CN110637029A - 减少治疗性抗体的应用相关的副反应 - Google Patents

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Abstract

本文报道了抗脑靶标治疗剂，其是抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体(1)抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对)，特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区，用于在个体中进行抗脑靶标治疗，在静脉内应用后具有减少的不期望的体温降低。

Description

减少治疗性抗体的应用相关的副反应
技术领域
本发明涉及治疗性抗体及其用于治疗中枢神经系统病症的用途。
背景技术
中枢神经系统(CNS)的病症包括中风、精神病、神经变性疾病、神经发育病症和脑肿瘤，是世界上残疾的主要原因。尽管使用常规单克隆抗体(mAb)的努力正在增加，但血脑屏障(BBB)继续阻碍有效疗法的开发。因此，克服BBB问题的技术受到重点关注(1，2)。当今的开发集中于证明在治疗剂量时脑中的大量摄取和相关活性，这反映了递送能力。然而，所使用的技术是否向药物开发传达安全性限制并不总是清楚的。预先解决这个问题对于确定设计和蛋白质和抗体工程可以促进mAb向大脑安全递送的方面至关重要。
BBB递送利用脑内皮细胞(BEC)上表达的天然受体用于转运目的。特别地，由于在BBB上的显著表达，人运铁蛋白受体(TfR；也称为TfR1)作为BBB递送受体已被广泛研究(3)。许多研究小组已经研究了TfR作为受体介导的胞吞作用(RMT)系统用于递送分子穿过BBB(4-7)。最近工程化抗体以允许富有成效的和有效的穿过BBB的努力已经受到越来越多的关注(8-11)。
开发了一种使用双特异性抗体的脑穿梭(BS)技术，所述双特异性抗体具有两个与治疗靶标的结合位点(即对于治疗靶标是二价的)和一个与TfR的结合位点(即对于人运铁蛋白受体1是单价的)，以允许递送具有完全功能的单克隆抗体(mAb)(即治疗靶标结合以及具有效应功能活性的(competent)IgG结构)。这是通过将一个BS模块融合到mAb一条重链的C末端实现的。通过将BS模块连接到抗淀粉样蛋白βmAb(AmAb)，最近已证明其在脑暴露、靶标衔接和功效方面有实质性的改善(9)。据推测，这种增强的脑递送是BS构建体与TfR的天然单价衔接的直接结果。
在WO2014/033074中公开了结合血脑屏障(R/BBB)上的受体的血脑屏障穿梭工具及其使用方法。
Niewoehner等人(Neuron81(2014)49-60；9)公开了使用单价分子穿梭工具的治疗性抗体的增加的脑渗透和效力。
发明概述
本发明中发现了一种减少双特异性治疗性单克隆抗体的应用相关副作用和反应的方法。这通过空间上取消与Fcγ受体(FcγR)的结合来实现的。一个实例是双特异性治疗性抗体，其特异性结合至与中枢神经系统的病症和人运铁蛋白受体(TfR)有关的治疗靶标。
最近的研究揭示了以前使用常规的抗TfR(TfR1)的mAb所忽略的不利之处。在给药后直接在小鼠中观察到急性临床体征，这与mAb的效应功能状态有关(12)。当使用双特异性mAb时，其中只有一个Fab臂结合TfR(TfR1)，也观察到这种情况，前提是所述mAb含有天然的完全活性效应功能。综合起来，mAb的效应功能似乎与观察到的急性临床体征直接相关，因此一种明显的规避策略是使用效应死亡变体。然而，对于某些mAb，天然效应功能对于作用模式和最佳治疗概况是至关重要的。
现已发现，在新的Fc-人源化小鼠模型中，就天然IgG效应功能的潜在首次输注反应(FIR)不利之处而言，在体外和体内评估不同形式的脑穿梭-mAb(BS-mAb)系统，根据BS-mAb的形式，当mAb结合TfR(TfR1)(且同时不结合治疗靶标)时，靶向TfR(TfR1)的BS-mAb的Fc区效应功能被掩饰，但当mAb结合其CNS靶标(且同时不结合TfR(TfR1))时，靶向BS-mAb的TfR(TfR1)的Fc区效应功能恢复活性。
不受该理论的束缚，假定观察到的FIR的形式依赖性是由于空间因素，其影响Fc区与位于免疫细胞上的FcγR的结合/可及性。假设当TfR(TfR1)被BS模块结合时，BS-mAb相反末端的两个天然Fab臂阻止了BS-mAb的Fc区与效应细胞上的FcγR所需的接近。一旦BS-mAb从TfR(TfR1)释放，例如进入CNS实质中，并且固有的靶标被天然的治疗性IgG Fab结合，重链C端的游离BS模块不再影响或阻止Fc区与募集的效应细胞上的FcγR的相互作用。
因此，本文所传达的教导为选择和使用可安全转运穿过BBB的完全效应功能的mAb提供了基础。此外，它为集中于增强脑中mAb摄取的未来TfR(TfR1)靶向治疗提供关键考虑。本文报道的数据提供关于在第一细胞上结合至其抗原的mAb与在第二细胞上结合至FcγR的几何结构之间的相互作用的新教导。因此，可以提供和/或选择具有减少的首次注射反应(FIR)的新的mAb设计。
本发明一方面涉及双特异性抗体的用途，所述双特异性抗体特异性结合第一和第二(细胞表面)靶标并具有特定形式的(天然)效应功能，其中所述抗体具有特异性结合第一(细胞表面)靶标的两个结合位点(VH/VL对)，特异性结合第二(细胞表面)靶标的一个结合位点(VH/VL对)和效应功能活性，例如天然的Fc区，其用于减少在疾病/病症治疗中不期望的施用(输注)相关副作用(如血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降，特别是与Fc区效应功能有关的低体温)。
本发明一方面涉及用于治疗疾病的方法的治疗组合物，所述治疗组合物包含双特异性抗体，所述双特异性抗体特异性结合第一和第二(细胞表面)靶标并具有特定形式的(天然)效应功能，其中所述抗体具有特异性结合第一(细胞表面)靶标的两个结合位点(VH/VL对)，一个特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点(VH/VL对)和效应功能活性，例如天然的Fc区，其中治疗性组合物具有减少的与Fc区效应功能有关的不期望的施用(输注)相关副作用(如血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降，特别是低体温)。
本发明一方面涉及药物组合物，其包含治疗性双特异性抗体，通过施用所述双特异性抗体，用于预防和/或治疗具有与Fc区效应功能有关的不期望的施用(输注)相关副作用(如血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降，特别是低体温)的疾病，所述双特异性抗体特异性结合第一和第二(细胞表面)靶标并具有特定形式的(天然)效应功能，其中所述抗体具有特异性结合第一(细胞表面)靶标的两个结合位点(VH/VL对)，一个特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的Fc区。
本发明一方面涉及用于治疗患者疾病的双特异性抗体，
其中所述双特异性抗体包含
i)(具有效应功能活性的)Fc区，
ii)两个特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点，和
iii)一个特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点，
其中治疗在施用后具有减少的副作用，
其中所述副作用是选自由血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降和低体温组成的组中的一种或更多种。
换句话说，本发明一方面涉及一种双特异性抗体，其用于治疗患者的疾病并用于减少施用后的副作用，
其中所述双特异性抗体包含
i)(具有效应功能活性的)Fc区，
ii)两个特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点，和
iii)一个特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点，
其中所述副作用是选自由血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降和低体温组成的组中的一种或更多种。
在一个实施方案中，特异性结合第一靶标的两个结合位点和特异性结合第二靶标的结合位点以相反方向排列，即一个与Fc区的N端缀合，另一个与Fc区的C端缀合。
在一个实施方案中，第一(细胞表面)靶标和第二(细胞表面)靶标是不同的。
在一个实施方案中，特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点和特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点位于相反末端(即特异性结合第一靶标的那些二者都/每个在(全长)抗体重链的N端末端，特异性结合第二靶标的在双特异性抗体的(全长)抗体重链之一的C端末端)。
在一个实施方案中，所述特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点和特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点位于双特异性抗体的相反末端，即特异性结合第一靶标的结合位点之一与Fc区的第一N端缀合，且另一个与Fc区的第二N端缀合，且特异性结合第二靶标的结合位点与Fc区的C端之一缀合。
在一个实施方案中，与施用相关的副作用是与输注相关的副作用。在一个实施方案中，与输注相关的副作用是血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降和低体温。在一个优选的实施方案中，与输注相关的副作用是低体温。
在一个实施方案中，特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点通过肽接头与特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点之一连接。在一个实施方案中，肽接头具有SEQID NO：37或38的氨基酸序列。
在一个实施方案中，特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点在Fc区内，其中CH2结构域、CH3结构域或CH4结构域中的任何一个的至少一个结构环区包含至少一个修饰，所述修饰使得所述至少一个经修饰的环区能够结合第二(细胞表面)靶标，其中未修饰的免疫球蛋白恒定结构域不结合所述靶标。
在一个实施方案中，所述结合位点是抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域的对。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含
i)一对第一抗体轻链和第一抗体重链，
ii)一对第二抗体轻链和第二抗体重链，和
iii)额外的抗体片段，所述额外的抗体片段选自由scFv、Fab、scFab、dAb片段、DutaFab和CrossFab组成的组，
其中i)和ii)的抗体链对包含特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点，iii)的额外的抗体片段包含特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点。
在一个实施方案中，iii)的额外的抗体片段直接或经由肽接头缀合至第一抗体重链或第二抗体重链。在一个实施方案中，iii)的额外的抗体片段直接或经由肽接头缀合至i)或ii)的抗体重链的C端。在一个实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO：37或38的氨基酸序列。在一个实施方案中，第一抗体轻链和第二抗体轻链具有相同的氨基酸序列，并且第一抗体重链和第二抗体重链的不同在于异二聚化所需的突变。在一个实施方案中，异二聚化所需的突变是杵臼(knob-into-hole)突变。在一个实施方案中，未与iii)的额外的抗体片段缀合的抗体重链不包含i)C端赖氨酸残基或ii)C端甘氨酸-赖氨酸二肽。
在一个实施方案中，第一靶标是脑靶标，第二靶标是人运铁蛋白受体。在一个实施方案中，第一靶标是脑靶标，第二靶标是人运铁蛋白受体1。
在一个实施方案中，所述脑靶标选自由β-分泌酶1(BACE1)、人淀粉样蛋白β(Aβ)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、人tau蛋白质、磷酸化的人tau蛋白质、载脂蛋白E4(ApoE4)、人α-突触核蛋白、人CD20、亨廷顿蛋白(huntingtin)、朊病毒蛋白(PrP)、富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)、帕金蛋白(parkin)、早老蛋白1、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受体6(DR6)、淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)、p75神经营养蛋白受体(p75NTR)和胱天蛋白酶6组成的组。在一个优选的实施方案中，所述脑靶标选自由人CD20、人tau蛋白质、磷酸化的人tau蛋白质、人α-突触核蛋白和人淀粉样β蛋白质组成的组。在一个优选的实施方案中，所述脑靶标是人淀粉样β蛋白。在一个实施方案中，所述脑靶标选自SEQ ID NO：01至05。
在一个优选的实施方案中，如本文报道的所有方面中的所述双特异性抗体包含
i)一对第一抗体轻链和第一抗体重链，其包含第一轻链可变结构域和第一重链可变结构域，其形成特异性结合脑靶标的第一结合位点，所述脑靶标选自由人CD20、人tau蛋白质、磷酸化人tau蛋白质、人α-突触核蛋白和人淀粉样β蛋白组成的组，
ii)一对第二抗体轻链和第二抗体重链，其包含第二轻链可变结构域和第二重链可变结构域，其形成特异性结合与第一结合位点相同的脑靶标的第二结合位点，
iii)额外的抗体片段，其选自由scFv、Fab、scFab、dAb片段、DutaFab和CrossFab组成的组，所述额外的抗体片段包含第三轻链可变结构域和第三重链可变结构域，其形成特异性结合人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的第三结合位点，和
iv)(人)具有效应功能活性的Fc区(人IgG1亚类)，
其中iii)的额外的抗体片段直接或经由肽接头缀合至i)或ii)的抗体重链的C端。
在一个实施方案中，所述额外的抗体片段是Fab片段，所述Fab片段特异性结合第二抗原，并且其通过肽接头融合至i)或ii)的重链之一的C端，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换，其包含第三轻链可变结构域和第三重链可变结构域，其形成特异性结合人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的第三结合位点。
在一个实施方案中，特异性结合人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的结合位点包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：06或07的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：08或09或10的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：11、12或13的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：14或15的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：17或18的氨基酸序列。
在一个实施方案中，特异性结合人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的结合位点包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含SEQID NO：18的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和至少一对(如一对或两对)SEQ ID NO：23的重链可变结构域和SEQ ID NO：24的轻链可变结构域，其(各自)形成人淀粉样β蛋白(Aβ)结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的结合位点，和两对SEQID NO：21的重链可变结构域和SEQ ID NO：22的轻链可变结构域，其各自形成人CD20结合位点。在一个实施方案中，所述重链可变区包含用除亮氨酸以外的任何氨基酸替换Kabat位置11处的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述取代包含用非极性氨基酸替换Kabat位置11处的氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，所述取代包含用选自由缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸组成的组中的氨基酸残基替换SEQ ID NO：21的重链可变结构域中Kabat位置11处的氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对SEQID NO：25的重链可变结构域和SEQ ID NO：26的轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对源自SEQ ID NO：27的人源化重链可变结构域和源自SEQ ID NO：28的人源化轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体结合位点，和两对源自SEQ ID NO：29的人源化重链可变结构域和源自SEQ ID NO：30的人源化轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对源自SEQ ID NO：31的人源化重链可变结构域和源自SEQ ID NO：32的人源化轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对源自SEQ ID NO：33的人源化重链可变结构域和源自SEQ ID NO：34的人源化轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对源自SEQ ID NO：35的人源化重链可变结构域和源自SEQ ID NO：36的人源化轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述疾病是神经学病症。在一个实施方案中，所述疾病选自神经学病症的组，所述神经学病症由神经病、淀粉样变性、癌症、眼疾病或眼病症、病毒或微生物感染、炎症、局部缺血、神经变性疾病、癫痫发作、行为病症、溶酶体贮存病、路易体(Lewybody)病、脊髓灰质炎后综合征、夏伊-德雷格综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、tau蛋白病(tauopathies)、阿尔茨海默病、核上性麻痹、朊病毒病、牛海绵状脑病、痒病、克雅病综合征(Creutzfeldt-Jakob syndrome)、库鲁病(kuru)、格-施-沙病、慢性消耗性疾病，和致命性家族性失眠症、延髓麻痹、运动神经元病、神经系统异变性(heterodegenerative)病症、卡纳万(Canavan)病、亨廷顿(Huntington)病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大(Alexander)病、图雷特(Tourette)综合征、门克士卷发综合征、科凯恩(Cockayne)综合征、Halervorden-Spatz综合征、拉福拉(lafora)病、雷特综合征、肝豆状核变性、莱施奈恩二氏综合征、翁-伦(Unverricht-Lundborg)综合征、痴呆、皮克氏病、脊髓小脑性共济失调、CNS癌和/或脑癌、包括因身体其他部位的癌症而导致的脑转移组成。在一个实施方案中，所述疾病选自神经学病症的组，所述神经学病症由阿尔茨海默病、帕金森病、CNS癌和/或脑癌、包括因身体其他部位的癌症而导致的脑转移，和tau蛋白病组成。在一个实施方案中，所述疾病选自神经学病症的组，所述神经学病症由阿尔茨海默病、帕金森病和tau蛋白病组成。
在一个实施方案中，所述抗体包含具有效应功能活性的Fc区。在一个实施方案中，所述具有效应功能活性的Fc区是特异性结合人Fcγ受体/可被人Fcγ受体特异性结合的Fc区。在一个实施方案中，所述具有效应功能活性的Fc区可引起ADCC。
在一个实施方案中，由所述双特异性抗体引起的ADCC(注射时/结合第二(细胞表面)靶标时)低于仅具有一个(即正好一个)特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点和(正好)一个特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点(即特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点之一被缺失)的二价双特异性抗体引起的ADCC。在一个实施方案中，所述ADCC低10倍或更多。
在一个实施方案中，所述施用是静脉内、皮下或肌内施用。
在一个实施方案中，施用相关的副作用是低体温。在一个实施方案中，在治疗剂量的双特异性抗体下，将低体温减少至体温下降小于0.5℃。在一个实施方案中，体温的下降在施用后60分钟内。
在一个实施方案中，(i)的)第一抗体重链和(ii)的)第二抗体重链形成异二聚体。在一个实施方案中，所述第一抗体重链和第二抗体重链包含支持异二聚体形成的突变。
在一个实施方案中，
a)抗体重链是人亚类IgG1的全长抗体重链，
b)抗体重链是人亚类IgG4的全长抗体重链，
c)抗体重链之一是具有突变T366W和可选的S354C或Y349C的人亚类IgG1的全长抗体重链，另一条抗体重链是具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C或S354C的人亚类IgG1的全长抗体重链，
d)两条抗体重链都是人亚类IgG1的全长抗体重链，在一条抗体重链中具有突变I253A、H310A和H435A以及突变T366W和可选的S354C或Y349C，在相应的其他抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C或S354C，
e)两条抗体重链都是人亚类IgG1的全长抗体重链，在一条抗体重链中具有突变M252Y、S254T和T256E以及突变T366W和可选的S354C或Y349C，在相应的其他抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C或S354C，或
f)两条抗体重链都是人亚类IgG1的抗体重链，在一条抗体重链中具有突变T307H和N434H以及突变T366W和可选的S354C或Y349C，在相应的其他抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C或S354C。
在一个实施方案中，
a)所述抗体重链是人亚类IgG1的抗体重链，
b)所述抗体重链是人亚类IgG4的抗体重链，
c)抗体重链之一是具有突变T366W和可选的S354C或Y349C的人亚类IgG1的抗体重链，另一条抗体重链是具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C或S354C的人亚类IgG1的抗体重链，
d)两条抗体重链都是人亚类IgG1的抗体重链，在一条抗体重链中具有突变I253A、H310A和H435A以及突变T366W和可选的S354C或Y349C，在相应的其他抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C或S354C，
e)两条抗体重链都是人亚类IgG1的抗体重链，在一条抗体重链中具有突变M252Y、S254T和T256E以及突变T366W和可选的S354C或Y349C，在相应的其他抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C或S354C，或
f)两条抗体重链都是人亚类IgG1的抗体重链，在一条抗体重链中具有突变T307H和N434H以及突变T366W和可选的S354C或Y349C，在相应的其他抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C或S354C，
其中C端赖氨酸或甘氨酸-赖氨酸二肽存在或不存在。
本发明涉及双特异性抗体的用途，所述双特异性抗体特异性结合脑靶标和人运铁蛋白受体1并具有特定形式的(天然)效应功能，其中所述抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对)，一个特异性结合人运铁蛋白受体1的结合位点(VH/VL对)和效应功能活性，例如天然的Fc区，用于减少在神经病症的治疗中不期望的施用(输注)相关副作用(如血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降，特别是与Fc区效应功能有关的低体温)。该抗体是可以转运穿过血脑屏障的完全效应功能性抗体。
不受该理论的束缚，据信治疗性抗体同时与效应细胞上的人Fcγ受体以及身体的任何TfR(TfR1)表达细胞上的人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的结合可至少部分负责在其输注后观察到的类过敏反应。通过提供特定形式的治疗性抗体，其防止不期望的Fc-受体相互作用脱靶，可以减少或甚至防止施用(输注)相关的副作用，特别是低体温的发生。
此外，预期减少类过敏反应的临床益处将允许治疗抗体的更好的耐受性和/或更高的施用(输注)速率或剂量。
如上文所述，提供了具有减少的第一注射反应(FIR)的新mAb设计。与其他治疗性双特异性抗体形式的施用方案相比，这进而允许应用双特异性治疗性抗体或包含双特异性治疗性抗体的治疗性组合物的更高剂量、更频繁的给药和/或更高的输注速率。类似地，根据本发明，在经历与不期望的施用(输注)相关的副作用(如血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降，特别是低体温)的患者中，不必如现有疗法中那样减少剂量、给药频率和/或输注速率。
在常规抗体疗法中，当接受抗体疗法的患者经历施用(输注)相关副作用(本文也称为输注相关反应)时，需要降低输注速率，或在严重情况下需要中断治疗或完全中止。利用本发明可以避免这种情况。对于经历轻度或中度输注相关反应的患者(例如根据美国国家癌症研究所(NCI)的不良事件通用术语标准(CTCAE)v5.0的1级和2级)，输注速率可以降低。经历严重输注相关副作用的患者(例如根据美国国家癌症研究所(NCI)的不良事件通用术语标准(CTCAE)v5.0的3级和4级)，必须立即停止并最终中止治疗。本发明提供了一种治疗方法，其可以安全地施用以完全避免这样的副反应或至少大大减少这样的副反应。
因此，在一些方面，本发明用于治疗患者，所述患者否则将经历施用(输注)相关的副作用(诸如血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降，特别是低体温)，特别是1级至4级(根据美国国家癌症研究所(NCI)的不良事件通用术语标准(CTCAE)v5.0)施用(输注)相关的的副作用，更特别是2级至4级，更特别是3级和4级。
例如，对于没有输注相关副作用的患者，一些抗体的典型的输注速率可以在12ml/h和400ml/h之间(例如，输注可以在第一次(和可选的第二次)施用时以12ml/h的速率开始，并且每30分钟加倍，直到达到200ml/h的速率；第三次和随后的输注可以例如以25mg/l的速率开始，每30分钟加倍，直到达到400ml/h的最大输注速率)。在常规抗体疗法中，对于经历轻度或中度输注相关反应的患者，在该实例中输注可以中断，随后以12ml/h恢复，并在医师监督下缓慢增加。如所讨论的，利用本发明可以避免这种情况。
已经发现，需要两种治疗性靶标结合Fab臂以最大化对FcγR募集的抑制作用，以便最小化施用(输注)相关的体温下降和细胞因子释放。
因此，本文报道的一个方面是抗脑靶标治疗剂，其是抗脑靶标/人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)(双特异性)抗体，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体(1)抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对)，特异性结合人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区，用于在个体中进行抗脑靶标治疗，在静脉内应用后具有减少的不期望的输注相关副作用(诸如血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降，特别是低体温)。
本文报道的另一方面是一种治疗神经学病症的方法，其具有在个体中降低的输注相关副作用(诸如血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降，特别是低体温)，所述方法包括施用有效量的抗脑靶标/人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)(双特异性)抗体，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对)，特异性结合人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区，其中所述治疗导致减少的输注相关副作用(诸如血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降，特别是低体温)。
在一个实施方案中，输注相关的副作用是低体温，即体温下降。
在上述方面中采用的抗体可以是如本文所述的任何抗体。
在一个实施方案中，低体温减少至体温下降小于2℃，在一个实施方案中，低体温减少至体温下降小于1℃，在一个优选的实施方案中，低体温减少至体温下降小于0.5℃。
在一个实施方案中，低体温是在施用后30分钟之内。在一个实施方案中，低体温是在施用后60分钟之内。在一个实施方案中，低体温是在施用后120分钟之内。
在一个实施方案中，在施用后低体温减少至体温下降小于1℃，在一个优选实施方案中，60分钟之内小于0.5℃，在一个优选实施方案中，120分钟之内。
在一个实施方案中，所述具有效应功能活性的Fc区是特异性结合人Fcγ受体/可被人Fcγ受体特异性结合的Fc区。
在一个实施方案中，所述具有效应功能活性的Fc区可引起ADCC。
在一个实施方案中，所述具有效应功能活性的Fc区是特异性结合人Fcγ受体/可被人Fcγ受体特异性结合的Fc区且可引起ADCC。
在一个实施方案中，抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体是三价、双特异性抗体，其包含
i)全长抗体的第一轻链和第一重链，其特异性结合第一抗原，
ii)全长抗体的第二重链，其当与第一轻链配对时，特异性结合第一抗原，和
iii)Fab片段，其特异性结合第二抗原，且其通过肽接头融合至i)或ii)的重链之一的C端，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换，
其中C端赖氨酸或甘氨酸-赖氨酸二肽存在或不存在。
在一个优选的实施方案中，如本文报道的所有方面中的所述双特异性抗体包含
i)一对第一抗体轻链和第一抗体重链，其包含第一轻链可变结构域和第一重链可变结构域，其形成特异性结合脑靶标的第一结合位点，所述脑靶标选自由人CD20、人tau蛋白质、磷酸化人tau蛋白质、人α-突触核蛋白和人淀粉样β蛋白组成的组，
ii)一对第二抗体轻链和第二抗体重链，其包含第二轻链可变结构域和第一重链可变结构域，其形成特异性结合与第一结合位点相同的脑靶标的第二结合位点，
iii)额外的抗体片段，其选自由scFv、Fab、scFab、dAb片段和CrossFab组成的组，所述额外的抗体片段包含第三轻链可变结构域和第三重链可变结构域，其形成特异性结合人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的第三结合位点，和
iv)一个具有(人)效应功能活性的Fc区，
其中iii)的额外的抗体片段直接或经由肽接头缀合至i)或ii)的抗体重链的C端，
其中C端赖氨酸或甘氨酸-赖氨酸二肽存在或不存在。
在一个实施方案中，特异性结合人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的结合位点包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：06或07的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：08或09或10的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：11、12或13的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：14或15的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：17或18的氨基酸序列。
在一个实施方案中，特异性结合人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)的结合位点包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含SEQID NO：18的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和至少一对(即一对或两对)SEQ ID NO：23的重链可变结构域和SEQ ID NO：24的轻链可变结构域，其形成人淀粉样β蛋白(Aβ)结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对SEQID NO：21的重链可变结构域和SEQ ID NO：22的轻链可变结构域，其各自形成人CD20结合位点。在一个实施方案中，所述重链可变区包含用除亮氨酸以外的任何氨基酸替换Kabat位置11处的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述取代包含用非极性氨基酸替换Kabat位置11处的氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，所述取代包含用选自由缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸组成的组的氨基酸残基替换SEQ ID NO：21的重链可变结构域中Kabat位置11处的氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对SEQID NO：25的重链可变结构域和SEQ ID NO：26的轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对源自SEQ ID NO：27的人源化重链可变结构域和源自SEQ ID NO：28的人源化轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对源自SEQ ID NO：29的人源化重链可变结构域和源自SEQ ID NO：30的人源化轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对源自SEQ ID NO：31的人源化重链可变结构域和源自SEQ ID NO：32的人源化轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对源自SEQ ID NO：33的人源化重链可变结构域和源自SEQ ID NO：34的人源化轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体包含一对SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ IDNO：20的轻链可变结构域，其形成人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)结合位点，和两对源自SEQ ID NO：35的人源化重链可变结构域和源自SEQ ID NO：36的人源化轻链可变结构域，其各自形成人α-突触核蛋白结合位点。
在一个实施方案中，所述疾病是神经学病症。在一个实施方案中，所述疾病选自神经学病症的组，所述神经学病症由神经病、淀粉样变性、癌症、眼疾病或眼病症、病毒或微生物感染、炎症、局部缺血、神经变性疾病、癫痫发作、行为病症、溶酶体贮存病、路易体(Lewybody)病、脊髓灰质炎后综合征、夏伊-德雷格综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、tau蛋白病(tauopathies)、阿尔茨海默病、核上性麻痹、朊病毒病、牛海绵状脑病、痒病、克雅病综合征(Creutzfeldt-Jakob syndrome)、库鲁病(kuru)、格-施-沙病、慢性消耗性疾病，和致命性家族性失眠症、延髓麻痹、运动神经元病、神经系统异变性(heterodegenerative)病症、卡纳万(Canavan)病、亨廷顿(Huntington)病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大(Alexander)病、图雷特(Tourette)综合征、门克士卷发综合征、科凯恩(Cockayne)综合征、Halervorden-Spatz综合征、拉福拉(lafora)病、雷特综合征、肝豆状核变性、莱施奈恩二氏综合征、翁-伦(Unverricht-Lundborg)综合征、痴呆、皮克氏病、脊髓小脑性共济失调、CNS癌和/或脑癌、包括因身体其他部位的癌症而导致的脑转移组成。在一个实施方案中，所述疾病选自神经学病症的组，所述神经学病症由阿尔茨海默病、帕金森病、CNS癌和/或脑癌、包括因身体其他部位的癌症而导致的脑转移和tau蛋白病组成。在一个实施方案中，所述疾病选自神经学病症的组，所述神经学病症由阿尔茨海默病、帕金森病和tau蛋白病组成。
在一个实施方案中，所述抗体包含具有效应功能活性的Fc区。在一个实施方案中，所述具有效应功能活性的Fc区是特异性结合人Fcγ受体/可被人Fcγ受体特异性结合的Fc区。在一个实施方案中，所述具有效应功能活性的Fc区可引起ADCC。
在一个实施方案中，由所述双特异性抗体引起的ADCC(注射时/结合第二(细胞表面)靶标时)低于仅具有一个(即正好一个)特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点和(正好)一个特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点的二价双特异性抗体引起的ADCC。在一个实施方案中，所述ADCC低10倍或更多。
在一个实施方案中，所述施用是静脉内、皮下或肌内施用。
在一个实施方案中，施用相关的副作用是低体温。在一个实施方案中，在治疗剂量的双特异性抗体下，低体温减少至体温下降小于0.5℃。在一个实施方案中，体温的下降是在施用后60分钟之内。
在一个实施方案中，(i)的)第一抗体重链和(ii)的)第二抗体重链形成异二聚体。在一个实施方案中，所述第一抗体重链和第二抗体重链包含支持异二聚体形成的突变。
在一个实施方案中，所述全长抗体是
a)人亚类IgG1的全长抗体，
b)人亚类IgG4的全长抗体，
c)人亚类IgG1的全长抗体，其一条重链中具有突变T366W和可选的S354C，在相应的其他重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，
d)人亚类IgG1的全长抗体，其两条重链中均具有突变I253A、H310A和H435A，且其一条重链中具有突变T366W和可选的S354C，在相应的其他重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，
e)人亚类IgG1的全长抗体，其两条重链中均具有突变M252Y、S254T和T256E，且其一条重链中具有突变T366W和可选的S354C，在相应的其他重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，或
f)两条抗体重链都是人亚类IgG1的抗体重链，在一条抗体重链中具有突变T307H和N434H以及突变T366W和可选的S354C，在相应的其他抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，
在一个实施方案中，
a)所述抗体重链是人亚类IgG1的抗体重链，
b)所述抗体重链是人亚类IgG4的抗体重链，
c)抗体重链之一是具有突变T366W和可选的S354C的人亚类IgG1的抗体重链，另一条抗体重链是具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C的人亚类IgG1的抗体重链，
d)两条抗体重链都是人亚类IgG1的抗体重链，在一条抗体重链中具有突变I253A、H310A和H435A以及突变T366W和可选的S354C，在相应的其他抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，
e)两条抗体重链都是人亚类IgG1的抗体重链，在一条抗体重链中具有突变M252Y、S254T和T256E以及突变T366W和可选的S354C，在相应的其他抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，或
f)两条抗体重链都是人亚类IgG1的抗体重链，在一条抗体重链中具有突变T307H和N434H以及突变T366W和可选的S354C，在相应的其他抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，
其中C端赖氨酸或甘氨酸-赖氨酸二肽存在或不存在。
在一个实施方案中，具有人效应功能活性的Fc区包含选自由SEQ ID NO：57至60和63至66组成的组的两种多肽。
在一个实施方案中，具有人效应功能活性的Fc区包含SEQ ID NO：61的第一Fc区多肽和SEQ ID NO：62的第二Fc区多肽。
如本文所用术语“方面”表示本发明的独立主题，而术语“实施方案”表示独立主题的进一步定义的从属子项。
本发明的实施方案的详细描述
本文报道了一种用于减少双特异性治疗性单克隆抗体的应用相关的副作用和反应的方法。这通过空间上取消与Fcγ受体(FcγR)的结合来实现的。一个实例是双特异性治疗性抗体，其特异性结合至与中枢神经系统的病症和人运铁蛋白受体，尤其是运铁蛋白受体1(TfR1)有关的治疗靶标。
人运铁蛋白受体(TfR)(运铁蛋白受体1，TfR1)已显示有希望将抗体(mAb)转运穿过血脑屏障(BBB)。然而，已经报道了与外周TfR(TfR1)-结合和Fc区效应功能相关的安全性不利之处。脑穿梭-mAb(BS-mAb)技术用于研究体外和在新的FcγR人源化小鼠模型中Fc区效应功能的作用。对于针对具有天然IgG1Fc区的TfR(TfR1)的常规二价单特异性mAb，观察到强的第一注射反应(FIR)。使用Fc区效应子-死亡构建体完全消除了所有FIR。值得注意的是，对于具有天然IgG1Fc区的2+1BS-mAb构建体，没有观察到FIR。本文报道的本发明至少部分基于这样的发现，TfR(TfR1)通过C-末端BS模块的结合减弱Fc区-FcγR相互作用，主要是由于位阻。然而，当BS-mAb结合其靶标时，其维持效应功能活性。总之，具有完整效应功能的mAb只有当与其靶标衔接时才能在外周以隐形模式转运，并在大脑中被激活。
定义
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat编号系统编号，所述Kabat编号系统在Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述,并且在本文中称为“根据Kabat编号”。具体地，Kabat编号系统(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),参见647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3，在这种情况下，通过参考“根据Kabat Eu索引编号”进一步阐明)。
在Carter P.；Ridgway J.B.B.；Presta L.G.:Immunotechnology,Volume 2,Number 1,February 1996,pp.73-73(1)中描述杵臼二聚化模块及其在抗体工程化中的应用。
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下中给出：Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。
用于实施本发明的有用方法和技术在例如Ausubel,F.M.(ed.),CurrentProtocols in Molecular Biology,卷I至III(1997)；Glover,N.D.,和Hames,B.D.,ed.,DNA Cloning:A Practical Approach,卷I和II(1985),Oxford University Press；Freshney,R.I.(ed.),Animal Cell Culture–a practical approach,IRL Press Limited(1986)；Watson,J.D.,et al.,Recombinant DNA,第二版,CHSL Press(1992)；Winnacker,E.L.,From Genes to Clones；N.Y.,VCH Publishers(1987)；Celis,J.,ed.,CellBiology,第二版,Academic Press(1998)；Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique,第二版,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)中描述。
使用重组DNA技术能够生成核酸的衍生物。这些衍生物例如可以通过取代、改变、交换、缺失或插入在单个或几个核苷酸位置上进行修饰。修饰或衍生作用可以例如通过定点诱变的方式实施。本领域技术人员可以容易地进行这种修饰(参见例如Sambrook,J.等，Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,USA；Hames,B.D.,and Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization–apractical approach(1985)IRL Press,Oxford,England)。
必须注意，除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式的“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”包括复数参考。因此，例如，提及“一个细胞”包括本领域技术人员已知的多个这样的细胞及其等同物，等等。同样，术语“一个(a)”(或“一个(an)”)、“一个或更多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。还应注意，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
术语“约”表示其后的接着的数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语约表示其后的接着的数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语约表示其后的接着的数值的+/-5％的范围。
本文所用术语“测定”还包括术语测量和分析。
如本文所用术语“结构域交换(crossover)”表示在一对抗体重链VH-CH1片段和其相应同源抗体轻链中，即在抗体结合臂中(即在Fab片段中)，由于至少一个重链结构域被其相应轻链结构域取代并且反之亦然，结构域序列偏离天然序列。存在三种一般类型的结构域交换，(i)CH1和CL结构域的交换，其导致具有VL-CH1结构域序列的结构域交换轻链和具有VH-CL结构域序列的结构域交换重链片段(或具有VH-CL铰链-CH2-CH3结构域序列的全长抗体重链)，(ii)VH和VL结构域的结构域交换，其导致具有VH-CL结构域序列的结构域交换轻链和具有VL-CH1结构域序列的结构域交换重链片段，和(iii)完整的轻链(VL-CL)和完整的VH-CH1重链片段的结构域交换(“Fab交换”)，其导致具有VH-CH1结构域序列的结构域交换轻链和具有VL-CL结构域序列的结构域交换重链片段(所有上述结构域序列均以N端至C端方向表示)。
如本文所用的关于相应重链和轻链结构域的术语“彼此替换”是指上述结构域交换。这样，当CH1和CL结构域“彼此替换”时，是指在第(i)项提及的结构域交换和所得重链和轻链结构域序列。因此，当VH和VL“彼此替换”时，是指在第(ii)项提及的结构域交换；并且当CH1和CL结构域“彼此替换”并且VH1和VL结构域“彼此替换”时，其是指在第(iii)项提及的结构域交换。包括结构域交换的双特异性抗体报道于例如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer,W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA108(2011)11187-11192。
所述多特异性抗体包含Fab片段，所述Fab片段包括如上文第(i)项所述的CH1和CL结构域的结构域交换，或如上文第(ii)项所述的VH和VL结构域的结构域交换。特异性结合相同抗原的Fab片段被构建为具有相同的结构域序列。因此，在多特异性抗体中含有一个以上具有结构域交换的Fab片段的情况下，所述Fab片段特异性结合相同的抗原。
术语“抗体”在本文中以最广义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要其展示所需的抗原结合活性即可。
术语“抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)”是由Fc受体结合介导的功能，指在效应细胞存在下，如本文报道的抗体对靶细胞的裂解。在一个实施方案中，通过在效应细胞(如新鲜分离的PBMC(外周血单核细胞)或从血沉棕黄层中纯化的效应细胞(如单核细胞或NK(自然杀伤)细胞))存在下，用本文报道的抗体处理表达CD19的红细胞系细胞(例如表达重组人CD19的K562细胞)的制剂来测量ADCC。靶细胞用51Cr标记，随后与抗体一起温育。经标记的细胞与效应细胞一起温育，分析上清液释放的51Cr。对照包括将靶内皮细胞与效应细胞一起温育，但不与抗体一起温育。通过测量抗体与表达Fcγ受体的细胞(如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞或NK细胞(基本上表达FcγRIIIA的细胞)的结合来研究抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力。在一个优选的实施方案中，测量与NK细胞上的FcγR的结合。
“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述完整抗体的部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；dAb片段；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“补体依赖的细胞毒性作用(CDC)”是指在补体存在下由本文报道的抗体诱导的细胞裂解。在一个实施方案中，CDC是通过在补体存在下用本文报道的抗体处理表达CD19的人内皮细胞测量的。在一个实施方案中，所述细胞用钙黄绿素标记。在一个实施方案中，如果抗体在30μg/ml的浓度下诱导20％或更多的靶细胞裂解，则发现CDC。与补体因子C1q的结合可在ELISA中测量。原则上，在这种测定中，ELISA板用浓度范围的抗体包被，并向其中加入纯化的人C1q或人血清。通过针对C1q的抗体，随后通过过氧化物酶标记的缀合物检测C1q结合。结合的检测(最大结合Bmax)以过氧化物酶底物(2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐(6)])在405nm处的光密度(OD405)进行测量。
“效应功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物学活性，其随抗体种类而变化。这样的Fc区在本文中表示为“具有效应功能活性”。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
Fc受体结合依赖的效应功能可以通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用介导，Fc受体是造血细胞上的特化细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已经显示通过免疫复合物的吞噬作用介导抗体包被的病原体的去除，以及通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)介导用相应抗体包被的红细胞和各种其它细胞靶标(例如肿瘤细胞)的裂解(参见例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR通过其对免疫球蛋白同种型的特异性来定义：IgG抗体的Fc受体称为FcγR。Fc受体结合在例如Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；和Gessner,J.E.等人,Ann.Hematol.76(1998)231-248中描述。
IgG抗体的Fc区受体(FcγR)的交联触发了多种效应功能，包括吞噬作用、抗体依赖的细胞毒性作用和炎性介质的释放，以及免疫复合物的清除和抗体产生的调节。在人类中，已经表征了三类FcγR，它们是：
—FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并在巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。IgG的Fc区中至少在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引编号)之一处的修饰降低与FcγRI的结合。被取代入IgG1和IgG4的在位置233–236处的IgG2残基使与FcγRI的结合降低了103倍，并且消除了人单核细胞对抗体敏化的(sensitized)红血细胞的反应(Armour,K.L.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
—FcγRII(CD32)以中到低亲和力结合复合的IgG，并广泛表达。该受体可被分为两种亚型，FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA在许多涉及杀伤的细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞)上被发现，并且似乎能够激活杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，并且在B细胞、巨噬细胞和在肥大细胞和嗜酸性粒细胞上发现。在B细胞上，其似乎起到抑制进一步免疫球蛋白产生和同种型转换到例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB可抑制通过FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B型可能通过IgE与其独立受体结合而有助于抑制这些细胞的活化。例如，对于包含在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引编号)中的至少一个处具有突变的IgG Fc区的抗体，发现了FcγRIIA的结合降低。
—FcγRIII(CD16)以中到低亲和力结合IgG，并作为两种类型存在。FcγRIIIA被发现在NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和一些单核细胞和T细胞上，并介导ADCC。FcγRIIIB在嗜中性粒细胞中高度表达。例如，对于包含在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376(根据Kabat的EU索引编号)中的至少一个处具有突变的IgG Fc区的抗体，发现了与FcγRIIIA的结合降低。
人IgG1上Fc受体结合位点的作图，上述的突变位点和测量与FcγRI和FcγRIIA的结合的方法描述于Shields,R.L.等人.J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604。
本文所用术语“Fc受体”是指以存在与该受体相关的细胞质ITAM序列为特征的活化受体(参见例如Ravetch,J.V.和Bolland,S.,Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。这样的受体是FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。术语“不结合FcγR”表示在抗体浓度为10μg/ml时，如本文报道的抗体与NK细胞的结合是所发现的抗OX40L抗体LC.001结合的10％或更少，正如WO2006/029879中报道的。
尽管IgG4显示FcR结合减少，但其它IgG亚类的抗体显示强的结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc碳水化合物的丢失)、Pro329和234、235、236和237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434，和His435是如果改变也减少FcR结合而提供的残基(Shields,R.L.等人.J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等人,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等人,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434)。
本文中术语“Fc区”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如描述于Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIHPublication 91-3242。
本文报道的方法中使用的抗体包含Fc区，在一个实施方案中，Fc区源自人来源。在一个实施方案中，Fc区包含人恒定区的所有部分。抗体的Fc区直接参与补体活化、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。尽管抗体对补体系统的影响依赖于某些条件，但与C1q的结合是由Fc区中确定的结合位点引起的。这样的结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由Lukas,T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.,和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434描述。这样的结合位点是例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示补体活化、C1q结合和C3活化，而IgG4不激活补体系统，不结合C1q且不激活C3。“抗体的Fc区”是本领域技术人员熟知的术语，并且是基于抗体的木瓜蛋白酶切割定义的。在一个实施方案中，Fc区是人Fc区。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中被可互换地用于指一种抗体，所述抗体具有与天然抗体结构基本类似的结构或具有含有如本文中所限定的Fc区的重链。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，奶牛、绵羊、猫、狗，和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴子)、兔，和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度，如由例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等,J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”指获自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，包含所述群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除可能的变体抗体以外，例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的制备过程中产生，此种变体通常少量存在。对比于多克隆抗体制剂(通常包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)，单克隆抗体制剂中的各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。因此，定语“单克隆”表明抗体的性质为获得自基本上同源的抗体群体，并且不被解释为要求通过任何特定的方法制备所述抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA法、噬菌体展示法，以及利用含有所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了这样的方法以及其他用于制备单克隆抗体的示例性方法。
“裸抗体”是指不与异源结构部分(例如，细胞毒性结构部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指天然存在的具有多种结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，由通过二硫键键合的两个相同的轻链和两个相同的重链组成。从N端到C端，各重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重链结构域或重链可变结构域，之后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中铰链区位于第一和第二恒定结构域之间。类似地，从N端到C端，各个轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，之后是轻链恒定(CL)结构域。
抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配至两种类型之一，被称为κ(κ)和λ(λ)。
术语“天然效应功能”是指与具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子，即天然抗体相关的效应功能。
术语“药物制剂”是指一种制剂，其具有的形式允许包含在其中的活性成分的生物学活性是有效的，并且其不含对将被施用所述制剂的受试者不可接受的毒性的额外的组分。
“药学可接受载体”是指药物制剂中除活性成分以外的成分，其对受试者是无毒性的。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的，“治疗(treatment)”(及其语法上的变体诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指尝试改变受治疗的个体的自然过程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理过程期间进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发、减轻症状、消除疾病的任何直接或间接的病理结果、防止转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及消除或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体被用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
术语“血脑屏障”(BBB)表示外周循环与脑和脊髓之间的生理屏障，其由脑毛细血管内皮质膜中的紧密连接形成，产生限制分子(甚至非常小的分子如尿素(60道尔顿))转运进入脑的紧密屏障。脑内BBB、脊髓内血液-脊髓屏障和视网膜内血液-视网膜屏障是CNS内连续的毛细血管屏障，并且在本文中统称为血脑屏障或BBB。BBB还包括血液-CSF屏障(脉络丛)，其中屏障由室管膜细胞而不是毛细血管内皮细胞组成。
术语“中枢神经系统”(CNS)表示控制身体功能的神经组织的复合体，包括脑和脊髓。
术语“血脑屏障受体”(BBBR)表示在脑内皮细胞上表达的胞外膜连接的受体蛋白质，其能够转运分子穿过BBB或用于转运外源施用的分子。BBBR的实例包括但不限于运铁蛋白受体(TfR)，尤其是运铁蛋白受体1(TfR1)、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF-R)、低密度脂蛋白受体，包括但不限于低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。示例性BBBR是人运铁蛋白受体(TfR)，尤其是运铁蛋白受体1(TfR1)。
术语“单价结合实体”表示能够特异性地并以单价结合模式结合BBBR的分子。本文报道的血脑穿梭模块和/或缀合物的特征在于单价结合实体的单个单元的存在，即，本发明的血脑穿梭模块和/或缀合物恰好包含单价结合实体的一个单元。单价结合实体包括但不限于多肽、全长抗体、抗体片段(包括Fab、Fab’、Fv片段、单链抗体分子(例如单链Fab、scFv))。单价结合实体可以是例如使用现有技术如噬菌体展示或免疫法改造的支架蛋白质。单价结合实体也可以是多肽。在某些实施方案中，单价结合实体包含CH2-CH3Ig结构域和针对血脑屏障受体的单链Fab(scFab)。scFab通过接头偶联至CH2-CH3Ig结构域的C端。在某些实施方案中，所述scFab针对人运铁蛋白受体(运铁蛋白受体1)。
术语“单价结合模式”表示对BBBR的特异性结合，其中单价结合实体和BBBR之间的相互作用通过一个单表位发生。单价结合模式防止由于单个表位相互作用点而导致的BBBR的任何二聚化/多聚化。单价结合模式防止BBBR的细胞内分选改变。
术语“表位”表示能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是被抗体结合的抗原区域。
术语“(人)运铁蛋白受体(TfR)”和“运铁蛋白受体1”(TfR1)在本文可互换使用。它们表示跨膜糖蛋白(具有分子量约180,000Da)，其由两个二硫键结合的亚基(每个表观分子量约90,000Da)组成，并参与脊椎动物中铁摄取。在一个实施方案中，本文的TfR(TfR1)是人TfR(TfR1)，其包含如Schneider等人(Nature 311(1984)675-678)中报道的氨基酸序列。
术语“神经学病症”表示影响CNS和/或在CNS中具有病因的疾病或病症。示例性CNS疾病或病症包括但不限于神经病、淀粉样变性、癌症、眼疾病或眼病症、病毒或微生物感染、炎症、局部缺血、神经变性疾病、癫痫发作、行为障碍和溶酶体贮存病。为了本申请的目的，CNS将被理解为包括眼睛，其通常通过血-视网膜屏障与身体的其余部分隔离。神经学病症的具体实例包括但不限于神经变性疾病(包括但不限于路易体病、脊髓灰质炎后综合征、夏伊-德雷格综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、tau蛋白病(包括但不限于阿尔茨海默病和核上性麻痹)、朊病毒病(包括但不限于牛海绵状脑病、痒病、克雅病综合征、库鲁病、格-施-沙病、慢性消耗性疾病和致命性家族性失眠)、延髓麻痹、运动神经元病和神经系统异变性病症(包括但不限于卡纳万病、亨廷顿病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大病、图雷特综合征、门克士卷发综合征、科凯恩综合征、Halervorden-Spatz综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、莱施奈恩二氏综合征和翁-伦综合征)、痴呆(包括但不限于皮克氏病和脊髓小脑性共济失调)、癌症(例如CNS癌和/或脑癌，包括因身体其他部位的癌症导致的脑转移)。
术语“神经学病症药物”表示治疗一种或更多种神经学病症的药物或治疗剂。神经学病症药物包括但不限于小分子化合物、抗体、肽、蛋白质、一种或更多种CNS靶标的天然配体，一种或更多种CNS靶标的天然配体的修饰形式、适体、抑制性核酸(即小抑制性RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA))、核酶和小分子，或任何前述的活性片段。示例性神经学病症药物包括但不限于：抗体、适体、蛋白质、肽、抑制性核酸和小分子以及任何前述的活性片段，其本身或特异性识别和/或作用于(即抑制、激活或检测)CNS抗原或靶标分子，例如但不限于淀粉样前体蛋白或其部分、淀粉样蛋白β、β-分泌酶、γ-分泌酶、tau、α-突触核蛋白、帕金蛋白、亨廷顿蛋白、DR6、早老蛋白、ApoE、神经胶质瘤或其他CNS癌症标记物和神经营养蛋白。神经学病症药物及其可用于治疗的相应病症的非限制性实例：脑源性神经营养因子(BDNF)、慢性脑损伤(神经发生)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、抗表皮生长因子受体脑癌、(EGFR)-抗体、神经胶质细胞系衍生神经因子帕金森氏病、(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)肌萎缩性侧索硬化、抑郁症、脑溶酶体酶的溶酶体贮存病、睫状神经营养因子(CNTF)肌萎缩性侧索硬化、神经调节蛋白-1精神分裂症、抗HER2抗体(例如曲妥单抗)HER2阳性癌症的脑转移。
术语“显像剂”表示具有一种或多种特性的化合物，所述特性允许直接或间接地检测所述化合物的存在和/或位置。这样的显像剂的实例包括掺入允许检测的标记实体的蛋白质和小分子化合物。
术语“CNS抗原”和“脑靶标”表示在CNS(包括脑)中表达的抗原和/或分子，其可以被抗体或小分子靶向。这样的抗原和/或分子的实例包括但不限于：β-分泌酶1(BACE1)、淀粉样蛋白β(Aβ)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、tau、载脂蛋白E4(ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、亨廷顿蛋白、朊病毒蛋白(PrP)、富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受体6(DR6)、淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、p75神经营养蛋白受体(p75NTR)和胱天蛋白酶6。在一个实施方案中，所述抗原是BACE1。
术语“特异性结合”表示选择性或优先结合抗原的抗体。结合亲和力通常使用标准测定法来确定，如Scatchard分析法或表面等离振子共振技术(例如使用)。
“缀合物”是缀合至一个或更多个异源分子的融合蛋白，所述异源分子包括但不限于标记物、神经学病症药物或细胞毒素剂。
术语“接头”表示化学接头或单链肽接头，其将如本文报道的血脑屏障穿梭模块和/或融合多肽和/或缀合物的不同实体共价地连接在一起。接头将例如脑效应实体连接至单价结合实体。例如，如果单价结合实体包含CH2-CH3Ig实体和针对血脑屏障受体的scFab，则所述接头将scFab缀合至CH3-CH2Ig实体的C端末端。将脑效应实体缀合至单价结合实体的接头(第一接头)和将scFab连接至CH2-CH3Ig结构域的C端末端的接头(第二接头)可以相同或不同。
可以使用单链肽接头，其包含1至20个通过肽键连接的氨基酸残基。在某些实施方案中，所述氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在某些其它实施方案中，一种或更多种氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在其它实施方案中，所述接头是化学接头。在某些实施方案中，所述接头是具有至少25个氨基酸残基长度的氨基酸序列的单链肽接头，在一个优选的实施方案中，具有32至50个氨基酸残基的长度。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n接头，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8、9或10)或(x＝4和n＝6、7或8)，在一个实施方案中，其中x＝4，n＝6或7，在一个优选的实施方案中，其中x＝4，n＝7。在一个实施方案中，所述接头是(G4S)4(SEQ ID NO：37)。在一个实施方案中，所述接头是(G4S)6G2(SEQ ID NO：38)。
可以使用多种化学接头进行缀合。例如，使用多种双功能的蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯(dimethyl adipimidate)HC1)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯),可以缀合单价结合实体或融合多肽和脑效应实体。所述接头可以是“可切割的接头”，其促进效应实体在递送至脑后的释放。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari et al,Cancer Res.52(1992)127-131；US 5,208,020)。
共价缀合可以是直接的或通过接头进行。在某些实施方案中，直接缀合是通过构建多肽融合体进行(即通过编码针对BBBR的单价结合实体和效应实体的两种基因的基因融合，并表达为单一多肽(链))。在某些实施方案中，直接缀合是通过在针对BBBR的单价结合实体的两个部分之一上的反应基团与脑效应实体上的相应基团或接受体之间形成共价键进行。在某些实施方案中，直接缀合通过将要缀合的两种分子中的一种进行修饰(即基因修饰)而进行，从而包括在适当条件下形成与要缀合的另一个分子的共价连接的反应基团(作为非限制性实例，巯基或羧基)。作为一个非限制性实例，可以引入具有期望的反应基团(即，半胱氨酸残基)的分子(即，氨基酸)，例如针对BBBR抗体的单价结合实体中，并与神经学药物形成二硫键。使核酸与蛋白质共价缀合的方法也是本领域已知的(例如，光交联,参见,例如,Zatsepin等人，Russ.Chem.Rev.74(2005)77-95)。还可以使用多种接头进行缀合。例如，使用多种双功能的蛋白偶联剂可以缀合单价结合实体和效应实体，所述双功能的蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HC1)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。还可以使用肽接头，其包含1至20个通过肽键连接的氨基酸残基。在某些这样的实施方案中，所述氨基酸残基选自20种天然存在的氨基酸。在某些其它这样的实施方案中，一种或更多种氨基酸残基选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。所述接头可以是“可切割的接头”，其促进效应实体在递送至脑后的释放。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Res.52(1992)127-131；US 5,208,020)。
术语“与输注相关的副作用”是指与用治疗性抗体治疗受试者相关的非预期的不良事件。在一个实施方案中，这种输注相关的副作用选自由血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降和低体温(静脉内应用后)组成的组。在一个实施方案中，这样的事件是低体温，导致在静脉内施用治疗性抗体后两小时内体温下降。
术语“效应细胞”是指参与免疫应答的效应阶段的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(如B细胞和T细胞，包括细胞溶解性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达特异性Fc受体并实现特异性免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)，诸如能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如，表达Fc受体的单核细胞、巨噬细胞参与特异性杀伤靶细胞并将抗原呈递至免疫系统的其它组分，或与呈递抗原的细胞结合。
如下文所述，本文所用的术语“施用后减少副作用”是相对于施用后完全效应功能的mAb(即，具有完全的效应功能的抗体，在空间上或其他方面没有受到阻碍)具有的副作用。特别地并且出于实际原因，本发明的双特异性抗体减少的副作用可以相对于缺少特异性结合第一(细胞表面)靶标的两个结合位点，特别是缺少针对第一靶标的抗体的两个Fab部分的相同抗体来确定。与本发明的抗体进行比较的这样的构建体是例如在本文表1中显示为“mBS-无Fab”。
组合物和方法
抗运铁蛋白受体(TfR1)的抗体和抗体片段已用于通过受体介导的转胞吞作用将大分子转运到脑中(Yu等人，2011；Niewoehner等人,2014)。然而，最近的研究揭示了以前使用常规的抗TfR1的mAb所忽略的不利之处(Couch等人,2013)。在给药后直接在小鼠中观察到急性临床体征，这与mAb的效应功能状态有关。当使用双特异性mAb时，其中只有一个Fab臂结合TfR1，也观察到这种情况，前提是所述mAb含有天然的完全活性效应功能。综合起来，抗体的效应功能与观察到的急性临床体征直接相关，因此一种明显的策略是使用效应死亡变体。然而，对于某些mAb，天然效应功能对于作用模式和最佳治疗概况是至关重要的。通过mAb工程化和仔细的体外和在新型Fc人源化小鼠模型中的体内评估，比较BS-mAb系统的多个构建体(脑-穿梭模块，即单价抗TfR1结合位点与治疗性单克隆抗体的重链或轻链的C末端的Fc区的融合，产生脑穿梭-mAb(BS-mAb))，以评估使用天然IgG效应功能的潜在的AIR(急性输注反应)不利之处。
本发明至少部分基于这样的发现：靶向TfR1的BS-mAb的效应功能当结合TfR1时被掩蔽，但当其结合其CNS靶标时回到活性构型。不受该理论的束缚，当TfR1被BS Fab/BS-mAb结合时，这种双重行为可以归因于Fc区与免疫细胞上的FcγR结合的空间位阻。在此位置，BS-mAb的相反N端末端的两个Fab臂阻止BS-mAb的Fc区与效应细胞上的FcγR必要的接近。一旦BS-mAb从TfR1释放到CNS实质中，并且驻留靶标被N端Fab结合，则C端的游离BS-Fab不再干扰与驻留效应细胞上FcγR的相互作用。因此，这些数据为使用可安全转运穿过BBB的完全效应功能的mAb提供了基础。
本发明至少部分基于这样的发现：当mAb与TfR1结合时，靶向TfR1的BS-mAb的Fc区效应功能被掩饰，但是当mAb结合其CNS靶标时回到活性构型。
本发明至少部分基于以下发现：需要两个治疗靶结合Fab臂以最大化对FcγR募集的抑制作用，以便最小化与输注相关的体温下降和细胞因子释放。
因此，本文报道的效果与双特异性三价形式的BS-mAb有关，即全长二价单特异性抗体，其在其重链C端之一处与BS-Fab缀合。用常规的二价双特异性抗体没有观察到这种屏蔽作用。
下面用表示为BS-mAb31的脑穿梭单克隆抗体(BS-mAb)来举例说明本文报道的方法，所述抗体特异性结合作为治疗靶标的淀粉样蛋白-β原纤维/斑块(plaque)，并特异性结合作为BBB穿梭受体的人运铁蛋白受体1。MAb31是一种抗AβmAb，其特异性识别对Aβ斑块具有高表观亲和力的寡聚和原纤维结构(14)。所用的所有构建体含有具有完全效应功能的人天然IgG1Fc区，除了效应死亡(P329G/L234A/L235A)突变变体之外。这些构建体仅用于举例说明本发明，而不应被解释为对权利要求中所阐述的本发明范围的限制。
将BS模块融合到常规治疗性mAb的重链或轻链的C端的Fc区，产生脑穿梭-mAb(BS-mAb)。这保留了BS-mAb的天然构型，其具有两种不同的构型，该两种构型要么与靶标结合以实现治疗效果，要么与TfR1结合以进行BBB转运。
实验结果
脑穿梭-mAb以游离形式维持Fc区效应功能，并与治疗性抗原直接靶标衔接
Fc区效应功能负责抗体依赖的细胞介导的毒性作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性作用(CDC)。如下所述，BS-mAb31构建体和mAb31IgG对应物的FcγR结合被证实。
第一个结合研究是用溶液中的抗体(BS-mAb31和亲本mAb31)和固定在2维表面上的FcγR进行的。这允许确定溶液中游离mAb与任何方向固定的FcγR之间的相互作用(图1A)。首先，使用基于表面等离振子共振(SPR)的测定法，其中四种不同的FcγR作为固定的靶标被固定在流动通道中。SPR结果显示两种构建体结合不同的FcγR，相似并根据低和高亲和力受体(参见图1B和1C)。来自SPR实验的结合谱与报道的针对不同的FcγR的结合亲和力的等级次序一致(13)。
第二，进行细胞结合实验，其中不同的人FcγR在细胞上分别过表达。BS-mAb31和亲本mAb31结合得同样好(图1D和1E)，并且等级次序与SPR数据一致。
总之，当受体以无约束的方式(在SPR表面或更天然的细胞表面)存在时，这两种构建体(BS-mAb和亲本mAb)的Fc区-FcγR相互作用没有差异。这显示即使当BS模块融合到Fc区的C端末端时，参与FcγR相互作用的Fc区区域是完全功能性的。
接下来研究当抗体与其治疗性靶标相互作用时，BS-mAb31构建体是否保持Fc区效应功能。与溶液中游离的情况相比，与其靶标结合将以更明确的、硬性的、具有较少的空间位阻、更像天然的构象呈递用于FcγR相互作用的构建体(图2A)。因此，采用包被在表面上的人Aβ蛋白和单核细胞的抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)测定法被用于模拟呈递FcγR的效应细胞。使用两种不同的细胞因子作为细胞毒性的读出。发现BS-mAb31具有与亲本mAb31相当的效价(参见图2B和2C)。不受该理论的束缚，当脑穿梭构建体与其治疗靶结合时，其以防止来自BS模块的干扰的方向呈递Fc区。
在第二种测定法中，吞噬作用测定法，采用与原代人效应细胞一起培养的死后阿尔茨海默病(AD)脑组织切片(14)。AD脑切片与不同浓度的BS-mAb31和亲本mAb31预温育，随后与效应细胞温育。对于两种抗体，观察到Aβ斑块负荷的浓度依赖性降低(参见图2D和2K)。这些结果与现有技术一致，证实了Fc受体/小神经胶质细胞介导的mAb修饰的Aβ斑块的吞噬作用是脑中Aβ斑块清除的主要机制(15-17)。不受该理论的束缚，可以得出结论，当脑穿梭构建体与其在细胞表面上的治疗性靶标衔接或修饰脑中的Aβ斑时，FcγR衔接和小胶质细胞募集不受融合的BS模块的阻碍。
尽管有更快的血浆清除率，脑穿梭依然可改善mAb31在大脑中的体内功效
为了在合适的体内模型中转化体外斑块清除效果，在转基因淀粉样变性小鼠模型(APP London：APP V717I)中研究了BS-mAb31构建体对比亲本mAb31的斑块减少特性(18)。与mAb31相比，BS-mAb31的血浆暴露更低(参见图3A)。不受该理论的束缚，假设BS构建体的较低暴露归因于靶标介导的药物沉积(TMDD)，所述靶标介导的药物沉积通过结合至外周中的TfR1实现。
基于每周剂量设计了4个月的疗效研究，并模拟了血浆暴露(参见图3B)。对于亲本mAb31预计有更高和持久性暴露。然而，先前的数据也显示，在PS2APP转基因小鼠模型中，BS-mAb31的脑暴露明显大于亲本mAb31的脑暴露(9)。
研究了每周给药4个月后，抗AβmAb及其脑穿梭构建体在皮层中的靶标衔接。用BS-mAb31可检测到大体上更多的斑块修饰(图2C和2D)。在这4个月的长期治疗研究中，与载体对照和等摩尔的低剂量mAb31相比，可见到在BS-mAb31治疗的小鼠中皮层和海马中的Aβ淀粉样蛋白斑块明显减少，尽管脑穿梭的血浆暴露实质上降低(参见图2E和2F)。先前已经在另一种淀粉样变性转基因小鼠模型中显示了提高的功效，在该模型中阐明了单价TfR1衔接是绝对必要的(9)。
总之，该数据显示，在mAb31的C端连接的BS模块不干扰小胶质细胞上其与FcγR的相互作用。从而通过增强治疗性IgG的脑暴露，除了明显提高体内功效，还促进Aβ斑块清除(9)。
脑穿梭独特的TfR1结合模式减弱与FcγRs的衔接。
研究了BS-mAb31和抗-TfR1mAb的体外TfR1结合特性。BS-mAb31构建体含有一个抗-TfR1Fab作为C端BS模块。已发现BS-mAb31(图4A)和二价天然抗-TfR1mAb(图4B)与TfR1的结合是不同的，导致治疗实体(IgG)和Fc区对于环境的不同的空间呈现。
使用抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)测定确定了当构建体与TfR1结合时Fc区的功能。在该测定中，一个细胞表达TfR1，且另一个细胞(人NK92)具有表达FcγRIIIA的效应细胞的功能。ADCC是一种细胞介导的免疫防御机制，通过该机制免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞，该靶细胞的膜表面抗原已被特定抗体结合。
使用三种不同的IgG构建体已经分析了相互作用。如预期的那样，具有完全效应功能的标准抗-TfR1mAb(二价，单特异性)产生了强烈的ADCC应答。抗-TfR1单Fab mAb也产生ADCC应答，但由于失去了亲合(avid)结合而处于较高浓度(图4C)。所有细胞毒性作用均由Fc区介导。使用没有效应功能的抗-TfR1mAb(Fc区中的P329G/L234A/L235A突变)进行确认。该抗体在该ADCC测定中没有作用。有趣的是，具有一个或两个BS模块与mAb31的重链的C端融合的两个脑穿梭构建体，没有或只有非常低的细胞毒性水平(图4C)。在标准的抗-TfR1mAb引起最高ADCC效应的浓度下，对于抗-TfR1单Fab mAb，只有很小的作用被检测到，而所有其他构建体均没有可检测的效果(图4D)。
必须指出的是，对于dBS-2Fab形式，以前已经发现了较低的脑穿梭活性(9)。
这些结果不能由不同构建体之间的结合强度差异来解释，因为先前已显示dBS-2Fab构建体与抗-TfR1mAb构建体具有相似的表观TfR1结合亲和力，因为两个构建体均具有两个Fab结合TfR1结构域(9)。
因此，已经发现即使具有完全效应功能，脑穿梭构建体中的Fc区也不能有效地与某些FcγRs衔接以诱导ADCC应答。
具有效应功能的常规抗-TfR1mAb引起首次输注反应和细胞因子诱导。
如上所示，在脑中当BS-mAb构建体与其靶标衔接时，维持其效应功能。现在已确定当BS抗体通过BS模块结合至TfR1时，其效应功能将具有什么结果。鉴于近期的发现：在小鼠中标准的Y型抗-TfR1mAb治疗会引起急性临床体征(12)，这尤其重要。
第一步，在huFcγR转基因小鼠系统中进行了检查。简而言之，该模型是通过四个人的对应物(FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C和FCGR3B)对两个活化的低亲和力小鼠FcγR基因(Fcγr3和Fcγr4)的基因靶向替换而产生的(图5A)。这提供了足够的系统来评价人/人源化mAb与人FcγR之间在体内潜在的相互作用，从而触发效应功能。该模型使用遥测温度读出(图5B)来监测首次输液反应(FIR)。如上所述，FIR是由与FcγR相互作用和效应免疫细胞的募集而诱导的。该模型中的无线电记录系统允许动物在研究过程中自由移动。
第一，确定通过注射常规抗-TfR1mAb诱导的FIR。如在图5C中所示，常规抗TfR1mAb的注射导致体温的浓度依赖性和瞬时下降，所述体温在约两个小时内恢复到正常水平。
第二，确定通过注射单价形式的常规抗-TfR1mAb诱导的FIR。常规抗-TfR1mAb的单价形式仅包含一个针对TfR1的Fab臂。同样，该mAb强烈诱导FIR。因此，由此发现通过二价mAb结合的TfR1的二聚化/多聚化不引起温度下降。
第三，在该模型中使用抗TfR1mAb，观察到的效应功能对FIR的相对贡献是通过使用具有在Fc区中FcγR结合所需残基突变的mAb确定的(20)。缺少FcγR相互作用的Fc区三突变体P329G/L234A/L235A在模型中未显示温度下降(图5D)。因此，已经发现Fc区造成显著的FIR。使用Fc区效应功能消除的构建体的体外数据证实了这一点(图4C)。
确定不同细胞因子的水平，作为抗-TfR1mAb施用的应答。发现某些细胞信号分子的浓度大大增加(图5E)。特别是，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、角质形成细胞衍生的细胞因子(KC)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP-2)和干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)显示出强烈的应答。这些细胞因子应答可以与嗜中性粒细胞活化相关。如在温度读出实验中所见，当使用具有消除的Fc区效应功能的IgG构建体时，几乎不产生对细胞因子诱导的效果(图5E)。
因此，已经在体外和体内发现：与TfR1结合的IgG使Fc区处于外周效应细胞可及的位置，并可引起适应性免疫应答。
针对TfR1的脑穿梭结合模式使效应功能沉默，并减弱首次输注反应和细胞因子的 产生。
上面的数据证明，当BS模块与其治疗性靶标结合时，不会削弱mAb效应功能(图2和3)。另一方面，已经发现常规的mAb与TfR1结合可以通过Fc区介导的效应功能诱导FIR(图4和5)。
由于TfR1在外周细胞上广泛表达，因此确定了TfR1通过BS模块与这些细胞类型结合的结果。为了评估这一点，三种不同的BS-mAb构建体被施用于huFcγR转基因小鼠(图6A)。这些都具有人天然的IgG1效应功能，但不同在于治疗有效的Fab数量(＝结合位点)。
出乎意料的是，对于标准BS-mAb(在图中表示为mBS-2Fab)构建体未观察到FIR，表明BS-mAb不会在体内外周触发FcγR活化(图6B)。
不受此理论的束缚，假设以下内容：当BS-mAb通过BS模块结合至TfR1时，BS-mAb以不适合Fc区识别的构型呈现在细胞表面(图4A)。该构建体的mAb部分呈相反方向，两个Fab臂从细胞表面延伸出。在这样的构型中，结合的BS-mAb的Fc区相对于相邻效应细胞上的FcγR以相反的方向放置。可以假设，相对于FcγR的Fc区的相反方向或远离细胞表面延伸的治疗性靶标结合Fab臂在FcγR相互作用的消除和用BS-mAb构建体观察到的FIR沉默中起作用。
设计了在mAb部分上缺失一个或两个治疗靶标结合Fab臂的两种构建体(图6A)。将这些构建体应用于huFcγR转基因小鼠时，明显引起FIR，如通过快速而强烈的温度下降所评分(图6B)。对于缺少两个Fab臂(BS-无Fab)的构建体，温度下降甚至更加明显。通过分析在FIR期间引起的细胞因子模式，进一步证实了用不同构建体观察到的温度下降。如图6C所示，仅引起温度下降的构建体BS-无Fab也展示升高的细胞因子水平。与此相反，当对huFcγR小鼠施用时，标准BS-mAb构建体不会引起细胞因子上调(图6C)。BS-mAb的细胞因子概况与用效应死亡构建体获得的细胞因子概况相当(参见图5D)。这说明了在适当的位置呈递IgG的Fc区以与FcγR衔接的重要性。
因此已经发现，需要两种治疗性靶标结合Fab臂以最大化对FcγR募集的抑制作用，以便最小化FIR和细胞因子释放。
还研究了BS-mAb构建体的剂量应答(图6D)，在最高剂量(20mg/kg)下可检测到小的和短暂的效应。该剂量比减少斑块形成的非常有效的治疗剂量高10倍(图3E和3F)。
当将标准抗-TfR1mAb与BS-无Fab进行比较时(图6E)，缺少两个Fab臂的构建体也比常规mAb诱导更强的温度下降，即使Fc区以相反方向呈现且BS-无Fab以单价态衔接，缺乏亲合力结合的贡献。
抗-TfR1mAb的特异性细胞因子标记和通过脑穿梭构建体减弱的效应。
对各种mAb构建体的细胞因子谱进行了更详细的分析。生成了热图以突出显示关键的细胞因子(图7)。特别地，两种细胞因子应答非常不同。
血管内全身光学成像显示脑穿梭构建体减弱ROS产生。
活性氧类别(ROS)是化学反应性的化学类别。在标准抗-TfR1mAb和脑穿梭构建体上外周施用后，扫描全身ROS类别的诱导。在图8A中，代表性图像显示抗-TfR1mAb和BS-mAb(mBS-2Fab)构建体之间的差异。定量数据并且与载体组相比，BS-mAb(mBS-2Fab)没有显示显著的差异(图8B)。
不同mAb构建体的结构建模显示与FcγR衔接的主要差异。
使用分子结构信息分析了三种不同构建体之间的Fc区-FcγR相互作用，所述三种构建体或者通过mAb靶标结合或者通过BS-模块结合被呈递在表达TfR1的细胞表面上。在图9中，总结了主要观察结果。
第一，已经对在一个细胞表面上与其治疗性靶标结合的标准BS-mAb以及与相邻细胞表面上展示的FcγR衔接的可能性进行了建模(图9A和9D)。该模型预测了对FcγR的自由接近和聚簇。同样，图9A和9D还显示，在标准IgG C端存在额外的BS模块(抗-TfR1CrossFab)不会干扰FcγR结合。
第二，对在体内非常有活性的BS-无Fab构建体进行了建模。该构建体与TfR1结合时以有利的方式呈递给FcγR，并且以与标准mAb与其靶标结合时相似的方式允许聚簇(图9B和9E)。
第三，对脑穿梭构建体(BS-mAb＝mBS-2Fab)进行建模。已经发现该模型支持本文报道的体内发现，即治疗性抗原结合Fab定位在非常靠近FcγR的位置，并且特别是似乎阻止了BS-scFab/FcγR复合物的紧密聚簇(图9C和9F)。
概要
在许多情况下，Fc区依赖的效应功能是某些mAb作用机制的一部分用于在CNS领域中具有治疗功效。mAb与其同源抗原结合，并又被免疫细胞细胞表面上的特定Fc受体识别。这些Fc受体的交联导致几种效应细胞功能的激活(22)。这样，mAb是免疫系统两臂之间的桥梁，将适应性免疫系统识别的特异性与先天免疫系统细胞的破坏潜力桥接在一起。效应功能可能对于治疗效果至关重要的实例包括阿尔茨海默病和帕金森病，其中聚集的淀粉样蛋白-β、磷酸化的tau蛋白和α-突触核蛋白需要通过FcγR结合和小胶质细胞吞食来去除。BS-mAb构建体包含一个额外的结合结构域(BS模块)，其将结合外周组织中的TfR1，并使mAb在表达运铁蛋白受体1的细胞表面上以完全不同的排列定向(图4A)。
现在，本发明人已经发现，当BS-mAb通过mAb的Fv部分结合至其治疗靶标时，完全能够刺激效应功能。因此，重链上的C末端连接的BS模块不干扰Fc-FcγR募集和结合。BS-mAb和亲本mAb具有同等效力(图2显示其对于示例性抗-AβmAb的作用；两种抗体在刺激Aβ的神经胶质吞食方面均具有同等效力，已显示直接依赖于效应功能(23))。
在BS-mAb可以在脑中促进其治疗作用之前，该构建体在施用后将在血流中循环(全身性的)。因此，它将与在多种细胞类型上表达的TfR1衔接(24)，并穿过BBB转运。该TfR1参与体循环可能会产生涉及Fc区效应功能的局部炎性反应。
通过使用新型huFcγR转基因小鼠模型(其表达关键的huFcγR，概括了人类表达谱)，基于适应性遥测监测系统(允许连续收集温度数据)评估了由人/人源化mAb触发的FIR。在野生型动物中发现的FIR应答要低得多(这反映了小鼠与人FcγR之间的固有差异)，这证明了使用这种人源化FcγR模型用于研究人/人源化mAb的重要性。
已经发现，具有天然IgG1Fc区的常规二价抗TfR1mAb引起强烈的FIR(参见图5C)。还已经发现，与FIR相关的温度变化是由Fc区-FcγR相互作用驱动的，因为效应子-死亡变体是完全无活性的。
已经发现，包含完全天然的人IgG1Fc区的BS-mAb构建体可以与FcγR受体完全相互作用，这取决于结合模式。设计BS-mAb以通过与CNS血管腔部分上的TfR1结合，通过穿过BBB的迁移而促进其进入CNS。因此，内皮TfR1的结合先于大脑驻留靶标的结合。因此，由于广泛表达的TfR1的外周参与，理想情况下，BS-mAb构建体不应引起诸如FIR之类的系统性不良反应。在穿过BBB后，相同的BS-mAb需要在结合局部表达的靶抗原后保留完整的效应功能，例如：用于小胶质细胞辅助的斑块清除。现已发现，使用温度读出，向huFcγR小鼠全身施用BS-mAb构建体不会诱导可测量的FIR，即使该构建体在外周结合小鼠TfR1并具有完全功能的Fc区(图6B)。
本发明人已经发现，空间位阻是这种差异行为的原因。已经发现，即使当C端BS结合TfR1时由于非天然取向而使Fc部分反转，缺乏天然Fab臂的构建体也恢复引起FIR的能力。
已经发现，仅包含一个与BS模块相对的Fab臂的构建体显示出中等的FIR效应(图6B)。
使用建模方法，已经发现在标准IgG形式的抗-TfR1抗体的情况下，其抗-TfR1 Fab之一与靶细胞上的TfR1的结合以其天然构型展示Fc区以与FcγR相互作用。
不受该理论的束缚，第二非结合的Fab受到抗体铰链中的二硫键的约束，因此可能会仿效向下指向靶细胞。或者，第二Fab可以结合靶细胞上的另一个TfR1受体。
Fc-抗-TfR1Fab的C端融合可实现不受阻碍的FcγR相互作用，因为抗-TfR1Fab通过4x G4S柔性接头的C端融合不会干扰主要涉及Fc区的N端部分的Fc区-FcγR相互作用。在溶液中以及在细胞-细胞相互作用时或如在这种靶标(即Aβ斑块)-细胞相互作用情况下就是这种情况。因此，当与其靶标相互作用时，BS-mAb Fc区与效应细胞上的Fcγ受体的相互作用不受C端融合的脑穿梭模块(即单价抗-TfR1抗体)的影响。
不受此理论的束缚，当BS-mAb构建体与TfR1结合时，情况是不同的，其中两个天然的N端治疗性靶标结合Fab片段(在不存在靶标可能与它们的Fc区大致在同一平面上的情况下)正在形成空间位阻。尽管Fc区仍可以实现与单个FcγR的结合，但可能阻碍了FcγR二聚化或多聚化所必需的额外的FcγR的接近，从而抑制了ADCC的形成。图9中概述了这一概念，该图说明与靶向的IgG-抗-TfR1 Fab C端融合复合物相比，标准IgG和Fc-抗-TfR1 Fab C端融合复合物更可能实现多个FcγR分子的侧向接近。一种备选的或补充的解释是，货物IgG上的天然Fab由于体积大而增加了吞噬杯内细胞之间的间隙，因此无法在空间上排除扩散屏障之外的磷酸酶(25，26)。这将阻止吞噬杯中亚微米级的磷酸酶和激酶的关键分离，这是激活下游激酶信号传导所需的。
综上所述，已经发现在常规mAb的C端附加BS模块不会干扰由Fc区和FcγR相互作用介导的BS-mAb形式的治疗效果。还发现当TfR1在外周被BS模块衔接而被沉默时，在BS-mAb中，Fc区介导的效应功能潜在地导致FIR。不受此理论的束缚，BS-mAb形式的这种有益特性归因于两个天然IgG货物Fab臂在与BS模块相对的N端位置施加的空间位阻。这种独特的特征允许进一步开发与野生型Fc的BS-mAb融合物，然后所述融合物仅在其治疗靶点上能够发挥其所需的FcγR相关药理作用，而无FIR风险。
药物制剂
制备了用于应用抗-脑靶标/人运铁蛋白受体抗体的药物制剂，其中所述抗-脑靶标/人运铁蛋白受体抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对)，特异性结合人运铁蛋白受体的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区，通过将具有所需纯度的这种抗体与一种或更多种可选的药学上可接受的载体混合，以冻干制剂或水溶液形式来制备所述药物制剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(ed.)(1980))。药学上可接受的载体通常在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，包括但不限于：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的反离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性的sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20描述于US 2005/0260186和US 2006/0104968中。一方面，将sHASEGP与一种或更多种额外的糖胺聚糖酶(如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于US 6,267,958。含水的抗体制剂包括在US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
对于所治疗的特定适应症，如果需要，本文的制剂还可以含有一种以上的活性成分，优选地是那些具有不会不利地影响彼此的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对于预期目的有效的量组合存在。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可以容易地实现，例如通过无菌滤膜过滤。
治疗方法和组合物
在一方面，提供了一种抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对)，特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区，其用于治疗神经学病症，具有减少/预防与输注相关的体温下降。在某些实施方案中，提供了一种抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对)，特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区，其用于神经学疾病的治疗方法中，具有减少/预防的与输注相关的体温下降。在某些实施方案中，本发明提供一种抗脑靶标/人转铁蛋白受体抗体，其中抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对),特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区，用于患有神经学病症的个体的治疗方法中，所述方法包括对该个体施用有效量的抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对)，特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区，其中减少/预防与输注相关的体温下降。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂。在进一步的实施方案中，本发明提供一种抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对),特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区，用于减少/预防与输注相关的体温下降。在某些实施方案中，本发明提供一种抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体，其中抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对),特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区，用于减少个体输注相关的体温下降的方法中，所述方法包括对个体施用有效量的抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体，其中抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对),特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区。根据以上实施方案中的任何一个的“个体”优选地是人。
在另一方面，本发明提供了一种治疗神经学病症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对患有这种神经学病症的个体施用有效量的抗脑靶标/人运蛋白受体1抗体，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对),特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂。根据以上实施方案中的任何一个的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供了一种用于减少个体中与输注相关的体温下降的方法。在一个实施方案中，该方法包括对个体施用有效量的抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对),特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区。在一个实施方案中，“个体”是人。
抗脑靶标/人运蛋白受体1抗体可以单独使用或可以与其他药物联合用于治疗，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对),特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区。例如，这样的抗体可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。
抗脑靶标/人运蛋白受体1抗体将被配制，给药和以符合良好医疗规范的方式施用，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对),特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区。在此上下文中考虑的因素包括正在治疗的特定病症，正在治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床病况，病症的原因，药物的递送部位，施用方法，施用时间表，以及其他医学从业人员已知的因素。该抗体不是必须但可选地与目前用于预防或治疗讨论中的病症的一种或更多种试剂一起配制。这些其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量，病症或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述的剂量的约1-99％，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，合适剂量的抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体(当单独使用或与一种或更多种额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型，抗体类型，疾病的严重程度和病程，出于预防还是治疗目的而施用抗体，既往治疗，患者的临床病史和对该抗体的应答以及主治医师的酌处权，其中所述抗脑靶标/人运铁蛋白受体1抗体具有特异性结合脑靶标的两个结合位点(VH/VL对),特异性结合人运铁蛋白受体1的一个结合位点(VH/VL对)和具有效应功能活性的(天然)Fc区。一次或经过一系列治疗将抗体适当地施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度，大约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的抗体可以作为向患者施用的初始候选剂量，例如，通过一次或更多次单独施用或连续输注。取决于上述因素，一种典型的每日剂量范围可能约1μg/kg至100mg/kg或更高。对于几天或更长的重复施用，取决于病情，通常将持续治疗直至出现疾病症状所需的抑制。抗体的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg的一种或更多种剂量(或其任意组合)。这样的剂量可以间歇地施用，例如，每周或每三周(例如使患者接受约二至约二十剂量，或例如约六剂量的抗体)。可以施用初始较高的负荷剂量，随后施用一个或多个较低剂量。示例性的给药方案包括施用约4mg/kg的初始负荷剂量，随后每周约2mg/kg的抗体维持剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法很容易监测该疗法的进展。
对于本发明的双特异性抗体的施用的典型输注速率在50ml/h至400ml/h之间，特别是≥50ml/h、≥100ml/h、≥150ml/h或≥200ml/h；例如100ml/h至400ml/h，150ml/h至400ml/h或200ml/h至400ml/h。
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求中阐明。应该理解的是，可以在不背离本发明的精神的前提下对所提出的步骤进行修改。
附图说明
图1图1A-1E显示在BS-mAb31构建体中，当其游离于溶液中时，体外FcγR结合和Fc区功能是保守的。图1A说明在自由溶液中与细胞表面上的FcγR结合的脑穿梭构建体，所述结构包括FcγR、Fc区、Fab和BS模块。图1B描述表面等离振子共振(SPR)传感图，其显示不同的FcγR的固定(第一信号)和抗-Aβ抗体mAb31与其的结合(第二信号)。图1C描述表面等离振子共振(SPR)传感图，其显示不同的FcγR的固定(第一信号)和抗Aβ抗体mAb31(BS-mAb31)与其的结合(第二信号)。图1D描述mAb31(空心符号)和BS-mAb31(实心符号)与huFcγRI(三角形)或huFcγRIIIa(圆形)的细胞结合，其证明两种构建体都具有与这两种FcγR相当的亲和力，并且对高亲和力huFcγRI更强。图1E描述mAb31(空心符号)和BS-mAb31(实心符号)与huFcγRIIa(正方形)或huFcγRIIb(菱形)的细胞结合，显示两种构建体都具有与这两种低亲和力huFcγR相当的亲和力。
图2图2A-2K显示当参与Aβ靶标结合时，在BS-mAb31构建体中，体外FcγR结合和Fc区功能是保守的。图2A说明当抗-AβFab臂结合Aβ时，脑穿梭构建体结合FcγR，所述结构包括FcγR、Fc区、Fab和BS模块。图2B和2C描述mAb31和BS-mAb31的体外ADCC活性，使用Aβ1-42包被的表面和U937单核细胞效应细胞测量IL-8释放(图2B)或IP-10释放(图2C)。两种构建体具有相似的ADCC活性。图2D-2K显示人Aβ斑块的细胞吞噬作用。人AD脑切片与mAb31(图2D-2G)或BS-mAb31(图2H-2K)预温育，随后在作为效应细胞的原代人巨噬细胞存在下培养细胞。所使用的等摩尔浓度是0μg/ml(图2D和2H)、1μg/ml(图2E和2I)、5μg/ml(图2F和2J)和5μg/ml(图2G和2K)，不含原代人巨噬细胞。然后用抗-Aβ抗体标记斑块。数据显示两种构建体的相似的浓度依赖的吞噬作用活性和体外斑块清除。
图3图3A-3F说明BS-mAb31构建体的体内靶衔接和淀粉样蛋白β减少。图3A显示在C57BL6雄性小鼠中进行的药代动力学，且与mAb31相比，BS-mAb31的血浆暴露较低。BS分子的较低暴露归因于结合外周中的TfR1。图3B显示然后使用药代动力学参数模拟慢性剂量分布，所述药代动力学参数由单剂量PK数据以合适的使用剂量确定。图3C-3D显示在mAb31(图3C)和BS-mAb31(图3D)的最终4个月的剂量后评估斑块结合。用mAb31或BS-mAb31处理APPLondon小鼠4个月。显示在17.5个月大时处死的未经处理的动物的斑块负荷作为研究开始时淀粉样变性的基线水平用于比较。图3E-3F显示，与在载体和mAb31组中看到的进行性斑块形成相比，在皮质(图3E)和海马(图3F)上的用BS-mAb31处理后的斑块数量的强烈且显著的减少是明显的。
图4图4A-4E说明TfR1结合的BS-mAb31的取向在次优位置上展示Fc区，以在相邻细胞上产生有效的FcγR相互作用。图4A和4B是脑穿梭构建体(图4A)或结合细胞表面上的TfR1的标准抗-TfR1 IgG mAb(图4B)的示意图。TfR1、Tf、BS模块、Fc区和货物Fab(治疗性结合位点)。图4C显示不同构建体的细胞毒性曲线。抗-TfR1IgG1抗体引起BaF3靶细胞的ADCC，而BS构建体具有减弱的活性。标准抗-TfR1mAb(圆形)，具有单个Fab的标准抗-TfR1mAb(带误差线的正方形)，BS-2Fab三角形，BS-mAb)，dBS-IgG(三角形)，对照IgG(菱形)，标准抗-TfR1 mAb PGLALA(不带误差线的正方形)。图4D显示在具有标准抗-TfR1mAb最大效果的浓度下各构建体的总细胞毒性值；只有具有一个Fab的标准抗-TfR1mAb显示小的效果，而所有其它构建体没有可检测的ADCC活性。所有的构建体均含有完全功能性的人IgG1Fc区。图4E显示在ADCC测定法中研究的构建体的示意图。标绘的值是平均值±SD(n＝3)，****p≤0.0001(t检验，与标准抗-TfR1mAb给药的动物相比)。
图5图5A-5E显示具有效应功能的标准抗-TfR1mAb诱导第一输注反应和细胞因子诱导。图5A说明FcγR人源化小鼠模型的设计的概述。基因靶向的FcγR基因座交换。图5B说明使用皮下注射的胶囊，用无线系统监测小鼠的温度变化；在研究期间允许动物自由活动。图5C显示FIR可在FcγR人源化小鼠中被引起，且其特征在于体温下降。标准抗-TfR1 mAb诱导剂量(在5mg/kg(圆形)和20mg/kg(正方形)时)依赖的瞬时温度降低，载体对照(三角形)。图5D显示FIR应答需要完全活性的效应功能，因为标准抗-TfR1mAb PGLALA(实心圆)在20mg/kg时不诱导温度下降。标准抗-TfR1 mAb(实心三角形)和载体(空心三角形)被包括在内作为对照。图5E显示血液中的一组细胞因子在注射后2小时被监测。在标准抗-TfR1mAb(阴影条形)组中对于某些细胞因子有强烈增加，其在没有效应功能的组中几乎减少(标准抗-TfR1 mAb PGLALA，白色条形)。
图6图6A-6E显示具有效应功能的抗-TfR1脑穿梭构建体减弱第一输注反应和细胞因子诱导。图6A显示了三种不同的经改造和生产的用于测试的脑穿梭构建体。构建体之间的差异是货物Fab的缺失，以研究当构建体结合TfR1时如何影响FcγR的体内衔接。图6B显示当在相同研究中在5mg/kg测试三种构建体时的结果。mBS-2Fab(BS-mAb；三角形)未诱导FIR，而缺乏两个货物Fab的构建体具有最强的效果(正方形)。一个货物Fab构建体(圆形)在其它两个构建体之间。图6C显示在注射构建体后2小时血液中一组细胞因子的细胞因子应答％。只有mBS-无Fab(空心条形)诱导了某些细胞因子的强烈诱导，而mBS-2Fab(BS-mAb；阴影条形)没有显著的效果。图6D比较BS-sFab的两个剂量，5mg/kg(空心三角形)和20mg/kg(实心圆)以及载体组(实心三角形)。在20mg/kg时对于BS-sFab有小的和非常瞬时的温度下降。图6E显示与BS-无Fab构建体相比，标准抗TfR1mAb的通过温度下降监测的FIR。有趣的是，BS-无Fab(正方形)更有效地诱导FIR。载体组(三角形)包括在内。
图7图7说明具有效应功能的标准抗-TfR1mAb诱导的不同的细胞因子模式，所述效应功能对于脑穿梭构建体而言减少。在图7的左上角显示参考颜色(比例尺)。热图显示在5mg/kg剂量时对于各种构建体的概况。显示对于两种细胞因子和各种构建体的温度-细胞因子关系。产生热图以强调关键细胞因子。特别地，两种细胞因子的应答非常不同。
图8图8A-8B显示具有效应功能的标准抗-TfR1mAb诱导ROS活化，其使用脑穿梭构建体而减轻。图8A显示使用全身成像检测ROS诱导。图8B描述ROS产生的定量，显示仅抗-TfR1mAb诱导强反应，这与FIR数据一致。
图9图9A-9F说明推定的FcγR/TfR1结合模式的分子建模。图9A和9D表示标准IgG(可选地具有C端抗-TfR1CrossFab融合)；图9B和9E表示BS-无Fab(Fc-抗-TfR1CrossFab C端融合)；以及图9C和9F表示BS-mAb(mBS-2Fab；靶向的IgG-抗-mTfR1CrossFab C端融合)。图9A-9C显示侧视图，效应细胞和其上的FcγR在顶部，且各自的靶标(分别为TfR1和斑块)在底部。图9D-9F显示在效应细胞膜的基底外侧的顶视图，并近似显示图9A-9C中所示的多个复合物如何在相互作用配偶体平面上侧向聚簇。图9A和9D显示当标准IgG与其治疗性靶标结合时，标准IgG与效应细胞上的FcγR的相互作用是可能的。图9A和9D还显示在标准IgG的C-末端存在额外的BS模块(抗TfR1CrossFab)不干扰FcγR结合。图9C和9F显示，当BS-mAb结合至TfR时，BS-mAb与效应细胞上的FcγR的相互作用是不可能的。
引用的参考文献列表
1.Lajoie,J.M.and Shusta,E.V.,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.55(2015)613-631.
2.Pardridge,W.M.,Clin.Pharmacol.Ther.97(2015)347-361.
3.Jefferies,W.A.,et al.,Nature 312(1984)162-163.
4.Friden,P.M.,et al.,Science 259(1993)373-377.
5.Fishman,J.B.,et al.,J.Neurosci.Res.18(1987)299-304.
6.Pardridge,W.M.,et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.259(1991)66-70.
7.Roberts,R.L.,et al.,J.Cell.Sci.104(1993)521-532.
8.Yu,Y.J.,et al.,Science Translat.Med.3(2011)84ra44.
9.Niewoehner,J.,et a.,Neuron 81(2014)49-60.
10.Bien-Ly,N..,et al.,J.Exp.Med.211(2014)233-244.
11.Yu,Y.J.,et al.,Science Translat.Med.6(2014)261ra154.
12.Couch,J.A.,et al.,Science Transl.Med.5(2013)183ra157,181-112.
13.Bruhns,P.,et al.,Blood 113(2009)3716-3725.
14.Bohrmann,B.,et al.,J.Alzheimer’s Dis.28(2012)49-69.
15.Bard,F.,et al.,Nature Med.6(2000)916-919.
16.Nicoll,J.A.,et al.,Nature Med.9(2003)448-452.
17.Boche,D.,et al.,Brain 131(2008)3299-3310.
18.Dewachter,I.,et al.,Exp.Geront.35(2000)831-841.
19.Zhang,Y.,et al.,J.Neurosci.34(2014)11929-11947.
20.Wines,B.D.,et al.,J.Immunol.164(2000)5313-5318.
21.Friden,P.M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)4771-4775.
22.Nimmerjahn,F.and Ravetch,J.V.,Nat.Rev.Immunol.8(2008)34-47.
23.Adolfsson,O.,et al.,J.Neurosci.32(2012)9677-9689.
24.Ponka,P.,et al.,Semin.Hematol.35(1998)35-54.
25.Freeman,S.A.,et al.,Cell 164(2016)128-140.
26.Chang,V.T.,et al.,Nature Immunol.17(2016)574-582.
27.Saphire,E.O.,et al.,Science 293(2001)1155-1159.
28.Bujotzek,A.,et al.,mAbs 7(2015)838-852.
29.Ramsland,P.A.,et al.,J.Immunol.187(2011)3208-3217.
30.Lawrence,C.M.,et al.,Science 286(1999)779-782.
31.Rayner,L.E.,et al.,J.Biol.Chem.290(2015)8420-8438.
32.Saphire,E.A.,et al.,Science 293(2001)1155-1159.
本文引用的所有其它专利和非专利参考文献通过引用整体并入本文。
实施例
实施例1
脑穿梭构建体
通过将编码IgG重链和轻链的cDNA分别克隆到哺乳动物表达载体中，产生抗体构建体。所有抗体恒定区是人的，可变区是人或大鼠的，这取决于所使用的抗体。通过将单链Fab构建体(其中重链和轻链通过G4S接头连接)再次经由G4S接头融合至IgG重链的3'端，实现Fab融合至Fc C端。使用杵臼技术获得不对称的构建体(Ridgway等人，1996)。在HEK293或CHO-K1细胞中表达构建体，并通过标准蛋白A亲和，随后通过尺寸排阻层析(SEC)纯化。通过毛细管电泳和SEC常规地分析抗体制备物，并测量内毒素含量。
相应地产生了以下构建体，并用于本文报道的实施例中：
表1：本文使用的示例性的构建体
实施例2
通过表面等离振子共振对Fcγ受体的结合评估
对于FcγR的测量，使用SPR捕获测定法。通过使用由GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒，在pH5.0下将捕获系统(10μg/ml Penta-His；Quiagen cat.34660)的约5000个共振单位(RU)偶联在CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上。样品和系统缓冲液是PBS-T+pH7.4。将流动池设定为25℃，并将样品组块设定为12℃并用运行缓冲液引发两次。通过以10μl/min的流速注射5μg/ml溶液60秒，捕获FcγR-His-受体。通过以10μl/min的流速注射100nM抗体样品180秒来测量结合。通过用10mM甘氨酸pH1.7溶液以10μl/min的流速洗涤30秒再生表面。用该测定法来确定IgG或BS-IgG构建体与FcγR的结合。
实施例3
原代人细胞的分离和吞噬作用测定
通过Ficoll密度离心从来自血沉棕黄层(从当地血库获得)的人外周血单核细胞(PBMC)获得单核细胞。使用分离法(Miltenyi Biotec,Germany#130-091-153)通过磁性标记从PBMC中分离单核细胞，该分离法由单核细胞分离试剂盒II组成，用于通过非单核细胞的消耗(阴性选择)来分离人单核细胞。通过加入0.3g/mL人巨噬细胞集落刺激因子(GenScript Z02001)，单核细胞分化为巨噬细胞。在具有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Gibco#15140-122)的RPMI 1640(Gibco#61870-044)培养基中培养经分化的人巨噬细胞。经分化的巨噬细胞在抗体依赖的细胞吞噬作用测定中温育，采用冷冻切片的死后人AD脑切片作为底物。以20μm的标称厚度制备来自皮质区的人AD脑组织切片(Braak阶段VI)，并将其置于可移除的聚-D-赖氨酸包被的2孔培养皿(BiocoatTM#40629)上。将脑切片与不同浓度的Ganternerumab预温育1小时，用PBS洗涤，然后以0.8至1.5×106个细胞/mL接种人原代细胞，并在37℃下用5％二氧化碳培养2至3天。不相关的人IgG1(Serotec，PHP010)抗体用作额外的对照。在室温下，在用2％甲醛固定10分钟，洗涤并用10g/ml与AlexaFluor488缀合的BAP2染色1小时后，检测淀粉样蛋白斑块。用如上所述的针对A的抗体和Ganteneumab和针对LAMP2的溶酶体标记抗体(Fitzgerald Industries Intl的RDI Division)进行巨噬细胞的双标记。
实施例4
免疫组织化学
在PBS灌注后制备脑，并且根据Paxinos和Franklin的脑图集切割在侧向～1.92和1.68毫米之间的矢状冷冻切片。使用Leica CM3050 S低温恒温器在-15℃下以20微米的标称厚度将脑切片，并将其置于预冷的载玻片上(Superfrost plus,Menzel,德国)。对于每个脑，将三个间隔80微米的切片沉积在同一载玻片上。
切片在PBS中再水合5分钟，随后用预冷至-20℃的100％丙酮浸泡2分钟。所有附加的步骤在室温下进行。用PBS，pH7.4洗涤具有脑切片的载玻片，并通过在Ultra V block(LabVision)中连续温育5分钟，随后用PBS洗涤并在Power封闭溶液(BioGenex)中与在PBS中的2％标准山羊血清温育20分钟，封闭非特异性结合位点。将载玻片与浓度20μg/ml的二级抗体(缀合至Alexa Fluor 555染料的亲和纯化的山羊抗人IgG(重链和轻链特异的)(#A-21433，批号54699A，Molecular Probes))在PBS，pH7.4中的2％标准山羊血清中直接温育1小时。用PBS大量洗涤后，通过用BAP-2(一种缀合到Alexa Fluor488染料的针对Aβ的罗氏内部鼠单克隆抗体)，以0.5μg/ml在含Power封闭溶液(BioGenex)和10％标准绵羊血清的PBS中温育1小时，双标记Aβ斑块来评估斑块的定位。PBS洗涤后，通过在50mM乙酸铵pH 5中的4mM CuSO4中温育30分钟淬灭，降低脂褐质的自发荧光。用双蒸馏水冲洗载玻片后，用共聚焦基质(Micro Tech Lab，奥地利)包埋载玻片。
实施例5
显微镜检查和图像处理
拍摄来自每个PS2APP小鼠的脑的每个切片的三幅图像，所述PS2APP小鼠在额皮质(初级运动皮质区)中具有含斑块的区域。用具有设置为1艾里(Airy)的针孔设置的LeicaTCS SP5共焦系统记录图像。用Alexa Fluor 488染料免疫标记的斑块在具有调整的光电倍增增益和抵销(通常分别为770V和-0％)的相同的光谱条件下(488nm激发和500-554nm带通发射)在30％激光功率下被捕获。在561nm激发激光线处，在范围570至725nm(覆盖所应用的检测抗体的激发范围)的窗口处，记录组织切片的可及表面上的结合的二级Alexa Fluor555抗体。仪器设置保持恒定用于图像采集，以允许对测试的人抗-Aβ抗体进行比较强度测量；特别是激光功率、扫描速度、增益和抵销。激光功率被设置为30％，且PMT增益的设置通常为850V，标称抵销为0％。这使得能够以相同的设置可视化微弱的和强染色的斑块。采集频率为400Hz。利用HCX PL APO 20x 0.7 IMM UV物镜在水中以512×512像素分辨率将共聚焦扫描记录为单个光学层，并交互地控制在垂直轴的光学测量深度，以确保在组织切片中成像。对位于额皮层的2-5层中的淀粉样蛋白-β斑块成像并定量荧光强度。
实施例6
统计学分析
免疫阳性区域可视化为TIFF图像，并用ImageJ版本1.45(NIH)处理以定量荧光强度和面积(以像素为单位)。为了定量，在每个图像中减去5的背景强度，并滤出小于5平方像素的阳性区域。将选定等值面的总荧光强度确定为单个单独的阳性区域强度的总和，并用总强度除以所分析的像素数来计算平均像素强度。使用Microsoft Excel(Redmond/WA,美国)从所有测量的等值面(获自每只动物从三个不同切片拍摄的九张图片)计算平均值和标准差值。使用用于组比较的斯氏t检验或Mann-Whitney检验进行统计学分析。
实施例7
药代动力学研究
使用平均体重30g的C57BL6雄性小鼠实施mAb31和BS-mAb31两者的药代动力学研究。分别以5mg/kg和10mg/kg将各自的抗体静脉内推注施用于小鼠(n＝3小鼠/药物)。使用毛细管微量取样在各个时间点制备K2EDTA血浆样品，以允许对于每只小鼠在2周内的完整的血浆药代动力学概况。使用抗-人CH1/CL1(κ)捕获/检测免疫分析法分析样品，以确定药物量。使用两室药代动力学模型，使用Pharsight Phoenix 64分析浓度-时间概况。然后使用由所用的适当剂量下的单剂量PK数据确定的药代动力学参数模拟慢性给药概况。
实施例8
ADCC测定
表达运铁蛋白受体1的(TfR1+)BaF3细胞(DSMZ，#CLPZ04004)用作由不同的抗体和抗体融合分子诱导的用于抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)实验的靶细胞。简言之，将1×104个BaF3细胞接种于圆底96孔中，并可选地在存在或不存在指定抗体的情况下与人NK92效应细胞(高亲和性CD16克隆7A2F3；Roche Glycart)以效应细胞/靶标比3:1共培养。在四小时的温育(在37℃，5％CO2)后，通过从死亡/垂死细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放的测量来评估细胞毒性。为此，将细胞以250×g离心5分钟，并将50μl上清液转移至平底板。加入50μlLDH反应混合物(Roche LDH反应混合物，目录号11644793001；Roche Diagnostics GmbH)，并将反应物在37℃、5％CO2下温育20分钟。随后，在Tecan Sunrise读数器上492/620nm波长处测量吸光度。
所有样品一式三份进行测定，且特异性杀伤/ADCC基于以下计算和对照：
-仅靶细胞(+培养基)
-最大LDH释放量：靶细胞+3％Triton-X
-自发释放量：靶细胞+NK细胞(E:T为3:1)
-通过以下术语计算特异性ADCC/裂解％
实施例9
单核细胞活化测定
96孔细胞培养板用Aβ1-42肽(Bachem；在PBS中20μg/mL)过夜包被，然后将其与抗-Aβ抗体溶液在37℃温育1小时。洗涤平板后，每孔加入105U-937人单核细胞，所述105U-937人单核细胞已用400U/mL干扰素-γ预先活化过夜以上调Fcγ受体，并将平板在37℃/5％CO2下温育24小时。第二天，将上清液转移至ELISA平板上，根据制造商的方案(R&DSystems)用于确定IL-8和IP-10的浓度。
实施例10
通过FACS分析确认FcγRx结合
为了确认IgG和BS-IgG是否能够结合至细胞表达的FcγR亚型，我们使用内部产生的重组CHO细胞克隆，所述重组CHO细胞克隆稳定地表达FcγRI(CHO-K1_flhFcγRI)、FcγRIIa(CHO-K1_flhFcγRIIa_LR)、FcγRIIB(CHO-K1_flhFcγRIIb)或FcγRIIIa(CHO-K1_flhFcγRIIIa)。根据标准细胞培养条件，CHO细胞在补充的EMDM(PAN Biotech)中生长。将1×105CHO细胞/孔接种到96孔圆底板中，并与不同浓度的指示的抗体变体在培养基中冰上温育45分钟。人IgG1(Sigma，#I5154)用作同种型对照。洗涤后，将细胞重悬于200μl培养基中，并与10μg/ml的AlexaFluor488缀合的山羊抗-人IgG-F(ab')2片段(Jackson,#109-546-006)冰上温育额外的45分钟。然后，用培养基将细胞洗涤两次，重悬于200μl培养基中，并分析其与FACS-Canto-II(BD)上的相应的FcγRII的结合。
实施例11
FcγR人源化小鼠中的温度研究
采用FcγR人源化小鼠以确定输注相关的副作用。对于体内温度测量，使用遥测温度测量系统：我们将BMDS IPTT300温度遥测系统与DAS-7006读数器系统联合使用。在实验前约两周，将这种基于芯片的遥测系统植入小鼠体内。在实验之前，测量所有个体的基线温度。在静脉注射(i.v.)测试化合物后，以5分钟的间隔测量体温。
实施例12
细胞因子测定和分析
使用R&D细胞因子阵列板A评估血清细胞因子水平，其提供炎症标志物的40路(plex)分析。每组使用200微升合并的血清。根据制造商的方案进行测定。为了进行分析：将所有测得的相对强度表示为膜内部阳性对照斑点(spot)的百分比。通常，显示值是通过从目标条件中减去缓冲液对照生成的。
实施例13
全身ROS成像
对于全身ROS成像，使用PerkinElmer IVIS Spectrum CT。ROS检测是通过PerkinElmer炎症探针完成的。简而言之，在小鼠的预期测量时间点之前10分钟用PerkinElmer炎症探针对其进行腹膜内注射。刚好在采集之前，小鼠被注射测试构建体并在异氟烷麻醉下成像。图像采集是用5分钟的曝光时间，F1光圈和中等分箱(binning)完成的。
实施例14
分子建模
基于具有PDB ID 1HZH的完整IgG晶体结构创建了IgG和IgG衍生的结构(27)。可变区的结构用抗体同源性建模方案MoFvAb进行建模(28)。采用了来自IgG1的人Fc区与FcγRIIa复合的晶体结构(PDB ID 3RY6(29))的Fc区-FcγR结合模式。mTfR1同型二聚体的同源性模型是从具有PDB ID 1CX8的hTfR1胞外结构域的晶体结构建模的(30)(77％序列同一性，88％序列相似性)。抗-mTfR1脑穿梭Fab与mTfR1的结合模式是基于通过肽作图实验鉴定的表位序列估算的。采用来自最近公布的一组IgG溶液NMR状态(31)的抗体铰链构象(仅Cα原子)，并选择其以最小化与模型其余部分的空间冲突。所有分子模型均使用Dassault Systèmes的BIOVIA Discovery Studio 4.5生成和可视化，并使用GNU图像处理程序GIMP进行排列和后处理。
实施例15
结合研究
首先，使用基于表面等离振子共振(SPR)的测定法，其中将四个不同的FcγR固定在流动通道中，作为固定的靶标。SPR结果显示，根据低亲和力受体和高亲和力受体，两种构建体均相似地结合不同的FcγR(参见图1B和1C)。
其次，进行细胞结合实验，其中不同的人FcγR在细胞上过表达。BS-mAb31和亲本mAb31结合的同样好(图1D和1E)，并且等级顺序与SPR数据一致。
抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)测定法中，将Aβ包被在表面上，并将单核细胞用作呈递FcγR的效应细胞。两种不同的细胞因子被用作细胞毒性的读出。发现BS-mAb31具有与亲本mAb31相当的效力(参见图2B和2C)。
在吞噬作用测定法中，采用与原代人效应细胞一起培养的死后阿尔茨海默病(AD)脑组织切片(14)。AD脑切片与不同浓度的BS-mAb31和亲本mAb31预温育，随后与效应细胞温育。对于两种抗体，观察到Aβ斑块负荷的浓度依赖性降低(参见图2D和2K)。
实施例16
mAb31在脑中的体内功效
在转基因淀粉样变性小鼠模型(APP London：APP V717I)中研究了BS-mAb31构建体对比亲本mAb31的斑块减少特性(18)。与mAb31相比，BS-mAb31的血浆暴露更低(参见图3A)。
基于每周剂量设计了4个月的疗效研究，并模拟了血浆暴露(参见图3B)。研究了每周给药4个月后，抗-AβmAb及其脑穿梭构建体在皮层中的靶标衔接。用BS-mAb31可检测到大体上更多的斑块修饰(图2C和2D)。在这4个月的长期治疗研究中，与载体对照和等摩尔的低剂量mAb31相比，在BS-mAb31处理的小鼠中皮层和海马中的Aβ淀粉样蛋白斑块显著减少，尽管脑穿梭的血浆暴露实质性降低(参见图2E和2F)。该数据显示，在mAb31的C端连接的BS模块不干扰其与小胶质细胞上FcγR的相互作用。从而通过治疗性IgG的增强的脑暴露，除了明显提高体内功效外，还促进Aβ斑块清除(9)。
实施例17
TfR1结合模式减弱与FcγR的衔接。
研究了BS-mAb31和抗-TfR1mAb的体外TfR1结合特性。BS-mAb31构建体含有一个抗-TfR1Fab作为C端BS模块。已发现BS-mAb31(图4A)和二价天然抗-TfR1mAb(图4B)与TfR1的结合是不同的，导致治疗实体(IgG)和Fc区对于环境以不同的空间呈现。使用抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)测定确定了当构建体与TfR1结合时Fc区的功能。在该测定中，一个细胞表达TfR1，且另一个细胞(人NK92)具有表达FcγRIIIA的效应细胞的功能。ADCC是一种细胞介导的免疫防御机制，通过该机制免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞，该靶细胞的膜表面抗原已被特异性抗体结合。
使用三种不同的IgG构建体已经分析了相互作用。具有完整效应功能的标准抗-TfR1mAb产生强烈的ADCC应答。抗-TfR1单Fab mAb也产生ADCC应答，但由于失去了亲合结合而处于较高浓度(图4C)。所有细胞毒性作用均由Fc区介导。使用没有效应功能的抗-TfR1mAb(Fc区中的P329G/L234A/L235A突变)进行确认。该抗体在该ADCC测定中没有作用。有趣的是，具有一个或两个BS模块与mAb31的重链的C端融合的两个脑穿梭构建体，没有或只有非常低的细胞毒性水平(图4C)。在标准的抗-TfR1mAb引起最高ADCC效应的浓度下，对于抗-TfR1单Fab mAb，只有很小的效果被检测到，而所有其他构建体均没有可检测的效果(图4D)。
实施例18
首次输注反应和细胞因子诱导
当BS抗体通过BS模块结合至TfR1时，已确定其效应功能将具有什么结果。
第一步，在huFcγR转基因小鼠系统中进行了检查。简而言之，该模型是通过四个人的对应物(FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C和FCGR3B)对两个活化的低亲和力小鼠FcγR基因(Fcγr3和Fcγr4)的基因靶向替换而产生的(图5A)。这提供了足够的系统来评价人/人源化mAb与人FcγR之间在体内潜在的相互作用，从而触发效应功能。该模型使用遥测温度读出(图5B)来监测首次输液反应(FIR)。如上所述，FIR是由FcγR相互作用和效应免疫细胞的募集而诱导的。该模型中的无线电记录系统允许动物在研究过程中自由移动。
首先，测定如通过注射常规抗-TfR1mAb诱导的FIR。如图5C所示，常规抗TfR1mAb的注射导致体温的浓度依赖性和瞬时下降，所述体温在约两个小时内恢复到正常水平。
其次，确定通过注射单价形式的常规抗-TfR1mAb诱导的FIR。常规抗-TfR1mAb的单价形式仅包含一个针对TfR1的Fab臂。同样，该mAb强烈诱导FIR。
第三，使用具有Fc区中FcγR结合所需残基的突变的mAb，确定在该模型中使用抗TfR1mAb观察到的效应功能对FIR的相对贡献(20)。缺少FcγR相互作用的Fc区三突变体P329G/L234A/L235A在模型中未显示温度下降(图5D)。使用Fc区效应功能消除的构建体的体外数据证实了这一点(图4C)。
确定不同细胞因子的水平，作为抗-TfR1mAb施用的应答。发现某些细胞信号分子的浓度强烈增加(图5E)。特别是，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、角质形成细胞衍生的细胞因子(KC)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP-2)和干扰素γ诱导的蛋白10(IP-10)显示出强烈的应答。这些细胞因子应答可以与嗜中性粒细胞活化相关。如在温度读出实验中所见，当使用具有消除的Fc区效应功能的IgG构建体时，实际上不产生对细胞因子诱导的应答(图5E)。
实施例19
脑穿梭结合模式效应
为了评估FIR的诱导，三种不同的BS-mAb构建体被施用于huFcγR转基因小鼠(图6A)。这些都具有人天然的IgG1效应功能，但不同在于治疗有效的Fab数量(＝结合位点)。
出乎意料的是，对于标准BS-mAb构建体未观察到FIR，表明mBS-2Fab不会在体内外周触发FcγR活化(见图6B)。
设计了在mAb部分上缺失一个或两个治疗靶标结合Fab臂的两种构建体(参见图6A)。将这些构建体应用于huFcγR转基因小鼠后，明显引起FIR，如通过快速而强烈的温度下降所评分(图6B)。对于缺少两个Fab臂(BS-无Fab)的构建体，温度下降甚至更加明显。通过分析在FIR期间引起的细胞因子模式，进一步证实了用不同构建体观察到的温度下降。如图6C所示，仅引起温度下降的构建体BS-无Fab也展示升高的细胞因子水平。与此相反，当对huFcγR小鼠施用时，标准BS-mAb构建体不会引起细胞因子上调(参见图6C)。BS-mAb的细胞因子概况与用效应死亡构建体获得的细胞因子概况相当(见图5D)。
还研究了BS-mAb构建体的剂量应答(图6D)，在最高剂量(20mg/kg)下可检测到小的和短暂的效应。该剂量比减少斑块形成的非常有效的治疗剂量高10倍(图3E和3F)。
实施例20
特定的细胞因子标记
对各种mAb构建体的细胞因子概况进行了更详细的分析。生成了一个热图以突出显示关键的细胞因子(图7左上方的比例尺)。特别是，两种细胞因子应答非常不同。
血管内全身光学成像显示脑穿梭构建体减弱ROS产生。
活性氧类别(ROS)是化学反应性的化学类别。在标准抗-TfR1mAb和脑穿梭构建体上外周施用后，扫描全身的ROS类别的诱导。在图8A中，代表性图像显示抗-TfR1mAb和mBS-2Fab构建体之间的差异。数据被定量并且与载体组相比，mBS-2Fab没有显示显著的差异(图8B)。
实施例21
不同mAb构建体的结构建模
使用分子结构信息分析了通过mAb靶标结合或BS-模块结合在表达TfR1的细胞表面上呈递的三种不同构建体之间的Fc区-FcγR相互作用。在图9中，总结了主要观察结果。
首先，已经对在一个细胞表面上与其治疗性靶标结合的标准BS-mAb以及与相邻细胞表面上展示的FcγR衔接的可能性进行了建模(图9A和9D)。该模型预测了对FcγR的自由接近和聚簇。同样，图9A和9D还显示，在标准IgG C端存在额外的BS模块(抗-TfR1CrossFab)不会干扰FcγR结合。
其次，对在体内非常有活性的BS-无Fab构建体进行了建模。当与TfR1结合时，该构建体以有利的方式呈递给FcγR，当与其靶标结合时，以与标准mAb相似的方式允许聚簇(图9B和9E)。
第三，对脑梭构建体(BS-mAb＝mBS-2Fab)进行建模。已经发现该模型支持本文报道的体内发现，即治疗性抗原结合Fab定位在非常靠近FcγR的位置，并且特别是似乎阻止了BS-scFab/FcγR复合物的紧密聚簇(图9C和9F)。

Claims (37)

1.一种用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述抗体包含
i)Fc区，
ii)两个特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点，和
iii)一个特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点，
其中所述治疗在施用后具有减少的副作用，其中所述施用是静脉内、皮下或肌内施用，其中所述副作用是与施用相关的副作用，和
其中所述副作用是选自由血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降和低体温组成的组中的一种或更多种。
2.根据权利要求1所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述施用是通过输注进行的。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中与缺乏一个或两个特异性结合第一(细胞表面)靶标的所述结合位点的相同抗体相比，所述治疗在施用后具有减少的副作用。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述第一靶标的结合位点二者均在抗体重链的N端末端，所述第二靶标的结合位点在抗体重链之一的C端末端。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述抗体包含
i)一对第一抗体轻链和第一抗体重链，
ii)一对第二抗体轻链和第二抗体重链，和
iii)一个额外的抗体片段，所述额外的抗体片段选自由scFv、Fab、scFab、dAb片段、DutaFab和CrossFab组成的组，
其中i)和ii)的抗体链对特异性结合第一靶标，iii)的额外的抗体片段特异性结合第二靶标。
6.根据权利要求5所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中iii)的额外的抗体片段直接或经由肽接头缀合至i)或ii)的抗体重链的C端。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述神经学病症选自由神经病、淀粉样变性、癌症、眼疾病或眼病症、病毒或微生物感染、炎症、局部缺血、神经变性疾病、癫痫发作、行为病症、溶酶体贮存病、路易体病、脊髓灰质炎后综合征、夏伊-德雷格综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、tau蛋白病、阿尔茨海默病、核上性麻痹、朊病毒病、牛海绵状脑病、痒病、克雅病综合征、库鲁病、格-施-沙病、慢性消耗性疾病，和致命性家族性失眠症、延髓麻痹、运动神经元病、神经系统异变性病症、卡纳万病、亨廷顿病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大病、图雷特综合征、门克士卷发综合征、科凯恩综合征、Halervorden-Spatz综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、莱施奈恩二氏综合征、翁-伦综合征、痴呆、皮克氏病、脊髓小脑性共济失调、CNS癌和/或脑癌、包括因身体其他部位的癌症而导致的脑转移组成的组。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述第一靶标选自由人CD20、人tau蛋白质、磷酸化人tau蛋白质、人葡糖脑苷脂酶、人α-突触核蛋白和人淀粉样β蛋白组成的组，且所述第二个靶标是人运铁蛋白受体1。
9.根据权利要求8所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述第一靶标选自由由人tau蛋白质、磷酸化人tau蛋白质、人葡糖脑苷脂酶、人α-突触核蛋白和人淀粉样β蛋白组成的组，并且其中神经学病症选自由阿尔茨海默病、帕金森病和tau蛋白病组成的组。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述结合位点是抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域对。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述抗体包含具有效应功能活性的Fc区。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中在施用于患者后由所述双特异性抗体引起的ADCC低于由二价双特异性抗体引起的ADCC，所述二价双特异性抗体仅具有一个特异性结合第一靶标的结合位点和一个特异性结合第二靶标的结合位点。
13.根据权利要求12所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述ADCC低10倍或更低。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中所述副作用是低体温。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中在治疗剂量下，低体温减少至小于0.5℃的体温下降。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中体温的下降是在施用后60分钟之内。
17.根据权利要求3至16中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中
a)抗体重链是人亚类IgG1的全长抗体重链，
b)抗体重链是人亚类IgG4的全长抗体重链，
c)抗体重链之一是具有突变T366W和可选的S354C的人亚类IgG1的全长抗体重链，另一条抗体重链是具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C的人亚类IgG1的全长抗体重链，
d)两条抗体重链都是人亚类IgG1的全长抗体重链，在一条抗体重链中具有突变I253A、H310A和H435A以及突变T366W和可选的S354C，在相应的另一条抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，
e)两条抗体重链都是人亚类IgG1的全长抗体重链，在一条抗体重链中具有突变M252Y、S254T和T256E以及突变T366W和可选的S354C，在相应的另一条抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，或
f)两条抗体重链都是人亚类IgG1的抗体重链，在一条抗体重链中具有突变T307H和N434H以及突变T366W和可选的S354C，在相应的另一条抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，其中所述c端赖氨酸或甘氨酸-赖氨酸二肽可在一条或两条重链中独立地存在或不存在，
其中C端赖氨酸或甘氨酸-赖氨酸二肽可在一条或两条重链中彼此独立地存在或不存在。
18.一种治疗患者神经学病症的方法，包括向所述患者施用双特异性抗体，
其中所述抗体包含
i)Fc区，
ii)两个特异性结合第一(细胞表面)靶标的结合位点，和
iii)一个特异性结合第二(细胞表面)靶标的结合位点，
其中所述治疗在施用后具有减少的副作用，其中所述施用是静脉内、皮下或肌内施用，其中所述副作用是与施用相关的副作用，和
其中所述副作用是选自由血管舒张、支气管收缩、喉水肿、心压下降和低体温组成的组中的一种或更多种。
19.根据权利要求18所述的方法，与用缺乏一个或两个特异性结合第一(细胞表面)靶标的所述结合位点的相同抗体治疗相比，其中所述治疗在施用后具有减少的副作用。
20.根据权利要求18或19中任一项所述的方法，其中所述施用是通过输注进行的。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述输注速率≥50ml/h。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述输注速率≥100ml/h。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述输注速率≥150ml/h。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述第一靶标的结合位点二者均在抗体重链的N端末端，所述第二靶标的结合位点在抗体重链之一的C端末端。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述抗体包含
i)一对第一抗体轻链和第一抗体重链，
ii)一对第二抗体轻链和第二抗体重链，和
iii)额外的抗体片段，所述额外的抗体片段选自由scFv、Fab、scFab、dAb片段、DutaFab和CrossFab组成的组，
其中i)和ii)的抗体链对特异性结合第一靶标，iii)的额外的抗体片段特异性结合第二靶标。
26.根据权利要求25所述的方法，其中iii)的额外的抗体片段直接或经由肽接头缀合至i)或ii)的抗体重链的C端。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述神经学病症选自由神经病、淀粉样变性、癌症、眼疾病或眼病症、病毒或微生物感染、炎症、局部缺血、神经变性疾病、癫痫发作、行为病症、溶酶体贮存病、路易体病、脊髓灰质炎后综合征、夏伊-德雷格综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、tau蛋白病、阿尔茨海默病、核上性麻痹、朊病毒病、牛海绵状脑病、痒病、克雅病综合征、库鲁病、格-施-沙病、慢性消耗性疾病，和致命性家族性失眠症、延髓麻痹、运动神经元病、神经系统异变性病症、卡纳万病、亨廷顿病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大病、图雷特综合征、门克士卷发综合征、科凯恩综合征、Halervorden-Spatz综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、莱施奈恩二氏综合征、翁-伦综合征、痴呆、皮克氏病、脊髓小脑性共济失调、CNS癌和/或脑癌、包括因身体其他部位的癌症而导致的脑转移组成的组。
28.根据权利要求18至27中任一项所述方法，其中所述第一靶标选自由人CD20、人tau蛋白、磷酸化人tau蛋白、人葡糖脑苷脂酶、人α-突触核蛋白和人淀粉样β蛋白组成的组，且所述第二个靶标是人运铁蛋白受体1。
29.根据权利要求18至28中任一项所述方法，其中所述第一靶标选自由由人tau蛋白、磷酸化人tau蛋白、人葡糖脑苷脂酶、人α-突触核蛋白和人淀粉样β蛋白组成的组，并且其中神经学病症选自由阿尔茨海默病、帕金森病和tau蛋白病组成的组。
30.根据权利要求18至29中任一项所述方法，其中所述结合位点是抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域对。
31.根据权利要求18或30中任一项所述的方法，其中所述抗体包含具有效应功能活性的Fc区。
32.根据权利要求18至31中任一项所述的方法，其中在施用于患者后由所述双特异性抗体引起的ADCC低于由二价双特异性抗体引起的ADCC，所述二价双特异性抗体仅具有一个特异性结合第一靶标的结合位点和一个特异性结合第二靶标的结合位点。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述ADCC低10倍或更低。
34.根据权利要求18至33中任一项所述的方法，其中所述副作用是低体温。
35.根据权利要求18至34中任一项所述的方法，其中在治疗剂量下，低体温减少至小于0.5℃的体温下降。
36.根据权利要求18至35中任一项所述的方法，其中体温的下降是在施用后60分钟之内。
37.根据权利要求25至36中任一项所述的用于治疗患者的神经学病症的双特异性抗体，其中
a)抗体重链是人亚类IgG1的全长抗体重链，
b)抗体重链是人亚类IgG4的全长抗体重链，
c)抗体重链之一是具有突变T366W和可选的S354C的人亚类IgG1的全长抗体重链，另一条抗体重链是具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C的人亚类IgG1的全长抗体重链，
d)两条抗体重链都是人亚类IgG1的全长抗体重链，在一条抗体重链中具有突变I253A、H310A和H435A以及突变T366W和可选的S354C，在相应的另一条抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，
e)两条抗体重链都是人亚类IgG1的全长抗体重链，在一条抗体重链中具有突变M252Y、S254T和T256E以及突变T366W和可选的S354C，在相应的另一条抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，或
f)两条抗体重链都是人亚类IgG1的抗体重链，在一条抗体重链中具有突变T307H和N434H以及突变T366W和可选的S354C，在相应的另一条抗体重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和可选的Y349C，其中所述c端赖氨酸或甘氨酸-赖氨酸二肽可在一条或两条重链中独立地存在或不存在，
其中C端赖氨酸或甘氨酸-赖氨酸二肽可在一条或两条重链中彼此独立地存在或不存在。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201906947SA (en) 2017-02-17 2019-08-27 Bristol Myers Squibb Co Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
PT3583120T (pt) 2017-02-17 2022-12-15 Denali Therapeutics Inc Polipeptídeos de ligação ao recetor de transferrina manipulados
SG11202006420TA (en) * 2018-01-10 2020-08-28 Denali Therapeutics Inc Transferrin receptor-binding polypeptides and uses thereof
CN112040985A (zh) 2018-02-07 2020-12-04 瑞泽恩制药公司 用于递送治疗性蛋白质的方法和组合物
SG11202106198YA (en) * 2018-12-21 2021-07-29 Hoffmann La Roche Antibody that binds to vegf and il-1beta and methods of use
KR20240008492A (ko) 2022-07-12 2024-01-19 신장섭 송아지 난산 분만용 도구
WO2024026488A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus
WO2024026494A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Viral particles retargeted to transferrin receptor 1

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014033074A1 (en) * 2012-08-29 2014-03-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Blood brain barrier shuttle
CN104093744A (zh) * 2011-10-11 2014-10-08 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 双特异性抗体的改进的组装
WO2017055540A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-human a-beta/human transferrin receptor antibodies and methods of use

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
WO2001070260A1 (en) * 2000-03-17 2001-09-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Cd18-binding antibodies inhibit stenosis-related disorders
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9382321B2 (en) * 2014-11-26 2016-07-05 Adventis Health System/Sunbelt, Inc. Effector-deficient anti-CD32A antibodies

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104093744A (zh) * 2011-10-11 2014-10-08 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 双特异性抗体的改进的组装
WO2014033074A1 (en) * 2012-08-29 2014-03-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Blood brain barrier shuttle
WO2017055540A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-human a-beta/human transferrin receptor antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NIEWOEHNER 等: "Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle", 《NEURON》 *
PALABRICA 等: "Adverse events of intravenous immunoglobulin infusions: a ten-year retrospective study", 《ASIA PACIFIC ALLERGY》 *
VOGEL 等: "Infusion Reactions:Diagnosis, Assessment, and Management", 《CLIN. J. ONCOL. NURSING》 *
胡荷宇: "抗转铁蛋白受体抗体新型分子的构建及其生物学特性研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *

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Publication number Publication date
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