JP2023520821A - 血液脳関門送達のための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

薬剤を、それを必要とする対象の脳に送達するためのモノクローナル抗ＴｆＲ抗体およびその抗原結合性断片が、記載される。神経学的障害を処置もしくは検出するため、および／または治療剤もしくは診断剤を血液脳関門を越えて送達するための、治療剤または診断剤、例えば、第２の抗体およびその抗原結合性断片に連結された抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片を含む、コンジュゲートおよび融合構築物もまた、記載される。抗体、コンジュゲート、および融合構築物をコードする核酸、ならびに関連する組換え宿主細胞もまた、記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月８日に出願された米国仮出願第６３／００６，９９８号および２０２０年６月８日に出願された米国仮出願第６３／０３６，０２０号の優先権を主張し、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の参照
本出願は、配列表を含み、これは、「００４８５２．１５８ＷＯ１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ Ｌｉｓｔｉｎｇ」というファイル名で作成日が２０２１年３月３０日であり、１．３ＭＢのサイズを有する、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて電子的に提出されたＡＳＣＩＩ形式の配列表である。ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する血液脳関門シャトル、およびそれを使用する方法に関する。
血液脳関門（ＢＢＢ）は、有害な物質が脳内に進入するのを防止し、脳の恒常性のためには必須であるが、薬物を脳へ効率的に送達するには手強い障壁となる。大型の分子、例えば、モノクローナル抗体および他の生物学的治療薬は、中枢神経系（ＣＮＳ）における病態を処置／検出することに関して、大きな治療的／診断的可能性を有する。しかしながら、脳へのそれらの経路は、ＢＢＢによって妨げられる。これまでの研究により、血流中に注射されたＩｇＧのうち、非常にわずかなパーセンテージ（およそ０．１％）のみが、ＢＢＢを通ってＣＮＳコンパートメントに入ることができることが示されている（Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164, 1974)）。これにより、ＣＮＳ内での抗体の濃度が低いことに起因して、任意の薬理学的作用が制限されることになる。
受容体によって媒介されるトランスサイトーシス（ＲＭＴ）の使用を含め、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の脳への送達を改善するために、多数のアプローチが研究されている。ＲＭＴは、ＢＢＢの管腔側に豊富に発現される受容体を、脳内皮細胞を通じた輸送に利用する。治療用ｍＡｂを脳内に送達するための臨床的に実現可能なプラットフォームを生成するためのこれまでの取り組みは、トランスサイトーシスの効率を増加させるように抗体を操作することに焦点を当てており、結合価、ｐＨ依存性、および親和性に対する観察を通じて結果を得ていた（Goulatis et al., 2017, Curr Opin Struct Biol 45: 109-115において考察されている）。しかしながら、ＮＨＰおよび診療所への移行は、標的によって媒介される薬物体内動態（ＴＭＤＤ）による急速な末梢クリアランスおよび急性網状赤血球枯渇による安全性によって、制限されている（Gadkar, 2016, Eur J Pharm Biopharm. 2016 Apr;101:53-61）。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、特に、ＴｆＲ１は、鉄が負荷されたトランスフェリン（Ｔｆ）の血液から脳への輸送、および鉄が枯渇したＴｆの血液への返却を媒介する（Kawabata, Free Radical Biology & Medicine, 133, 46-54, 2019）。抗ＴｆＲ１モノクローナル抗体は、薬物を脳へと送達するために使用されている（Burkhart, et al. Progress in neurobiology, 181, 101665, 2019）。しかしながら、抗ＴｆＲ１モノクローナル抗体の安全に関する信頼性および不良な薬物動態（ＰＫ）により、それらをＢＢＢ運搬体として臨床開発することは妨げられている。
したがって、改善された安全性およびＰＫで効率的に薬物を脳へと輸送するために使用することができる、抗ＴｆＲモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片に対する必要性が存在する。
本出願は、送達される薬剤、例えば、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の脳内濃度だけではなく、ｍＡｂの末梢薬物動態、安全性、および薬力学を含むｍＡｂの治療的に関連する特徴も考慮した、脳への送達のための最適化されたプラットフォームに関する。このプラットフォームは、ＴｆＲ結合分子、特に、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、好ましくは、ヒトトランスフェリン受容体１（ｈｕＴｆＲ１）に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、ＴｆＲ結合分子が、６．８～７．８の中性ｐＨ、例えば、生理学的ｐＨ（例えば、７．４）、および４．５～６．５の酸性ｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントにおいて見出されることが多い酸性ｐＨの両方において、結合速度ｋａおよび解離速度ｋｄ値によって定義される最適化された輸送機能を有する、ＴｆＲ結合分子を利用する。
本発明者らは、予想外なことに、最適な値が、単純に、典型的な抗体－標的相互作用において予測され得るような、もっとも速い結合速度ｋａ値およびもっとも遅い解離速度ｋｄ値ではないことを発見した。すなわち、この系に関しては、かならずしも、抗体－標的複合体の寿命がもっとも長くなるように比較的高い速度でＴｆＲに「結合」および会合し、次いで、より緩徐にＴｆＲから解離する分子を使用することが求められるわけではない。代わりに、一実施形態では、本明細書に記載されるＴｆＲ結合剤の最適化された輸送機能は、好ましくは、生理学的ｐＨ（例えば、７．４）および低いｐＨ（例えば、６．５または６．０）の両方において、類似の（例えば、同じ桁の範囲内で）ｋａ速度を有するが、低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５または６．０）では、生理学的ｐＨ（例えば、７．４）におけるｋｄ速度と比較して、より速い解離速度ｋｄを有する。
１つの一般的な態様では、本出願は、治療剤または診断剤を、それを必要とする対象の脳に送達するための抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片であって、中性ｐＨにおいて、少なくとも１ｎＭ、好ましくは、１ｎＭ～５００ｎＭの解離定数ＫＤで、酸性ｐＨ、好ましくは、ｐＨ５において、少なくとも１０－４秒－１、好ましくは、１０－４～１０－１秒－１の解離速度定数ｋｄで、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、好ましくは、ヒトＴｆＲ１に結合する、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片について記載する。
一部の実施形態では、請求項１に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、中性ｐＨにおいて、２×１０－２～２×１０－４秒－１、好ましくは、２．０×１０－３秒－１の解離速度定数ｋｄを有する。
別の実施形態では、本明細書に記載されるある特定のＴｆＲ結合剤の最適化された輸送機能は、好ましくは、生理学的ｐＨ（例えば、７．４）で、少なくとも１．０５×１０５のｋａ速度、および少なくとも２．０×１０－３ｓ－１またはそれよりも速いｋｄ速度を有する。前述のｐＨ、ＫＤ、ｋａ、およびｋｄパラメーターは、最適化されたトランスサイトーシス条件を反映するにすぎず、決して、本明細書におけるある特定のＴｆＲ結合剤にコンジュゲートされたある特定の分子のＴｆＲによって媒介される輸送が、いずれにせよ記載される好ましいパラメーター外で生じ得るという本発明者らの発見を制限するものではない。
１つの一般的な態様では、本出願は、薬剤を、それを必要とする対象の脳に送達するための抗体またはその抗原結合性断片であって、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、好ましくは、ヒトトランスフェリン受容体１（ｈｕＴｆＲ１）に結合し、
（１）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、
（ｉ）それぞれ、配列番号２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、および２９７、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、および２８４、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号５７、５８、５９、６０、６１、および６２、
（ｖ）それぞれ、配列番号８５、８６、８７、８８、８９、および９０、
（ｖｉ）それぞれ、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、および１１５、
（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および１４０、
（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、および１９６、
（ｉｘ）それぞれ、配列番号２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、および２４９、
（ｘ）それぞれ、配列番号２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、および２６８、
（ｘｉ）それぞれ、配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、および３５０、
（ｘｉｉ）それぞれ、配列番号３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、および３６０、
（ｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、および３７０、
（ｘｉｖ）それぞれ、配列番号３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、および３８０、
（ｘｖ）それぞれ、配列番号３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、および３９０、
（ｘｖｉ）それぞれ、配列番号３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、および４００、
（ｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、および４１０、
（ｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、および４２０、
（ｘｉｘ）それぞれ、配列番号４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、および４３０、
（ｘｘ）それぞれ、配列番号４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、および４４０、
（ｘｘｉ）それぞれ、配列番号４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、および４５０、
（ｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、および４６０、
（ｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、および４７０、
（ｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、および４８０、
（ｘｘｖ）それぞれ、配列番号４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、および４９０、
（ｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、および５００、
（ｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、および５１０、
（ｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、および５２０、
（ｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、および５３０、
（ｘｘｘ）それぞれ、配列番号５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、および５４０、もしくは
（ｘｘｘｉ）それぞれ、配列番号５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、および５５０のアミノ酸配列を有する、
重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または
（２）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）であって、
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、および９、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号３１７、３１８、および３１９、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３２４、３２５、および３２６、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号３３１、３３２、および３３３、もしくは
（ｖ）それぞれ、配列番号３３８、３３９、および３４０
のアミノ酸配列を有する、重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）
を含む、抗体またはその抗原結合性断片に関する。
ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号６、３１６、３２３、３３０、または３３７に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗ＴｆＲ ＶＨＨ断片に関する。
他の実施形態では、本出願は、抗ＴｆＲ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、リンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合的に連結された、重鎖可変領域を含み、好ましくは、リンカーが、配列番号３１４のアミノ酸配列を有する、抗ＴｆＲ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に関する。より好ましくは、ｓｃＦｖは、配列番号２７８、２９１、２８、５６、８４、１０９、１３４、１６２、１９０、２１８、２４３、２６２、３４４、３５４、３６４、３７４、３８４、３９４、４０４、４１４、４２４、４３４、４４４、４５４、４６４、４７４、４８４、４９４、５０４、５１４、５２４、５３４、または５４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本出願の別の態様は、治療剤または診断剤、例えば、神経学的障害薬または神経学的障害を検出するための薬剤に連結された本出願の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片を含む、コンジュゲートに関する。好ましくは、治療剤または診断剤は、脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片である。
ある特定の実施形態では、本出願は、脳の標的、例えば、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６からなる群から選択される脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に連結された、本出願の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片を含む、融合構築物に関する。
ある特定の実施形態では、本出願の融合構築物は、Ｔａｕに結合し、それぞれ配列番号５５４～５５９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、第２の抗体またはその抗原結合性断片を含む。好ましくは、第２の抗体は、配列番号３１０のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号３１１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体である。
一実施形態では、本出願の融合構築物は、リンカーを介して、脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片の２つの重鎖のうちの一方のみのカルボキシル末端に共有結合的に連結された、本出願の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片、好ましくは、抗ｈｕＴｆＲ１ ＶＨＨまたはｓｃＦｖ断片を含む。好ましくは、リンカーは、配列番号３１２または配列番号３１３のアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合性断片の２つの重鎖のそれぞれは、２つの重鎖間のヘテロ二量体の形成を促進するように、野生型重鎖定常３（ＣＨ３）ドメインと比較して改変されたＣＨ３ドメインを含む。２つの重鎖間のヘテロ二量体の形成を促進する任意の突然変異を、使用することができる。好ましくは、第１の重鎖の改変されたＣＨ３ドメインは、Ｔ３５０位、Ｌ３５１位、Ｆ４０５位、およびＹ４０７位におけるアミノ酸改変を含み、第２の重鎖の改変されたＣＨ３ドメインは、Ｔ３５０位、Ｔ３６６位、Ｋ３９２位、およびＴ３９４位におけるアミノ酸改変を含む。好ましくは、Ｔ３５０位におけるアミノ酸改変は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３５０Ｉ、Ｔ３５０Ｌ、またはＴ３５０Ｍであり、Ｌ３５１位におけるアミノ酸改変は、Ｌ３５１Ｙであり、Ｆ４０５位におけるアミノ酸改変は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、またはＦ４０５Ｓであり、Ｙ４０７位におけるアミノ酸改変は、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ａ、またはＹ４０７Ｉであり、Ｔ３６６位におけるアミノ酸改変は、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｍであり、Ｋ３９２位におけるアミノ酸改変は、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｌ、またはＫ３９２Ｍであり、Ｔ３９４位におけるアミノ酸改変は、Ｔ３９４Ｗである。より好ましくは、第１の重鎖の改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２の重鎖の改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含む。本明細書全体を通じて抗体におけるアミノ酸残基の番号付けは、別途明示されない限り、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載されるＥＵインデックスに従って行われる。
ある特定の実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合性断片の結晶性断片領域（Ｆｃ領域）は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を変更する（増加または減少させる）、好ましくは、排除する、置換を含む。好ましくは、第２の抗体またはその抗原結合性断片のＦｃ領域は、第２の抗体またはその抗原結合性断片の、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）への結合を減少または停止させ、エフェクター機能によって媒介される毒性を回避する、１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。例えば、第２の抗体またはその抗原結合性断片のＦｃ領域は、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位における１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を含み得、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである。
ある特定の実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合性断片のＦｃ領域は、第２の抗体またはその抗原結合性断片の、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を変更する（増加または減少させる）、好ましくは、増加させる、置換を含む。好ましくは、１つまたは複数の突然変異は、酸性ｐＨにおける結合を増強させ、より好ましくは、Ｆｃは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）突然変異を有し、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである。
ある特定の実施形態では、本出願の融合構築物は、
（１）配列番号３０１、３０４、３０７、２８５、２８８、２９８、１０、１３、１６、１９、２２、２５、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２５０、２５２、２５６、２５９、２６９、２７２、２７５、３２０、３２７、３３４、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、および４７１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第１の重鎖と、
（２）それぞれ３０２、３０５、３０８、２８６、２８９、２９９、１１、１４、１７、２０、２３、２６、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２５１、２５３、２５７、２６０、２７０、２７３、２７６、３２１、３２８、３３５、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、および４７２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を、それぞれが独立して有する、２つの軽鎖と、
（３）それぞれ３０３、３０６、３０９、２８７、２９０、３００、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２５２、２５４、２５８、２６１、２７１、２７４、２７７、３２２、３２９、３３６、３４３、３５３、３６３、３７３、３８３、３９３、４０３、４１３、４２３、４３３、４４３、４５３、４６３、および４７３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第２の重鎖と
を含む。
本出願の別の一般的な態様は、本出願の抗体もしくは抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物をコードする、単離された核酸に関する。また、本出願の単離された核酸を含むベクター、本出願の核酸またはベクターを含む宿主細胞も、提供される。
本出願の別の一般的な態様は、本出願の抗体もしくは抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物を産生させる方法に関する。本方法は、本出願の核酸を含む細胞を、抗体もしくは抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物を産生させる条件下において培養するステップと、抗体もしくは抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物を、細胞または細胞培養物から回収するステップとを含む。
さらに、本出願のコンジュゲートまたは融合構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物が、提供される。
本出願の別の一般的な態様は、神経学的障害の処置または検出を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、有効量の本出願の抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物、または医薬組成物を投与するステップを含む、方法に関する。好ましくは、神経学的障害は、神経変性疾患（例えば、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症）、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病および核上性麻痺）、プリオン病（例えば、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、慢性消耗性疾患、および致死性家族性不眠症）、球麻痺、運動ニューロン疾患、および神経系ヘテロ変性障害（nervous system heterodegenerative disorder）（例えば、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥーレット病、メンケス症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト・ルントボルグ病）、認知症（例えば、ピック病および脊髄小脳失調症）、ならびにＣＮＳおよび／または脳のがん（例えば、身体の他の箇所のがんから生じる脳転移）からなる群から選択される。
好ましくは、本出願の抗体もしくはその抗原結合性断片、コンジュゲート、融合構築物、または医薬組成物は、静脈内投与される。
また、治療剤または診断剤を、それを必要とする対象の脳に送達する方法であって、対象に、本出願の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片に連結された治療剤または診断剤を含むコンジュゲートを投与するステップを含む、方法も記載される。好ましくは、治療剤または診断剤は、脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片である。より好ましくは、対象の脳への、本出願の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片に連結された治療剤または診断剤の投与は、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片に連結されていない治療剤または診断剤の投与と比較して、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能の低減をもたらし、かつ／または急速な網状赤血球枯渇を誘導しない。
本発明のさらに別の一般的な態様は、抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）の誘導を、それを必要とする対象において、炎症促進性サイトカインの分泌を刺激することなく行う方法であって、対象に、本発明の実施形態に記載のその抗原結合性断片に連結、好ましくは、共有結合的にコンジュゲートされた治療用抗体またはその抗原結合性断片を含む、複合体を投与するステップを含み、治療用抗体またはその抗原結合性断片が、エフェクター機能を有さず、例えば、治療用抗体またはその抗原結合性断片が、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位における１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を含み、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである、方法に関する。好ましくは、治療用抗体またはその抗原結合性断片は、ｔａｕ凝集体に特異的に結合する。
本発明の他の態様、特性、および利点は、本発明の詳細な説明およびその好ましい実施形態、ならびに添付の特許請求の範囲を含む、以下の説明から明らかであろう。
上述の概要ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良好に理解されるだろう。図面には、本発明を説明する目的で、本件において好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示されているまさにそのような実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
特許または出願の書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許または本特許出願公報のコピーは、請求および必要な手数料の支払いに応じて特許庁によって提供される。
脳送達プラットフォームに使用されるトリポッドｍＡｂフォーマット（ＴＴＰ ｍＡｂとも呼ばれる）の説明図である。 ヒト脳内皮細胞でのトリポッド（tripod）ｍＡｂの内部移行を示す画像である。トリポッドｍＡｂは赤色に、核は青色に、アクチンは緑色に染色されている。 ｐＨ７．４でのオフレートを、ｐＨを６．５および６．０に低減させた際のオフレートと比較することによって評価したｐＨ依存性結合を示すグラフである。ｐＨの減少と共にオフレートがより速くなった場合、トリポッドｍＡｂにプラスのスコアを付けた。 ヒト脳内皮細胞でのトリポッドｍＡｂ ＢＢＢＢ３８３の内部移行を示す画像である。トリポッドｍＡｂは赤色に、核は青色に、アクチンは緑色に染色されている。 ＢＢＢＢ３８３およびＢＢＢＢ４２６の血漿ＰＫ（図５Ａ）および脳ＰＫ（図５Ｂ）を示すグラフである。抗ＢＡＣＥ ｍＡｂ、ＢＢＢＢ３８３およびＢＢＢＢ４２６を含むブレインシャトル（brain shuttle）を、ＢＢＢＢ４５６（ブレインシャトルを有していない抗ＢＡＣＥ ｍＡｂ）と比較した。記号は、４匹のマウス（４および２４時間時）または５匹のマウス（７２時間時）の平均を表す。 ＢＢＢＢ３８３およびＢＢＢＢ４２６で処置した後の脳内のＡβ１～４０濃度を示すグラフである。抗ＢＡＣＥ ｍＡｂ、ＢＢＢＢ３８３およびＢＢＢＢ４２６を含むブレインシャトルを、ＢＢＢＢ４５６（ブレインシャトルを有しない抗ＢＡＣＥ ｍＡｂ）と比較した。記号は、４匹のマウス（４および２４時間時）または５匹のマウス（７２時間時）の平均を表す。 ブレインシャトル抗ＢＡＣＥ ｍＡｂの血漿ＰＫ（図７Ａ）および脳ＰＫ（図７Ｂ）を示すグラフである。抗ＢＡＣＥ ｍＡｂを含むブレインシャトルを、ＢＢＢＢ４５６と比較した（ブレインシャトルを有しない抗ＢＡＣＥ ｍＡｂ、黒抜き菱形および点線）。各記号は、１時点当たり２匹のマウスの平均を表す。 ブレインシャトルｍＡｂによる処置後の脳内のＡβ１～４０濃度を示すグラフである。抗ＢＡＣＥ ｍＡｂを含むブレインシャトルを、ＢＢＢＢ４５６と比較した（ブレインシャトルを有しない抗ＢＡＣＥ ｍＡｂ、黒抜き菱形および点線）。ＢＢＢＢ９８３を除くすべてのブレインシャトルで、ＡＢレベルの用量依存的減少が観察された。各記号は、１時点当たり２匹のマウスの平均を表す。 ヒト脳内皮細胞でのトリポッドｍＡｂ ＢＢＢ－００４８９の内部移行を示す画像である。トリポッドｍＡｂは赤色に、アクチンは緑色に染色されている。 カニクイザルにおける脳内薬物動態を示すグラフである。カニクイザルに、３つのＴＴＰ ｍＡｂ、ＢＢＢＢ１１３４、ＢＢＢＢ１１３６（左）、およびＢＢＢＢ１１３３（右）を１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬し、対照ｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４と比較した。投薬７２時間後に脳曝露を測定した（ｎ＝３匹カニクイザル／ｍＡｂ）。ｍＡｂの脳内濃度を、様々な区域にわたって決定し、動物全体で平均した。各記号は、脳の領域を表す。 非ブレインシャトル対照と比較した、様々な領域におけるブレインシャトル含有ｍＡｂの脳内濃度を示すグラフである。個々の点は各動物を表す（ｎ＝３）。 ｉ．ｖ．投薬したｍＡｂの、４、２４、および７２時間時の血漿濃度を示すグラフである。ブレインシャトルｍＡｂはすべて、非ブレインシャトルｍＡｂよりも速いクリアランスを示した。個々の点は各動物を表す（ｎ＝３）。 ＢＢＢＢ１１３４ではｃｙｎｏ研究中に網状赤血球枯渇が観察されたが、他のｍＡｂでは観察されなかったことを示し、Ｆｃ機能が、ＴｆＲ結合ｍＡｂおよび網状赤血球枯渇に対して影響を及ぼすことが確認されるグラフである。 ｈｕＴｆＲノックインマウスにおけるトリポッドｍＡｂの脳内薬物動態および薬物動力学を示す図である。ヒトＴｆＲノックインマウスに、一群のトリポッドｍＡｂ（ＢＢＢＢｘ）を１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬し、１つの対照ｍＡｂと比較した。脳曝露を２４時間時に評価した。 図１４Ａ：増強無し（ＢＢＢＢ９７４、白抜き四角）から１０．５×（ＢＢＢＢ９７８、白抜き三角）までの範囲の曝露増強が観察された（ｎ＝２匹マウス。記号は各々個々の動物を表し、バーは平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す）。 図１４Ｂ：トリポッドｍＡｂのオフレートは、脳曝露と良好に相関し、速過ぎでも遅過ぎでももいずれでもないオフレートが最適であることが観察された。 図１４Ｃ：ｍＡｂ、抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂの脳内薬物動力学を評価し、ＢＢＢＢ９８３を除くすべてのトリポッドｍＡｂで、強力なＰＫ／ＰＤ関係性が脳内にて観察されたことを示す図である。ＢＢＢＢ９８３は脳曝露を増強したが（５．５×）、Ａβ１～４０の濃度は対照ｍＡｂと同様だった（各三角は個体を表す）。遅い中性オフレートが標的への脳内拡散を妨げているという仮説が成り立つ。 （上記の通り。） ミクログリアファゴソーム内へのｍＡｂ媒介性取込みを示すグラフである。ブレインシャトルｍＡｂはすべて、非ブレインシャトルｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４よりもファゴソーム内へのより効率的な取込みを促進した。ブレインシャトルｍＡｂの中では、完全なエフェクター機能を有するもの（ＢＢＢＢ１１３１、１１３４、および１０４６）は、エフェクター機能を有しないものよりも効率的だった。 マクロファージファゴソーム内へのｍＡｂ媒介性取込みを示すグラフである。ブレインシャトルｍＡｂはすべて、非ブレインシャトルｍＡｂ、Ｂ２１Ｍ－ＩｇＧ１よりもファゴソーム内へのより効率的な取込みを促進した。 カニクイザルにおける脳内薬物動態が、治療用ｍＡｂの脳への送達の増強を示す図である。 図１７Ａ：カニクイザルに２つのトリポッドｍＡｂ、ＢＢＢＢ１１３４およびＢＢＢＢ１１３６、ならびに１つの対照ｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４を１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬した。投薬７２時間後に脳曝露を測定した（ｎ＝３匹のカニクイザル／ｍＡｂ。記号は個々の動物を表し、バーは平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す）。両ブレインシャトルｍＡｂでは、評価した脳のすべての領域にわたって、脳曝露の増強が観察された。 図１７Ｂ：ＢＢＢＢ１１３４およびＢＢＢＢ１３６では、対照ｍＡｂと比較して、脳内濃度のそれぞれ７×および１１×の増強が観察された。 図１７Ｃ：７２時間にわたる血漿曝露は、トリポッドｍＡｂの標的媒介性薬物動態を示し、対照ｍＡｂと比較してクリアランスの加速が観察された。トリポッドｍＡｂは、ＦｃＲｎに対する結合親和性が異なり、ＢＢＢＢ１１３６は高結合親和性「ＹＴＥ」突然変異を含む。ＢＢＢＢ１１３６（三角）は、ＢＢＢＢ１１３４（白抜き四角）と比較して、７２時間時に血漿濃度のおよそ２×増強を示した。 図１７Ｄ：陽性対照ＢＢＢＢ１７５高親和性抗ＴｆＲ結合ＩｇＧ１ ｍＡｂおよび標的細胞に結合しないＩｇＧ１ ｍＡｂである陰性対照ＣＮＴＯ３９３０と比較したトリポッドｍＡｂ（ＢＢＢＢ１１３４およびＢＢＢＢ１１３６）のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性。ＩｇＧ１ ｍＡｂであるＢＢＢＢ１１３４は、ヒトＰＢＭＣおよびｃｙｎｏ ＰＢＭＣの両方で標的細胞のロバストなＡＤＣＣを強化する。エフェクター機能サイレントＩｇＧ１ ｍＡｂであるＢＢＢＢ１１３６は、ＡＤＣＣ活性を示さないことが観察された。 図１７Ｅ：補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対するＢＢＢＢ１１３４およびＢＢＢＢ１１３６のＳＰＲ結合データ。ＢＢＢＢ１１３４は、Ｃ１ｑに結合するが、ＢＢＢＢ１１３６は結合しない。 図１７Ｆ：カニクイザルＰＫ試験で観察された網状赤血球枯渇。対照ｍＡｂまたはＢＢＢＢ１１３６では、投薬２日後に網状赤血球喪失は観察されなかったが、ＢＢＢＢ１１３４での処置後にはロバストな枯渇が観察された（記号は個々の動物を表し、バーは平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す）。 （上記の通り。） （上記の通り。） カニクイザルにおけるＢＢＢＢ１１３３の反復投薬および用量応答の脳内および血清薬物動態を示す図である。 図１８Ａ：カニクイザルに、ＢＢＢＢ１１３３を２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇのいずれかで静脈内投薬し、脳曝露を１、７、または１５日後に評価した（ｎ＝３匹のサル／ｍＡｂおよび時点。記号は平均脳内濃度を表し、エラーバーは標準偏差を表す）。２～１０ｍｇ／ｋｇでは線形性の脳ＰＫが観察されたが、１０～３０ｍｇ／ｋｇでは非線形性のＰＫが観察され、ＴｆＲの飽和用量は３０ｍｇ／ｋｇであることが示唆された。 図１８Ｂ：ＢＢＢＢ１１３３の血清濃度を、この研究全体にわたって測定した（投薬の１、６時間後、ならびに１、２、４、１０、および１４日目）。３つの用量すべてで線形性の薬物動態が観察された。Ｔ１／２＝６日が、血清中のＢＢＢＢ１１３３で決定された。 図１８Ｃ：カニクイザルに、ＢＢＢＢ１１３３を、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇのいずれかで３週間にわたって週１回静脈内投薬した。投薬１、７、１５、または２１日後に、脳曝露を評価した（ｎ＝３匹のサル／ｍＡｂおよび時点。記号は平均脳内濃度を表し、エラーバーは標準偏差を表す）。２～１０ｍｇ／ｋｇでは線形性の脳ＰＫが観察されたが、１０～３０ｍｇ／ｋｇでは非線形性のＰＫが観察され、ＴｆＲの飽和用量は３０ｍｇ／ｋｇであることが示唆された。３０ｍｇ／ｋｇ用量では蓄積の証拠が観察された。 図１８Ｄ：ＢＢＢＢ１１３３の血清濃度を、この研究全体にわたって測定した（最初の投薬の１、６時間後、ならびに１、２、４、１０、１４、１４．０２、１４．２５、１５、１６、１８、および２１日目）。３つの用量すべてで線形性の薬物動態が観察され、反復投薬によるＰＫ耐性の証拠はなかった。 （上記の通り。） 非古典的な非ＦｃγＲ媒介性ＡＤＰは、ヒトミクログリアにおけるＴａｕ凝集体の効率的なファゴサイトーシスを促進することを示す図である。 図１９Ａ：エフェクター機能障害ＩｇＧ１トリポッドｍＡｂ、ＢＢＢＢ１１３３およびＢＢＢＢ１１３６が、ミクログリアでのＴａｕ凝集体の取込みを促進する能力を評価するため、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアを、ｍＡｂおよびストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８（ＡＦ４８８）で標識したビオチン化ホスホＴａｕオリゴマーと共にインキュベートした。インキュベーション４時間後に、細胞を洗浄し、固定し、透過処理し、染色し、共焦点顕微鏡を使用して画像化した。Ｌａｍｐ－１染色リソソームと共局在化したＴａｕ凝集体を含む細胞を定量化した。ＢＢＢＢ１１３３およびＢＢＢＢ１１３６は、抗Ｔａｕ ＷＴ ＩｇＧ１ ｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４よりも効率的な取込みおよびリソソーム輸送を促進した。 図１９Ｂ：Ｔａｕオリゴマーの取込みは、過剰な可溶性ＴｆＲ ＥＣＤで阻止することができるが、可溶性Ｆｃの添加による影響を受けず、取込みがＴｆＲを介して生じることを示す。 図１９Ｃ：ヒトｉＰＳｃ由来ミクログリアを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ホスホＴａｕペプチド（緑色）と共に、ＰＴ１Ｂ８４４またはＢＢＢＢ１１３３の存在下で４時間インキュベートした。固定した後、細胞を、クラスリン、ＥＥＡ１、Ｒａｂ１７、またはＬａｍｐ１に対する抗体で染色し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７二次抗体（赤色）で検出した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘを倍率６０×の共焦点モードで使用して、細胞を画像化した。２μｍ平面の代表的な細胞画像が示されている。縮尺バー＝１０μｍ。矢印は、挿入図に詳細に示されている共局在化区域を指している。各ホスホＴａｕ抗体処置の３番目の列は、他の２つの列をマージした結果である。また、核を検出するためにＤＡＰＩで、細胞質を検出するためにｈｃｓ Ｃｅｌｌｍａｓｋオレンジで細胞を染色および画像化した（図示せず）。 （上記の通り。） 非古典的な非ＦｃγＲ媒介性ＡＤＰは、ヒトマクロファージおよびミクログリアにおいて、ヒトＡＤ患者脳に由来するＴａｕ凝集体の効率的なファゴサイトーシスを促進することを示す図である。 図２０Ａ：ヒト単球由来マクロファージを、Ｔａｕ凝集体およびＢＢＢＢ１１３３（白抜き四角）および対照抗Ｔａｕ ｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４（丸）と共にインキュベートした。培養上清に残るｐＴａｕの量を経時的に定量化した。ｐＴａｕの同様の分解が８時間まで観察された。その時点で、ＰＴ１Ｂ８４４媒介性ＡＤＰは停止するが、ＢＢＢＢ１１３３媒介性ＡＤＰが分解を促進し続ける。 図２０Ｂ：ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアを使用しても同様の傾向が観察され、ＢＢＢＢ１１３３（白抜き四角）は、ＰＴ１Ｂ８４４と比較してよりロバストなｐＴａｕの分解を経時的に増強した。ＢＢＢＢ１１３３媒介性ｐＴａｕ分解の機序は、過剰量の可溶性ＴｆＲ ＥＣＤを使用して分解を阻止することによって、ＴｆＲを介して生じることが示された。 図２０Ｃ～図２０Ｅ：ミクログリア実験の上清を、サイトカイン濃度について評価した図である。ＰＴ１Ｂ８４４媒介ｐＴａｕ ＡＤＰは、炎症促進性サイトカイン、ＴＦＮα（図２０Ｃ）、ＩＬ６（図２０Ｄ）、およびＩＬ１β（図２０Ｅ）の放出をシミュレートしたが、ＢＢＢＢ１１３３は、同様の放出をシミュレートしなかった。 （上記の通り。） （上記の通り。） 表示のＴａｕ抗体と共にＰＨＦを同時注射すると、Ｔａｕ病理の誘導が低減されることを示す図である。 図２１Ａ：Ｆｃ依存性活性に対するこのモデルの部分的依存性は、マウスＩｇＧ２ａによるＴａｕの中和に統計的な有意差があることによって示される。 図２１Ｂ：両抗Ｔａｕ ｍＡｂは、アイソタイプ対照と比較してＴａｕ接種を中和した。このｍＡｂとこのＴＴＰ ｍＡｂとの間に統計的差異は観察されず、このＴＴＰ ｍＡｂはこのｍＡｂと比較してわずかに向上された中和を示し、非古典的ＡＤＰ機序がｉｎ ｖｉｖｏで機能性であることが示された。
様々な刊行物、論文、および特許が、背景技術および本明細書全体において引用または記載されており、これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、動作、材料、デバイス、物品などに関する考察は、本発明の文脈を提供する目的のためのものである。そのような考察は、これらのものの一部またはすべてが、開示または特許請求される任意の発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。それ以外の場合、本明細書に使用されるある特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。本明細書に引用されているすべての特許、公開特許出願、および刊行物は、参照によって、本明細書に全内容が記載されているように組み込まれる。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照物を含むことに留意しなければならない。
別途示されない限り、本明細書に記載される任意の数値、例えば、濃度または濃度範囲は、すべての事例において「約」という用語によって修飾されているものとして理解されたい。したがって、数値は、典型的に、言及された値の±１０％を含む。例えば、１０ｍｇの投薬量は、９ｍｇ～１１ｍｇを含む。本明細書に使用される場合、数値範囲の使用は、文脈により別途明確に示されない限り、すべての可能性のある部分範囲、その範囲内のすべての個々の数値を含み、そのような範囲内の整数および数値の分数が含まれる。
本明細書に使用される場合、複数の言及される要素間の「および／または」という接続詞は、個別および組合せの両方の選択肢を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が、「および／または」によって接続されている場合、第１の選択肢は、第２の要素なしで第１の要素を適用することを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしで第２の要素を適用することを指す。第３の選択肢は、第１および第２の要素を一緒に適用することを指す。これらの選択肢のうちのいずれのものも、この意味の範囲内に含まれ、したがって、本明細書に使用される「および／または」という用語の要件を満たことが理解される。選択肢のうちの１つを上回るものを同時に適用することもまた、この意味の範囲内に含まれ、したがって、「および／または」という用語の要件を満たすことが理解される。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈により別途要求されない限り、「含む（comprise）」という言葉、ならびに「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」などの変化形は、言及された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を意味し、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外を意味するものではないことを理解されたい。本明細書に使用される場合、「含む（comprising）は、「含む（containing）」もしくは「含む（including）」という用語、または本明細書に使用される一部の場合には「有する」という用語と置換することができる。
本明細書に使用される場合、「からなる」は、特許請求要素に示されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書に使用される場合、「から本質的になる」は、特許請求の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを除外しない。「含む（comprising）」、「含む（containing）」、「含む（including）」、および「有する」という前述の用語のいずれも、本発明の態様または実施形態の文脈において本明細書に使用される場合は常に、「からなる」または「から本質的になる」という用語と置き換えて、本開示の範囲を変動させてもよい。
本明細書における「抗体」という用語は、広義に使用され、具体的には全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ならびに別途示されない限りまたは文脈に矛盾しない限り、所望される生物学的活性を呈する限りは、それらの抗原結合性断片、抗体バリアント、および多重特異性分子を含む。一般に、全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互に接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合性部分である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインから構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される保存性の高い領域が点在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに分割することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体分子構造の一般原則、および抗体の産生に関する様々な技法は、例えば、Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1988)に提供されている。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、全長抗体は、異なる「クラス」に割り当てられ得る。全長抗体の５つの主要なクラスには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分割され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は、周知である。
「抗体」はまた、重鎖単独抗体（ＨｃＡｂ）とも称される重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）抗体であってもよく、これは、軽鎖が欠如しており、ラクダ科動物またはサメによって天然に産生され得る。ＨｃＡｂの抗原結合性部分は、ＶＨＨ断片から構成される。
「組換え抗体」という用語は、本明細書に使用される場合、抗体をコードする核酸を含む組換え宿主細胞によって発現される抗体（例えば、キメラ、ヒト化、もしくはヒト抗体、またはその抗原結合性断片）を指す。組換え抗体を産生させるための「宿主細胞」の例としては、（１）哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、骨髄腫細胞（ＹＯおよびＮＳＯ細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、Ｈｅｌａ、およびＶｅｒｏ細胞、（２）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、およびＴｎ５、（３）植物細胞、例えば、ニコチアナ（Nicotiana）属に属する植物（例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum））、（４）酵母細胞、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属するもの（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属するもの（例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））、（５）細菌細胞、例えば、大腸菌（Escherichia, coli）細胞、または枯草菌（Bacillus subtilis）細胞などが挙げられる。
抗体の「抗原結合性断片」は、抗原に検出可能に結合することができる全長抗体の一部分を含む、典型的には、少なくともＶＨ領域の１つまたは複数の部分を含む、分子である。抗原結合性断片は、抗体の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗原結合性部分を含む多価分子、ならびにＶＬおよびＶＨ領域、またはその選択された部分が、合成リンカーまたは組換え方法によって結合されて、機能的抗原結合性分子を形成した一本鎖構築物を含む。抗原結合性断片はまた、ナノボディとしても知られている単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であってもよく、これは、単一の単量体可変抗体ドメイン（ＶＨＨ）からなる抗体断片である。抗体のいくつかの抗原結合性断片は、より大きな抗体分子の実際の断片形成（例えば、酵素切断）によって得ることができるが、ほとんどは、典型的には、組換え技法によって産生される。本発明の抗体は、全長抗体またはその抗原結合性断片として調製することができる。抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ、例えば、Bird et al., Science 1988; 242:423-426およびHuston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883を参照されたい）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（典型的には、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン）、ならびにｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、およびＶ－ＮＡＲドメイン；単一のＶＨおよび単一のＶＬ鎖を含む一価分子；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびカッパボディ（例えば、Ill et al., Protein Eng 1997; 10:949-57を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；ならびに１つまたは複数の単離されたＣＤＲまたは機能性パラトープ（ここで、単離されたＣＤＲまたは抗原結合性残基もしくはポリペプチドは、機能性抗体断片を形成するように、一緒に会合または連結され得る）が挙げられる。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23:1126-1136、国際公開第ＷＯ２００５０４０２１９号、ならびに公開済みの米国特許出願第２００５０２３８６４６号および同第２００２０１６１２０１号において記載または考察されている。抗体断片は、従来的な組換えまたはタンパク質操作技法を使用して得ることができ、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で、抗原結合性または他の機能についてスクリーニングすることができる。
抗体断片の産生のための様々な技法が開発されている。従来的には、これらの断片は、全長抗体のタンパク質分解による消化を介して導出されていた（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)、およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、現在では、組換え宿主細胞によって、直接的に産生させることができる。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、大腸菌（E. coli）から直接的に回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)）。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離することができる。他の実施形態では、選択される抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第ＷＯ １９９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号、および米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片はまた、例えば、例として、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような「線形抗体」であってもよい。そのような線形抗体断片は、単一特異性であってもよく、または二重特異性であってもよい。
「抗体誘導体」という用語は、本明細書に使用される場合、１つまたは複数のアミノ酸が、化学的に改変または置換された、全長抗体またはその抗原結合性断片を含む分子を指す。抗体誘導体において使用することができる化学的改変としては、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成など、例えば、抗体を第２の分子に連結させるためのものが挙げられる。例示的な改変としては、ＰＥＧ化（例えば、システイン－ＰＥＧ化）、ビオチニル化、放射標識、および第２の薬剤（例えば、細胞毒性剤）とのコンジュゲーションが挙げられる。
本明細書における抗体は、変更された抗原結合性または生物学的活性を有する「アミノ酸配列バリアント」を含む。そのようなアミノ酸変更の例としては、抗原に対する増強された親和性を有する抗体（例えば、「親和性成熟」抗体）、ならびに変更されたＦｃ領域を有し、存在する場合には、例えば、変更された（増加または減少した）抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／もしくは補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）（例えば、国際公開第ＷＯ ００／４２０７２号、Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ．および同第ＷＯ ９９／５１６４２号、Ｉｄｕｏｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ）、および／または増加もしくは減少した血清半減期（例えば、国際公開第ＷＯ００／４２０７２号、Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ．）を有する抗体が挙げられる。
「多重特異性分子」は、少なくとも１つの他の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質、例えば、別の抗体または受容体のリガンド）と会合しているか、またはそれに連結された、抗体またはその抗原結合性断片を含み、それによって、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する分子が形成される。例示的な多重特異性分子としては、二重特異性抗体、および可溶性受容体断片もしくはリガンドに連結された抗体が挙げられる。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書に使用される場合、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する（すなわち、それと同一であるか、またはそれと本質的に同一である）可変領域を有する、抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含む場合には、定常領域もまた、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に「由来」する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異生成によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書に使用される場合、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図しない。
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、ヒト／非ヒトキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ残基のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含み得る。さらなる詳細については、例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)、およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、国際公開第ＷＯ ９２／０２１９０号、米国特許出願第２００６００７３１３７号、ならびに米国特許第６，７５０，３２５号、同第６，６３２，９２７号、同第６，６３９，０５５号、同第６，５４８，６４０号、同第６，４０７，２１３号、同第６，１８０，３７０号、同第６，０５４，２９７号、同第５，９２９，２１２号、同第５，８９５，２０５号、同第５，８８６，１５２号、同第５，８７７，２９３号、同第５，８６９，６１９号、同第５，８２１，３３７号、同第５，８２１，１２３号、同第５，７７０，１９６号、同第５，７７７，０８５号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，２２５，５３９号を参照されたい。
「超可変領域」という用語は、本明細書に使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（軽鎖可変ドメインの残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）、（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）に由来するアミノ酸残基、ならびに／または「超可変ループ」（軽鎖可変ドメインの残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、および９１～９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196:901-917）に由来する残基を含む。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al.,（上記）に記載される方法によって行われる。本明細書における「Ｋａｂａｔの位置」、「Ｋａｂａｔによる可変ドメイン残基番号付け」、および「Ｋａｂａｔによる」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのこの番号付けシステムを指す。Ｋａｂａｔの番号付けシステムを使用すると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮形に相当する、より少ないアミノ酸を含み得るか、またはそれへの挿入に相当する、追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に、単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に、挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。Ｋａｂａｔの残基番号付けは、所与の抗体に関して、その抗体の配列の相同性の領域における、「標準の」Ｋａｂａｔの番号付けを行った配列とのアライメントによって、決定され得る。
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＣＤＲ以外のＶＨまたはＶＬ残基である。
「エピトープ」または「結合部位」は、抗原結合性ペプチド（例えば、抗体）が特異的に結合する抗原上の範囲または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接的に関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも称される）、および結合には直接的に関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に抗原結合性ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基（換言すると、アミノ酸残基は、特異的に抗原結合性ペプチドの「溶媒排除表面（solvent-excluded surface）」および／または「フットプリント」内にある）を含み得る。
「パラトープ」は、抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合性部分の範囲または領域である。別途示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、パラトープは、エピトープ結合に直接的に関与する、いくつかが典型的にはＣＤＲ内にあるアミノ酸残基、ならびに結合に直接的に関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に結合した抗原によって効果的に遮断されるアミノ酸残基（換言すると、アミノ酸残基は、特異的に結合した抗原の「溶媒排除表面」および／または「フットプリント」内にある）を含み得る。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、参照抗体のその抗原への結合を、競合アッセイにおいて、５０％またはそれ以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、抗体のその抗原への結合を、競合アッセイにおいて、５０％またはそれ以上遮断する。
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から分離されているものである。一部の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって判定した場合に、９５％または９９％を上回る純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法に関する考察については、Flatman et al, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照されたい。
本発明の方法に関して、「投与すること」という用語は、本発明のコンジュゲート、またはその形態、組成物、もしくは医薬を使用することによって、本明細書に記載される症候群、障害、または疾患を、治療的または予防的に予防、処置、または緩和するための方法を意味する。そのような方法は、有効量の前記抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲート、またはその形態、組成物、もしくは医薬品を、治療過程の間の異なる時点において、または組合せ形態で同時に、投与するステップを含む。本発明の方法は、すべての公知の治療的処置レジメンを包含するものとして理解されたい。
標的抗体が標的分子の天然の標的リガンドへの結合を「遮断する」能力は、抗体が、可溶性または細胞表面結合型標的およびリガンド分子を使用するアッセイにおいて、標的分子のリガンドへの結合を、用量依存的様式で検出可能に低減させることができ、標的分子が、その抗体の不在下においてはリガンドに検出可能に結合することを意味する。
「血液脳関門」または「ＢＢＢ」は、分子の脳内への輸送を制限する緻密な障壁を作成する、脳毛細血管内皮形質膜内のタイトジャンクションによって形成される末梢循環と脳および脊髄との間の生理学的障壁を指す。ＢＢＢは、非常に小さな分子、例えば、尿素（６０ダルトン）でさえも、脳への輸送を制限することができる。ＢＢＢの例としては、脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液脊髄関門、および網膜内の血液網膜関門が挙げられ、これらのすべては、ＣＮＳ内の連続的な毛細血管関門である。ＢＢＢはまた、障壁が毛細血管内皮細胞ではなく上衣細胞から構成されている、血液ＣＳＦ関門（脈絡叢）も包含する。
「血液脳関門受容体」（本明細書において「Ｒ／ＢＢＢ」と略される）は、分子をＢＢＢを越えて輸送することができるか、または投与された外因性分子を輸送するために使用される、脳内皮細胞上に発現される細胞外膜結合型受容体タンパク質である。Ｒ／ＢＢＢの例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ－Ｒ）、限定することなく低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）を含む、低密度リポタンパク質受容体、ならびにヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における例示的なＲ／ＢＢＢは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。
「中枢神経系」または「ＣＮＳ」は、身体機能を制御する神経組織の複合体を指し、これには、脳および脊髄が含まれる。
「コンジュゲート」は、本明細書に使用される場合、治療用ペプチドもしくはタンパク質、抗体、標識、または神経学的障害薬を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の異種分子に共有結合的に連結されたタンパク質を指す。
本明細書に使用される場合、「連結された」という用語は、２つまたはそれ以上の物体が一緒に結合していることまたはその接続を指す。化学的または生物学的化合物に言及する場合、連結されたとは、２つまたはそれ以上の化学的または生物学的化合物の間の共有結合的な接続を指し得る。非限定的な例として、本発明の抗体は、目的のペプチドと連結されて、抗体連結型ペプチドを形成し得る。抗体連結型ペプチドは、抗体をペプチドにコンジュゲートするように設計された特定の化学反応を通じて形成され得る。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、リンカーを通じて本発明のペプチドに共有結合的に連結され得る。リンカーは、例えば、まず、抗体またはペプチドに共有結合的に接続され、次いで、ペプチドまたは抗体に共有結合的に接続され得る。
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」または「治療有効量」は、必要とされる投薬量および期間で、所望される治療的または予防的結果を達成するのに有効な量を指す。
「リンカー」は、本明細書に使用される場合、２つの異なる実体を共有結合的に接続する、化学的リンカーまたは一本鎖ペプチドリンカーを指す。リンカーは、本発明の抗体またはその断片、血液脳関門シャトル、融合タンパク質、およびコンジュゲートのうちの任意の２つを接続するために使用され得る。リンカーは、例えば、ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬ、またはモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を、治療用分子、例えば、第２の抗体に接続することができる。一部の実施形態では、一価の結合性実体が、ＴｆＲ、好ましくは、ｈｕＴｆＲ１に指向されるｓｃＦｖを含み、治療用分子が、ＣＮＳ標的、例えば、Ｔａｕに指向される抗体を含む場合、リンカーは、ｓｃＦｖを、Ｔａｕに指向される抗体に接続することができる。ペプチド結合によって結合された、１～２５個のアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個のアミノ酸から構成される、一本鎖ペプチドリンカーを、使用することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。ある特定の他の実施形態では、アミノ酸のうちの１つまたは複数は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。化学的リンカー、例えば、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）リンカー、多糖リンカー、ポリエステルリンカー、ＰＥＧおよび埋め込まれた複素環からなるハイブリッドリンカー、ならびに炭化水素鎖もまた、使用することができる。
「神経学的障害」は、本明細書に使用される場合、ＣＮＳに罹患する、および／またはＣＮＳに病因を有する、疾患または障害を指す。ＣＮＳ疾患または障害の例としては、ニューロパチー、アミロイドーシス、がん、眼疾患または障害、ウイルスまたは微生物感染症、炎症、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、およびリソソーム貯蔵疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本出願の目的で、ＣＮＳは、血液網膜関門によって身体の残りの部分から通常は封鎖されている眼を含むことが理解されるであろう。神経学的障害の特定の例としては神経変性疾患（レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症を含むが、これらに限定されない）、タウオパチー（アルツハイマー病および核上性麻痺を含むが、これらに限定されない）、プリオン病（ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、慢性消耗性疾患、および致死性家族性不眠症を含むが、これらに限定されない）、球麻痺、運動ニューロン疾患、および神経系ヘテロ変性障害（nervous system heterodegenerative disorder）（カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥーレット病、メンケス症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト・ルントボルグ病を含むが、これらに限定されない）、認知症（ピック病および脊髄小脳失調症を含むが、これらに限定されない）、がん（例えば、ＣＮＳおよび／または脳のもの、身体の他の箇所のがんから生じる脳転移を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
「神経学的障害薬」は、１つまたは複数の神経学的障害の作用を処置または緩和するのに有用な薬物または治療剤である。本発明の神経学的障害薬としては、小分子化合物、抗体、ペプチド、タンパク質、１つもしくは複数のＣＮＳ標的の天然のリガンド、１つもしくは複数のＣＮＳ標的の天然のリガンドの改変バージョン、アプタマー、阻害性核酸（すなわち、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、または前述のもののいずれかの活性な断片が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の例示的な神経学的障害薬は、本明細書に記載されており、これには、それ自体が、ＣＮＳ抗原または標的分子、例えば、限定されないが、アミロイド前駆体タンパク質またはその一部分、アミロイドベータ、ベータ－セクレターゼ、ガンマ－セクレターゼ、ｔａｕ、アルファ－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、神経膠腫または他のＣＮＳがんマーカー、ならびにニューロトロフィンであるか、またはそれらを特異的に認識する、および／もしくはそれらに対して作用する（すなわち、阻害、活性化、もしくは検出する）かのいずれかである、抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、阻害性核酸、および小分子、ならびに前述のもののいずれかの活性な断片が挙げられるが、これらに限定されない。神経学的障害薬の非限定的な例、およびそれらを使用して処置され得る対応する障害：脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、慢性脳損傷（神経発生）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）、抗上皮増殖因子受容体脳がん、（ＥＧＦＲ）－抗体、グリア細胞株由来神経因子 パーキンソン病、（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ） 筋萎縮性側索硬化症、鬱、脳のリソソーム酵素リソソーム貯蔵障害、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ） 筋萎縮性側索硬化症、ニューレグリン－１ 統合失調症、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ） ＨＥＲ２陽性がんからの脳転移。
「医薬製剤」という用語は、中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効となるのを許容するような形態にあり、製剤が投与されるであろう対象にとって、許容できないほどに毒性である追加の成分を含まない、調製物を指す。
本明細書に使用される場合、「薬学的に許容される担体または希釈剤」は、個体への投与に使用するのに好適な任意の物質を意味する。例えば、薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または注射用水であり得る。
本明細書に使用される場合、「薬学的に許容される塩」とは、化合物、例えば、オリゴマー化合物またはオリゴヌクレオチドの生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望される生物学的活性を保持し、望ましくない毒物学的作用を与えない、塩を意味する。
本発明において使用するための薬学的に許容される酸性／アニオン性塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシラート、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、ジヒドロクロリド、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グリセプテート（glyceptate）、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（glycollylarsanilate）、ヘキシルレゾルシネート（hexylresorcinate）、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硝酸メチル、硫酸メチル、ムカート、ナプシレート、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、およびトリエチオジドが挙げられ、これらに限定されない。また、有機酸または無機酸としては、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、プロピオン酸、グリコール酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、シュウ酸、２－ナフタレンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サッカリン酸、またはトリフルオロ酢酸が挙げられ、これらに限定されない。薬学的に許容される塩基性／カチオン性塩としては、アルミニウム、２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール（また、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタン、または「ＴＲＩＳ」としても知られている）、アンモニア、ベンザチン、ｔ－ブチルアミン、カルシウム、クロロプロカイン、コリン、シクロヘキシルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、リチウム、Ｌ－リジン、マグネシウム、メグルミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、ピペリジン、カリウム、プロカイン、キニン、ナトリウム、トリエタノールアミン、または亜鉛が挙げられ、これらに限定されない。
「ポリペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成した、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む、分子を意味する。５０個未満のアミノ酸の小さなポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。
「配列同一性」、または「配列同一性パーセント（％）」、または「同一性％」、または「％同一である」という語句は、アミノ酸配列を参照して使用される場合、２つまたはそれ以上のアライメントされるアミノ酸配列の、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較した、同一のアミノ酸の一致（「ヒット」）の数を説明する。換言すると、アライメントを使用して、２つまたはそれ以上の配列について、同じであるアミノ酸残基のパーセンテージ（例えば、アミノ酸配列の全長にわたって９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）は、配列を、当該技術分野において公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定される最大の一致について比較およびアライメントした場合、または手作業でアライメントされ目視で調査した場合に、判定され得る。配列同一性を判定するために比較される配列は、したがって、アミノ酸の置換、付加、または欠失によって異なり得る。タンパク質配列をアライメントするのに好適なプログラムは、当業者に公知である。タンパク質配列の配列同一性パーセンテージは、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul SF, et al (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を使用して、判定することができる。
２つのアミノ酸配列の文脈において、「実質的に同一である」という用語は、配列が、例えば、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのプログラムによって、デフォルトのギャップ重みを使用して最適にアライメントした場合に、少なくとも約５０パーセントの配列同一性を共有することを意味する。典型的に、実質的に同一である配列は、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約９８、または少なくとも約９９パーセントの配列同一性を呈するであろう。
「特異的に結合すること」、または「特異的に結合する」、または「結合する」とは、抗体が、他の抗原よりも高い親和性で、抗原または抗原内のエピトープに結合することを指す。典型的に、抗体は、約１×１０－８Ｍもしくはそれ未満、例えば、約１×１０－９Ｍもしくはそれ未満、約１×１０－１０Ｍもしくはそれ未満、約１×１０－１１Ｍもしくはそれ未満、または約１×１０－１２Ｍもしくはそれ未満の解離定数（ＫＤ）で、典型的には、その非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合のＫＤよりも少なくとも１００分の１のＫＤで、抗原または抗原内のエピトープに結合する。ＫＤは、抗体とその抗原との間のｋｏｆｆ／ｋｏｎの比である平衡解離定数である。ＫＤおよび親和性は、逆相関する。「結合速度」（ｋｏｎ）は、抗体がその標的にどれほど迅速に結合するかを特徴付けるために使用される定数である。「解離速度」（ｋｏｆｆ）は、抗体がその標的からどれほど迅速に解離されるかを特徴付けるために使用される定数である。解離定数ＫＤは、標準的な手順を使用して測定され得る。例えば、抗体のＫＤは、表面プラズモン共鳴を使用することによって、例えば、バイオセンサーシステム、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することによって、またはバイオレイヤーインターフェロメトリー技術、例えば、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムを使用することによって、判定することができる。抗体のＫＤの値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性は高い。抗原または抗原内のエピトープに特異的に結合する抗体は、しかしながら、他の関連する抗原、例えば、他の種（ホモログ）、例えば、ヒトまたはサル、例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）（カニクイザル（cynomolgus、ｃｙｎｏ））、チンパンジー（Pan troglodytes）（チンパンジー（chimpanzee、ｃｈｉｍｐ））、またはコモンマーモセット（Callithrix jacchus）（コモンマーモセット（common marmoset、ｍａｒｍｏｓｅｔ））に由来する同じ抗原に対して、交差反応性を有し得る。単一特異性抗体は、１つの抗原または１つのエピトープに特異的に結合するが、一方で二重特異性抗体は、２つの異なる抗原または２つの異なるエピトープに特異的に結合する。
「対象」という用語は、本明細書に使用される場合、哺乳動物を指す。哺乳動物としては、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、および非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、ならびにげっ歯動物（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。対象がヒトである場合、それらは、「患者」と称することができる。
「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」という用語は、本明細書に使用される場合、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスのプロセスによる細胞内鉄取り込みに必要とされる、細胞表面受容体を指す。トランスフェリンの運搬タンパク質。ＴｆＲは、脊椎動物における鉄取り込みに関与し、細胞内鉄濃度に応答して調節される。これは、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを通じて、トランスフェリン－鉄複合体を内部移行させることによって、鉄を取り込む。ヒトにおいては、トランスフェリン受容体１およびトランスフェリン受容体２という２つのトランスフェリン受容体が、特徴付けられている。これらの受容体のいずれも、膜貫通型糖タンパク質である。ＴｆＲ１は、高親和性の偏在的に発現される受容体である。ＴｆＲ２は、ＴｆＲ１よりも２５～３０分の１の親和性で、トランスフェリンに結合する。ＴｆＲ２の発現は、ある特定の細胞型に制限されており、細胞内鉄濃度によって影響を受けない。一実施形態では、ＴｆＲは、例えば、Schneider et al. Nature 311: 675-678 (1984)にあるようなアミノ酸配列を含む、ヒトＴｆＲである。これは、見かけの分子量がそれぞれ約９０，０００ダルトンである２つのサブユニットを有し、約１８０，０００ダルトンの分子量を有し得る。好ましくは、ＴｆＲは、ヒトＴｆＲ１である。
「標的抗原」または「脳の標的」は、本明細書に使用される場合、抗体または小分子により標的化することができる、脳を含め、ＣＮＳにおいて発現される抗原および／または分子を指す。そのような抗原および／または分子の例としては、限定することなく、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６が挙げられる。一部の実施形態では、標的抗原は、ＢＡＣＥ１である。一部の実施形態では、標的抗原は、Ｔａｕである。
本明細書に使用される場合、「処置」（およびその文法上の変化形、例えば、「処置する」または「処置すること」）は、処置されている個体の自然な経過を変更するよう試みる臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程の間のいずれかで、行われ得る。処置の所望される作用としては、疾患の発症または再発を予防すること、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理結果の減少、転移を予防すること、疾患進行の速度を減少させること、疾患状態の軽減または緩和、ならびに寛解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるため、または疾患の進行を遅らせるために使用される。
抗体または免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＧは、免疫グロブリンの５つのタイプの中でもっとも安定しており、ヒトにおいては約２３日間の血清半減期を有する。ＩｇＡおよびＩｇＧは、さらに、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に細分類される。４つのＩｇＧサブクラスのそれぞれは、エフェクター機能として知られる異なる生物学的機能を有する。これらのエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用を通じて、および／またはＣ１ｑに結合し補体を固定することによって、媒介される。ＦｃγＲへの結合は、抗体依存性細胞媒介型細胞溶解または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）をもたらし得るが、一方で補体因子への結合は、補体によって媒介される細胞溶解または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらし得る。本発明の抗ＴｆＲ抗体、または抗ＴｆＲ抗体にコンジュゲートもしくは融合させようとする治療用もしくは診断用抗体は、エフェクター機能をまったく有さないかまたは最小限しか有さなくてよいが、ＦｃＲｎに結合するその能力は保持し、その結合は、抗体が長いインビボ半減期を有する主要な手段となり得る。
ＦｃγＲまたは補体（例えば、Ｃ１ｑ）の抗体への結合は、いわゆるＦｃ部分結合部位における定義されたタンパク質－タンパク質相互作用によって引き起こされる。そのようなＦｃ部分結合部位は、当該技術分野において公知である。そのようなＦｃ部分結合部位としては、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）が挙げられ、例えば、これによって特徴付けられる。一部の実施形態では、本発明の抗ＴｆＲ抗体、または抗ＴｆＲ抗体にコンジュゲートもしくは融合させようとする治療用もしくは診断用抗体は、エフェクター機能を排除するために、１つまたは複数のＦｃ部分結合部位における１つまたは複数の置換を含む。例えば、本発明の抗ＴｆＲ抗体、または抗ＴｆＲ抗体にコンジュゲートもしくは融合させようとする治療用もしくは診断用抗体は、以下の置換：残基２３３におけるプロリンとグルタミン酸との置換、残基２３４におけるアラニンまたはバリンとフェニルアラニンとの置換、および残基２３５におけるアラニンまたはグルタミン酸とロイシンとの置換のうちの１つまたは複数を含む、Ｆｃ領域を含み得る（ＥＵ番号付け、Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., NIH Publication no. 91-3242）。好ましくは、目的の抗体は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓ（ＥＵ番号付け、Ｋａｂａｔ）のうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を含む。
サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は、通常、Ｃ１ｑおよびＣ３結合を含む補体活性化を示し、一方で、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑおよび／またはＣ３に結合しない。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、他のＩｇＧサブタイプと比較して低減されたＦｃγＲおよび補体因子に結合する能力を有する。好ましくは、本発明の抗ＴｆＲ抗体、または抗ＴｆＲ抗体にコンジュゲートもしくは融合させようとする治療用もしくは診断用抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域を含む。より好ましくは、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を排除する置換を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。例えば、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域におけるＮ結合型グリコシル化部位を、残基２９７（ＥＵ番号付け）におけるＡｌａをＡｓｎと置換することによって除去することは、残留エフェクター活性を確実に排除する別の手段である。
抗ＴｆＲ抗体およびその抗原結合性断片
１つの一般的な態様では、本出願は、霊長類ＴｆＲ、例えば、ヒトＴｆＲまたはサルＴｆＲに結合する抗体またはその抗原結合性断片に関し、抗体またはその抗原結合性断片は、薬物を、それを必要とする対象の脳に送達するために最適化されている。抗ＴｆＲ抗体のＴｆＲに対する結合親和性と、トランスサイトーシス効率との間の関係性は、ＴｆＲに対する親和性の減少によりトランスサイトーシスが改善されるとして、これまでに説明されている（Yu, Zhang et al. 2011, Sci Transl Med 3(84): 84ra44）。本発明の発明者らは、驚くべきことに、結合速度および解離速度の両方からの影響が、脳内濃度に影響を及ぼすという、これまでに説明されていたものとはわずかに異なる親和性とトランスサイトーシス効率との間の関係性を発見した。具体的には、速すぎることも遅すぎることもない中間の解離速度が、薬剤（例えば、ｍＡｂ）が抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片によって効率的に送達されるための最適な脳内ＰＫおよびＰＤに必要である。
好ましくは、本出願の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、ｐＨ感受性であり、例えば、それは、異なるｐＨではＴｆＲに対する異なる結合親和性を有する。例えば、本出願の抗ＴｆＲ抗体は、中性ｐＨ、例えば、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）においては、高い親和性で細胞表面ＴｆＲに結合することができるが、エンドソームコンパートメントに内部移行されると、酸性ｐＨ、例えば、比較的低いｐＨ（ｐＨ５．０～６．０）において、ＴｆＲから解離される。親和性は、２つの部分の間、例えば、抗体と抗原との間の結合の強度の尺度である。親和性は、いくつかの手段で表すことができる。１つの手段は、相互作用の解離定数（ＫＤ）に関する。ＫＤは、平衡透析、または抗原－抗体の解離および結合の速度、それぞれ、ｋｏｆｆ（ｋｄもしくはｋｄｉｓ）およびｋｏｎ（もしくはｋａ）速度を直接的に測定することによるものを含め、日常的な方法によって測定することができる（例えば、Nature, 1993 361:186-87を参照されたい）。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比は、親和性に関連しないすべてのパラメーターを打ち消し、解離定数ＫＤに等しくなる（一般に、Davies et al., Annual Rev Biochem, 1990 59:439-473を参照されたい）。したがって、ＫＤの低さは、親和性の高さを意味する。親和性の別の表現は、Ｋａであり、これは、ＫＤの逆数、すなわちｋｏｎ／ｋｏｆｆである。したがって、Ｋａの高さは、親和性の高さを意味する。例えば、本出願の組成物および／または方法において使用するための抗体またはその抗原結合性断片は、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．８～７．８）、例えば、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）において、１ナノモル（ｎＭ、１０－９Ｍ）またはそれ以上のＫＤで、ＴｆＲに結合し、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．５～６．０）、例えば、ｐＨ５．０）において、１０－４秒－１またはそれ以上のｋｄｉｓで、ＴｆＲから解離する、抗体またはその断片であり得る。
したがって、本出願の一般的な態様は、薬剤を、それを必要とする対象の脳に送達するための抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片であって、中性ｐＨにおいて、少なくとも１ｎＭ、好ましくは、１ｎＭ～５００ｎＭの解離定数ＫＤで、酸性ｐＨ、好ましくは、ｐＨ５において、少なくとも１０－４秒－１、好ましくは、１０－４～１０－１秒－１の解離速度定数ｋｄで、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、好ましくは、ヒトＴｆＲ１に結合する、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片に関する。
一実施形態では、本出願の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、中性ｐＨにおいて、２×１０－２～２×１０－４秒－１、例えば、２×１０－２、１×１０－２、９×１０－３、８×１０－３、７×１０－３、６×１０－３、５×１０－３、４×１０－３、３×１０－３、２×１０－３、１×１０－３、９×１０－４、８×１０－４、７×１０－４、６×１０－４、５×１０－４、４×１０－４、３×１０－４、２×１０－４秒－１、またはこれらの間の任意の値の解離速度定数ｋｄを有する。
ある特定の実施形態では、ヒトＴｆＲに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、および９、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号３１７、３１８、および３１９、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３２４、３２５、および３２６、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号３３１、３３２、および３３３、または
（ｖ）それぞれ、配列番号３３８、３３９、および３４０
のアミノ酸配列を有する、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む、重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）抗体である。
好ましくは、それは、配列番号６、３１６、３２３、３３０、または３３７に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ断片である。
他の実施形態では、ヒトＴｆＲに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、
（ｉ）それぞれ、配列番号２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、および２９７、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、および２８４、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号５７、５８、５９、６０、６１、および６２、
（ｖ）それぞれ、配列番号８５、８６、８７、８８、８９、および９０、
（ｖｉ）それぞれ、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、および１１５、
（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および１４０、
（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、および１９６、
（ｉｘ）それぞれ、配列番号２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、および２４９、
（ｘ）それぞれ、配列番号２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、および２６８、
（ｘｉ）それぞれ、配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、および３５０、
（ｘｉｉ）それぞれ、配列番号３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、および３６０、
（ｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、および３７０、
（ｘｉｖ）それぞれ、配列番号３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、および３８０、
（ｘｖ）それぞれ、配列番号３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、および３９０、
（ｘｖｉ）それぞれ、配列番号３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、および４００、
（ｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、および４１０、
（ｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、および４２０、
（ｘｉｘ）それぞれ、配列番号４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、および４３０、
（ｘｘ）それぞれ、配列番号４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、および４４０、
（ｘｘｉ）それぞれ、配列番号４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、および４５０、
（ｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、および４６０、
（ｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、および４７０、
（ｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、および４８０、
（ｘｘｖ）それぞれ、配列番号４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、および４９０、
（ｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、および５００、
（ｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、および５１０、
（ｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、および５２０、
（ｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、および５３０、
（ｘｘｘ）それぞれ、配列番号５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、および５４０、または
（ｘｘｘｉ）それぞれ、配列番号５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、および５５０
のアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
他の実施形態では、本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に例証される抗体または抗原結合性断片と競合する。抗体または抗原の結合部位は、公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどによって判定することができる。ある特定の実施形態では、そのような競合する抗体は、例証された抗体またはその抗原結合性断片が結合するのと同じエピトープ（例えば、線形または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法は、Morris, G. E., (ed.), “Epitope Mapping Protocols,” In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, N.J. (1996)に提供されている。参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、参照抗体のその抗原への結合を、競合アッセイにおいて、５０％またはそれ以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、抗体のその抗原への結合を、競合アッセイにおいて、５０％またはそれ以上遮断する。
好ましくは、抗体またはその抗原結合性断片は、可動性リンカーを介して軽鎖可変領域（ＬＶ）に共有結合的に連結された重鎖可変領域（ＨＶ）を含む、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、もともとの免疫グロブリンの特異性を保持することができる。ｓｃＦｖにおいて、ドメインの順序は、ＨＶ－リンカー－ＬＶ、またはＬＶ－リンカー－ＨＶのいずれかであり得る。リンカーは、デノボで設計することができるか、または重大な立体障害を有することなくｓｃＦｖの可変ドメインを架橋するのに適合する長さおよび立体構造を提供する公知のタンパク質構造に由来してもよい。リンカーは、１０～約２５個のアミノ酸の長さを有し得る。好ましくは、リンカーは、ドメインがフォールディングし、インタクトな抗原結合性部位を形成する能力に影響を及ぼすことのない、可変ドメインのカルボキシ末端と他のドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍ（３５Å）に及ぶペプチドリンカーである（Huston et al., Methods in Enzymology, vol. 203, pp. 46-88, 1991、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。リンカーは、好ましくは、タンパク質フォールディングを通して可変ドメイン内または可変ドメイン間のペプチドのインターカレーションを回避するために、親水性配列を含む（Argos, Journal of Molecular Biology, vol. 211, no. 4, pp. 943-958, 1990）。例えば、リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基を含み得、かつ／または可溶性を増強させるためにＧｌｕ、Ｔｈｒ、およびＬｙｓなどの荷電残基が一緒に介在していてもよい。一実施形態では、リンカーは、配列番号３１４（ＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ）のアミノ酸配列を有する。任意の他の好適なリンカーもまた、本開示を踏まえて、使用することができる。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２７８、２９１、２８、５６、８４、１０９、１３４、１６２、１９０、２１８、２４３、２６２、３４４、３５４、３６４、３７４、３８４、３９４、４０４、４１４、４２４、４３４、４４４、４５４、４６４、４７４、４８４、４９４、５０４、５１４、５２４、５３４、または５４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、ＴｆＲ、好ましくは、ヒトＴｆＲ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、遊離システインを含まない。
抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ＶＨＨもしくはｓｃＦｖ断片）は、本開示を踏まえて、当該技術分野における好適な方法を使用して、産生させることができる。例えば、ＶＨＨまたはｓｃＦｖ断片は、抗体断片の産生に好適な条件下において、組換え宿主細胞（例えば、細菌、酵母、または哺乳動物細胞）を増殖させ、細胞培養物から断片を回収することによって、組換えで産生させることができる。
脳シャトル構築物
本質的なトランスサイトーシス効率を増強させ、末梢薬物動態を拡張し、治療用ｍＡｂの有効性を維持すると同時に許容可能な安全性プロファイルとなるように操作することによって、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を使用した最適化されたＲＭＴ脳送達プラットフォームが、開発されている。ヒトＴｆＲノックインマウスにおけるトランスサイトーシス受容体親和性と脳内濃度との間の相互作用が、研究されている。結合動態に関する十分な研究により、ｍＡｂの最適な脳内ＰＫおよびＰＤのためには、速すぎることも遅すぎることもない中間の解離速度が必要であることが示されている。マウスにおいて観察された増強された脳への送達が、カニクイザルにおいて確認された。
胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への増加した結合を有する操作された抗体定常領域が、末梢クリアランスの減少および脳内濃度の増強をもたらしたこともまた、発見されている。
Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）への結合を停止させ、エフェクター機能によって媒介される毒性を回避するために、追加のＦｃ突然変異が導入される。高親和性抗Ｔａｕ結合ｍＡｂと連結された場合、これらの突然変異は、末梢におけるエフェクター機能によって媒介される毒性を予防し、同時に、ミクログリア取り込みおよび標的分解のための新規な非ＦｃγＲ機序を通じて抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）を維持する。この機序は、ＴｆＲ受容体を通じた内部移行に依存し、炎症促進性サイトカインの分泌を刺激することなく、従来的なＦｃγＲによって媒介されるＡＤＰよりも標的分解の促進がより効率的である。本発明者らが知る限り、様々な治療適用に利用することができる、新規の効率的な非炎症性ファゴサイトーシス機序を表すＦｃγＲによって媒介されないＡＤＰに関する報告は、これが初めてである。
したがって、１つの一般的な態様では、本出願は、本出願の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片を含む、抗体標的化脳送達システムに関する。抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、治療剤または診断剤を、細胞（例えば、がん細胞）またはＢＢＢ系に送達するために使用することができる。送達することができる薬剤としては、任意の神経学的障害薬、または神経学的障害薬を検出もしくは分析するために使用することができる薬剤が挙げられる。例えば、そのような薬剤は、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）を含むがこれらに限定されない、神経栄養因子；サブスタンスＰ、神経ペプチドＹ、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、ガンマ－アミノ－酪酸（ＧＡＢＡ）、ドーパミン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、エンドルフィン、エンケファリン、およびチロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）を含むがこれらに限定されない、神経ペプチド；サイトカイン；抗不安剤；抗けいれん薬；例えば、低分子干渉ＲＮＡおよび／もしくはアンチセンスオリゴを含む、ポリヌクレオチドおよび導入遺伝子；または脳の標的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。本出願の抗ｈＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、目的の薬剤の、血液から脳への送達、およびそこでの機能を増強させるための有効な手段であり得る。
具体的には、目的の薬剤は、本出願の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片と組み合わされた形態、またはそれと連結された状態で、非経口で、例えば、静脈内に、送達することができる。例えば、薬剤は、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片に非共有結合的に結合していてもよい。薬剤はまた、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に結合されて、コンジュゲートを形成してもよい。ある特定の実施形態では、コンジュゲーションは、タンパク質融合体の構築によるもの（すなわち、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片および神経学的障害薬をコードする２つの遺伝子の遺伝子融合、ならびに単一のタンパク質としての発現によるもの）である。公知の方法を使用して、本開示を踏まえて、薬剤を、抗体またはその抗原結合性断片に連結することができる。例えば、Wu et al., Nat Biotechnol., 23(9):1137-46, 2005、Trail et al., Cancer Immunol Immunother., 52(5):328-37, 2003、Saito et al., Adv Drug Deliv Rev., 55(2):199-215, 2003、Jones et al., Pharmaceutical Research, 24(9):1759-1771, 2007を参照されたい。
一部の実施形態では、脳に送達しようとする治療剤または診断剤、ならびに抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、非ペプチドリンカーまたはペプチドリンカーを介して、一緒に共有結合的に連結され得る（またはコンジュゲートされ得る）。非ペプチドリンカーの例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、デキストラン、ポリビニルエーテル、生体分解性ポリマー、重合脂質、キチン、およびヒアルロン酸、またはこれらの誘導体、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドリンカーは、ペプチド結合またはその誘導体によって連結された１～５０個のアミノ酸からなるペプチド鎖であってもよく、そのＮ末端およびＣ末端は、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に連結され得る。
ある特定の実施形態では、本出願のコンジュゲートは、ＴｆＲに結合する第１の抗原結合性領域と、脳の抗原、例えば、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、ｔａｕ、および本明細書に開示される他の脳の抗原に結合する第２の抗原結合性領域とを含む、多重特異性抗体である。多重特異性抗体を作製するための技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537, 1983）、国際公開第ＷＯ ９３／０８８２９号、およびTraunecker et al, EMBO J. 10: 3655, 1991を参照されたい）、ならびに「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、静電ステアリング作用を操作すること（国際公開第ＷＯ ２００９／０８９００４号Ａ１）、２つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号およびBrennan et al, Science, 229: 81, 1985を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al, J. Immunol., 148(5): 1547-1553,1992)を使用すること）、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448, 1993)を参照されたい）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994)を参照されたい）、ならびに例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60, 1991に記載される三重特異性抗体を調製することによって、作製することができる。本出願の多重特異性抗体はまた、３つまたはそれ以上の機能性抗原性結合部位を有する抗体を包含し、これには、「オクトパス抗体」または「二重可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）が挙げられる（例えば、米国出願第ＵＳ２００６／００２５５７６号Ａ１、Wu et al. Nature Biotechnology, 25(11):1290-7, 2007を参照されたい）。本出願の多重特異性抗体は、ＴｆＲならびに脳の抗原（例えば、ＢＡＣＥ１またはＴａｕ）に結合する抗原結合性領域を含む、「二重作用性Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」も包含する（米国出願公開第ＵＳ２００８／００６９８２０号を参照されたい）。一実施形態では、抗体は、抗体断片であり、様々なそのような断片が、本明細書に開示されている。
一実施形態では、本出願の多重特異性抗体は、第２の抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に連結（または融合）された本出願の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片を含む、融合構築物である。好ましくは、第２の抗体またはその抗原結合性断片は、脳の標的、例えば、ＢＡＣＥ、ｔａｕ、または他の脳の抗原、例えば、本明細書に記載されるものに結合する。抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、直接的に、またはリンカーを介して、第２の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖および／または重鎖のカルボキシ末端および／またはアミノ末端に融合され得る。
一実施形態では、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、直接的に、またはリンカーを介して、第２の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖のカルボキシ末端に融合される。
別の実施形態では、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、直接的に、またはリンカーを介して、第２の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖のアミノ末端に融合される。
別の実施形態では、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、直接的に、またはリンカーを介して、第２の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖のカルボキシ末端に融合される。
別の実施形態では、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片は、直接的に、またはリンカーを介して、第２の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖のアミノ末端に融合される。
好ましい実施形態では、本出願の融合構築物は、リンカーを介して、脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片の２つの重鎖のうちの一方のみのカルボキシ末端に共有結合的に連結された、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片、好ましくは、本出願の抗ｈｕＴｆＲ１ ＶＨＨまたはｓｃＦｖ断片を含む。好ましくは、リンカーは、配列番号３１２または配列番号３１３のアミノ酸配列を有する。
２つの重鎖間、例えば、抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片の融合体を有するものと有さないものとの間、または抗ＴｆＲアームのためのＦｃを含むものと抗脳標的アームのためのものとの間のヘテロ二量体の形成を促進するために、ヘテロ二量体突然変異が、２つの重鎖のＦｃに導入される。そのようなＦｃ突然変異の例としては、Ｚｙｍｅｗｏｒｋ突然変異（例えば、米国特許第１０，４５７，７４２号を参照されたい）および「ノブ・イン・ホール」突然変異（例えば、Ridgway et al., Protein Eng., 9(7): 617-621, 1996を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。他のヘテロ二量体突然変異もまた、本発明において使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変されたＣＨ３が、２つの重鎖間のヘテロ二量体の形成を促進するために使用される。
ヘテロ二量体突然変異に加えて、他の突然変異もまた導入され得る。一部の実施形態では、融合構築物または二重特異性抗体のＦｃ領域は、さらに、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを変更する（増加もしくは減少させる）、好ましくは、排除する、１つもしくは複数の突然変異（例えば、本明細書に記載されるＡＡＳ突然変異）、ならびに／またはＦｃＲｎへの融合構築物もしくは二重特異性抗体の結合を変更する（増加もしくは減少させる）、好ましくは、増加させる、１つもしくは複数の突然変異（例えば、本明細書に記載されるＹＴＥ突然変異）を含む。一部の実施形態では、融合構築物または二重特異性抗体における１つまたは複数のシステイン残基が、他のアミノ酸、例えば、セリンと置換される。
ある特定の実施形態では、本出願の融合構築物は、
（１）配列番号３０１、３０４、３０７、２８５、２８８、２９８、１０、１３、１６、１９、２２、２５、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２５０、２５２、２５６、２５９、２６９、２７２、２７５、３２０、３２７、３３４、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、および４７１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第１の重鎖と、
（２）それぞれ３０２、３０５、３０８、２８６、２８９、２９９、１１、１４、１７、２０、２３、２６、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２５１、２５３、２５７、２６０、２７０、２７３、２７６、３２１、３２８、３３５、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、および４７２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を、それぞれが独立して有する、２つの軽鎖と、
（３）それぞれ３０３、３０６、３０９、２８７、２９０、３００、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２５２、２５４、２５８、２６１、２７１、２７４、２７７、３２２、３２９、３３６、３４３、３５３、３６３、３７３、３８３、３９３、４０３、４１３、４２３、４３３、４４３、４５３、４６３、および４７３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第２の重鎖と
を含む。
本出願のコンジュゲート、例えば、多重特異性抗体または融合構築物は、本開示を踏まえて、当該技術分野において公知のいくつかの技法のうちのいずれかによって産生させることができる。例えば、それは、融合構築物または多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが、標準的な技法によって宿主細胞にトランスフェクトされた、組換え宿主細胞から発現させることができる。宿主細胞は、原核生物宿主細胞であってもよく、または真核生物宿主細胞であってもよい。
例示的な系では、本出願の融合構築物のヘテロ二量体の２つの重鎖および軽鎖をコードする１つまたは複数の組換え発現ベクターは、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって、宿主細胞に導入される。選択された形質転換体宿主細胞を、融合構築物を産生させるのに十分な条件下において、重鎖および軽鎖の発現を可能にするように培養し、融合構築物を、培養培地から回収する。標準的な分子生物学技法を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地からタンパク質構築物を回収する。
本出願は、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかまたは特許請求の範囲のうちのいずれかにおける、単独または融合構築物もしくは多重特異性抗体の一部としての、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供する。単離された核酸は、ベクター、好ましくは、発現ベクターの一部であってもよい。
別の態様では、本出願は、本明細書に開示されるベクターが形質転換された宿主細胞に関する。ある実施形態では、宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、大腸菌（E. coli）である。別の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、ＰＥＲ．Ｃ６を含むがこれらに限定されない、哺乳動物細胞、または真菌細胞、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、または昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９である。
医薬組成物および関連する方法
本発明はまた、医薬組成物、その調製方法、およびその使用方法にも関する。
別の一般的な態様において、本発明は、本発明の抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。本発明の抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、またはコンジュゲート（例えば、多重特異性抗体もしくは融合構築物）はまた、本明細書に言及される治療適用のための医薬の製造においても有用である。薬学的に許容される担体は、任意の好適な賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、緩衝化剤、安定化剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソームカプセル封入、または医薬製剤における使用について当該技術分野において周知の他の材料であり得る。担体、賦形剤、または希釈剤の特徴は、具体的な適用の投与経路に依存するであろうことが、理解されるであろう。
したがって、一実施形態では、本出願は、治療剤または診断剤を、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送する方法であって、治療剤または診断剤に連結された抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片を、血液脳関門に曝露するステップを含み、結果として抗体またはその抗原結合性断片が、そこに連結された薬剤を、血液脳関門を越えて輸送することになる、方法に関する。一実施形態では、薬剤は、神経学的障害薬である。別の実施形態では、薬剤は、イメージング剤、または神経学的障害を検出するための薬剤である。好ましくは、抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートは、ＴｆＲのその天然のリガンドであるトランスフェリンへの結合を損なわない。抗体は、それが、ＴｆＲのトランスフェリンへの結合を阻害しない様式で、ＴｆＲに特異的に結合する。一部の実施形態では、ＢＢＢは、哺乳動物、好ましくは、霊長類、例えば、ヒト、より好ましくは、神経学的障害を有するヒトにおけるものである。一実施形態では、神経学的障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、ページェット病、がん、および外傷性脳損傷からなる群から選択される。
一実施形態では、本出願の抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートは、症状の発生前に神経学的障害を検出するため、および／または疾患もしくは障害の重症度もしくは期間を評価するために、使用される。抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲートは、放射線撮影法、断層撮影法、または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によるイメージングを含め、神経学的障害の検出および／またはイメージングを可能にする。
別の実施形態では、抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートは、処置を必要とする対象に、有効量の抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートを投与するステップを含む、神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）の処置において、使用される。一部の実施形態では、本方法は、さらに、対象に、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与するステップを含む。
別の実施形態では、本出願は、医薬の製造または調製における、本出願の抗ＴｆＲ抗体もしくは抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートの使用に関する。一実施形態では、医薬は、神経学的疾患または障害の処置のためのものである。さらなる実施形態では、医薬は、神経学的疾患または障害を有する個体に、有効量の医薬を投与するステップを含む、神経学的疾患または障害を処置する方法における使用のためのものである。
本出願の別の一般的な態様は、抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）の誘導を、それを必要とする対象において、炎症促進性サイトカインの分泌を刺激することなく行う方法であって、対象に、本出願の実施形態による抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片に連結、好ましくは、共有結合的にコンジュゲートされた、治療用抗体またはその抗原結合性断片を含む、複合体を投与するステップを含み、治療用抗体またはその抗原結合性断片が、エフェクター機能を有さない、方法に関する。例えば、治療用抗体またはその抗原結合性断片は、エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを低減または排除する１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、Ｆｃガンマ受容体への結合を低減または停止させる突然変異を含み得る。そのような突然変異は、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位におけるもの、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異であり得、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである。一実施形態では、治療用抗体またはその抗原結合性断片は、ｔａｕ凝集体に特異的に結合する。
一部の実施形態では、本方法は、さらに、対象に、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片またはコンジュゲートが処置に利用されるものと同じかまたは異なる神経学的障害を処置するのに有効な治療剤である。例示的な追加の治療剤としては、上述の様々な神経学的薬物、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル、ガランタミン、ロバスチグミン（rovastigmine）、およびタクリン）、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン）、アミロイドベータペプチド凝集阻害剤、抗酸化剤、γ－セクレターゼモジュレーター、神経増殖因子（ＮＧＦ）模倣体またはＮＧＦ遺伝子療法、ＰＰＡＲｙアゴニスト、ＨＭＳ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤（スタチン）、アムパキン（ampakine）、カルシウムチャネル遮断剤、ＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤、静脈内免疫グロブリン、ムスカリン受容体アゴニスト、ニクロチン（nicrotinic）受容体モジュレーター、能動的または受動的アミロイドベータペプチド免疫付与、ホスホジエステラーゼ阻害剤、セロトニン受容体アンタゴニスト、ならびに抗アミロイドベータペプチド抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、神経学的薬物の１つまたは複数の副作用を軽減するその能力に関して、選択される。追加の治療剤は、同じかまたは別個の製剤で投与することができ、抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片またはコンジュゲートと一緒または別個に投与することができる。本出願の抗ＴｆＲ抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートは、追加の治療剤および／またはアジュバントの投与の前に、それと同時に、および／またはその後に、投与することができる。本出願の抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片またはコンジュゲートはまた、放射線療法、行動療法、または当該技術分野において公知であり、処置もしくは予防しようとする神経学的障害に適切な他の治療などであるがこれらに限定されない、他の介入治療と組み合わせて使用することもできる。
本出願の抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片またはコンジュゲート（および任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、および鼻内、ならびに所望される場合には局所処置、病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって、投与することができる。非経口注入としては、投与が短期間であるか慢性的であるかに部分的に応じて、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。単回投与または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むがこれらに限定されない、様々な投薬スケジュールが、本明細書において企図される。
疾患の予防または処置に関して、本出願の抗ＴｆＲ抗体もしくはその抗原結合性断片またはコンジュゲート（単独で、または１つもしくは複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）の適切な投薬量は、様々な要因、例えば、処置しようとする疾患のタイプ、抗体またはコンジュゲートのタイプ、疾患の重症度および経過、抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲートが、予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、これまでの治療、患者の臨床病歴および抗体に対する応答、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、ならびに担当医師の判断に依存するであろう。処置投薬量は、最適には、安全性および有効性を最適化するために、滴定される。抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲートは、好適には、一回、または一連の処置にわたって、患者に投与される。
特定の実施形態によると、治療有効量は、以下の作用のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を達成するのに十分である、治療の量を指す：（ｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の重症度を低減または緩和すること、（ｉｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の持続期間を低減させること、（ｉｉｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の進行を予防すること、（ｉｖ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の退縮を引き起こすこと、（ｖ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の発症または発生を予防すること、（ｖｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の再発を予防すること、（ｖｉｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状を有する対象の入院を低減させること、（ｖｉｉｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状を有する対象の入院の長さを低減させること、（ｉｘ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状を有する対象の生存期間を増加させること、（ｘｉ）対象における処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状を阻害または低減させること、ならびに／あるいは（ｘｉｉ）別の治療の予防作用または治療作用を増強または改善すること。
別の態様では、本出願は、上記に記載される障害の処置、予防、および／または診断に有用な材料を含む、製品（例えば、キット）に関し、それが提供される。製品は、容器、および容器上または容器と関連するラベルもしくは添付文書を含む。好適な容器としては、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、組成物を、それ自体で、または状態の処置、予防、および／もしくは診断に有効な別の組成物との組合せで保持し、滅菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射用ニードルによって穿刺可能なストッパーを有する、静注バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本出願の抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲートである。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）本出願の抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲートを含む組成物が中に含まれる第１の容器、および（ｂ）さらなる細胞毒性剤またはそれ以外の治療剤を含む組成物が中に含まれる第２の容器を含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、さらに、組成物が、特定の状態を処置するために使用することができることを示す、添付文書を含み得る。必要に応じて、製品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液を含む、第２の（または第３の）容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、およびシリンジを含め、商業上および使用者の観点から望ましい他の材料を、さらに含んでもよい。
実施形態
また、本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
１．薬剤を、それを必要とする対象の脳に送達するための抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片であって、中性ｐＨにおいて、少なくとも１ｎＭの解離定数ＫＤで、ならびに酸性ｐＨ、好ましくは、ｐＨ５において、少なくとも１０－４秒－１の解離速度定数ｋｄで、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、好ましくは、ヒトＴｆＲ１に結合する、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
１ａ． 中性ｐＨにおいて、１ｎＭ～５００ｎＭ、例えば１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、またはその間の任意の値の解離定数ＫＤを有する、実施形態１に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
１ｂ． 酸性ｐＨにおいて、１０－４秒－１～１０－１秒－１、例えば１０－４、１０－３、１０－２、１０－１秒－１、またはその間の任意の値の解離速度定数ｋｄを有する、実施形態１または１ａに記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
２． 中性ｐＨにおいて、２×１０－２～２×１０－４秒－１、好ましくは、２．０×１０－３秒－１の解離速度定数ｋｄを有する、実施形態１～１ｂのいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
２ａ． 中性ｐＨにおける解離速度定数ｋｄが、２×１０－２～２×１０－４秒－１、例えば２×１０－２、１×１０－２、９×１０－３、８×１０－３、７×１０－３、６×１０－３、５×１０－３、４×１０－３、３×１０－３、２×１０－３、１×１０－３、９×１０－４、８×１０－４、７×１０－４、６×１０－４、５×１０－４、４×１０－４、３×１０－４、２×１０－４秒－１、またはその間の任意の値である、実施形態２に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
３．
（１）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、
ｉ．それぞれ、配列番号２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、および２９７、
ｉｉ．それぞれ、配列番号２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、および２８４、
ｉｉｉ．それぞれ、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４、
ｉｖ．それぞれ、配列番号５７、５８、５９、６０、６１、および６２、
ｖ．それぞれ、配列番号８５、８６、８７、８８、８９、および９０、
ｖｉ．それぞれ、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、および１１５、
ｖｉｉ．それぞれ、配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および１４０、
ｖｉｉｉ．それぞれ、配列番号１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、および１９６、
ｉｘ．それぞれ、配列番号２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、および２４９、
ｘ．それぞれ、配列番号２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、および２６８、
ｘｉ．それぞれ、配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、および３５０、
ｘｉｉ．それぞれ、配列番号３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、および３６０、
ｘｉｉｉ．それぞれ、配列番号３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、および３７０、
ｘｉｖ．それぞれ、配列番号３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、および３８０、
ｘｖ．それぞれ、配列番号３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、および３９０、
ｘｖｉ．それぞれ、配列番号３９５、３９６、３７７、３９８、３９９、および４００、
ｘｖｉｉ．それぞれ、配列番号４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、および４１０、
ｘｖｉｉｉ．それぞれ、配列番号４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、および４２０、
ｘｉｘ．それぞれ、配列番号４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、および４３０、
ｘｘ．それぞれ、配列番号４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、および４４０、
ｘｘｉ．それぞれ、配列番号４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、および４５０、
ｘｘｉｉ．それぞれ、配列番号４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、および４６０、
ｘｘｉｉｉ．それぞれ、配列番号４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、および４７０、
ｘｘｉｖ．それぞれ、配列番号４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、および４８０、
ｘｘｖ．それぞれ、配列番号４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、および４９０、
ｘｘｖｉ．それぞれ、配列番号４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、および５００、
ｘｘｖｉｉ．それぞれ、配列番号５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、および５１０、
ｘｘｖｉｉｉ．それぞれ、配列番号５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、および５２０、
ｘｘｉｘ．それぞれ、配列番号５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、および５３０、
ｘｘｘ．それぞれ、配列番号５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、および５４０、もしくは
ｘｘｘｉ．それぞれ、配列番号５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、および５５０
のアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、
または
（２）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）であって、
ｉ．それぞれ、配列番号７、８、および９、
ｉｉ．それぞれ、配列番号３１７、３１８、および３１９、
ｉｉｉ．それぞれ、配列番号３２４、３２５、および３２６、
ｉｖ．それぞれ、配列番号３３１、３３２、および３３３、もしくは
ｖ．それぞれ、配列番号３３８、３３９、および３４０
のアミノ酸配列を有する、重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）
を含む、実施形態１から２ａのいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
４． 配列番号６、３１６、３２３、３３０、または３３７に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ断片である、実施形態３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４ａ． ＶＨＨ断片が、配列番号６、３１６、３２３、３３０、または３３７のアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５． 約１０～約２５アミノ酸長を有するペプチドリンカーなどのリンカーを介して軽鎖可変領域（ＶＬ）に共有結合的に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ａ． ＶＨが、ｓｃＦｖにあるリンカーを介してＶＬのアミノ末端に連結されている、実施形態５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｂ． ＶＨが、ｓｃＦｖにあるリンカーを介してＶＬのカルボキシ末端に連結されている、実施形態５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｃ． リンカーが、ＧｌｙおよびＳｅｒのうちの１つまたは複数を含み、１つまたは複数のＧｌｕ、Ｔｈｒ、およびＬｙｓ残基が散在しており、好ましくは、リンカーが配列番号３１４のアミノ酸配列を有する、実施形態５ａまたは５ｂに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｄ． ｓｃＦｖが、それぞれ、配列番号２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、および２８４のアミノ酸配列、またはそれぞれ、配列番号２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、および２９７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、実施形態５ｃに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｅ． ｓｃＦｖが、配列番号２７８、２９１、２８、５６、８４、１０９、１３４、１６２、１９０、２１８、２４３、２６２、３４４、３５４、３６４、３７４、３８４、３９４、４０４、４１４、４２４、４３４、４４４、４５４、４６４、４７４、４８４、４９４、５０４、５１４、５２４、５３４、または５４４に対して少なくとも８０％、例えば８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｆ． ｓｃＦｖが、配列番号２７８、２９１、２８、５６、８４、１０９、１３４、１６２、１９０、２１８、２４３、２６２、３４４、３５４、３６４、３７４、３８４、３９４、４０４、４１４、４２４、４３４、４４４、４５４、４６４、４７４、４８４、４９４、５０４、５１４、５２４、５３４、または５４４のアミノ酸配列を含む、実施形態５ｅに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｇ． ｓｃＦｖが、配列番号２７８、２９１、１６２、または２１８のアミノ酸配列を含む、実施形態５ｅに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｈ． 実施形態３から５ｇのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合性断片。
５ｉ． ＴｆＲに対する結合を、実施形態３から５ｇのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体またはその抗原結合性断片。
５ｊ． ｐＨ７．４において、１～５００ｎＭ、例えば１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、またはその間の任意の値の解離定数ＫＤでヒトＴｆＲ１に結合する、実施形態３から５ｉのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｋ． ｐＨ５において、１０－４～１０－１秒－１、例えば１０－４、１０－３、１０－２、１０－１秒－１、またはその間の任意の値の解離速度定数ｋｄでヒトＴｆＲ１に結合する、実施形態３から５ｊのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６． 治療剤または診断剤に連結された、実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む複合体。
６ａ． 抗体またはその抗原結合性断片が、治療剤または診断剤に非共有結合的に連結されている、実施形態６に記載の複合体。
６ｂ． 抗体またはその抗原結合性断片が、治療剤または診断剤に共有結合的に連結されてコンジュゲートを形成している、実施形態６に記載の複合体。
６ｃ． 抗体またはその抗原結合性断片が、リンカーを介して治療剤または診断剤に共有結合的に連結されている、実施形態６に記載の複合体。
６ｄ． リンカーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエーテル、生分解性ポリマー、重合脂質、キチン、およびヒアルロン酸、またはそれらの誘導体、またはそれらの組合せなどの非ペプチドリンカーである、実施形態６ｃに記載の複合体。
６ｅ． リンカーが、ペプチド結合によって連結された１～５０個のアミノ酸からなるペプチド鎖などのペプチドリンカーまたはその誘導体である、実施形態６ｃに記載の複合体。
６ｆ． 抗体またはその抗原結合性断片が、神経学的障害を検出するための診断剤に連結されており、好ましくは、診断剤が、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の薬剤またはＩＤＫ用の薬剤である、実施形態６から６ｅのいずれか一項に記載の複合体。
６ｇ． 抗体またはその抗原結合性断片が、治療剤、好ましくは神経学的障害薬に連結されている、実施形態６から６ｅのいずれか一項に記載の複合体。
６ｈ． 神経学的障害薬が、小分子化合物、抗体、ペプチド、タンパク質、１つまたは複数のＣＮＳ標的の天然リガンド、１つまたは複数のＣＮＳ標的の天然リガンドの修飾型、アプタマー、阻害性核酸（つまり、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、および上述のものの活性断片からなる群から選択される、実施形態６ｇに記載の複合体。
６ｉ． 神経学的障害薬が、これらに限定されないが、アミロイド前駆体タンパク質またはその部分、アミロイドベータ、ベータ－セクレターゼ、ガンマ－セクレターゼ、Ｔａｕ、アルファ－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、神経膠腫または他のＣＮＳがんマーカー、およびニューロトロフィンなどの、ＣＮＳ抗原もしくは標的分子それ自体であるかまたはそれらを特異的に認識および／もしくはそれらに対して作用する（つまり、阻害する、活性化する、または検出する）抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、阻害性核酸、および小分子、ならびに上述のもののいずれかの活性断片からなる群から選択され、神経学的障害薬およびそれらを使用して治療することができる対応する障害の非限定的な例は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、慢性脳傷害（神経発生）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）、抗上皮増殖因子受容体 脳がん、（ＥＧＦＲ）抗体、グリア細胞株由来神経因子 パーキンソン病、（ＧＤＮＦ）、脳来神経栄養因子（ＢＤＮＦ） 筋萎縮性側索硬化症、うつ病、脳のリソソーム酵素リソソーム貯蔵障害、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ） 筋萎縮性側索硬化症、ニューレグリン１統合失調症、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ） ＨＥＲ２陽性がんからの脳転移である、実施形態６ｇに記載の複合体。
７． ＴｆＲに結合する第１の抗原結合性領域および脳抗原（または脳標的）に結合する第２の抗原結合性領域を含む多重特異性抗体であり、第１の抗原結合性領域が、実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載のその抗原結合性断片を含む、実施形態６に記載の複合体。
７ａ． 脳標的が、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６からなる群から選択される、実施形態７に記載の多重特異性抗体。
７ｂ． 第２の抗原結合性領域が、ＢＡＣＥ１またはＴａｕに結合する、実施形態７ａに記載の多重特異性抗体。
７ｃ． 第１の抗原結合性領域が、第１のＦｃに共有結合的に連結されており、第２の抗原結合性領域が、第２のＦｃに共有結合的に連結されている、実施形態７から７ｂのいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
７ｄ． 第１のＦｃは、第１のＦｃと第２のＦｃとのヘテロ二量体形成を促進するために、１つまたは複数のアミノ酸残基が第２のＦｃとは異なる、実施形態７ｃに記載の多重特異性抗体。
８． 脳抗原（または脳標的）に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に連結されている実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む融合構築物である、実施形態７から７ｄのいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
８ａ． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖のアミノ末端に、好ましくはリンカーを介して共有結合的に連結されている、実施形態８に記載の融合構築物。
８ｂ． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖のアミノ末端に、好ましくはリンカーを介して共有結合的に連結されている、実施形態８に記載の融合構築物。
８ｃ． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖のカルボキシ末端に、好ましくはリンカーを介して共有結合的に連結されている、実施形態８に記載の融合構築物。
８ｄ． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖のカルボキシ末端に、好ましくはリンカーを介して共有結合的に連結されている、実施形態８に記載の融合構築物。
９． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の２つの重鎖のうちの一方のみのカルボキシ末端に、リンカーを介して共有結合的に連結されている、実施形態８ｄに記載の融合構築物。
９ａ． リンカーが、ＧｌｙおよびＳｅｒのうちの１つまたは複数を含むペプチドリンカーであり、好ましくは、リンカーが、配列番号３１２または配列番号３１３のアミノ酸配列を有する、実施形態８ａから９のいずれか一項に記載の融合構築物。
９ｂ． 第２の抗体またはその抗原結合性断片が、その第１の重鎖に第１のＦｃを含み、その第２の重鎖に第２のＦｃを含み、第１のＦｃは、第１のＦｃと第２のＦｃとのヘテロ二量体の形成を促進するために、１つまたは複数のアミノ酸残基が第２のＦｃとは異なる、実施形態８から９ａのいずれか一項に記載の融合構築物。
９ｃ． 第１のＦｃが１つまたは複数の「ノブ」突然変異を含み、第２のＦｃが１つまたは複数の対応する「ホール」突然変異を含むかまたはその逆であり（例えば、「ノブ・イン・ホール」突然変異については、米国特許第５，７３１，１６８号明細書、Ridgway et al., Protein Eng., 9(7): 617-621, 1996を参照。これら文献は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、好ましくはノブ突然変異はＴ３６６Ｗであり、ホール突然変異はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖである、実施形態７ｄに記載の多重特異性抗体または実施形態９ｂに記載の融合構築物。
９ｄ． 第１のＦｃおよび第２のＦｃの各々が、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含み、好ましくは改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、米国特許第１０，４５７，７４２号明細書に記載の１つまたは複数の突然変異を含む、実施形態７ｄに記載の多重特異性抗体または実施形態９ｂに記載の融合構築物。
９ｅ． 第１のＦｃの改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、Ｔ３５０位、Ｌ３５１位、Ｆ４０５位、およびＹ４０７位にアミノ酸改変を含み、第２のＦｃの改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、Ｔ３５０位、Ｔ３６６位、Ｋ３９２位、およびＴ３９４位にアミノ酸改変を含む、実施形態９ｄに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
９ｆ． Ｔ３５０位のアミノ酸修飾が、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３５０Ｉ、Ｔ３５０Ｌ、またはＴ３５０Ｍであり、Ｌ３５１位のアミノ酸改変がＬ３５１Ｙであり、Ｆ４０５位のアミノ酸改変が、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、またはＦ４０５Ｓであり、Ｙ４０７位のアミノ酸改変が、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ａ、またはＹ４０７Ｉであり、Ｔ３６６位のアミノ酸改変が、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｍであり、Ｋ３９２位のアミノ酸改変が、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｌ、またはＫ３９２Ｍであり、Ｔ３９４位のアミノ酸改変がＴ３９４Ｗである、実施形態９ｅに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
９ｇ． 第１のＦｃの改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃの改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含むか、またはその逆である、実施形態９ｅに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１０． 多重特異性抗体または融合構築物のＦｃ領域が、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する第２の抗体またはその抗原結合性断片の結合を変更する（増加または減弱させる）、好ましくは増加させる置換をさらに含む、実施形態７から９ｇのいずれか一項に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１０ａ． 第２の抗体またはその抗原結合性断片が、融合体と胎児性Ｆｃ受容体（ＲｃＲｎ）との結合を増強する１つまたは複数の突然変異をＦｃドメインに含む、実施形態１０に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１０ｂ． １つまたは複数の突然変異が、酸性ｐＨにおける結合を増強させる、実施形態１０または１０ａに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１０ｃ． 第２の抗体のＦｃが、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）突然変異を有し、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスに従う、実施形態１０ｂに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１１． 多重特異性抗体または融合構築物のＦｃ領域が、エフェクター機能を変更する（増加または減弱させる）、好ましくは低減または排除する置換をさらに含む、実施形態７から１０ｃのいずれか一項に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１１ａ． 第２の抗体またはその抗原結合性断片が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能を低減または排除する１つまたは複数の突然変異をＦｃドメインに含む、実施形態１１に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１１ｂ． 第２の抗体のＦｃが、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位に１つまたは複数のアミノ酸改変を有し、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスに従う、実施形態１１ａに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１１ｃ． 第２の抗体のＦｃが、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つまたは３つの突然変異（ＡＡＳ突然変異）を有する、実施形態１１ｂに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１２． 第１の抗原結合性領域または抗体もしくはその抗原結合性断片がシステインを含まない、実施形態７から１１ｃのいずれか一項に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１３． 第２の抗原結合性領域または第２の抗体もしくはその抗原結合性断片が、Ｔａｕに結合し、好ましくは、それぞれ配列番号５５４～５５９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、第２の抗体が、配列番号３１０のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号３１１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含むモノクローナル抗体である、請求項７から１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１４．
（１）配列番号３０１、３０４、３０７、２８５、２８８、２９８、１０、１３、１６、１９、２２、２５、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２５０、２５２、２５６、２５９、２６９、２７２、２７５、３２０、３２７、３３４、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、および４７１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第１の重鎖と、
（２）それぞれ３０２、３０５、３０８、２８６、２８９、２９９、１１、１４、１７、２０、２３、２６、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２５１、２５３、２５７、２６０、２７０、２７３、２７６、３２１、３２８、３３５、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、および４７２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を、それぞれが独立して有する、２つの軽鎖と、
（３）それぞれ３０３、３０６、３０９、２８７、２９０、３００、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２５２、２５４、２５８、２６１、２７１、２７４、２７７、３２２、３２９、３３６、３４３、３５３、３６３、３７３、３８３、３９３、４０３、４１３、４２３、４３３、４４３、４５３、４６３、および４７３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第２の重鎖と
を含む、実施形態９に記載の融合構築物。
１４ａ． ２つの軽鎖が同一のアミノ酸配列を有する、実施形態１４に記載の融合構築物。
１４ｂ． ２つの軽鎖が異なるアミノ酸配列を有する、実施形態１４に記載の融合構築物。
１４ｃ．
（１）第１の重鎖が、配列番号３０１、３０４、３０７、２８５、２８８、２９８、１０、１３、１６、１９、２２、２５、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２５０、２５２、２５６、２５９、２６９、２７２、２７５、３２０、３２７、３３４、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、および４７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
（２）２つの軽鎖は、それぞれ３０２、３０５、３０８、２８６、２８９、２９９、１１、１４、１７、２０、２３、２６、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２５１、２５３、２５７、２６０、２７０、２７３、２７６、３２１、３２８、３３５、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、および４７２からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有し、
（３）第２の重鎖が、それぞれ３０３、３０６、３０９、２８７、２９０、３００、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２５２、２５４、２５８、２６１、２７１、２７４、２７７、３２２、３２９、３３６、３４３、３５３、３６３、３７３、３８３、３９３、４０３、４１３、４２３、４３３、４４３、４５３、４６３、および４７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、
実施形態１４に記載の融合構築物。
１４ｄ．
（１）第１の重鎖が、配列番号２８５、２８８、２９８、または３０１のアミノ酸配列を有し、
（２）２つの軽鎖が、それぞれ２８６、２８９、２９９、または３０２のアミノ酸配列をそれぞれ有し、
（３）第２の重鎖が、それぞれ２８７、２９０、３００、または３０３のアミノ酸配列を有する、
実施形態１４に記載の融合構築物。
１５． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または実施形態７から１４ｄのいずれか一項に記載の融合構築物をコードする、単離された核酸。
１６． 請求項１５に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
１７． 実施形態１５に記載の核酸または実施形態１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
１８． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、または実施形態７から１４ｄのいずれか一項に記載の融合構築物を産生させる方法であって、抗体もしくは抗原結合性断片または融合構築物をコードする核酸を含む細胞を、抗体もしくは抗原結合性断片または融合構築物を産生させる条件下において培養するステップと、抗体もしくは抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物を、細胞または細胞培養物から回収するステップとを含む、方法。
１９． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、実施形態６から６ｉのいずれか一項に記載の複合体、または請求項７から１４ｄのいずれか一項に記載の多重特異性抗体もしくは融合構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
２０． それを必要とする対象の神経学的障害を処置または検出する方法であって、実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、実施形態６から６ｉのいずれか一項に記載の複合体、または実施形態７から１４ｄのいずれか一項に記載の多重特異性抗体もしくは融合構築物、または実施形態１９に記載の医薬組成物の有効量を、対象に投与するステップを含む、方法。
２１． それを必要とする対象の脳への治療剤または診断剤の送達を増加させる方法であって、対象に、実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片に連結された治療剤または診断剤を含むコンジュゲートを投与するステップを含む、方法。
２２． 血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて治療剤または診断剤を輸送する方法であって、治療剤または診断剤に連結された、実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片を、抗体またはその抗原結合性断片が、それに連結された薬剤が血液脳関門を越えて輸送されるように血液脳関門に曝露するステップを含む、方法。
２３． 治療剤または診断剤を、それを必要とする対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて送達する方法であって、対象に、実施形態１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片に連結、好ましくは共有結合的にコンジュゲートされた治療剤または診断剤を含む複合体を投与するステップを含む、方法。
２４． 抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）の誘導を、それを必要とする対象において、炎症促進性サイトカインの分泌を刺激することなく行う方法であって、対象に、実施形態１から５のいずれか一項に記載のその抗原結合性断片に連結、好ましくは共有結合的にコンジュゲートされた治療用抗体またはその抗原結合性断片を含む複合体を投与するステップを含み、治療用抗体またはその抗原結合性断片が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能を低減または排除する１つまたは複数の突然変異をＦｃドメインに含む、方法。
２４ａ． 治療用抗体またはその抗原結合性断片が、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスに従う、実施形態２３に記載の方法。
２４ｂ． 治療用抗体またはその抗原結合性断片が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を含む、実施形態２４ａに記載の方法。
２５． 対象が、神経学的障害の処置を必要としており、好ましくは、神経学的障害が、神経変性疾患（例えば、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症）、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病および核上性麻痺）、プリオン病（例えば、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、慢性消耗性疾患、および致死性家族性不眠症）、球麻痺、運動ニューロン疾患、および神経系ヘテロ変性障害（nervous system heterodegenerative disorder）（例えば、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥーレット病、メンケス症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト・ルントボルグ病）、認知症（例えば、ピック病および脊髄小脳失調症）、ならびにＣＮＳおよび／または脳のがん（例えば、身体の他の箇所のがんから生じる脳転移）からなる群から選択される、実施形態２０から２４ｂのいずれか一項に記載の方法。
２６． 抗体もしくはその抗原結合性断片、複合体、多重特異性抗体、融合構築物、または医薬組成物が、静脈内投与される、実施形態２０から２５のいずれか一項に記載の方法。
２７． 治療剤または治療用抗体もしくはその抗原結合性断片が、神経学的障害薬である、実施形態２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．薬剤が、造影剤または神経学的障害を検出するための薬剤である、実施形態２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
２９． 抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片、その複合体または融合物が、ＴｆＲとその天然リガンドであるトランスフェリンとの結合を損なわない、実施形態２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
３０． 投与が、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能を低減させる、実施形態２０から２９のいずれか一項に記載の方法。
３１． 投与が、急速な網状赤血球枯渇を誘導しない、実施形態２１から３０のいずれか一項に記載の方法。
３２． 治療用抗体またはその抗原結合性断片が、ｔａｕ凝集体に特異的に結合する、請求項３１に記載の方法。
３３． 対象が、霊長類、例えばヒト、より好ましくは神経学的障害を有するヒトである、実施形態２０から３２のいずれか一項に記載の方法。
３４． 神経学的障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、エンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、がん、および外傷性脳傷害からなる群から選択される、実施形態３３に記載の方法。
本発明の以下の実施例は、本発明の性質をさらに説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって決定されるものであることが理解されるべきである。
[実施例１]
血液脳関門（ＢＢＢ）は、有害物質の脳進入を防止し、脳恒常性にとって不可欠であるが、薬物の効率的な脳送達の場合は厄介な障害物になる。そのため、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ブレインシャトルプラットフォームが開発された。これは、ＢＢＢを通過し、ｍＡｂ単独よりも実質的により高い脳内濃度をもたらす。
抗体生成（ＯＭＴラットおよびＡｂｌｅｘｉｓマウス）
ＯＭＴラット（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＯｍｎｉＲａｔ（登録商標））およびＡｂｌｅｘｉｓマウス（Ａｂｌｅｘｉｓ，ＬＬＣ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を、４６日間（Ａｂｌｅｘｉｓ）、４９日間（ＯＭＴ）、または５０日間（ＯＭＴ）の反復免疫化多重部位（repetitive immunizations multiple sites）（ＲＩＭＭＳ）プロトコールを使用して、ヒト（配列番号１）、ｃｙｎｏ（配列番号２）、およびマーモセット（配列番号３）トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）で免疫した。手短に言えば、動物を、局所流入領域リンパ節に近位の複数の皮下部位で反復免疫した。血清力価測定（ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着検定法）を、３２日目（ＯＭＴ）または３５日目（Ａｂｌｅｘｉｓ）に行った。すべての動物は、ヒトＴｆＲ、ｃｙｎｏ ＴｆＲ、およびマーモセットＴｆＲに対して概して低～中程度の力価を示し、陰性対照に対しては力価を示さない。血清陽性ラットおよびマウスからリンパ節を採取し、融合させてハイブリドーマを生成した。
ハイブリドーマを、まず、ＨＥＫ２９３Ｔ ｈｕＴｆＲ（ヒトトランスフェリン受容体）発現細胞との結合について、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）またはＥＬＩＳＡでスクリーニングした。次いで、こうしたヒットをすべて、確認スクリーニングで試験した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）での確認スクリーニングでは、ＭＤＣＫ－ｈｕＴｆＲ細胞（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞）およびｐＢＥＣ（微小血管内皮細胞、内因性ｈｕＴｆＲ発現）を使用し、ＭＤＣＫ（親）細胞を陰性細胞系として使用した。確認スクリーニングの後、６１６個のＴｆＲ特異的細胞結合物質が識別された（いずれか／または両方のｈｕＴｆＲ発現細胞に結合する）。こうした６１６個のヒットのうち、３４０個は、ｐＢＥＣ細胞およびＭＤＣＫ－ｈｕＴｆＲ細胞に結合し、１６個は、ｐＢＥＣのみに結合し、２６０個は、ＭＤＣＫ－ｈｕＴｆＲのみに結合した。
次いで、ｐＢＥＣ細胞およびＭＤＣＫ－ｈｕＴｆＲ細胞に結合したハイブリドーマを、ラットＴｆＲ（配列番号４）およびマウスＴｆＲ（配列番号５）との結合について評価し、ｐＢＥＣでの内部移行およびＴｆＲとの競合について調査した。ヒト、ｃｙｎｏ、およびマーモセット交差反応性であり、ＴｆＲと競合することなく内部移行されたｍＡｂのＲＮＡライセートを調製した。抗体Ｖ領域配列決定データを得た。
抗体生成（ラマ）
ｃｙｎｏ、マウス、およびラットに対して交差反応性を有する、ヒトＴｆＲに対する単一ドメイン（ＶＨＨ）抗体を生成するため、Ａｂｃｏｒｅのプロジェクト４５２Ｌ（動物１６６３Ｌおよび１６６３Ｌ）での免疫化に２頭のラマを使用した。抗体力価を、ＴｆＲタンパク質（１μｇ／ｍｌ）を使用したＥＬＩＳＡで決定した。２匹の動物からの３回の採血物を試験した。両動物は良好な初期力価を示した。
ファージディスプレイは、Ａｂｃｏｒｅにおいてこの会社の標準的プロトコールを使用して行われた。２つのライブラリー：両動物の２回目の採血物に由来するライブラリー１（４５２Ｌ－１）ならびに２回目および３回目の採血物に由来するライブラリー２（４５２Ｌ－２）を作製した。１２個のランダムな個々のクローンに由来するプラスミドＤＮＡを配列決定した。＞８０％が正しいリーディングフレームを有するＶＨＨインサートを含んでいた。両ファージディスプレイライブラリーを、標準的Ａｂｃｏｒｅパニング手順を使用してヒトＴｆＲでスクリーニングした。１０μｇ／ｍｌのヒトＴｆＲを用いて３ラウンドのパニングを行った。パニングした後、９４個の個々のクローンを、プロテアーゼ活性化受容体１（Ｐａｒ１）Ｎ末端ドメインとの特異的結合およびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）との非特異的結合についてファージＥＬＩＳＡでスクリーニングした。ｃｙｎｏ、マウス、およびラットＴｆＲとの交差反応性を測定した。配列分析のために９４個のクローンを選択した。
ファージ抗体生成
ファージライブラリーを、トランスフェリンと複合体化したビオチン化ｈｕＴｆＲに対してパニングした。ビオチン化複合体を、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）で捕捉し、最終濃度１００ｎＭ（ラウンド１および２）または５０ｎＭ（ラウンド３および４）のトランスフェリンタンパク質と共にプレインキュベートしたｄｅ ｎｏｖｏ ｐＩＸ Ｆａｂライブラリーに曝露した。非特異的ファージをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗い流し、結合したファージを、ＭＣ１０６１Ｆ’大腸菌（E. coli）細胞に感染させることによって回収した。こうした細胞に由来するファージを一晩増幅し、パニングを合計で４ラウンド繰り返した。４ラウンドのバイオパニング後、モノクローナルＦａｂを、ヒトトランスフェリン受容体との結合についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。トランスフェリン受容体との結合を示したクローンの重鎖および軽鎖可変領域を配列決定した。
本発明のＴｆＲ抗体または抗原結合性断片の例は、以下の表１ａにまとめられている。
中性ｐＨ（７．４）および酸性ｐＨ（５）における、下記により詳細に記載のトリポッド融合構築物（ＢＢＢＢ構築物）の一部としての抗ＴｆＲ ｍＡｂの、ＴｆＲに対する結合親和性（ＫＤ、ｋｏｎまたはｋａおよびｋｏｆｆまたはｋｄｉｓまたはｋｄ）を、以下のバイオレイヤー干渉法を使用して測定した。結果は、下記の表１ｂに示されている。
Figure 2023520821000002
Figure 2023520821000003
Figure 2023520821000004
Figure 2023520821000005
Figure 2023520821000006
トリポッド構築物設計
げっ歯動物およびラマを免疫することによって、ＴｆＲに対する抗体を生成した。得られたｍＡｂを、トランスフェリンおよびトリポッドｍＡｂ（ＴＴＰ ｍＡｂとも称される）アーキテクチャのｓｃＦｖまたはナノボディとしてフォーマットされた非競合的ｍＡｂとの結合競合についてスクリーニングし、特徴付けた。トリポッドを使用して、目的の物質（例えば、モノクローナル抗体）を脳に送達する。より具体的には、ＴｆＲに対する抗体の抗原結合性断片と目的のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）との融合物を含むトリポッド構築物（図１）を、ｍＡｂがＢＢＢの通過を支援し、ｍＡｂ単独よりも実質的により高い脳内濃度のｍＡｂがもたらされるように開発した。
例えば、トリポッドｍＡｂは、ＴｆＲ結合ｓｃＦｖまたはナノボディが短い可撓性リンカーを使用して１つの抗体重鎖のＣ末端に付加された治療用ｍＡｂからなる。トリポッドｍＡｂを、トランスサイトーシスを増強することが以前に記載されている特徴（Goulatis and Shusta 2017に概説されている）：原子価、結合親和性、ｐＨ依存性結合、および脳内皮細胞での迅速な内部移行について分析した（図２～４）。
以下のフォーマット：Ｈｃ＿ＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号３１４）＿Ｌｃを使用して、ＴｆＲに対する抗体の重鎖および軽鎖可変配列を、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）としての単一遺伝子構築物に融合した。次いで、ＴｆＲに対するｓｃＦｖまたはＶＨＨを、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１２）またはＧＧＡＧＧＡ（配列番号３１３）リンカーのいずれかを使用して、目的の抗体の重鎖（Ｈｃ）のＣ末端に融合した。ＣＨ３のＺｙｍｅｗｏｒｋｓヘテロ二量体化突然変異（Zymeworks heterodimerization mutation）を、抗体Ｈｃ（Ｈｃ Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；Ｈｃ Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ）に使用して、トリポッド構築物（図１）を生成した。これは、トリポッドｍＡｂとも呼ばれる。トリポッドｍＡｂは、同一のアミノ酸配列を有する２つの軽鎖、及び異なるアミノ酸配列を有する２つの重鎖を含む。２つの重鎖のうちの１つのみが、本発明のＴｆＲ抗体のｓｃＦｖまたはＶＨＨに融合されており、２つの重鎖は定常領域も異なり、２つの重鎖間のヘテロ二量体化が促進される。したがって、本出願の一実施形態による各トリポッドｍＡｂは、３つのアミノ酸配列：ＴｆＲ抗体の抗原結合性断片に融合されている第１の重鎖のアミノ酸配列、軽鎖のアミノ酸配列、およびＴｆＲ抗体の抗原結合性断片に融合されていない第２の重鎖のアミノ酸配列に関連付けられる。
トリポッド発現および精製
トリポッドｍＡｂを、ＣＨＯ－Ｅｘｐｉ細胞で発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。
作製したトリポッドｍＡｂの例は、表２ａに示されている。
Figure 2023520821000007
Figure 2023520821000008
Figure 2023520821000009
Figure 2023520821000010
細胞結合およびＴｆＲ特異性
トリポッドｍＡｂを、トランスサイトーシスを増強することが以前に記載されている特徴（Goulatis and Shusta 2017に概説されている）：原子価、結合親和性、ｐＨ依存性結合、および脳内皮細胞での迅速な内部移行について分析した（図２～４）。
ヒト脳内皮細胞（ｈＣＭＥＣＤ３、５０，０００細胞）を１０ｕｇ／ｍＬの精製トリポッドｍＡｂと共にインキュベートし、１０×モル濃度のｈｕＴｆＲ１ ＥＣＤ（配列番号１）の存在下または非存在下のいずれかで４℃にて一晩のインキュベートを可能にした。翌朝、細胞を固定および洗浄し、二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｅｎｃｅｓ カタログ番号１０９－５４６－１７０）と共にインキュベートし、再度洗浄し、次いでＦＡＣＳで分析した。陽性結合物質は、結合シグナルがアイソタイプ対照の２倍を超え、かつ結合シグナル／ＴｆＲ ＥＣＤとの結合シグナルの比が≧２であるものであると規定した（表２ｂ）。
Figure 2023520821000011
追加のトリポッドｍＡｂに対する特異性を測定するために、追加のｈＣＭＥＣＤ３細胞結合アッセイを実施した。その結果は下記の表２ｃに示されている。
Figure 2023520821000012
トランスフェリン競合
組換えヒトトランスフェリン受容体を発現するＭＤＣＫ細胞を、ＭＡ６０００ ３８４ ＨＢプレートに１ウェル当たり１０，０００細胞で播種し、１０％ＦＢＳおよび５００μｇ／ｍＬジェネティシンで補完されたＤＭＥＭ培地で１８時間培養した。アッセイの前に、細胞を、３７℃のＣＯ２インキュベーター内にて、５μＭモネンシンで補完された無血清ＤＭＥＭ培地で１時間、次いで５μＭモネンシンで補完されたＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）で３０分間、室温にてインキュベートした。プレートの１つおきの列の細胞を、５μＭモネンシンで補完された無血清ＤＭＥＭ培地で調製した２．７ｍｇ／ｍＬヒトホロトランスフェリンと共に室温で３０分間インキュベートした。試験抗体を、５μＭモネンシンで補完された無血清ＤＭＥＭ培地で５μｇ／ｍＬに希釈し、ホロトランスフェリンを含む二重重複ウェルに、またはトランスフェリンを受け取っていない二重重複ウェルに添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。上清を除去し、２μｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏ－ＴＡＧ標識抗ヒト抗体を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。すべてのウェルをＰＢＳで洗浄し、界面活性剤を含まないＭＳＤ読取用緩衝剤Ｔを添加した。プレートを、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｓ６００イメージャーで読み取った。
平均、標準偏差、およびＲＳＤを含む統計分析を、Ｅｘｃｅｌで実施した。ＲＳＤ＞２５％の試料をすべて除外した。トランスフェリンの存在下でインキュベートした試験抗体の平均値を、トランスフェリンの非存在下での平均値と比較した。トランスフェリンの存在下での値が、トランスフェリンの非存在下での値の≦７０％だった抗体を、リガンド競合性であるとみなした（表３）。
Figure 2023520821000013
内部移行
ヒト脳内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）を、コラーゲンコーティング３８４ウェルＣｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に１０，０００細胞／ウェルで播種し、加湿インキュベーター内で１６時間３７℃にて付着を可能にした。次いで、細胞（５０，００細胞）を、２００ｕｇ／ｍＬの精製トリポッドｍＡｂと共にインキュベートし、３７℃で１時間のインキュベートを可能にした。細胞を固定し、洗浄し、蛍光標識二次抗体と共に１時間インキュベートした。次いで、細胞を再度洗浄し、蛍光標識アクチン染色剤ファロイジンおよび核染色剤Ｈｏｅｓｃｈｓｔ３３３４２と共にインキュベートした。細胞を再度洗浄し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を４０×対物レンズで使用して画像化した。ｍＡｂの内部移行は、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ６．０を使用して、ファロイジンとの共局在化に基づいて識別した。表２および３のｍＡｂはすべて、内部移行について陽性だった。
親和性分析＆ｐＨ依存性結合、種間交差反応性
親和性およびｐＨ依存性を、まず、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔプラットフォームを使用して測定した。ビオチン化ｈｕＴｆＲをストレプトアビジンセンサー上に固定化し、ｍＡｂを、０．１Ｍリン酸塩ｐＨ７．４中で１８０秒間結合させた。解離は、０．１Ｍリン酸塩ｐＨ７．４または０．１Ｍリン酸塩ｐＨ５のいずれかで３００秒間で完了した（表４）。好ましくは、目的のトリポッドｍＡｂは、トリポッドｍＡｂが中性ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）でＴｆＲに結合し、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５）でＴｆＲから解離するように、ｐＨ７．４では高い結合親和性を有し、ｐＨ５では低い結合親和性、例えば、ｐＨ５ではＫＤ≧１ｎＭおよびｋｄ≦１０－４秒－１、好ましくは約１０－３を有する。好ましくは、酸性ｐＨおよび中性ｐＨにおけるＫＤは同様であり、例えば、ＫＤ酸性／ＫＤ中性の比が約１．５である。
Figure 2023520821000014
親和性測定のさらなる正確性を得るために、ｈｕＴｆＲに対するトリポッドｍＡｂ親和性を、ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｏｎ機器、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６システムで表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使用して決定した。Ｆｃ捕捉表面は、アミンカップリング化学（ＢｉｏＲａｄ）を使用して抗ＩｇＧ Ｆｃ ｍＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）にカップリングすることによって生成した。トリポッドｍＡｂを、０．３ｕｇ／ｍＬの濃度を使用して捕捉し、１２０ＲＵの目標密度を得るために６０ｕＬ／分で３０秒間流し、次いでｈｕＴｆＲを、固定化されたトリポッドｍＡｂに対して３．１２５～８００ｎＭ（４倍系列希釈）の濃度で３分間（５０μＬ／分で）流して結合させ、続いて５０ｕＬ／分で１０分間解離させた。１００ｍＭ Ｈ３ＰＯ４（Ｓｉｇｍａ）を１００μＬ／分で２回１８秒間パルスすることによって、チップ表面を再生した。収集したデータを、ＰｒｏｔｅＯｎ ＭａｎａｇｅｒソフトウェアＶ３．１．０．６（ＢｉｏＲａｄ）を使用して処理した。まず、インタースポットを使用してデータのバックグラウンドを補正した。次いで、分析物を注入するための緩衝剤を注入することによって、データの二重参照減算を実施した。ラングミュア１：１結合モデルを使用して、データの動力学的分析を実施した。各ｍＡｂの結果を、Ｋａ（オンレート）、Ｋｄ（オフレート）、およびＫＤ（平衡解離定数）の形式で報告した（表５）。
Figure 2023520821000015
ｐＨ依存性結合は、解離中に緩衝剤ｐＨを７．４から６．５～６．０に段階的に下げたことを除いて、上記に記載のＳＰＲ（ｐｒｏｔｅｏｎ）法を使用して評価した。個々のセンサーグラムを評価し、ｐＨが減少すると共にオフレートがより速くなった場合に（例えば、図３）、ｐＨ依存性結合をスコア化した。
種間交差反応性を、使用したＴｆＲがｃｙｎｏ（配列番号２）、マーモセット（配列番号３）、ラット（配列番号４）、およびマウス（配列番号５）であった場合を除いて、結合親和性を決定するためのものと同じ方法を使用して評価した。ラット交差反応性ｍＡｂもマウス交差反応性ｍＡｂも識別されなかった。Ｃｙｎｏおよびマーモセット交差反応性トリポッドｍＡｂが識別された（表６）。
Figure 2023520821000016
本発明の抗ＴｆＲ抗体または抗原結合性断片を使用して、任意のタイプの免疫グロブリンを送達することができる。同様の結果が、トリポッド構造で送達したＩｇＧ１およびＩｇＧ４治療用ｍＡｂで観察されている（データ非表示）。
マウス薬物動態および薬物動力学ならびに抗ＢＡＣＥ ｍＡｂブレインシャトル
トランスサイトーシスに対する結合特性の影響を分析するために、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ ＰＫ／ＰＤ研究を完了させた。Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｆｒｃｔｍ２６１８（ＴＦＲＣ）Ａｒｔｅマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ａｒｔｅｍｉｓ）に、試験物質をＩＶボーラス注射（１３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍＬ／ｋｇ）で投与した。予定の時点で、マウスを吸入イソフルランで麻酔した。心臓穿刺によって採血し、血漿を処理した。５ｍＬの０．９％生理食塩溶液で全身灌流した後でマウス脳を収集した。収集した脳試料（小脳を除く）を右／左半球に分割し、液体窒素で瞬間凍結し、組織ホモジナイズおよび毛細血管枯渇処理まで－７０℃で保管した。
ＴｆＲ結合分子はいずれもマウスＴｆＲと交差反応しなかったため、ヒトＴｆＲ ＫＩマウスを使用してトランスサイトーシスを評価した。脳内へのトランスサイトーシス後のｍＡｂの薬物動力学評価を可能にするために、トリポッドｍＡｂを、抗ベータセクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）アンタゴニストｍＡｂを用いてフォーマットした。ＢＡＣＥ１は、ベータアミロイドを切断してＡβ１～４０を放出する。ＢＡＣＥ１の阻害を、脳内における、産物Ａβ１～４０の濃度を定量化することによって測定する。マウスに、対照ｍＡｂ、ＢＢＢＢ４５６と共に、２つのトリポッドｍＡｂ、ＢＢＢＢ３８３およびＢＢＢＢ４２６を静脈内投薬した。ＢＢＢＢ４５６は、抗ＢＡＣＥ１アンタゴニストｍＡｂ単独である。ＢＢＢＢ３８３およびＢＢＢＢ４２６は、ＴｆＲに対する親和性のみが異なり、それぞれＫＤ＝１８ｎＭおよび１３０ｎＭである。血液中のまたは血管内皮内に保持されたｍＡｂからの干渉を低減するために、灌流および毛細血管枯渇後に、脳曝露を測定した（Johnsen, Burkhart et al. 2017）。ＢＢＢＢ３８３およびＢＢＢＢ４２６の両方の脳内濃度は、すべての時点でＢＢＢＢ４５６よりも増強され、ＢＢＢＢ３８３は、ＢＢＢＢ４２６よりも大きなｍＡｂ脳内濃度を示した。強力なＰＫ／ＰＤ関係性が観察され、ｍＡｂ脳内濃度は、Ａβ１～４０レベルの低減と相関していた。両ＴｆＲ含有ｍＡｂの血漿曝露がより低いのは、末梢でＴｆＲに結合することによるＴＭＤＤに起因する。
次いで、選択した抗ＴｆＲブレインシャトルを、原型抗ＢＡＣＥ（βセクレターゼ）ｍＡｂに融合させ、結合親和性を上記に記載のものと同じ方法を使用して再評価した。表５に示されているように、抗ＴｆＲブレインシャトルの親和性は、Ｂ２１Ｍ ｍＡｂ（抗ヒト呼吸器合胞体ウイルス）および抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂと融合させた場合、類似していた。選択した分子の内部移行を評価し、抗ＴｆＲブレインシャトルをＢ２１Ｍ ｍＡｂに融合させた場合に観察された内部移行から変化していないことを見出した。
抗ＴｆＲブレインシャトルはマウスＴｆＲにもラットＴｆＲにも結合しないため、原型抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂ（ＢＢＢＢ４５６、配列番号３０７、３０８、および３０９）を使用して、ｈｕＴｆＲノックインマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｆｒｃｔｍ２６１８（ＴＦＲＣ）Ａｒｔｅマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ａｒｔｅｍｉｓ））においてｉｎ ｖｉｖｏげっ歯動物研究を実施した。抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂを、脳内に輸送されたｍＡｂの量を反映するＢＡＣＥ１阻害を測定するための（その産物ペプチドＡβ１～４０の濃度によって）モデルＰＤ系として選択した。
最初のｉｎ ｖｉｖｏ研究では、ｈｕＴｆＲマウスの脳におけるＰＫ／ＰＤ関係性を評価した。ノックイン（ＫＩ）マウスに、ＢＢＢＢ３８３（配列番号２５６、２５７、および２５８）、ＢＢＢＢ４２６（配列番号２７５、２７６、および２７７）、およびＢＢＢＢ４５６（配列番号３０７、３０８、および３０９）を１３ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投薬した。脳および血漿を、４、２４、および７２時間時に採取した。予定の時点で、イソフルランの吸入でマウスを麻酔した。５ｍＬの０．９％生理食塩溶液で全身灌流した後でＫＩマウスからマウス脳を収集した。収集した脳試料（小脳を除く）を右／左半球に分割し、液体窒素で瞬間凍結し、組織ホモジナイズおよび毛細血管枯渇処理まで－７０℃で保管した。
毛細血管枯渇脳組織ライセートの試料調製では、薬物濃度を測定するために脳半球の個々の重量を得た。脳組織試料を、プロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ；Ａ３２９５５）を含む計算体積の改変ｄＰＢＳ緩衝剤（組織１ｍｇ当たり２．５～３μＬ緩衝剤）に添加し、溶解マトリックスＤ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（商標）；６９１３－１００）チューブに移した。Ｂｅａｄ Ｒｕｐｔｏｒ ２４ Ｅｌｉｔｅ（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、組織試料を２．９ｍ／ｓで１５秒間ホモジナイズした。全細胞懸濁物を新しいチューブに移し、等体積の２６％デキストラン緩衝剤と混合した（最終デキストラン濃度１３％）。混合組織ホモジネートを２，０００ｇで１０分間４℃にて遠心分離した。上部層（毛細血管枯渇画分）を残りの試料から慎重に分離し、１０×ＲＩＰＡ溶解緩衝剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）；２０－１８８）を含む新しいチューブに移した。溶解緩衝剤を加えた毛細血管枯渇試料を十分にボルテックスし、１４，０００ｒｐｍで３０分間４℃にて遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。脳組織試料溶解物は、－７０℃で凍結保管したか、またはＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）；２３２２７）を使用してタンパク質濃度を測定したかのいずれかだった。最終的な脳組織試料ライセートを、ＢＢＢ対応化ｍＡｂのイムノアッセイ決定前に、７ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度に対して正規化した。
ＰＫ評価のためのマウス脳組織中のＢＢＢ対応化ｍＡｂの濃度を、典型的なサンドイッチイムノアッセイ形式で開発されたＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ（登録商標）；ゲイサーズバーグ、メリーランド州）ＥＣＬＩＡ技術を使用して決定した。アッセイは、ＭＳＤ Ｇｏｌｄ（商標）Ｓｍａｌｌ Ｓｐｏｔ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ９６ウェルプレート（カタログ番号：Ｌ４５ＳＡ）で実施した。手短に言えば、ストレプトアビジンコーティングプレートを、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間室温にてブロッキングした。５０％ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス脳組織ライセートを新たに系列希釈して、標準曲線を作成した。作業アッセイ濃度の２×のナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス脳組織ライセートで調製した凍結品質管理対照（ＱＣ）を希釈し、各アッセイで試験した。捕捉（ビオチン化抗ヒトＦｃ ｍＡｂ、１μｇ／ｍＬ）および検出（ルテニウム標識抗ヒトＦｃ ｍＡｂ、０．５μｇ／ｍＬ）試薬を含むマスターミックスを、希釈した標準物質、ＱＣ、および試料とアッセイプレートにて１：１体積比で一緒にした。混合物を室温で振盪しながら１時間インキュベートした。アッセイプレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｔ読取用緩衝剤（１×）をすべてのウェルに添加した。生データ値を、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｓ６００イメージャーで読み取った。アッセイの標準曲線範囲を、最小必要試料希釈（ＭＲＤ）が１：２の１～５１２ｎｇ／ｍＬにて試験し、脳組織ライセートでは２ｎｇ／ｍＬの感度限界が得られた。生ＥＣＬ計数を含むＭＳＤ出力ファイルを、Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にインポートし、次いで１／Ｆ２加重による５パラメーターロジスティックフィッティングで回帰分析した。
ＰＫ評価のためのマウス血漿中のＢＢＢ対応化ｍＡｂの濃度を、上記に記載のものと同様のプロトコールを使用して決定した。１０％マウス血漿プールを新たに系列希釈することによって標準曲線を作成した。マウス血漿プールで作業アッセイ濃度の１０×に調製した凍結ＱＣを希釈し、各アッセイで試験した。捕捉（ビオチン化抗ヒトＦｃ ｍＡｂ、１μｇ／ｍＬ）および検出（ルテニウム標識抗ヒトＦｃ ｍＡｂ、０．５μｇ／ｍＬ）試薬を含むマスターミックスを、希釈した標準物質、ＱＣ、および試料とアッセイプレートにて１：１体積比で一緒にした。混合物を室温で振盪しながら１時間インキュベートした。アッセイプレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｔ読取用緩衝剤（１×）をすべてのウェルに添加した。生データ値を、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｓ６００イメージャーで読み取った。アッセイの標準曲線範囲を、ＭＲＤが１：１０の２～５１２ｎｇ／ｍＬにて試験し、血漿マトリックスでは２０ｎｇ／ｍＬの感度限界が得られた。生ＥＣＬ計数を含むＭＳＤ出力ファイルを、Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にインポートし、次いで１／Ｆ２加重による５パラメーターロジスティックフィッティングで回帰分析した。
ＢＡＣＥ活性測定は、マウス脳を２ｍｌの溶解マトリックスＤチューブ中でホモジナイズすることによって行った（脳重量１ｍｇ当たり８μｌの０．４％ＤＥＡ／５０ｍＭ ＮａＣｌ、Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ－２４で６回／振盪／秒で２０秒間）。次いで、チューブを、最高速度に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で５分間４℃にて遠心分離した。次いで、ホモジネート（上清）を予冷チューブに移し、次いでそれを１３，０００ｒｐｍで７０分間４℃にて遠心分離した。次いで、上清を１０％の０．５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬを含むチューブに移し、アッセイまで－８０℃で凍結した。Ａβ１～４０ペプチド標準物質および解凍処理した脳ホモジネートを、ルテニウム（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）、Ｒ９１ＡＮ－１）標識抗Ａβ抗体と１：１で事前に複合体化させた。Ａβ１～４０に対する捕捉抗体を含むブロックキング済みプレートに５０μｌの複合体を添加した。振盪せずに２～８℃で一晩インキュベーションした後、プレートを洗浄し、２×読取用緩衝剤（ＭＳＤ、Ｒ９２ＴＣ－１）を添加した。Ｍｅｓｏ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ６００（ＭＳＤ、ＩＣ０ＡＡ）を使用してプレートを読み取った。
ｍＡｂ ＢＢＢＢ３８３およびＢＢＢＢ４２６を含むブレインシャトルは、抗ＢＡＣＥ ｍＡｂ ＢＢＢＢ４５６単独よりも速い血漿クリアランスを示すことが観察された（図５Ａ）。しかしながら、脳内ではその逆であり、ＢＢＢＢ３８３およびＢＢＢＢ４２６は、すべての時点で対照ＢＢＢＢ４５６よりも脳内濃度の増加を示したことが観察された。ＢＡＣＥ阻害のＰＤ効果が測定された場合、両ブレインシャトルｍＡｂは、対照抗ＢＡＣＥ ｍＡｂ単独よりもＢＡＣＥの活性をより大幅に阻害することが観察された。（図５Ｂ）。
ｍＡｂを含む追加のブレインシャトルを、１３ｍｇ／ｋｇでのｉ．ｖ．投薬の４および２４時間後に同様に評価した（図７Ａ～７Ｂ）。最初の研究と同様に、すべてのブレインシャトルｍＡｂは、対照抗ＢＡＣＥ ｍＡｂよりも速い血漿クリアランスを示すことが観察された。脳内濃度の増強を示すブレインシャトルｍＡｂでは、ＢＢＢＢ９７４を除くすべてで一定範囲の脳内濃度が観察された。ＢＢＢＢ９７４は、その結合動態のため、脳内に効率的に輸送されないという仮説を立てた。具体的には、ＢＢＢＢ９７４は、中性でのオンレートが遅く、それによってｉｎ ｖｉｖｏではＴｆＲとの効率的な結合が妨げられた可能性がある。トリポッドｍＡｂ濃度依存性のＡβ１～４０レベル減少は、ＢＢＢＢ９８３を除くすべてのトリポッドｍＡｂでも観察された。ＢＢＢＢ９８３は、対照ＢＢＢＢ４５６よりも脳内濃度の増加を示したが、Ａβ１～４０濃度には影響を及ぼさなかった（図８）。ＢＢＢＢ９８３は、中性でのオフレートが非常に遅く、それによってＢＡＣＥ阻害に必要な脳内での効率的な拡散が妨げられる可能性があるため、この観察は、結合動態によるものである可能性がある。こうしたデータは、ＴｆＲ結合動態が、治療用ｍＡｂの送達および機能の両方にとって重要であることを強調している。
親和性とトランスサイトーシス効率との関係性は、ＴｆＲに対する親和性が減少すると共にトランスサイトーシスが向上すると以前に記載されており（Yu, Zhang et al. 2011）、これは、上記のデータと矛盾する結論である。トランスサイトーシスの親和性関係性をより詳細に調査するために、上記に記載のマウスモデルにおいて９つのトリポッドｍＡｂの脳ＰＫ／ＰＤを評価した。こうしたトリポッドｍＡｂは、ＴｆＲに対する親和性がおよそ１００倍異なっていた（ＫＤは、０．２ｎＭ～８１ｎＭの範囲だった）。ＩＶ投薬の２４時間後に脳内濃度を測定した（Ｃｍａｘ脳）（図１７）。予想どおり、トランスサイトーシス効率の範囲は、対照ｍＡｂに対して増強無しから１０倍の向上までが観察された。このデータは、親和性とトランスサイトーシス効率との関係性が、以前に記載されているものよりも微妙なものであり、オンレートおよびオフレートの両方の作用が、脳内濃度に影響を及ぼすことを示している。例えば、ＢＢＢＢ９４６は、ｐＨ６ではＫＤ＝６５ｎＭであり、オフレートが速かったが、対照ｍＡｂよりも大きな脳曝露の増強は観察されなかった。しかしながら、このｍＡｂは独特であり、研究されている他のｍＡｂよりも遅いオンレートを有していた（およそ１０５Ｍ－１ｓ－１のｋａと比較しておよそ１０３Ｍ－１ｓ－１のｋａ）。実際、ＫＤは同様だったが（ＫＤ＝８１ｎＭ）、オンレートが１００×より速い別のトリポッド抗体ＢＢＢＢ９６９と比較すると、違いは明らかである。ＢＢＢＢ９６９は、脳内濃度を５．５倍増強した。これは、効率的な脳送達には、十分に速いオンレートが重要であることを示している。研究した他の８つのｍＡｂのトランスサイトーシスの効率は、それらのオフレートで最も良好に説明することができ、最適な脳送達は、速過ぎでも遅過ぎでももいずれでもないオフレートで生じる（最適な中性ｋｄは２×１０－３ｓ－１である）。ＢＢＢＢ９８３を除くすべてのトリポッドｍＡｂで強力なＰＫ／ＰＤ関係性が観察された。ＢＢＢＢ９８３は、脳内濃度の５．５×向上を示したが、Ａβ１～４０レベルには影響を及ぼさなかった。このｍＡｂは、中性でのオフレートが遅く（＜８×１０－５ｓ－１）、本発明者らは、それが脳内で標的へと拡散する能力に影響を及ぼしているという仮説を立てた。まとめると、こうしたデータは、最適な脳ＰＫおよびＰＤのためには、中性でのオンレートおよびオフレートの両方を最適化することが重要であることを示している。本発明者らは、この研究では、ＴｆＲに対するエピトープ結合に関する影響を観察しなかった（データ非表示）。
ｃｙｎｏ研究のためのｍＡｂの選択および抗Ｔａｕ ｍＡｂに融合させたブレインシャトルの評価
ＴｆＲ標的指向性トリポッドｍＡｂがヒトにおいて治療用抗体脳曝露を増強する能力を確認するためには、非ヒト霊長類において脳への送達の増強を示すことが重要である。マウス研究で性能が最も高いトリポッドｍＡｂ（ＢＢＢＢ９７９およびＢＢＢＢ９７８）は、ｃｙｎｏ ＴｆＲに結合しなかったため、さらなる研究から除外した。次善のＢＢＢＢ９７０およびＢＢＢＢ９６９は両方とも、抗ＴｆＲブレインシャトルの軽鎖に遊離システイン残基を含んでいた（配列番号１６２および配列番号２１８）。遊離システイン残基は、製造中に非理想的な生物物理学的特性に寄与する可能性があるため、遊離システインをセリン残基に突然変異させた（配列番号２７８および配列番号２９１）。
新しいｓｃＦｖを、抗Ｔａｕ ｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４（配列番号３１０および３１１）に融合させて、ＢＢＢＢ１１３６（配列番号２８５、２８６、および２８７）／ＢＢＢＢ１１３４（配列番号２８８、２８９、および２９０）、およびＢＢＢＢ１１３３（配列番号２９８、２９９、および３００）／ＢＢＢＢ１１３１（配列番号３０１、３０２、および３０３）（ＩｇＧ１ ＡＡＳ ＹＴＥ／ＩｇＧ１）を生成した。ｈｕＴｆＲに対する親和性を測定した（表７）。
Figure 2023520821000017
ＢＢＢＢ１１３４／ＢＢＢＢ１１３６は、ＢＢＢＢ５５７／ＢＢＢＢ９７０と非常に類似したｈｕＴｆＲとの結合を維持した。これは、Ｃｙｓ－Ｓｅｒ突然変異も抗Ｔａｕ ｍＡｂとの融合も、ｈｕＴｆＲに対する結合親和性を妨害しなかったことを示している。しかしながら、ＢＢＢＢ１１３１／ＢＢＢＢ１１３３は、結合親和性が、ＢＢＢＢ５４３／ＢＢＢＢ９６９と比較しておよそ１／２の強さだった。親和性の変化がｃｙｓ－ｓｅｒ突然変異によるものであったか、または抗Ｔａｕ ｍＡｂとの融合によるものであったかを決定するために、突然変異を有していないが抗Ｔａｕと融合されたブレインシャトルを生成し、結合を評価した（ＢＢＢＢ１０４８（配列番号１７８、１７９、および１８０）／ＢＢＢＢ１０４６（配列番号１８１、１８２、および１８３））。非突然変異ＢＢＢＢ１０４８／ＢＢＢＢ１０４６の親和性は、ＢＢＢＢ５４３／ＢＢＢ９６９と非常に類似していた。これは、親和性の喪失が、Ｔａｕ ｍＡｂとの融合によるものではなく、ｃｙｓ－ｓｅｒ突然変異によるものであったことを示している（表８）。
Figure 2023520821000018
以前の研究と同様に内部移行も評価した。抗Ｔａｕ ｍＡｂとブレインシャトルとの融合は、ヒト脳内皮細胞に内部移行するその能力に影響を及ぼさなかった（例えば、図９。試験したｍＡｂは表９に記載されている）。
Figure 2023520821000019
抗ＴａｕブレインシャトルｍＡｂのＣｙｎｏ薬物動態
カニクイザルに、ＩＶ注射（緩徐ボーラス）によって試験物質を表示用量で投与した。予定の時点で、上半身を生理食塩水で最低５分間灌流した後、カニクイザル脳を収集し、冷却生理食塩溶液ですすいだ。所定の脳位置を単離し、液体窒素で瞬間凍結し、組織ホモジナイズおよび毛細血管枯渇処理まで－８０℃で保管した。
ＢＢＢＢ１１３３、ＢＢＢＢ１１３６、およびＢＢＢＢ１１３４を、非ブレインシャトル対応化ｍＡｂ ＰＴ１Ｂ８４４（図１８）およびＰＴ１Ｂ９１６と共に１０ｍｇ／ｋｇでカニクイザルにｉ．ｖ．投与した。血漿を、４、２４、および７２時間時に試料採取した。上半身を生理食塩水で最低で５分間灌流した後、カニクイザル脳を収集し、冷却生理食塩溶液ですすいだ。所定の脳位置を単離し、液体窒素で瞬間凍結し、組織ホモジナイズおよび毛細血管枯渇処理まで－８０℃で保管した。
毛細血管枯渇脳組織ライセートの試料調製のために、収集した脳位置の個々の組織重量を得た。脳組織試料を、プロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ；Ａ３２９５５）を含む計算体積の改変ｄＰＢＳ緩衝剤（組織１ｍｇ当たり２．５μＬの緩衝剤）に添加し、溶解マトリックスＤ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（商標）；６９１３－１００）チューブに移した。Ｂｅａｄ Ｒｕｐｔｏｒ ２４ Ｅｌｉｔｅ（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、組織試料を２．９ｍ／ｓで１５秒間ホモジナイズした。全細胞懸濁物を新しいチューブに移し、等体積の２６％デキストラン緩衝剤と混合した（最終デキストラン濃度１３％）。混合組織ホモジネートを２，０００ｇで１０分間４℃にて遠心分離した。上部層（毛細血管枯渇画分）を残りの試料から慎重に分離し、１０×ＲＩＰＡ溶解緩衝剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）；２０－１８８）を含む新しいチューブに移した。溶解緩衝剤を加えた毛細血管枯渇試料を十分にボルテックスし、１４，０００ｒｐｍで３０分間４℃にて遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。脳組織試料溶解物は、－７０℃で凍結保管したか、またはＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）；２３２２７）を使用してタンパク質濃度を測定したかのいずれかだった。最終的な脳組織試料ライセートを、ＢＢＢ対応化ｍＡｂのイムノアッセイ決定前に、７ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度に対して正規化した。
ＰＫ評価のためのカニクイザル脳組織中のＢＢＢ対応化ｍＡｂの濃度を、典型的なサンドイッチイムノアッセイ形式で開発されたＭＳＤ（登録商標）ＥＣＬＩＡ技術を使用して決定した。アッセイは、ＭＳＤ Ｇｏｌｄ（商標）Ｓｍａｌｌ Ｓｐｏｔ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ９６ウェルプレートで実施した。ストレプトアビジンコーティングプレートを、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間室温にてブロッキングした。５０％ナイーブｃｙｎｏ脳組織ライセートを新たに系列希釈して、標準曲線を作成した。作業アッセイ濃度の２×のナイーブｃｙｎｏ脳組織ライセートで調製した凍結ＱＣを希釈し、各アッセイで試験した。捕捉（ビオチン化抗ヒトＦｃ ｍＡｂ、１μｇ／ｍＬ）および検出（ルテニウム標識抗ヒトＦｃ ｍＡｂ、０．５μｇ／ｍＬ）試薬を含むマスターミックスを、希釈した標準物質、ＱＣ、および試料とアッセイプレートにて１：１体積比で一緒にした。混合物を室温で振盪しながら１時間インキュベートした。アッセイプレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｔ読取用緩衝剤（１×）をすべてのウェルに添加した。生データ値を、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｓ６００イメージャーで読み取った。アッセイの標準曲線範囲を、最小必要試料希釈（ＭＲＤ）が１：２の１～５１２ｎｇ／ｍＬにて試験し、脳組織ライセートでは２ｎｇ／ｍＬの感度限界が得られた。生ＥＣＬ計数を含むＭＳＤ出力ファイルを、Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にインポートし、次いで１／Ｆ２加重による５パラメーターロジスティックフィッティングで回帰分析した。
ＰＫ評価のためのカニクイザル血漿中のＢＢＢ対応化ｍＡｂの濃度を、典型的なサンドイッチイムノアッセイ形式で開発されたＭＳＤ（登録商標）ＥＣＬＩＡ技術を使用して決定した。アッセイを、ＭＳＤ Ｇｏｌｄ（商標）ストレプトアビジン９６ウェルプレートで実施した。ストレプトアビジンコーティングプレートを、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０で、３０分間室温にてブロッキングした。１０％ｃｙｎｏ血漿プールを新たに系列希釈することによって標準曲線を作成した。ｃｙｎｏ血漿プールで作業アッセイ濃度の１０×に調製した凍結ＱＣを希釈し、各アッセイで試験した。捕捉（ビオチン化抗ヒトＦｃ ｍＡｂ、１μｇ／ｍＬ）および検出（ルテニウム標識抗ヒトＦｃ ｍＡｂ、１μｇ／ｍＬ）試薬を含むマスターミックスを、希釈した標準物質、ＱＣ、および試料とアッセイプレートにて１：１体積比で一緒にした。混合物を室温で振盪しながら１時間インキュベートした。アッセイプレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｔ読取用緩衝剤（１×）をすべてのウェルに添加した。生データ値を、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｓ６００イメージャーで読み取った。アッセイの標準曲線範囲を、最小必要資料希釈（ＭＲＤ）が１：１０の２～５１２ｎｇ／ｍＬにて試験し、血漿マトリックスでは２０ｎｇ／ｍＬの感度限界が得られた。生ＥＣＬ計数を含むＭＳＤ出力ファイルを、Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にインポートし、次いで１／ｙ２加重による５パラメーターロジスティックフィッティングで回帰分析した。
様々な区域にわたってｍＡｂの脳内濃度を決定した（図１０）。脳内濃度データを動物全体で平均した。各記号は脳の領域を表す。対照ｍＡｂと比較して、ＢＢＢＢ１１３４、ＢＢＢＢ１１３６、およびＢＢＢＢ１１３３では、それぞれ７×、１１×、および１１×のより大きな脳内濃度が観察された。ｍＡｂを含むすべてのブレインシャトルは、脳のすべての領域において、ｍＡｂを含む非ブレインシャトルよりも脳曝露の増加を示した（図１１）。
血漿中のｍＡｂ濃度も決定した（図１２）。ＴＭＤＤの証拠が末梢で観察され、トリポッドｍＡｂは、対照ｍＡｂよりもクリアランスの加速を示した（図１８）。この研究では、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合の影響を評価した。ＢＢＢＢ１１３４およびＢＢＢＢ１１３６は、ＢＢＢＢ１１３６がＦｃドメインに「ＹＴＥ」突然変異を有することを除いて同一だった（Dall’Acqua, K, et al. 2006）。「ＹＴＥ」突然変異は、酸性ｐＨでＦｃＲｎとの結合を強化し、ヒトを含む複数の種においてｍＡｂの半減期を増加させることが示されている（Robbie, C, et al. 2013）。予想した通り、ＢＢＢＢ１１３６の場合、「ＹＴＥ」突然変異の付加は、ＢＢＢＢ１１３４と比較して血漿濃度の増加をもたらした。ＦｃＲｎは、ＩｇＧ恒常性を維持し、ヒトにおいてＩｇＧの血清半減期を延長する上で重要な受容体であるが（Roopenian and Akilesh 2007）、脳からの逆トランスサイトーシスまたは排出受容体としても示唆されている（Cooper, C, et al. 2013）。ＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させることによる半減期の向上は、脳排出の増加によって脳曝露を犠牲にしたことによるものである可能性があるため、本発明者らは、ＦｃＲｎのこうした２つの機能間の相互関係を理解することに興味を持った。興味深いことに、血漿濃度の２倍増加は脳内濃度の２倍の増加によって反映され、この系ではあらゆる潜在的な排出増加が無視できる程度であることが示唆された。
ＢＢＢＢ１１３３は、ブレインシャトルを有していないｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４およびＰＴ１Ｂ９１６に最も類似した末梢半減期を有していた。
カニクイザルにおける網状赤血球枯渇
脳曝露を増強するためのＴｆＲ標的化に関する既知の不利益は、Ｆｃ依存的様式の網状赤血球の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による網状赤血球枯渇である（Science Translational Medicine 2013: Vol. 5, 183）。ＷＴ ＩｇＧ１（ＢＢＢＢ１１３４）、およびｃｙｎｏ ＰＫ試験において網状赤血球枯渇のためにＦｃγＲ結合を低減させた突然変異「ＡＡＳ」（ＢＢＢＢ１１３６およびＢＢＢＢ１１３３）を用いて、ｍＡｂを試験した。予想通り、急速な網状赤血球枯渇が、ＷＴ ＩｇＧ１トリポッドｍＡｂ、ＢＢＢＢ１１３４で観察されたが、ＢＢＢＢ１１３６、ＢＢＢＢ１１３３、または非ブレインシャトルｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４およびＰＴ１Ｂ９１６では観察されず（図１３）、Ｆｃ機能が、ＴｆＲ結合ｍＡｂおよび網状赤血球枯渇に対して影響を及ぼすことが確認された。
第３のトリポッドｍＡｂ、ＢＢＢＢ１１３３を、用量応答および反復投薬カニクイザルＰＫために選択した。カニクイザルに、２、１０、および３０ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬し、脳ＰＫを、４８時間後、７日後、および１４日後に決定した。血漿ＰＫを２週間にわたって評価した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。線形性の脳ＰＫが２～１０ｍｇ／ｋｇで観察され、非線形性の脳ＰＫが１０～３０ｍｇ／ｋｇで観察された。提唱されている送達機序は受容体媒介性であり、それは飽和性ということになる。データは、カニクイザルでは３０ｍｇ／ｋｇが飽和用量であることを示した。線形性のＰＫが、血漿およびＣＳＦで観察され、半減期はおよそ６日間だった。また、３週間週１回投薬した同じ用量範囲を使用して、反復投薬を完了した（図１８Ｃおよび１８Ｄ）。３０ｍｇ／ｋｇの反復投薬による蓄積の証拠が観察された。これは３０ｍｇ／ｋｇが飽和用量であるという以前の観察と一致する。この場合も線形性のＰＫが末梢で観察され、反復投薬によるＰＫ耐性の証拠はなかった。
網状赤血球データは、この脳送達プラットフォームの安全な投薬には、エフェクターサイレントＦｃ ｍＡｂが必要であることを示した。網状赤血球枯渇の回避は、治療用ｍＡｂの安全性にとって重要な特徴であるが、この要件は、治療作用機序にＡＤＰのようなエフェクター機能を必要とする任意の治療用ｍＡｂに抗ＴｆＲ媒介性脳送達を使用することを妨げることになる。例えば、１つの潜在的な治療作用機序は、Ｔａｕ凝集体のＦｃ依存性ミクログリアファゴサイトーシスに頼る。ブレインシャトルｍＡｂがＦｃγＲに結合して網状赤血球枯渇を防止する能力を阻害することによって、ｍＡｂは、ミクログリア細胞上のＦｃγＲに結合してＴａｕ凝集体のファゴサイトーシスを促進することができなくなるだろう。
ＡＤＰの代替経路を探索するために、本発明者らは、エフェクターサイレントトライポッドｍＡｂ、ＢＢＢＢ１１３３およびＢＢＢＢ１１３６が、ヒトＩＰＳＣ由来ミクログリア細胞にてＴａｕオリゴマーのファゴサイトーシスを誘導する能力を評価した。両トリポッドｍＡｂは、ＩｇＧ１ ｍＡｂである対照抗Ｔａｕ ｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４よりもより大きなＴａｕオリゴマーのファゴサイトーシスを誘導した（図１９Ａ）。ＢＢＢＢ１１３３によるＴａｕオリゴマーのＡＤＰは、ＴｆＲ媒介性内部移行によって生じることが示されており、過剰な可溶性ＴｆＲ細胞外ドメインを添加することで阻止することができる。過剰な可溶性Ｆｃの添加はＡＤＰに影響を及ぼさず、非古典的ＡＤＰはＦｃγＲではなくＴｆＲを使用することが確認された（図１９Ｂ）。初期エンドソーム（ＥＥＡ１）から中間エンドソーム（Ｒａｂ１７）への、最終的にはリソソーム（ＬＡＭＰ１）への、対照ｍＡｂ（ＰＴ１Ｂ８４４）と同様のＴａｕ細胞内輸送が、ＢＢＢＢ１１３３で観察された（図１９Ｃ）。
ミクログリアによるＴａｕ分解の生理学的関連機序としての非古典的ＡＤＰをさらに検証するために、本発明者らは、トリポッドｍＡｂが、ヒト死後アルツハイマー病脳由来Ｔａｕ線維（ＰＨＦ－Ｔａｕ）のファゴサイトーシスを誘導する能力を評価した。ＰＨＦ－ＴａｕのＡＤＰを、ヒト単球由来マクロファージおよびヒトＩＰＳＣ由来ミクログリア細胞の両方で測定した（図２０）。ＰＴ１Ｂ８４４およびＢＢＢＢ１１３３は両方とも、初期時点でＰＨＦ－Ｔａｕのファゴサイトーシスを誘導した。しかしながら、後期時点では、ＢＢＢＢ１１３３は、ＰＨＦ－ＴａｕのＡＤＰを誘導し続けるが、ＰＴ１Ｂ８４４媒介性ＡＤＰは停止する。これは、古典的ＡＤＣＰについて記載されているマクロファージおよびミクログリア疲弊の証拠であり（Church, VanDerMeid et al. 2016）、ＢＢＢＢ１１３３によって使用される非古典的ＡＤＰ機序の潜在的な利点である可能性がある。Ｔａｕオリゴマーを使用した前述の実験と同様に、過剰量の可溶性ＴｆＲを添加することによってＴａｕの取り込みが阻止され、これはＴｆＲ依存性機序であることが示された。古典的ＡＤＰに対する非古典的ＡＤＰの別の潜在的な利点を調べるために、炎症促進性サイトカインを、ＰＨＦ Ｔａｕファゴサイトーシス実験で測定した。予想通り、ＰＴ１Ｂ８４４によって媒介される古典的ＡＤＰは、炎症促進性サイトカインの分泌をもたらしたが、ＢＢＢＢ１１３３によって媒介される非古典的ＡＤＰはそうではなかった。
ミクログリア細胞でのＴａｕ凝集体の取込みを促進するＡＡＳ ＩｇＧ１トリポッドｍＡｂの能力を評価するために、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するヒトミクログリアを、３８４ウェルＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａプレートに１ウェル当たり７０００細胞に希釈して播種し、Ｇｌｕｔａｍａｘ＋、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＩＬ３４（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＧＭＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を有するアドバンスドＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で維持した。アッセイの当日、ビオチン化ホスホＴａｕオリゴマー［配列：ＳＣＢｉｏｔ－（ｄＰＥＧ４）ＧＴＰＧＳＲＳＲ（ｐＴ）ＰＳＬＰ（ｐＴ）ＰＰＴＲＥＰＬＬ（配列番号３１５）－アミド］が、１５倍モル過剰のストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）と複合体化することを可能にした。次いで、標識ホスホＴａｕオリゴマーが、およそ２×モル過剰の試験ｍＡｂと結合することを室温で３０分間可能にした。次いで、ｍＡｂ：Ｔａｕオリゴマー複合体を、２０μｌ／ウェルでミクログリアに送達した。インキュベーションの２、４、および８時間後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドの存在下で１５分間室温にて固定した。固定した後、細胞を再びＰＢＳで２回洗浄し、透過処理緩衝剤（０．１％サポニン＋１％魚皮ゼラチン）中４ｕｇ／ｍｌの濃度の、リソソームのマーカーであるＬＡＭＰ１一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７にコンジュゲートした透過処理緩衝剤中１ｕｇ／ｍｌの二次抗体で１時間４℃にて染色した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍｌのヘキストＤＮＡ染色剤で１０分間室温にて対比染色した。次いで、細胞を最後にもう１回ＰＢＳで洗浄し、１ウェル当たり２０ｕｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ共焦点ハイコンテント顕微鏡で画像化した。取得した画像を、ＨａｒｍｏｎｙおよびＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェアを使用して分析した。１条件当たりおよそ５００個の細胞を、ファゴリソソーム構造内のＴａｕオリゴマーの存在についてスコア化し、ＬＡＭＰ１抗体で標識した。
ブレインシャトルｍＡｂはすべて、非ブレインシャトルｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４よりもファゴソーム内へのより効率的な取込みを促進した（図１５）。ブレインシャトルｍＡｂの中では、完全なエフェクター機能を有するもの（ＢＢＢＢ１１３１、１１３４、および１０４６）は、エフェクター機能を有しないものよりも効率的だった。こうしたデータは、ＦｃγＲとの結合を排除して網状赤血球枯渇のリスクを低減しても、抗Ｔａｕ ｍＡｂの治療有効性に影響を及ぼさないはずであることを示している。実際、ＴｆＲ媒介性内部移行およびファゴリソソームへの輸送は、ミクログリアでは、従来のＦｃγＲ媒介性ファゴサイトーシスよりも効率的であると思われる。
他の標的および細胞を使用してもこの観察が繰り返され得るか否かを探究するために、ＲＳＶ Ｆタンパク質の取込みをヒトマクロファージにて評価した。初代ヒトマクロファージを、３８４ウェルＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａプレートに１ウェル当たりおよそ６０００細胞に希釈して播種し、１０％ＦＢＳ、５０ｍｇ／ｍｌマクロファージコロニー刺激因子（ｍＣＳＦ）ＣＳＦ、および２５ｎｇ／ｍｌインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）で補完されたＸ－ＶＩＶＯ １０無血清造血細胞培地で培養した。アッセイの当日、およそ７倍モル過剰のＲＳＶ－Ｆタンパク質（抗Ｈｉｓビオチン化抗体およびストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８と複合体化したＨｉｓタグ付きＦタンパク質）が、抗ＲＳＶｍＡｂ（１ｕｇ／ｍｌ）に結合することを室温で３０分間可能にした。次いで、ｍＡｂ：Ｆタンパク質複合体を２０ｕｌ／ウェルでマクロファージに送達した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識大腸菌（E. Coli）は、ファゴサイトーシスの陽性対照としての役目を果たした。インキュベーションの３時間後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドの存在下で１５分間室温にて固定した。固定した後、細胞を再びＰＢＳで２回洗浄し、透過処理緩衝剤（０．１％サポニン＋１％魚皮ゼラチン）中４ｕｇ／ｍｌの濃度の、リソソームのマーカーであるＬＡＭＰ１一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートした透過処理緩衝剤中１ｕｇ／ｍｌの二次抗体で１時間４℃にて染色した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍｌのヘキストＤＮＡ染色剤で１０分間室温にて対比染色した。次いで、細胞を最後にもう１回ＰＢＳで洗浄し、１ウェル当たり２０ｕｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ共焦点ハイコンテント顕微鏡で画像化した。取得した画像を、ＨａｒｍｏｎｙおよびＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェアを使用して分析した。１条件当たりおよそ３００個の細胞を、ＬＡＭＰ１抗体で標識されたファゴリソソーム構造内のＦタンパク質焦点の存在についてスコア化した。
Ｔａｕ細胞およびミクログリア細胞で観察されたように、ブレインシャトルｍＡｂはすべて、非ブレインシャトルｍＡｂ、Ｂ２１Ｍ－ＩｇＧ１よりも効率的にファゴソーム内への取込みを促進した（図１６）。しかしながら、ＩｇＧ１（ＢＢＢＢ９３２およびＢＢＢＢ９３４）とＩｇＧ１ ＡＡＳ（ＢＢＢＢ３５４およびＢＢＢＢ３６８）ブレインシャトルｍＡｂとの間に取込みの差異は観察されなかった。Ｂ２１Ｍ実験とＴａｕ実験（図１５および図１６）との間の差異が、標的によるものかまたは細胞によるものかはまだ決定されていない。にも関わらず、こうしたデータにより、この機序がロバストであり、ＴｆＲ媒介性内部移行およびファゴリソソームへの輸送が、従来のＦｃγＲ媒介性ファゴサイトーシスと少なくとも同じ程度に効率的であると考えられることが確認される。
本発明者らの知る限り、この非古典的ＡＤＰ機序を治療用ｍＡｂに活用することを記載した刊行物は一切存在しない。理論に束縛されることは望まないが、ファゴサイトーシスおよびエンドサイトーシスは両方とも、ファゴリソソーム経路の収束によって分解に結び付く可能性があり、内部移行誘発要因（ＦｃγＲ媒介性ファゴサイトーシスまたはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシス）に関わりなく、内部移行された積荷は、ファゴリソソームに輸送され、そこで分解されると考えられている。
ｈｕＴｆＲマウスの網膜におけるＰＫ／ＰＤ関係性の評価
次いで、選択した抗ＴｆＲブレインシャトルを、原型抗ＢＡＣＥ（βセクレターゼ）ｍＡｂに融合させ、上記に記載のものと同じ方法を使用して結合親和性を再評価した。表５に示されているように、抗ＴｆＲブレインシャトルの親和性は、Ｂ２１Ｍ ｍＡｂ（抗ヒト呼吸器合胞体ウイルス）および抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂと融合させた場合、類似していた。選択した分子の内部移行を評価し（図４）、抗ＴｆＲブレインシャトルをＢ２１Ｍ ｍＡｂに融合させた場合に観察された内部移行から変化していないことを見出した。
抗ＴｆＲブレインシャトルはマウスＴｆＲにもラットＴｆＲにも結合しないため、原型抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂ（ＢＢＢＢ９７０、ＢＢＢＢ９７８、ＢＢＢＢ９８３）を使用して、ｈｕＴｆＲノックインマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｆｒｃｔｍ２６１８（ＴＦＲＣ）Ａｒｔｅマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ａｒｔｅｍｉｓ））においてｉｎ ｖｉｖｏげっ歯動物研究を実施することになる。抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂを、脳内に輸送されたｍＡｂの量を反映するＢＡＣＥ１阻害を測定するための（その産物ペプチドＡβ１～４０の濃度によって）モデルＰＤ系として選択した。
最初のｉｎ ｖｉｖｏ研究では、ｈｕＴｆＲマウスの網膜におけるＰＫ／ＰＤ関係性を評価することになる。ノックイン（ＫＩ）マウスに、ＢＢＢＢ９７０、ＢＢＢＢ９７８、ＢＢＢＢ９８３、および対照ＢＢＢＢ４５６を１０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投薬することになる。投薬の４時間および２４時間後に、眼および血漿を採取することになる。予定の時点で、マウスをイソフルランの吸入で麻酔することになる。５ｍＬの０．９％生理食塩溶液で全身灌流した後で、ＫＩマウスからマウス眼を収集することになる。収集した眼試料（視神経を除く）を、液体窒素で瞬間凍結し、組織をホモジナイズするまでまたは免疫組織化学用に調製するまで－７０℃で保管することになる。
ＢＡＣＥ活性測定は、マウス眼を溶解マトリックスＤチューブ中でホモジナイズすることによって行うことになる（脳重量１ｍｇ当たり８μｌの０．４％ＤＥＡ／５０ｍＭ ＮａＣｌ、Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ－２４で６回／振盪／秒で２０秒間）。次いで、チューブを、最高速度に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で５分間４℃にて遠心分離することになる。次いで、ホモジネート（上清）を予冷チューブに移すことになり、次いでそれを１３，０００ｒｐｍで７０分間４℃にて遠心分離した。次いで、上清を１０％の０．５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬを含むチューブに移し、アッセイまで－８０℃で凍結することになる。Ａβ１～４０ペプチド標準物質および解凍処理された眼ホモジネートを、ルテニウム（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）、Ｒ９１ＡＮ－１）標識抗Ａβ抗体と１：１で事前に複合体化させる。Ａβ１～４０に対する捕捉抗体を含むブロックキングされたプレートに５０ｕｌの複合体を添加することになる。振盪せずに２～８℃で一晩インキュベーションした後、プレートを洗浄し、２×読取用緩衝剤（ＭＳＤ、Ｒ９２ＴＣ－１）を添加することになる。Ｍｅｓｏ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ６００（ＭＳＤ、ＩＣ０ＡＡ）を使用してプレートを読み取ることになる。
サイトカイン分泌分析
ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアに異なる処置を施した後、細胞上清中の分泌タンパク質の相対濃度を、抗体ベース２９プレックスイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＬＸＳＡＨＭ－２９）を使用して測定した。２９個の分泌タンパク質は、ＢＤＮＦ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ１α、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ３α、Ｇｒｏβ／ＭＩＰ２、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ１０／ＣＲＧ２、ＧＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＬ１α、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１７／ＩＬ１７α、ＭＣＳＦ、ＲＡＧＥ／ＡＧＥＲ、ＴＮＦα、ＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ１、ＣＣＬ４／ＭＩＰ１β、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＦＧＦｂ／ＦＧＦ２、ＧＭＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ１β、ＩＬ４、ＩＬ８／ＣＸＣＬ８、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ２３、ＭＭＰ９、レジスチンだった。
ＰＨＦ Ｔａｕ
５人の組織学的に確認されたＡＤ患者（Ｂｒａａｋ病期Ｖ～ＶＩ）から得られた皮質の死後組織を使用して、（Mercken et al. , Acta Neuropathologica (1992) 84: 265-272; Greenberg, et al. J. biol. Chem. (1992) 267: 564-569）の改変方法によって、部分的に精製されたＰＨＦのプールを生成した。典型的には、５ｇの頭頂皮質または前頭皮質を、１０体積の冷却緩衝剤Ｈ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１０％スクロース／ｐＨ７．４）中にて、ガラス／テフロン製Ｐｏｔｔｅｒ組織ホモジナイザー（ＩＫＡ Ｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ；シュタウフェン、ドイツ）を１０００ｒｐｍで使用してホモジナイズした。ホモジナイズした物質を、２７０００×ｇで２０分間４℃にて遠心分離した。ペレットを廃棄し、上清を、最終濃度１％（重量／体積）のＮ－ラウロイルサルコシンに調整し、３７℃で２時間インキュベートした。続いて、上清を１８４０００×ｇで９０分間２０℃にて遠心分離した。ペレットをＰＢＳで慎重に洗浄し、７５０ｕＬのＰＢＳに再懸濁し、アリコートし、－８０℃で凍結した。ＰＨＦ－Ｔａｕ調製物の品質を、ＡＴ８／ＡＴ８ホスホ凝集体選択的ＭＳＤ ＥＬＩＳＡを使用して評価した。Ｔａｕ含有量を、組換え２Ｎ４ＲＴａｕを較正物質として用いてｈＴａｕ１０（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒ＆Ｄ）を使用したウェスタンブロッティングで決定した。
ＡＤＰをｉｎ ｖｉｖｏで強化するＴｆＲ ＴＴＰ ｍＡｂの能力に関する研究
ＡＤＰをｉｎ ｖｉｖｏで強化するＴｆＲ ＴＴＰ ｍＡｂの能力を、Ｔａｕ接種マウスモデルで研究した。マウスモデルには、Ｐ３０１Ｌ突然変異を有する最も長いヒトＴａｕアイソフォーム（Ｔａｕ－４Ｒ／２Ｎ－Ｐ３０１Ｌ）を発現するトランスジェニックＴａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスを使用した（Terwel, et al. (2005) J Biol Chem; 280(5): 3963-73）。こうしたＴＴＰはマウスＴｆＲ交差反応性を欠如しているため、リードヒトＴｆＲ ＴＴＰと同様の結合特性を有するマウスサロゲートＴＴＰを開発し、この研究で使用した。Ｔａｕ接種モデルは、ＰＨＦ－Ｔａｕを定位海馬注射することを含み、それによってＴａｕ凝集の用量依存的な増加が誘導される（Vandermeeren, et al., J Alzheimers Dis. (2018); 65(1): 265-281）。ｍＡｂの同時注射後に、異なる抗Ｔａｕ ｍＡｂによってＴａｕ接種を中和することにより、このモデルが、ＴａｕのＦｃ媒介性ＡＤＰに部分的に依存することが示された（図２１Ａ）。両抗Ｔａｕ ｍＡｂは、アイソタイプ対照と比較してＴａｕ接種を中和したが、エフェクター機能を有するｍＡｂ（マウスＩｇＧ２ａ）とエフェクター機能を有していないｍＡｂ（マウスＩｇＧ２ａσ（Vafa, et al., Methods. 2014 Jan 1; 65(1): 114-26））との間に統計的有意差が観察されている。これは、このモデルがｍＡｂエフェクター機能に部分的に依存することを示す。
マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃを有するＰＴ１Ｂ８４４である抗Ｔａｕ ｍＡｂと、ヒトＩｇＧ１ ＡＡＳ Ｆｃを有するＰＴ１Ｂ８４４ ＴＴＰ ｍＡｂとを比較する同様の研究を完了した。ｍＡｂの同時注射を使用して、ｍＡｂとＴＴＰ ｍＡｂとの間のＰＫ特性のあらゆる差異を正規化した。両抗Ｔａｕ ｍＡｂは、アイソタイプ対照と比較してＴａｕ接種を中和した。ＴＴＰ ｍＡｂは、完全なＦｃエフェクター機能を有するｍＡｂと比較して少なくとも同じであることを示し、非古典的ＡＤＰ機序がｉｎ ｖｉｖｏで機能性であることが示唆された（図２１Ｂ）。
Ｐ３０１ＬマウスにおけるＰＨＦの定位注射
現在説明されている研究を含むＰＨＦ Ｔａｕ接種研究は、現地倫理委員会（６２８－Ｔａｕ Ｓｐｒｅａｄ、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ）およびＡＡＡＬＡＣガイドラインに準拠した国立機関によって承認されたプロトコールに従って実施されている。Ｐ３０１Ｌ突然変異を有する最も長いヒトＴａｕアイソフォーム（ｔａｕ－４Ｒ／２Ｎ－Ｐ３０１Ｌ）を発現するマウス（Terwel et al., 2005; Peeraer et al., 2015）を、富栄養環境の個別に換気したケージにて１２／１２時間の明暗サイクル（午前６：００に点灯）下で単独飼育した。９０＋／－７日齢の時点で、マウスを、処置群および性別で無作為化し、ＡＤ由来ＰＨＦを右海馬（ＣＡ１）に片側注射した（抗ＩｇＧ２ａ（ｎ＝１９）；抗ホスホＴａｕマウスＩｇＧ２ａ（ｎ＝２０）または抗ホスホＴａｕ ＴＴＥ（ｎ＝２０）の存在下で）。
Ｔａｕ．Ｐ３０１Ｌマウスをイソフルラン（３６％酸素中５％）で深く麻酔し、定位フレームに固定した（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ－Ｎｅｕｒｏｓｔａｒの組合せ）。さらなる手順の間、２％イソフルランレベルを維持した。３０Ｇシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用して、右半球の選択した座標：ブレグマから前後方向－２．０、内外方向＋１．６、硬膜から背腹方向１．４ｍｍに０．２５μｌ／分の速度で３μＬを注射した。体重を注射前および注射後週１回モニターした。すべての注射実験で、処置群と対照群との間に差異は観察されなかった（データ非表示）。
注射の２か月後、マウスを断頭して犠牲にし、同側半球に由来する脳組織を瞬間凍結した。抽出前に、組織を秤量し、組織１００ｍｇ当たり６００μＬの緩衝剤Ｈ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１０％スクロース／ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。ホモジネートを、２７，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を－８０℃で凍結した。
生化学分析ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）
コーティング抗体（ＡＴ８）をＰＢＳで希釈し（１μｇ／ｍＬ）、ＭＳＤプレート（１ウェル当たり３０μＬ）（Ｌ１５ＸＡ、ＭＳＤ、ロックビル、メリーランド州、米国）にアリコートし、４℃で一晩インキュベートした。５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄した後、プレートを、ＰＢＳ中０．１％カゼインでブロッキングし、５×２００μｌのＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０で再度洗浄した。試料と標準物質（両方ともＰＢＳ中０．１％カゼインで希釈）を添加した後、プレートを４℃で一晩インキュベートした。その後、プレートを、５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄し、ＰＢＳ中０．１％カゼイン中のＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）コンジュゲート検出抗体（ＡＴ８）を添加し、６００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートした。最後の洗浄後（５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）、１５０μＬの２×緩衝剤Ｔ（ＭＳＤ）を添加し、プレートを、ＭＳＤイメージャーで読み取った。生信号を、死後ＡＤ脳に由来するサルコシル不溶性調製物（ＰＨＦ）の１６個の希釈物からなる標準曲線に対して正規化し、任意単位（ＡＵ）ＰＨＦとして表した。ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、統計分析（多重検定のボンフェローニ補正付きのＡＮＯＶＡ）を実施した。Ｐ値＜０．０５を、有意差があるとみなした。
考察
受容体媒介性トランスサイトーシスに基づく最適化脳送達プラットフォームを実現するために、ｐＨ依存的様式にて一連の親和性でヒトトランスフェリン受容体（ｈｕＴｆＲ）に特異的に結合するｍＡｂを生成した。ＴｆＲ結合親和性とトランスサイトーシス効率との関係性は、平衡解離定数ＫＤに焦点を当てた数多くの出版物に広範に取り上げられている。ＫＤは重要な尺度であるが、驚くべきことに、トランスサイトーシスに関しては、結合動態ｋａおよびｋｄが重要であることが本発明にて実証された。本発明者らは、送達される治療用ｍＡｂの効率的なトランスサイトーシスおよび薬物動力学的活性のために、オンレートおよびオフレートの両方を最適化する必要があることを発見した。こうした結果に基づくと、最適なトランスサイトーシスは、例えば、ｋａ≧１０５Ｍ－１ｓ－１および中性ｋｄ＝２×１０－３秒－１の場合に生じる。理論に束縛されることは望まないが、オンレートとオフレートとの相互関係は、分極細胞でのタンパク質輸送に関与する多様な細胞内小胞による効率的な経細胞輸送を確保するために重要であるという仮説が立てられる。
カニクイザルにトリポッドｍＡｂを投薬すると、対照ｍＡｂよりも６～１２×の脳内濃度の増強がもたらされることが示された。酸性ＦｃＲｎ結合の増加は、末梢クリアランスの低減および脳内濃度の増強をもたらした。通常の生理学的条件下では、脳からのＦｃＲｎ媒介性抗体排出は、脳内の望ましくない炎症および免疫応答を回避することによって脳恒常性を維持する上で重要である可能性が高い（Schlachetzki, Zhu et al. 2002, Roopenian and Akilesh 2007）。有力な証拠が、ＦｃＲｎ媒介性抗体流出に果たす役割が強力であることを示唆するが、このクリアランス機序については議論の余地が残っている（Garg and Balthasar 2009, Abuqayyas and Balthasar 2013）。本発明者らは、ＦｃＲｎに対する結合親和性の増加が、末梢濃度および脳内濃度の両方に肯定的な影響を及ぼすことを発見した。これは、この系ではいかなる排出増強もあまり著しいものではないことが示唆される。トリポッドｍＡｂを使用したカニクイザルでの用量反応実験では、輸送機序の飽和性が示された。飽和性はこの種では３０ｍｇ／ｋｇで生じる。カニクイザルでの広範な反復投薬、用量反応特徴付けも完了させた。これにより、ヒト用量の予測および特定の治療適用に対するこのプラットフォームの有用性が大きく支援されることになる。
網状赤血球枯渇は、ＴｆＲ結合抗体の既知安全性不利益である。本発明者は、エフェクター機能コンピテントｍＡｂでは、実際に急性でほぼ完全な網状赤血球枯渇を観察することができることを観察した。エフェクター機能の低減｛Couch, 2013 #589｝および分子アーキテクチャ｛Weber, 2018 #590｝を含む、この枯渇を回避するための数多くのアプローチが記載されている。本発明者らは、末梢エフェクター機能を立体的に減衰させることが可能であると記載されているものと非常に類似したアーキテクチャを使用したが、エフェクター機能コンピテントｍＡｂではロバストな網状赤血球枯渇を観察した。
Ｆｃ突然変異誘発の明らかな欠点は、治療用ｍＡｂからエフェクター機能が排除されることである。ベータアミロイドおよびＴａｕのような、脳内の多くの治療標的にとって、ＡＤＰは、有効性に重要であると考えられている。以前の研究では、ＴｆＲを含むリサイクル受容体は、多価積荷結合によって選別細管から除外され、リソソームに転送され得ることが示されている（Marsh, 1995, J Cell Biol (1995) 129 (6): 1509-1522; Weflen, 2013 Mol Biol Cell. 2013 Aug 1; 24(15): 2398-24050）。本発明者らは、多価積荷のこの内因性転送を、ＡＤＰの代替的非古典的非ＦｃγＲ機序として使用することができることを示した。非古典的および古典的ＡＤＰによって内部移行されたＴａｕは、ミクログリアでは同様に輸送され、Ｔａｕ凝集体は、分解のためにエンドリソソーム系からリソソームへと輸送される。記載されている非古典的ＡＤＰは、有効性のためにはＡＤＰを必要とするが、安全性のためには古典的ＡＤＰが有害である様々な治療適用に活用することができる。
こうしたデータは、非古典的ＡＤＰが、古典的ＡＤＰよりも効率的であることを示している。これは、ＦｃγＲとＴｆＲとの結合および内部移行に固有の違いがあることによる可能性がある。ＦｃγＲ媒介性内部移行は、ｍＡｂによる受容体クラスター化を必要とするが、ＴｆＲは、ｍＡｂ結合とは無関係に急速に内部移行およびリサイクルされる。第２の考え得る説明は、マクロファージ枯渇およびミクログリア枯渇である（Zent, 2017 FEBS J. 2017 Apr; 284(7):1021-1039）。マクロファージ枯渇は、マクロファージが標的に曝露される時間の長さに依存すると考えられる（Church, VanDerMeid et al. 2016, Clin Exp Immunol. 2016 Jan;183(1):90-101）（Mukundan, 2009, Nat Med. 2009 Nov;15(11):1266-72）。これは、古典的ＡＤＰが時間と共に停止するという本発明者らの観察と一致している。マクロファージ枯渇の観察は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび患者でなされており、この枯渇表現型が、エフェクター機能を有するｍＡｂの治療有効性に影響を及ぼす可能性があることを示している。非古典的ＡＤＰは、有効性の利点を提供し、ＦｃγＲと結合することでミクログリアを活性化することなくＡＤＰを媒介することによって、この枯渇表現型を回避する。
非古典的ＡＤＰの別の利点は、ミクログリアの活性化を回避することによって、炎症促進性サイトカインの産生を刺激することなくＡＤＰが生じることである。特に、慢性神経炎症を既に罹患している患者の神経炎症の増加に関する脳内疾患の処置にエフェクター機能コンピテントｍＡｂを使用することの安全性に関しては議論の余地が残っている（｛Heneka, 2015 #591｝に概説）。加えて、炎症の増加が関与すると考えられる神経変性疾患の病因において炎症が果たす役割、ならびに議論中のすでに疲弊している可能性のあるミクログリアに係合するかまたはそれをさらに活性化する能力に対する注目が高まっている。例えば、古典的ＡＤＰのニューロンに対する毒性効果が示されており、エフェクター機能コンピテントｍＡｂが安全上のリスクを呈する可能性があるという仮説が立てられていた｛Lee, 2016 #592｝。ここに記載の非古典的ＡＤＰ機序は、ミクログリアを活性化する必要も炎症促進性サイトカインの放出を刺激する必要もなくＴａｕの効率的なクリアランスを強化することによって、潜在的な神経炎症の不利益を回避する。結論として、ロバストな脳送達プラットフォームは、薬物動態、薬物動力学、および安全性が特徴付けられており、臨床試験に進むために必要なロバストな前臨床特徴付けが確立されている。
ｓｃＦｖブレインシャトルとしてフォーマットし、原型抗ＢＡＣＥ（ベータセクレターゼ）アンタゴニストｍＡｂと融合すると、ｈｕＴｆＲを発現するトランスジェニックマウスのｉ．ｖ．投薬後に、脳内濃度が、抗ＢＡＣＥ ｍＡｂ単独よりも４～１０×向上することが観察された。強力なＰＫ：ＰＤ関係性も確認され、ベータ－アミロイドの用量依存的減少が検出された。性能が最も高いブレインシャトルは、競合分子よりも脳送達を増強し、ブレインシャトルとｈｕＴｆＲとの結合相互作用を最適化することによってクラス最高の送達を達成した。
次いで、最適化されたブレインシャトルを、Ｔａｕ結合ｍＡｂであるＰＴ１Ｂ８４４に融合した。ＰＴ１Ｂ８４４と融合したブレインシャトルを、カニクイザルにｉ．ｖ．投薬すると、脳内濃度の６～１６倍の向上を示した。マウスデータと同様に、脳内濃度の向上は、文献に報告されている最良のブレインシャトルを上まわった。優れた脳ＰＫに加えて、本ブレインシャトルは、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能を低減させるように遺伝子操作されており、競合者によって報告されているようなカニクイザルでの急速な網状赤血球枯渇を誘発しない。重要なことに、ブレインシャトルは、ミクログリアによるＴａｕ取込みの媒介が、ＰＴ１Ｂ８４４単独よりも効率的であるため、Ｆｃ機能の喪失は、治療用Ｔａｕ ｍＡｂの有効性に影響を及ぼさない。
当業者であれば、その幅広い発明概念から逸脱することなく、上記に記載の実施形態に変更をなすことができることを理解するだろう。したがって、本発明は、本開示の特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲内の改変を包含することが意図されていることが理解される。
引用文献
Figure 2023520821000020

Claims (26)

  1. 薬剤を、それを必要とする対象の脳に送達するための抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片であって、中性ｐＨにおいて、少なくとも１ｎＭ、好ましくは、１～５００ｎＭの解離定数ＫＤで、酸性ｐＨ、好ましくは、ｐＨ５において、少なくとも１０－４秒－１、好ましくは１０－４～１０－１秒－１の解離速度定数ｋｄで、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、好ましくは、ヒトＴｆＲ１に結合する、抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
  2. 中性ｐＨにおいて、２×１０－２～２×１０－４秒－１、好ましくは、２．０×１０－３秒－１の解離速度定数ｋｄを有する、請求項１に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
  3. （１）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、
    （ｉ）それぞれ、配列番号２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、および２９７、
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、および２８４、
    （ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４、
    （ｉｖ）それぞれ、配列番号５７、５８、５９、６０、６１、および６２、
    （ｖ）それぞれ、配列番号８５、８６、８７、８８、８９、および９０、
    （ｖｉ）それぞれ、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、および１１５、
    （ｖｉｉ）それぞれ、配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および１４０、
    （ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、および１９６、
    （ｉｘ）それぞれ、配列番号２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、および２４９、
    （ｘ）それぞれ、配列番号２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、および２６８、
    （ｘｉ）それぞれ、配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、および３５０、
    （ｘｉｉ）それぞれ、配列番号３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、および３６０、
    （ｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、および３７０、
    （ｘｉｖ）それぞれ、配列番号３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、および３８０、
    （ｘｖ）それぞれ、配列番号３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、および３９０、
    （ｘｖｉ）それぞれ、配列番号３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、および４００、
    （ｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、および４１０、
    （ｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、および４２０、
    （ｘｉｘ）それぞれ、配列番号４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、および４３０、
    （ｘｘ）それぞれ、配列番号４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、および４４０、
    （ｘｘｉ）それぞれ、配列番号４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、および４５０、
    （ｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、および４６０、
    （ｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、および４７０、
    （ｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、および４８０、
    （ｘｘｖ）それぞれ、配列番号４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、および４９０、
    （ｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、および５００、
    （ｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、および５１０、
    （ｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、および５２０、
    （ｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、および５３０、
    （ｘｘｘ）それぞれ、配列番号５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、および５４０、もしくは
    （ｘｘｘｉ）それぞれ、配列番号５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、および５５０
    のアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、
    または
    （２）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）であって、
    （ｉ）それぞれ、配列番号７、８、および９、
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号３１７、３１８、および３１９、
    （ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３２４、３２５、および３２６、
    （ｉｖ）それぞれ、配列番号３３１、３３２、および３３３、もしくは
    （ｖ）それぞれ、配列番号３３８、３３９、および３４０
    のアミノ酸配列を有する、重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）
    を含む、請求項１または２に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
  4. 配列番号６、３１６、３２３、３３０、または３３７に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ断片である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
  5. リンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合的に連結された重鎖可変領域を含む、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、好ましくは、前記リンカーが、配列番号３１４のアミノ酸配列を有し、より好ましくは、前記ｓｃＦｖが、配列番号２７８、２９１、２８、５６、８４、１０９、１３４、１６２、１９０、２１８、２４３、２６２、３４４、３５４、３６４、３７４、３８４、３９４、４０４、４１４、４２４、４３４、４４４、４５４、４６４、４７４、４８４、４９４、５０４、５１４、５２４、５３４、または５４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片。
  6. 治療剤または診断剤に連結された、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片を含む、コンジュゲートであって、好ましくは、前記コンジュゲートが、ＴｆＲに結合し、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原結合性断片を含む、第１の抗原結合性領域と、脳の標的、例えば、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６からなる群から選択される脳の標的に結合する、第２の抗原結合性領域とを含む、多重特異性抗体である、コンジュゲート。
  7. 脳の標的、例えば、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６からなる群から選択される脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に連結された、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片を含む、融合構築物。
  8. 前記抗ＴｆＲ抗体またはその抗原結合性断片が、リンカーを介して前記第２の抗体またはその抗原結合性断片の２つの重鎖のうちの一方のみのカルボキシ末端に共有結合的に連結されており、好ましくは、前記リンカーが、配列番号３１２または配列番号３１３のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の融合構築物。
  9. 前記第２の抗体またはその抗原結合性断片の前記２つの重鎖のそれぞれが、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して、１つもしくは複数のヘテロ二量体突然変異、例えば、改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメイン、または１つもしくは複数のノブ・アンド・ホール突然変異を含む、請求項８に記載の融合構築物。
  10. 前記ヘテロ二量体突然変異が、Ｔ３５０位、Ｌ３５１位、Ｆ４０５位、およびＹ４０７位におけるアミノ酸改変を含む前記第１の重鎖の前記改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメイン、ならびにＴ３５０位、Ｔ３６６位、Ｋ３９２位、およびＴ３９４位におけるアミノ酸改変を含む前記第２の重鎖の前記改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含み、Ｔ３５０位における前記アミノ酸改変が、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３５０Ｉ、Ｔ３５０Ｌ、またはＴ３５０Ｍであり、Ｌ３５１位における前記アミノ酸改変が、Ｌ３５１Ｙであり、Ｆ４０５位における前記アミノ酸改変が、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、またはＦ４０５Ｓであり、Ｙ４０７位における前記アミノ酸改変が、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ａ、またはＹ４０７Ｉであり、Ｔ３６６位における前記アミノ酸改変が、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｍであり、Ｋ３９２位における前記アミノ酸改変が、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｌ、またはＫ３９２Ｍであり、Ｔ３９４位における前記アミノ酸改変が、Ｔ３９４Ｗであり、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである、請求項９に記載の融合構築物。
  11. 前記第１の重鎖の前記改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、前記第２の重鎖の前記改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含む、請求項１０に記載の融合構築物。
  12. 前記第２の抗体またはその抗原結合性断片が、胎児性Ｆｃ受容体（ＲｃＲｎ）への前記融合体の結合を増強させる、Ｆｃドメインにおける１つまたは複数の突然変異を含み、好ましくは、前記１つまたは複数の突然変異が、酸性ｐＨにおいて前記結合を増強させ、より好ましくは、前記Ｆｃが、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）突然変異を有し、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである、請求項７から１１のいずれか一項に記載の融合体。
  13. 前記第２の抗体またはその抗原結合性断片が、エフェクター機能を低減または排除する、前記Ｆｃドメインにおける１つまたは複数の突然変異を含み、好ましくは、前記Ｆｃが、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位における１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を有し、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである、請求項７から１２のいずれか一項に記載の融合体。
  14. 前記第２の抗体またはその抗原結合性断片が、Ｔａｕに結合し、それぞれ配列番号５５４～５５９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記第２の抗体が、配列番号３１０のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号３１１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含むモノクローナル抗体である、請求項７から１３のいずれか一項に記載の融合構築物。
  15. （１）配列番号３０１、３０４、３０７、２８５、２８８、２９８、１０、１３、１６、１９、２２、２５、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２５０、２５２、２５６、２５９、２６９、２７２、２７５、３２０、３２７、３３４、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、および４７１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第１の重鎖と、
    （２）それぞれ３０２、３０５、３０８、２８６、２８９、２９９、１１、１４、１７、２０、２３、２６、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２５１、２５３、２５７、２６０、２７０、２７３ ２７６、３２１、３２８、３３５、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、および４７２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を、それぞれが独立して有する、２つの軽鎖と、
    （３）それぞれ３０３、３０６、３０９、２８７、２９０、３００、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２５２、２５４、２５８、２６１、２７１、２７４、２７７、３２２、３２９、３３６、３４３、３５３、３６３、３７３、３８３、３９３、４０３、４１３、４２３、４３３、４４３、４５３、４６３、および４７３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第２の重鎖と
    を含む、請求項７から１４のいずれか一項に記載の融合構築物。
  16. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、請求項６に記載のコンジュゲート、または請求項７から１５のいずれか一項に記載の融合構築物をコードする、単離された核酸。
  17. 請求項１６に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
  18. 請求項１６に記載の核酸または請求項１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  19. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、請求項６に記載のコンジュゲート、または請求項７から１５のいずれか一項に記載の融合構築物を産生させる方法であって、前記抗体もしくは抗原結合性断片、前記コンジュゲート、または前記融合構築物をコードする核酸を含む細胞を、前記抗体もしくは抗原結合性断片、前記コンジュゲート、または前記融合構築物を産生させる条件下において培養するステップと、前記抗体もしくは抗原結合性断片、前記コンジュゲート、または前記融合構築物を、前記細胞または細胞培養物から回収するステップとを含む、方法。
  20. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、請求項６に記載のコンジュゲート、または請求項７から１５のいずれか一項に記載の融合構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  21. 障害、好ましくは、神経学的障害の処置または検出を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、請求項６に記載のコンジュゲート、請求項７から１５のいずれか一項に記載の融合構築物、または請求項２０に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、好ましくは、前記神経学的障害が、神経変性疾患（例えば、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症）、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病および核上性麻痺）、プリオン病（例えば、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、慢性消耗性疾患、および致死性家族性不眠症）、球麻痺、運動ニューロン疾患、および神経系ヘテロ変性障害（nervous system heterodegenerative disorder）（例えば、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥーレット病、メンケス症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト・ルントボルグ病）、認知症（例えば、ピック病および脊髄小脳失調症）、ならびにＣＮＳおよび／または脳のがん（例えば、身体の他の箇所のがんから生じる脳転移）からなる群から選択される、方法。
  22. 前記抗体もしくはその抗原結合性断片、コンジュゲート、または医薬組成物が、静脈内投与される、請求項２１に記載の方法。
  23. 治療剤または診断剤を、それを必要とする対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて送達する方法であって、前記対象に、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片に連結、好ましくは共有結合的にコンジュゲートされた前記治療剤または診断剤を含む、複合体を投与するステップを含む、方法。
  24. 前記投与が、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能を低減させる、および／または急速な網状赤血球枯渇を誘導しない、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  25. 抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）の誘導を、それを必要とする対象において、炎症促進性サイトカインの分泌を刺激することなく行う方法であって、前記対象に、請求項１から５のいずれか一項に記載のその抗原結合性断片に連結、好ましくは、共有結合的にコンジュゲートされた治療用抗体またはその抗原結合性断片を含む、複合体を投与するステップを含み、前記治療用抗体またはその抗原結合性断片が、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位における１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を含み、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである、方法。
  26. 前記治療用抗体またはその抗原結合性断片が、ｔａｕ凝集体に特異的に結合する、請求項２５に記載の方法。
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