらに限定されるものではない。
「Aβペプチドの生物学的効果」または「Aβ生物学的活性」は、直接的または間接的であってよい眼科疾患におけるAβの影響を意味し、理論に束縛されることなく、脂質輸送調節不全におけるAβの関与が含まれる。間接的影響には、網膜機能および視力に対する影響を有するAβが含まれるが、これに限定されるものではない。
本明細書で使用する眼科疾患の進行を「遅らせること」は、疾患の発生を猶予、妨害、減速、遅延、安定化、および/または延期することを意味する。この遅延は、治療されている疾患および/または個体の病歴に応じて、様々な長さの時間の遅延であってよい。当業者には明らかなように、十分な、または有意な遅延は、実際に、個体が疾患を発生しないという点で、予防を包含する。眼科疾患の発生を「遅らせる」方法は、その方法を使用しないことに比較した場合に、所与の時間枠で疾患発生の確率を軽減し、および/または所与の時間枠で疾患の程度を軽減する方法である。そのような比較は、通常、統計的に有意な数の対象を用いる臨床試験に基づいている。
眼科疾患の「発生」は、個体内の眼科疾患の発症および/または進行を意味する。眼科疾患の発生は、本明細書に記載されているような標準的臨床技法を用いて検出可能である。しかしながら、発生は、初期に検出不可能なことがある疾患進行も指す。本発明の目的にとって、進行は、この場合には、標準的眼科検査により、またはより特殊化した試験によって決定されるように、疾患状態の生物学的過程を指す。様々な診断テストには、視野、視力、フルオレセイン血管造影、網膜電図、光コヒーレンストモグラフィー(OCT)、視覚誘発電位(VEP)、インドシアニングリーン、色覚、アムスラーグリッド、眼内圧および当業者に知られている他の診断ツールが含まれるが、これらに限定されるものではない。AMDの診断テストには、とりわけ、視力、眼底鏡検査、フルオレセイン血管造影、インドシアニングリーン、および光コヒーレンストモグラフィー(OCT)が含まれるが、これらに限定されるものではない。「発生」には、出現、再発および発症が含まれる。本明細書で使用する眼科疾患の「発症」または「出現」には、初期の発症および/または再発が含まれる。
本明細書で使用する網膜機能を「保護すること」または網膜機能の「保護」は、網膜機能を安定化または保存することを指す。本明細書で使用する網膜機能の「回復」は、事前の損傷後の網膜機能の回復を指す。網膜機能の保護または回復は、とりわけ視力、網膜電図、視野、眼底検査、フルオレセイン血管造影、インドシアニングリーン、および光コヒーレンストモグラフィー(OCT)などの上述の眼科診断ツールのいずれかによって測定されるように、統計的に有意な結果(すなわち、p<0.05)について測定することにより決定することができる。例えば、下の実施例4に示すように、網膜機能の統計的に有意な保護または回復は、網膜電図におけるb波振幅の回復によって示された(p=0.008)。
視力の「保存」または「回復」は、標準的視力表ならびに当技術分野においてよく知られている様々な眼科診断ツールによって測定することができる。
本明細書で使用する「併せた」投与には、同時投与および/または異なった時点での投与が含まれる。併せた投与は、同時処方としての投与または別々の組成物としての投与も包含する。本明細書で使用する併せた投与は、抗Aβ抗体および別の薬剤が個体に投与される任意の環境を包含するように意図されており、同時に、および/または別々に起きることがある。本明細書でさらに議論するように、当然のことながら、抗Aβ抗体および他の薬剤は、様々な投与頻度または間隔で投与することができる。例えば、抗Aβ抗体は、毎週投与することができ、一方、他の薬剤は、より低い頻度で投与することができる。当然のことながら、抗Aβ抗体および他の薬剤は、同じ投与経路または異なる投与経路を用いて投与することができる。
「生物試料」は、個体から得られる様々な試料タイプを包含し、診断アッセイまたはモニタリングアッセイで使用することができる。この定義は、生物起源の血液および他の液体試料、生検標本またはそれに由来する組織培養液もしくは細胞などの固体組織試料、およびそれらの子孫を包含する。この定義には、それらの入手後に、タンパク質もしくはポリヌクレオチドなどの特定の成分についての試薬による処理、可溶化、もしくは富化、または切片化目的の半固体もしくは固体マトリクスへの包埋などの任意の方法で操作された試料も含まれる。用語「生物試料」は、臨床試料を包含し、培養液中の細胞、細胞上清、細胞ライセート、血清、血漿、体液、および組織試料も含まれる。
「個体」(あるいは、「対象」と呼ばれる)は、哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類には、家畜(ウシなど)、スポーツ動物、ペット(ネコ、イヌ、ウマなど)、霊長類、マウスおよびラットが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する「ベクター」は、宿主細胞において、関心のある1個または複数の遺伝子または配列を送達する、好ましくは発現することができる構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合しているDNAまたはRNA発現ベクター、リポソームに封止されているDNAまたはRNA発現ベクター、およびプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する「発現制御配列」は、核酸の転写を誘導する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的プロモーターもしくは誘導プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであってよい。発現制御配列は、転写される核酸配列と動作可能に連結される。
本明細書で使用する「薬学的に許容できる担体」には、活性成分と混ぜ合わせた場合に、成分の生物学的活性を保たせ、対象の免疫系と非反応性である任意の材料が含まれる。例には、リン酸緩衝食塩溶液、水、油/水エマルジョンなどの乳剤、および様々なタイプの湿潤剤などの標準的な医薬品担体のいずれかが含まれるが、これらに限定されるものではない。エアロゾルまたは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液または普通の(0.9%)食塩水である。そのような担体を含む組成物は、よく知られている従来の方法により製剤化される(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、A.Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1990;およびRemington、The Science and Practice of Pharmacy第20版、Mack Publishing、2000を参照)。
本明細書で使用する用語「kon」は、抗体の抗原との会合に関するオン速度定数を指すことが意図されている。
本明細書で使用する用語「koff」は、抗体/抗原複合体からの抗体の解離に関するオフ速度定数を指すことが意図されている。
本明細書で使用する用語「K」は、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すことが意図されている。
組成物および組成物を製造する方法
抗Aβ抗体およびポリペプチド:
I.抗体9TLならびに9TL由来の抗体およびポリペプチド
本発明は、抗体9TLおよび表3に示すその変異体または抗体9TLに由来するポリペプチドおよび表3に示すその変異体、ならびに9TL抗体およびその変異体またはポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を含む組成物を包含する。本明細書で使用する組成物は、Aβ1〜40のC末端と結合する1個または複数の抗体またはポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)および/またはAβ1〜40のC末端と結合する1個または複数の抗体またはポリペプチドをコードする配列を含む1個または複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野でよく知られている、緩衝液を含む薬学的に許容できる賦形剤などの適当な賦形剤をさらに含むことができる。
本発明の抗体およびポリペプチドは、以下の特徴、すなわち、(a)Aβ1〜40のC末端ペプチド28〜40と結合するが、Aβ1〜42またはAβ1〜43と有意に結合しない、(b)Aβ1〜40のC末端ペプチド33〜40と結合する、(c)対象におけるアミロイドプラークの形成を抑制する、(d)対象の眼におけるアミロイドプラークを低減する、(e)加齢性黄斑変性症(萎縮型と滲出型の双方)、緑内障、糖尿病性網膜症(黄斑浮腫を含む)および他の関連する網膜変性疾患を含むがこれらに限定されない眼科疾患の1個または複数の症状を治療、予防、軽減する、(f)網膜機能の有意な保護または回復を引き起こす、および(g)視力の有意な保存または回復を引き起こすうちのいずれか(1個または複数)を特徴とする。
本発明の抗体およびポリペプチドは、他の報告された抗Aβ抗体と対照的に、望ましい安全性プロファイルも示すことがある。
したがって、本発明は、以下のうちのいずれか、または以下の、すなわち、(a)抗体9TLまたは表3に示すその変異体、(b)抗体9TLまたは表3に示すその変異体のフラグメントもしくは領域、(c)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の軽鎖、(d)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の重鎖、(e)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数の可変領域、(f)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の1個または複数のCDR(1、2、3、4、5または6個のCDR)、(g)抗体9TLの重鎖由来のCDR H3、(h)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の軽鎖由来のCDR L3、(i)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の軽鎖由来の3個のCDR、(j)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の重鎖由来の3個のCDR、(k)抗体9TLまたは表3に示すその変異体の軽鎖由来の3個のCDRおよび重鎖由来の3個のCDR、および(l)(b)から(k)までのいずれか1個を含む抗体のうちのいずれかを含む組成物(医薬組成物を含む)を提供する。本発明は、上記のいずれか1個または複数を含むポリペプチドも提供する。
抗体9TLのCDR部分(ChothiaおよびKabat CDRを含む)を図1に図式的に示す。CDR領域の決定は、当技術分野の技能の十分に範囲内である。当然のことながら、一部の実施形態において、CDRは、Kabat CDRとChothia CDRの組合せ(「複合CDR」または「拡大CDR」とも呼ばれる)であってよい。一部の実施形態において、CDRは、Kabat CDRである。他の実施形態において、CDRは、Chotia CDRである。換言すれば、2個以上のCDRの実施形態において、CDRは、Kabat、Chothia、組合せCDR、またはそれらの組合せのうちのいずれであってもよい。
一部の実施形態において、本発明は、9TLまたは表3に示すその変異体の少なくとも1個のCDR、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または6個すべてのCDRと実質的に同一である少なくとも1個のCDR、少なくとも2個、少なくとも3個、または少なくとも4個、少なくとも5個、または6個すべてのCDRを含むポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)を提供する。他の実施形態には、9TLまたは9TLに由来する少なくとも2、3、4、5または6個のCDRと実質的に同一である少なくとも2、3、4、5、または6個のCDRを有する抗体が含まれる。一部の実施形態において、少なくとも1、2、3、4、5、または6個のCDRは、9TLまたは表3に示すその変異体の少なくとも1、2、3、4、5または6個のCDRと、少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。当然のことながら、本発明の目的のために、結合特異性および/または全体的活性は、一般的に保持されるが、活性の程度は、9TLまたは表3に示すその変異体に比較して異なることがある(高めまたは低めであってよい)。
本発明は、以下の、すなわち、9TLまたは表3に示すその変異体の配列の少なくとも5個の隣接するアミノ酸、少なくとも8個の隣接するアミノ酸、少なくとも約10個の隣接するアミノ酸、少なくとも約15個の隣接するアミノ酸、少なくとも約20個の隣接するアミノ酸、少なくとも約25個の隣接するアミノ酸、少なくとも約30個の隣接するアミノ酸のうちのいずれかを有する9TLまたは表3に示すその変異体のアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうちの少なくとも3個は、9TL(図1)または表3に示すその変異体の可変領域由来であるポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)も提供する。一実施形態において、可変領域は、9TLの軽鎖由来である。別の実施形態において、可変領域は、9TLの重鎖由来である。例示的ポリペプチドは、9TLの重鎖可変領域と軽鎖可変領域の双方由来の隣接するアミノ酸(上記に記載されている長さ)を有する。別の実施形態において、5個(またはそれ以上)の隣接するアミノ酸は、図1に示す9TLの補体性決定領域(CDR)由来である。一部の実施形態において、隣接するアミノ酸は、9TLの可変領域由来である。
II.抗体6Gならびに6G由来の抗体およびポリペプチド
本発明は、Aβ1〜40、Aβ1〜42、およびAβ1〜43と結合する抗体またはポリペプチドを投与することを含む眼科疾患を治療する方法をさらに提供する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜42、およびAβ1〜43との結合よりも高い親和性でAβ1〜40と結合する。一部の実施形態において、抗体は、Aβ1〜36、Aβ1〜37、Aβ1〜38、およびAβ1〜39と結合する。一部の実施形態において、抗体は、Aβ22〜35と結合する。一部の実施形態において、抗体は、Aβ28〜40と結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸25〜34および40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと結合する。
本発明は、本明細書に記載されている抗体もしくはポリペプチドのうちのいずれか(抗体6Gおよび表8に示すその変異体または抗体6Gおよび表8に示すその変異体に由来するポリペプチド)、または本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む眼科疾患を治療する方法も提供する。本明細書で使用する組成物は、Aβ1〜40のC末端と結合する1個または複数の抗体またはポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)および/またはAβ1〜40のC末端と結合する1個または複数の抗体またはポリペプチドをコードする配列を含む1個または複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野でよく知られている、緩衝液を含む薬学的に許容できる賦形剤などの適当な賦形剤をさらに含むことができる。
本発明の抗体およびポリペプチドは、以下の特徴、すなわち、(a)Aβ1〜40、Aβ1〜42、およびAβ1〜43と結合する、(b)Aβ1〜42およびAβ1〜43よりもAβ1〜40と、より高い親和性結合でAβ1〜40、Aβ1〜42、およびAβ1〜43と結合する、(c)アミノ酸25〜34および40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと結合する、(d)Aβ1〜40との結合と比較して、より低い親和性だがAβ1〜36、Aβ1〜37、Aβ1〜38およびAβ1〜39と結合する、(e)約1μM未満のKでAβ22〜37と結合する、(f)Aβ22〜35と結合する、(g)Aβ28〜40と結合する、(h)細胞中で発現されるAPPと結合しない、(i)対象の眼におけるアミロイドプラークを低減する、(j)加齢性黄斑変性症(萎縮型と滲出型の双方)、緑内障、糖尿病性網膜症(黄斑浮腫を含む)および他の関連する網膜変性疾患を含むがこれらに限定されない眼科疾患の1個または複数の症状を治療、予防、軽減する、(k)網膜機能の有意な保護または回復を引き起こす、および(l)視力の有意な保存または回復を引き起こすうちのいずれか(1個または複数)を特徴とする。本発明の抗体およびポリペプチドは、本明細書に記載されているエフェクター機能障害も有することもある。エフェクター機能障害を有する抗体およびポリペプチドは、他の報告された抗Aβ抗体と対照的に、望ましい安全性プロファイルも示すことがある。例えば、本発明の組成物は、有意な、または許容できないレベルの、脳脈管系における出血(脳出血)、髄膜脳炎(磁気共鳴スキャンの変化を含む)、脳脊髄液における白血球数の上昇、中枢神経系の炎症のうちのいずれか1個または複数を引き起こさないことがある。
したがって、本発明は、以下のうちのいずれか、または以下の、すなわち、(a)抗体6Gまたは表8に示すその変異体、b)抗体6Gまたは表8に示すその変異体のフラグメントまたは領域、c)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の軽鎖、d)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の重鎖、e)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数の可変領域、f)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の1個または複数のCDR(1、2、3、4、5または6個のCDR)、(g)抗体6Gの重鎖由来のCDR H3、(h)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の軽鎖由来のCDR L3、(i)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の軽鎖由来の3個のCDR、(j)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の重鎖由来の3個のCDR、(k)抗体6Gまたは表8に示すその変異体の軽鎖由来の3個のCDRおよび重鎖由来の3個のCDR、および(l)(b)から(k)までのうちのいずれか1個を含む抗体のうちのいずれかを含む組成物(医薬組成物を含む)を提供する。本発明は、上記のうちのいずれか1個または複数を含むポリペプチドも提供する。
抗体6GのCDR部分(ChothiaおよびKabat CDRを含む)を図8に図式的に示す。CDR領域の決定は、当技術分野の技能の十分に範囲内である。
一部の実施形態において、本発明は、6Gまたは表8に示すその変異体の少なくとも1個のCDR、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または6個すべてのCDRと実質的に同一である少なくとも1個のCDR、少なくとも2個、少なくとも3個、または少なくとも4個、少なくとも5個、または6個すべてのCDRを含むポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)を提供する。他の実施形態には、6Gまたは6G由来の少なくとも2、3、4、5または6個のCDRと実質的に同一である少なくとも2、3、4、5、または6個のCDRを有する抗体が含まれる。一部の実施形態において、少なくとも1、2、3、4、5、または6個のCDRは、抗体6Gまたは表8に示すその変異体の少なくとも1、2、3、4、5または6個のCDRと、少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。当然のことながら、本発明の目的のために、結合特異性および/または全体的活性は、一般的に保持されるが、活性の程度は、6Gまたは表8に示すその変異体に比較して異なることがある(高めまたは低めであってよい)。
本発明は、以下の、すなわち、6Gまたは表8に示すその変異体の配列の少なくとも5個の隣接するアミノ酸、少なくとも8個の隣接するアミノ酸、少なくとも約10個の隣接するアミノ酸、少なくとも約15個の隣接するアミノ酸、少なくとも約20個の隣接するアミノ酸、少なくとも約25個の隣接するアミノ酸、少なくとも約30個の隣接するアミノ酸のうちのいずれかを有する6Gまたは表8に示すその変異体のアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうちの少なくとも3個は、6G(図)または表8に示すその変異体の可変領域由来であるポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)も提供する。一実施形態において、可変領域は、6Gの軽鎖由来である。別の実施形態において、可変領域は、6Gの重鎖由来である。例示的ポリペプチドは、6Gの重鎖可変領域と軽鎖可変領域の双方由来の隣接するアミノ酸(上記に記載されている長さ)を有する。別の実施形態において、5個(またはそれ以上)の隣接するアミノ酸は、図8に示す6Gの補体性決定領域(CDR)由来である。一部の実施形態において、隣接するアミノ酸は、6Gの可変領域由来である。
本発明の抗体およびポリペプチドの結合親和性は、以下に記載されている例示的実施形態のように、異なることがあり、特定の値または範囲である必要はない(しかし、特定の値または範囲であってもよい)。Aβペプチド(Aβ1〜40、Aβ1〜42またはAβ1〜43ペプチドを含む)に対する本発明の抗体およびポリペプチドの結合親和性(K)は、約0.10〜約0.80nM、約0.15〜約0.75nMおよび約0.18〜約0.72nMであってよい。一部の実施形態において、結合親和性は、約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、約40pM、または約40pM超である。一実施形態において、結合親和性は、約2pM〜22pMである。他の実施形態において、結合親和性は、約10nM未満、約5nM、約1nM、約900pM、約800pM、約700pM、約600pM、約500pM、約400pM、約300pM、約200pM、約150pM、約100pM、約90pM、約80pM、約70pM、約60pM、約50pM、約40pM、約30pM、約10pMである。一部の実施形態において、結合親和性は、約10nMである。他の実施形態において、結合親和性は、約10nM未満、約50nM未満、約100nM未満、約150nM未満、約200nM未満、約250nM未満、約500nM未満、または約1000nM未満である。他の実施形態において、結合親和性は、約5nM未満である。他の実施形態において、結合親和性は、約1nM未満である。他の実施形態において、結合親和性は、約0.1nMまたは約0.07nMである。他の実施形態において、結合親和性は、約0.1nM未満または約0.07nM未満である。他の実施形態において、結合親和性は、約10nM、約5nM、約1nM、約900pM、約800pM、約700pM、約600pM、約500pM、約400pM、約300pM、約200pM、約150pM、約100pM、約90pM、約80pM、約70pM、約60pM、約50pM、約40pM、約30pM、約10pMのうちのいずれかから約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、または約40pMのうちのいずれかまでである。一部の実施形態において、結合親和性は、約10nM、約5nM、約1nM、約900pM、約800pM、約700pM、約600pM、約500pM、約400pM、約300pM、約200pM、約150pM、約100pM、約90pM、約80pM、約70pM、約60pM、約50pM、約40pM、約30pM、約10pMのうちのいずれかである。さらに他の実施形態において、結合親和性は、約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、約40pM、または約40pM超である。本発明の抗体およびポリペプチドは、Aβ1〜40、Aβ1〜42および/またはAβ1〜43ペプチドの組合せと結合することができる。一実施形態において、抗体およびポリペプチドは、少なくともAβ1〜40およびAβ1〜42ペプチドと結合する。
本発明の抗体およびポリペプチドは、Aβ1〜36、Aβ1〜37、Aβ1〜38、Aβ1〜39、Aβ1〜42およびAβ1〜43のうちのいずれか1個または複数とも結合することができるが、一部の実施形態において、これらのペプチドのうちのいずれか1個または複数に対する結合親和性は、Aβ1〜40に対するそれらの結合親和性未満である。一部の実施形態において、Aβ1〜36、Aβ1〜37、Aβ1〜38、Aβ1〜39、Aβ1〜42およびAβ1〜43のうちのいずれか1個または複数に対する抗体またはポリペプチドのKは、Aβ1〜40に対するKの少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約80倍、少なくとも約100倍、少なくとも約150倍、少なくとも約200倍、または少なくとも約250倍である。
本発明は、これらの抗体またはポリペプチドのうちのいずれかを製造する方法も提供する。本発明の抗体は、当技術分野において知られている手順によって製造することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解または他の分解により、上記に記載されているような組み換え法(すなわち、単一または融合ポリペプチド)により、または化学合成により製造することができる。抗体のポリペプチド、特に約50アミノ酸までの短めのポリペプチドは、化学合成によって好都合に製造される。化学合成の方法は、当技術分野において知られており、市販されている。例えば、抗体は、固相法を用いる自動ポリペプチド合成装置によって製造することができるであろう。米国特許第5,807,715号、第4,816,567号、および第6,331、415号も参照されたい。
別の代替法において、抗体は、当技術分野においてよく知られている手順を用いて組み換え的に製造することができる。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域をコードする配列を含む。別の実施形態において、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、発現または増殖のために1個または複数のベクター中にクローニングされる。関心のある抗体をコードする配列を、宿主細胞においてベクター内に維持することができ、次いで、宿主細胞を、将来使用するために拡大して冷凍することができる。ベクター(発現ベクターを含む)および宿主細胞については、本明細書においてさらに記載される。
本発明は、9TLおよび6Gなどの本発明の抗体の単鎖可変領域フラグメント(「scFv」)も包含する。単鎖可変領域フラグメントは、短い連結ペプチドを用いることにより軽鎖および/または重鎖可変領域を連結することによって製造される。Bird他(1988)Science 242:423〜426。連結ペプチドの一例は、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端の間の約3.5nmを架橋する(GGGGS)である。他の配列のリンカーが設計され使用されている。Bird他(1988)。したがって、リンカーは、薬物の接続または固体支持体への接続などの追加的機能のために改変することができる。単鎖変異体は、組み換え的または合成的のどちらかで製造することができる。scFvの合成的製造の場合、自動合成装置を使用することができる。scFvの組み換え的製造の場合、scFvをコードするポリヌクレオチドを含有する適当なプラスミドを、適当な宿主細胞、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳類細胞などの真核生物、または大腸菌(E.coli)などの原核生物のどちらかに導入することができる。関心のあるscFvをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどのルーチンな操作によって製造することができる。得られるscFvは、当技術分野において知られている標準的なタンパク質精製技法を用いて単離することができる。
ダイアボディ(diabody)などの単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、VHおよびVLドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現され、しかし同じ鎖上の2個のドメイン間で対合させるには短すぎるリンカーを用い、それによって、そのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、2個の抗原結合部位を作製する二価の二重特異性抗体である(例えば、Holliger,P.他(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90:6444〜6448;Poljak,R.J.他(1994)Structure 2:1121〜1123を参照)。
例えば、二重特異性抗体、少なくとも2個の異なる抗原、すなわちAβ1〜40およびAβ1〜42に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体は、本明細書に開示されている抗体を用いて調製することができる。二重特異性抗体を製造するための方法は、当技術分野において知られている(例えば、Suresh他、1986、Methods in Enzymology 121:210を参照)。伝統的に、二重特異性抗体の組み換え的製造は、2個の重鎖が異なる特異性を有する2種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの同時発現に基づいている(MillsteinおよびCuello、1983、Nature 305、537〜539)。
二重特異性抗体を製造することへの一アプローチに従い、望ましい結合特異性を持つ抗体可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。この融合は、ヒンジ、CH2およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとであることが好ましい。融合物のうちの少なくとも1個に存在し、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一重鎖定常領域(CH1)を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および、望ましい場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは、別々の発現ベクターに挿入され、適当な宿主生物体中に同時形質導入される。これにより、構築に使用される3個のポリペプチド鎖の等しくない比が最適収量を提供する実施形態において、3個のポリペプチドフラグメントのお互いの比率を調整する際の大きな柔軟性が得られる。しかしながら、等しい比の少なくとも2個のポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、または比が特に意味を持たない場合、2個または3個すべてのポリペプチド鎖のためのコーディング配列を1個の発現ベクターに挿入することが可能である。
一アプローチにおいて、二重特異性抗体は、一方の腕における第1の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方の腕におけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対(第2の結合特異性を提供する)からなる。二重特異性分子の半分だけに免疫グロブリン軽鎖を持つこの非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの望ましい二重特異性化合物の分離を容易にする。このアプローチは、1994年3月3日に公開されたPCT公開WO94/04690に記載されている。
2個の共有結合で結合した抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内にある。そのような抗体は、免疫系細胞を望ましくない細胞の標的とするため(米国特許第4,676,980号)、およびHIV感染を治療するため(PCT出願公開WO91/00360およびWO92/200373;EP03089)に使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を用いて製造することができる。適当な架橋剤および技法は、当技術分野においてよく知られており、米国特許第4,676,980号に記載されている。
キメラまたはハイブリッド抗体も、架橋剤が関わる方法を含む、合成タンパク質化学の知られている方法を用いてin vitroで調製することができる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用い、またはチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適している試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−4−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
抗体9TLの1個もしくは複数のCDRまたは抗体9TLに由来する1個または複数のCDRを含むヒト化抗体は、当技術分野において知られている任意の方法を用いて製造することができる。例えば、4つの一般的ステップを用いてモノクローナル抗体をヒト化することができる。これらは、(1)出発抗体の軽および重可変ドメインのヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列を決定すること、(2)ヒト化抗体を設計すること、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をヒト化プロセス中に使用するかを決定すること、(3)実際のヒト化方法/技法および(4)ヒト化抗体の形質移入および発現である。例えば、米国特許第4,816,567号、第5,807,715号、第5,866,692号、第6,331,415号、第5,530,101号、第5,693,761号、第5,693,762号、第5,585,089号、第6,180,370号、第5,225,539号、第6,548,640号を参照されたい。
組み換えヒト化抗体において、Fc部分を改変し、Fcγ受容体および補体免疫系との相互作用を避けることができる。このタイプの改変は、Cambridge Universityのthe Department of PathologyのMike Clark博士により設計された。そのような抗体を調製するための技法は、1999年11月18に公開されたWO99/58572に記載されている。
例えば、定常領域を、より似ているヒト定常領域へと操作し、抗体がヒトにおける臨床試験および臨床治療に使用される場合に、免疫反応を避けることができる。例えば、米国特許第5,997,867号および第5,866,692号を参照されたい。
本発明は、それらの特性に著しく影響しない機能的に等価な抗体ならびに活性および/または親和性が増強または低下した変異体を含む、抗体9TLおよび6Gの改変形態を包含する。例えば、抗体9TLまたは6Gのアミノ酸配列を突然変異させ、標的Aβペプチドに対して望ましい結合親和性を持つ抗体を得ることができる。ポリペプチドの改変は当技術分野において通常の業務であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。ポリペプチドの改変を実施例に例示する。改変されたポリペプチドの例には、機能活性を著しく有害に変化させないアミノ酸残基の保存的置換、アミノ酸の1個または複数の欠失または付加を有する、または化学的類似体が使用されたポリペプチドが含まれる。
アミノ酸配列挿入物には、長さで1個の残基から100個以上の残基を含有するポリペプチドに及ぶアミノ−および/またはカルボキシ末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入物の例には、N末端メチオニル残基を持つ抗体またはエピトープタグと融合された抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増大させる酵素またはポリペプチドの抗体のN−またはC末端との融合物が含まれる。
置換変異体は、除去される抗体分子中の少なくとも1個のアミノ酸残基およびその場所に挿入される異なる残基を有する。置換突然変異誘発にとって最も興味深い部位には、超可変領域が含まれるが、FR変異も企図されている。保存的置換を、表1の「保存的置換」の項目の下に示す。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表1で「例示的置換」と呼ばれ、またはアミノ酸クラスに関して以下でさらに記載されるように、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングすることができる。
Figure 0005964004
抗体の生物学的特性の実質的改変は、(a)例えば、シートコンホメーションまたはらせんコンホメーションのような置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、(b)標的部位における分子の電荷または疎水性、または(c)側鎖の大きさを維持することに対するそれらの影響が著しく異なる置換を選択することによって行うことができる。天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づいて群に分けられる。
(1)非極性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、
(2)電荷のない極性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性(負の電荷を帯びた):Asp、Glu、
(4)塩基性(正の電荷を帯びた);Lys、Arg、
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro、および
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe、His。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することより行われる。
抗体の適切なコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基も、一般的にセリンで置換し、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、1個または複数のシステイン結合を抗体に加え、その安定性、特に、抗体がFvフラグメントなどの抗体フラグメントである場合に、その安定性を改善することができる。
アミノ酸改変は、1個または複数のアミノ酸を変える、または改変することから、可変領域などの領域の完全な再設計まで及ぶことがある。可変領域の変化は、結合親和性および/または特異性を変化させることがある。一部の実施形態において、1個程度から5個の保存的アミノ酸置換は、CDRドメイン内で行われる。他の実施形態において、1個程度から3個の保存的アミノ酸置換は、CDRドメイン内で行われる。さらに他の実施形態において、CDRドメインは、CDR H3および/またはCDR L3である。
改変形態には、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに、例えば、様々な糖によるグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの他の翻訳後改変を持つポリペプチドも含まれる。抗体は、それらの定常領域中の保存的位置でグリコシル化される(JefferisおよびLund、1997、Chem.Immunol.65:111〜128;WrightおよびMorrison、1997、TibTECH 15:26〜32)。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能(Boyd他、1996、Mol.Immunol.32:1311〜1318;WittweおよびHoward、1990、Biochem.29:4175〜4180)ならびに糖タンパク質のコンホメーションおよび示された三次元表面に影響を及ぼすことがある糖タンパク質の部分間の分子内相互作用(HefferisおよびLund、前掲書;WyssおよびWagner、1996、Current Opin.Biotech.7:409〜416)に影響を及ぼす。オリゴ糖も、特定の認識構造に基づき、所与の糖タンパク質を特定の分子の標的にする役目を果たすことがある。抗体のグリコシル化も、抗体依存性細胞性細胞障害(ADCC)に影響を及ぼすことが報告されている。特に、バイセクティングGlcNAcの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ(1,4)−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)のテトラサイクリン調節性発現を有するCHO細胞は、改善されたADCC活性を有することが報告されている(Umana他、1999、Mature Biotech.17:176〜180)。
抗体のグリコシル化は、通常、N−結合型またはO−結合型のどちらかである。N−結合型は、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖との接続を指す。トリペプチド配列アスパラギン−X−セリン、アスパラギン−X−スレオニン、およびアスパラギン−X−システイン(Xは、プロリンを除く任意のアミノ酸である)は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖との酵素的接続のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のうちのどれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。O−結合型グリコシル化は、糖N−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの1つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはセロトニンとの接続を指すが、5−ヒドロキシプロリンまたは5−ヒドロキシリシンも使用されることがある。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、抗体が上述のトリペプチド配列のうちの1個または複数を含有するようにアミノ酸配列を変化させることにより好都合に行われる(N−結合型グリコシル化部位のために)。その変化も、元の抗体の配列への1個または複数のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはそれらによる置換によって行うことができる(O−結合型グリコシル化部位のために)。
抗体のグリコシル化パターンも、基礎をなすヌクレオチド配列を変化させることなく変化させることができる。グリコシル化は、抗体を発現するために使用される宿主によって大きく左右される。潜在的治療薬としての組み換え糖タンパク質、例えば抗体の発現のために使用される細胞タイプは、天然の細胞であることはまれであるため、抗体のグリコシル化パターンの変化が予想される(例えば、Hse他、1997、J.Biol.Chem.272:9062〜9070を参照)。
宿主細胞の選択の他に、抗体の組み換え的製造中のグリコシル化に影響を及ぼす要因には、成長モード、培地処方、培養密度、酸素化、pH、精製スキームなどが含まれる。オリゴ糖産生に関わる特定の酵素を導入または過剰発現することを含む、特定の宿主生物体において行われるグリコシル化パターンを変化させるための様々な方法が提案されている(米国特許第5,047,335号、第5,510,261号および第5,278,299号)。グリコシル化部、または特定のタイプのグリコシル化部は、例えば、エンドグリコシダーゼH(Endo H)、実施例3に記載されているようなN−グリコシダーゼF、エンドグリコシダーゼF1、エンドグリコシダーゼF2、エンドグリコシダーゼF3を用い、糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組み換え宿主細胞を遺伝子操作し、特定のタイプの多糖を加工するのを不完全にすることができる。これらおよび類似の技法は、当技術分野においてよく知られている。
改変の他の方法には、酵素的手段、酸化置換およびキレート化を含むがこれらに限定されない、当技術分野において知られているカップリング技法を使用することが含まれる。改変は、例えば、イムノアッセイのための標識の接続に使用することができる。改変された9TLポリペプチドは、当技術分野において確立された手順を用いて製造することができ、当技術分野において知られている標準的なアッセイを用いてスクリーニングすることができ、それらの一部については、以下および実施例に記載される。
本発明の一部の実施形態において、抗体は、免疫学的に不活性または部分的に不活性である、すなわち、補体媒介性溶解を誘発せず、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)を刺激せず、もしくはミクログリアを活性化しないか、または以下の、すなわち、補体媒介性溶解を誘発すること、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)を刺激すること、もしくはミクログリアを活性化することのうちのいずれか1つまたは複数において活性の低下(非改変抗体と比較して)を有する定常領域などの改変定常領域を含む。定常領域の様々な改変を用い、エフェクター機能の最適レベルおよび/または組合せを実現することができる。例えば、Morgan他、Immunology 86:319〜324(1995);Lund他、J.Immunology 157:4963〜9 157:4963〜4969(1996);Idusogie他、J.Immunology 164:4178〜4184(2000);Tao他、J.Immunology 143:2595〜2601(1989);およびJefferis他、Immunological Reviews 163:59〜76(1998)を参照されたい。一部の実施形態において、定常領域は、Eur.J.Immunol.(1999)29:2613〜2624;PCT出願第PCT/GB99/01441号;および英国特許出願第9809951.8号に記載されているように改変される。他の実施形態において、抗体は、以下の変異、すなわち、A330P331からS330S331(野生型IgG2a配列に準拠したアミノ酸ナンバリング)を含むヒト重鎖IgG2a定常領域を含む。Eur.J.Immunol.(1999)29:2613〜2624。さらに他の実施形態において、定常領域は、N−結合型グリコシル化部についてアグリコシル化される。一部の実施形態において、定常領域は、定常領域中のN−グリコシル化部位認識配列の一部であるグリコシル化アミノ酸配列または隣接残基を突然変異させることによりN−結合型グリコシル化部についてアグリコシル化される。例えば、N−グリコシル化部位N297は、A、Q、K、またはHへ突然変異させることができる。Tao他、J.Immunology 143:2595〜2601(1989);およびJefferis他、Immunological Reviews 163:59〜76(1998)を参照されたい。一部の実施形態において、定常領域は、N−結合型グリコシル化部についてアグリコシル化される。定常領域は、酵素的に(酵素PNGaseによって炭水化物を除去することなど)、またはグリコシル化欠損宿主細胞における発現により、N−結合型グリコシル化部についてアグリコシル化されてもよい。
他の抗体改変形態には、1999年11月18に公開されたPCT公開WO99/58572に記載されているように改変された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子を対象とする結合ドメインの他に、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域のすべてまたは一部と実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、有意な補体依存性溶解、または標的の細胞媒介性破壊を誘発することなく、標的分子と結合することができる。一部の実施形態において、エフェクタードメインは、FcRnおよび/またはFcγRIIbと特異的に結合することができる。これらは、通常、2個以上のヒト免疫グロブリン重鎖C2ドメインに由来するキメラドメインに基づいている。この方法で改変された抗体は、炎症および従来の抗体療法に対する他の有害反応を避けるために、長期抗体療法で使用するのに特に適している。
本発明には、親和性成熟(affinity matured)実施形態が含まれる。例えば、親和性成熟抗体は、当技術分野において知られている手順によって製造することができる(Marks他、1992、Bio/Technology、10:779〜783;Barbas他、1994、Proc Nat.Acad.Sci、USA 91:3809〜3813;Schier他、1995、Gene、169:147〜155;Yelton他、1995、J.Immunol.、155:1994〜2004;Jackson他、1995、J.Immunol.、154(7):3310〜9;Hawkins他、1992、J.Mol.Biol.、226:889〜896;およびWO2004/058184)。
以下の方法は、抗体の親和性を調整するため、およびCDRを特徴付けるために使用することができる。抗体のCDRを特徴付けることおよび/または抗体などのポリペプチドの結合親和性を変化させること(改善することなど)の一方法は、「ライブラリースキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。一般的に、ライブラリースキャニング突然変異誘発は、以下の通り行う。CDR中の1個または複数のアミノ酸位置を、当技術分野でよく知られている(art recognized)方法を用い、2個以上(3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個など)のアミノ酸で置き換える。これにより、クローンの小さなライブラリーが作製され(一部の実施形態において、分析されるアミノ酸位置ごとに1個)、各々は、2個以上のメンバーの複雑性を持つ(2個以上のアミノ酸が位置ごとに置換される場合)。一般的に、このライブラリーには、天然(非置換)アミノ酸を含むクローンが含まれる。各ライブラリーからの少数のクローン、例えば、20〜80個のクローン(ライブラリーの複雑性に応じて)を、標的ポリペプチド(または他の結合性標的)に対する結合親和性についてスクリーニングし、結合が増加した、同じ、減少した、または結合しない候補を同定する。結合親和性を決定するための方法は、当技術分野においてよく知られている。結合親和性は、約2倍以上の結合親和性の差を検出するBIAcore表面プラズモン共鳴分析を用いて決定することができる。BIAcoreは、出発抗体が、比較的高い親和性、例えば約10nM以下のKですでに結合している場合に特に有用である。BIAcore表面プラズモン共鳴を用いるスクリーニングは、本明細書において実施例に記載されている。
結合親和性は、Kinexa Biocensor、シンチレーション近接アッセイ、ELISA、ORIGENイムノアッセイ(IGEN)、蛍光消光、蛍光移動、および/または酵母ディスプレーを用いて決定することができる。結合親和性は、適当なバイオアッセイを用いてもスクリーニングすることができる。
一部の実施形態において、CDR中のあらゆるアミノ酸位置は、当技術分野でよく知られている突然変異誘発法を用い、20個すべての天然アミノ酸で置き換えられる(一部の実施形態において、一度に1個)(その一部は、本明細書に記載されている)。これにより、クローンの小さなライブラリーが作製され(一部の実施形態において、分析されるアミノ酸位置ごとに1個)、各々は、20個のメンバーの複雑性を持つ(20個すべてのアミノ酸が位置ごとに置換される場合)。
一部の実施形態において、スクリーニングするべきライブラリーは、2個以上の位置に置換を含み、それらは、同じCDR中または2個以上のCDR中にあってよい。したがって、ライブラリーは、1個のCDR中で2個以上の位置に置換を含むことができる。ライブラリーは、2個以上のCDR中で2個以上の位置に置換を含むことができる。ライブラリーは、3、4、5個、またはそれ以上の位置に置換を含むことができ、前記位置は、2、3、4、5または6個のCDR中に見出される。この置換は、低冗長性コドンを用いて調製することができる。例えば、Balint他、(1993)Gene 137(1):109〜18の表2を参照されたい。
CDRは、CDRH3および/またはCDRL3であってよい。CDRは、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、および/またはCDRH3のうちの1個または複数であってよい。CDRは、Kabat CDR、Chothia CDR、または拡大CDRであってよい。
改善された結合を持つ候補を配列決定し、それによって、改善された親和性(「改善された」置換とも呼ばれる)をもたらすCDR置換突然変異体を同定する。結合する候補も配列決定し、それによって、結合を保持するCDR置換を同定することができる。
複数回のスクリーニングを行うことができる。例えば、改善された結合を持つ候補(各々は、1個または複数のCDRの1個または複数の位置にアミノ酸置換を含む)は、各々の改善されたCDR位置(すなわち、置換突然変異体が改善された結合を示したCDR中のアミノ酸位置)に、少なくとも、元のアミノ酸および置換されたアミノ酸を含有する第2のライブラリーを設計するのにも有用である。このライブラリーの調製、およびスクリーニングまたは選択については、以下でさらに議論される。
ライブラリースキャニング突然変異誘発は、改善された結合、同じ結合、低下した結合を持つか、または結合しないクローンの頻度が、抗体−抗原複合体の安定性についての各アミノ酸位置の重要性に関する情報も提供する限りにおいて、CDRを特徴付けるための手段も提供する。例えば、CDRのある位置が、20個すべてのアミノ酸に変えられた場合に結合を保持する場合、その位置は、抗原結合にとって必要でなさそうな位置と見なされる。逆に、CDRのある位置が、わずかな比率の置換のみで結合を保持する場合、その位置は、CDR機能に重要である位置と見なされる。したがって、ライブラリースキャニング突然変異誘発法は、多くの異なるアミノ酸(20個すべてのアミノ酸を含む)に変えることができるCDR中の位置、および変えることができないか、またはおよび少数のアミノ酸のみに変えることができるCDR中の位置に関する情報を生む。
改善された親和性を持つ候補は、改善されたアミノ酸、その位置の元のアミノ酸が含まれ、望ましいライブラリーの複雑性に応じて、その位置に追加の置換がさらに含まれていてよい、または望ましいスクリーニングまたは選択方法を用いて可能である第2のライブラリーで組み合わせることができる。さらに、望ましい場合、隣接アミノ酸位置を、少なくとも2個以上のアミノ酸に無作為化することができる。隣接アミノ酸の無作為化は、突然変異体CDRにおける追加のコンホメーション柔軟性を可能にすることができ、これは、多数の改善突然変異の導入を可能または容易にすることができる。このライブラリーは、第1回目のスクリーニングにおいて改善された親和性を示さなかった位置における置換も含むことができる。
第2のライブラリーは、BIAcore表面プラズモン共鳴分析を用いるスクリーニング、ならびにファージディスプレー、酵母ディスプレー、およびリボソームディスプレーを含む、選択に関して当技術分野において知られている任意の方法を用いる選択を含む、当技術分野において知られている任意の方法を用い、改善されたおよび/または変化を受けた結合親和性を持つライブラリーメンバーについてスクリーニングまたは選択される。
本発明は、本発明の抗体(9TLおよび6Gなど)またはポリペプチド由来の1個または複数のフラグメントまたは領域を含む融合タンパク質も包含する。一実施形態において、可変軽鎖領域の少なくとも10個の隣接するアミノ酸、および/または示される可変重鎖領域の少なくとも10個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態において、可変軽鎖領域の少なくとも約10個、少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約25個、または少なくとも約30個の隣接するアミノ酸、および/または可変重鎖領域の少なくとも約10個、少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約25個、または少なくとも約30個の隣接するアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、9TLまたは6Gの軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を含む。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、9TLまたは6Gの1個または複数のCDRを含む。さらに他の実施形態において、融合ポリペプチドは、抗体9TLまたは6GのCDR H3および/またはCDR L3を含む。本発明の目的で、9TLまたは6G融合タンパク質は、それぞれ1個または複数の9TLまたは6G抗体および天然分子では接続していない別のアミノ酸配列、例えば、異種配列または別の領域由来の相同配列を含有する。例示的異種配列には、FLAGタグまたは6Hisタグなどの「タグ」が含まれるが、これらに限定されるものではない。タグは、当技術分野においてよく知られている。
融合ポリペプチドは、当技術分野において知られている方法により、例えば合成的または組み換え的に作製することができる。通常、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載されている組み換え法を用い、それらをコードするポリヌクレオチドを発現する調製することにより製造されるが、例えば、化学合成を含む当技術分野において知られている他の手段によっても調製することができる。
本発明は、固体支持体とのカップリングを容易にする試剤(ビオチンまたはアビジンなど)とコンジュゲートされた(例えば、連結された)抗体またはポリペプチドを含む組成物も提供する。話を簡単にするために、一般的に、これらの方法が、本明細書に記載されているAβ結合性実施形態のうちのいずれかに当てはまるという理解の下で抗体に言及する。一般的に、コンジュゲーションは、本明細書に記載されているようなこれらの成分と連結することを指す。連結(一般的に、少なくとも投与のために近接会合でこれらの成分を固定している)は、任意の数の方法で行うことができる。例えば、試剤と抗体の間の直接反応は、各々が他方と反応することができる置換基を有している場合に可能である。例えば、一方の上のアミノまたはスルフヒドリル基などの求核基は、他方の上の無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、または良好な脱離基(例えば、ハロゲン化物)を含むアルキル基と反応することができる。
本発明の抗体またはポリペプチドは、蛍光分子、放射性分子などの標識剤(あるいは、「標識」と呼ばれる)または当技術分野において知られているその他の標識と連結することができる。一般的にシグナルを(直接的または間接的のどちらか)提供する標識は、当技術分野において知られている。
本発明は、抗体9TLまたは6G、および、本開示が明らかにするように、本明細書に記載されている抗体および/またはポリペプチドのうちのいずれか、またはそれらのすべてを含む組成物(医薬組成物を含む)およびキットも提供する。
エフェクター機能障害を有する抗Aβペプチド抗体およびポリペプチド
本発明の方法は、β−アミロイド(Aβ)ペプチドと特異的に結合し、エフェクター機能障害を有する抗体またはポリペプチド(抗体またはポリペプチドを含む医薬組成物を含む)を使用する。抗体およびポリペプチドは、以下の特徴、すなわち、(a)対象におけるアミロイドプラークの形成を抑制する、(b)対象の眼におけるアミロイドプラークを低減する、(c)加齢性黄斑変性症(萎縮型と滲出型の双方)、緑内障、糖尿病性網膜症(黄斑浮腫を含む)および他の関連する網膜変性疾患を含むがこれらに限定されない眼科疾患の1個または複数の症状を治療、予防、軽減する、(d)網膜機能の有意な保護または回復を引き起こす、および(e)視力の有意な保存または回復を引き起こすうちのいずれか(1個または複数)をさらに特徴とする。
本明細書に記載されている抗体およびポリペプチドは、望ましい安全性プロファイルを示すことがあり、例えば、本発明の組成物は、脳脈管系における出血(脳出血)、髄膜脳炎(磁気共鳴スキャンの変化を含む)、脳脊髄液における白血球数の上昇、中枢神経系の炎症のうちのいずれか1個または複数の有意な、もしくは許容できないレベルを引き起こさず、または低下したレベルを有する。
本明細書で使用する「エフェクター機能障害」(「免疫学的に不活性である」または「部分的に免疫学的に不活性である」と同義的に使用される)を有する抗体またはポリペプチドは、いかなるエフェクター機能も有しない、またはエフェクター機能の低下した1個または複数の活性を有する(改変されていない、すなわち天然に存在する定常領域を有する抗体またはポリペプチドと比較して)、例えば、以下の、すなわち、a)補体媒介性溶解を誘発すること、b)抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)を刺激すること、およびc)ミクログリアを活性化することのうちのいずれか1個または複数で活性を有しないか、または低下した活性を有する抗体またはポリペプチドを指す。エフェクター機能活性は、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、および100%のうちのいずれか低下させることができる。一部の実施形態において、抗体は、標的の有意な補体依存性溶解、または細胞媒介性破壊を誘発せずにβ−アミロイドペプチドと結合する。例えば、定常領域上のFc受容体結合部位を改変または突然変異させ、FcγRI、FcγRII、および/またはFcγRIIIなどの特定のFc受容体に対する結合親和性を除去または低減することができる。話を簡単にするために、一般的に、実施形態が、ポリペプチドにも当てはまるという理解の下で抗体に言及する。EUナンバリングシステム(Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest;第5版 Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.、1991)を使用し、定常領域(例えば、IgG抗体の)の1個または複数のどのアミノ酸が変異または突然変異したかを示す。ナンバリングは、類似の変化が、抗体および種のタイプを横断して行われることがあるという理解の下で、特定のタイプの抗体(例えば、IgG1)または種(例えば、ヒト)について使用することができる。
一部の実施形態において、Aβペプチドと特異的に結合する抗体は、エフェクター機能障害を有する重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、天然に存在する配列を有することができ、または変異体である。一部の実施形態において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸の置換、挿入および/または欠失により突然変異し、それによって定常領域のエフェクター機能が損なわれる。一部の実施形態において、重鎖定常領域のFc領域のN−グリコシル化部も変化させることができ、例えば、完全または部分的に除去することができ、それによって、定常領域のエフェクター機能が損なわれる。
一部の実施形態において、エフェクター機能は、抗AβペプチドのFc領域(例えば、IgGのCH2ドメイン中の)のN−グリコシル化部を除去することにより損なわれる。一部の実施形態において、Fc領域のN−グリコシル化部は、定常領域中のグリコシル化部位認識配列の一部であるグリコシル化アミン酸残基または隣接残基を突然変異させることにより除去される。トリペプチド配列アスパラギン−X−セリン(N−X−S)、アスパラギン−X−スレオニン(N−X−T)およびアスパラギン−X−システイン(N−X−C)(Xは、プロリンを除く任意のアミノ酸である)は、炭水化物部分をN−グリコシル化のためのアスパラギン側鎖と酵素的に接続するための認識配列である。定常領域中のトリペプチド配列においてアミノ酸のいずれかを突然変異させることにより、アグリコシル化IgGが得られる。
例えば、ヒトIgG1およびIgG3のN−グリコシル化部位N297を、A、D、Q、K、またはHに突然変異させることができる。Tao他、J.Immunology 143:2595〜2601(1989);およびJefferis他、Immunological Reviews 163:59〜76(1998)を参照されたい。Gln、His、またはLysでAsn−297が置換されたヒトIgG1およびIgG3は、ヒトFcγRIと結合せず、補体を活性化せず、C1q結合能力が、IgG1については完全に失われ、IgG3については劇的に低下することが報告されている。一部の実施形態において、トリペプチド配列中のアミノ酸Nは、アミノ酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Yのうちのいずれか1個に突然変異される。一部の実施形態において、トリペプチド配列中のアミノ酸Nは、保存的置換に突然変異される。一部の実施形態において、トリペプチド配列中のアミノ酸Xは、プロリンに突然変異される。一部の実施形態において、トリペプチド配列中のアミノ酸Sは、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Yに突然変異される。一部の実施形態において、トリペプチド配列中のアミノ酸Tは、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Yに突然変異される。一部の実施形態において、トリペプチド配列中のアミノ酸Cは、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Yに突然変異される。一部の実施形態において、トリペプチドに続くアミノ酸は、Pに突然変異される。一部の実施形態において、定常領域中のN−グリコシル化部は、酵素的に除去される(実施例3に記載されているようなN−グリコシダーゼF、エンドグリコシダーゼF1、エンドグリコシダーゼF2、エンドグリコシダーゼF3、およびエンドグリコシダーゼHなど)。N−グリコシル化部を除去することは、N−グリコシル化部に欠損を有する細胞系で抗体を産生することにより行うこともできる。Wright他、J Immunol.160(7):3393〜402(1998)。
一部の実施形態において、定常領域のN−グリコシル化部位に接続しているオリゴ糖と相互作用するアミノ酸残基は、FcγRIに対する結合親和性を低下させるために突然変異される。例えば、ヒトIgG3のF241、V264、D265を突然変異させることができる。Lund他、J.Immunology 157:4963〜4969(1996)を参照されたい。
一部の実施形態において、エフェクター機能は、PCT WO99/58572およびArmour他、Molecular Immunology 40:585〜593(2003);Reddy他、J.Immunology 164:1925〜1933(2000)に記載されているように、ヒトIgGの233〜236、297、および/または327〜331などの領域を改変することにより損なわれる。PCT WO99/58572およびArmour他に記載されている抗体は、標的分子を対象とする結合ドメインの他に、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域のすべてまたは一部と実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の有意な補体依存性溶解、または細胞媒介性破壊を誘発することなく、標的分子と結合することができる。一部の実施形態において、エフェクタードメインは、FcγRI、FcγRIIa、およびFcγRIIIについて低下した親和性を有する。一部の実施形態において、エフェクタードメインは、FcRnおよび/またはFcγRIIbと特異的に結合することができる。これらは、通常、2個以上のヒト免疫グロブリン重鎖C2ドメインに由来するキメラドメインに基づいている。この方法で改変された抗体は、炎症および従来の抗体療法に対する他の有害反応を避けるために、長期抗体療法で使用するのに特に適している。一部の実施形態において、抗体の重鎖定常領域は、以下の突然変異、すなわち、1)A327A330P331からG327S330S331、2)E233L234L235G236からG236が欠失したP233V234A235、3)E233L234L235からP233V234A235、4)E233L234L235G236A327A330P331からG236が欠失したP233V234A235G327S330S331、5)E233L234L235A327A330P331からP233V234A235G327S330S331、および6)N297からA297またはNを除くその他のアミノ酸のうちのいずれかのあるヒト重鎖IgG1である。一部の実施形態において、抗体の重鎖定常領域は、以下の突然変異、すなわち、A330P331からS330S331のあるヒト重鎖IgG2である。一部の実施形態において、抗体の重鎖定常領域は、以下の突然変異、すなわち、E233F234L235G236からG236が欠失したP233V234A235、E233F234L235からP233V234A235、およびS228L235からP228E235のうちのいずれかのあるヒト重鎖IgG4である。
抗体の定常領域を改変し、補体活性を傷害することもできる。例えば、補体のC1成分の結合に続くIgG抗体の補体活性化は、C1結合モチーフ(例えば、C1q結合モチーフ)中の定常領域においてアミノ酸残基を突然変異させることにより減少させることができる。ヒトIgG1のD270、K322、P329、P331の各々についてのAla突然変異は、抗体がC1qと結合して補体を活性化する能力を著しく低下させることが報告されている。マウスIgG2bの場合、C1q結合モチーフは、残基E318、K320、およびK322からなる。Idusogie他、J.Immunology 164:4178〜4184(2000);Duncan他、Nature 322:738〜740(1988)。
マウスIgG2bについて同定されたC1q結合モチーフE318、K320、およびK322は、他の抗体アイソタイプについて共通すると考えられている。Duncan他、Nature 322:738〜740(1988)。IgG2bのC1q結合活性は、その側鎖上に不適切な官能基を有する残基で、この3個の特定の残基のうちのいずれか1個を置き換えることにより消滅させることができる。C1q結合を消滅させるためには、イオン性残基をAlaのみで置き換える必要はない。C1q結合を消滅させるためには、3個の残基のうちのいずれか1個の代わりに、Gly、Ile、Leu、もしくはValなどの他のアルキル置換非イオン性残基、またはPhe、Tyr、Trpなどの芳香族非極性残基およびProを用いることも可能である。さらに、C1q結合活性を消滅させるためには、残基318ではなく残基320および322の代わりに、Ser、Thr、Cys、およびMetなどの極性非イオン性残基を用いることも可能である。
本発明は、エフェクター機能障害を有し、改変されたヒンジ領域を有する抗体も提供する。そのFc受容体に対するヒトIgGの結合親和性は、ヒンジ領域を改変することにより調節することができる。Canfield他、J.Exp.Med.173:1483〜1491(1991);Hezareh他、J.Virol.75:12161〜12168(2001);Redpath他、Human Immunology 59:720〜727(1998)。特定のアミノ酸残基を突然変異または欠失させることができる。改変されたヒンジ領域は、CH1ドメイン由来の様々な抗体クラスまたはサブクラスの抗体に由来する完全ヒンジ領域を含むことができる。例えば、クラスIgG抗体の定常領域(CH1)は、クラスIgG4抗体のヒンジ領域に接続することができる。代替方法として、新たなヒンジ領域は、天然ヒンジの一部または反復中の各単位が天然ヒンジ領域に由来する反復単位を含むことができる。一部の実施形態において、天然ヒンジ領域は、1個または複数のシステイン残基を、アラニンなどの中性残基に変換することにより、または適当に置かれた残基をシステイン残基に変換することにより変異される。米国特許第5,677,425号。そのような変異は、当技術分野でよく知られているタンパク質化学および、好ましくは遺伝子操作技法を用い、本明細書に記載されているように行われる。
Aβペプチドと特異的に結合し、エフェクター機能障害を有する重鎖定常領域と融合されたポリペプチドも、本明細書に記載されている方法に使用することができる。一部の実施形態において、ポリペプチドは、抗体9TLまたは表3に示すその変異体に由来する配列を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Aβペプチドと結合する単一ドメイン抗体に由来する。単一ドメイン抗体は、当技術分野において知られている方法を用いて作製することができる。Omidfar他、Tumour Biol.25:296〜305(2004);Herring他、Trends in Biotechnology 21:484〜489(2003)。
一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、F(ab’)フラグメントではない。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Fabフラグメントではない。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、単鎖抗体scFvではない。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、PEG化F(ab’)フラグメントである。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、PEG化Fabフラグメントである。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、PEG化単鎖抗体scFvである。
当技術分野において知られているエフェクター機能障害を有する抗体を製造する他の方法も使用することができる。
改変された定常領域を持つ抗体およびポリペプチドは、1種または複数のアッセイにおいてテストし、出発抗体と比較した生物学的活性におけるエフェクター機能低下のレベルを評価することができる。例えば、変異したFc領域を持つ抗体またはポリペプチドが、補体もしくはFc受容体(例えば、ミクログリア上のFc受容体)、または変異したヒンジ領域と結合する能力は、本明細書に開示されているアッセイならびに任意の当技術分野でよく知られているアッセイを用いて評価することができる。PCT WO99/58572;Armour他、Molecular Immunology 40:585〜593(2003);Reddy他、J.Immunology 164:1925〜1933(2000);Song他、Infection and Immunity 70:5177〜5184(2002)。
一部の実施形態において、β−アミロイドペプチドと特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。一部の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態において、抗体は、ヒト抗体である。一部の実施形態において、抗体は、キメラ抗体である。一部の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態において、抗体は、霊長類化抗体である。例えば、Yocum他、J.Pheumatol.25:1257〜62(1998);Bugelski他、Human & Experimental Toxicoloy 19:230〜243(2000)を参照されたい。一部の実施形態において、抗体は、抗体がヒト免疫系を活性化しないように、突然変異により脱免疫化される。例えば、Nanus他、J.Urology 170:S84〜S89(2003)を参照されたい。
本明細書で使用するAβペプチドには、アミロイド前駆体タンパク質の酵素的切断産物の任意のフラグメントが含まれる。例えば、Aβペプチドには、Aβ1〜40、Aβ1〜42、またはAβ1〜43の任意のフラグメント、およびAβ1〜40、Aβ1〜42、またはAβ1〜43のN末端またはC末端にて様々な数のアミノ酸について切断されたペプチドが含まれる。本明細書で使用するアミノ酸ナンバリングは、Aβ1〜43(配列番号17)のナンバリングに基づく。
一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβペプチドの残基1〜16内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβペプチドの残基16〜28内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜40ペプチドの残基28〜40内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜42ペプチドの残基28〜42内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜43ペプチドの残基28〜43内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、完全長アミロイド前駆体タンパク質(APP)と結合することなくAβペプチドと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、可溶形態と結合することなくAβの凝集形態と特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、凝集形態と結合することなくAβの可溶形態と特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβの凝集形態と可溶形態の双方と特異的に結合する。Aβの様々な凝集形態と結合する抗体、例えば、アミロイドβ由来拡散性リガンド(ADDL)と結合する抗体、アミロイド線維および/または沈着と結合する抗体は、当技術分野において知られている。WO03/104437;米国公開第2003/0147887号;米国公開第2004/0219146号。
一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、3D6免疫グロブリン軽鎖(米国公開第2003/0165496号、または第2004/0087777号における配列番号2)由来の1、2、または3個のCDR、および/または3D6免疫グロブリン重鎖(米国公開第2003/0165496号、または第2004/0087777号における配列番号4)由来の1、2、または3個のCDRを含む。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、米国公開第2003/0165496号において配列番号8に示されるような可変重鎖領域および米国公開第2003/0165496号において配列番号5に示されるような可変軽鎖領域を含む。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、米国公開第2003/0165496号において配列番号12に示されるような可変重鎖領域および米国公開第2003/0165496号において配列番号11に示されるような可変軽鎖領域を含む。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、10D5免疫グロブリン軽鎖(米国公開第2003/0165496号、または第2004/0087777号における配列番号14)由来の1、2、または3個のCDR、および/または10D5免疫グロブリン重鎖(米国公開第2003/0165496号、または第2004/0087777号における配列番号16)由来の1、2、または3個のCDRを含む。
一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜40の残基33〜40内のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸35〜40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸36〜40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸39および/または40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜40と特異的に結合するが、Aβ1〜42および/またはAβ1〜43とは特異的に結合しない。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、抗体9TLまたは本明細書に記載されている9TLに由来する抗体もしくはポリペプチドである。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、抗体9TLおよび/または9TLに由来する抗体もしくはポリペプチドがAβ1〜40と結合するのを競合的に阻害する。一部の実施形態において、抗体は、PCT WO2004/032868に記載されている抗体2286ではない。他の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、抗体6Gまたは本明細書に記載されている6Gに由来する抗体もしくはポリペプチドである。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、抗体6Gおよび/または6Gに由来する抗体もしくはポリペプチドがAβ1〜40およびAβ1〜42と結合するのを競合的に阻害する。一部の実施形態において、抗体は、米国2004/0146512およびWO04/032868に記載されている抗体2294ではない。WO2006118959に記載されているように、抗体2294は、抗体6Gに極めて類似しているエピトープと結合する。
抗体およびポリペプチドを製造する方法は、当技術分野において知られており、本明細書に記載されている。
競合アッセイを用い、2種の抗体が、同一の、または立体的に重なったエピトープを認識することにより同じエピトープと結合するのか、または一方の抗体が、もう一方の抗体が抗原に結合するのを競合的に阻害するのか否かを決定することができる。これらのアッセイは、当技術分野において知られている。通常、抗原をマルチウェルプレート上に固定化し、非標識抗体が標識抗体の結合をブロックする能力を測定する。そのような競合アッセイのための一般的標識は、放射性標識または酵素標識である。
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明の抗体およびポリペプチド(図1および8に示す軽鎖および重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む抗体を含む)をコードする単離ポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
したがって、本発明は、以下の、すなわち、(a)抗体9TLもしくは6Gまたは表3および表8に示すそれらの変異体、(b)抗体9TLもしくは6Gまたは表3および表8に示すそれらの変異体のフラグメントもしくは領域、(c)抗体9TLもしくは6Gまたは表3および表8に示すそれらの変異体の軽鎖、(d)抗体9TLもしくは6Gまたは表3および表8に示すそれらの変異体の重鎖、(e)抗体9TLもしくは6Gまたは表3および表8に示すそれらの変異体の軽鎖および/または重鎖由来の1個または複数の可変領域、(f)抗体9TLもしくは6Gまたは表3および表8に示すそれらの変異体の1個または複数のCDR(1、2、3、4、5または6個のCDR)、(g)抗体9TLまたは6Gの重鎖由来のCDR H3、(h)抗体9TLもしくは6Gまたは表3および表8に示すそれらの変異体の軽鎖由来のCDR L3、(i)抗体9TLもしくは6Gまたは表3および表8に示すそれらの変異体の軽鎖由来の3個のCDR、(j)抗体9TLもしくは6Gまたは表3および表8に示すそれらの変異体の重鎖由来の3個のCDR、(k)抗体6Gまたは表3および表8に示すその変異体の軽鎖由来の3個のCDRおよび重鎖由来の3個のCDR、および(l)(b)から(k)のうちのいずれか1個を含む抗体のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド(または、医薬組成物を含む組成物)を提供する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号9、配列番号10、配列番号34、および配列番号35に示すポリヌクレオチドのどちらか、または双方を含む。
別の態様において、本発明は、エフェクター機能障害を有する抗体およびポリペプチドなどの、本明細書に記載されている抗体(抗体フラグメントを含む)およびポリペプチドのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている手順によって製造することができる。
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む組成物(医薬組成物など)を提供する。一部の実施形態において、組成物は、本明細書に記載されているような9TL抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態において、組成物は、本明細書に記載されている抗体またはポリペプチドのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに他の実施形態において、組成物は、配列番号9および配列番号10に示すポリヌクレオチドのどちらか、または双方を含む。
発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与については、本明細書でさらに記載される。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドのうちのいずれかを製造する方法を提供する。
任意のそのような配列に対して相補的なポリヌクレオチドも、本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖(コーディングまたはアンチセンス)または二本鎖であってよく、DNA(ゲノム、cDNAまたは合成の)またはRNA分子であってよい。RNA分子には、イントロンを含有し、1対1でDNA分子と対応するHnRNA分子、およびイントロンを含有しないmRNA分子が含まれる。追加のコーディングまたは非コーディング配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在することはあるが、必要ではなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および/または支持体材料と連結していることはあるが、必要ではない。
ポリヌクレオチドは、天然配列(すなわち、抗体またはその一部をコードする内在性配列)を含むことができ、またはそのような配列の変異体を含むことができる。ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの免疫反応性が、天然の免疫反応性分子に比べて減少しないような1個または複数の置換、付加、欠失および/または挿入を含有する。一般的に、コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する影響は、本明細書に記載されているように評価することができる。変異体は、天然抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約70%の同一性、より好ましくは少なくとも約80%の同一性、最も好ましくは少なくとも約90%の同一性を示すことが好ましい。
2種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、2種の配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載されているような最大対応に対してアラインメントされた時に同じである場合、「同一」であると言われる。2種の配列間の比較は、通常、比較ウインドウ(comparison window)全体で配列を比較し、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって行われる。本明細書で使用する「比較ウインドウ」は、少なくとも約20、通常は30〜約75、40〜約50の隣接する位置のセグメントを指し、ある配列は、2種の配列を最適にアラインメントした後で、同数の隣接する位置の参照配列と比較することができる。
比較のための配列の最適アラインメントは、デフォルトパラメーターを用い、バイオインフォマティクスソフトウェアのLasergeneパッケージソフト(suite)(DNASTAR,Inc.、Madison、WI)中のMegalignプログラムを用いて行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献、すなわち、Dayhoff,M.O.(編)Atlas of Protein Sequence and Structure、National Biomedical Research Foundation、Washington DC 第5巻、Suppl.3、345〜358ページ中のDayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteines−Matrices for detecting distant relationships;Hein J.、1990、Unified Approach to Alignment and Phylogenes 626〜645ページ Methods in Enzymology 第183巻、Academic Press,Inc.、San Diego、CA;Higgins,D.G.およびSharp,P.M.、1989、CABIOS 5:151〜153;Myers,E.W.およびMuller W.、1988、CABIOS 4:11〜17;Robinson,E.D.、1971、Comb.Theor.11:105;Santou,N,、Nes,M.、1987、Mol.Biol.Evol.4:406〜425;Sneath,P.H.A.およびSokal,R.R.、1973、Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy、Freeman Press、San Francisco、CA;Wilbur,W.J.およびLipman,D.J.、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726〜730に記載されているいくつかのアラインメントスキームを実施する。
「配列同一性の百分率」は、少なくとも20個の位置の比較ウインドウ全体で2種の最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、2種の配列の最適アラインメントのための参照配列(付加または欠失を含まない)と比較して、20%以下、通常は5〜15%、または10〜12%の付加または欠失(すなわちギャップ)を含むことがある。この百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を出し、マッチした位置の数を、参照配列中の位置の総数(すなわち、ウインドウサイズ)で除し、その結果に100を乗じて配列同一性の百分率を出すことにより算出される。
または代替方法として、変異体は、天然遺伝子、またはそれらの一部もしくは相補体と実質的に相同であってもよい。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中程度に厳密な条件の下で、天然抗体をコードする天然に存在するDNA配列(または、相補配列)とハイブリダイズすることができる。
適当な「中程度に厳密な条件」には、5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)中で予洗すること、50℃〜65℃、5×SSCにて一夜ハイブリダイズすること、続いて0.1%SDSを含有する2×、0.5×および0.2×SSCの各々で65℃にて20分間、2回洗浄することが含まれる。
本明細書で使用する「高度に厳密な条件」または「高厳密性条件」は、(1)洗浄のために、低イオン強度で高温の、例えば、0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを50℃にて用いる、(2)ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミド、例えば、0.1%ウシ血清アルブミンを添加した50%(v/v)ホルムアミド/0.1% Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを添加したpH6.5の50mMリン酸ナトリウム緩衝液などの変性剤を42℃にて用いる、または(3)0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)および55℃の50%ホルムアミド中の42℃における洗浄と、続く55℃におけるEDTAを含有する0.1×SSCからなる高厳密性洗浄と共に、50%ホルムアミド、5×SSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、および10%デキストラン硫酸を42℃にて用いる条件である。当業者は、必要に応じて温度、イオン強度などを調整し、プローブ長などの要素を適応させる方法を知っているであろう。
当業者には当然のことながら、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載されているようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在する。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列と最低限の相同性を有する。しかしながら、コドン使用頻度の差によって異なるポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図されている。さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内にある。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および/または置換などの1個または複数の突然変異の結果として変異された内在性遺伝子である。得られるmRNAおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有することがあるが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的技法(ハイブリダイゼーション、増幅および/またはデータベース配列比較など)を用いて同定することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組み換え法、またはPCRを用いて得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野においてよく知られており、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書で提供される配列および市販のDNA合成装置を用いて望ましいDNA配列を製造することができる。
RNAは、適切なベクター中で単離DNAを用い、適当な宿主細胞にそれを挿入することにより得ることができる。細胞が複製し、DNAがRNAに転写されたら、例えば、Sambrook他(1989)に記載されているように、当業者によく知られている方法を用いてRNAを単離することができる。
適当なクローニングベクターは、標準的な技法に従って構築することができ、または当技術分野において使用可能な多数のクローニングベクターから選択することができる。
一般的に、発現ベクターは、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソーム、または染色体DNAの不可欠な部分のどちらかとして、宿主細胞において複製可能でなければならないことが意味される。適当な発現ベクターには、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびPCT公開WO87/04462に開示されている1種または複数の発現ベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
関心のあるポリヌクレオチドを含有するベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE−デキストラン、または他の物質を用いる形質移入、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、リポフェクション、および感染(例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染因子である場合)を含む多くの適切な手段のうちのいずれかにより宿主細胞中に導入することができる。
本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む宿主細胞も提供する。関心のある抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的で、異種DNAを過剰発現することができる任意の宿主細胞を使用することができる。哺乳類宿主細胞の非限定的な例には、COS、HeLa、およびCHO細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。PCT公開WO87/04462も参照されたい。適当な非哺乳類宿主細胞には、原核生物(大腸菌(E.coli)および枯草菌(B.subtillis)など)および酵母(サッカロミセスセレビサエ(S.cerevisae)、シゾサッカロミセスポンベ(S.pombe)、またはクルイベロミセスラクチス(K.lactis)など)が含まれる。宿主細胞は、宿主細胞中で、存在する場合、関心のある対応する内在性の抗体またはタンパク質のレベルに比べて約5倍高い、より好ましくは10倍高い、より好ましくは20倍高いレベルでcDNAを発現することが好ましい。Aβ1〜40との特異結合についての宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはFACSによって行われる。関心のある抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
エフェクター機能障害を有する9TLまたは6G由来の抗体および抗Aβ抗体の診断使用
1個または複数のAβペプチドのC末端と結合する抗体9TLまたは6Gを用い、眼における標的Aβの有無を同定または検出することができる。話を簡単にするために、一般的に、これらの方法が、本明細書に記載されているAβ結合性実施形態(ポリペプチドなど)のうちのいずれかに当てはまるという理解の下で9TLまたは6G抗体に言及する。一般的に、検出は、生物試料をAβ1〜40と結合する本明細書に記載されている抗体と接触させ、Aβ1〜40とAβ1〜40と特異的に結合する抗体(例えば、9TL)の間で複合体を形成させるものである。そのような複合体の形成は、in vitroまたはin vivoであってよい。本明細書で使用する用語「検出」には、対照を参照する、または対照を参照しない定性的および/または定量的検出(レベルを測定すること)が含まれる。
ポリペプチドと結合する抗体を用いる、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)などによるイムノアッセイ、およびコードされるポリペプチドについての機能アッセイ、例えば、結合活性または酵素アッセイを含むがこれらに限定されない、様々な知られている方法のうちのいずれかを検出に使用することができる。一部の実施形態において、抗体は検出可能に標識される。他の実施形態は、当業者に知られており、本明細書に記載されている。
本発明の抗体およびポリペプチドは、変化した、または異常なAβまたはβAPP発現を有する眼の疾患、状態、または障害を検出、診断およびモニターするのに使用することができる。したがって、一部の実施形態において、本発明は、眼における変化した、または異常なAβ発現を有する疑いのある個体の標本(試料)を本発明の抗体またはポリペプチドと接触させること、およびAβペプチドのレベルが、対照または比較標本のレベルと異なるか否かを決定することを含む方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、個体の標本(試料)を接触させ、Aβ発現のレベルを決定することを含む方法を提供する。
診断的用途の場合、抗体は、放射性同位元素、蛍光標識、および様々な酵素基質標識を含むがこれらに限定されない、検出可能な部分で標識することができる。標識を抗体にコンジュゲートする方法は、当技術分野において知られている。本発明の他の実施形態において、本発明の抗体は、標識する必要がなく、その存在は、本発明の抗体と結合する標識抗体を用いて検出することができる。
本発明の抗体は、競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどの任意の知られているアッセイ方法で用いることができる。Zola、Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques、147〜158ページ(CRC Press,Inc.1987)。
抗体は、in vivoイメージングなどのin vivo診断アッセイにも使用することができる。一般的に、抗体は、関心のある細胞または組織が、免疫シンチオグラフィー(immunoscintiography)を用いて局在化することができるように、放射性核種(111In、99Tc、14C、131I、125I、またはHなど)で標識される。抗体は、当技術分野においてよく知られている技法に従い、病変における染色試薬としても使用することができる。
エフェクター機能障害を有する抗Aβ抗体は、網膜関連変性性眼科疾患の危険性がある、またはそれと診断された対象を診断するために網膜機能を測定するため、および任意の治療および疾患ステージの進行を評価するために使用することができる。一部の実施形態において、エフェクター機能障害を有する抗Aβ抗体は、対象に投与され、血漿中のAβのレベルが測定され、それによって、血漿Aβの増加は、対象における脳アミロイド負荷の存在および/またはレベルを明らかにする。これらの方法を用い、治療の有効性および疾患ステージをモニターし、将来の投与および頻度を決定することができる。エフェクター機能障害を有する抗体は、優れた安全性プロファイルを有し、これらの診断的使用に利点を提供することがある。
治療目的で抗Aβ抗体を使用する方法
本明細書に記載されている抗体(ポリペプチドを含む)、ポリヌクレオチド、および医薬組成物は、網膜関連変性を特徴とする眼科疾患の発生を治療、予防および阻止するための方法において使用することができる。方法は、対象に有効量の、タンパク質もしくはタンパク質沈着物と特異的に結合する抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、抗体は、エフェクター機能障害を有する。
本明細書に記載されている抗体(ポリペプチドを含む)、ポリヌクレオチド、および医薬組成物は、加齢性黄斑変性症、および加齢性黄斑変性症(滲出型と萎縮型の双方)、緑内障、糖尿病性網膜症(糖尿病性黄斑浮腫を含む)、ブルッフ膜における裂傷、近視性変性、眼腫瘍および他の関連する網膜変性疾患などの他の眼科疾患の発生を治療、予防および阻止するための方法で使用することができる。そのような方法は、対象に、抗体、ポリペプチド、もしくはポリヌクレオチド、または医薬組成物を投与することを含む。予防的用途の場合、医薬組成物または医薬品は、眼科疾患を起こしやすいか、さもなければ眼科疾患の危険性がある患者に、危険性を排除または低減する、重症度を軽減する、または疾患の生化学的、組織学的および/または行動的症状、疾患の発生中に現れるその合併症および中間的な病理学的表現型を含む疾患の始まりを遅延するのに十分な量で投与される。治療的用途の場合、組成物または医薬品は、そのような疾患が疑われる、またはそのような疾患にすでに罹患している患者に、疾患の発生におけるその合併症および中間的な病理学的表現型を含む疾患の症状(生化学的、組織学的および/または行動的)を治癒する、または少なくとも部分的に停止するのに十分な量で投与される。
加齢性黄斑変性症の合併症および中間的な病理学的表現型には、厚いびまん性の網膜色素上皮(RPE)下沈着、リップリッチ(lip−rich)ドルーゼン様(drusen−like)沈着、ブルッフ膜の肥厚、RPE萎縮の斑状領域および脈絡膜血管新生が含まれる。
本発明は、対象において網膜変性および/またはその症状の発生を遅延する方法であって、対象に、有効用量の本明細書に記載されている抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法も提供する。
本発明は、対象において網膜機能を回復または保護する方法であって、対象に、有効投与量の本明細書に記載されている抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法も提供する。
本発明は、対象の網膜においてアミロイドプラークを減少させ、および/またはAβ蓄積を低減または遅延する方法であって、対象に、有効投与量の本明細書に記載されている抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法も提供する。
本発明は、対象の網膜においてアミロイドプラークおよび/またはAβ蓄積を除去または一掃する方法であって、対象に、有効投与量の本明細書に記載されている抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法も提供する。一部の実施形態において、アミロイドプラークは、対象の脳内にある。
本発明は、網膜組織においてAβペプチドを減少させ、網膜組織においてAβペプチドの蓄積を阻害および/または低減する方法であって、対象に、有効投与量の本明細書に記載されている抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法も提供する。Aβペプチドは、可溶形態、オリゴマー形態、または沈着形態であってよい。Aβのオリゴマー形態は、2〜50個のAβポリペプチドからなってよく、完全長1〜40と1〜42ペプチドの混合物および/またはこれらのペプチドの任意の切断型バージョンであってよい。
本発明は、眼科疾患において網膜変性を改善または逆転する方法であって、対象に、有効用量の本明細書に記載されている抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法も提供する。
本発明は、網膜変性に伴う疾患を治療または予防する方法であって、対象に、有効用量のβ−アミロイドペプチドまたはβ−アミロイドペプチドの凝集形態と特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を投与することを含み、抗体が、天然に存在するFc領域由来の変異のあるFc領域を含み、その変異が、エフェクター機能障害をもたらし、それによって抗体の投与が、変異のない抗体の投与よりも脳微小出血をあまり引き起こさない方法も提供する。
本明細書に記載されている方法(予防または治療を含む)は、単一または複数部位への単一時点または複数時点での単回直接注射によって行うことができる。投与は、複数部位へほぼ同時であってよい。投与回数は、療法の過程全体で決定および調整することができ、望ましい結果を得ることが基準となる。一部の例において、本発明の抗体(ポリペプチドを含む)、ポリヌクレオチド、および医薬組成物の持続性の連続放出製剤が適切であることがある。持続性放出を実現するための様々な製剤および装置は、当技術分野において知られている。
患者、対象、または個体には、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、およびヒツジ動物などの哺乳類が含まれる。対象は、ヒトであることが好ましく、疾患に罹患していても罹患していなくてもよく、現在、症状を示していても示していなくてもよい。本方法は、対象患者の危険性についていかなる評価もする必要がなく一般的な集団へ予防的に投与することができる。本方法は、加齢性黄斑変性症の知られている遺伝的危険性を有する個体に有用である。そのような個体には、この疾患を経験した親族を有する個体、および遺伝的または生化学的マーカーの分析によって危険性が判定された個体が含まれる。
上記の方法で使用することができる医薬組成物には、本明細書に記載されている抗体、ポリペプチド、および/またはポリヌクレオチドのうちのいずれかが含まれる。一部の実施形態において、抗体は、抗体9TLもしくは6Gまたは表3および8に示すそれらの変異体である。一部の実施形態において、抗体は、Aβペプチドと特異的に結合し、エフェクター機能障害を有する定常領域を含む抗体である。
投与および用量
抗体は、担体、好ましくは薬学的に許容できる担体中で哺乳類に投与されることが好ましい。適当な担体およびそれらの製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、A.Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1990;およびRemington、The Science and Practice of Pharmacy第20版、Mack Publishing、2000に記載されている。通常、製剤化には、適切な量の薬学的に許容できる塩を使用し、製剤を等張性にする。担体の例には、食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液が含まれる。溶液のpHは、約5〜約8であることが好ましく、約7〜約7.5であることがより好ましい。他の担体には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスなどの持続放出調製物が含まれ、マトリクスは、成型品、例えば、フィルム剤、リポソーム剤または微粒子剤の形態である。当業者には明らかであるが、例えば、投与経路および投与されている抗体の濃度に応じて、特定の担体がより好ましいことがある。
抗体は、有効な形態での血流への抗体の送達を保証する、注射により(例えば、全身的な、静脈内の、腹腔内の、皮下の、筋肉内の、門脈内の、脳内の、脳室内の、および鼻腔内の)、または注入などの他の方法により投与することができる。抗体は、摘出組織灌流などの摘出灌流技法によって投与し、局所的な治療効果を発揮することができる。さらに、本発明の抗体は、局所的に、または硝子体内注射、網膜下注射または両側性注射などの注射の形態で眼に投与することができる。眼への化合物の投与に関する他の情報は、Tolentino他、Retina 24(2004)132〜138;Reich他、Molecular vision 9(2003)210〜216に見出すことができる。
抗体を投与するための有効な用量およびスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは、当技術分野の技能の範囲内にある。当業者は、投与しなければならない抗体の用量が、例えば、抗体を受けるはずの哺乳類、投与経路、使用される抗体の特定のタイプおよび哺乳類の投与されている他の薬物に応じて異なることを理解しているであろう。
抗体の適切な投与量を選択する際のガイダンスは、抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies、Ferrone他編、Noges Publications、Park Ridge、N.J.、1985、ch.22および303〜357ページ;Smith他、Antibodies in Human Diagnosis and Therapy、Haber他編、Raven Press、New York、1977、365〜389ページ中に見出される。単独で使用される抗体の典型的な1日用量は、上述の要素に応じて、1日につき体重1kg当たり約1μgから100mg以上まで、またはそれ以上の範囲であろう。一般的に、以下の投与量のうちのいずれかを使用することができ、すなわち、体重1kg当たり少なくとも約50mg、体重1kg当たり少なくとも約10mg、体重1kg当たり少なくとも約3mg、体重1kg当たり少なくとも約1mg、体重1kg当たり少なくとも約750μg、体重1kg当たり少なくとも約500μg、体重1kg当たり少なくとも約250μg、体重1kg当たり少なくとも約100μg、体重1kg当たり少なくとも約50μg、体重1kg当たり少なくとも約10μg、体重1kg当たり少なくとも約1μg、またはそれ以上の投与量が投与される。抗体を、治療の開始時には低めの投与量または少なめの頻度で投与し、一過性の脳のアミロイドアンギオパチー(CAA)などの潜在的副作用を避けることができる。
一部の実施形態において、2種以上の抗体が存在することがある。そのような組成物は、本発明の少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種の異なる抗体(ポリペプチドを含む)を含有することができる。
抗体は、有効量の1種または複数の他の治療薬と組み合わせて哺乳類に投与することができる。抗体は、1種または複数の他の治療薬と順次または同時に投与することができる。抗体および治療薬の量は、例えば、どのタイプの薬物が使用されるか、治療されている病的状態、投与のスケジューリングおよび経路によって異なるが、一般的に、各々が個々に使用される場合よりも少ないであろう。
哺乳類への抗体の投与後、哺乳類の生理学的状態を、当業者によく知られている様々な方法でモニターすることができる。
投与および用量の上記の原則は、本明細書に記載されているポリペプチドに適応させることができる。
本明細書に記載されている抗体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、望ましい細胞における抗体またはポリペプチドの送達および発現に使用することができる。発現ベクターを用いて抗体の直接的な発現を導くことは明らかである。発現ベクターは、全身的に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、皮下に、髄腔内に、脳室内に、経口的に、経腸的に、非経口的に、鼻腔内に、経皮的に、または吸入により投与することができる。例えば、発現ベクターの投与には、注射、経口投与、パーティクルガンもしくはカテーテル投与を含む局所もしくは全身投与、および局所性投与が含まれる。当業者は、in vivoで外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第6,436,908号、第6,413,942号、および第6,376,471号を参照されたい。
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む治療用組成物の標的送達も使用することができる。受容体媒介性DNA送達技法は、例えば、Findeis他、Trends Biotechnol.(1993)11:202;Chiou他、Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff編)(1994);Wu他、J.Biol.Chem.(1988)263:621;Wu他、J.Biol.Chem.(1994)269:542;Zenke他、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)87:3655;Wu他、J.Biol.Chem.(1991)266:338に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコルにおける局所投与の場合、DNA約100ng〜約200mgの範囲で投与される。遺伝子療法プロトコル中は、DNA約500ng〜約50mg、約1μg〜約2mg、約5μg〜約500μg、および約20μg〜約100μgの濃度範囲も使用することができる。本発明の治療用のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源であってよい(一般的には、Jolly、Cancer Gene Therapy(1994)1:51;Kimura、Human Gene Therapy(1994)5:845;Connelly、Human Gene Therapy(1995)1:185;およびKaplitt、Nature Genetics(1994)6:148を参照)。そのようなコーディング配列の発現は、内因性の哺乳類または異種プロモーターを用いて誘発することができる。コーディング配列の発現は、構成的または調節的のどちらかであってよい。
望ましい細胞における望ましいポリヌクレオチドの送達および発現のためのウイルスベースのベクターは、当技術分野においてよく知られている。例示的なウイルスベースのビヒクルには、組み換えレトロウイルス(例えば、PCT公開WO90/07936、WO94/03622、WO93/25698、WO93/25234、WO93/11230、WO93/10218、WO91/02805、米国特許第5,219,740号、第4,777,127号、英国特許第2,200,651号、およびEP0345242を参照)、αウイルスベースのベクター(例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス(ATCC VR−67;ATCC VR−1247)、ロスリバーウイルス(ATCC VR−373;ATCC VR−1246)、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス(ATCC VR−923;ATCC VR−1250;ATCC VR1249;ATCC VR−532)、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(例えば、PCT公開WO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984およびWO95/00655を参照)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
Curiel、Hum.Gene Ther.(1992)3:147に記載されているような死んだアデノウイルスに連結されたDNAの投与も用いることができる。
死んだアデノウイルス単独に連結された、または連結されていないポリカチオン性濃縮DNA(例えば、Curiel、Hum.Gene Ther.(1992)3:147を参照)、リガンド連結型DNA(例えば、Wu、J.Biol.Chem.(1989)264:16985を参照)、真核細胞送達ビヒクル細胞(例えば、米国特許第5,814,482号;PCT公開WO95/07994、WO96/17072、WO95/30763、およびWO97/42338を参照)、および核電荷中和または細胞膜との融合を含むがこれらに限定されない、非ウイルス送達ビヒクルおよび方法も用いることができる。裸のDNAも用いることができる。例示的な裸のDNAの導入方法は、PCT公開WO90/11092および米国特許第5,580,859号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルの役割を果たすことができるリポソームは、米国特許第5,422,120号;PCT公開WO95/13796;WO94/23697;WO91/14445;およびEP0524968に記載されている。追加のアプローチは、Philip、Mol.Cell Biol.(1994)14:2411、およびWoffendin、Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581に記載されている。
キット
本発明は、加齢性黄斑変性症(滲出型と萎縮型の双方)、緑内障、糖尿病性網膜症(糖尿病性黄斑浮腫を含む)、ブルッフ膜における裂傷、近視性変性、眼腫瘍および他の関連する網膜変性疾患などの、本明細書に記載されている眼科疾患を治療するのに有用な材料を含有する製品およびキットも提供する。製品は、ラベル付きの容器を含む。適当な容器には、例えば、瓶、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から製作することができる。容器は、病的な眼の状態を治療するのに、またはAβもしくはβAPPを検出または精製するのに有効である活性剤を有する組成物を保持する。組成物中の活性剤は、抗体であり、AβまたはβAPPに特異的なモノクローナル抗体を含むことが好ましい。一部の実施形態において、活性剤は、抗体9TLもしくは6Gおよびそれらに由来する抗体またはポリペプチドを含む。一部の実施形態において、活性剤は、エフェクター機能障害を有する抗Aβ抗体またはポリペプチドを含む。一部の実施形態において、抗Aβ抗体またはポリペプチドは、重鎖定常領域を含み、定常領域は、エフェクター機能障害を有する。容器上のラベルは、組成物が、AMDなどの病的な眼の状態を治療するのに使用されることを示し、上記に記載されている使用などのin vivo使用またはin vitro使用のどちらかについての使用法を示すこともある。
本発明は、本明細書に記載されている抗体(9TLまたは6Gなど)、ポリペプチド、ポリヌクレオチドのうちのいずれかを含むキットも提供する。一部の実施形態において、本発明のキットは、上記に記載されている容器を含む。他の実施形態において、本発明のキットは、上記に記載されている容器および緩衝液を含む第2の容器を含む。他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、注射器、および本明細書に記載されている任意の方法(AMDを治療するための方法、および脳におけるAβペプチドの蓄積を阻害または低減するための方法)を行うための説明書付きの添付文書を含む、商業的および使用者の立場から望ましい他の材料がさらに含まれることがある。AβまたはβAPPを検出または精製するのに使用すべきキットにおいて、抗体は、通常、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素などの検出可能なマーカーで標識される。
一部の実施形態において、本発明は、医薬品としての使用および/または医薬品を製造するための使用に関連しているかは別にして、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにおいて使用するための組成物(本明細書に記載されている)を提供する。
以下の実施例は、例示のために提供されるのであって、本発明を限定するものではない。
(実施例)
抗体9TLおよびその変異体の結合親和性の決定
A.一般法
以下の一般法を、本実施例で使用した。
クローンの特徴付けに使用される発現ベクター
抗体のFabフラグメントの発現は、Barbas(2001)Phage display:a laboratory manual、Cold Spring Harbor、NY、Cold Spring Harbor Laboratory Press pg2.10.Vector pComb3Xに記載されているプロモーターに類似しているIPTG誘導性lacZプロモーターの制御下としたが、改変には、以下の追加ドメイン、すなわち、ヒトκ軽鎖定常ドメインおよびIgG2aヒト免疫グロブリンのCHI定常ドメイン、Igγ−2鎖C領域、タンパク質アクセッション番号P01859;免疫グロブリンκ軽鎖(ヒト)、タンパク質アクセッション番号CAA09181の付加および発現が含まれていた。
小規模なFab調製
96ウェルプレートにおけるFabの小規模な発現を以下の通り行った。Fabライブラリーを形質移入した大腸菌(E.coli)から出発し、コロニーを採取し、マスタープレート(寒天LB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコース)と作業プレート(2ml/ウェル、LB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコース1.5mLを含有する96ウェル/プレート)の双方に接種した。両プレートを、30℃にて8〜12時間培養した。マスタープレートを4℃にて保存し、作業プレートからの細胞を、5000rpmでペレット化し、LB+アンピシリン(50μg/ml)+1mM IPTG 1mLで再懸濁し、Fabの発現を誘導した。細胞を、30℃にて5時間の発現後に遠心分離により採集し、次いで、緩衝液HBS−P(10mM HEPES緩衝液pH7.4、150mM NaCl、0.005% P20)500μLに再懸濁した。HBS−Pに再懸濁した細胞の溶解は、1サイクルの凍結(−80℃)次いで37℃における解凍によって行った。細胞ライセートを、5000rpmにて30分間遠心分離し、Fabを含有する上清から細胞残屑を分離した。次いで、上清を、BIAcoreプラズモン共鳴装置に注入し、各Fabについての親和性の情報を得た。Fabを発現するクローンを、マスタープレートから取り出し、以下に記載されるような大規模なFabの産生および詳細な特徴付けのためにDNAを配列決定した。
大規模なFab調製
詳細な速度論的パラメーターを得るため、Fabを、大きい培養液から発現および精製した。200mLのLB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコースを含有する三角フラスコに、選択されたFab発現大腸菌(E.coli)クローンからの一夜培養液5mLを接種した。クローンを、1.0のOD550nmが得られるまで30℃にてインキュベートし、次いで、200mLのLB+アンピシリン(50μg/ml)+1mM IPTGに培地を置き換えた。30℃にて5時間の発現後、細胞を遠心分離によりペレット化し、次いで、10mLのPBS(pH8)に再懸濁した。細胞の溶解は、2サイクルの凍結/解凍(それぞれ、−80℃および37℃)によって得られた。細胞ライセートの上清を、PBSで平衡化したNi−NTAスーパーフローセファロース(Qiagen、Valencia.CA)カラム上にロードし、次いで、5カラム体積のPBS、pH8で洗浄した。個々のFabは、PBS(pH8)+300mMイミダゾールで様々な画分に溶出した。Fabを含有する画分をプールし、PBS中で透析し、次いで、親和性の特徴付けに先立ってELISAにより定量化した。
完全抗体(full antibody)の調製
完全抗体の発現のため、重および軽鎖可変領域を哺乳類の発現ベクターにクローン化し、一過性発現のためにHEK293細胞中にリポフェクタミンを用いて形質移入した。抗体を、標準的な方法を用いてタンパク質Aを用いて精製した。
ベクターpDb.9TL.hFc2aは、9TL抗体の重鎖を含む発現ベクターであり、重鎖の一過性または安定発現に適している。ベクターpDb.9TL.hFc2aは、以下の領域、すなわち、マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域(ヌクレオチド1〜612);合成イントロン(ヌクレオチド619〜1507);DHFRコーディング領域(ヌクレオチド707〜1267);ヒト成長ホルモンシグナルペプチド(ヌクレオチド1525〜1602);9TLの重鎖可変領域(ヌクレオチド1603〜1951);以下の突然変異、すなわち、A330P331からS330S331(野生型IgG2a配列に準拠したアミノ酸ナンバリング;Eur.J.Immunol.(1999)29:2613〜2624を参照)を含有するヒト重鎖IgG2a定常領域;SV40遅発性(late)ポリアデニル化シグナル(ヌクレオチド2960〜3203);SV40エンハンサー領域(ヌクレオチド3204〜3449);ファージf1領域(ヌクレオチド3537〜4992)およびβラクタマーゼ(AmpR)コーディング領域(ヌクレオチド4429〜5286)に対応するヌクレオチド配列を有する。ベクターpDb.9TL.hFc2aは、2004年7月20日にATCCに寄託され、ATCCアクセッション番号PTA−6124を割り当てられた。
ベクターpEb.9TL.hKは、9TL抗体の軽鎖を含む発現ベクターであり、軽鎖の一過性発現に適している。ベクターpEb.9TL.hKは、以下の領域、すなわち、マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域(ヌクレオチド1〜612);ヒトEF−1イントロン(ヌクレオチド619〜1142);ヒト成長ホルモンシグナルペプチド(ヌクレオチド1173〜1150);抗体9TL軽鎖可変領域(ヌクレオチド1251〜1593);ヒトκ鎖定常領域(ヌクレオチド1594〜1914);SV40遅発性ポリアデニル化シグナル(ヌクレオチド1932〜2175);SV40エンハンサー領域(ヌクレオチド2176〜2421);ファージf1領域(ヌクレオチド2509〜2964)およびβラクタマーゼ(AmpR)コーディング領域(ヌクレオチド3410〜4258)に対応するヌクレオチド配列を有する。ベクターpEb.9TL.hKは、2004年7月20日にATCCに寄託され、ATCCアクセッション番号PTA−6125を割り当てられた。
Biacoreアッセイ
9TLモノクローナル抗体の親和性は、BIAcore3000(商標)表面プラズモン共鳴(SPR)システム(BIAcore,Inc、Piscaway NJ)を用いて決定した。親和性を決定する一方法は、CM5チップ上に9TLを固定化し、抗体に対するAβ1〜40ペプチドの結合反応速度(binding kinetics)を測定することである。CM5チップを、供給業者の説明書に従ってN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸(EDC)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化した。抗体9TLまたはその変異体を、10mM酢酸ナトリウムpH4.0または5.0中に希釈し、0.005mg/mLの濃度で活性化したチップ上に注入した。個々のチップチャネルにわたる可変フロータイムを用い、一連の抗体密度、すなわち1000〜2000または2000〜3000反応単位(RU)を得た。チップをエタノールアミンでブロックした。再生研究は、2倍量のPIERCE溶出緩衝液および1倍量の4M NaClを含有する溶液が、200回を超える注入についてチップ上の9TLの活性を保ちながら、結合したAβ1〜40ペプチドを効率的に除去することを示した。HBS−EP緩衝液(0.01M HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性剤P20)を、すべてのBIAcoreアッセイのランニングバッファーとして使用した。精製したAβ1〜40合成ペプチド試料の段階希釈液(0.1〜10×推定K)を100μL/minで1分間注入し、10分間の解離時間を置いた。速度論的な会合速度(kon)および解離速度(k0ff)は、BIAevaluationプログラムを用い、1:1ラングミュア結合モデル(Karlsson,R.Roos、H.Fagerstam、L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99〜110)にデータを当てはめることにより同時に得られた。平衡解離定数(K)値は、k0ff/konとして算出した。
代替方法として、親和性は、SAチップ上にAβ1〜40ペプチドを固定化し、固定化されたAβ1〜40ペプチドに対する9TL Fabおよび9TL変異体のFabの結合反応速度を測定することにより決定した。9TLのFabフラグメントおよびその変異体のFabフラグメントの親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR)システム(BIAcore3000(商標)、BIAcore,Inc.、Piscaway NJ)により決定した。SAチップ(ストレプトアビジン)は、供給業者の説明書に従って使用した。ビオチン化Aβペプチド1〜40を、HBS−EP(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% P20)中に希釈し、0.005mg/mLの濃度でチップ上に注入した。個々のチップチャネルにわたる可変フロータイムを用い、抗体密度の2つの範囲、すなわち、詳細な速度論的研究のための10〜200反応単位(RU)ならびに濃度試験およびスクリーニングのための500〜600RUを得た。再生研究は、100mMリン酸(2倍量の50mM NaOHおよび1倍量の70%エタノールを含有する溶液を続けてもよい)が、200回を超える注入についてチップ上のAβペプチドの活性を保ちながら、結合したFabを効率的に除去することを示した。HBS−EP緩衝液を、すべてのBIAcoreアッセイのランニングバッファーとして使用した。精製したFab試料の段階希釈液(0.1〜10×推定K)を100μL/minで2分間注入し、10分間の解離時間を置いた。Fabタンパク質の濃度は、知られている濃度(アミノ酸分析により決定した)の標準Fabを用いるELISAおよび/またはSDS−PAGEにより決定した。速度論的な会合速度(kon)および解離速度(k0ff)は、BIAevaluationプログラムを用い、1:1ラングミュア結合モデル(Karlsson,R.Roos、H.Fagerstam、L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99〜110)にデータを当てはめることにより同時に得られた。平衡解離定数(K)値は、k0ff/konとして算出した。
B.抗体9TLおよびその変異体のAβ1〜40に対する結合親和性
抗体9TLの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図1に示す。上記に記載されているBiacoreの両方法を用いて決定された抗体9TLのAβ1〜40に対する結合親和性を以下の表2に示す。
Figure 0005964004
9TLの変異体のアミノ酸配列を以下の表3に示す。表3に示す変異体のすべてのアミノ酸置換は、9TLの配列と比較して記載されている。9TL変異体のFabフラグメントの結合親和性も表3に示す。Kおよび他の速度論的パラメーターは、SAチップ上に固定化されたAβ1〜40について上記に記載されているBIAcore分析により決定した。
Figure 0005964004
Figure 0005964004
抗体9TLが結合するAβ1〜40ペプチド上のエピトープの特徴付け
抗体9TLによって認識されるAβペプチド上のエピトープを決定するため、表面プラズモン共鳴(SPR、Biacore3000)結合分析を使用した。ビオチン(Global Peptide Services,CO)とカップリングさせたAβ1〜40ポリペプチドを、ストレプトアビジンでコーティングしたチップ(SAチップ)上に固定化した。Aβペプチドの様々な可溶性フラグメント(10μMにて、American Peptide Company Inc.、CA製)の存在下または非存在下での、固定化されたAβ1〜40とのAβ抗体Fabフラグメント(50nMにて)の結合。Aβ1〜40、Aβ1〜42、およびAβ1〜43のアミノ酸配列を表4で以下に示す。抗体9TL FabフラグメントのAβ1〜40との結合に置き換わったAβペプチドは、それぞれAβ28〜40、Aβ1〜40、Aβ33〜40、およびAβ17〜40であった(図2)。したがって、抗体9TLは、Aβ1〜40のC末端ペプチド(33〜40)と結合する。図2に示すように、Aβ1〜28、Aβ28〜42、Aβ22〜35、Aβ1〜16、Aβ1〜43、およびAβ1〜38ペプチドは、抗体9TL Fabフラグメントの結合を阻害せず、抗体9TLは、Aβ1〜40ペプチドのC末端と結合することを示唆した。
さらに、Aβ28〜42およびAβ1〜43ペプチドは、抗体9TLがAβ1〜40と結合するのを阻害しなかったが、それらは、Aβ1〜40の16〜28と結合する対照抗体(抗体2289、この抗体は、米国出願公開第2004/0146512およびWO04/032868に記載されている)とのAβ1〜40の結合を容易に阻害することができた。これらの結果は、抗体9TLが、Aβ1〜42およびAβ1〜43ではなくAβ1〜40と優先的に結合することを示している。
Figure 0005964004
モノクローナル抗体2H6および脱グリコシル化2H6の作製
A.モノクローナル抗体2H6の作製および特徴付け
マウスを、Geerligs HJ他、1989、J.Immunol.Methods 124:95〜102;Kenney JS他、1989、J.Immunol.Methods 121:157〜166;およびWicher K他、1989、Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89:128〜135に記載されているように連続約16週間間隔でアジュバント(1足蹠につき50μl、1匹のマウスにつき計100μl)中のKLHにコンジュゲートしたペプチド(Aβ1〜40のアミノ酸28〜40)25〜100μgで免疫化した。まず、マウスを、CFA(完全フロインドアジュバント)中のペプチド50μgで免疫化した。次に、21日後、マウスを、IFA(不完全フロインドアジュバント)中のペプチド25μgで免疫化した。2回目の免疫化から23日後、3回目の免疫化を、IFA中のペプチド25μgで行った。10日後、ELISAを用いて抗体価をテストした。3回目の免疫化の34日後、4回目の免疫化を、IFA中のペプチド25μgで行った。4回目の免疫化の32日後、最後の追加免疫を100μgの可溶性ペプチドで行った。
免疫化したマウスから脾細胞を取得し、ポリエチレングリコール1500により、10:1の比でNSO骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリッドを、20%ウマ血清および2−オキサロ酢酸/ピルビン酸/インスリン(Sigma)を含有するDMEM中で96ウェルプレート中にプレートアウトし、ヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジン選択を開始した。8日目に、20%ウマ血清を含有するDMEM 100μlをすべてのウェルに加えた。ハイブリッドの上清を、抗体捕捉イムノアッセイを用いることによりスクリーニングした。抗体クラスの決定は、クラス特異的な第2抗体で行った。
モノクローナル抗体産生細胞系の一団を、特徴付けのために選択した。選択された1つの細胞系は、2H6と命名された抗体として産生する。この抗体は、IgG2b重鎖を有すると判定された。
Aβ1〜40に対する抗体2H6の親和性を決定した。モノクローナル抗体2H6は、タンパク質A親和性クロマトグラフィーを用い、ハイブリドーマ培養液の上清から精製した。上清を、pH8まで平衡化した。次いで、上清を、PBSでpH8まで平衡化されたタンパク質AカラムMabSelect(Amersham Biosciences #17−5199−02)にロードした。カラムを、5カラム体積のPBS、pH8で洗浄した。抗体は、50mMクエン酸−リン酸緩衝液、pH3で溶出された。溶出された抗体を、1Mリン酸緩衝液、pH8で中和した。精製抗体を、PBSで透析した。抗体濃度は、マウスmAb標準曲線を用い、SDS−PAGEにより決定した。
2H6 Fabは、Immunopure Fabキット(pierce #44885)を用いて2H6完全抗体のパパインタンパク質分解により調製し、製造者説明書に従ってタンパク質Aクロマトグラフィーに通して流すことにより精製した。濃度は、10D=0.6mg/mlを用いるSDS−PAGEおよびA280により決定した。
2H6モノクローナル抗体の親和性は、BIAcore3000(商標)表面プラズモン共鳴(SPR)システム(BIAcore,INC、Piscaway NJ)を用いて決定した。親和性を決定する一方法は、CM5チップ上に2H6抗体を固定化し、抗体に対するAβ1〜40ペプチドの結合反応速度を測定することである。CM5チップを、供給業者の説明書に従ってN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸(EDC)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化した。2H6モノクローナル抗体を、10mM酢酸ナトリウムpH4.0または5.0中に希釈し、0.005mg/mLの濃度で活性化したチップ上に注入した。個々のチップチャネルにわたる可変フロータイムを用い、一連の抗体密度、すなわち1000〜2000または2000〜3000反応単位(RU)を得た。チップをエタノールアミンでブロックした。再生研究は、Pierce溶出緩衝液(製品番号21004、Pierce Biotechnology、Rockford、IL)と4M NaClの混合物(2:1)が、200回を超える注入についてチップ上の2H6抗体の活性を保ちながら、結合したAβ1〜40ペプチドを効率的に除去することを示した。HBS−EP緩衝液(0.01M HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性剤P20)を、すべてのBIAcoreアッセイのランニングバッファーとして使用した。精製したAβ1〜40合成ペプチド試料の段階希釈液(0.1〜10×推定K)を100μL/minで1分間注入し、10分間の解離時間を置いた。速度論的な会合速度(kon)および解離速度(k0ff)は、BIAevaluationプログラムを用い、1:1ラングミュア結合モデル(Karlsson,R.Roos、H.Fagerstam、L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99〜110)にデータを当てはめることにより同時に得られた。平衡解離定数(K)値は、k0ff/konとして算出した。
代替方法として、親和性は、SAチップ上にAβ1〜40ペプチドを固定化し、固定化されたAβ1〜40ペプチドに対する2H6 Fabの結合反応速度を測定することにより決定した。2H6 Fabフラグメントの親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR)システム(BIAcore3000(商標)、BIAcore,Inc.、Piscaway NJ)により決定した。SAチップ(ストレプトアビジン)は、供給業者の説明書に従って使用した。ビオチン化Aβペプチド1〜40(配列番号15)を、HBS−EP(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% P20)中に希釈し、0.005mg/mLの濃度でチップ上に注入した。個々のチップチャネルにわたる可変フロータイムを用い、抗体密度の2つの範囲、すなわち、詳細な速度論的研究のための10〜200反応単位(RU)および濃度試験のための500〜600RUを得た。再生研究は、Pierce溶出緩衝液と4M NaClの混合物(2:1)が、200回を超える注入についてチップ上のAβペプチドの活性を保ちながら、結合したFabを効率的に除去することを示した。HBS−EP緩衝液を、すべてのBIAcoreアッセイのランニングバッファーとして使用した。精製したFab試料の段階希釈液(0.1〜10×推定K)を100μL/minで2分間注入し、10分間の解離時間を置いた。Fabタンパク質の濃度は、知られている濃度(アミノ酸分析により決定した)の標準Fabを用いるELISAおよび/またはSDS−PAGEにより決定した。速度論的な会合速度(kon)および解離速度(k0ff)は、BIAevaluationプログラムを用い、1:1ラングミュア結合モデル(Karlsson,R.Roos、H.Fagerstam、L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99〜110)にデータを当てはめることにより同時に得られた。平衡解離定数(K)値は、k0ff/konとして算出した。上記に記載されている両方法を用いて決定された2H6抗体の親和性を以下の表5に示す。
Aβ1〜40のアミノ酸28〜40のペプチドと結合するマウス抗体2286の親和性を、上記に記載されているようにテストした。抗体2286は、米国出願第10/683,815号およびPCT/US03/32080に記載されている。
Figure 0005964004
抗体2H6によって認識されるAβポリペプチド上のエピトープを決定するため、表面プラズモン共鳴(SPR、Biacore3000)結合分析を使用した。ビオチン(Global Peptide Services,CO)とカップリングさせたAβ1〜40ポリペプチド(配列番号15)を、ストレプトアビジンでコーティングしたチップ(SAチップ)上に固定化した。Aβペプチドの様々な可溶性フラグメント(16μMにて、American Peptide Company Inc.、CA製)の存在下または非存在下での、固定化されたAβ1〜40とのAβ抗体(100nMにて)の結合。抗体2H6のAβ1〜40との結合に置き換わったAβペプチドは、それぞれAβ17〜40、Aβ33〜40、およびAβ1〜40であった(図3)。したがって、抗体2H6は、Aβ1〜40のC末端ペプチド(33〜40)と結合する。しかしながら、Aβ1〜40のこのC末端ペプチド(33〜40)は、テストした濃度において抗体2286のAβ1〜40との結合に置き換わらなかった。図3に示すように、Aβ1〜38ペプチドは、抗体2H6または抗体2286がAβ1〜40と結合するのを阻害せず、抗体2286と同様に、抗体2H6が結合するエピトープには、Aβ1〜40ペプチドのアミノ酸39および/または40が含まれることを示唆した(図3)。
さらに、Aβ1〜42およびAβ1〜43ペプチドは、抗体2H6がAβ1〜40と結合するのを阻害しなかったが、それらは、Aβ1〜40の16〜28と結合する対照抗体(抗体2289、この抗体は、米国出願第10/683,815号およびPCT/US03/32080に記載されている)とのAβ1〜40の結合を容易に阻害することができた(図3)。これらの結果は、抗体2H6が、Aβ1〜42およびAβ1〜43ではなくAβ1〜40と優先的に結合することを示している。
抗体2H6が結合するβ−アミロイドペプチドの個別アミノ酸残基の関与をさらに評価するため、最後の6個のアミノ酸(Aβ1〜40アミノ酸残基35〜40)の各々が、アラニンによって個別に置き換えられている(アラニンスキャニング突然変異誘発)様々なAβ1〜40変異体を、部位特異的突然変異誘発により作製した。これらのAβ1〜40変異体(表6に示す配列)は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ USA)として大腸菌(E.coli)において発現され、続いて、グルタチオン−アガロースビーズ(Sigma−Aldrich Corp.、St.Louis、MO、USA)上で親和性精製した。対照として、野生型(WT)Aβ1〜40ならびにAβ1〜41、Aβ1〜42、およびAβ1〜43も、GST融合タンパク質として発現させた。次いで、Aβ1〜40、Aβ1〜41、Aβ1〜42、Aβ1〜39ならびに6種の様々な変異体(表6に示すM35A(1〜40)、V36A(1〜40)、G37A(1〜40)、G38A(1〜40)、V39A(1〜40)、V40A(1〜40))を、ELISAアッセイプレート上に固定化し(ウェル当たり0.025μg/μlのGST−ペプチド100μl)、0.3nM以下の段階希釈液中のmAb 2286、2289、および2H6のうちのいずれかと共にインキュベートした(0.3nM mAbを用いたデータを図4に示す)。10回の連続洗浄後、アッセイプレートを、ウェル当たり0.03μg/mlのビオチン結合ヤギ抗マウス(H+L)抗体(Vector Laboratories、ベクター#BA−9200、Burllingame CA、USA)100μlと、続いてウェル当たり0.025μg/mlのHRP結合ストレプトアビジン(Amersham Biosciences Corp.、#RPN4401V、NJ、USA)100μlと共にインキュベートした。プレートの吸光度を450nmにて読み取った。
Figure 0005964004
図4に示すように、Aβのアミノ酸16〜28を対象とするMab2289は、同じ強度ですべての変異体を認識し、プレート上のタンパク質濃度およびタンパク質完全性の内部陽性対照としての役割を果たした。抗体2H6は、図4に示すように、Aβ1〜41、Aβ1〜39またはAβ1〜42を認識しなかった。Aβ1〜40変異体V40A、V39A、G38A、G37A、V36A、およびM35Aは、抗体2H6に対する結合の減少を示し、抗体2H6エピトープが、Aβ1〜40のC末端終末において少なくとも6個のアミノ酸にわたっていることを証明した。VおよびGのAへの突然変異は、極めて保存的であり、タンパク質における重要なコンホメーション変化を生じそうにないため、抗体2H6結合に対するこれらの突然変異の大きな影響は、Aβとの関連で述べたアミノ酸を見分ける抗体の能力に起因している可能性があり、これらのデータは、この抗体に関する極めて高度な特異性を証明した。
2H6および9TLがAβ1〜40との結合について競合するか否かを決定するため、Biacoreアッセイを用いて競合実験を行った。抗体2H6、9TLおよび2289を、CM5チップの異なるチャネル上に固定化した。CM5チップチャネルを、供給業者の説明書に従ってN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸(EDC)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化した。抗体2H6、9TLおよび2289を、各々、10mM酢酸ナトリウムpH4.0中に希釈し、0.005mg/mLの濃度で活性化したチップ上に注入した。抗体密度は、2H6については1625反応単位(RU)、9TLについては4000RU、2289については2200RUとした。各チャネルをエタノールアミンでブロックした。Aβ1〜40ペプチド(150uM)を、チップ上に2分間流した。次いで、0.6uMの抗体2H6(結合の競合についてテストされる)を、チップ上に1分間流した。HBS−EP緩衝液(0.01M HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性剤P20)を、すべてのBIAcoreアッセイのランニングバッファーとして使用した。Aβ1〜40の結合を測定した後、チップのすべてのチャネルを、Pierce溶出緩衝液(製品番号21004、Pierce Biotechnology、Rockford、IL)と4M NaClの混合物(2:1)で6秒間、2回洗浄することにより再生させた。次いで、競合結合を抗体9TLについて、次いで、抗体2289について行った。Aβ1〜40との結合について9TLと2H6の間の競合が観察されたが、9TLと2289または2H6と2289の間に競合は観察されなかった。固定化された抗体とチップ上に流された同じ抗体の間の競合の観察は、陽性対照としての役割を果たした。
B.抗体2H6はAPPと結合しない
2H6がアミロイド前駆体タンパク質(APP)と結合するか否かを決定するため、野生型APPを形質移入した細胞に対する2H6の結合を決定した。293細胞を、野生型ヒトアミロイド前駆体タンパク質をコードするcDNAで形質移入した。形質移入の48時間後、細胞を、モノクローナル抗体抗Aβ1〜16、抗Aβ16〜28または2H6(10%FCSを添加したDMEM中5ug/ml)と共に氷上で45分間インキュベートした。次いで、細胞をPBS中で5分間、3回洗浄し、4%PFAで固定した。細胞を、PBS中で再び3回洗浄し、抗体結合を、蛍光顕微鏡下でJackson Immunoresearch製の二次Cy3結合ヤギ抗マウス抗体(1:500の希釈)で検出した。
抗Aβ1〜16および抗Aβ16〜28抗体は、Aβ中のN末端または中心エピトープを認識し、双方とも、細胞上で発現されるAPP前駆体タンパク質との有意な結合を示した。対照的に、2H6は、APP発現細胞と結合しなかった。
C.脱グリコシル化抗体2H6の作製
脱グリコシル化抗体2H6を作製するため、精製抗体2H6を、20mM Tris−HCl pH8.0中のペプチド−N−グリコシダーゼF(Prozyme、抗体1mg当たり0.05U)と共に37℃にて7日間インキュベートした。脱グリコシル化の完全性は、MALDI−TOF−MSおよびタンパク質ゲル電気泳動により検証した。脱グリコシル化抗体を、タンパク質Aクロマトグラフィーにより精製し、内毒素を、Q−セファロースにより除去した。脱グリコシル化2H6のAβ1〜40との結合親和性を、上記に記載されているBiacoreアッセイを用いてテストし、脱グリコシル化2H6のAβ1〜40との結合親和性は、インタクトな抗体2H6と一致することが判明した。
加齢性黄斑変性症の動物モデルにおける網膜機能の保護および回復における脱グリコシル化抗体2H6(2H6−D)の効果
初期の研究(Malek,G.他、PNAS 102:11900〜5(2005))は、3つの危険因子、すなわち(1)アポリポタンパク質アイソフォームE4(APOE4)遺伝子型、(2)高齢(65週超)および(3)高脂肪およびコレステロールの多い(HF−C)食事の組合せが、ヒトAMDの臨床的特徴に極めて近似した動物モデルを生み出すことを立証した。老齢のAPOE4マウスは、網膜色素上皮(RPE)−色素変化、厚いびまん性のRPE下沈着、脂質の多いドルーゼン様沈着、ブルッフ膜の肥厚、光受容体変性に重なるRPE萎縮の斑状領域および脈絡膜血管新生(CNV)を含む萎縮型と滲出型双方のヒトAMDにおいて観察される形態学的特徴に類似した病理学的変化を発生した。これらの変化は、食事計画とは無関係に対照のヒトAPOE3発現マウスのいずれにおいても検出されないばかりか、幼若APOE4マウスでもいかなる病変も検出されなかった。機能障害は、全視野暗順応網膜電図から識別した。罹患動物は、対照と比較して、aおよびb波振幅の顕著な低下を有していた。重要なことに、これらの組織病理学的および機能的変化は、3つすべての危険因子の存在を必要とした。自然に発生するCNVのこの動物モデルは、ヒト疾患の生理学的に関連する危険因子を初めて組み込むモデルである。
A.実験プロトコル
抗体の投与。高齢の(65週を超える)ヒトApoE4を発現する標的置換(targeted−replacement)マウスを実験に使用した。これらのマウスに存在するAMD様表現型は、以前に開示されている(Malek,G.他、PNAS 102:11900〜5(2005))。8週間の治療試験の場合、65週齢以上のApoE4−トランスジェニックマウスは、4群のうちの1群に割り付けた。第1群(E4−ND)は、普通食で継続的に維持された(n=2)。第2群(E4−HFC−R1)は、高脂肪、コレステロール富化(HF−C)食を8週間給餌された(n=2)。第3群(E4−HFC−R1)は、HF−C食を8週間給餌され、Rinat1(3mg/kg)の腹腔内注射を週に一度受けた(n=5)。第4群(E4−HFC−R2)は、HF−C食を8週間給餌され、Rinat2(3mg/kg)の腹腔内注射を週に一度受けた(n=5)。試験の終了後、群を非盲検化した。Rinat1は、PBSビヒクルであり、Rinat2は、脱グリコシル化抗Aβ抗体2H6(実施例3に記載されているようなマウスモノクローナル抗ヒトAβ28〜40IgG2b「2H6−D」)であった。
in vivo評価。眼底検査を0週目に行い、一方、眼底およびフルオレセイン血管造影を8週目に行った。眼底カメラ(TRC−50EX Retina Camera)を用い、写真を撮った。TOPCON IMAGEnet(商標)システムを用いて画像を捕らえた。フルオレセイン色素(10%フルオレセインナトリウム、約0.1mL/kg)を、血管アクセスポートを介して注入した。色素注入後、動脈相、早期動静脈相およびいくつかの晩期動静脈相を含むいくつかの時点で写真を撮り、新血管新生を評価し、CNV病変に伴うフルオレセインの漏出をモニターした。フルオレセイン血管造影の解釈および分析は、眼科医によって独立に行われた。
全血における総血漿コレステロールレベルを、8週間のHF−C食の投与前後にマウス(5時間絶食した)から集めた。
フルオレセイン血管造影(FA)。1匹の動物、E4−HFC−R2は、血管造影の後期フレームで漏出の可能性を示した。この動物は、網膜電図前であるがFA後に死亡し、組織は回収できなかった。
網膜電図記録。9週目に、網膜電図(ERG)記録を、少なくとも12時間暗順応させた動物から得た。各動物を、ケタミン/キシラジンカクテルで麻酔し、瞳孔を拡大させ、37℃の加温パッド上で動物を安定化した後、一滴の2.5%ヒドロキシプロピルメチルセルロースと一緒に眼に接触して置かれた銀線試験電極を用いてERGトレーシングを記録した。マウスを、明順応刺激装置チャンバーに入れ、動物を、閃光(0.0005から出発し、1000cd−s/mの最大強度を1logステップで減衰させる)に暴露した。a波振幅は、ベースラインからa波トラフまで測定し、b波振幅は、a波トラフからb波ピークまで測定した。
組織学的分析。屠殺日に、マウスの体重を量り、Avertin(体重10gm当たり0.2ml)を過剰投与し、次いで、20mLの食塩水で心臓内灌流した。脳を素早く摘出し、脳の左半分を、組織病理のために新たに調製した10%ホルマリン中で16時間浸漬固定した。30ミクロンのビブラトーム切片を、10%MeOH、1×PBS、および2% H2O2で前処理し、PBSで洗浄し、抗原回復のために88%ギ酸中で1分間インキュベートし、5%正常ヤギ血清(NGS)およびPBSでブロックした。切片を、1%NGS/PBS中のビオチン化4G8一次抗体(β−アミロイドのアミノ酸残基17〜24に対するSignet 4G8モノクローナルマウスヒトIgG2b)の1:1000希釈液と共に一夜インキュベートし、製造者によって記載されているようにABC Vectastain Kit(Vector Labs)を用いて可視化した。
B.結果
脱グリコシル化抗体の投与による網膜機能の回復/保護
図5に示すように、高脂肪およびコレステロールの多い食事(E4−HFC)を給餌されたApoE4マウスでは、普通食(E4−ND)を与えられたマウスに比べて、aおよびb波振幅に統計的に有意な低下がある(a波 p=0.0106、b波 p=0.008)。注射された動物から得られたERGを、我々のERGのベースラインセットと比較した。E4−HFCと比較して、注射された群のどちら(E4−HFC−R1およびE4−HFC−R2)にもa波振幅に有意差はなかった(図示せず)。対照的に、b波振幅は、E4−HFC−R2群における網膜機能の顕著な回復および/または保護を示している(図6)。
抗Aβ抗体2H6−Dを注射したHF−C食を与えられたAPOE4マウスにおけるAβ沈着物の減少。図7に例示するように、E4−HFCマウスにおける全Aβ免疫染色は、対照ビヒクル群と比較して、抗体2H6−Dによる8週間の免疫療法後に減少した。
C.結論
上記のデータは、1)抗Aβ抗体2H6−Dを注射したマウスのERGによって証明されるような網膜機能の回復/保護および2)未治療AMDマウス群と比較して、マウス脳における抗体2H6−Dで治療した場合のアミロイド沈着の減少を証明している。
抗体6Gおよびその変異体の結合親和性の決定
A.一般法
以下の一般法を、本実施例および他の実施例で使用した。
クローンの特徴付けに使用される発現ベクター
抗体のFabフラグメントの発現は、Barbas(2001)Phage display:a laboratory manual、Cold Spring Harbor、NY、Cold Spring Harbor Laboratory Press pg2.10.Vector pComb3Xに記載されているプロモーターに類似しているIPTG誘導性lacZプロモーターの制御下としたが、改変には、以下の追加ドメイン、すなわち、ヒトκ軽鎖定常ドメインおよびIgG2aヒト免疫グロブリンのCHI定常ドメイン、Igγ−2鎖C領域、タンパク質アクセッション番号P01859;免疫グロブリンκ軽鎖(ヒト)、タンパク質アクセッション番号CAA09181の付加および発現が含まれていた。
小規模なFab調製
96ウェルプレートにおけるFabの小規模な発現を以下の通り行った。Fabライブラリーを形質移入した大腸菌(E.coli)から出発し、コロニーを採取し、マスタープレート(寒天LB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコース)と作業プレート(2ml/ウェル、LB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコース1.5mLを含有する96ウェル/プレート)の双方に接種した。両プレートを、30℃にて8〜12時間培養した。マスタープレートを4℃にて保存し、作業プレートからの細胞を、5000rpmでペレット化し、LB+アンピシリン(50μg/ml)+1mM IPTG 1mLで再懸濁し、Fabの発現を誘導した。細胞を、30℃にて5時間の発現後に遠心分離により採集し、次いで、緩衝液HBS−EP(100mM HEPES緩衝液pH7.4、150mM NaCl、0.005% P20)500μLに再懸濁した。HBS−Pに再懸濁した細胞の溶解は、1サイクルの凍結(−80℃)次いで37℃における解凍によって行った。細胞ライセートを、5000rpmにて30分間遠心分離し、Fabを含有する上清から細胞残屑を分離した。次いで、上清を、BIAcoreプラズモン共鳴装置に注入し、各Fabについての親和性の情報を得た。Fabを発現するクローンを、マスタープレートから取り出し、以下に記載するような大規模なFabの産生および詳細な特徴付けのためにDNAを配列決定した。
大規模なFab調製
詳細な速度論的パラメーターを得るため、Fabを、大きい培養液から発現および精製した。200mLのLB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコースを含有する三角フラスコに、選択されたFab発現大腸菌(E.coli)クローンからの一夜培養液5mLを接種した。クローンを、1.0のOD550nmが得られるまで30℃にてインキュベートし、次いで、200mlのLB+アンピシリン(50μg/ml)+1mM IPTGに培地を置き換えた。30℃にて5時間の発現後、細胞を遠心分離によりペレット化し、次いで、10mLのPBS(pH8)に再懸濁した。細胞の溶解は、2サイクルの凍結/解凍(それぞれ、−80℃および37℃)によって得られた。細胞ライセートの上清を、PBS、pH8で平衡化したNi−NTAスーパーフローセファロース(Qiagen、Valencia.CA)カラム上にロードし、次いで、5カラム体積のPBS、pH8で洗浄した。個々のFabは、PBS(pH8)+300mMイミダゾールで様々な画分に溶出した。Fabを含有する画分をプールし、PBS中で透析し、次いで、親和性の特徴付けに先立ってELISAにより定量化した。
完全抗体の調製
完全抗体の発現のため、重および軽鎖可変領域を哺乳類の発現ベクターにクローン化し、一過性発現のためにHEK293細胞中にリポフェクタミンを用いて形質移入した。抗体を、標準的な方法を用いてタンパク質Aを用いて精製した。
ベクターpDb.6G.hFc2aは、6G抗体の重鎖を含む発現ベクターであり、重鎖の一過性または安定発現に適している。ベクターpDb.6G.hFc2aは、以下の領域、すなわち、マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域(ヌクレオチド1〜612);合成イントロン(ヌクレオチド619〜1507);DHFRコーディング領域(ヌクレオチド707〜1267);ヒト成長ホルモンシグナルペプチド(ヌクレオチド1525〜1602);6Gの重鎖可変領域;以下の突然変異、すなわち、A330P331からS330S331(野生型IgG2a配列に準拠したアミノ酸ナンバリング;Eur.J.Immunol.(1999)29:2613〜2624を参照)を含有するヒト重鎖IgG2a定常領域;SV40遅発性ポリアデニル化シグナル;SV40エンハンサー領域;ファージf1領域およびβラクタマーゼ(AmpR)コーディング領域に対応するヌクレオチド配列を有する。
ベクターpEb.6G.hKは、6G抗体の軽鎖を含む発現ベクターであり、軽鎖の一過性発現に適している。ベクターpEb.6G.hKは、以下の領域、すなわち、マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域(ヌクレオチド1〜612);ヒトEF−1イントロン(ヌクレオチド619〜1142);ヒト成長ホルモンシグナルペプチド(ヌクレオチド1173〜1150);抗体6G軽鎖可変領域;ヒトκ鎖定常領域;SV40遅発性ポリアデニル化シグナル;SV40エンハンサー領域;ファージf1領域およびβラクタマーゼ(AmpR)コーディング領域に対応するヌクレオチド配列を有する。
Biacoreアッセイ
6Gモノクローナル抗体の親和性は、上記の実施例1に記載されている方法を用い、BIAcore3000(商標)表面プラズモン共鳴(SPR)システム(BIAcore,INC、Piscaway NJ)を用いて決定した。
ELISAアッセイ
ELISAを、抗体6Gおよび変異体の非ビオチン化Aβペプチドとの結合を測定するために使用した。NUNCmaxisorpプレートを、4℃にて1時間超、PBSpH7.4中の2.5ug/mlのAβペプチドでコーティングした。プレートを、PBS緩衝液pH7.4中の1%BSAでブロックした。一次抗体(細胞上清、望ましい希釈で抗Aβ抗体、または精製完全抗体もしくはFabを含有する血清から)を、固定化したAβペプチドと共に室温にて1時間インキュベートした。洗浄した後、プレートを、1:5000希釈にて二次抗体、HRP結合ヤギ抗ヒトκ鎖抗体(MP Biomedicals、55233)と共にインキュベートした。洗浄した後、結合している二次抗体を、TMB基質(KPL、50−76−02、50−65−02)を加えることにより測定した。HRP反応を、1Mリン酸を加えることにより停止させ、450nmにおける吸光度を測定した。
ELISAを、抗体6Gおよび変異体のビオチン化Aβペプチドとの結合を測定するために使用した。NUNCmaxisorpプレートを、4℃にて1時間超、PBSpH7.4中の6ug/mlのストレプトアビジン(Pierce、21122)でコーティングした。プレートを、PBS緩衝液pH7.4中の1%BSAでブロックした。洗浄した後、PBS pH7.4中のビオチン化Aβペプチドを室温にて1時間インキュベートした。一次抗体(細胞上清、望ましい希釈で抗Aβ抗体、または精製完全抗体もしくはFabを含有する血清から)を、固定化したAβペプチドと共に室温にて1時間インキュベートした。洗浄した後、プレートを、1:5000希釈にて二次抗体、HRP結合ヤギ抗ヒトκ鎖抗体(MP Biomedicals、55233)と共にインキュベートした。洗浄した後、結合している二次抗体を、TMB基質(KPL、50−76−02、50−65−02)を加えることにより測定した。HRP反応を、1Mリン酸を加えることにより停止させ、450nmにおける吸光度を測定した。
B.抗体6Gおよびその変異体のAβ1〜40、Aβ1〜42および他のAβペプチドに対する結合親和性
抗体6Gの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図8に示す。上記に記載されているBiacoreを用いて決定された6G抗体のAβ1〜40、Aβ1〜42およびAβ22〜37に対する結合親和性を以下の表7に示す。
Figure 0005964004
6Gの変異体のアミノ酸配列を以下の表8に示す。表8に示す変異体のすべてのアミノ酸置換は、6Gの配列と比較して記載されている。6G変異体の相対的結合も表8に示す。結合は、ELISAプレートの表面上に固定化された非ビオチン化Aβ1〜40またはAβ1〜42について上記に記載されているELISAにより決定した。
Figure 0005964004
Figure 0005964004
抗体6Gが結合するAβペプチド上のエピトープの特徴付け
抗体6Gによって認識されるAβペプチド上のエピトープを決定するため、ELISA結合分析を使用した。様々なAβペプチド(Global Peptide Services,CO)をELISAプレート上に固定化した。6G完全抗体(20nMにて)の固定化されたAβとの結合を、上記に記載されているようなELISAにより決定した。Aβ1〜40、Aβ1〜42、およびAβ1〜43のアミノ酸配列を以下の表9に示す。図9に示すように、抗体6Gは、Aβペプチド17〜40、17〜42、22〜35、28〜40、1〜38、1〜40、1〜42、1〜43、および28〜42と結合するが、28〜42との結合は、他のAβペプチドよりもかなり弱い。抗体6Gは、Aβペプチド1〜16、1〜28および33〜40とは結合しなかった。したがって、抗体6Gは、様々な切断型Aβペプチド、例えば、22〜35、1〜38、1〜40、1〜42、および1〜43のC末端と結合する。
以下の表9は、Biacoreアッセイを用いてkoff(1/s)によって測定される6GのAβ1〜40または他のAβペプチドに対する結合親和性の比較を示している。抗体6Gは、他のペプチドと比較して最も高い親和性でAβ1〜40と結合し、切断型Aβ1〜40(1〜36、1〜37、1〜38、および1〜39など)、Aβ1〜42およびAβ1〜43との親和性は有意に低めである。これは、Aβのアミノ酸40(バリン)の側鎖または骨格が、6GのAβ1〜40との結合に関与しており、結合は、このアミノ酸が存在しないと著しく減少する(例えば、親和性の約10から約50〜250倍の消失)ことを示している。カルボキシ末端がアミド化されたAβ1〜40との低めの親和性での結合は、6GのAβ1〜40との結合が、Aβ1〜40の遊離C末端を必要とするが、依存していないことを示している。Aβ1〜42およびAβ1〜43に対する低めの親和性結合は、単量体形態のAβ1〜40とAβ1〜42またはAβ1〜43の間のコンホメーションの差に起因するのかもしれない。Aβ1〜42の単量体は、溶液中のAβ1〜40単量体と異なるコンホメーションを有することが分かっている。アクセッション番号1IYTによりProtein Data Bank(pdbファイル)に示されるAβ1〜42についての単量体構造座標、およびアクセッション番号1BA6および1BA4によりProtein Data Bank(pdbファイル)に示されるAβ1〜40についての単量体構造座標を参照されたい。
Figure 0005964004
抗体6Gのエピトープマッピングを、ELISAアッセイにより行った。様々なAβペプチドのビオチン化15量体または10量体(これらのペプチドは、C末端に付加されたグリシンを有する)を、ストレプトアビジンをコーティングしたプレート上に固定化した。抗体6G(2.5ug/ml〜10ug/ml)を、固定化されたペプチドと共にインキュベートし、結合を、上記に記載されているように測定した。図10に示すように、抗体6Gは、C末端にグリシンのあるアミノ酸20〜34、21〜35、22〜36、23〜37、24〜38、25〜39および25〜34のAβペプチドと結合したが、これらのペプチドのC末端にグリシンを有するアミノ酸19〜33、26〜40、27〜41、24〜33、および26〜35のAβペプチドとは結合しない。これは、抗体6Gが結合するエピトープには、アミノ酸25〜34が含まれることを示唆している。
上記に示すデータに基づき、抗体6Gが結合する抗体には、アミノ酸25〜34および40が含まれるようである。図11は、抗体6Gのエピトープを示す略図である。
B.抗体6Gは、APPと結合しない
6Gがアミロイド前駆体タンパク質(APP)と結合するか否かを決定するため、野生型APPを形質移入した細胞に対する6Gの結合を決定した。HEK293細胞を、野生型ヒトアミロイド前駆体タンパク質をコードするcDNAで形質移入した。形質移入の48時間後、細胞を、モノクローナル抗体抗Aβ1〜16、(m2324)または6G(10%FCSを添加したDMEM中5ug/ml)と共に氷上で45分間インキュベートした。次いで、細胞をPBS中で5分間、3回洗浄し、4%PFAで固定した。細胞を、PBS中で再び3回洗浄し、抗体結合を、蛍光顕微鏡下でJackson Immunoresearch製の二次Cy3結合ヤギ抗マウス抗体(1:500の希釈)で検出した。
図12に示すように、Aβ中のN末端エピトープを認識する抗Aβ1〜16抗体は、細胞上で発現されるAPP前駆体タンパク質との有意な結合を示した。対照的に、6Gは、APP発現細胞と結合しなかった。
マウス抗体7G10(抗Aβ1〜42/Aβ1〜43)の製造および特徴付け
マウスを、Konig,G.他、Annals New York Academy of Sciences.777:344〜55(1996)に記載されているようにアジュバント中のKLHにコンジュゲートされたペプチド約100μgで免疫化した。BA4ペプチドの29〜42位は、APPの推定膜貫通領域内に完全にあり、性質が疎水性であるため、KLHペプチドを、親水性スペーサーとコンジュゲートさせた。KLH−HDGDGD−MVGGVVIAを、Anaspecにおいて合成した。5残基スペーサーは、不溶性の問題を克服し、担体から離れてC末端を延長するのに十分であった。1日目に、マウスを、皮下で、CFA(完全フロインドアジュバント)と共に35〜42/KLHペプチド100μgで免疫化した。15日目に、マウスを、100μgのペプチド/KLH Ribi/ミョウバンで免疫化した。55日目に、マウスを、15日目と同様に免疫化した。95日目に、マウスを、静脈内で100μgのペプチド/KLHで追加免疫した。
免疫化したマウスから脾細胞を取得し、99日目に、ポリエチレングリコール1500により10:1の比で、P3×63Ag8.653骨髄腫細胞、ATCC CRL1580と融合させた。融合細胞を、20%ウマ血清および2−オキサロ酢酸/ピルビン酸/インスリン(Sigma)を含有するDMEM中で96ウェルプレート中にプレートし、上清を、融合後10日目から出発し、Elisaアッセイを用い、2ug/mlのAβ1〜42(Anaspec)でコーティングしてアッセイした。陽性を選択して拡大し、さらに特徴付けした。
融合の日のマウス血清力価は、Aβ1〜42を含まないペプチドについてテストした場合、1/9000であった。7G10のAβ1〜40、1〜42、および1〜43に対する結合親和性を、Biacoreにより分析した。
Biacoreアッセイ
7G10抗体の親和性を、実施例1にすでに記載されているようなBIAcore3000(登録商標)を用いて決定した。N−ビオチン化Aβ1〜40、1〜42、および1〜43を、SAチップ上に捕捉した。抗Aβ1〜40Fab、抗Aβ1〜42Fab、および抗Aβ1〜43Fabの3倍希釈シリーズをそれぞれ、上記に列挙されている7G10ストックの1/6希釈から出発して注入した。チップは、6%EtOH+6mM NaOHの18秒パルスで再生した。
Figure 0005964004
上記に示すように、7G10は、Aβ1〜42ペプチドに対して37.6nMのKおよびAβ1〜43ペプチドに対して41nMのKを有していた。Aβ1〜40ペプチドに対しては測定可能な結合は検出されなかった。
加齢性黄斑変性症の動物モデルにおける網膜機能の保護および回復における抗体9TL、6Gおよび7G10の比較効果
A.実験プロトコル
抗体の投与。上記の実施例4に記載されているようなプロトコルを繰り返した。65週齢以上のApoE4−トランスジェニックマウスは、8週間、5群のうちの1群に割り付けた。第1群(E4−ND)は、普通食で継続的に維持された(n=6)。第2群(E4−HFC−R1)は、高脂肪、コレステロール富化(HF−C)食を8週間給餌された(n=12)。第3群(E4−HFC−R1)は、HF−C食を8週間給餌され、Rinat3(3mg/kg)の腹腔内注射を週に一度受けた(n=12)。第4群(E4−HFC−R2)は、HF−C食を8週間給餌され、Rinat4(3mg/kg)の腹腔内注射を週に一度受けた(n=12)。第5群(E4−HFC−R)は、HF−C食を8週間給餌され、Rinat5(3mg/kg)の腹腔内注射を週に一度受けた(n=12)。試験の終了後、群を非盲検化した。Rinat3は、7G10であり、Rinat4は、脱グリコシル化抗Aβ抗体2H6であり、Rinat5は、6Gであった。
眼底検査およびフルオレセイン血管造影を、上記の実施例4にすでに記載されているように行った。ERG記録を、上記の実施例4にすでに記載されているように8週目の後に得た。
結果
脱グリコシル化抗体の投与による網膜機能の回復/保護
図13に示すように、b波振幅は、2H6(E4−HFC抗Aβ1〜40).A.で治療した群における網膜機能の有意な回復および/または保護を裏付けた。b波振幅は、7G10(E4−HFC抗Aβ1〜42/Aβ1〜43)で治療した群に回復がほとんどないか、まったくないことを示している。驚いたことに、b波振幅は、6G(E4−HFC抗Aβ1〜40/Aβ1〜42)で治療した群における網膜機能のさらに大きな回復および/または保護を示している。図14に示すように、6Gで治療した群のb波振幅は、正常マウスの対照群に匹敵し、網膜機能の完全な回復および/または保護を示していた。
結論
上記のデータは、1)RPE下アミロイドが、AMDにおいて病原性および/または毒性であること、2)抗Aβ抗体2H6−Dを注射したマウスのERGによって証明された網膜機能の有意な回復/保護、および3)二重特異性抗Aβ1〜40/Aβ1〜426Gを注射したマウスのERGによって証明された網膜機能の完全な回復および/または保護を示している。
当然のことながら、本明細書に記載されている実施例および実施形態は、例示目的のために過ぎず、それらを踏まえた様々な改変形態または変更形態が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内に含まれるべきである。本明細書に引用されているすべての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許および特許出願が参照により組み込まれるように具体的および個別的に指示されている場合と同程度に、すべての目的から参照により全体として本明細書に組み込まれるものとする。
生物学的材料の寄託
以下の材料は、American Type Culture Collection、10801 University Boulevard、Manassas、Virginia20110―2209、USA(ATCC)に寄託された。
Figure 0005964004
ベクターpEb.9TL.hKは、9TL軽鎖可変領域および軽鎖κ定常領域をコードするポリヌクレオチドであり、ベクターpDb.9TL.hFc2aは、9TL重鎖可変領域および以下の突然変異、すなわち、A330P331からS330S331(野生型IgG2a配列に準拠したアミノ酸ナンバリング;Eur.J.Immunol.(1999)29:2613〜2624を参照)を含有する重鎖IgG2a定常領域をコードするポリヌクレオチドである。
ベクターpEb.6G.hKは、6G軽鎖可変領域および軽鎖κ定常領域をコードするポリヌクレオチドであり、ベクターpDb.6G.hFc2aは、6G重鎖可変領域および以下の突然変異、すなわち、A330P331からS330S331(野生型IgG2a配列に準拠したアミノ酸ナンバリング;Eur.J.Immunol.(1999)29:2613〜2624を参照)を含有する重鎖IgG2a定常領域をコードするポリヌクレオチドである。
これらの寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約およびその規則(the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder)(ブダペスト条約)の規定の下で行われた。これは、寄託日から30年間、寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物は、当該米国特許の発行または任意の米国もしくは外国の特許出願の一般人への公開のうちどちらか早い方が行われたならば、一般人に対する寄託物の培養物の子孫の永久的および無制限の入手可能性を保証し、米国特許商標庁長官によって35USC Section122およびそれに準じる長官規則(特に886OG638に関連して37CFR Section1.14を含む)に従って資格があると判断された者に対する子孫の入手可能性を保証するブダペスト条約の条項の下で、およびRinat Neuroscience Corp.とATCCの間の合意に従ってATCCにより入手可能とされるであろう。
本出願の譲受人は、万一、寄託した材料の培養物が、適当な条件下で培養された場合に、死滅するか、または紛失もしくは破壊された場合、通知があり次第、材料をその別のものと即座に取り替えることに同意した。寄託された材料の入手可能性は、任意の政府の権限下でその特許法に従って付与された権利に違反して本発明を実施するためのライセンスであると解釈されるべきではない。
抗体配列
9TL重鎖可変領域アミノ酸配列(配列番号1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPATGNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLYSLPVYWGQGTTVTVSS
9TL軽鎖可変領域アミノ酸配列(配列番号2)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQISRLDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHYPVLFGQGTRLEIKRT
9TL CDR H1(拡大CDR)(配列番号3)
GYYTEAYYIH
9TL CDR H2(拡大CDR)(配列番号4)
RIDPATGNTKYAPRLQD
9TL CDR H3(拡大CDR)(配列番号5)
LYSLPVY
9TL CDR L1(拡大CDR)(配列番号6)
KSSQSLLYSDAKTYLN
9TL CDR L2(拡大CDR)(配列番号7)
QISRLDP
9TL CDR L3(拡大CDR)(配列番号8)
LQGTHYPVL
9TL重鎖可変領域ヌクレオチド配列(配列番号9)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAAGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACGGAGGCTTACTATATCCACTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATTGATCCTGCGACTGGTAATACTAAATATGCCCCGAGGTTACAGGACCGGGTGACCATGACTCGCGATACCTCCACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCCTCCCTTTATAGTCTCCCTGTCTACTGGGGCCAGGGTACCACTGTTACCGTGTCCTCT
9TL軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(配列番号10)
GATGTTGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCTTTGCCAGTTACCCTGGGACAACCAGCCTCCATATCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGCCAAGACATATTTGAATTGGTTCCAACAGAGGCCTGGCCAGTCTCCACGCCGCCTAATCTATCAGATTTCCCGGCTGGACCCTGGCGTGCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTGGGAGTTTATTACTGCTTACAAGGTACACATTATCCGGTGCTCTTCGGTCAAGGGACCCGCCTGGAGATCAAACGCACT
9TL重鎖完全抗体アミノ酸配列(本明細書に記載されているような改変IgG2aを含む)(配列番号11)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPATGNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLYSLPVYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
9TL軽鎖完全抗体アミノ酸配列(配列番号12)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQISRLDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHYPVLFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
9TL重鎖完全抗体ヌクレオチド配列(本明細書に記載されているような改変IgG2aを含む)(配列番号13)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAAGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACGGAGGCTTACTATATCCACTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATTGATCCTGCGACTGGTAATACTAAATATGCCCCGAGGTTACAGGACCGGGTGACCATGACTCGCGATACCTCCACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCCTCCCTTTATAGTCTCCCTGTCTACTGGGGCCAGGGTACCACTGTTACCGTGTCCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAATTCTAGA
9TL軽鎖完全抗体ヌクレオチド配列(配列番号14)
GATGTTGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCTTTGCCAGTTACCCTGGGACAACCAGCCTCCATATCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGCCAAGACATATTTGAATTGGTTCCAACAGAGGCCTGGCCAGTCTCCACGCCGCCTAATCTATCAGATTTCCCGGCTGGACCCTGGCGTGCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTGGGAGTTTATTACTGCTTACAAGGTACACATTATCCGGTGCTCTTCGGTCAAGGGACCCGCCTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAATTCTAG
6G重鎖可変領域アミノ酸配列(配列番号26)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQGLEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLVTVS
6G軽鎖可変領域アミノ酸配列(配列番号27)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQPPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTV
6G CDR H1(拡大CDR)(配列番号28)
GYTFTTYAIH
6G CDR H2(拡大CDR)(配列番号29)
FTSPYSGVSNYNQKFKG
6G CDR H3(拡大CDR)(配列番号30)
FDNYDRGYVRDY
6G CDR L1(拡大CDR)(配列番号31)
RASESVDNDRISFLN
6G CDR L2(拡大CDR)(配列番号32)
AATKQGT
6G CDR L3(拡大CDR)(配列番号33)
QQSKEFPWS
6G重鎖可変領域ヌクレオチド配列(配列番号34)
CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTTACCACCTATGCCATCCATTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCGGGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGACACCTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCGCCGTGTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCC
6G軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(配列番号35)
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGATCGTATTTCCTTTCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCCACCAAACAGGGTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTTGGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGTG
6G重鎖完全抗体アミノ酸配列(本明細書に記載されているような改変IgG2aを含む)(配列番号36)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQGLEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6G軽鎖完全抗体アミノ酸配列(配列番号37)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQPPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
6G重鎖完全抗体ヌクレオチド配列(本明細書に記載されているような改変IgG2aを含む)(配列番号38)
CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTTACCACCTATGCCATCCATTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCGGGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGACACCTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCGCCGTGTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAG
6G軽鎖完全抗体ヌクレオチド配列(配列番号39)
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGATCGTATTTCCTTTCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCCACCAAACAGGGTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTTGGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGC
m7G10重鎖アミノ酸配列(配列番号40)
EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWIRQTPEKRLEWVASIG

NSSRTYYPDSVKGRFTISRDNAGSILYLQMSSLRSEDTAIYYCARGEDGNYAWFT

YWGQGTQVTVS
m7G10軽鎖アミノ酸配列(配列番号41)
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSVKNNLHWYQQKSHESPRLLIKYTFQS

MSGIPSRFSGSGSGTDFTLIINSVETEDFGMYFCQQSNRWPLTFGAGTKLEL
m7G10 H1 CDRアミノ酸配列(配列番号42)
TYAMS
m7G10 H2 CDRアミノ酸配列(配列番号43)
SIGNSSRTYYPDSVKG
m7G10 H3 CDRアミノ酸配列(配列番号44)
GEDGNYAWFTY
m7G10 L1アミノ酸配列(配列番号45)
RASQSVKNNLH
m7G10 L2アミノ酸配列(配列番号46)
YTFQSMS
m7G10 L3アミノ酸配列(配列番号47)
QQSNRWPLT
m7G10HC重鎖ヌクレオチド配列(配列番号48)
GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGCCATGTCTTGGATTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCCTCCATTGGTAATAGTAGTAGGACTTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCGGGAGCATCCTGTACCTCCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATTTATTATTGTGCAAGAGGGGAAGATGGTAACTACGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACTCAGGTCACCGTCTCC
m7G10HC軽鎖ヌクレオチド配列(配列番号49)
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTGTTAAGAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAGTCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATACTTTCCAGTCCATGTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCAGGGACAGATTTCACTCTCATTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACCGTTGGCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTG
9TL抗体の重鎖可変領域(配列番号1)および軽鎖可変領域(配列番号2)のアミノ酸配列を示す図である。Kabat CDRは、太字テキストで表され、Chothia CDRには下線が引かれている。重鎖および軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、連続的に番号付けされている。 ペプチド競合による抗体9TLのエピトープマッピングを示す図である。Aβ1〜40ペプチドを、SAチップ上に固定化した。モノクローナル抗体2289および9TL Fabフラグメント(各50nM)の各々を、10μMの様々なペプチド(Aβのアミノ酸28〜40、1〜40、1〜28、28〜42、22〜35、1〜16、1〜43、33〜40、1〜38、または17〜40)と共に、またはペプチドなしに1時間プレインキュベートし、次いで、チップ上に流した。抗体Fabフラグメントの固定化Aβ1〜40ペプチドとの結合を測定した。 ペプチド競合による抗体2H6のエピトープマッピングを示すグラフを示す図である。Aβ1〜40ペプチドを、SAチップ上に固定化した。モノクローナル抗体2289、2286、または2H6(各100nM)の各々を、16μMの様々なペプチド(Aβのアミノ酸1〜16、1〜28、1〜38、1〜40、1〜42、1〜43、17〜40、17〜42、22〜35、25〜35、または33〜40)と共に、またはペプチドなしに1時間プレインキュベートし、チップ上に流した。抗体の固定化Aβ1〜40ペプチドとの結合を測定した。 抗体2H6、2286、および2289の様々なAβペプチドC末端変異体との結合を示すグラフを示す図である。GST−Aβ変異体(M35A、V36A、G37A、G38A、V39A、またはV40A)、またはGST−Aβペプチド1〜39、1〜41、1〜40、1〜42を、ELISAプレート上に固定化した。モノクローナル抗体2286、2H6、または2289(各mAb0.3nM)を、固体化ペプチドの各々と共にインキュベートし、それらの結合を、ビオチン化抗マウスIgG(H+L)と、続いてストレプトアビジン−HRPと共にさらにインキュベートすることにより検出した。 普通食に対し高脂肪食および高コレステロール食を与えられた高齢のアポリポタンパク質アイソフォームE4(APOE4)マウスからのaおよびb波の強度(A)ならびにサンプル網膜電図(B)のグラフを示す図である。 普通食動物の前試験に対してプロットされたAPOE4マウスのb波のみの強度のグラフを示す図である。R2トレースは、AMD様マウス(E4−HFC−R2)を抗Aβ抗体で治療した場合の網膜機能の保護または回復を示している。 AMD様(APOE4)マウス脳の全Aβ免疫組織化学を示す図である。スライドA(抗Aβ抗体で治療されたAMD様マウス)は、陰性のアミロイド検出を示している。スライドB、C、およびD(ビヒクル注射で治療されたAMD様マウス)は、陽性のアミロイド検出を示している。スライドEは、陽性対照から採取され、血小板由来APPマウスモデル(pdAPP、血小板由来増殖因子プロモーターの制御下の突然変異(V717F)ヒトAPP(Games,D.他 Nature 373:523〜527(1995))の脳から採取される。 6G抗体の重鎖可変領域(配列番号1)および軽鎖可変領域(配列番号27)のアミノ酸配列を示す図である。Kabat CDRは、太字テキストで表され、Chothia CDRには下線が引かれている。重鎖および軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、連続的に番号付けされている。 ELISAによる抗体6Gのエピトープマッピングを示す図である。Aβペプチド(1〜16、1〜28、17〜40、17〜42、22〜35、28〜40、28〜42、1〜38、1〜40、1〜42、1〜43、および33〜40)を、ELISAプレート上に固定化した。モノクローナル抗体6G(20nM)を、様々な固定化ペプチドと共に1時間インキュベートした。固定化Aβペプチドと結合した抗体6Gを、ヤギ抗ヒトκHRP結合二次抗体を用いて測定した。 ELISAによる抗体6Gのエピトープマッピングを示す図である。様々なAβペプチドを、ELISAプレート上に固定化した。抗体6Gを、様々な固定化ペプチドと共に1時間インキュベートした。固定化Aβペプチドと結合した抗体6Gを、ヤギ抗ヒトκHRP結合二次抗体を用いて測定した。「NB」は、結合が検出されないことを指す。 抗体6GがAβ上に結合するエピトープを示す略図を示す図である。細胞膜におけるアミロイド前駆体タンパク質(APP)おおびAPPの部分におけるAβの相対位置を示す。「CT99」は、APPのC末端99アミノ酸を指す。 Aβ1〜16(m2324)を対象とするモノクローナル抗体および抗体6GによるAPP発現細胞の免疫染色を示す写真を示す図である。一番上のパネルは、細胞を、m2324または6G(各5ug/ml)と共にインキュベートし、結合を、二次Cy3結合ヤギ抗マウスまたは抗ヒト抗体により検出した後の蛍光顕微鏡下の細胞を示している。一番下のパネルは、顕微鏡下で観察された細胞を示している。 APOE4マウスの5つの試験群、すなわち、普通食を与えた対照APOE4マウス、高脂肪および高コレステロール食(「HFC」)を与えた対照APOE4マウス(AMD様モデル)、7G10で治療されたAPOE4−HFCマウス、2H6で治療されたAPOE4−HFCマウス、および6Gで治療されたAPOE4−HFCマウスのb波のみの強度のグラフを示す図である。 APOE4マウスの3つの試験群、すなわち、普通食を与えた対照APOE4マウス、対照APOE4−HFCマウス、および6Gで治療されたAPOE4−HFCマウスのb波のみの強度のグラフを示す図である。

Claims (10)

  1. Aβ1〜40のC末端領域に特異的に結合する抗体を含む、加齢性黄斑変性症治療用医薬組成物。
  2. 抗体が、Aβ1〜42上のエピトープとも特異的に結合する請求項1に記載の医薬組成物。
  3. 抗体が、100nM以下のKでAβ1〜40ペプチドと結合する請求項1に記載の医薬組成物。
  4. 抗体が、100nM以下のKでAβ1〜42ペプチドとも結合する請求項3に記載の医薬組成物。
  5. 抗体が、アミノ酸25〜34および40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと結合する請求項1に記載の医薬組成物。
  6. 抗体のFc領域が、N−グリコシル化されていないか、または天然Fc領域に関して変更されているN−グリコシル化パターンを有する請求項1に記載の医薬組成物。
  7. 抗体が、配列番号26に示す抗体6G重鎖可変領域由来の3個のCDRを含む重鎖可変領域および配列番号27に示す抗体6G軽鎖可変領域由来の3個のCDRを含む軽鎖可変領域を含む請求項1に記載の医薬組成物。
  8. 抗体が、配列番号26に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号27に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む請求項1に記載の医薬組成物。
  9. Aβ1〜40およびAβ1〜42のC末端領域に特異的に結合する抗体を含む、加齢性黄斑変性症治療用医薬組成物。
  10. 抗体が、配列番号36に示す重鎖および配列番号37に示す軽鎖を含む請求項1に記載の医薬組成物。
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