CN117083298A - 针对成对螺旋细丝tau的人源化抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本专利申请描述了人源化抗PHF‑tau抗体及其抗原结合片段。也描述了编码该抗体、该抗体的缀合物和融合构建体的核酸、包含该抗体的组合物、产生该抗体以及使用该抗体来治疗或预防病症诸如tau蛋白病的方法。

Description

针对成对螺旋细丝tau的人源化抗体及其用途

技术领域

本专利申请涉及人源化抗PHF-tau抗体、抗体缀合物、编码抗体的核酸和表达载体、含有载体的重组细胞以及包含抗体的组合物。还提供了制备抗体的方法、使用抗体治疗包括tau蛋白病的病症的方法、以及使用抗体诊断疾病诸如tau蛋白病的方法。

以电子方式提交的参考序列表

本专利申请含有序列表，该序列表作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式递交，文件名为“065768.98US2 Sequence Listing”，并且创建日期为2022年3月8日，并且大小为125kb。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是退行性脑病症，其特征在于渐进性的记忆、认知、推理、判断和情感稳定性的丧失，该丧失逐渐导致极度精神衰退和最终的死亡。AD是老年人中进行性精神障碍(痴呆)的非常常见的病因，并且被认为是美国第四大最常见的医学死因。AD已在全世界的种族群体中观察到，并且代表目前和未来的主要公共健康问题。

患有AD的个体的脑表现出称作老年(或淀粉样蛋白)斑块、淀粉样蛋白血管病(淀粉样蛋白在血管中沉积)和神经原纤维缠结的特征性病变。一般在患有AD的患者中对于记忆和认知功能重要的人脑几个区域中发现大量的这些病变，特别是淀粉样斑块和成对螺旋细丝的神经原纤维缠结。

当前的AD治疗方案仅包括被批准用于治疗患有痴呆的患者的认知症状的疗法。尚无改变或减缓AD的发展的批准疗法。潜在的疾病调节剂是抗淀粉样抗体，包括礼来公司(Eli Lilly)的多奈单抗,一种识别Aβ(p3-42)(Aβ的焦谷氨酸盐形式)的人源化IgG1单克隆抗体以及阿杜那单抗，一种针对Aβ上发现的构象表位的人IgG1单克隆抗体。这些疗法以及可能在未来十年上市的大多数其他潜在疾病调节剂靶向Aβ(作为AD的两种“标志”病理征之一的淀粉样斑块的主要组分)。

神经原纤维缠结即AD的第二标志病理征，主要由超磷酸化tau蛋白的聚集体构成。tau的主要生理功能为微管聚合和稳定。tau与微管的结合通过tau的微管结合区的正电荷与微管网架上的负电荷之间的离子相互作用发生(Butner和Kirschner，J Cell Biol.115(3):717-30,1991)。tau蛋白含有85个可能的磷酸化位点，并且在这些位点中的许多位点处的磷酸化干扰tau的主要功能。结合至轴突微管网架的tau处于低磷酸化状态，而AD中的聚集的tau是超磷酸化的，从而提供不同于tau的生理活性库的独特表位。

tau蛋白病(tauopathy)传播和蔓延假设已得到描述，并且基于人脑中的tau蛋白病发展的Braak阶段和在临床前tau模型中的tau聚集体注射后的tau蛋白病蔓延(Frost等人，J Biol Chem.284:12845-52,2009；Clavaguera等人,Nat Cell Biol.11:909-13,2009)。

开发预防或清除tau聚集的治疗剂多年来一直受到关注，并且候选药物(包括抗聚集化合物和激酶抑制剂)已进入临床测试(Brunden等人，Nat Rev Drug Discov.8:783-93,2009)。已经公布了多项研究，示出转基因小鼠模型中主动tau免疫和被动tau免疫两者的有益治疗效果(Chai等人，JBiol Chem.286:34457-67,2011；Boutajangout等人,JNeurochem.118:658-67,2011；Boutajangout等人,J Neurosci.30:16559-66,2010；Asuni等人,J Neurosci.27:9115-29,2007)。已经报告了磷酸定向抗体和非磷酸定向抗体两者的活性(Schroeder等人，J Neuroimmune Pharmacol.11(1):9-25,2016)。

尽管具有进展，仍然需要预防tau聚集和tau蛋白病发展以治疗tau蛋白病(诸如AD)及其他神经退化性疾病的有效治疗剂。

发明内容

本专利申请通过提供对成对螺旋细丝(PHF)-tau具有高结合亲和力并且对磷酸化tau具有选择性的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段来满足该需要。本专利申请的人源化抗体通过小鼠PHF-tau特异性抗体的人框架适应(HFA)而生成。认为抗体对磷酸化tau的选择性允许针对抗病原性tau的功效而不干扰正常tau功能。本专利申请还提供了编码抗体的核酸、包含抗体的组合物以及制备和使用抗体的方法。本专利申请的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段抑制tau种子，如通过使用源自突变tau转基因小鼠的HEK细胞裂解物或脊髓裂解物的tau种子的细胞测定法测量的。此外，具有本专利申请的抗PHF-tau抗体的可变区和小鼠Ig恒定区(诸如小鼠IgG2a恒定区)的嵌合抗体在体内突变tau转基因小鼠模型中阻断接种活性。

AD脑中tau蛋白病的发展遵循明显特有的蔓延模式。临床前模型已示出，细胞外磷酸tau种子可在神经元中诱导tau蛋白病(Clavaguera等人，PNAS110(23):9535-40,2013)。因此，据信tau蛋白病能够以类似朊病毒的方式从一个脑区蔓延到下一脑区。该蔓延过程将涉及tau种子的外化，该tau种子可被附近神经元吸收并且诱导进一步的tau蛋白病。不受理论的束缚，认为本专利申请的抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段通过与磷酸tau种子相互作用来预防脑中的tau聚集或tau蛋白病蔓延。

在一个总的方面，本专利申请涉及结合PHF-tau的分离的人源化抗体或其抗原结合片段。

在另一个总的方面，本专利申请涉及分离的人源化抗体或其抗原结合片段，该分离的人源化抗体或其抗原结合片段在由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或该氨基酸序列内的tau蛋白的表位处与tau蛋白结合，其中抗体或其抗原结合片段结合成对螺旋细丝(PHF)-tau，优选地人PHF-tau。

根据特定的方面，本专利申请涉及分离的人源化抗体或其抗原结合片段，该分离的人源化抗体或其抗原结合片段在由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或该氨基酸序列内的tau蛋白的表位处与tau蛋白结合，其中抗体或其抗原结合片段结合成对螺旋细丝(PHF)-tau、优选地人PHF-tau，其中tau蛋白的表位包含tau蛋白的磷酸化T427、磷酸化S433和磷酸化S435中的一者或多者，但不包含磷酸化T427、磷酸化S433和磷酸化S435中的全部。

根据另一个特定的方面，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：分别具有SEQID NO:4、5和6的多肽序列的免疫球蛋白重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别具有SEQ ID NO:7或14、8和9的多肽序列的免疫球蛋白轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有与SEQ ID NO:12或18有至少90％同一性的多肽序列的重链可变区，以及具有与SEQ ID NO:13、19、23或59有至少90％同一性的多肽序列的轻链可变区。

根据另一个特定的方面，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ IDNO:12或18的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:13、19、23或59的多肽序列的轻链可变区。

根据另一个特定的方面，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:13的多肽序列的轻链可变区；

(b)具有SEQ ID NO:18的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:19的多肽序列的轻链可变区；

(c)具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:23的多肽序列的轻链可变区；或者

(d)具有SEQ ID NO:18的多肽序列的重链可变区以及具有SEQ ID NO:59的多肽序列的轻链可变区。

根据另一个特定的方面，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:15或20的多肽序列的第一重链；

(b)各自独立地具有SEQ ID NO:16、21、24或60的多肽序列的两条轻链；以及

(c)具有SEQ ID NO:17或22的多肽序列的第二重链。

根据另一个特定的方面，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:61或62的多肽序列的重链；以及

(a)分别具有SEQ ID NO:16或24、或者21或60的多肽序列的轻链。

在另一个总的方面，本专利申请涉及缀合物，该缀合物包含与抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段偶联的本专利申请的分离的人源化抗体或其抗原结合片段。

根据特定的方面，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段分别与CD98、优选地人CD98hc或者TfR、优选地人TfR1结合，其中在中性pH下解离常数K_D为至少1nM、优选地1nM至500nM，并且在酸性pH、优选地pH5下离解速率常数k_d为至少10^-4sec^-1、优选地10^-4至10^-1sec^-1。

根据另一个特定的方面，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段在中性pH下的离解速率常数k_d为2×10^-2至2×10^-4sec^-1、优选地8×10^-3sec^-1。

根据另一个特定的方面，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段包含：包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：

(a)抗CD98抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:26、27、28或33、29、30和31的氨基酸序列；或者

(b)抗TfR抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:35、36、37、38、39和40的氨基酸序列。

根据另一个特定的方面，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段为单链可变片段(scFv)，该scFv包含经由接头与轻链可变区共价连接的重链可变区，优选地，接头具有SEQID NO:50或51的氨基酸序列，更优选地，scFv包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34或SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在另一个总的方面，本专利申请涉及包含本专利申请的缀合物的融合构建体，其中抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段经由接头与分离的人源化抗体或其抗原结合片段的两条重链中的仅一条重链的羧基末端共价连接，优选地其中接头具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列。

根据特定的方面，与野生型CH3结构域多肽相比，分离的人源化抗体或其抗原结合片段的两条重链中的每条重链包含一个或多个异源二聚体突变诸如修饰的异源二聚体CH3结构域，或者一个或多个杵臼结构突变。

根据另一个特定的方面，第一重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含在位置T350、L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，并且第二重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含在位置T350、T366、K392和T394处的氨基酸修饰，其中在位置T350处的氨基酸修饰为T350V、T350I、T350L或T350M；在位置L351处的氨基酸修饰为L351Y；在位置F405处的氨基酸修饰为F405A、F405V、F405T或F405S；在位置Y407处的氨基酸修饰为Y407V、Y407A或Y407I；在位置T366处的氨基酸修饰为T366L、T366I、T366V或T366M，在位置K392处的氨基酸修饰为K392F、K392L或K392M，并且在位置T394处的氨基酸修饰为T394W，并且其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。

根据另一个特定的方面，第一重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T366W，并且第二重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T366S、L368A和Y407V。

根据另一个特定的方面，分离的人源化抗体或其抗原结合片段在Fc结构域中包含一个或多个突变，该一个或多个突变增强融合体与新生Fc受体(RcRn)的结合，优选地该一个或多个突变增强在酸性pH下的该结合，更优选地Fc具有M252Y/S254T/T256E(YTE)突变，其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。

根据另一个特定的方面，分离的人源化抗体或其抗原结合片段在Fc结构域中包含减少或消除效应子功能的一个或多个突变，优选地Fc在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329处具有一个或多个氨基酸修饰，诸如L234A、L235A和P331S中的一个、两个或三个突变，其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。

在另一个总的方面，本专利申请涉及融合构建体，该融合构建体包含：

(a)第一重链，该第一重链具有选自由SEQ ID NO:42至49组成的组的氨基酸序列；

(b)两条轻链，该两条轻链各自独立地具有选自由SEQ ID NO:16、21、24和60组成的组的氨基酸序列；以及

(c)第二重链，该第二重链具有选自由SEQ ID NO:17和22组成的组的氨基酸序列。

在另一个总的方面，本专利申请涉及分离的核酸，该分离的核酸编码本专利申请的分离的人源化抗体或其抗原结合片段、本专利申请的缀合物或本专利申请的融合构建体。

在另一个总的方面，本专利申请涉及载体，该载体包含：本专利申请的分离的核酸。

在另一个总的方面，本专利申请涉及宿主细胞，该宿主细胞包含：本专利申请的分离的核酸或本专利申请的载体。

在另一个总的方面，本专利申请涉及产生本专利申请的人源化抗体或其抗原结合片段、本专利申请的缀合物或本专利申请的融合构建体的方法，该方法包括：在用于产生人源化抗体或其抗原结合片段、缀合物或融合构建体的条件下培养包含编码人源化抗体或其抗原结合片段、缀合物或融合构建体的核酸的细胞，以及从细胞或细胞培养物中回收人源化抗体或其抗原结合片段、缀合物或融合构建体。

在另一个总的方面，本专利申请涉及药物组合物，该药物组合物包含：本专利申请的分离的人源化抗体或其抗原结合片段、本专利申请的缀合物或本专利申请的融合构建体以及药学上可接受的载剂。

在另一个总的方面，本专利申请涉及阻断对其有需要的受试者中的tau接种的方法，该方法包括向受试者施用本专利申请的药物组合物。

在另一个总的方面，本专利申请涉及在对其有需要的受试者中诱导抗体依赖性吞噬作用(ADP)而不刺激促炎细胞因子的分泌的方法，该方法包括：向受试者施用本专利申请的药物组合物。

在另一个总的方面，本专利申请涉及治疗对其有需要的受试者中的tau蛋白病的方法，该方法包括向受试者施用本专利申请的药物组合物。

在另一个总的方面，本专利申请涉及减少对其有需要的受试者中的病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法，该方法包括向受试者施用本专利申请的药物组合物。

根据特定的方面，tau蛋白病选自由以下各项组成的组：家族性阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病、与17号染色体相关的额颞痴呆及帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合征、格-施-沙氏病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、脑炎后帕金森综合征、慢性创伤性脑病、以及拳击员痴呆症(拳击疾病)。

根据另一个特定的方面，药物组合物静脉内施用。

根据另一个特定的方面，药物组合物被递送穿过受试者的血脑屏障(BBB)。

根据另一个特定的方面，施用减少了Fc介导的效应子功能并且/或者不诱导快速网织红细胞耗尽。

在另一个总的方面，本专利申请涉及检测来自受试者的生物样品中PHF-tau的存在的方法，该方法包括：使生物样品与本专利申请的人源化抗体或其抗原结合片段接触，以及检测人源化抗体或其抗原结合片段与来自受试者的样品中的PHF-tau的结合。

根据特定的方面，生物样品为血液、血清、血浆、间质液或脑脊髓液样品。

根据以下公开内容，包括本专利申请的详细描述和其优选的实施方案以及所附权利要求书，本发明的根据本专利申请的实施方案的其他方面、特征和优点将显而易见。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及下文本专利申请的详细描述。应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。

图1是示出与PT1B995和PT1B585相比，人源化变体PT1B1142与全长Tau蛋白的ELISA结合的图表。

图2是示出与PT1B995和PT1B585相比，人源化变体PT1B1142在一定温度范围内的热稳定性ELISA信号的图表。

图3是示出亲本和人源化PT66抗体与人全长重组tau的代表性SPR结合数据的一系列图表。传感图表示在单循环动力学模式中以2.2nM、6.7nM、20nM和60nM进行的tau蛋白的逐步注射。实心黑色覆盖物指示用1:1朗格缪尔模型拟合的全局动力学。

图4是PT1B1183与全长重组Tau蛋白结合的SPR传感图。传感图表示tau蛋白的在单循环动力学模式中以1.1nM、3.3nM、10nM和30nM进行的逐步注射。针对每个Tau浓度的缔合时间为3分钟，并且离解时间为120分钟。实心黑色覆盖物指示用1:1朗格缪尔模型拟合的全局动力学。

具体实施方式

背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中已包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本专利申请提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均关于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本专利申请所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。

除非另有说明，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。

如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

贯穿本说明书和随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时，术语“包含”可用术语“含有”或“包括”替代，或者有时在本文使用时用术语“具有”替代。

当在本文使用时，“由……组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文使用时，“基本上由……组成”不排除没有实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。任何前述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”，每当在本文中在本专利申请的一个方面或实施方案的上下文中使用时，均可用术语“由……组成”或“基本上由……组成”替代以改变本公开的范围。

如本文所用，术语“分离的”意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与组分天然存在的生物体的其他生物组分(即其他染色体和染色体外的DNA和RNA以及蛋白质)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已经“分离的”核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离的”核酸、肽和蛋白质可为组合物的一部分，并且如果这样的组合物不是核酸、肽或蛋白质自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”广义地使用并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括鼠科动物、人、人适应的(human-adapted)、人源化和嵌合单克隆抗体以及抗体片段)。

一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。四种IgG亚类中的每一种具有不同的生物功能，这些生物功能被称为效应子功能。这些效应子功能通常通过与Fc受体(FcγR)的相互作用和/或通过结合C1q并固定补体来介导。与FcγR结合可导致抗体依赖性细胞介导的细胞溶解或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，而与补体因子结合可导致补体介导的细胞裂解或补体依赖性细胞毒性(CDC)。本专利申请的抗体包括在其Fc区具有变异的那些，使得其相比于野生型Fc区具有变更的特性，包括但不限于延长的半衰期、减小或增大的ADCC或CDC以及沉默Fc效应子功能。因此，本专利申请的抗体可为五种主要种类或对应的亚类中的任一种。优选地，本专利申请的抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。任何脊椎物种的抗体轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列划分为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本专利申请的抗体可含有κ或λ轻链恒定结构域。根据特定实施方案，本专利申请的抗体包括来自小鼠抗体或人抗体的重链和/或轻链恒定区。

除重链和轻链恒定结构域之外，抗体还含有轻链和重链可变区。免疫球蛋白轻链或重链可变区由被“抗原结合位点”间断的“框架”区组成。抗原结合位点用如下各种术语和编号方案定义：

(i)Kabat：“互补决定区”或“CDR”基于序列可变性(Wu和Kabat，J Exp Med.132:211-50,1970)。一般来讲，抗原结合位点在每个可变区具有三个CDR(例如重链可变区(VH)中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链可变区(VL)中的LCDR1、LCDR2和LCDR3)；

(ii)Chothia：术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的区，这些区是结构高变的，如由Chothia和Lesk(Chothia和Lesk，JMolBiol.196:901-17,1987)所定义的。一般地，抗原结合位点具有在每个VH(H1、H2、H3)和VL(L1、L2、L3)中的三个高变区。CDR和HV的编号系统以及注释已由Abhinandan和Martin(Abhinandan和Martin，Mol Immunol.45:3832-9,2008)修订；

(iii)IMGT：形成抗原结合位点的区的另一定义已由Lefranc(Lefranc等人，DevComp Immunol.27:55-77,2003)基于免疫球蛋白和T细胞受体的V结构域的比较提出。International ImMunoGeneTics(IMGT)数据库提供了这些区的标准化编号和定义。CDR、HV与IMGT划分之间的对应性在Lefranc等人，2003(同上)中有所描述；

(iv)AbM：Kabat与Chothia编号方案之间的折衷是Martin(MartinACR(2010)Antibody Engineering,编辑Kontermann R,Dubel S(施普林格出版社,柏林),第2卷,第33-51页)所述的AbM编号规定；

(v)也可基于“Specificity Determining Residue Usage”(SDRU)(Almagro,MolRecognit.17:132-43,2004)来划分抗原结合位点，其中SDR是指直接参与抗原接触的免疫球蛋白的氨基酸残基。

“框架”或“框架序列”是在抗体的可变区之内除限定为抗原结合位点序列的那些之外的剩余序列。因为抗原结合位点的确切定义可通过如上所述的多种划分来确定，所以确切的构架序列取决于抗原结合位点的定义。框架区(FR)是可变结构域的更高度保守的部分。天然重链和轻链的可变结构域各自包括四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，其通常采用β片层构型，通过三个高变环连接。每条链中的高变环通过FR与另一条链的高变环紧密结合在一起，并且有助于形成抗体的抗原结合位点。抗体的结构分析显示出由互补决定区所形成的结合位点的序列与形状之间的关系(Chothia等人，J.Mol.Biol.227:799-817,1992；Tramontano等人,J.Mol.Biol.215:175-182,1990)。尽管其序列变异性较高，六个环中的五个仅采用小规模主链构象，称为“典范结构”。这些构象首先由环的长度确定，其次由环和框架区中特定位置处的关键残基的存在而确定，这些关键残基通过其堆叠、氢键合或呈现独特主链构象的能力来确定构象。

“抗体”也可以为重链上单个可变结构域(VHH)抗体，也称为仅重链抗体(HcAb)，其缺乏轻链并且可由骆驼科或鲨鱼天然产生。HcAb的抗原结合部分由VHH片段构成。

如本文所用，术语“重组抗体”指由包含编码抗体的核酸的重组宿主细胞表达的抗体(例如嵌合、人源化或人抗体或其抗原结合片段)。用于产生重组抗体的“宿主细胞”的示例包括：(1)哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤细胞(包括YO和NSO细胞)、幼仓鼠肾(BHK)、Hela细胞和Vero细胞；(2)昆虫细胞，例如，sf9、sf21和Tn5；(3)植物细胞，例如属于烟草属(Nicotiana)的植物(例如烟草(Nicotiana tabacum))；(4)酵母细胞，例如，属于酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或曲霉属(Aspergillus)(例如黑曲霉(Aspergillus niger))的那些酵母细胞；(5)细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia,coli)细胞或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞等。

抗体的“抗原结合片段”为包含能够与抗原可检测地结合的全长抗体的一部分的分子，通常包含至少VH区的一个或多个部分。抗原结合片段包括多价分子和单链构建体，该多价分子包含抗体的一个、两个、三个或更多个抗原结合部分，在该单链构建体中，VL区和VH区或它们的选定部分通过合成接头或通过重组方法连接以形成功能性抗原结合分子。抗原结合片段也可以为单结构域抗体(sdAb)，也称为纳米抗体，其为由单个单体可变抗体结构域(VHH)组成的抗体片段。虽然抗体的一些抗原结合片段可通过较大抗体分子的实际片段化(例如，酶促裂解)来获得，但大多数通常通过重组技术来产生。本专利申请的抗体可制备为全长抗体或其抗原结合片段。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)₂、F(ab')₂、F(ab)₃、Fv(通常是抗体单臂的VL结构域和VH结构域)、单链Fv(scFv，参见例如Bird等人,Science 1988；242:423-426；和Huston等人，PNAS1988；85:5879-5883)、dsFv、Fd(通常是VH结构域和CH1结构域)和dAb(通常是VH结构域)片段；VH、VL、VHH和V-NAR结构域；包含单个VH链和单个VL链的单价分子；微小抗体(minibody)、双抗体、三抗体、四抗体和κ体抗体(参见，例如，Ill等人,Protein Eng 1997；10:949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离的CDR或功能性互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可缔合或连接在一起以便形成功能性抗体片段。在例如Holliger和Hudson，Nat Biotechnol 2005；23:1126-1136；WO2005040219和公开的美国专利申请20050238646和20020161201中已经描述或综述了各种类型的抗体片段。抗体片段可以使用常规的重组技术或蛋白质工程技术获得，并且可以以与完好抗体相同的方式筛选这些片段的抗原结合性或其他功能。

已经开发了各种技术来产生抗体片段。传统上，这些片段是经由全长抗体的蛋白水解得到的(参见，例如，Morimoto等人,JournalofBiochemical and BiophysicalMethods,24:107-117(1992)；以及Brennan等人，Science,229:81(1985))。然而，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。可替代地，Fab'-SH片段可从大肠杆菌直接回收并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人，Bio/Technology,10:163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab')2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 1993/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。该抗体片段也可以为“线性抗体”，例如，如美国专利号5,641,870中所述的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

如本文所用的术语“抗体衍生物”是指包含全长抗体或其抗原结合片段的分子，其中一个或多个氨基酸被化学修饰或取代。可用于抗体衍生物的化学修饰包括例如烷基化、聚乙二醇化、酰化、酯形成或酰胺形成等，例如用于将抗体连接至第二分子。示例性的修饰包括聚乙二醇化(例如，半胱氨酸聚乙二醇化)、生物素化、放射性标记和与第二试剂(诸如细胞毒剂)缀合。

本文中的抗体包括具有改变的抗原结合活性或生物活性的“氨基酸序列变体”。此类氨基酸改变的实例包括对抗原的亲合力增强的抗体(例如“亲合力成熟的”抗体)，和具有改变的Fc区(如果存在的话)，例如具有改变的(增加的或减少的)抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC)(参见，例如WO 00/42072，Presta,L.和WO 99/51642，Iduosogie等人)；和/或增加或减少的血清半衰期的抗体(参见，例如，WO00/42072，Presta,L.)。

“多特异性分子”包含抗体或其抗原结合片段，与至少一种其他功能性分子(例如另一种肽或蛋白质，诸如针对受体的另一种抗体或配体)缔合或连接，从而形成与至少两个不同结合位点或靶分子结合的分子。示例性多特异性分子包括双特异性抗体以及与可溶性受体片段或配体连接的抗体。

如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区两者均来源于人种系免疫球蛋白序列(即，与人种系免疫球蛋白序列相同或基本上相同)。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也“来源于”人种系免疫球蛋白序列。本专利申请的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括这样的抗体，在该抗体中，来源于另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已被接枝到人框架序列上。

“人源化”抗体为含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的人/非人嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区中的残基被非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的高变区中具有所需特异性、亲和力和能力的残基(供体抗体)替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中没有的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个并且通常为两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环状物对应于非人免疫球蛋白的那些高变环状物，并且所有或基本上所有的FR残基为人免疫球蛋白序列的那些FR残基。人源化抗体也可任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。对于更多细节，参见例如Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)、WO 92/02190、美国专利申请20060073137以及美国专利号6,750,325、6,632,927、6,639,055、6,548,640、6,407,213、6,180,370、6,054,297、5,929,212、5,895,205、5,886,152、5,877,293、5,869,619、5,821,337、5,821,123、5,770,196、5,777,085、5,766,886、5,714,350、5,693,762、5,693,761、5,530,101、5,585,089和5,225,539。

如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白、抗体或其抗原结合片段特异性结合至抗原的抗原上的位点。表位可由连续氨基酸或由通过蛋白质的三级折叠并置的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常在独特空间构象中包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和2维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris编辑(1996)。

作为参考抗体的“与相同表位结合的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合50％或更多的抗体，并且相反地，参考抗体在竞争测定中阻断该抗体与其抗原的结合50％或更多。

靶抗体“阻断”靶分子与天然靶配体的结合的能力意指在使用可溶性或细胞表面缔合的靶分子和配体分子的测定中，该抗体可以以剂量依赖性方式可检测地降低靶分子与配体的结合，其中靶分子在不存在该抗体的情况下可检测地结合该配体。

如本文所用，术语“tau”或“tau蛋白”是指具有多种同种型的丰富的中枢和周围神经系统蛋白质。在人中枢神经系统(CNS)中，由于可变剪接，存在大小范围为352至441氨基酸长度的六种主要tau同种型(Hanger等人，TrendsMolMed.15:112-9,2009)。同种型通过0至2个N末端插入序列的调节内含物以及3个或4个串联排列的微管结合重复序列而彼此不同，并且被称为0N3R(SEQ ID NO:53)、1N3R(SEQ ID NO:54)、2N3R(SEQ ID NO:55)、0N4R(SEQ ID NO:56)、1N4R(SEQ ID NO:57)和2N4R(SEQ ID NO:58)。如本文所用，术语“对照tau”是指SEQ ID NO:58的tau同种型，其缺乏磷酸化和其他翻译后修饰。如本文所用，术语“tau”包括包含全长野生型tau的突变，例如点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。术语“tau”还涵盖tau氨基酸序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于磷酸化。如本文所用，短语“tau蛋白的磷酸化S433”和类似短语是指在全长野生型tau蛋白的某一位置处的磷酸化氨基酸，例如，在第433位处的丝氨酸。

tau结合微管并调节货物(cargo)通过细胞的转运，该转运是可通过tau磷酸化调节的过程。在AD及相关病症中，tau的异常磷酸化是普遍的，并且被认为先于和/或触发tau聚集成称为成对螺旋细丝(PHF)的原纤维。PHF的主要组分是高度磷酸化tau。如本文所用，术语“成对螺旋细丝-tau”或“PHF-tau”是指成对螺旋细丝中的tau聚集体。PHF结构中的两个主要区在电子显微镜中较为明显，即绒毛状外壳和芯细丝；绒毛状外壳对蛋白水解作用敏感并且位于细丝外部，并且细丝的耐蛋白酶芯形成PHF的主链(Wischik等人，Proc NatlAcad Sci USA.85:4884-8,1988)。

如本文所用，“结合PHF-tau的分离的人源化抗体”或“分离的人源化抗PHF-tau抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的人源化抗PHF-tau抗体(例如，分离的人源化抗PHF-tau抗体基本上不含特异性地结合除PHF-tau之外的抗原的抗体)。然而，分离的人源化抗PHF-tau抗体可与例如来自其他物种(诸如PHF-tau物种同源物)的其他相关抗原具有交叉反应性。

如本文所用，术语“特异性结合”或“特异结合”是指本专利申请的抗PHF-tau抗体以约1×10^-6M或更严格的，例如约1×10^-7M或更低、约1×10^-8M或更低、约1×10^-9M或更低、约1×10^-10M或更低、约1×10^-11M或更低、约1×10^-12M或更低或约1×10^-13M或更低的解离常数(K_D)与预定靶结合的能力。KD获自Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)并且表示为摩尔浓度(M)。根据本公开，抗体的KD值可以使用本领域中的方法确定。例如，抗PHF-tau抗体的KD值可通过使用表面等离振子共振，诸如通过使用生物传感器系统，例如系统、ProteOn仪器(BioRad)、KinExA仪器(Sapidyne)、ELISA或本领域的技术人员已知的竞争性结合测定法来确定。通常，抗PHF-tau抗体与预定靶(即，PHF-tau)结合的K_D为其对于非特异性靶的K_D的至多十分之一，如通过使用例如ProteOn仪器(BioRad)的表面等离振子共振测量的。然而，与PHF-tau特异性地结合的抗PHF-tau抗体可对其他相关的靶标具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp)或狨猴(Callithrixjacchus)(commonmarmose，marmoset)的相同的预先确定的靶标具有交叉反应性。虽然单特异性抗体特异性结合一个抗原或一个表位，而双特异性抗体特异性结合两个不同的抗原或两个不同的表位。

如本文所用，“缀合物”是指与一种或多种异源分子共价连接的抗体或蛋白质，包括但不限于治疗性肽或蛋白质、抗体、标记或神经病症药物。

如本文所用，术语“偶联”是指两个或更多个对象结合或连接在一起。当提及化学或生物化合物时，偶联可以是指两个或更多个化学或生物化合物之间的共价连接。通过非限制性示例，本专利申请的抗体可与所关注的肽偶联以形成抗体偶联肽。抗体偶联肽可以通过设计成将抗体缀合至肽的特定化学反应来形成。在某些实施方案中，本专利申请的抗体可通过接头与本专利申请的肽共价偶联。接头可以例如首先共价连接至抗体或肽，然后共价连接至肽或抗体。

如本文所用的“接头”是指共价连接两个不同实体的化学接头或单链肽接头。接头可用于连接本专利申请的抗体或其片段、血脑屏障梭子、融合蛋白和缀合物中的任两者。接头可将例如scFv中的VH和VL连接，或者将人源化抗体或其抗原结合片段与第二分子(诸如二抗)连接。在一些实施方案中，如果单价结合实体包含针对CD98、优选地人CD98hc的scFv，并且治疗性分子包含针对Tau的抗体，则接头可将scFv与针对Tau的抗体连接。在一些实施方案中，如果单价结合实体包含针对TfR、优选地huTfR1的scFv，并且治疗性分子包含针对CNS靶标(诸如Tau)的抗体，则接头可将scFv与针对Tau的抗体连接。可以使用由通过肽键连接的1至25个氨基酸(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸)构成的单链肽接头。在某些实施方案中，这些氨基酸选自二十种天然存在的氨基酸。在某些其他实施方案中，这些氨基酸中的一个或多个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。也可以使用化学接头，诸如烃接头、聚乙二醇(PEG)接头、聚丙二醇(PPG)接头、多糖接头、聚酯接头、由PEG和嵌入的杂环组成的混合接头以及烃链。

如本文所用，术语“CD98”或“CD98hc”是指由通过二硫键与多个轻链中的任一轻链连接的分化簇98重链(CD98hc)组成的整合膜蛋白。当与LAT1或LAT2缔合时，异源二聚体转运蛋白复合物表现为强制性氨基酸交换剂。CD98hc具有约80kDa的分子量。优选地，CD98hc为人CD98hc(huCD98hc)。huCD98hc由SLC3A2基因编码。

如本文所用，术语“转铁蛋白受体”或“TfR”是指通过受体介导的针对转铁蛋白的载体蛋白内吞过程进行细胞铁摄入所必需的细胞表面受体。TfR参与脊椎动物中的铁摄入并且响应于细胞内铁浓度而被调节。其通过经由受体介导的内吞作用内化转铁蛋白-铁复合物来导入铁。已经表征了人类的两种转铁蛋白受体，转铁蛋白受体1和转铁蛋白受体2。这两种受体均为跨膜糖蛋白。TfR1为高亲和力遍在表达的受体。TfR2以TfR11/25至1/30的亲和力与转铁蛋白结合。TfR2的表达限于某些细胞类型并且不受细胞内铁浓度的影响。在一个实施方案中，例如，TfR为包含如Schneider等人，Nature 311:675-678(1984)中的氨基酸序列的人TfR。其可具有约180,000道尔顿的分子量，具有两个亚基，该两个亚基各自具有约90,000道尔顿的表观分子量。优选地，TfR为人TfR1(huTfR1)。

当参考氨基酸序列使用时，短语“序列同一性”或“序列同一性百分比(％)”或“同一性％”或“与...有％同一性”描述与构成氨基酸序列的总长度的氨基酸残基的数量相比，两个或更多个比对氨基酸序列的相同氨基酸的匹配数(“命中”)。换句话说，使用比对，对于两个或更多个序列，当使用本领域已知的序列比较算法测量的比较和比对序列的最大对应性时，或当手动比对和目视检查时，可确定相同的氨基酸残基的百分比(例如，在氨基酸序列全长上的90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性)。因此，被比较以确定序列同一性的序列可能因氨基酸的替换、添加或缺失而不同。用于比对蛋白质序列的合适程序是技术人员已知的。可例如使用诸如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST的程序，例如使用NCBI BLAST算法来确定蛋白质序列的序列同一性百分比(AltschulSF等人，(1997),Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。

在两个氨基酸序列的上下文中，术语“基本上相同”意指当诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认间隙权重被最佳比对时共享至少约50％序列同一性的序列。通常，基本上相同的序列将表现出至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％序列同一性。

“多肽”或“蛋白质”意指包含通过肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。

如本文所用，同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的术语“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。

如本文所用，术语“载体”是复制子，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含本专利申请的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，“宿主细胞”是用本专利申请的核酸分子转染的细胞。在另一个实施方案中，“宿主细胞”是此类经转染细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可以或不可与亲本细胞相同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。

如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到RNA的转录。该术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的结合PHF-tau的人源化抗体或其抗原结合片段可处于宿主细胞的细胞质之内，处于细胞外环境诸如细胞培养物的生长培养基中，或锚定至细胞膜。

如本文所用，术语“载剂”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于在药物制剂中使用的其它材料。应当理解，载剂、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰根据本专利申请的组合物的效果或根据本专利申请的组合物的生物活性的非毒性材料。根据本公开，根据特定实施方案，适用于在抗体药物组合物中使用的任何药学上可接受的载剂均可用于本专利申请中。

如本文所用，术语“受试者”是指动物，并且优选地指哺乳动物。根据特定实施方案，受试者是哺乳动物，包括非灵长类(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、犬、大鼠、兔子、豚鼠或小鼠)或灵长类(例如猴、黑猩猩或人)。在特定实施方案中，受试者是人。

就本专利申请的方法而言，术语“施用”意指用于通过使用本专利申请的抗体或其抗原结合片段、或缀合物、或其形式、组合物或药物来治疗性地或预防性地预防、治疗或改善如本文所述的综合征、病症或疾病的方法。此类方法包括在治疗过程中的不同时间施用有效量的所述抗体、其抗原结合片段或缀合物、其形式、组合物或药物，或者以组合形式同时施用。本专利申请的方法应理解为涵盖所有已知的治疗性处理方案。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或药物学响应的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验并以常规方式进行确定。例如，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。基于若干因素的考虑，包括所治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态以及技术人员已知的其他因素，本领域的技术人员可确定具体有效剂量的选择(例如，经由临床试验)。在制剂中待采用的精确剂量也将取决于施用途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可通过源自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。

如本文所用，术语“处理”和“治疗”均旨在是指与tau蛋白病变有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受试者中可识别的，但能够在受试者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、病症或病况的发展。在一个具体实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与tau蛋白病相关联的一种或多种症状的持续时间。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、病症或病况的复发。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、病症或病况的受试者的存活提高。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中疾病、病症或病况的消除。

如本文使用，“tau蛋白病”涵盖涉及脑之内的tau病理性聚集的任何神经退化性疾病。除家族性和散发性AD之外，其他示例性tau蛋白病是与17号染色体相关的额颞痴呆及帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结性痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合征、格-施-沙氏病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、脑炎后帕金森综合征和慢性创伤性脑病诸如拳击员痴呆症(拳击疾病)(Morris等人，Neuron,70:410-26,2011)。

“血脑屏障”或“BBB”是指外周循环与脑和脊髓之间的生理屏障，其通过脑毛细血管内皮质膜内的紧密结合部形成，从而形成限制分子到脑中的转运的紧密屏障。BBB可限制甚至非常小的分子诸如脲(60道尔顿)到脑中的转运。BBB的示例包括脑内的BBB、脊髓内的血脊髓屏障以及视网膜内的血视网膜屏障，所有这些都是CNS内的连续毛细血管屏障。BBB也涵盖血液CSF屏障(脉络丛)，其中屏障由室管膜细胞而不是毛细血管内皮细胞构成。

“血脑屏障受体”(本文中缩写为“R/BBB”)为在脑内皮细胞上表达的细胞外膜连接的受体蛋白，其能够跨BBB转运分子或用于转运外源施用的分子。R/BBB的示例包括但不限于大中性氨基酸转运蛋白(LAT)复合物，包括CD98组分、转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF-R)、低密度脂蛋白受体(包括但不限于低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8))和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。本文的示例性R/BBB为CD98hc或转铁蛋白受体(TfR)。

“中枢神经系统”或“CNS”是指控制身体功能的神经组织的复合物，并且包括脑和脊髓。

如本文所用，“神经病症”是指影响CNS和/或具有CNS中的致病源的疾病或病症。示例性CNS疾病或病症包括但不限于神经病、淀粉样变性、癌、眼病或病症、病毒或微生物感染、炎症、局部缺血、神经退化性疾病、癫痫、行为障碍和溶酶体贮积症。出于本专利申请的目的，CNS将被理解为包括眼部，其通常通过血视网膜屏障与身体的其余部分隔绝。神经病症的具体示例包括但不限于神经退化性疾病(包括但不限于路易体病、脊髓灰质炎后综合征、夏-德综合征、橄榄脑桥小脑萎缩、帕金森氏病、多系统萎缩、纹状体黑质退行性变、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌肉萎缩)、tau蛋白病(包括但不限于阿尔茨海默病和核上性麻痹)、朊病毒病(包括但不限于牛海绵状脑病、痒病、克-雅综合征、库鲁病、格-施-沙氏病、慢性消耗性疾病和致死性家族失眠症)、延髓性麻痹、运动神经元疾病和神经系统异质性退化性病症(包括但不限于卡纳万病、亨廷顿病、神经元蜡样脂褐质沉积病、亚历山大病、图雷特综合征、门克斯卷发综合征(Menkes kinky hair syndrome)、科凯恩综合征、哈勒沃登-施帕茨综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核退行性变、莱施-尼汉综合征和翁韦里希特-伦德伯格综合征(Unverricht-Lundborg syndrome))、痴呆(包括但不限于皮克病和脊髓小脑性共济失调)、癌(例如CNS和/或脑癌，包括由身体其他地方的癌引起的脑癌细胞转移)。

“神经病症药物”为可用于治疗或改善一种或多种神经病症的影响的药物或治疗剂。本专利申请的神经病症药物包括但不限于小分子化合物、抗体、肽、蛋白质、一种或多种CNS靶标的天然配体、一种或多种CNS靶标的天然配体的修饰形式、适体、抑制性核酸(即，小抑制性RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA))、核酶或前述中的任一者的活性片段。本专利申请的示例性神经病症药物在本文中描述并且包括但不限于：其自身或特异性识别和/或作用于(即，抑制、活化或检测)CNS抗原或靶分子(诸如但不限于淀粉样前体蛋白或其部分、β淀粉样蛋白、β-分泌酶、γ-分泌酶、tau、α-突触核蛋白、帕金蛋白、亨廷顿蛋白、DR6、早老蛋白、ApoE、胶质瘤或其他CNS癌标志物和神经营养蛋白)的抗体、适体、蛋白质、多肽、抑制性核酸以及前述中的任一者的小分子和活性片段。神经病症药物及其可用于治疗的对应病症的非限制性示例：脑源性神经营养因子(BDNF)、慢性脑损伤(神经形成)；成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、抗表皮生长因子受体抗体(EGFR)、脑癌；胶质细胞系源性神经因子(GDNF)、帕金森氏病；脑源性神经营养因子(BDNF)、肌萎缩性侧索硬化症、抑郁症；溶酶体酶、脑溶酶体贮积病；睫状神经营养因子(CNTF)、肌萎缩性侧索硬化症；神经调节蛋白-1、精神分裂症；抗HER2抗体(例如曲妥珠单抗)、HER2阳性癌的脑癌细胞转移。

如本文所用，“靶抗原”或“脑靶标”是指在CNS(包括脑)中表达的抗原和/或分子，其可用抗体或小分子靶向。此类抗原和/或分子的示例包括但不限于：β-分泌酶1(BACE1)、β淀粉样蛋白(Abeta)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、Tau、载脂蛋白E4(ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、亨廷顿蛋白、朊病毒蛋白(PrP)、富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受体6(DR6)、淀粉样前体蛋白(APP)、p75神经营养蛋白受体(p75NTR)和半胱天冬酶6。在一些实施方案中，靶抗原为BACE1。在一些优选的实施方案中，靶抗原为Tau。

术语“药物制剂”是指这样的制备物，该制备物为允许其中包含的活性成分的生物活性有效的此类形式，并且该制剂不含对将被施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。

如本文所用，“药学上可接受的载剂或稀释剂”意指适用于在向个体施用中使用的任何物质。例如，药学上可接受的载剂可以为无菌水溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或注射用水。

如本文所用，“药学上可接受的盐”意指化合物(诸如寡聚化合物或寡核苷酸)的生理上和药学上可接受的盐，即保留亲本化合物的期望的生物活性并且不赋予其不期望的毒性的盐。

在本专利申请中使用的药学上可接受的酸式盐/阴离子盐包括且不限于乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰对氨基苯胂酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明盐、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐和三乙基碘化物。有机酸或无机酸还包括且不限于氢碘酸、过氯酸、硫酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、甲磺酸、羟基乙磺酸、草酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、糖精酸或三氟乙酸。药学上可接受的碱盐/阳离子盐包括并且不限于铝、2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(也被称为三(羟甲基)氨基甲烷、氨基丁三醇或“TRIS”)、氨、苄星青霉素、叔丁胺、钙、氯普鲁卡因、胆碱、环己胺、二乙醇胺、乙二胺、锂、L-赖氨酸、镁、葡甲胺、N-甲基-D-葡糖胺、哌啶、钾、普鲁卡因、奎宁、钠、三乙醇胺或锌。

如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受试者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)、与此同时、或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。

人源化抗PHF-tau抗体

在一个总的方面，本专利申请涉及结合PHF-tau的分离的人源化抗体或其抗原结合片段。此类抗PHF-tau抗体可具有结合PHF-tau上的磷酸化表位或结合至PHF-tau上的非磷酸化表位的特性。抗PHF-tau抗体可用作治疗剂，以及用作研究或诊断试剂，以检测生物样品例如组织或细胞中的PHF-tau。

根据特定的方面，本专利申请涉及在tau蛋白的C末端结构域中的表位处与tau蛋白结合的分离的人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段在具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或该氨基酸序列内的tau蛋白的表位处与tau蛋白结合，其中抗体或其抗原结合片段结合PHF-tau，优选地人PHF-tau。优选地，分离的人源化抗体或其抗原结合片段在由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或该氨基酸序列内的tau蛋白的表位处与tau蛋白结合，其中抗体或其抗原结合片段结合PHF-tau，优选地人PHF-tau。

在一些实施方案中，tau蛋白的表位包含tau蛋白的磷酸化T427、磷酸化S433和磷酸化S435中的一者或多者，但不包含磷酸化T427、磷酸化S433和磷酸化S435中的全部。

人源化抗体具有基本上来自人抗体(称作受体抗体)的可变区框架残基以及基本上来自小鼠抗体(称为供体免疫球蛋白)的互补决定区。参见Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:10029-10033,1989、WO 90/07861、US5693762、US5693761、US5585089、US5530101和US5225539。一个或多个恒定区(如果存在)也基本上或完全来自人免疫球蛋白。人可变区通常选自人抗体，该人抗体的框架序列与CDR源自的鼠科动物可变区结构域表现出高度的序列同一性。重链和轻链可变区框架残基可源自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可为天然存在的人抗体序列，或者可为几个人抗体的共有序列。参见WO92/22653。基于其对CDR构象和/或与抗原结合的可能影响，选择人可变区框架残基的特定氨基酸用于替换。通过建模、检查具体位置处的氨基酸的特征或实验观察具体氨基酸替换或诱变的效果来对此类可能的影响进行研究。

例如，当氨基酸在鼠科动物可变区框架残基与所选择的人可变区框架残基之间有差异时，当合理预期该氨基酸：(1)直接非共价结合抗原，(2)邻近CDR区，(3)另外与CDR区相互作用(例如在CDR区约6埃之内)，或者(4)参与VL-VH界面时，人框架氨基酸应当通常用小鼠抗体的等同框架氨基酸替换。

用于替换的其他候选是受体人框架氨基酸，其在该位置处对于人免疫球蛋较罕见。这些氨基酸可用来自小鼠供体抗体的等同位置或更典型人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸替换。人源化免疫球蛋白的可变区框架通常示出与人可变区框架序列至少85％的序列同一性或共有此类序列。示例性框架替换包括例如下文实施例1中所述的那些。

抗体人源化可使用众所周知的方法来实现，该方法诸如特异性决定残基表面重塑(SDRR)(US2010/0261620)、表面重塑(Padlan等人,Mol.Immunol.28:489-98,1991)、超人源化(WO 04/006955)和人体串内容优化(US7657380)。可用于接枝或人源化的人框架序列可由本领域的技术人员从有关数据库中选择。还可通过诸如Queen等人,1989(同上)中所公开的那些的技术将所选择的框架修饰成保留或增强结合亲和力。根据特定实施方案，用于由小鼠亲本抗体人源化抗PHF-tau抗体的方法包括下文实施例1中所述的那些。

本专利申请的抗体可通过多种技术产生，例如通过杂交瘤法(Kohler和Milstein,Nature.256:495-7,1975)。可用US4816567中所公开的方法制备这样的嵌合单克隆抗体，其含有源自供体抗体(通常为鼠科动物)的轻链和重链可变区和与之相结合的源自受体抗体(通常为另一种哺乳类物种，诸如人)的轻链和重链恒定区。可以通过本领域的技术人员已知的技术(诸如US5225539中所公开的技术)来制备这样的CDR接枝单克隆抗体，其具有源自非人供体免疫球蛋白(通常为鼠科动物)和剩余免疫球蛋白的CDR，该剩余免疫球蛋白源自来源于一种或多种人免疫球蛋白的分子的部分。缺乏任何非人序列的完全人单克隆抗体可通过以下文献中提及的技术从人免疫球蛋白转基因小鼠制备(Lonberg等人，Nature.368:856-9,1994；Fishwild等人,Nat Biotechnol.14:845-51,1996；以及Mendez等人,NatGenet.15:146-56,1997)。还可从噬菌体展示文库制备和优化人单克隆抗体(参见，例如，Knappik等人，J Mol Biol.296:57-86,2000；Krebs等人,J Immunol Methods.254:67-84,2001；Shi等人,J Mol Biol.397:385-96,2010)。

在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含分别具有SEQ IDNO:4、5和6的多肽序列的免疫球蛋白重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别具有SEQ ID NO:7或14、8和9的多肽序列的免疫球蛋白轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中抗体或其抗原结合片段结合PHF-tau，优选地人PHF-tau，并且其中重链可变区结构域以及轻链可变区结构域中的框架区包含人免疫球蛋白的氨基酸序列。

在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有与SEQ IDNO:12或18有至少80％、优选地至少85％或90％、更优选地至少95％并且最优选地100％同一性的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO:13、19或23有至少80％、优选地至少85％或90％、更优选地至少95％并且最优选地100％同一性的多肽序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有与SEQ IDNO:12或18有至少80％、优选地至少85％或90％、更优选地至少95％并且最优选地100％同一性的多肽序列的重链可变区，以及具有与SEQ ID NO:13、19或23有至少80％、优选地至少85％或90％、更优选地至少95％并且最优选地100％同一性的多肽序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:13的多肽序列的轻链可变区。在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:18的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:19的多肽序列的轻链可变区。在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:23的多肽序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:15或20的多肽序列的第一重链；

(b)各自独立地具有SEQ ID NO:16、21或24或60的多肽序列的两条轻链；以及

(c)具有SEQ ID NO:17或22的多肽序列的第二重链。

根据另一个特定的方面，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(b)具有SEQ ID NO:61或62的多肽序列的重链；以及

(c)分别具有SEQ ID NO:16或24、或者21或60的多肽序列的轻链。

在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:15的多肽序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:16的多肽序列的两条轻链，以及具有SEQID NO:17的多肽序列的第二重链。在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:20的多肽序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:21的多肽序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的多肽序列的第二重链。在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:15的多肽序列的第一重链、各自具有SEQID NO:24的多肽序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的多肽序列的第二重链。在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:20的多肽序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:60的多肽序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的多肽序列的第二重链。

在一些实施方案中，分离的人源化抗体包含：各自具有SEQ ID NO:61的多肽序列的两条重链，以及各自具有SEQ ID NO:16或24的多肽序列的两条轻链。在一些实施方案中，分离的人源化抗体包含：各自具有SEQ ID NO:62的多肽序列的两条重链，以及各自具有SEQID NO:21或60的多肽序列的两条轻链。

在一些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段以5×10^-9M或更低的解离常数(KD)、优选地1×10^-9M或更低或者1×10^-10M或更低的KD与PHF-tau结合，其中KD通过表面等离振子共振分析，诸如通过使用Biacore或ProteOn系统来测量。

结合PHF-tau的人源化抗体及其抗原结合片段的功能活性可通过本领域已知及如本文所述的方法进行表征。用于表征结合PHF-tau的抗体及其抗原结合片段的方法包括但不限于亲和力和特异性测定，包括Biacore、ELISA和FACS分析；免疫组织化学分析；体外细胞测定和体内注射测定，以确定抗体抑制tau接种的功效；细胞毒性测定，以检测抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的存在；等。根据具体实施方案，用于表征结合PHF-tau的抗体及其抗原结合片段的方法包括以下实施例所述的那些。结合PHF-tau但不结合对照tau的人源化抗体的示例性小鼠亲本抗体为抗体PT3，其描述于美国专利号9,371,376中，该美国专利的内容全文以引用方式并入本文。

可采用若干众所周知的方法来确定本专利申请的抗体的结合表位。例如，当两种个体组分的结构已知时，可以进行硅片蛋白-蛋白对接以鉴定相容的相互作用位点。可以用抗原和抗体复合物进行氢-氘(H/D)交换，以对抗原上被抗体结合的区进行定位。抗原的区段诱变和点诱变可以用来定位对抗体结合重要的氨基酸。使用抗体-抗原复合物的共晶体结构来鉴定对表位和互补位有贡献的残基。

本专利申请的抗体可为双特异性或多特异性的。示例性双特异性抗体可结合在PHF-tau上的两个不同表位，或可结合PHF-tau和β淀粉样蛋白(Aβ)。另一种示例性双特异性抗体可结合PHF-tau和内源血脑屏障转胞吞作用受体，诸如胰岛素受体、转铁蛋白受体、胰岛素样生长因子-1受体和脂蛋白受体。示例性抗体具有IgG1类型。

本专利申请的抗体的免疫效应子特性可通过本领域的技术人员已知的技术通过Fc修饰得到增强或沉默。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制。药代动力学特性还可通过使Fc结构域中延长抗体半衰期的残基突变得到增强(Strohl,Curr Opin Biotechnol.20:685-91,2009)。

抗PHF-tau抗体可不具有或具有最小限度的效应子功能，但保留其结合FcRn的能力，其结合可以为抗体通过结合而具有延长的体内半衰期的主要手段。FcγR或补体(例如，C1q)与抗体的结合是由在所谓的Fc部分结合位点处限定的蛋白质-蛋白质相互作用引起的。此类Fc部分结合位点在本领域中是已知的。此类Fc部分结合位点包括例如氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引进行编号)。在一些实施方案中，抗PHF-tau抗体在一个或多个Fc部分结合位点中含有一个或多个替换以消除效应子功能。例如，抗PHF-tau抗体可含有Fc区，该Fc区含有以下替换中的一个或多个替换：在残基233处用脯氨酸替换谷氨酸，在残基234处用丙氨酸或缬氨酸替换苯丙氨酸，以及在残基235处用丙氨酸或谷氨酸替换亮氨酸(EU编号，Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.of Health and HumanServices,Bethesda,Md.,NIH出版号91-3242)。优选地，所关注的抗体含有L234A、L235A和P331S(EU编号，Kabat)的一个、两个或三个突变。

亚类IgG1、IgG2和IgG3抗体通常显示补体活化，包括C1q和C3结合，而IgG4不活化补体系统并且不结合C1q和/或C3。与其它IgG亚型相比，人IgG4 Fc区具有减小的结合FcγR和补体因子的能力。优选地，本专利申请的抗PHF-tau抗体包含来源于人IgG4 Fc区的Fc区。更优选地，Fc区包含具有消除效应子功能的替换的人IgG4 Fc区。例如，通过在残基297(EU编号)处用Ala取代Asn来去除IgG4 Fc区中的N-键合糖基化位点是确保消除残余效应子活性的另一种方式。

另外，本专利申请的抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(诸如添加聚乙二醇部分和脂质化)的过程进行翻译后修饰。此类修饰可在体内或体外发生。例如，本专利申请的抗体可与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)以改善其药代动力学曲线。缀合可通过本领域的技术人员已知的技术来进行。已经证实治疗性抗体与PEG的缀合增强药效学而不干扰功能(Knight等人，Platelets.15:409-18,2004；Leong等人,Cytokine.16:106-19,2001；Yang等人,Protein Eng.16:761-70,2003)。

在另一个总的方面，本专利申请涉及编码本专利申请的人源化抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸。本领域的技术人员将理解，可以改变(例如置换、缺失、插入等)蛋白质的编码序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本领域的技术人员将理解，可变更编码本专利申请的人源化抗体或其抗原结合片段的核酸序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。示例性分离的多核苷酸为编码包含实施例中所述的免疫球蛋白重链和轻链(例如，SEQ IDNO:15至17、20至22、24以及60至62)的多肽的多核苷酸，以及编码包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)(例如，SEQ ID NO:12、13、18、19、23和59)的多肽的多核苷酸。鉴于在给定表达系统中的遗传密码简并性或密码子优先性，编码本专利申请的抗体的其他多核苷酸也在本专利申请的范围之内。本专利申请的分离的核酸可使用众所周知的重组技术或合成技术进行制备。使用本领域已知的方法，容易分离且测序编码单克隆抗体的DNA。在杂交瘤生成的情况下，此类细胞可用作此类DNA的来源。另选地，可使用其中将编码序列与翻译产物联系起来的展示技术，诸如噬菌体或核糖体展示文库。

在另一个总的方面，本专利申请涉及包含编码本专利申请的人源化抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸的载体。根据本公开，可使用本领域的技术人员已知的任何载体，诸如质粒、粘端质粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，诸如质粒。载体可包括建立表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记物和复制起点。启动子可为组成型、诱导型或阻抑型启动子。能够向细胞递送核酸的多种表达载体在本领域中是已知的，并且在本文可用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。常规克隆技术或人工基因合成可用于根据本专利申请的实施方案生成重组表达载体。

在另一个总的方面，本专利申请涉及包含编码本专利申请的人源化抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸的宿主细胞。鉴于本公开，本领域的技术人员已知的任何宿主细胞可用于重组表达本专利申请的抗体或其抗原结合片段。此类宿主细胞可为真核细胞、细菌细胞、植物细胞或古菌细胞。示例性真核细胞可为哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括永生细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas,Va.,CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC号85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCCCRL-1580)鼠科动物细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他可用的细胞系包括源自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞系，诸如CHO-K1 SV(LonzaBiologics)、CHO-K1(ATCC CRL-61，Invitrogen)或DG44。

在另一个总的方面，本专利申请涉及产生本专利申请的人源化抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括：在用于产生本专利申请的人源化抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码人源化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的细胞，以及从细胞或细胞培养物(例如，从上清液)中回收抗体或其抗原结合片段。表达的抗体或其抗原结合片段可从细胞收获得到并且根据本领域已知的常规技术进行纯化。

带有抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段的缀合物和融合构建体

虽然血脑屏障(BBB)阻止有害物质进入脑并且对于脑稳态是必需的，但是它对于有效地将药物递送至脑呈现出难以克服的障碍。已经研究了许多方法来改善治疗性单克隆抗体(mAb)的脑递送，包括对受体介导的转胞吞作用(RMT)的使用。RMT利用BBB腔侧上大量表达的受体来通过脑内皮细胞进行转运。先前针对形成用于将治疗性mAb递送到脑中的临床可行平台的努力已集中于抗体工程，以增加转胞吞作用的效率，其中通过观察结合化合价、pH依赖性和亲和力获得了进展(Goulatis等人,2017,Curr Opin Struct Biol 45:109-115中综述)。然而，转化为非人灵长类(NHP)和临床已受到来自靶标介导的药物处置(TMDD)的快速外周清除和来自急性网织红细胞耗尽的安全性的限制(Gadkar K等人，Eur J PharmBiopharm.2016；101:53-61)。

在总的方面，本专利申请涉及与用于脑递送的优化平台偶联的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段。平台利用CD98或TfR结合分子，特别是与CD98或TfR结合的抗体或其抗原结合片段，优选人CD98重链(huCD98hc)或人TfR1(huTfR1)。本发明人出乎意料地发现，最佳值不只是在典型的抗体-靶标相互作用中如人们可能预期的最快缔合速率k_a值和最慢离解速率k_d值。即，对于该系统，人们不一定想要使用这样的分子，该分子以相对较高速率与CD98或TfR“结合”和缔合，并且随后更缓慢地从CD98或TfR解离以具有抗体-靶标复合物的最长寿命。相反，对于待通过抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段有效递送的药剂(诸如mAb)的最佳脑PK和PD，需要既不太快也不太慢的中性离解速率。也发现具有与新生Fc受体(FcRn)的增加的结合的工程化抗体恒定区导致降低的外周清除和脑浓度的增强。

引入附加的Fc突变以消除与Fcγ受体(FcγR)的结合并且避免效应子功能介导的毒性。当与高亲和力抗Tau结合mAb偶联时，这些突变防止外周中的效应子功能介导的毒性，同时通过新颖的非FcγR机制来保持抗体依赖性吞噬作用(ADP)，用于小神经胶质细胞摄入和靶标降解。该机制依赖于通过CD98或TfR进行的内化，并且在促进靶标降解方面比传统的FcγR介导的ADP更有效，而不刺激促炎细胞因子的分泌。

优选地，本专利申请的抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段是pH敏感的，例如，它在不同pH下具有对CD98或TfR的不同结合亲和力。例如，本专利申请的抗CD98或抗TfR抗体可在中性pH诸如生理pH(例如，pH7.4)下以高亲和力与CD98或TfR结合，但是在内化到内体隔室中时，在酸性pH诸如相对较低的pH(pH5至6.0)下从CD98或TfR解离。亲和力是两个部分(例如，抗体和抗原)之间结合强度的量度。亲和力可以若干方式来表达。一种方式是根据相互作用的解离常数(K_D)。K_D可通过常规方法(包括平衡渗析)或通过直接测量抗原-抗体解离和缔合的速率(分别为k_离解(kd或k_解离)和k_结合(或ka)速率)来测量(参见例如Nature,1993361:186-87)。k_离解/k_缔合的比率消除了与亲和力无关的所有参数，并且等于解离常数K_D(通常参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990 59:439-473)。因此，较小的K_D意味着较高的亲和力。亲和力的另一种表达为K_a(其为K_D的倒数)或k_缔合/k_离解。因此，较高的K_a意味着较高的亲和力。例如，在本专利申请的组合物和/或方法中使用的CD98或TfR抗体或其抗原结合片段可以为这样的抗体或其片段，该抗体或其片段在中性pH(例如，pH6.8至7.8)诸如生理pH(例如，pH7.4)下以1纳摩尔(nM，10^-9M)或更大的K_D与CD98或TfR结合，并且在酸性pH(例如，pH4.5至6.5)诸如pH5.0下以10^-4sec^-1或更大的k_解离从CD98或TfR解离。

因此，本专利申请的总的方面涉及用于向对其有需要的受试者的脑递送的与抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段偶联的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段，其中抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段与CD98、优选地CD98hc、更优选地人CD98hc或者TfR、优选地TfR1、更优选地人TfR1结合，其中在中性pH下解离常数K_D为至少1nM、优选地1nM至500nM，并且在酸性pH、优选地pH5下离解速率常数k_d为至少10^-4sec^-1、优选地10^-4sec^-1至10^{- 1}sec^-1。

在一些实施方案中，本专利申请的抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段在中性pH下具有2×10^-2sec^-1至2×10^-4sec^-1，诸如2×10^-2sec^-1、1×10^-2sec^-1、9×10^-3sec^-1、8×10^-3sec^-1、7×10^-3sec^-1、6×10^-3sec^-1、5×10^-3sec^-1、4×10^-3sec^-1、3×10^-3sec^-1、2×10^-3sec^-1、1×10^-3sec^-1、9×10^-4sec^-1、8×10^-4sec^-1、7×10^-4sec^-1、6×10^-4sec^-1、5×10^-4sec^-1、4×10^{- 4}sec^-1、3×10^-4sec^-1、2×10^-4sec^-1或其间的任何值的离解速率常数k_d。

在一些实施方案中，与人CD98或TfR结合的抗体或其抗原结合片段为单链可变片段(scFv)，该scFv包含经由柔性接头与轻链可变区(L_V)共价连接的重链可变区(H_V)。尽管去除了恒定区并引入了接头，但scFv可保留初始免疫球蛋白的特异性。在scFv中，结构域的次序可以为H_V-接头-L_V或L_V-接头-H_V。接头可被从头设计或来源于已知的蛋白质结构，以在桥接scFv的可变结构域时提供相容的长度和构象，而没有严重的空间干扰。接头可具有10至约25个氨基酸的长度。优选地，接头为这样的肽接头，该肽接头在可变结构域的羧基末端与其他结构域的氨基末端之间跨越约3.5nm而不影响结构域折叠和形成完整抗原结合位点的能力(Huston等人,Methods in Enzymology,第203卷,第46–88页,1991，其以全文引用的方式并入本文)。接头优选地包含亲水性序列，以便避免在整个蛋白质折叠过程中肽嵌入可变结构域内或可变结构域之间(Argos,Journal of Molecular Biology,第211卷,第4号,第943–958页,1990)。例如，接头可包含Gly和Ser残基和/或与带电荷的残基(诸如Glu、Thr和Lys)一起散布以增强溶解度。在一些实施方案中，接头具有SEQ ID NO:50(GGGSGGSGGCPPCGGSGG)或SEQ ID NO:51(GTEGKSSGSGSESKST)的氨基酸序列。根据本公开，也可使用任何其他合适的接头。

在一些实施方案中，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段包含：包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：

(a)抗CD98抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:26、27、28或33、29、30和31的氨基酸序列；或者

(b)抗TfR抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:35、36、37、38、39和40的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段为单链可变片段(scFv)，该scFv包含经由接头与轻链可变区共价连接的重链可变区，优选地，接头具有SEQID NO:50或51的氨基酸序列，更优选地，scFv包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34或SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，与CD98、优选地CD98hc、更优选地人CD98hc结合或与TfR、优选地TfR1、更优选地人TfR1结合的抗体或其抗原结合片段不含游离半胱氨酸。

抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段(诸如scFv片段)可根据本公开使用本领域中合适的方法来产生。例如，scFv片段可通过使重组宿主细胞(诸如细菌、酵母或哺乳动物细胞)在用于产生抗体片段的合适的条件下生长并从细胞培养物中回收片段来重组产生。示例性抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段可见于例如US 63/036,020和US 63/035,961中，其公开内容以全文引用的方式并入本文。

本专利申请的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段可以组合形式或者与抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段连接来进行非肠道(例如，静脉内)递送。例如，人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段可与抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段非共价附接。人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段也可与抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段共价附接以形成缀合物。在某些实施方案中，缀合是通过蛋白融合体的构造(即，通过编码人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段以及抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段的两个基因的基因融合并且表达为单一蛋白质)。根据本公开，已知方法可用于将人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段与CD98或TfR抗体或其抗原结合片段连接。参见例如Wu等人,NatBiotechnol.,23(9):1137-46,2005；Trail等人,Cancer Immunol Immunother.,52(5):328-37,2003；Saito等人,Adv Drug Deliv Rev.,55(2):199-215,2003；Jones等人,Pharmaceutical Research,24(9):1759-1771,2007。

在一些实施方案中，待递送至脑的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段以及抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段可经由非肽接头或肽接头共价连接在一起(或缀合)。非肽接头的示例包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯醚、生物可降解聚合物、聚合脂质、甲壳质和透明质酸、或它们的衍生物、或上述项的组合。肽接头可以为由通过肽键连接的1至50个氨基酸组成的肽链或其衍生物，其N末端和C末端可与抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段共价连接。

在某些实施方案中，本专利申请的缀合物为多特异性抗体，该多特异性抗体包含：结合PHF-tau的第一抗原结合区以及结合CD98或TfR的第二抗原结合区。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537,1983)、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBOJ.10:3655,1991)以及“杵臼结构”工程(参见例如美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可通过以下来制备：对静电操纵效应进行工程化(WO 2009/089004A1)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等人,Science,229:81,1985)；使用亮氨酸拉链(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553,1992))；使用“双价抗体”技术(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448,1993))；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol,152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如例如Tutt等人，J.Immunol.147:60,1991中所述。本专利申请的多特异性抗体也涵盖具有三个或更多个功能性抗原结合位点的抗体，包括“章鱼抗体”或“双可变结构域免疫球蛋白”(DVD)(参见例如US2006/0025576A1以及Wu等人，Nature Biotechnology,25(11):1290-7,2007)。本专利申请的多特异性抗体也涵盖“双重作用Fab”或“DAF”，其包含与CD98或TfR以及脑抗原(例如，Tau)结合的抗原结合区(参见例如US2008/0069820)。在一个实施方案中，抗体为抗体片段，本文公开了各种此类片段。

在一个实施方案中，本专利申请的多特异性抗体为融合构建体，其包含本专利申请的与抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段共价连接(或融合)的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段。抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段可直接或经由接头与人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链的羧基和/或氨基末端融合。

在一个实施方案中，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段直接或经由接头与人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段的轻链的羧基末端融合。

在另一个实施方案中，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段直接或经由接头与人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段的轻链的氨基末端融合。

在另一个实施方案中，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段直接或经由接头与人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段的重链的羧基末端融合。

在另一个实施方案中，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段直接或经由接头与人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段的重链的氨基末端融合。

在优选的实施方案中，本专利申请的融合构建体包含本专利申请的经由接头与结合至PHF-tau的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段的两条重链中的仅一条重链的羧基末端共价连接的抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段，优选地抗huCD98hc scFv片段或抗huTfR1 scFv片段。优选地，接头具有SEQ ID NO:52(GGAGGA)的氨基酸序列。

为了便于在两条重链之间形成异源二聚体(例如，一条重链带有抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段的融合体并且一条重链没有，或者一条重链含有针对抗CD98或抗TfR臂的Fc并且一条重链含有针对抗PHF-tau臂的Fc)，可将异源二聚体突变引入到两条重链的Fc中。此类Fc突变的示例包括但不限于Zymework突变(参见例如US10,457,742)和“杵臼结构”突变(参见例如Ridgway等人,Protein Eng.,9(7):617-621,1996)。其他异源二聚体突变也可在本专利申请中使用。在一些实施方案中，如本文所述的修饰的CH3用于便于在两条重链之间形成异源二聚体。

在一些实施方案中，与野生型CH3结构域多肽相比，分离的人源化抗体或其抗原结合片段的两条重链中的每条重链包含一个或多个异源二聚体突变(诸如修饰的异源二聚体CH3结构域)或者一个或多个杵臼结构突变。在一些实施方案中，第一重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含在位置T350、L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，并且第二重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含在位置T350、T366、K392和T394处的氨基酸修饰，其中在位置T350处的氨基酸修饰为T350V、T350I、T350L或T350M；在位置L351处的氨基酸修饰为L351Y；在位置F405处的氨基酸修饰为F405A、F405V、F405T或F405S；在位置Y407处的氨基酸修饰为Y407V、Y407A或Y407I；在位置T366处的氨基酸修饰为T366L、T366I、T366V或T366M，在位置K392处的氨基酸修饰为K392F、K392L或K392M，并且在位置T394处的氨基酸修饰为T394W，并且其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。在一些实施方案中，第一重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T350V、L351Y、F405A和Y407V，并且第二重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T350V、T366L、K392L和T394W。在一些实施方案中，第一重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含在位置T366处的氨基酸修饰，并且第二重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含在位置T366、L368和Y407处的氨基酸修饰，其中在位置T366处的氨基酸修饰为T366W或T366S，在位置L368处的氨基酸修饰为L368A，并且在位置Y407处的氨基酸修饰为Y407V。在一些实施方案中，第二重链的修饰的异源二聚体CH3结构域还包含H435R和Y436F氨基酸修饰，以破坏蛋白A结合并且在纯化期间去除臼-臼同源二聚体。在一些实施方案中，第一重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T366W，并且第二重链的修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。

除异源二聚体突变之外，也可引入其他突变。在一些实施方案中，融合构建体或双特异性抗体的Fc区还包含：变更(增加或减少)、优选地消除ADCC/CDC的一个或多个突变(诸如本文所述的AAS突变)，和/或变更(增加或减少)、优选地增加融合构建体或双特异性抗体与FcRn的结合的一个或多个突变(诸如本文所述的YTE突变)。在一些实施方案中，融合构建体或双特异性抗体中的一个或多个半胱氨酸残基被其他氨基酸(诸如丝氨酸)替换。在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段在Fc结构域中包含一个或多个突变，该一个或多个突变增强融合体与新生Fc受体(RcRn)的结合，优选地该一个或多个突变增强在酸性pH下的该结合，更优选地Fc具有M252Y/S254T/T256E(YTE)突变，其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。在一些实施方案中，分离的人源化抗体或其抗原结合片段在Fc结构域中包含减少或消除效应子功能的一个或多个突变，优选地Fc在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329处具有一个或多个氨基酸修饰，诸如L234A、L235A和P331S中的一个、两个或三个突变，其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。

在某些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：

(1)第一重链，该第一重链具有与选自由SEQ ID NO:42至49组成的组的氨基酸序列有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；

(2)两条轻链，该两条轻链各自独立地具有与选自由SEQ ID NO:16、21、24和60组成的组的氨基酸序列有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；以及

(3)第二重链，该第二重链具有与选自由SEQ ID NO:17和22组成的组的氨基酸序列有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ IDNO:24的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，本专利申请的融合构建体包含：具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。

本专利申请的缀合物(诸如多特异性抗体或融合构建体)可根据本公开通过本领域中已知的多种技术中的任一种技术来产生。例如，其可从重组宿主细胞进行表达，其中编码融合构建体或多特异性抗体的重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。宿主细胞可以是原核宿主细胞或真核宿主细胞。

在示例性系统中，通过转染或电穿孔将编码本申请的融合构建体的异二聚的两条重链和轻链的一个或多个重组表达载体引入宿主细胞中。培养所选的转化宿主细胞以允许在足以产生融合构建体的条件下表达重链和轻链，并从培养基中回收融合构建体。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，对转化子选择，培养宿主细胞并且从培养基中回收蛋白质构建体。

本专利申请提供了分离的核酸，该分离的核酸编码作为本文所述的实施方案中的任一实施方案或权利要求中的任一权利要求中的融合构建体或多特异性抗体的一部分的抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。分离的核酸可以为载体，优选地表达载体的一部分。

在另一方面，本申请涉及用本文公开的载体转化的宿主细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌(E.coli)。在另一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如，原生生物细胞、动物体细胞、植物细胞或真菌细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞是哺乳动物细胞(包括但不限于CHO、COS、NS0、SP2、PER.C6)，或真菌细胞(诸如酿酒酵母)，或昆虫细胞(诸如Sf9)。

药物组合物及治疗方法

本专利申请的人源化抗PHF-tau抗体或本专利申请的其片段、其缀合物或其融合构建体可用于治疗、减少或预防患有涉及脑内tau的病理性聚集或tau蛋白病的神经退化性疾病的患者(诸如患有AD的患者)的症状。

因此，在另一个总的方面，本专利申请涉及药物组合物，该药物组合物包含本专利申请的分离的人源化抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体以及药学上可接受的载剂。

在另一个总的方面，本专利申请涉及阻断对其有需要的受试者中的tau接种的方法，该方法包括向受试者施用本专利申请的药物组合物。如本文所用，“tau种子”是指当被细胞内化时或在体外暴露于单体tau时，能够成核或“接种”细胞内tau聚集的tau聚集体。tau接种活性可在如本文所述的细胞tau聚集测定法中进行评估(还可参见例如美国专利9,834,596号，该美国专利全文以引用方式并入)。

在另一个总的方面，本专利申请涉及治疗或减轻对其有需要的受试者中的疾病、病症或病况(诸如tau蛋白病)的症状的方法，该方法包括向受试者施用本专利申请的药物组合物。

在另一个总的方面，本专利申请涉及减少对其有需要的受试者中的病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法，该方法包括向受试者施用本专利申请的药物组合物。

根据本专利申请的实施方案，药物组合物包含治疗有效量的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体。如本文所用，相对于人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体，治疗有效量意指有以下作用的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体的量：导致疾病、病症或病状的治疗；预防或减缓疾病、病症或病况的发展；或者减轻或完全缓解与免疫疾病病症或病况相关联的症状。

根据特定实施方案，治疗有效量是指足以实现以下作用中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减小或改善所治疗疾病、病症或病况或与之相关联的症状的严重性；(ii)减少所治疗疾病、病症或病况或与之相关联的症状的持续时间；(iii)预防所治疗疾病、病症或病况或与之相关联的症状发展；(iv)引起所治疗疾病、病症或病况或与之相关联的症状消退；(v)预防所治疗疾病、病症或病况或与之相关联的症状发展或发作；(vi)预防所治疗疾病、病症或病况或与之相关联的症状复发；(vii)减少患有所治疗疾病、病症或病况或与之相关联的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有所治疗疾病、病症或病况或与之相关联的症状的受试者的住院时间；(ix)提高患有所治疗疾病、病症或病况或与之相关联的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中所治疗疾病、病症或病况或与之相关联的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。

根据具体实施方案，所治疗的疾病、病症或病况是tau蛋白病。根据更具体实施方案，所治疗的疾病、病症或病况包括但不限于家族性阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病、与17号染色体相关的额颞痴呆及帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合征、格-施-沙氏病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、脑炎后帕金森综合征、慢性创伤性脑病、或拳击员痴呆症(拳击疾病)。

tau蛋白病相关的行为表型包括但不限于认知损害、早期人格改变和失控、冷漠、意志缺乏、缄默症、失用症、持续言语、刻板的动作/行为、性欲亢进、混乱、无法计划或组织顺序任务、自私/无情、反社会特性、缺乏换位思考、踌躇、无语法的讲话伴频繁语义错误但相对保存完好的理解、受损的理解和选词障碍、缓慢渐进的步态不稳、反步症、不动、经常跌倒、非左旋多巴响应的轴向僵化、核上性凝视麻痹、方波抽搐、缓慢垂直扫视、假性延髓麻痹、肢体失用症、肌张力障碍、皮质感觉丧失和震颤。

顺应治疗的患者包括但不限于处于AD或其他tau蛋白病危险中的无症状个体，以及目前示出症状的患者。顺应治疗的患者包括具有已知AD遗传危险诸如AD家族史或基因组中存在遗传危险因素的个体。示例性危险因素是淀粉样前体蛋白(APP)中的突变，尤其是在第717位以及第670和671位处的突变(分别为哈迪突变和瑞典型突变)。其他危险因素是在早老蛋白基因PS1和PS2以及ApoE4中的突变、高胆固醇血症或动脉粥样硬化的家族史。目前患有AD的个体可通过上述危险因素的存在的特征性痴呆进行识别。此外，多个诊断测试可用于鉴定患有AD的个体。这些包括测量脑脊液tau和Aβ42水平。升高的tau和减小的Aβ42水平预示AD存在。患有AD的个体也可通过AD及相关病症协会(AD and Related DisordersAssociation)标准来诊断。

本专利申请的抗PHF-tau抗体适合作为用于治疗或预防涉及tau的病理性聚集的神经退化性疾病(诸如AD或其他tau蛋白病)的治疗剂和预防剂两者。在无症状患者中，治疗可在任何年龄(例如在约10、15、20、25、30岁)时开始。然而，通常，直到患者达到约40、50、60或70岁时才需要开始治疗。治疗通常需要在一段时间内的多个剂量。治疗可通过测定随着时间推移抗体或者活化T细胞或B细胞对治疗剂的响应进行监控。如果响应下降，则可指示加强剂量。

在预防应用中，将药物组合物或药剂施用于易患有AD或另外处于AD危险中的患者，其量足以消除或减少危险，减轻严重性，或延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病发展过程中存在的中间病理学表型。在治疗应用中，将组合物或药剂施用于易患有或已患有此类疾病的患者，其量足以减少、阻止或延迟疾病的症状中的任一种(生物化学、组织学和/或行为)。治疗剂的施用可减少或消除患者中的轻度认知损害，该患者仍未发展特征性阿尔茨海默病的病理学。

治疗有效量或剂量可根据各种因素，诸如所治疗的疾病、病症或病况、施用方式、目标部位、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)、受试者是人还是动物、施用的其他药物，以及该治疗为预防性还是治疗性的而变化。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。

在一些实施方案中，本专利申请涉及将人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段转运穿过血脑屏障(BBB)的方法，该方法包括：将与人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段偶联的抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段暴露于血脑屏障，使得抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段将与其偶联的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段转运穿过血脑屏障。优选地，抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体不干扰氨基酸转运。抗体以不干扰氨基酸转运的方式与CD98或TfR特异性结合。在一些实施方案中，BBB在哺乳动物，优选地灵长类，诸如人，更优选地患有神经病症的人中。在一个实施方案中，神经病症选自由以下项组成的组：阿尔茨海默病(AD)、卒中、痴呆、肌肉萎缩症(MD)、多发性硬化症(MS)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、囊性纤维化、天使人综合征、利德尔综合征、帕金森氏病、皮克病、佩吉特氏病、癌症和创伤性脑损伤。

本专利申请的抗体可被制备为药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的抗体、缀合物或融合构建体作为药学上可接受的载剂中的活性成分。载剂可为液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过常规的已知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中本专利申请的抗体的浓度可广泛改变，即从按重量计小于约0.5％，通常为或至少约1％到多达15％或20％，并且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。

本专利申请的抗体的治疗用途的施用模式可为将试剂递送至宿主的任何合适途径。例如，本文所述的组合物可被配制成适用于肠胃外施用，例如真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或颅内施用，或它们可施用到脑或脊柱的脑脊髓液中。

治疗可以单剂量方案或作为多剂量方案给予，在该多剂量方案中，初步治疗过程可使用1-10个单独的剂量，随后以为维持和/或增强响应所需的后续时间间隔给予其他剂量，例如在1-4个月时给予第二剂量，并且如果需要，在几个月之后给予一个或多个后续剂量。合适的治疗方案的示例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或其他足以引起预期会减轻疾病症状或减轻疾病严重程度的期望响应的方案。

可将本专利申请的抗体冻干用于储存，并在使用之前在合适的载剂中复原。该技术已示出对抗体及其他蛋白质制剂有效，并且可采用本领域已知的冻干和重构技术。

根据具体实施方案，治疗tau蛋白病中所用的组合物能够与有效治疗相关神经退化性疾病的其他试剂联合使用。在AD的情况下，本专利申请的抗体可与减少或预防淀粉样蛋白β(Aβ)的沉积的试剂联合施用。PHF-tau和Aβ病理学协同作用是可能的。因此，同时靶向PHF-tau和Aβ以及Aβ相关病理学两者的清除的联合疗法可能比单独靶向每一者更有效。在帕金森氏病及相关神经退化性疾病的情况下，清除聚集形式的α-突触核蛋白的免疫调节也是新出现的疗法。同时靶向tau和α-突触核蛋白两者的清除的联合疗法可能比单独靶向任一蛋白质更有效。

在另一个总的方面，本专利申请涉及产生包含本专利申请的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，该方法包括：将人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载剂组合以获得药物组合物。

在另一个实施方案中，本专利申请涉及本专利申请的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体在药物的制造或制备中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗神经疾病或病症。在另一个实施方案中，药物在治疗神经疾病或病症的方法中使用，该方法包括：向患有神经疾病或病症的个体施用有效量的药物。

本专利申请的另一个总的方面涉及在对其有需要的受试者中诱导抗体依赖性吞噬作用(ADP)而不刺激促炎细胞因子的分泌的方法，该方法包括：向受试者施用复合物，该复合物包含根据本专利申请的实施方案的与抗CD98或抗TfR抗体结合片段的其抗原结合片段偶联，优选地共价缀合的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段，其中人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段不具有效应子功能。例如，人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段可包含减少或消除效应子功能(诸如ADCC或CDC)的一个或多个氨基酸修饰，诸如减少或消除与Fcγ受体的结合的突变。此类突变可在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329处，诸如L234A、L235A和P331S中的一个、两个或三个突变，其中根据如Kabat中所述的EU索引进行氨基酸残基的编号。

在一些实施方案中，该方法还包括：向受试者施用有效量的至少一种附加治疗剂。在某些实施方案中，附加治疗剂为能有效地治疗与人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体被用于治疗的相同或不同的神经病症的治疗剂。示例性附加治疗剂包括但不限于：上述各种神经药物、抗胆碱酶剂(诸如多奈哌齐、加兰他敏、卡巴拉汀(rovastigmine)和他克林)、NMDA受体拮抗剂(诸如美金刚)、β淀粉样蛋白肽聚集抑制剂、抗氧化剂、γ-分泌酶调节剂、神经生长因子(NGF)模拟物或NGF基因疗法、PPARy激动剂、HMS-CoA还原酶抑制剂(斯达汀)、安帕金、钙通道阻滞剂、GABA受体拮抗剂、糖原合酶激酶抑制剂、静脉内免疫球蛋白、毒蕈碱受体激动剂、烟碱型受体调节剂、主动或被动β淀粉样蛋白肽免疫、磷酸二酯酶抑制剂、血清素受体拮抗剂和抗β淀粉样蛋白肽抗体。在某些实施方案中，该至少一种附加治疗剂针对其减轻神经药物的一种或多种副作用的能力来选择。附加治疗剂可在相同或独立的制剂中施用，并且与人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体一起或分开施用。本专利申请的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体可在施用附加治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后施用。本专利申请的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体也可与其他介入疗法组合使用，该其他介入疗法诸如但不限于放射疗法、行为疗法或本领域中已知并且适用于所治疗或预防的神经病症的其他疗法。

另一方面，本专利申请涉及含有可用于治疗或预防上述病症的材料的制品(诸如试剂盒)。制品包含容器以及在容器上或与容器相联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器保持对于治疗或预防病症本身有效或与另一组合物组合而有效的组合物，并且可具有无菌入口(例如容器可以为静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本专利申请的抗体、其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体。标签或包装说明书指示组合物用于治疗选择的病症。此外，制品可包括：(a)其中含有组合物的第一容器，其中组合物包含本专利申请的抗体、其抗原结合片段或缀合物；以及(b)其中含有组合物的第二容器，其中组合物包含另外的细胞毒性剂或治疗剂。本专利申请的该实施方案中的制品还可包括指示组合物可用于治疗特定病症的包装说明书。任选地，制品还可包括第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其还可包括从商业和用户观点来看所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

诊断方法和试剂盒

本专利申请的人源化抗PHF-tau抗体可在诊断受试者中的AD或其他tau蛋白病的方法中使用。

因此，在另一个总的方面，本专利申请涉及检测受试者中PHF-tau的存在的方法以及诊断受试者中的tau蛋白病的方法，其通过使用本专利申请的人源化抗体或其抗原结合片段来检测受试者中PHF-tau的存在。

在一个实施方案中，本专利申请的人源化抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体用于在症状发作之前检测神经病症和/或用于评估疾病或病症的严重程度或持续时间。抗体、抗原结合片段、其缀合物或其融合构建体允许对神经病症进行检测和/或成像，包括通过放射摄影术、断层摄影术或磁共振成像(MRI)进行成像。

通过使生物样品与诊断抗体试剂接触，并且检测诊断抗体试剂与来自受试者的样品中的磷酸化tau的结合，可在来自受试者的生物样品(例如血液、血清、血浆、间质液或脑脊髓液样品)中检测磷酸化tau。用于进行检测的测定包括众所周知的方法，诸如ELISA、免疫组织化学、蛋白质印迹或体内成像。

诊断抗体或类似试剂可通过静脉内注射到患者体内，或通过任何将该试剂递送至宿主的合适途径直接注射到脑中进行施用。抗体的剂量应在与治疗方法相同的范围之内。通常，将抗体标记，尽管在一些方法中，对磷酸化tau具有亲和力的一抗是未标记的，并且第二标记抗体用于结合至一抗。标记的选择取决于检测方法。例如，荧光标记适用于光学检测。顺磁性标记的使用适用于无需手术干预的断层摄影检测。放射性标记也可使用PET或SPECT进行检测。

诊断通过比较来自受试者的样品或受试者中的标记PHF-tau、tau聚集体和/或神经原纤维缠结的数目、大小和/或强度与对应基线值来执行。基线值可代表健康个体群体中的平均水平。基线值还可代表在相同受试者中测定的先前水平。

上文描述的诊断方法也可用于通过在治疗之前、在治疗过程中或在治疗之后检测受试者中磷酸化tau的存在，来监控受试者对疗法的响应。相对于基线值的降低发出针对治疗的正响应的信号。随着病理性tau从脑中清除，值还可在生物流体中瞬时增加。

本专利申请还涉及用于执行上述诊断和监控方法的试剂盒。通常，此类试剂盒含有诊断试剂(诸如本专利申请的抗体)和任选的可检测标记。诊断抗体自身可含有可检测标记(例如荧光分子、生物素等)，其可直接检测或可经由次级反应(例如与链霉抗生物素蛋白反应)检测。另选地，可使用含有可检测标记的第二试剂，其中该第二试剂对一抗具有结合特异性。在适用于测量生物样品中的PHF-tau的诊断试剂盒中，该试剂盒的抗体可以与固相诸如与微量滴定皿的孔预结合提供。

实施方案

本专利申请还提供了以下非限制性实施方案。

实施方案1是一种分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段在具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或所述氨基酸序列内的tau蛋白的表位处与所述tau蛋白结合，其中所述抗体或其抗原结合片段结合成对螺旋细丝(PHF)-tau、优选地人PHF-tau，其中所述tau蛋白的所述表位包含所述tau蛋白的磷酸化T427、磷酸化S433和磷酸化S435中的一者或多者，但不包含磷酸化T427、磷酸化S433和磷酸化S435中的全部。

实施方案2是根据实施方案1所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：分别具有SEQ ID NO:4、5和6的多肽序列的免疫球蛋白重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别具有SEQ ID NO:7或14、8和9的多肽序列的免疫球蛋白轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有与SEQ ID NO:12或18有至少90％同一性的多肽序列的重链可变区，或者具有与SEQ ID NO:13、19、23或59有至少90％同一性的多肽序列的轻链可变区。

实施方案2a是根据实施方案2所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：分别具有SEQ ID NO:4、5和6的多肽序列的免疫球蛋白重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别具有SEQ ID NO:7、8和9的多肽序列的免疫球蛋白轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3。

实施方案2b是根据实施方案2所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：分别具有SEQ ID NO:4、5和6的多肽序列的免疫球蛋白重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别具有SEQ ID NO:14、8和9的多肽序列的免疫球蛋白轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3。

实施方案3是根据实施方案2所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:12或18的多肽序列的重链可变区，或者具有SEQ ID NO:13、19、23或59的多肽序列的轻链可变区。

实施方案4是根据实施方案1至3中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:13的多肽序列的轻链可变区；

(b)具有SEQ ID NO:18的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:19的多肽序列的轻链可变区；

(c)具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:23的多肽序列的轻链可变区；或者

(d)具有SEQ ID NO:18的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:59的多肽序列的轻链可变区。

实施方案6a是根据实施方案6所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:13的多肽序列的轻链可变区。

实施方案4b是根据实施方案4所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:18的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:19的多肽序列的轻链可变区。

实施方案4c是根据实施方案4所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:23的多肽序列的轻链可变区。

实施方案4d是根据实施方案4所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:18的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:59的多肽序列的轻链可变区。

实施方案5是根据实施方案1至4中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:15或20的多肽序列的第一重链；

(b)各自独立地具有SEQ ID NO:16、21、24或60的多肽序列的两条轻链；以及

(c)具有SEQ ID NO:17或22的多肽序列的第二重链。

实施方案5a是根据实施方案5所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:15的多肽序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:16的多肽序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的多肽序列的第二重链。

实施方案5b是根据实施方案5所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:20的多肽序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:21的多肽序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的多肽序列的第二重链。

实施方案5c是根据实施方案5所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:15的多肽序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:24的多肽序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的多肽序列的第二重链。

实施方案5d是根据实施方案5所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:20的多肽序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:60的多肽序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的多肽序列的第二重链。

实施方案5e是根据实施方案1至4中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:61或62的多肽序列的重链；以及

(b)具有SEQ ID NO:16或24、或者21或60的多肽序列的轻链。

实施方案5f是根据实施方案5e所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:61的多肽序列的重链，以及具有SEQ ID NO:16或24的多肽序列的轻链。

实施方案5g是根据实施方案5e所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:62的多肽序列的重链，以及具有SEQ ID NO:21或60的多肽序列的轻链。

实施方案6是一种缀合物，所述缀合物包含与抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段偶联的根据实施方案1至5g中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段。

实施方案7是根据实施方案6所述的缀合物，其中所述抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段分别与CD98、优选地人CD98hc或者TfR、优选地人TfR1结合，其中在中性pH下解离常数K_D为至少1nM、优选地1nM至500nM，并且在酸性pH、优选地pH5下离解速率常数k_d为至少10^-4sec^-1、优选地10^-4sec^-1至10^-1sec^-1。

实施方案8是根据实施方案6或7所述的缀合物，其中所述抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段在中性pH下的离解速率常数k_d为2×10^-2sec^-1至2×10^-4sec^-1、优选地8×10^{- 3}sec^-1。

实施方案9是根据实施方案6至8中任一项所述的缀合物，其中所述抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段包含：包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：

(a)所述抗CD98抗体或其抗原结合片段的所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:26、27、28或33、29、30和31的氨基酸序列；或者

(b)所述抗TfR抗体或其抗原结合片段的所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:35、36、37、38、39和401的氨基酸序列。

实施方案9a是根据实施方案9所述的缀合物，其中所述抗CD98抗体或其抗原结合片段包含：包含分别具有SEQ ID NO:26、27和28的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及包含分别具有SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区。

实施方案9b是根据实施方案9所述的缀合物，其中所述抗CD98抗体或其抗原结合片段包含：包含分别具有SEQ ID NO:26、27和33的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及包含分别具有SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区。

实施方案9c是根据实施方案9所述的缀合物，其中所述抗TfR抗体或其抗原结合片段包含：包含分别具有SEQ ID NO:36、36和37的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及包含分别具有SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区。

实施方案10是根据实施方案6至9c中任一项所述的缀合物，其中所述抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段为单链可变片段(scFv)，所述scFv包含经由接头与轻链可变区共价连接的重链可变区，优选地，所述接头具有SEQ ID NO:50或51的氨基酸序列，更优选地，所述scFv包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列。

实施方案10a是根据实施方案10所述的缀合物，其中所述抗CD98抗体或其抗原结合片段为scFv，所述scFv包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列。

实施方案10b是根据实施方案10所述的缀合物，其中所述抗CD98抗体或其抗原结合片段为scFv，所述scFv包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列。

实施方案10c是根据实施方案10所述的缀合物，其中所述抗TfR抗体或其抗原结合片段为scFv，所述scFv包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列。

实施方案10d是根据实施方案10所述的缀合物，其中所述抗TfR抗体或其抗原结合片段为scFv，所述scFv包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列。

实施方案11是一种包含根据实施方案6至10中任一项所述的缀合物的融合构建体，其中所述抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段经由接头与所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段的两条重链中的仅一条重链的羧基末端共价连接，优选地其中所述接头具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列。

实施方案12是根据实施方案11所述的融合构建体，其中与野生型CH3结构域多肽相比，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段的所述两条重链中的每条重链包含一个或多个异源二聚体突变诸如修饰的异源二聚体CH3结构域，或者一个或多个杵臼结构突变。

实施方案13是根据实施方案12所述的融合构建体，其中所述第一重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域包含在位置T350、L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，并且所述第二重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域包含在位置T350、T366、K392和T394处的氨基酸修饰，其中在位置T350处的所述氨基酸修饰为T350V、T350I、T350L或T350M；在位置L351处的所述氨基酸修饰为L351Y；在位置F405处的所述氨基酸修饰为F405A、F405V、F405T或F405S；在位置Y407处的所述氨基酸修饰为Y407V、Y407A或Y407I；在位置T366处的所述氨基酸修饰为T366L、T366I、T366V或T366M，在位置K392处的所述氨基酸修饰为K392F、K392L或K392M，并且在位置T394处的所述氨基酸修饰为T394W，并且其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。

实施方案13a是根据实施方案13所述的融合构建体，其中所述第一重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T350V、L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T350V、T366L、K392L和T394W。

实施方案14是根据实施方案12所述的融合构建体，其中所述第一重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T366W，并且所述第二重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T366S、L368A和Y407V。

实施方案14a是根据实施方案14所述的融合构建体，其中所述第二重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域还包含突变H435R和Y436F。

实施方案15是根据实施方案11至14a中任一项所述的融合构建体，其中所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段在Fc结构域中包含一个或多个突变，所述一个或多个突变增强融合体与新生Fc受体(RcRn)的结合，优选地所述一个或多个突变增强在酸性pH下的所述结合，更优选地所述Fc具有M252Y/S254T/T256E(YTE)突变，其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。

实施方案16是根据实施方案11至15中任一项所述的融合构建体，其中所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段在Fc结构域中包含减少或消除效应子功能的一个或多个突变，优选地所述Fc在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329处具有一个或多个氨基酸修饰，诸如L234A、L235A和P331S中的一个、两个或三个突变，其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。

实施方案17是一种融合构建体，所述融合构建体包含：

(a)第一重链，所述第一重链与选自由SEQ ID NO:42至49组成的组的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性；

(b)两条轻链，所述两条轻链各自独立地与选自由SEQ ID NO:16、21、24和60组成的组的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性；以及

(c)第二重链，所述第二重链与选自由SEQ ID NO:17和22组成的组的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性。

实施方案17a是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17b是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17c是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17d是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17e是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17f是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17g是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17h是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17i是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17j是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17k是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17l是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17m是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17n是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17o是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。

实施方案17p是根据实施方案17所述的融合构建体，所述融合构建体包含：具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的第一重链、各自具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的两条轻链，以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二重链。

实施方案18是一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据实施方案1至5g中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段、根据实施方案6至10d中任一项所述的缀合物或根据实施方案11至17p中任一项所述的融合构建体。

实施方案19是一种载体，所述载体包含根据实施方案18所述的分离的核酸。

实施方案20是一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案18所述的分离的核酸或根据实施方案19所述的载体。

实施方案21是一种产生根据实施方案1至5g中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、根据实施方案6至10中任一项所述的缀合物或根据实施方案11至17p中任一项所述的融合构建体的方法，所述方法包括：在用于产生所述人源化抗体或其抗原结合片段、所述缀合物或所述融合构建体的条件下培养包含编码所述人源化抗体或其抗原结合片段、所述缀合物或所述融合构建体的核酸的细胞，以及从所述细胞或细胞培养物中回收所述人源化抗体或其抗原结合片段、所述缀合物或所述融合构建体。

实施方案22是一种药物组合物，所述药物组合物包含：根据实施方案1至5g中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段、根据实施方案6至10d中任一项所述的缀合物或根据实施方案11至17p中任一项所述的融合构建体以及药学上可接受的载剂。

实施方案23是一种阻断对其有需要的受试者中的tau接种的方法，所述方法包括：向所述受试者施用根据实施方案22所述的药物组合物。

实施方案24是一种在对其有需要的受试者中诱导抗体依赖性吞噬作用(ADP)而不刺激促炎细胞因子的分泌的方法，所述方法包括：向所述受试者施用根据实施方案22所述的药物组合物。

实施方案25是一种治疗对其有需要的受试者中的tau蛋白病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用根据实施方案22所述的药物组合物。

实施方案26是一种减少对其有需要的受试者中的病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法，所述方法包括：向所述受试者施用根据实施方案22所述的药物组合物。

实施方案27是根据实施方案25或26所述的方法，其中所述tau蛋白病选自由以下项组成的组：家族性阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病、与17号染色体相关的额颞痴呆及帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合征、格-施-沙氏病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、非关岛运动神经元病伴神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、慢性创伤性脑病以及拳击员痴呆症(拳击疾病)。

实施方案28是根据实施方案23至27中任一项所述的方法，其中所述药物组合物静脉内施用。

实施方案29是根据实施方案23至28中任一项所述的方法，其中所述药物组合物被递送穿过所述受试者的血脑屏障(BBB)。

实施方案30是根据实施方案23至29中任一项所述的方法，其中所述施用减少了Fc介导的效应子功能并且/或者不诱导快速网织红细胞耗尽。

实施方案31是一种在来自受试者的生物样品中检测PHF-tau的存在的方法，所述方法包括：使所述生物样品与根据实施方案1至5g中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段接触，以及检测所述人源化抗体或其抗原结合片段与来自所述受试者的所述样品中的PHF-tau的结合。

实施方案32是根据实施方案31所述的方法，其中所述生物样品为血液、血清、血浆、间质液或脑脊髓液样品。

实施方案33是一种产生包含根据实施方案1至5g中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，所述方法包括：将所述人源化抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载剂组合以获得所述药物组合物。

实施方案34是根据实施方案1至5g中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段或根据实施方案22所述的药物组合物，所述人源化抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物用于治疗对其有需要的受试者中的tau蛋白病。

实施方案35是根据实施方案34所述的用途，其中所述tau蛋白病选自由以下项组成的组：家族性阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病、与17号染色体相关的额颞痴呆及帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合征、格-施-沙氏病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、非关岛运动神经元病伴神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、慢性创伤性脑病以及拳击员痴呆症(拳击疾病)。

实施方案36是根据实施方案1至5g中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段、根据实施方案6至10d中任一项所述的缀合物或根据实施方案11至17p中任一项所述的融合构建体用于制备用于治疗对其有需要的受试者中的tau蛋白病的药物的用途。

实施例

本专利申请的以下实施例旨在进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本专利申请，并且本专利申请的范围由所附权利要求书确定。

实施例1–抗体生成、表达和纯化

抗Tau鼠mAb PT/66：PT1B1142的人源化

PT/66(PT1B585)的轻链(LC)和重链(HC)的V区以Fab形式人源化。简而言之，来自PT/66的V_L CDR(AbM定义)被接枝到人IGKV2-24*01种系上，并且两个位置F41L和S28P(根据Kabat编号系统)被鉴定为人到小鼠回复突变。来自PT/66的V_H CDR被接枝到人IGHV1-18*01种系上，并且一个位置A40R被鉴定为人到小鼠回复突变。另外，将V_L和V_H CDR接枝到没有人到小鼠回复突变的上述人种系上(PT1B995)。含有所有三种突变的一种Fab变体为PT1B1142，并且其全人IgG型式为PT1B1153。对PT1B1153的轻链中的第2框架区进行修饰以获得另一人源化抗体PT1B1183。与全长重组Tau蛋白结合的PT1B1183的SPR传感图在图4中示出。

人源化PT/66 Fab变体PT1B1142与重组Tau的结合

人源化PT/66变体在大肠杆菌(E.coli)中表达，并且随后针对与重组全长Tau蛋白的结合和热稳定性进行筛选。简而言之，将Fab编码序列克隆到vDR001246载体(加利福尼亚州圣地亚哥抗体设计实验室(Antibody Design Labs))中，该载体具有分别用于重链和轻链的分泌的PelB和OmpA前导序列。用质粒转化大肠杆菌(E.coli)细胞(MC1061菌株)，并且使其在补充有100μg/mL羧苄青霉素的2xYT微生物生长培养基中在37℃下生长过夜。过夜培养物用于接种0.5mL表达培养物，并且在37℃下生长直至OD600为约2.0。通过加入1mMIPTG来诱导蛋白质表达，并且使培养物在30℃下生长过夜。在表达之后，通过以3,500×g离心10min来使细胞沉淀，并且收集上清液并在ELISA测定法中进行直接测试。对于ELISA，将生物素酰化全长Tau蛋白经2倍稀释以0.039μg/mL至2.5μg/mL的浓度范围固定在板上，之后在室温下温育45min。用补充有3％乳液的1x PBS-Tween封闭板。用1x PBS-Tween洗涤板。将上清液添加到每个板中，并在室温下温育45min。使用经1:5,000稀释的GoatAnitFab'2-辣根过氧化物酶以50uL/孔来检测结合的Fab，并且随后用化学发光底物(Sigma目录号11582950001)检测。所有测试的来源于PT/66的Fab分子结合全长Tau蛋白。PT1B1142与PT/66和PT1B995进行比较的结合曲线在图1中示出。

测定人源化Fab变体的热稳定性

在热处理ELISA测定法中测定人源化PT/66变体的热稳定性。如上所述进行表达和ELISA测定法(结合)。然而，将每种变体的表达上清液分成四(4)个等分试样。将一个等分试样保持在室温下，并且将另外三个等分试样分别加热至60℃、65℃和70℃并随后冷却至室温。获得所有四个样品的ELISA结合信号(一式三份)。在升高的温度下的结合信号(表达为相对于室温信号的比率)表示变体的热稳定性(表1和图2)。

表1.在升高的温度下的结合信号(表达为相对于室温信号的比率)表示变体的热稳定性。

抗Tau鼠mAb PT/66：PT1B635和PT1B901的人源化

在独立的尝试中，使用不同的受体人框架将PT/66人源化。简而言之，将来自PT/66的V_L CDR移植到人IGKV2D-40*01种系上，并且将V_H CDR移植到人IGHV1-18*01种系上。在轻链中没有回复突变。然而，V_L中的两个位置M70L和T72V(Kabat编号系统)被鉴定为人到小鼠回复突变。人源化变体被命名为PT1B635。此外，来自PT/66的LC含有DG(CDR1中的第43至44位)基序，该基序存在异构化的风险。该风险通过制备含有突变G44L的变体来减轻。该变体为PT1B901。通过SPR来针对与重组tau蛋白的结合对PT1B635和PT1B901进行测试。

抗体表达和纯化

通过用编码PT1B635和PT1B901的经纯化的质粒DNA进行瞬时转染，研究级材料以小规模(2mL)在ExpiCHO细胞中表达。在收获培养物上清液之前将转染的细胞在37℃下温育七天。将收获的上清液通过离心澄清并且之后进行过滤。使用MabSelectSuRe蛋白-A亲和力色谱法来纯化细胞培养物上清液，并且将含有单体蛋白(在Tris-乙酸盐缓冲液中)的最终洗脱液透析到dPBS 7.2中。通过在NanoDrop分光光度计上在280nm处的吸光度来测定经纯化的蛋白质的浓度，并且通过分析型SE-HPLC来评估质量。终产物的纯度>98％并且用于后续研究。表达并纯化以下人源化抗体。

表1a.人源化抗Tau抗体及其序列。

实施例2-通过SPR进行对抗tau抗体与重组tau的结合表征

使用Biacore T200，在25℃下用补充有3mM EDTA和0.05％Tween 20的HBSpH 7.4缓冲液通过SPR来研究抗tau抗体与人全长重组tau(2N4R)的相互作用。简而言之，使用制造商针对胺偶联化学的说明(>4000个响应单位(RU))，通过将抗小鼠/抗人IgG Fcγ片段特异性抗体的混合物与CM4传感器芯片的表面偶联来制备生物传感器表面。偶联缓冲剂是10mM乙酸钠(pH 4.5)。将抗tau抗体在运行缓冲液中稀释并注射，以获得实现对抗原结合的检测的足够的捕集。在抗tau mAb的捕集之后注射重组表达tau溶液(以5倍稀释，范围为0.12nM至75nM)。以50μL/min流速分别监测缔合和解离3分钟和60min。用0.85％H₃PO₄来执行传感器表面的再生。使用1:1朗格缪尔结合模型来拟合结合传感图，以获得缔合速率、离解速率和亲和力。PT1B635和PT1B901以与亲本mAb PT/66或PT1B545类似的紧密亲和力来与全长tau蛋白结合(下文图3和表2)。

表2.人源化PT66抗体与重组Tau的SPR结合动力学和亲和力

k_离解基于1小时极限*或2小时极限**并且假设5％解离。对应的亲和力被报告为“比...更紧密”。

实施例3-通过免疫耗尽进行功能测试

为了研究最大百分比抑制值是否与AD tau种子上的表位的密度相关或与含有PT/66表位的种子的数量相关，将在免疫耗尽测定法中针对对tau接种的抑制来对PT/66的人源化变体进行测试。在该测定法中，小鼠亲本PT/66抗体已显示耗尽tau种子的>90％(参见US63/166,439，其全文内容以引用方式并入本文)。可由22至23周龄P301S转基因动物的脊髓或由冷冻保存的人AD脑组织生成用于免疫耗尽的含有tau种子的匀浆。将通过与细胞接种测定法非常相关的hTau60/hTau60和/或PT/66/PT/66自夹心MSD测定法来进行对免疫耗尽样品的生物化学分析(参见例如US 63/166,439)。后一种测定法利用表达两种发色团标记的K18 tau片段的HEK细胞，该细胞在由于聚集而靠近时生成信号。当细胞用源自不同来源的聚集和磷酸化完整大小tau的种子进行处理时，诱导K18聚集体，该聚集体可通过使用荧光活化细胞分选(FACS)对荧光共振能量转移(FRET)阳性细胞计数来进行定量(Holmes等人,2014,PNAS.111(41):E4376-85)。

AD tau种子将与测试抗体一起温育并且用蛋白G珠从溶液中移除。将使用PT/66/PT/66自夹心MSD测定法来针对残余tau种子对耗尽的上清液进行测试。这将证实PT/66的人源化型式在耗尽AD tau种子方面是否与亲本PT/66mAb一样有效。

实施例4–融合构建体

融合构建体设计

开发了含有针对CD98hc或huTfR的抗体的抗原结合片段(scFv)与人源化抗PHF-tau抗体(Tau Ab)的融合体的融合构建体，以使Tau Ab能够穿透BBB，导致与仅TauAb相比基本上更高的脑浓度。

例如，含有人源化TauAb和CD98hc或huTfR结合scFv的融合构建体使用短的柔性接头附加到人源化Tau的一条抗体重链的C末端。针对先前已被描述为增强转胞吞作用的特征来分析融合构建体(综述于：Goulatis和Shusta 2017中)：化合价、结合亲和力、pH依赖性结合以及在脑内皮细胞中的快速内化。

使用以下形式将针对CD98hc或huTfR的抗体的重链可变序列和轻链可变序列融合在单个基因构建体中作为单链可变片段(scFv)：

Hc_GGGSGGSGGCPPCGGSGG(SEQ ID NO:50)_Lc

或Hc_GTEGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:51_Lc

然后使用GGAGGA(SEQ ID NO:52)接头将针对CD98hc或huTfR的scFv与人源化TauAb的一条重链(Hc)的C末端融合。CH3中的杵臼结构异源二聚化突变用于抗体Hc(Hc A杵：T366W；Hc B臼：T366S_L368A_Y407V)中以生成融合构建体。此外，CH3中的RF双突变(H435R_Y436F)用于HcB上，以破坏蛋白A结合并且在纯化期间去除臼-臼同源二聚体。融合构建体包含：带有相同氨基酸序列的两条轻链以及带有不同氨基酸序列的两条重链。两条重链中的仅一条重链与CD98或TfR抗体的scFv融合，并且两条重链在它们的恒定区方面也有所不同，以便于两条重链之间的异源二聚化。因此，根据本专利申请的实施方案的每个融合构建体与三个氨基酸序列相关联：与CD98或TfR抗体的抗原结合片段融合的第一重链的氨基酸序列、轻链的氨基酸序列、以及未与CD98或TfR抗体的抗原结合片段融合的第二重链的氨基酸序列。

融合表达、纯化和表征

融合构建体在CHO-Expi细胞中表达，并且使用蛋白A亲和力色谱法进行纯化，之后进行尺寸排阻色谱法或离子交换色谱法。

制备的融合构建体的示例在表3中提供：

表3.Tau-BBB分子

使用与上文实施例2和3中所述的那些方法类似的方法来针对融合构建体对结合特征和通过免疫耗尽进行的功能测试进行确定。

内化

将人脑内皮细胞(hCMECD3)以10,000个细胞/孔接种在胶原包被的384孔CellCarrier Ultra板(Perkin Elmer)中，并且使其在37℃下在潮湿的培养箱中附着16小时。然后将细胞(50,000个细胞)与200ug/mL经纯化的融合构建体一起温育，并且使其在37℃下温育一小时。将细胞固定、洗涤并且用荧光标记的二抗温育一小时。然后再次洗涤细胞，并且与荧光标记的肌动蛋白染色剂鬼笔环肽和核染色剂Hoeschst 33342一起温育。再次洗涤细胞，并且使用带有40x物镜的ImageXpress Micro(Molecular Devices)进行成像。使用MetaXpress 6.0在与鬼笔环肽共定位的基础上鉴定内化构建体。

为了评估融合构建体促进小神经胶质细胞中的Tau聚集体的摄入的潜力，将来源于诱导的多能干细胞(iPSC)的人小神经胶质细胞以每板7000个细胞的稀释度接种到384孔PerkinElmerCell Carrier Ultra板上，并且保持在带有Glutamax+、青霉素/链霉素、IL34(100ng/ml)和GMCSF(10ng/ml)的高级DMEM/F12培养基中。在测定当天，使生物素酰化的tau低聚物与15倍摩尔过量的链霉亲和素Alexa Flour 488(AF488)复合。然后使标记的tau低聚物在室温下结合约2X摩尔过量的测试构建体30分钟。然后将Ab:tau低聚物复合物以20μl/孔递送至小神经胶质细胞。在温育后2小时、4小时和8小时时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，并且在4％多聚甲醛的存在下在室温下固定15分钟。在固定后，将细胞再一次在PBS中洗涤两次，并且与LAMP1一抗(针对溶酶体的标志物)在透化缓冲液(0.1％皂草苷+1％鱼皮明胶)中以4μg/ml的浓度在4℃下温育过夜。温育后，将细胞用PBS洗涤两次，并且用1μg/ml与Alexa flour 647缀合的二抗在透化缓冲液中在4℃下染色1小时。温育后，将细胞用PBS洗涤两次，用1μg/ml的Hoechst DNA染色剂在PBS中在室温下复染10分钟。然后将细胞在PBS中最后洗涤一次，重悬于每孔20μl的PBS中，并且在Opera Phenix共焦高含量显微镜上进行成像。使用Harmony和ImageJ分析软件来分析获取的图像。针对用LAMP1抗体标记的吞噬溶酶体结构内的Tau低聚物的存在，对每个条件约500个细胞进行评分。针对到吞噬体中的摄入将融合构建体与Tau Ab进行比较。

尽管本发明的实施方案已结合其具体实施方案进行了详细描述，但对于本领域的普通技术人员来说将显而易见的是，可在不脱离本发明的实质和范围的情况下进行各种变化和修改。

序列

PHF-tau表位SEQ ID NO:1

SPQLATLADEVSASLAK

抗PHF-Tau抗体

CDR带下划线

PT/66抗PHF-Tau单克隆Ab

PT1B545 VH SEQ ID NO:2

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWITWVKQRPGQGLEWIGDIHPGRGSTKSNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCARRWGFDYWGQGTTLTVSS

PT1B545 VL SEQ ID NO:3

DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGAGTKLELK

PT1B545 HCDR1 SEQ ID NO:4

GYTFTSYWIT

PT1B545 HCDR2 SEQ ID NO:5

DIHPGRGSTK

PT1B545 HCDR3 SEQ ID NO:6

RWGFDY

PT1B545 LCDR1 SEQ ID NO:7

RSSKSLLYKDGKTYLN

PT1B545 LCDR2 SEQ ID NO:8

LMSTRAS

PT1B545 LCDR3 SEQ ID NO:9

QQLVDYPLT

PT1B545 HC SEQ ID NO:10

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWITWVKQRPGQGLEWIGDIHPGRGSTKSNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCARRWGFDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

PT1B545 LC SEQ ID NO:11

DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

PT1B901人源化Ab

PT1B901 VH SEQ ID NO:12

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSS

PT1B901 VL SEQ ID NO:13

DIVITQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYKDLKTYLNWFLQKPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGQGTKLEIK

PT1B901 HCDR1 SEQ ID NO:4

GYTFTSYWIT

PT1B901 HCDR2 SEQ ID NO:5

DIHPGRGSTK

PT1B901 HCDR3 SEQ ID NO:6

RWGFDY

PT1B901 LCDR1 SEQ ID NO:14

RSSKSLLYKDLKTYLN

PT1B901 LCDR2 SEQ ID NO:8

LMSTRAS

PT1B901 LCDR3 SEQ ID NO:9

QQLVDYPLT

PT1B901 HC1 SEQ ID NO:15

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

PT1B901 LC1/2 SEQ ID NO:16

DIVITQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYKDLKTYLNWFLQKPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

PT1B901 HC2 SEQ ID NO:17

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

PT1B901 HC SEQ ID NO:61

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

PT1B1153人源化Ab

PT1B1153 VH SEQ ID NO:18

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQRPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSS

PT1B1153 VL SEQ ID NO:19

DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWLQQRPGQPPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGQGTKLEIK

PT1B1153 HCDR1 SEQ ID NO:4

GYTFTSYWIT

PT1B1153 HCDR2 SEQ ID NO:5

DIHPGRGSTK

PT1B1153 HCDR3 SEQ ID NO:6

RWGFDY

PT1B1153 LCDR1 SEQ ID NO:7

RSSKSLLYKDGKTYLN

PT1B1153 LCDR2 SEQ ID NO:8

LMSTRAS

PT1B1153 LCDR3 SEQ ID NO:9

QQLVDYPLT

PT1B1153 HC1 SEQ ID NO:20

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQRPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

PT1B1153 LC1/2SEQ ID NO:21

DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWLQQRPGQPPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

PT1B1153 HC2 SEQ ID NO:22

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQRPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

PT1B1153 HC SEQ ID NO:62

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQRPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

PT1B635人源化Ab

PT1B635 VH SEQ ID NO:12

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSS

PT1B635 VL SEQ ID NO:23

DIVITQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQKPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGQGTKLEIK

PT1B635 HCDR1 SEQ ID NO:4

GYTFTSYWIT

PT1B635 HCDR2 SEQ ID NO:5

DIHPGRGSTK

PT1B635 HCDR3 SEQ ID NO:6

RWGFDY

PT1B635 LCDR1 SEQ ID NO:7

RSSKSLLYKDGKTYLN

PT1B635 LCDR2 SEQ ID NO:8

LMSTRAS

PT1B635 LCDR3 SEQ ID NO:9

QQLVDYPLT

PT1B635 HC1 SEQ ID NO:15

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

PT1B635 LC1/2SEQ ID NO:24

DIVITQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQKPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

PT1B635 HC2 SEQ ID NO:17

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

PT1B635 HC SEQ ID NO:61

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗CD98和抗TfR scFv序列

CDR带下划线；scFv接头为斜体

C98B72(抗CD98hc scFv)SEQ ID NO:25

>TPP000231088|C98B72|成熟_scFv|C98B72(抗CD98hc)scFv-HL[16-aa修饰的Bird接头]

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSNKHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAPSSFYFDYWGQGTLVTVSSGTEGKSSGSGSESKSTDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPPTFGQGTKVVIK

C98B72 HCDR1 SEQ ID NO:26

GFTFSSYGMH

C98B72 HCDR2 SEQ ID NO:27

IISYDGSNKH

C98B72 HCDR3 SEQ ID NO:28

APSSFYFDY

C98B72 LCDR1 SEQ ID NO:29

KSSQSVLFSSNNKNYLA

C98B72 LCDR2 SEQ ID NO:30

WASTRES

C98B72 LCDR3 SEQ ID NO:31

QQYYSTPPT

C98B73(抗CD98hc scFv)SEQ ID NO:32

>TPP000231089|C98B73|成熟_scFv|C98B73(抗CD98hc)scFv-HL[16-aa修饰的Bird接头]

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSNKHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAPSHFYFDYWGQGTLVTVSSGTEGKSSGSGSESKSTDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPPTFGQGTKVVIK

C98B73 HCDR1 SEQ ID NO:26

GFTFSSYGMH

C98B73 HCDR2 SEQ ID NO:27

IISYDGSNKH

C98B73 HCDR3 SEQ ID NO:33

APSHFYFDY

C98B73 LCDR1 SEQ ID NO:29

KSSQSVLFSSNNKNYLA

C98B73 LCDR2 SEQ ID NO:30

WASTRES

C98B73 LCDR3 SEQ ID NO:31

QQYYSTPPT

TFRB321(抗TfR scFv)SEQ ID NO:34

>TPP000231087|TFRB321|成熟_scFv|TFRB321(抗TfR)spFv-HL[经缝合的接头]

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCADSGFTFSSYAMNWVRQAPGCGLEWVSGISGSGGHTYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYDSSGYNPFDYWGQGTQVTVSSGGGSGGSGGCPPCGGSGGSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGCGTKLTVL

TFRB321 HCDR1 SEQ ID NO:35

GFTFSSYAMN

TFRB321 HCDR2 SEQ ID NO:36

GISGSGGHTY

TFRB321 HCDR3 SEQ ID NO:37

EGYDSSGYNPFDY

TFRB321 LCDR1 SEQ ID NO:38

SGDKLGDKYAS

TFRB321 LCDR2 SEQ ID NO:39

QDSKRPS

TFRB321 LCDR3 SEQ ID NO:40

QAWDSSTVV

TFRB320(抗TfR scFv)SEQ ID NO:41

>TPP000231086|TFRB320|成熟_scFv|TFRB320(抗TfR)scFv-HL[16-aa修饰的Bird接头]

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCADSGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGHTYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYDSSGYNPFDYWGQGTQVTVSSGTEGKSSGSGSESKSTSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL

TFRB320 HCDR1 SEQ ID NO:35

GFTFSSYAMN

TFRB320 HCDR2 SEQ ID NO:36

GISGSGGHTY

TFRB320 HCDR3 SEQ ID NO:37

EGYDSSGYNPFDY

TFRB320 LCDR1 SEQ ID NO:38

SGDKLGDKYAS

TFRB320 LCDR2 SEQ ID NO:39

QDSKRPS

TFRB320 LCDR3 SEQ ID NO:40

QAWDSSTVV

抗Tau-BBB缀合物

ScFV带下划线；Hc_scFv拴系接头为斜体

BBBB1910

>BBBB1910|重_链_1|SEQ ID NO:43

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQRPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGAGGAEVQ LLESGGGLVQPGGSLRLSCADSGFTFSSYAMNWVRQAPGCGLEWVSGISGSGGHTYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAREGYDSSGYNPFDYWGQGTQVTVSSGGGSGGSGGCPPCGGSGGSYELTQPPSVSVSPGQT ASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSST VVFGCGTKLTVL

>BBBB1910|轻_链_1/2|SEQ ID NO:60

DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

>BBBB1910|重_链_2|SEQ ID NO:22

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQRPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

BBBB1909

>BBBB1909|重_链_1|SEQ ID NO:45

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQRPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGAGGAEVQ LLESGGGLVQPGGSLRLSCADSGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGHTYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAREGYDSSGYNPFDYWGQGTQVTVSSGTEGKSSGSGSESKSTSYELTQPPSVSVSPGQTAS ITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVV FGGGTKLTVL

>BBBB1909|轻_链_1/2|SEQ ID NO:60

DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

>BBBB1909|重_链_2|SEQ ID NO:22

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQRPGQGLEWMGDIHPGRGSTKYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

BBBB1626

>BBBB1626|重_链_1|SEQ ID NO:42

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BBBB1506

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BBBB1505

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BBBB1503

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>PT1B1183 VH SEQ ID NO:18

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>PT1B1183 VL SEQ ID NO:59

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>PT1B1183 HCDR1 SEQ ID NO:4

GYTFTSYWIT

>PT1B1183 HCDR2 SEQ ID NO:5

DIHPGRGSTK

>PT1B1183 HCDR3 SEQ ID NO:6

RWGFDY

>PT1B1183 LCDR1 SEQ ID NO:7

RSSKSLLYKDGKTYLN

>PT1B1183 LCDR2 SEQ ID NO:8

LMSTRAS

>PT1B1183 LCDR3 SEQ ID NO:9

QQLVDYPLT

>PT1B1183 HC1 SEQ ID NO:20

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>PT1B1183 LC SEQ ID NO:60

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>PT1B1183 HC2 SEQ ID NO:22

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>PT1B1183 HC SEQ ID NO:62

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<110> Janssen Biotech, Inc.

<120> 针对成对螺旋细丝tau的人源化抗体及其用途

<130> 065768.11772/98US2

<160> 62

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Lys

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B545 VH

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Arg Gly Ser Thr Lys Ser Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B545 VL

<400> 3

Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Leu Ser Asn Pro Val Thr Ser Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu

85 90 95

Val Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B545 HCDR1

<400> 4

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Thr

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<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B545 HCDR2

<400> 5

Asp Ile His Pro Gly Arg Gly Ser Thr Lys

1 5 10

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B545 HCDR3

<400> 6

Arg Trp Gly Phe Asp Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B545 LCDR1

<400> 7

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B545 LCDR2

<400> 8

Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B545 LCDR3

<400> 9

Gln Gln Leu Val Asp Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B545 HC

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Asp Ile His Pro Gly Arg Gly Ser Thr Lys Ser Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro

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Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser

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Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu

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Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser

180 185 190

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Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile

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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln

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Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

275 280 285

Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu

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Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys

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Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys

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Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro

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Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr

355 360 365

Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys

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Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

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Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val

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<210> 11

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B545 LC

<400> 11

Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Leu Ser Asn Pro Val Thr Ser Gly

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Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu

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Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

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Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B901 VH

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Asp Ile His Pro Gly Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Leu

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Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B901 VL

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Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

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Asp Leu Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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<212> PRT

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<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B901 HC1

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Asp Ile His Pro Gly Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Leu

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Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Arg Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

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65 70 75 80

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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65 70 75 80

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100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

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Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn

195 200 205

Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val Phe Gly Cys Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Thr Val Leu

245

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<400> 56

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<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 57

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

210 215 220

Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys

225 230 235 240

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val

245 250 255

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

275 280 285

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

305 310 315 320

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

325 330 335

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

340 345 350

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

355 360 365

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

370 375 380

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

385 390 395 400

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

405 410 415

Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

420 425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

435 440

<210> 58

<211> 441

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 58

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

210 215 220

Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys

225 230 235 240

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val

245 250 255

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

275 280 285

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

305 310 315 320

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

325 330 335

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

340 345 350

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

355 360 365

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

370 375 380

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

385 390 395 400

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

405 410 415

Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

420 425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

435 440

<210> 59

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B1183 VL

<400> 59

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu

85 90 95

Val Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 60

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B1183 LC

<400> 60

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu

85 90 95

Val Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 61

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PR1B901 & PT1B635 HC

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 62

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PT1B1153 & PT1B1183 HC

<400> 62

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

Claims (33)

1.一种分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段在由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或所述氨基酸序列内的tau蛋白的表位处与所述tau蛋白结合，其中所述抗体或其抗原结合片段结合成对螺旋细丝(PHF)-tau、优选地人PHF-tau，其中所述tau蛋白的所述表位包含所述tau蛋白的磷酸化T427、磷酸化S433和磷酸化S435中的一者或多者，但不包含磷酸化T427、磷酸化S433和磷酸化S435中的全部。

2.根据权利要求1所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：分别具有SEQ ID NO:4、5和6的多肽序列的免疫球蛋白重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别具有SEQ ID NO:7或14、8和9的多肽序列的免疫球蛋白轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有与SEQ ID NO:12或18有至少90％同一性的多肽序列的重链可变区，或者具有与SEQ ID NO:13、19、23或59有至少90％同一性的多肽序列的轻链可变区。

3.根据权利要求2所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:12或18的多肽序列的重链可变区，以及具有SEQID NO:13、19、23或59的多肽序列的轻链可变区。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变区以及具有SEQ ID NO:13的多肽序列的轻链可变区；

(b)具有SEQ ID NO:18的多肽序列的重链可变区以及具有SEQ ID NO:19的多肽序列的轻链可变区；

(c)具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变区以及具有SEQ ID NO:23的多肽序列的轻链可变区；或者

(d)具有SEQ ID NO:18的多肽序列的重链可变区以及具有SEQ ID NO:59的多肽序列的轻链可变区。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:15或20的多肽序列的第一重链；

(b)各自独立地具有SEQ ID NO:16、21、24或60的多肽序列的两条轻链；以及

(c)具有SEQ ID NO:17或22的多肽序列的第二重链。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:61或62的多肽序列的重链；以及

(b)具有分别为SEQ ID NO:16或24、或者21或60的多肽序列的轻链。

7.一种缀合物，所述缀合物包含与抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段偶联的根据权利要求1至6中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段。

8.根据权利要求7所述的缀合物，其中所述抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段分别与CD98、优选地人CD98hc或者TfR、优选地人TfR1结合，其中在中性pH下解离常数K_D为至少1nM、优选地1nM至500nM，并且在酸性pH、优选地pH 5下离解速率常数k_d为至少10^-4sec^-1、优选地10^-4至10^-1sec^-1。

9.根据权利要求7或8所述的缀合物，其中所述抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段在中性pH下的离解速率常数k_d为2×10^-2至2×10^-4sec^-1、优选地8×10^-3sec^-1。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的缀合物，其中所述抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段包含：包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区以及包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：

(a)所述抗CD98抗体或其抗原结合片段的所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:26、27、28或33、29、30和31的氨基酸序列；或者

(b)所述抗TfR抗体或其抗原结合片段的所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:35、36、37、38、39和40的氨基酸序列。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的缀合物，其中所述抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段为单链可变片段(scFv)，所述scFv包含经由接头与轻链可变区共价连接的重链可变区，优选地，所述接头具有SEQ ID NO:55或56的氨基酸序列，更优选地，所述scFv包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列。

12.一种包含根据权利要求7至11中任一项所述的缀合物的融合构建体，其中所述抗CD98或抗TfR抗体或其抗原结合片段经由接头与所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段的两条重链中的仅一条重链的羧基末端共价连接，优选地其中所述接头具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列。

13.根据权利要求12所述的融合构建体，其中与野生型CH3结构域多肽相比，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段的所述两条重链中的每条重链包含一个或多个异源二聚体突变诸如修饰的异源二聚体CH3结构域，或者一个或多个杵臼结构突变。

14.根据权利要求13所述的融合构建体，其中所述第一重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域包含在位置T350、L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，并且所述第二重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域包含在位置T350、T366、K392和T394处的氨基酸修饰，其中在位置T350处的所述氨基酸修饰为T350V、T350I、T350L或T350M；在位置L351处的所述氨基酸修饰为L351Y；在位置F405处的所述氨基酸修饰为F405A、F405V、F405T或F405S；在位置Y407处的所述氨基酸修饰为Y407V、Y407A或Y407I；在位置T366处的所述氨基酸修饰为T366L、T366I、T366V或T366M，在位置K392处的所述氨基酸修饰为K392F、K392L或K392M，并且在位置T394处的所述氨基酸修饰为T394W，并且其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。

15.根据权利要求13所述的融合构建体，其中所述第一重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T366W，并且所述第二重链的所述修饰的异源二聚体CH3结构域包含突变T366S、L368A和Y407V。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的融合构建体，其中所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段在Fc结构域中包含一个或多个突变，所述一个或多个突变增强融合体与新生Fc受体(RcRn)的结合，优选地所述一个或多个突变增强在酸性pH下的所述结合，更优选地所述Fc具有M252Y/S254T/T256E(YTE)突变，其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。

17.根据权利要求12至16中任一项所述的融合构建体，其中所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段在Fc结构域中包含减少或消除效应子功能的一个或多个突变，优选地所述Fc在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329处具有一个或多个氨基酸修饰，诸如L234A、L235A和P331S中的一个、两个或三个突变，其中根据如Kabat中列出的EU索引进行氨基酸残基的编号。

18.一种融合构建体，所述融合构建体包含：

(a)第一重链，所述第一重链具有选自由SEQ ID NO:42至49组成的组的氨基酸序列；

(b)两条轻链，所述两条轻链各自独立地具有选自由SEQ ID NO:16、

21、24和60组成的组的氨基酸序列；以及

(c)第二重链，所述第二重链具有选自由SEQ ID NO:17和22组成的组的氨基酸序列。

19.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1至6中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段、根据权利要求7至11中任一项所述的缀合物或根据权利要求12至18中任一项所述的融合构建体。

20.一种载体，所述载体包含根据权利要求19所述的分离的核酸。

21.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求19所述的分离的核酸或根据权利要求20所述的载体。

22.一种产生根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、根据权利要求7至11中任一项所述的缀合物或根据权利要求12至18中任一项所述的融合构建体的方法，所述方法包括：在用于产生所述人源化抗体或其抗原结合片段、所述缀合物或所述融合构建体的条件下培养包含编码所述人源化抗体或其抗原结合片段、所述缀合物或所述融合构建体的核酸的细胞，以及从所述细胞或细胞培养物中回收所述人源化抗体或其抗原结合片段、所述缀合物或所述融合构建体。

23.一种药物组合物，所述药物组合物包含：根据权利要求1至6中任一项所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段、根据权利要求7至11中任一项所述的缀合物或根据权利要求12至18中任一项所述的融合构建体以及药学上可接受的载剂。

24.一种阻断对其有需要的受试者中的tau接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求23所述的药物组合物。

25.一种在对其有需要的受试者中诱导抗体依赖性吞噬作用(ADP)而不刺激促炎细胞因子的分泌的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求23所述的药物组合物。

26.一种治疗对其有需要的受试者中的tau蛋白病的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求23所述的药物组合物。

27.一种减少对其有需要的受试者中的病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求23所述的药物组合物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述tau蛋白病选自由以下各项组成的组：家族性阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病、与17号染色体相关的额颞痴呆及帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合征、格-施-沙氏病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、脑炎后帕金森综合征、慢性创伤性脑病、以及拳击员痴呆症(拳击疾病)。

29.根据权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述药物组合物静脉内施用。

30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中所述药物组合物被递送穿过所述受试者的血脑屏障(BBB)。

31.根据权利要求24至30中任一项所述的方法，其中所述施用减少了Fc介导的效应子功能并且/或者不诱导快速网织红细胞耗尽。

32.一种在来自受试者的生物样品中检测PHF-tau的存在的方法，所述方法包括：使所述生物样品与根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段接触，以及检测所述人源化抗体或其抗原结合片段与来自所述受试者的所述样品中的PHF-tau的结合。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述生物样品为血液、血清、血浆、间质液或脑脊髓液样品。