CN116096427A - 用于血脑屏障递送的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于递送药剂到有需要的受试者的脑的单克隆抗‑TfR抗体和其抗原结合片段。还描述了含有与治疗剂或诊断剂(例如第二抗体和其抗原结合片段)偶联的抗‑TfR抗体或其抗原结合片段的缀合物和融合构建体，用于治疗或检测神经学病症和/或跨血脑屏障递送治疗剂或诊断剂。还描述了编码所述抗体、缀合物和融合构建体的核酸以及相关的重组宿主细胞。

Description

用于血脑屏障递送的组合物和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月8日提交的美国临时申请号63/006,998和2020年6月8日提交的美国临时申请号63/036,020的优先权，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
对电子方式提交的序列表的引用
本申请含有序列表，其作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web以电子方式提交，文件名称为“004852.158WO1-Sequence_ Listing”，创建日期为2021年3月30日，并且大小为1.3 MB。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并且通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明涉及结合人转铁蛋白受体(TfR)的血脑屏障穿梭载体以及其使用方法。
发明背景
尽管血脑屏障(BBB)阻止有害物质进入脑并且对于脑稳态是必需的，但它对于有效递送药物至脑，呈现出强大的阻碍。大分子，例如单克隆抗体和其它生物治疗剂，对于治疗/检测中枢神经系统(CNS)中的病理，具有极大的治疗/诊断潜力。然而，它们进入脑中的路线被BBB阻碍。之前的研究已经表明，仅极小比例(大约0.1%)的注入血流中的IgG能够穿过BBB进入CNS隔室(Felgenhauer,  Klin. Wschr. 52: 1158-1164, 1974))。由于在CNS内抗体的低浓度，这将限制任何药理学效果。
已经研究了许多方法来改进治疗性单克隆抗体(mAb)的脑递送，包括使用受体介导的转胞吞作用(RMT)。RMT利用在BBB的内腔侧上大量表达的受体来运输通过脑内皮细胞。产生临床上可行的平台以递送治疗性mAb到脑中的之前工作关注抗体改造以增加转胞吞作用的效率，其中通过结合价位、pH依赖性和亲和力方面的观察结果而获益(综述于Goulatis等, 2017,  Curr Opin Struct Biol 45: 109-115)。然而，到NHP和临床的转变受到来自靶标介导药物处置(TMDD)的快速外周清除率和来自急性网织红细胞耗竭的安全性的限制(Gadkar, 2016, Eur J Pharm Biopharm. 2016 Apr;101:53-61)。转铁蛋白受体(TfR)，特别是TfR1，介导荷铁转铁蛋白(Tf)从血液转运到脑以及缺铁Tf回到血液(Kawabata,  Free  Radical Biology & Medicine, 133, 46–54, 2019)。抗-TfR1单克隆抗体已用于将药物递送至脑(Burkhart等 Progress in neurobiology, 181, 101665, 2019)。然而，抗-TfR1单克隆抗体的安全性负累和差的药代动力学(PK)已经妨碍了它们作为BBB载体的临床开发。
因此，对于可用于将药物以改进的安全性和PK有效穿梭至脑中的抗-TfR单克隆抗体或其抗原结合片段，存在需要。
发明概述
本申请涉及用于脑递送的优化平台，不仅考虑了递送的药剂例如治疗性单克隆抗体(mAb)的脑浓度，而且考虑了mAb的治疗相关特征，包括mAb的外周药代动力学、安全性和药效学。所述平台利用TfR结合分子，特别是结合转铁蛋白受体(TfR)、优选地人转铁蛋白受体1 (huTfR1)的抗体或其抗原结合片段，其中所述TfR结合分子已经优化了在6.8-7.8的中性pH，例如生理pH (例如，7.4)和4.5-6.5的酸性pH，例如通常在内体隔室中存在的酸性pH二者下由结合速率ka和解离速率kd值定义的运输功能。
本发明人出人意料地发现，最优值不仅仅是最快结合速率ka值和最慢解离速率kd值，如在典型的抗体-靶标相互作用中可能预期的。即是说，对于该系统，不一定想使用以相对高的速率“结合”和缔合TfR，然后较缓慢地从TfR解离以具有最长寿命的抗体-靶标复合物的分子。而是，在一个实施方案中，本文所述的TfR结合剂的优化的运输功能优选地具有在生理pH (例如，7.4)和较低pH (例如，6.5或6.0)二者下类似(例如，在相同数量级内)的ka速率，但当与在生理pH (例如，7.4)下的kd速率相比时在较低pH (例如，pH 6.5或6.0)下具有更快的解离速率kd。
在一个一般方面，本申请描述了抗-TfR抗体或其抗原结合片段，用于递送治疗剂或诊断剂至有需要的受试者的脑，其中抗-TfR抗体或其抗原结合片段以在中性pH下至少1nM、优选地1 nM至500 nM的解离常数KD和在酸性pH、优选地pH 5下至少10-4 sec-1、优选地10-4至10-1 sec-1的解离速率常数kd，结合转铁蛋白受体(TfR)，优选地人TfR1。
在一些实施方案中，权利要求1的抗-TfR抗体或其抗原结合片段在中性pH下具有2x 10-2至2 x 10-4 sec-1、优选地2.0 x 10-3 sec-1的解离速率常数kd。
在另一个实施方案中，本文所述的某些TfR结合剂的优化的运输功能优选地在生理酸性pH (例如，7.4)下具有至少1.05 x 105的ka速率和至少2.0 x 10-3 s-1或更快的kd速率。前述pH、KD、ka和kd参数仅反映了优化的转胞吞作用条件，并且绝不限制我们的发现，即与本文的某些TfR结合剂缀合的某些分子的TfR介导的运输然而可发生在所述优选参数之外。
在一个一般方面，本申请涉及抗体或其抗原结合片段，用于递送药剂至有需要的受试者的脑，其中所述抗体或其抗原结合片段结合转铁蛋白受体(TfR)，优选地人转铁蛋白受体1 (huTfR1)，包含
(1) 包含重链互补决定区(HCDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区和包含轻链互补决定区(LCDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有以下氨基酸序列：
(i)分别为SEQ ID NO: 292、293、294、295、296和297；
(ii)分别为SEQ ID NO: 279、280、281、282、283和284；
(iii)分别为SEQ ID NO: 29、30、31、32、33和34；
(iv)分别为SEQ ID NO: 57、58、59、60、61和62；
(v)分别为SEQ ID NO: 85、86、87、88、89和90；
(vi)分别为SEQ ID NO: 110、111、112、113、114和115；
(vii)分别为SEQ ID NO: 135、136、137、138、139和140；
(viii)分别为SEQ ID NO: 191、192、193、194、195和196；
(ix)分别为SEQ ID NO: 244、245、246、247、248和249；
(x)分别为SEQ ID NO: 263、264、265、266、267和268；
(xi)分别为SEQ ID NO: 345、346、347、348、349和350；
(xii)分别为SEQ ID NO: 355、356、357、358、359和360；
(xiii)分别为SEQ ID NO: 365、366、367、368、369和370；
(xiv)分别为SEQ ID NO: 375、376、377、378、379和380；
(xv)分别为SEQ ID NO: 385、386、387、388、389和390；
(xvi)分别为SEQ ID NO: 395、396、377、398、399和400；
(xvii)分别为SEQ ID NO: 405、406、407、408、409和410；
(xviii)分别为SEQ ID NO: 415、416、417、418、419和420；
(xix)分别为SEQ ID NO: 425、426、427、428、429和430；
(xx)分别为SEQ ID NO: 435、436、437、438、439和440；
(xxi)分别为SEQ ID NO: 445、446、447、448、449和450；
(xxii)分别为SEQ ID NO: 455、456、457、458、459和460；
(xxiii)分别为SEQ ID NO: 465、466、467、468、469和470；
(xxiv)分别为SEQ ID NO: 475、476、477、478、479和480；
(xxv)分别为SEQ ID NO: 485、486、487、488、489和490；
(xxvi)分别为SEQ ID NO: 495、496、497、498、499和500；
(xxvii)分别为SEQ ID NO: 505、506、507、508、509和510；
(xxviii)分别为SEQ ID NO: 515、516、517、518、519和520；
(xxix)分别为SEQ ID NO: 525、526、527、528、529和530；
(xxx)分别为SEQ ID NO: 535、536、537、538、539和540；或
(xxxi)分别为SEQ ID NO: 545、546、547、548、549和550；或者
(2)重链单一可变结构域(VHH)，其包含具有以下氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(i)分别为SEQ ID NO: 7、8和9；
(ii)分别为SEQ ID NO: 317、318和319；
(iii)分别为SEQ ID NO: 324、325和326；
(iv)分别为SEQ ID NO: 331、332和333；或
(v)分别为SEQ ID NO: 338、339和340。
在某些实施方案中，本申请涉及抗-TfR VHH片段，其包含与SEQ ID NO: 6、316、323、330或337具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列。
在其它实施方案中，本申请涉及抗-TfR单链可变片段(scFv)，其包含通过接头共价连接至轻链可变区的重链可变区，优选地所述接头具有SEQ ID NO: 314的氨基酸序列。更优选地，所述scFv包含与SEQ ID NO: 278、291、28、56、84、109、134、162、190、218、243、262、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534或544的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列。
本申请的另一个方面涉及缀合物，其包含与治疗剂或诊断剂、例如神经学病症药物或用于检测神经学病症的药剂偶联的本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段。优选地，治疗剂或诊断剂是结合脑靶标的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本申请涉及融合构建体，其包含与第二抗体或其抗原结合片段共价连接的本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，所述第二抗体或其抗原结合片段结合脑靶标，例如选自β-分泌酶1 (BACE1)、β淀粉样蛋白(Abeta)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2 (HER2)、Tau、载脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、亨廷顿蛋白、朊蛋白(PrP)、富含亮氨酸的重复激酶2 (LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受体6 (DR6)、淀粉样前体蛋白(APP)、p75神经营养因子受体(p75NTR)和胱天蛋白酶6的脑靶标。
在某些实施方案中，本申请的融合构建体包含第二抗体或其抗原结合片段，其结合Tau并包含分别具有SEQ ID NO: 554-559的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。优选地，所述第二抗体是包含具有SEQ ID NO: 310的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO: 311的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体。
在一个实施方案中，本申请的融合构建体包含通过接头共价连接至结合脑靶标的第二抗体或其抗原结合片段的两条重链中仅一条的羧基末端的本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，优选地抗-huTfR1 VHH或scFv片段。优选地，所述接头具有SEQ ID NO: 312或SEQ ID NO: 313的氨基酸序列。
在某些实施方案中，与野生型CH3结构域相比，第二抗体或其抗原结合片段的两条重链各自包含修饰的恒定重链3 (CH3)结构域，以促进在两条重链之间形成异二聚体。可使用促进在两条重链之间形成异二聚体的任何突变。优选地，第一重链的修饰的CH3结构域包含位置T350、L351、F405和Y407的氨基酸修饰，和第二重链的修饰的CH3结构域包含位置T350、T366、K392和T394的氨基酸修饰。优选地，位置T350的氨基酸修饰是T350V、T350I、T350L或T350M；位置L351的氨基酸修饰是L351Y；位置F405的氨基酸修饰是F405A、F405V、F405T或F405S；位置Y407的氨基酸修饰是Y407V、Y407A或Y407I；位置T366的氨基酸修饰是T366L、T366I、T366V或T366M；位置K392的氨基酸修饰是K392F、K392L或K392M；和位置T394的氨基酸修饰是T394W。更优选地，第一重链的修饰的异二聚体CH3结构域包含突变T350V、L351Y、F405A和Y407V，和第二重链的修饰的异二聚体CH3结构域包含突变T350V、T366L、K392L和T394W。在整个说明书中，抗体的氨基酸残基的编号根据Kabat等, Sequences ofProteins of Immunological Interest, 第五版. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (1991)中描述的EU索引进行，除非另外明确说明。
在某些实施方案中，第二抗体或其抗原结合片段的片段可结晶区(Fc区)含有改变(增加或减少)、优选地消除效应子功能、例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的置换。优选地，第二抗体或其抗原结合片段的Fc区包含降低或废除第二抗体或其抗原结合片段与Fc γ受体(FcγR)的结合和避免效应子功能介导的毒性的一个或多个氨基酸修饰。例如，第二抗体或其抗原结合片段的Fc区可包含位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329的一个或多个氨基酸修饰，例如L234A、L235A和P331S的一个、两个或三个突变，其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。
在某些实施方案中，第二抗体或其抗原结合片段的Fc区含有改变(增加或减少)、优选地增加第二抗体或其抗原结合片段与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的置换。优选地，所述一个或多个突变增强在酸性pH下的结合，更优选地所述Fc具有M252Y/S254T/T256E(YTE)突变，其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。
在某些实施方案中，本申请的融合构建体包含：
(1)第一重链，其具有与选自SEQ ID NO: 301、304、307、285、288、298、10、13、16、19、22、25、35、38、41、44、47、50、53、63、66、69、72、75、78、81、91、94、97、100、103、106、116、119、122、125、128、131、141、144、147、150、153、156、159、169、172、175、178、181、184、187、197、200、203、206、209、212、215、225、228、231、234、237、240、250、252、256、259、269、272、275、320、327、334、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461和471的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列；
(2)两条轻链，各自独立地具有分别与选自302、305、308、286、289、299、11、14、17、20、23、26、36、39、42、45、48、51、54、64、67、70、73、76、79、82、92、95、98、101、104、107、117、120、123、126、129、132、142、145、148、151、154、157、160、170、173、176、179、182、185、188、198、201、204、207、210、213、216、226、229、232、235、238、241、251、253、257、260、270、273、276、321、328、335、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462和472的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列；和
(3)第二重链，其具有分别与选自303、306、309、287、290、300、12、15、18、21、24、27、37、40、43、46、49、52、55、65、68、71、74、77、80、83、93、96、99、102、105、108、118、121、124、127、130、133、143、146、149、152、155、158、161、171、174、177、180、183、186、189、199、202、205、208、211、214、217、227、230、233、236、239、242、252、254、258、261、271、274、277、322、329、336、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463和473的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列。
本申请的另一个一般方面涉及分离的核酸，其编码本申请的抗体或抗原结合片段、缀合物或融合构建体。还提供了包含本申请的分离的核酸的载体，包含本申请的所述核酸或所述载体的宿主细胞。
本申请的另一个一般方面涉及产生本申请的抗体或抗原结合片段、缀合物或融合构建体的方法。所述方法包括在产生抗体或抗原结合片段、缀合物或融合构建体的条件下培养包含本申请的核酸的细胞，并且从细胞或细胞培养物回收所述抗体或抗原结合片段、缀合物或融合构建体。
进一步提供了药物组合物，其包含本申请的缀合物或融合构建体和药学上可接受的载剂。
本申请的另一个一般方面涉及治疗或检测有需要的受试者的神经学病症的方法，其包括给予所述受试者有效量的本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段、缀合物或融合构建体或药物组合物。优选地，神经学病症选自神经退行性疾病(例如路易体病(Lewy bodydisease)、脊髓灰质炎后综合征、Shy-Draeger综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩)、tau蛋白病(例如阿尔茨海默病和核上性麻痹)、朊病毒病(例如牛海绵状脑病、羊搔症、克雅氏综合征、库鲁病(kuru)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、慢性消耗病和致命性家族性失眠症)、延髓麻痹、运动神经元病和神经系统异变性疾病(例如卡纳万病(Canavan disease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大病(Alexander'sdisease)、图雷特综合征(Tourette's syndrome)、门克斯扭结发综合征(Menkes kinkyhair syndrome)、科凯恩综合征(Cockayne syndrome)、Hallervorden-Spatz综合征、拉福拉病(lafora disease)、雷特综合征(Rett syndrome)、肝豆状核变性、Lesch-Nyhan综合征和Unverricht-Lundborg综合征)、痴呆(例如皮克氏病和脊髓小脑性共济失调)和CNS和/或脑的癌症(例如身体别处的癌症导致的脑转移)。
优选地，本申请的抗体或其抗原结合片段、缀合物、融合构建体或药物组合物经静脉内给予。
还描述了递送治疗剂或诊断剂至有需要的受试者的脑的方法，其包括给予所述受试者包含与本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段偶联的治疗剂或诊断剂的缀合物。优选地，治疗剂或诊断剂是结合脑靶标的第二抗体或其抗原结合片段。更优选地，与给予没有与本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段偶联的治疗剂或诊断剂相比，给予与本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段偶联的治疗剂或诊断剂至受试者的脑导致Fc介导的效应子功能减少和/或不引起快速网织红细胞耗竭。
本发明的又一个一般方面涉及在有需要的受试者中诱导抗体依赖性吞噬作用(ADP)而不刺激促炎细胞因子的分泌的方法，其包括给予所述受试者包含与根据本发明的实施方案的其抗原结合片段偶联、优选地共价缀合的治疗性抗体或其抗原结合片段的复合物，其中所述治疗性抗体或其抗原结合片段不具有效应子功能，例如所述治疗性抗体或其抗原结合片段包含位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329的一个或多个氨基酸修饰，例如L234A、L235A和P331S的一个、两个或三个突变，其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。优选地，所述治疗性抗体或其抗原结合片段与tau聚集体特异性结合。
本发明的其它方面、特征和益处从以下公开内容(包括本发明的详细描述和其优选的实施方案)以及随附的权利要求将是明显的。
附图简述
前文的概述以及随后的发明详细描述当结合附图阅读时将得到更好理解。为举例说明本发明的目的，在附图中显示了当前优选的实施方案。然而应理解，本发明不限于附图中显示的精确实施方案。
专利或申请文件含有至少一个以彩色完成的附图。本专利或专利申请公布的具有彩色附图的副本经请求和支付必要的费用后将由专利局提供。
图1是用于脑递送平台的三足(tripoid) mAb格式(亦称为TTP mAb)的示意图。
图2是显示三足mAb在人脑内皮细胞中的内化的图像。三足mAb染色成红色，细胞核是蓝色，以及肌动蛋白是绿色。
图3是显示pH依赖性结合的图，其通过比较pH 7.4的解离速率与pH降低到6.5和6.0时的解离速率来评价。如果解离速率随着pH降低而更快，则三足mAb评分为正的。
图4是显示三足mAb BBBB383在人脑内皮细胞中的内化的图像。三足mAb染色成红色，细胞核是蓝色，以及肌动蛋白是绿色。
图5A-图5B是显示BBBB383和BBBB426的血浆(图5A)和脑(图5B) PK的图。含有抗-BACE mAb的脑穿梭载体BBBB383和BBBB426与BBBB456 (没有脑穿梭载体的抗-BACE mAb)比较。符号表示4只小鼠(4和24小时)或5只小鼠(72小时)的平均值。
图6是显示在用BBBB383和BBBB426治疗后的脑中的Aβ1-40浓度的图。含有抗-BACEmAb的脑穿梭载体BBBB383和BBBB426与BBBB456 (没有脑穿梭载体的抗-BACE mAb)比较。符号表示4只小鼠(4和24小时)或5只小鼠(72小时)的平均值。
图7A-图7B是显示脑穿梭载体抗-BACE mAb的血浆(图7A)和脑(图7B) PK的图。含有抗-BACE mAb的脑穿梭载体与BBBB456 (没有脑穿梭载体的抗-BACE mAb，实心菱形以及虚线)比较。各符号表示每个时间点的两只小鼠的平均值。
图8是显示在用脑穿梭载体mAb治疗后的脑中的Aβ1-40浓度的图。含有抗-BACEmAb的脑穿梭载体与BBBB456 (没有脑穿梭载体的抗-BACE mAb，实心菱形以及虚线)比较。除了BBBB983之外，对于所有脑穿梭载体观察到AB水平的剂量依赖性降低。各符号表示每个时间点的两只小鼠的平均值。
图9是显示三足mAb BBB-00489在人脑内皮细胞中内化的图。三足mAb染色成红色，以及肌动蛋白是绿色。
图10是显示在食蟹猴中的脑药代动力学的图。静脉内给予食蟹猴10mg/kg的三种TTP mAb，即BBBB1134和BBBB1136 (左)和BBBB1133 (右)，并与对照mAb PT1B844比较。给药后72小时测量脑暴露(n= 3只食蟹猴/mAb)。对于mAb，跨各种区域测定脑浓度，并在动物中取平均值。各符号代表脑的区域。
图11是显示在不同区域中与非脑穿梭载体对照相比，含有脑穿梭载体的mAb的脑浓度的图。各个点表示每只动物(n=3)。
图12是显示 i. v.给予的mAb在4、24和72小时的血浆浓度的图。所有脑穿梭载体mAb具有比非脑穿梭载体mAb更快的清除率。各个点表示每只动物(n=3)。
图13是显示在食蟹猴研究期间对于BBBB1134而非其它mAb观察到的网织红细胞耗竭的图，证实了Fc功能对TfR结合mAb和网织红细胞耗竭的影响。
图14A-图14C：在huTfR敲入小鼠中三足mAb的脑药代动力学和药效学。与一种对照mAb相比，静脉内给予人TfR敲入小鼠10mg/kg的一组三足mAb (BBBBx)，并在24小时评价脑暴露：
图14A：观察到一定范围的增强暴露，从无增强(BBBB974，空心正方形)到10.5x(BBBB978，空心三角形) (n= 2只小鼠，符号表示每只个体动物，其中条棒表示平均值和误差棒表示标准偏差)。
图14B：三足mAb解离速率与脑暴露充分相关，其中观察到既不太快也不太慢的解离速率是最佳的。
图14C：评价mAb——抗-BACE拮抗剂mAb的脑药效学，并且除了BBBB983之外，对于所有三足mAb在脑中观察到强PK/PD关系。BBBB983具有增强的脑暴露(5.5x)但与对照mAb类似浓度的Aβ1-40 (各三角形表示个体)。假设慢-中性解离速率阻止在脑中扩散至靶标。
图15是显示mAb介导摄取到小胶质细胞吞噬体中的图。与非脑穿梭载体mAbPT1B844相比，所有脑穿梭载体mAb促进更有效摄取到吞噬体中。在脑穿梭载体mAb内，具有完全效应子功能的那些(BBBB1131、1134和1046)比没有效应子功能的那些更有效。
图16是显示mAb介导的摄取至巨噬细胞吞噬体的图。与非脑穿梭载体mAb B21M-IgG1相比，所有脑穿梭载体mAb促进更有效摄取至吞噬体中。
图17A-图17F：在食蟹猴中的脑药代动力学证实治疗性mAb的增强的脑递送。
图17A：静脉内给予食蟹猴10 mg/kg的两种三足mAb BBBB1134和BBBB1136，以及一种对照mAb PT1B844。给药后72小时测量脑暴露(n= 3只食蟹猴/mAb，符号表示每只个体动物，其中条棒表示平均值和误差棒表示标准偏差)。对于两种脑穿梭载体mAb，在评价的所有脑区域中观察到增强的脑暴露。
图17B：与对照mAb相比，对于BBBB1134和BBBB136分别观察到7x和11x脑浓度增强。
图17C：72小时内的血浆暴露证实了对于三足mAb的靶标介导的药物处置，与对照mAb相比观察到加速的清除率。三足mAb在它们对于FcRn的结合亲和力方面不同，其中BBBB1136含有高结合亲和力“YTE”突变；与BBBB1134 (空心正方形)相比，BBBB1136 (三角形)在72小时具有大约2x增强的血浆浓度。
图17D：与阳性对照BBBB175 (高亲和力抗-TfR结合IgG1 mAb)和阴性对照CNTO3930 (不结合靶细胞的IgG1 mAb)相比，三足mAb (BBBB1134和BBBB1136)的体外ADCC活性。用人和食蟹猴PBMC二者，BBBB1134——IgG1 mAb使靶细胞的稳健ADCC成为可能。观察到BBBB1136——效应子功能沉默的IgG1 mAb没有ADCC活性。
图17E：BBBB1134和BBBB1136对于补体组分1q (C1q)的SPR结合数据。BBBB1134结合C1q而BBBB1136不结合。
图17F：在食蟹猴PK研究中观察到网织红细胞耗竭。对于对照mAb或BBBB1136，给药后2天没有观察到网织红细胞损失，而在用BBBB1134治疗后观察到稳健的耗竭(符号表示个体动物，条棒表示平均值和误差棒表示标准偏差)。
图18A-图18D：在食蟹猴中BBBB1133的重复给药的脑和血清药代动力学以及剂量应答：
图18A：静脉内给予食蟹猴2mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的BBBB1133，并在之后1、7或15天评价脑暴露(n=3只猴/mAb和时间点。符号表示平均脑浓度和误差棒表示标准偏差)。在2和10mg/kg之间观察到线性脑PK，但在10和30 mg/kg之间观察到非线性PK，提示对于TfR，30mg/kg是饱和剂量。
图18B：在整个研究中测量BBBB1133的血清浓度(给药后1、6小时和第1、2、4、10和14天)。在所有三个剂量下观察到线性药代动力学。对于BBBB1133在血清中确定T1/2 = 6天。
图18C：每周静脉内给予食蟹猴2mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的BBBB1133，持续三周。在给药后1、7、15或21天评价脑暴露(n=3只猴/mAb和时间点。符号表示平均脑浓度和误差棒表示标准偏差)。在2和10mg/kg之间观察到线性脑PK，但在10和30 mg/kg之间观察到非线性PK，提示对于TfR，30mg/kg是饱和剂量。在30mg/kg剂量下观察到累积证据。
图18D：在整个研究中测量BBBB1133的血清浓度(首次给药后1、6小时和第1、2、4、10、14、14.02、14.25、15、16、18和21天)。在所有三个剂量下观察到线性药代动力学，没有在重复给药时PK耐受性的证据。
图19A-图19C：非经典的非FcγR介导的ADP促进在人小胶质细胞中Tau聚集体的有效吞噬作用：
图19A：为了评价效应子功能受损的IgG1三足mAb BBBB1133和BBBB1136促进tau聚集体在小胶质细胞中的摄取的潜力，将人iPSC衍生的小胶质细胞与mAb和用链霉亲和素Alexa Flour 488 (AF488)标记的生物素化的磷酸-tau寡聚物孵育。在孵育后4小时，将细胞洗涤，固定，透化，染色和使用共聚焦显微术成像。量化含有与Lamp-1染色的溶酶体共定位的tau聚集体的细胞。与抗-Tau WT IgG1 mAb PT1B844相比，BBBB1133和BBBB1136促进更有效摄取和溶酶体运输。
图19B：Tau寡聚物的摄取可用过量的可溶性TfR ECD阻断，但不受加入可溶性Fc的影响，证实了摄取通过TfR发生。
图19C：人iPSc衍生的小胶质细胞与Alexa Fluor 488标记磷酸Tau肽(绿色)在PT1B844或BBBB1133的存在下孵育4小时。固定后，细胞用针对网格蛋白、EEA1、Rab17或Lamp1的抗体染色，并用Alexa Fluor 647-第二抗体(红色)检测。细胞使用Perkin ElmerOpera Phenix 60x放大倍率共聚焦模式成像。显示了2 µm水平的代表性细胞图像。比例尺=10 µm。箭头指向在插图中详述的共定位区域。对于各磷酸Tau-抗体治疗的第三列是其它两列的合并结果。细胞还用DAPI染色和成像以检测细胞核以及用hcs Cellmask orange染色和成像以检测细胞质(未显示)。
图20A-图20E：非经典的非FcγR介导的ADP促进源自人AD患者脑的Tau聚集体在人巨噬细胞和小胶质细胞中的有效吞噬作用：
图20A：人单核细胞衍生的巨噬细胞用Tau聚集体和BBBB1133 (空心正方形)和对照抗-Tau mAb PT1B844 (圆圈)孵育。随时间量化保持在培养上清液中的pTau的量。观察到类似pTau降解，直到8小时，此时PT1B844介导的ADP停顿，而BBBB1133介导的ADP继续促进降解。
图20B：使用人iPSC衍生的小胶质细胞观察到类似趋势，其中与PT1B844相比，BBBB1133 (空心正方形)使更稳健的随时间pTau降解成为可能。通过使用过量的可溶性TfRECD阻断降解，BBBB1133介导的pTau降解的机制被证实为通过TfR发生。
图20C-图20E：评价来自小胶质细胞实验的上清液的细胞因子浓度。PT1B844介导的pTau ADP刺激促炎细胞因子TFNα (图20C)、IL6 (图20D)和IL1β (图20E)的释放，而BBBB1133不刺激类似释放。
图21：PHF与指示的tau抗体的共注射降低tau病理的诱导：
图21A：模型对Fc依赖性活性的部分依赖性通过Tau被小鼠IgG2a中和的统计学显著差异证实。
图21B：与同种型对照相比，两种抗-Tau mAb中和了Tau接种。在所述mAb和TTP mAb之间没有观察到统计学差异，其中与所述mAb相比，TTP mAb具有略微改进的中和，证实了非经典的ADP机制在体内是有功能的。
发明详细描述
在背景中和在整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考资料各自通过引用以其整体并入本文。已包括在本说明书中的文件、法案、材料、装置、文章等的论述用于为本发明提供背景的目的。关于公开或要求保护的任何发明，这样的论述并非承认任何或所有这些材料形成现有技术的一部分。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。否则，本文使用的某些术语具有如说明书中阐述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物通过引用并入，如同完全在本文中阐述一样。必须注意，如本文和随附权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数对象，除非上下文清楚另外指明。
除非另外说明，本文描述的任何数值，例如浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10%。例如，10 mg的剂量包括9 mg至11mg。如本文使用的，数字范围的使用明确包括所有可能的子范围，在所述范围内的所有各个数值，包括在这样的范围内的整数和所述值的分数，除非上下文清楚另外指明。
如本文使用的，在多个记载的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包括单个选项和组合选项二者。例如，在两个要素通过“和/或”连接在一起时，第一个选项涉及在没有第二个要素的情况下第一个要素的适用性。第二个选项涉及在没有第一个要素的情况下第二个要素的适用性。第三个选项涉及第一个和第二个要素一起的适用性。这些选项中的任何一个被理解为落入含义内，因此满足本文使用的术语“和/或”的要求。超过一个选项的同时适用性也被理解为落入含义内，因此满足术语“和/或”的要求。
在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另外要求，词语“包含(comprise)”和变化例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗指包括所述整数或步骤，或整数或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤，或整数或步骤组。当本文使用时，术语“包含”可被替换为术语“含有”或“包括”或有时当本文使用时被替换为术语“具有”。
当本文使用时，“由……组成”排除了在权利要求要素中没有规定的任何要素、步骤或成分。当本文使用时，“基本上由……组成”不排除没有实质影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。“包含”、“含有”、“包括”和“具有”中的任何前述术语无论在本文用于发明的方面或实施方案的任何情况下均可被替换为术语“由……组成”或“基本上由……组成”以改变公开内容的范围。
术语“抗体”在本文中以最宽泛含义使用，并且特别包括全长单克隆抗体、多克隆抗体，以及除非另外说明或上下文矛盾，抗原结合片段、抗体变体和其多特异性分子，只要它们显示所需的生物活性。一般而言，全长抗体是包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有更加保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体分子结构的一般原则和与抗体产生有关的各种技术在例如，Harlow和Lane, ANTIBODIES: A LABORATORYMANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.,(1988)中提供。
根据它们的重链的恒定结构域的氨基酸序列，全长抗体可被分配为不同的“类别”。全长抗体存在五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中若干可被进一步分成“子类” (同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是众所周知的。
“抗体”也可以是重链单一可变结构域(VHH)抗体，亦称为仅重链抗体(HcAb)，其缺少轻链，并且可由骆驼科动物或鲨鱼天然产生。HcAb的抗原结合部分包含VHH片段。
如本文使用的，术语“重组抗体”是指由包含编码抗体(例如，嵌合、人源化或人抗体，或其抗原结合片段)的核酸的重组宿主细胞表达的抗体。用于产生重组抗体的“宿主细胞”的实例包括：(1) 哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤细胞(包括YO和NSO细胞)、幼仓鼠肾(BHK)、Hela和Vero细胞；(2) 昆虫细胞，例如，sf9、sf21和Tn5；(3) 植物细胞，例如属于烟草属(例如 Nicotiana tabacum)的植物；(4) 酵母细胞，例如，属于酵母属(例如酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae))或曲霉属(例如黑曲霉(Aspergillusniger))的那些；(5) 细菌细胞，例如大肠杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞等。
抗体的"抗原结合片段"是包含全长抗体的一部分的分子，其能够可检测地结合至抗原，通常包含至少VH区的一个或多个部分。抗原结合片段包括包含抗体的一个、两个、三个或更多个抗原-结合部分的多价分子，以及单链构建体，其中VL和VH区或其选择部分通过合成接头或通过重组方法连接以形成有功能的抗原-结合分子。抗原结合片段也可以是单结构域抗体(sdAb)，亦称为纳米抗体，其是由单一单体可变抗体结构域(VHH)组成的抗体片段。尽管抗体的一些抗原结合片段可通过较大抗体分子的实际片段化(例如，酶切)获得，但大多数通常通过重组技术产生。本发明的抗体可作为全长抗体或其抗原结合片段制备。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、F(ab)3、Fv (通常是抗体的单臂的VL和VH结构域)、单链Fv (scFv，参见例如，Bird等, Science 1988; 242:423-426；和Huston等PNAS 1988; 85:5879-5883)、dsFv、Fd (通常是VH和CH1结构域)和dAb (通常是VH结构域)片段；VH、VL、VHH和V-NAR结构域；包含单一VH和单一VL链的单价分子；迷你体、双体、三体、四体和κ体(参见例如，Ill等, Protein Eng 1997; 10:949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离的CDR或有功能的互补位，其中分离的CDR或抗原-结合残基或多肽可缔合或连接在一起，以形成有功能的抗体片段。各种类型的抗体片段已经描述或综述于例如，Holliger和Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23:1126-1136; WO2005040219和公布的美国专利申请20050238646和20020161201。抗体片段可使用常规的重组或蛋白质改造技术获得，并且片段可对于抗原-结合或其它功能以与完整抗体相同的方式进行筛选。
已经开发了各种技术来产生抗体片段。传统上，这些片段通过全长抗体的蛋白水解消化获得(参见，例如，Morimoto等, Journal of Biochemical and BiophysicalMethods, 24:107-117 (1992)；和Brennan等, Science, 229:81 (1985))。然而，这些片段现在可通过重组宿主细胞直接产生。或者，Fab′-SH片段可从大肠杆菌直接回收和化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等, Bio/Technology, 10:163-167 (1992))。根据另一种方法，F(ab′)2片段可从重组宿主细胞培养物直接分离。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 1993/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。例如，抗体片段也可以是“线性抗体”，例如描述于美国专利号5,641,870。这样的线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
本文使用的术语"抗体衍生物"是指包含全长抗体或其抗原结合片段的分子，其中一个或多个氨基酸被化学修饰或置换。可用于抗体衍生物的化学修饰包括例如，烷基化、PEG化、酰化、酯形成或酰胺形成等，例如用于连接抗体至第二分子。示例性的修饰包括PEG化(例如，半胱氨酸-PEG化)、生物素化、放射性标记和与第二药剂(例如细胞毒性剂)缀合。
在本文中抗体包括具有改变的抗原-结合或生物活性的“氨基酸序列变体”。这样的氨基酸改变的实例包括具有增强的抗原亲和力的抗体(例如“亲和力成熟”抗体)，和具有改变的Fc区(如果存在的话)，例如具有改变(增加或减少)的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC) (参见例如，WO 00/42072, Presta, L.和WO 99/51642,Iduosogie等)，和/或增加或减少的血清半衰期(参见例如，WO00/42072, Presta, L.)的抗体。
“多特异性分子”包含抗体或其抗原结合片段，其缔合或连接至至少一种其它有功能的分子(例如另一肽或蛋白，例如另一抗体或受体配体)，从而形成结合至少两个不同的结合位点或靶标分子的分子。示例性的多特异性分子包括双特异性抗体和连接至可溶性受体片段或配体的抗体。
如本文使用的，术语“人抗体”意图包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列(即，与其相同或基本上相同)。此外，如果抗体含有恒定区，恒定区也“源自”人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不意图包括其中源自另一哺乳动物物种，例如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
“人源化”抗体是人/非人嵌合抗体，其含有源自非人免疫球蛋白的最少序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的超变区的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)，例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的超变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步精修抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个和通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的超变环对应于非人免疫球蛋白的那些，和所有或基本上所有的FR残基是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可任选地包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人免疫球蛋白的恒定区(Fc)。对于进一步的细节，参见例如，Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、WO 92/02190、美国专利申请20060073137和美国专利号6,750,325、6,632,927、6,639,055、6,548,640、6,407,213、6,180,370、6,054,297、5,929,212、5,895,205、5,886,152、5,877,293、5,869,619、5,821,337、5,821,123、5,770,196、5,777,085、5,766,886、5,714,350、5,693,762、5,693,761、5,530,101、5,585,089和5,225,539。
当本文使用时，术语“超变区”是指抗体的氨基酸残基，其负责抗原结合。超变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(轻链可变结构域中的残基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)和重链可变结构域中的31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3)；(Kabat等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S.Department of Health and Human Services, NIH公布号91-3242)和/或来自“超变环”的那些残基(轻链可变结构域中的残基26-32 (L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)和重链可变结构域中的26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3)；Chothia和Lesk, J. Mol. Biol. 1987;196:901-917)。通常，在该区域中氨基酸残基的编号通过描述于Kabat等, 同上的方法进行。在本文中，短语例如“Kabat位置”、“按Kabat的可变结构域残基编号”和“根据Kabat”是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的较少或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可包括在CDR H2的残基52后的单个氨基酸插入(根据Kabat，残基52a)和在重链FR残基82后的插入残基(例如根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。对于给定的抗体，残基的Kabat编号可通过抗体序列与“标准” Kabat编号序列的同源性区域比对确定。
“框架区”或“FR”残基是除了本文定义的CDR之外的那些VH或VL残基。
“表位”或“结合位点”是在抗原上抗原-结合肽(例如抗体)特异性结合的区域或区。蛋白质表位可包含直接参与结合的氨基酸残基(亦称为表位的免疫显性成分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的“溶剂排除表面”和/或“足迹”内)。
“互补位”是特异性结合抗原的抗体的抗原-结合部分的区域或区。除非另外说明或上下文明显矛盾，互补位可包含直接参与表位结合的氨基酸残基，其中数个通常在CDR中，以及不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性结合的抗原有效阻断的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基在特异性结合的抗原的“溶剂排除表面”和/或“足迹”内)。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合达50%或更多的抗体，并且反之，在竞争测定中参考抗体阻断所述抗体与其抗原的结合达50%或更多。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于95%或99%纯度，如通过例如，电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。对于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如，Flatman等, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
关于本发明的方法，术语“给予”意指通过使用本发明的缀合物或其形式、组合物或药物，治疗性或预防性预防、治疗或改善本文所述的综合征、病症或疾病的方法。这样的方法包括在疗程期间的不同时间或以组合形式同时给予有效量的所述抗体、其抗原结合片段或缀合物或其形式、组合物或药物。本发明的方法应理解为包括所有已知的治疗性治疗方案。
靶标抗体“阻断”靶标分子与天然靶标配体的结合的能力意指在使用可溶性或细胞表面缔合的靶标和配体分子的测定中所述抗体可以剂量依赖性方式可检测地减少靶标分子与配体的结合，其中在缺少所述抗体的情况下靶标分子可检测地结合配体。
“血脑屏障”或“BBB”是指在外周循环与脑和脊髓之间的生理屏障，其通过脑毛细管内皮质膜内的紧密接合形成，产生限制分子运输到脑中的紧密屏障。BBB可限制甚至非常小的分子例如尿素(60道尔顿)运输到脑中。BBB的实例包括脑内的BBB、脊髓内的血液-脊髓屏障和视网膜内的血液-视网膜屏障，其都是CNS内的连续毛细管屏障。BBB还包括血液-CSF屏障(脉络丛)，其中屏障包含室管膜细胞，而非毛细管内皮细胞。
“血脑屏障受体” (本文简称“R/BBB”)是在脑内皮细胞上表达的细胞外膜连接的受体蛋白，其能够运输分子跨过BBB或用于运输外源给予的分子。R/BBB的实例包括但不限于转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF-R)、低密度脂蛋白受体(包括但不限于低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (LRP1)和低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8))和肝素-结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。在本文中，示例性的R/BBB是转铁蛋白受体(TfR)。
“中枢神经系统”或“CNS”是指控制身体功能的神经组织的复合物，并且包括脑和脊髓。
本文使用的“缀合物”是指与一种或多种异源分子共价连接的蛋白，所述分子包括但不限于治疗性肽或蛋白、抗体、标签或神经学病症药物。
本文使用的术语“偶联”是指两个或更多个对象连接或联系在一起。当涉及化学或生物学化合物时，偶联可指两个或更多个化学或生物学化合物之间的共价连接。作为非限制性实例，本发明的抗体可与感兴趣的肽偶联以形成抗体偶联肽。抗体偶联肽可通过经设计以将抗体缀合至肽的特定化学反应形成。在某些实施方案中，本发明的抗体可通过接头与本发明的肽共价偶联。接头可以例如，首先共价连接至抗体或肽，然后共价连接至肽或抗体。
药剂，例如药物制剂的“有效量”或“治疗有效量”是指以必须的剂量和时间段有效实现所需的治疗或预防结果的量。
本文使用的“接头”是指共价连接两个不同实体的化学接头或单链肽接头。接头可用于连接本发明的抗体或其片段、血脑屏障穿梭载体、融合蛋白和缀合物中的任何两种。接头可连接例如，scFv中的VH和VL、或单克隆抗体或其抗原结合片段与治疗性分子，例如第二抗体。在一些实施方案中，如果单价结合实体包含针对TfR、优选地huTfR1的scFv，和治疗性分子包含针对CNS靶标、例如Tau的抗体，则接头可将scFv连接至针对Tau的抗体。可使用包含通过肽键连接的1-25个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸的单链肽接头。在某些实施方案中，氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在某些其它实施方案中，一种或多种氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。也可使用化学接头，例如烃接头、聚乙二醇(PEG)接头、聚丙二醇(PPG)接头、多糖接头、聚酯接头、由PEG和嵌入杂环组成的杂合接头以及烃链。
本文使用的“神经学病症”是指影响CNS和/或具有CNS病因的疾病或病症。示例性的CNS疾病或病症包括但不限于神经病、淀粉样变性、癌症、眼睛疾病或病症、病毒或微生物感染、炎症、缺血、神经退行性疾病、癫痫、行为障碍和溶酶体贮积症。为了本申请的目的，CNS被理解为包括眼睛，其通常通过血液-视网膜屏障与身体的其余部分隔离。神经学病症的具体实例包括但不限于，神经退行性疾病(包括但不限于路易体病、脊髓灰质炎后综合征、Shy-Draeger综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩)、tau蛋白病(包括但不限于阿尔茨海默病和核上性麻痹)、朊病毒病(包括但不限于牛海绵状脑病、羊搔症、克雅氏综合征、库鲁病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、慢性消耗病和致命性家族性失眠症)、延髓麻痹、运动神经元病和神经系统异变性疾病(包括但不限于卡纳万病、亨廷顿氏病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大病、图雷特综合征、门克斯扭结发综合征、科凯恩综合征、Hallervorden-Spatz综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、Lesch-Nyhan综合征和Unverricht-Lundborg综合征)、痴呆(包括但不限于皮克氏病和脊髓小脑性共济失调)、癌症(例如CNS和/或脑的癌症，包括身体别处的癌症导致的脑转移)。
“神经学病症药物”是可用于治疗或改善一种或多种神经学病症的影响的药物或治疗剂。本发明的神经学病症药物包括但不限于小分子化合物、抗体、肽、蛋白质、一种或多种CNS靶标的天然配体、一种或多种CNS靶标的天然配体的修饰形式、适体、抑制性核酸(即，小抑制性RNA (siRNA)和短发夹RNA (shRNA))、核酶或任何前述药物的活性片段。本发明的示例性的神经学病症药物在本文中描述并包括但不限于：抗体、适体、蛋白质、肽、抑制性核酸和小分子和任何前述药物的活性片段，其本身是或特异性识别和/或作用于(即，抑制、激活或检测) CNS抗原或靶标分子，例如但不限于，淀粉样前体蛋白或其部分、β淀粉样蛋白、β-分泌酶、γ-分泌酶、tau、α-突触核蛋白、parkin、亨廷顿蛋白、DR6、早老素、ApoE、胶质瘤或其它CNS癌症标志物和神经营养因子。神经学病症药物和它们可用于治疗的相应病症的非限制性实例：脑源性神经营养因子(BDNF)、慢性脑损伤(神经发生)、成纤维细胞生长因子2 (FGF-2)、抗-表皮生长因子受体、脑癌症、(EGFR)-抗体、胶质细胞系衍生神经因子、帕金森病、(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、肌萎缩侧索硬化、抑郁症、溶酶体酶、脑的溶酶体贮积症、睫状神经营养因子(CNTF)、肌萎缩侧索硬化、神经调节蛋白-1、精神分裂症、抗-HER2抗体(例如曲妥珠单抗)、从HER2阳性癌症的脑转移。
术语“药物制剂”是指呈允许其中含有的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含有对给予所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分的制备物。
如本文使用的，“药学上可接受的载剂或稀释剂”意指适用于给予个体的任何物质。例如，药学上可接受的载剂可以是无菌水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或注射用水。
如本文使用的，“药学上可接受的盐”意指化合物、例如寡聚化合物或寡核苷酸的生理和药学上可接受的盐，即，保留母体化合物的所需生物活性并且对其不产生不需要的毒理学效果的盐。
本发明使用的药学上可接受的酸性/阴离子盐包括但不限于乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、glyceptate、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰基对氨苯基胂酸盐、己基间苯二甲酸盐、海巴胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱盐、甲苯磺酸盐和三乙基碘化物(trithiodide)。有机或无机酸还包括但不限于氢碘酸、高氯酸、硫酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、甲磺酸、羟基乙磺酸、草酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、糖精酸或三氟乙酸。药学上可接受的碱性/阳离子盐包括但不限于铝、2-氨基-2-羟基甲基-丙烷-1,3-二醇(亦称为三(羟基甲基)氨基甲烷、氨丁三醇或“TRIS”)、氨、苄星、叔丁胺、钙、氯普鲁卡因、胆碱、环己胺、二乙醇胺、乙二胺、锂、L-赖氨酸、镁、葡甲胺、N-甲基-D-葡萄糖胺、哌啶、钾、普鲁卡因、奎宁、钠、三乙醇胺或锌。
“多肽”或“蛋白质”意指包含通过肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以被称为“肽”。
短语“序列同一性”或“百分比(%)序列同一性”或“%同一性”或“与……具有%同一性”当关于氨基酸序列使用时描述与构成全长氨基酸序列的氨基酸残基数量相比，两个或更多个比对的氨基酸序列的相同氨基酸的匹配(“命中”)数量。换句话说，当对于最大一致性比较和比对序列时，如使用本领域已知的序列比较算法测量的，或当手动比对和视觉检查时，对于两个或更多个序列使用比对，可以确定相同的氨基酸残基的百分比(例如对于全长氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性)。经比较以确定序列同一性的序列因此可能通过置换、添加或缺失氨基酸而不同。用于比对蛋白质序列的合适程序是技术人员已知的。蛋白质序列的百分比序列同一性可例如，用程序例如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST，例如使用NCBI BLAST算法(Altschul SF等(1997),  Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)确定。
术语“基本上相同”在两个氨基酸序列的情况下意指所述序列当最佳比对时，例如通过程序GAP或BESTFIT使用默认的空缺权重，共有至少约50%的序列同一性。通常，基本上相同的序列将显示至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约95、至少约98或至少约99%的序列同一性。
“特异性结合”或“特异性地结合”或“结合”是指抗体以大于对其它抗原的亲和力结合至抗原或抗原内的表位。通常，抗体以约1x10-8 M或更小、例如约1x10-9 M或更小、约1x10-10 M或更小、约1x10-11 M或更小或约1x10-12 M或更小的解离常数(KD)，通常以其对于结合非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的KD的至多1/100的KD，结合抗原或抗原内的表位。KD是抗体和其抗原之间的平衡解离常数，koff/kon的比率。KD和亲和力负相关。“结合速率”(kon)是用于表征抗体如何快速结合其靶标的常数。“解离速率” (koff)是用于表征抗体如何快速从其靶标解离的常数。解离常数KD可使用标准程序测量。例如，抗体的KD可通过使用表面等离子共振，例如通过使用生物传感器系统，例如Biacore®系统，或通过使用生物层干涉技术，例如Octet RED96系统测定。抗体的KD值越小，抗体结合靶标抗原的亲和力越高。然而，特异性结合抗原或抗原内的表位的抗体可对其它相关抗原，例如来自其它物种(同系物)，例如人或猴，例如 Macaca fascicularis (食蟹猴，cyno)、 Pan troglodytes (黑猩猩，chimp)或 Callithrix jacchus (普通狨猴，狨猴)的相同抗原具有交叉反应性。尽管单特异性抗体特异性结合一种抗原或一种表位，但双特异性抗体特异性结合两种不同的抗原或两种不同的表位。
本文使用的术语“受试者”是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，例如猴)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。当受试者是人时，他们也可被称为“患者”。
如本文使用的术语“转铁蛋白受体”或“TfR”是指对于通过受体介导的内吞过程的细胞铁摄取必需的细胞表面受体。对于转铁蛋白的载体蛋白。TfR在脊椎动物中参与铁摄取，并响应细胞内铁浓度来调节。其通过受体介导的内吞作用来内化转铁蛋白-铁复合物而输入铁。在人中已经表征了两种转铁蛋白受体，转铁蛋白受体1和转铁蛋白受体2。这些受体都是跨膜糖蛋白。TfR1是遍在表达的高亲和力受体。TfR2以TfR1的1/25-1/30的亲和力结合转铁蛋白。TfR2的表达限于某些细胞类型，并且不受细胞内铁浓度的影响。在一个实施方案中，TfR是人TfR，其包含例如Schneider等Nature 311: 675-678 (1984)中所示的氨基酸序列。其可具有约180,000道尔顿的分子量，具有两个亚基，各自具有约90,000道尔顿的表观分子量。优选地，TfR是人TfR1。
如本文使用的，“靶标抗原”或“脑靶标”是指在CNS (包括脑)中表达的抗原和/或分子，其可被抗体或小分子靶向。这样的抗原和/或分子的实例包括但不限于：β-分泌酶1(BACE1)、β淀粉样蛋白(Abeta)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2 (HER2)、Tau、载脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、亨廷顿蛋白、朊蛋白(PrP)、富含亮氨酸的重复激酶2 (LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受体6 (DR6)、淀粉样前体蛋白(APP)、p75神经营养因子受体(p75NTR)和胱天蛋白酶6。在一些实施方案中，靶标抗原是BACE1。在一些实施方案中，靶标抗原是Tau。
如本文使用的，“治疗(treatment)” (以及其语法变体，例如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变治疗的个体的自然过程的临床干预，并且可以为预防目的或在临床病理过程期间进行。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病发生或复发，减轻症状，减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，以及缓和或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病发展，或减慢疾病进展。
抗体或免疫球蛋白根据重链恒定结构域氨基酸序列，可被分配为五个主要类别，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG是五个类型的免疫球蛋白中最稳定的，在人中具有约23天的血清半衰期。IgA和IgG被进一步细分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。四个IgG亚类各自具有不同的生物学功能，称为效应子功能。这些效应子功能一般通过与Fc受体(FcγR)相互作用和/或通过结合C1q和固定补体来介导。与FcγR结合可导致抗体依赖性细胞介导的细胞溶解或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，而与补体因子结合可导致补体介导的细胞溶解或补体依赖性细胞毒性(CDC)。本发明的抗-TfR抗体，或与抗-TfR抗体缀合或融合的治疗性或诊断性抗体可能没有或具有最少的效应子功能，但保留其结合FcRn的能力，其结合可能是抗体具有延长的体内半衰期的主要手段。
FcγR或补体(例如，C1q)与抗体的结合由所谓的Fc部分结合位点处规定的蛋白质-蛋白质相互作用引起。这样的Fc部分结合位点是本领域已知的。这样的Fc部分结合位点包括例如，由氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329表征(编号根据Kabat的EU索引)。在一些实施方案中，本发明的抗-TfR抗体，或与抗-TfR抗体缀合或融合的治疗性或诊断性抗体，在一个或多个Fc部分结合位点处含有一个或多个置换以消除效应子功能。例如，本发明的抗-TfR抗体，或与抗-TfR抗体缀合或融合的治疗性或诊断性抗体，可含有Fc区，其含有一个或多个以下置换：在残基233处脯氨酸置换谷氨酸，在残基234处丙氨酸或缬氨酸置换苯丙氨酸，以及在残基235处丙氨酸或谷氨酸置换亮氨酸(EU编号，Kabat,E. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版. U.S.Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., NIH公布号91-3242)。优选地，感兴趣的抗体含有L234A、L235A和P331S中的一个、两个或三个突变(EU编号, Kabat)。
亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示补体活化，包括C1q和C3结合，而IgG4不激活补体系统，并且不结合C1q和/或C3。与其它IgG亚类相比，人IgG4 Fc区具有降低的结合FcγR和补体因子的能力。优选地，本发明的抗-TfR抗体，或与抗-TfR抗体缀合或融合的治疗性或诊断性抗体，包含源自人IgG4 Fc区的Fc区。更优选地，Fc区含有具有消除效应子功能的置换的人IgG4 Fc区。例如，通过在残基297 (EU编号)处Ala置换Asn，在IgG4 Fc区中除去N-连接的糖基化位点是确保消除残留的效应子功能的另一种方式。
抗-TfR抗体和其抗原结合片段
在一个一般方面，本申请涉及结合灵长类动物TfR、例如人TfR或猴TfR的抗体或其抗原结合片段，并且所述抗体或其抗原结合片段被优化以递送药剂至有需要的受试者的脑。在抗-TfR抗体对TfR的结合亲和力和转胞吞作用效率之间的关系之前已描述为转胞吞作用随着对TfR的亲和力降低而提高(Yu, Zhang等2011, Sci Transl Med 3(84):84ra44)。本发明的发明人令人惊讶地发现了比之前已经描述的更有细微差别的在亲和力和转胞吞作用效率之间的关系，其中来自结合速率和解离速率二者的影响对脑浓度产生影响。特别是，对于抗-TfR抗体或其抗原结合片段有效递送的药剂(例如mAb)的最佳脑PK和PD，需要不太快也不太慢的中性解离速率。
优选地，本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段是pH-敏感性的，例如，在不同的pH下其对TfR具有不同的结合亲和力。例如，本申请的抗-TfR抗体可在中性pH、例如生理pH(例如，pH 7.4)下以高亲和力结合细胞表面TfR，但在内化至内体隔室中之后，在酸性pH、例如相对低的pH (pH 5.0-6.0)下从TfR解离。亲和力是两个部分，例如抗体和抗原之间的结合强度的度量。亲和力可以几种方式表示。一种方式是根据相互作用的解离常数(KD)。KD可通过常规方法(包括平衡透析)或通过直接测量抗原-抗体解离和缔合的速率(分别为koff (kd或kdis)和kon (或ka)速率)测量(参见例如， Nature, 1993 361:186-87)。koff/kon比率消除了所有与亲和力无关的参数，并且等于解离常数KD (总体上参见Davies等,  Annual Rev  Biochem, 1990 59:439-473)。因此，较小的KD意味着较高的亲和力。亲和力的另一种表示是Ka，其是KD的倒数，或kon/koff。因此，较高的Ka意味着较高的亲和力。例如，用于本申请的组合物和/或方法的抗体或其抗原结合片段可以是在中性pH (例如，pH 6.8-7.8)、例如生理pH (例如，pH 7.4)下以1纳摩尔(nM, 10−9 M)或更大的KD结合TfR，和在酸性pH (例如，pH4.5-6.0)、例如pH 5.0下以10-4 sec-1或更大的kdis从TfR解离的抗体或其片段。
因此，本申请的一般方面涉及抗-TfR抗体或其抗原结合片段，用于递送药剂至有需要的受试者的脑，其中所述抗-TfR抗体或其抗原结合片段以在中性pH下至少1 nM、优选地1 nM至500 nM的解离常数KD和在酸性pH, 优选地pH 5下至少10-4 sec-1、优选地10-4至10-1 sec-1的解离速率常数kd结合转铁蛋白受体(TfR)，优选地人TfR1。
在一个实施方案中，本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段具有在中性pH下2 x10-2至2 x 10-4 sec-1、例如2 x 10-2、1 x 10-2、9 x 10-3、8 x 10-3、7 x 10-3、6 x 10-3、5 x10-3、4 x 10-3、3 x 10-3、2 x 10-3、1 x 10-3、9 x 10-4、8 x 10-4、7 x 10-4、6 x 10-4、5 x10-4、4 x 10-4、3 x 10-4、2 x 10-4 sec-1或之间的任何值的解离速率常数kd。
在某些实施方案中，结合人TfR的抗体或其抗原结合片段是重链单一可变结构域(VHH)抗体，其包含具有以下氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(i) 分别为SEQ ID NO: 7、8和9；
(ii) 分别为SEQ ID NO: 317、318和319；
(iii) 分别为SEQ ID NO: 324、325和326；
(iv) 分别为SEQ ID NO: 331、332和333；或
(v) 分别为SEQ ID NO: 338、339和340。
优选地，其是包含与SEQ ID NO: 6、316、323、330或337具有至少80%、例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的VHH片段。
在其它实施方案中，结合人TfR的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(其包含重链互补决定区(HCDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3)，以及轻链可变区(其包含轻链互补决定区(LCDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有以下氨基酸序列：
(i)分别为SEQ ID NO: 292、293、294、295、296和297；
(ii)分别为SEQ ID NO: 279、280、281、282、283和284；
(iii)分别为SEQ ID NO: 29、30、31、32、33和34；
(iv)分别为SEQ ID NO: 57、58、59、60、61和62；
(v)分别为SEQ ID NO: 85、86、87、88、89和90；
(vi)分别为SEQ ID NO: 110、111、112、113、114和115；
(vii)分别为SEQ ID NO: 135、136、137、138、139和140；
(viii)分别为SEQ ID NO: 191、192、193、194、195和196；
(ix)分别为SEQ ID NO: 244、245、246、247、248和249；
(x)分别为SEQ ID NO: 263、264、265、266、267和268；
(xi)分别为SEQ ID NO: 345、346、347、348、349和350；
(xii)分别为SEQ ID NO: 355、356、357、358、359和360；
(xiii)分别为SEQ ID NO: 365、366、367、368、369和370；
(xiv)分别为SEQ ID NO: 375、376、377、378、379和380；
(xv)分别为SEQ ID NO: 385、386、387、388、389和390；
(xvi)分别为SEQ ID NO: 395、396、377、398、399和400；
(xvii)分别为SEQ ID NO: 405、406、407、408、409和410；
(xviii)分别为SEQ ID NO: 415、416、417、418、419和420；
(xix)分别为SEQ ID NO: 425、426、427、428、429和430；
(xx)分别为SEQ ID NO: 435、436、437、438、439和440；
(xxi)分别为SEQ ID NO: 445、446、447、448、449和450；
(xxii)分别为SEQ ID NO: 455、456、457、458、459和460；
(xxiii)分别为SEQ ID NO: 465、466、467、468、469和470；
(xxiv)分别为SEQ ID NO: 475、476、477、478、479和480；
(xxv)分别为SEQ ID NO: 485、486、487、488、489和490；
(xxvi)分别为SEQ ID NO: 495、496、497、498、499和500；
(xxvii)分别为SEQ ID NO: 505、506、507、508、509和510；
(xxviii)分别为SEQ ID NO: 515、516、517、518、519和520；
(xxix)分别为SEQ ID NO: 525、526、527、528、529和530；
(xxx)分别为SEQ ID NO: 535、536、537、538、539和540；或
(xxxi)分别为SEQ ID NO: 545、546、547、548、549和550。
在其它实施方案中，本申请的抗体或其抗原结合片段与本文例举的抗体或抗原结合片段竞争。抗体或抗原的结合位点可通过已知的方法，例如ELISA、蛋白质印迹等确定。在某些实施方案中，这样的竞争性抗体结合例举的抗体或其抗原结合片段结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。用于抗体结合的表位作图的详细示例性方法提供于Morris, G.E., (ed.), “Epitope Mapping Protocols,”载于: Methods in Molecular Biology,Vol. 66, Humana Press, Totowa, N.J. (1996)。“结合与参考抗体相同表位的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合达50%或更多的抗体，并且反过来，参考抗体在竞争测定中阻断所述抗体与其抗原的结合达50%或更多。
优选地，抗体或其抗原结合片段是单链可变片段(scFv)，其包含通过柔性接头与轻链可变区(LV)共价连接的重链可变区(HV)。scFv可保留原始免疫球蛋白的特异性，但除去了恒定区并引入接头。在scFv中，结构域的顺序可以是HV-接头-LV，或LV-接头-HV。接头可从新设计，或衍生自已知的蛋白质结构，以在桥接scFv的可变结构域方面提供相容的长度和构象，而没有严重的空间阻碍。接头可具有10-约25个氨基酸长度。优选地，接头是在可变结构域的羧基末端和另一结构域的氨基末端之间跨越约3.5 nm (35 Å)而不影响结构域折叠和形成完整抗原-结合位点的能力的肽接头(Huston等,  Methods in Enzymology, vol.203, pp. 46–88, 1991，其通过引用以其整体并入本文)。接头优选地包含亲水性序列以避免在整个蛋白质折叠过程中在可变结构域内或之间嵌入肽(Argos,  Journal of  Molecular Biology, vol. 211, no. 4, pp. 943–958, 1990)。例如，接头可包含Gly和Ser残基和/或与散布的带电荷残基例如Glu、Thr和Lys一起以增强溶解度。在一个实施方案中，接头具有SEQ ID NO: 314 (GTEGKSSGSGSESKST)的氨基酸序列。根据本公开内容，任何其它合适的接头也可使用。
在一些实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO: 278、291、28、56、84、109、134、162、190、218、243、262、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534或544的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，结合TfR、优选地人TfR1的抗体或其抗原结合片段不含有游离半胱氨酸。
根据本公开内容，抗-TfR抗体或其抗原结合片段(例如VHH或scFv片段)可使用本领域合适的方法产生。例如，VHH或scFv片段可通过在用于生产抗体片段的合适条件下培养重组宿主细胞(例如细菌、酵母或哺乳动物细胞)和从细胞培养物回收片段来重组产生。
脑穿梭载体构建体
通过增强固有转胞吞作用效率，延长外周药代动力学和改造用于可接受的安全性概况，同时维持治疗性mAb的功效，使用转铁蛋白受体(TfR)开发优化的RMT脑递送平台。在人TfR敲入小鼠中研究了转胞吞作用受体亲和力和脑浓度之间的相互作用。结合动力学的全面研究证实了对于mAb的最佳脑PK和PD，需要不太快也不太慢的中性解离速率。在小鼠中观察到的增强的脑递送在食蟹猴中得到证实。
还发现，具有增加的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的改造抗体恒定区导致降低外周清除率和脑浓度提高。
引入另外的Fc突变以废除与Fc γ受体(FcγR)的结合和避免效应子功能介导的毒性。当与高亲和力抗-Tau结合mAb偶联时，这些突变防止在外周中效应子功能介导的毒性，同时通过新的非FcγR机制维持抗体依赖性吞噬作用(ADP)以供小胶质细胞摄取和靶标降解。该机制依赖于通过TfR受体的内化并且在促进靶标降解方面比传统FcγR介导的ADP更加有效，而不刺激促炎细胞因子的分泌。据发明人所知，这是首次报告非FcγR介导的ADP，代表了吞噬作用的新的高效非炎性机制，其可用于各种治疗性应用。
因此，在一个一般方面，本申请涉及抗体靶向的脑递送系统，其包含本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段。抗-TfR抗体或其抗原结合片段可用于递送治疗剂或诊断剂至细胞(例如，癌细胞)或BBB系统。可递送的药剂包括任何神经学病症药物或可用于检测或分析神经学病症药物的药剂。例如，这样的药剂可以是神经营养因子，包括但不限于神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系神经营养因子(GDNF)和胰岛素样生长因子(IGF)；神经肽，包括但不限于P物质、神经肽Y、血管活性肠肽(VIP)、γ-氨基-丁酸(GABA)、多巴胺、胆囊收缩素(CCK)、内啡肽、脑啡肽和促甲状腺素释放激素(TRH)；细胞因子；抗焦虑剂；抗惊厥药；多核苷酸和转基因，包括例如小干扰RNA和/或反义寡聚物；或结合脑靶标的抗体或其抗原结合片段。本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段可能是增强从血液递送感兴趣的药剂至脑并在其中发挥功能的有效工具。
特别是，感兴趣的药剂可以组合形式或与本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段连接，经胃肠外，例如静脉内递送。例如，所述药剂可以非共价连接至抗-TfR抗体或其抗原结合片段。所述药剂也可以共价连接至抗-TfR抗体或其抗原结合片段以形成缀合物。在某些实施方案中，通过构建蛋白质融合物进行缀合(即，通过基因融合编码抗-TfR抗体或其抗原结合片段和神经学病症药物的两个基因并作为单一蛋白质表达)。根据本公开内容，可使用已知方法连接药剂至抗体或其抗原结合片段。参见例如，Wu等,  Nat Biotechnol., 23(9):1137-46, 2005; Trail等,  Cancer Immunol Immunother., 52(5):328-37, 2003;Saito等,  Adv Drug Deliv Rev., 55(2):199-215, 2003; Jones等,  Pharmaceutical  Research, 24(9):1759-1771, 2007。
在一些实施方案中，待递送至脑的治疗剂或诊断剂和抗-TfR抗体或其抗原结合片段可通过非肽接头或肽接头共价连接在一起(或缀合)。非肽接头的实例包括但不限于，聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯醚、可生物降解聚合物、聚合脂质、壳多糖和透明质酸，或其衍生物或其组合。肽接头可以是由通过肽键连接的1-50个氨基酸组成的肽链或其衍生物，其N末端和C末端可共价连接至抗-TfR抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本申请的缀合物是多特异性抗体，其包含结合TfR的第一抗原结合区和结合脑抗原、例如β-分泌酶1 (BACE1)、tau和本文公开的其它脑抗原的第二抗原结合区。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,  Nature 305: 537, 1983), WO 93/08829和Traunecker等,  EMBO J. 10: 3655, 1991)以及“旋钮入孔(knob-in-hole)”改造(参加例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可通过改造静电转向效应(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如，美国专利号4,676,980和Brennan等, Science, 229: 81, 1985)；使用亮氨酸拉链(参见例如，Kostelny等,  J. Immunol., 148(5): 1547-1553,1992))；使用“双体”技术(参见例如，Hollinger等,  Proc. Natl. Acad.  Sci. USA, 90:6444-6448, 1993))；使用单链Fv (sFv)二聚体(参见例如Gruber等,  J.  Immunol, 152:5368 (1994))；和如例如Tutt等  J. Immunol. 147: 60, 1991中所述制备三特异性抗体来制备。本申请的多特异性抗体还包括具有三个或更多个功能抗原结合位点的抗体，包括“Octopus抗体”或“双重可变结构域免疫球蛋白” (DVD) (参见例如US 2006/0025576A1和Wu等 Nature Biotechnology, 25(11):1290-7, 2007)。本申请的多特异性抗体还包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含结合TfR以及脑抗原(例如BACE1或Tau)的抗原结合区(参见例如US 2008/0069820)。在一个实施方案中，抗体是抗体片段，各种这样的片段在本文中公开。
在一个实施方案中，本申请的多特异性抗体是融合构建体，其包含共价连接(或融合)至第二抗体或其抗原结合片段的本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段。优选地，第二抗体或其抗原结合片段结合脑靶标，例如BACE、tau或其它脑抗原，例如本文描述的那些。抗-TfR抗体或其抗原结合片段可直接或通过接头融合至第二抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链的羧基和/或氨基末端。
在一个实施方案中，抗-TfR抗体或其抗原结合片段直接或通过接头融合至第二抗体或其抗原结合片段的轻链的羧基末端。
在另一个实施方案中，抗-TfR抗体或其抗原结合片段直接或通过接头融合至第二抗体或其抗原结合片段的轻链的氨基末端。
在另一个实施方案中，抗-TfR抗体或其抗原结合片段直接或通过接头融合至第二抗体或其抗原结合片段的重链的羧基末端。
在另一个实施方案中，抗-TfR抗体或其抗原结合片段直接或通过接头融合至第二抗体或其抗原结合片段的重链的氨基末端。
在优选的实施方案中，本申请的融合构建体包含本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，优选地抗-huTfR1 VHH或scFv片段，其通过接头共价连接至结合脑靶标的第二抗体或其抗原结合片段的两条重链中仅一条的羧基末端。优选地，接头具有SEQ ID NO: 312或SEQ ID NO: 313的氨基酸序列。
为了促进两条重链之间的异二聚体的形成，例如一条具有抗-TfR抗体或其抗原结合片段的融合物和一条没有，或者一条含有对于抗-TfR臂的Fc和一条含有对于抗-脑靶标臂的Fc，将异二聚体突变引入两条重链的Fc中。这样的Fc突变的实例包括但不限于，Zymework突变(参见例如，US 10,457,742)和“旋钮入孔”突变(参见例如，Ridgway等, Protein Eng., 9(7): 617-621, 1996)。其它异二聚体突变也可用于本发明。在一些实施方案中，本文所述的修饰的CH3用于促进在两条重链之间异二聚体的形成。
除了异二聚体突变，也可引入其它突变。在一些实施方案中，融合构建体或双特异性抗体的Fc区进一步包含改变(增加或减少)、优选地消除ADCC/CDC的一个或多个突变(例如本文描述的AAS突变)和/或改变(增加或减少)、优选地增加融合构建体或双特异性抗体与FcRn的结合的一个或多个突变(例如本文描述的YTE突变)。在一些实施方案中，在融合构建体或双特异性抗体中的一个或多个半胱氨酸残基被替换为其它氨基酸，例如丝氨酸。
在某些实施方案中，本申请的融合构建体包含：
(1) 第一重链，其具有与选自SEQ ID NO: 301、304、307、285 、288、298、10、13、16、19、22、25、35、38、41、44、47、50、53、63、66、69、72、75、78、81、91、94、97、100、103、106、116、119、122、125、128、131、141、144、147、150、153、156、159、169、172、175、178、181、184、187、197、200、203、206、209、212、215、225、228、231、234、237、240、250、252、256、259、269、272、275、320、327、334、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461和471的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列；
(2) 两条轻链，各自独立地具有分别与选自302、305、308、286、289、299、11、14、17、20、23、26、36、39、42、45、48、51、54、64、67、70、73、76、79、82、92、95、98、101、104、107、117、120、123、126、129、132、142、145、148、151、154、157、160、170、173、176、179、182、185、188、198、201、204、207、210、213、216、226、229、232、235、238、241、251、253、257、260、270、273、276、321、328、335、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462和472的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列；和
(3) 第二重链，其具有分别与选自303、306、309、287、290、300、12、15、18、21、24、27、37、40、43、46、49、52、55、65、68、71、74、77、80、83、93、96、99、102、105、108、118、121、124、127、130、133、143、146、149、152、155、158、161、171、174、177、180、183、186、189、199、202、205、208、211、214、217、227、230、233、236、239、242、252、254、258、261、271、274、277、322、329、336、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463和473的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列。
根据本公开内容，本申请的缀合物，例如多特异性抗体或融合构建体，可通过本领域已知的多种技术中的任何一种产生。例如，其可从重组宿主细胞表达，其中编码融合构建体或多特异性抗体的重链和轻链的表达载体通过标准技术被转染至宿主细胞中。宿主细胞可以是原核或真核宿主细胞。
在示例性的系统中，编码本申请的融合构建体的异二聚体两条重链和轻链的一种或多种重组表达载体通过转染或电穿孔被引入宿主细胞中。在足以产生融合构建体的条件下培养选择的转化株宿主细胞以允许表达重链和轻链，和从培养基回收融合构建体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化株，培养宿主细胞和从培养基回收蛋白质构建体。
本申请提供了分离的核酸，其编码单独或作为本文所述的任何实施方案或任何权利要求中的融合构建体或多特异性抗体的一部分的抗-TfR抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。分离的核酸可以是载体、优选地表达载体的一部分。
在另一个方面中，本申请涉及用本文公开的载体转化的宿主细胞。在实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如原生生物细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞。在实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO、COS、NS0、SP2、PER.C6，或真菌细胞，例如酿酒酵母，或昆虫细胞，例如Sf9。
药物组合物和相关方法
本发明还涉及药物组合物、其制备方法和使用方法。
在另一个一般方面中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗-TfR抗体或其抗原结合片段或其缀合物和药学上可接受的载剂。本发明的抗-TfR抗体或其抗原结合片段或缀合物(例如多特异性抗体或融合构建体)还可用于制备用于本文提及的治疗性应用的药物。药学上可接受的载剂可以是任何合适的赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含脂质溶媒、微球、脂质体包封或本领域众所周知的用于药物制剂的其它材料。将理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征取决于对于特定应用的给予途径。
因此，在一个实施方案中，本申请涉及跨越血脑屏障(BBB)运输治疗剂或诊断剂的方法，其包括将与治疗剂或诊断剂偶联的抗-TfR抗体或其抗原结合片段暴露于血脑屏障，使得抗体或其抗原结合片段跨越血脑屏障运输与其偶联的药剂。在一个实施方案中，药剂是神经学病症药物。在另一个实施方案中，药剂是成像剂或用于检测神经学病症的药剂。优选地，抗-TfR抗体或其抗原结合片段或其缀合物不损害TfR与其天然配体转铁蛋白的结合。抗体以不抑制TfR与转铁蛋白结合的方式特异性结合TfR。在一些实施方案中，BBB在哺乳动物，优选地灵长类动物，例如人，更优选地具有神经学病症的人中。在一个实施方案中，神经学病症选自阿尔茨海默氏病(AD)、中风、痴呆、肌营养不良症(MD)、多发性硬化症(MS)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、囊性纤维化、安格曼综合征(Angelman's syndrome)、里德尔综合征(Liddle syndrome)、帕金森病、皮克氏病、佩吉特病(Paget's disease)、癌症和创伤性脑损伤。
在一个实施方案中，本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段或其缀合物用于在症状发作之前检测神经学病症和/或评价疾病或病症的严重性或持续时间。抗体、其抗原结合片段或缀合物允许检测和/或成像神经学病症，包括通过放射照相、断层扫描或磁共振成像(MRI)成像。
在另一个实施方案中，抗-TfR抗体或其抗原结合片段或其缀合物用于治疗神经学病症(例如，阿尔茨海默氏病)，其包括给予需要治疗的受试者有效量的抗-TfR抗体或其抗原结合片段或其缀合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括给予所述受试者有效量的至少一种另外的治疗剂。
在另一个实施方案中，本申请涉及本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段或缀合物在生产或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗神经学疾病或病症。在进一步的实施方案中，所述药物用于治疗神经学疾病或病症的方法，所述方法包括给予具有神经学疾病或病症的个体有效量的所述药物。
本申请的另一个一般方面涉及在有需要的受试者中诱导抗体依赖性吞噬作用(ADP)而不刺激促炎细胞因子分泌的方法，其包括给予所述受试者包含与根据本申请的实施方案的抗-TfR抗体结合片段的其抗原结合片段偶联、优选地共价缀合的治疗性抗体或其抗原结合片段的复合物，其中所述治疗性抗体或其抗原结合片段不具有效应子功能。例如，所述治疗性抗体或其抗原结合片段可包含降低或消除效应子功能、例如ADCC或CDC的一个或多个氨基酸修饰，例如减少或废除与Fc γ受体的结合的突变。这样的突变可以在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329，例如L234A、L235A和P331S中的一个、两个或三个突变，其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。在一个实施方案中，治疗性抗体或其抗原结合片段特异性结合tau聚集体。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括给予所述受试者有效量的至少一种另外的治疗剂。在某些实施方案中，另外的治疗剂是有效治疗与正在使用抗-TfR抗体或其抗原结合片段或缀合物治疗的相同或不同神经学病症的治疗剂。示例性的另外治疗剂包括但不限于：上述各种神经学药物、胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐、加兰他敏、rovastigmine和他克林)、NMDA受体拮抗剂(例如美金刚)、β淀粉样蛋白肽聚集抑制剂、抗氧化剂、γ-分泌酶调节剂、神经生长因子(NGF)模拟物或NGF基因疗法、PPARy激动剂、HMS-CoA还原酶抑制剂(他汀类药物)、安帕金、钙通道阻滞剂、GABA受体拮抗剂、糖原合酶激酶抑制剂、静脉内免疫球蛋白、毒蕈碱受体激动剂、烟碱受体调节剂、主动或被动β淀粉样蛋白肽免疫、磷酸二酯酶抑制剂、血清素受体拮抗剂和抗-β淀粉样蛋白肽抗体。在某些实施方案中，对于其减轻神经学药物的一种或多种副作用的能力，选择至少一种另外的治疗剂。另外的治疗剂可在相同或分开的制剂中给予，并且与抗-TfR抗体或其抗原结合片段或缀合物一起或分开给予。本申请的抗-TfR抗体或抗原结合片段或缀合物可在给予另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后给予。本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段或缀合物也可与其它介入疗法组合使用，所述其它介入疗法例如但不限于放射疗法、行为疗法或本领域已知并适合于待治疗或预防的神经学病症的其它疗法。
本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段或缀合物(以及任何另外的治疗剂)可通过任何合适的方式给予，所述方式包括胃肠外、肺内和鼻内，以及如果对于局部治疗需要的话，病灶内给予。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予，部分取决于给予是短暂的还是长期的。本文预期各种给药方案，包括但不限于在各个时间点单次或多次给予、推注给予和脉冲输注。
对于预防或治疗疾病，本申请的抗-TfR抗体或其抗原结合片段或缀合物的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于各种因素，例如待治疗的疾病类型、抗体或缀合物的类型、疾病的严重性和进程、为预防还是治疗目的给予抗体、其抗原结合片段或缀合物、之前的疗法、患者的临床历史和对抗体的应答、受试者的生理状态(包括例如，年龄、体重、健康)和主治医师的判断。最佳滴定治疗剂量以优化安全性和功效。抗体、其抗原结合片段或缀合物合适地一次或经过一系列治疗给予患者。
根据特定的实施方案，治疗有效量是指足以实现一个、两个、三个、四个或更多个以下效果的疗法的量：(i) 降低或改善待治疗的疾病、病症或病况或与其相关的症状的严重性；(ii) 减少待治疗的疾病、病症或病况或与其相关的症状的持续时间；(iii) 预防待治疗的疾病、病症或病况或与其相关的症状的进展；(iv) 导致待治疗的疾病、病症或病况或与其相关的症状的消退；(v) 预防待治疗的疾病、病症或病况或与其相关的症状的发展或发作；(vi) 预防待治疗的疾病、病症或病况或与其相关的症状的复发；(vii) 减少具有待治疗的疾病、病症或病况或与其相关的症状的受试者的住院；(viii) 减少具有待治疗的疾病、病症或病况或与其相关的症状的受试者的住院时长；(ix) 增加具有待治疗的疾病、病症或病况或与其相关的症状的受试者的存活；(xi) 抑制或减少受试者的待治疗的疾病、病症或病况或与其相关的症状；和/或(xii) 增强或改进另一疗法的预防性或治疗性效果。
在另一个方面，本申请涉及提供含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品(例如药盒)。所述制品包含容器和在容器上或与容器关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各种材料例如玻璃或塑料形成。容器容纳组合物，其为自身或与有效治疗、预防和/或诊断病况的另一组合物组合，并且可具有无菌接入端口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本申请的抗体、其抗原结合片段或缀合物。标签或包装插页指示组合物用于治疗选择的病况。此外，制品可包括(a) 其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本申请的抗体、其抗原结合片段或缀合物；和(b) 其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性或其它治疗剂。在本发明的该实施方案中的制品可进一步包括包装插页，其指示组合物可用于治疗特定的病况。任选地，制品可进一步包含第二(或者第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可进一步包括商业和用户立场所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、填充剂、针头和注射器。
实施方案
本发明还提供了以下非限制性实施方案。
1. 抗-TfR抗体或其抗原结合片段，其用于递送药剂至有需要的受试者的脑，其中所述抗-TfR抗体或其抗原结合片段以在中性pH下至少1 nM的解离常数KD和在酸性pH、优选地pH 5下至少10-4 sec-1的解离速率常数kd，结合转铁蛋白受体(TfR)，优选地人TfR1。
1a. 实施方案1的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，具有在中性pH下1 nM至500 nM，例如1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、200 nM、300 nM、400 nM、500 nM或其之间任何值的解离常数KD。
1b. 实施方案1或1a的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，具有在酸性pH下10-4 sec-1至10-1 sec-1，例如10-4、10-3、10-2、10-1 sec-1或其之间任何值的解离速率常数kd。
2. 实施方案1-1b中任一项的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，具有在中性pH下2 x10-2至2 x 10-4 sec-1、优选地2.0 x 10-3 sec-1的解离速率常数kd。
2a. 实施方案2的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，其中在中性pH下的解离速率常数kd是2 x 10-2至2 x 10-4 sec-1，例如2 x 10-2、1 x 10-2、9 x 10-3、8 x 10-3、7 x 10-3、6x 10-3、5 x 10-3、4 x 10-3、3 x 10-3、2 x 10-3、1 x 10-3、9 x 10-4、8 x 10-4、7 x 10-4、6 x10-4、5 x 10-4、4 x 10-4、3 x 10-4、2 x 10-4 sec-1或其之间任何值。
3. 实施方案1-2a中任一项的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，包含
(1) 包含重链互补决定区(HCDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区和包含轻链互补决定区(LCDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有以下氨基酸序列：
i. 分别为SEQ ID NO: 292、293、294、295、296和297；
ii. 分别为SEQ ID NO: 279、280、281、282、283和284；
iii. 分别为SEQ ID NO: 29、30、31、32、33和34；
iv. 分别为SEQ ID NO: 57、58、59、60、61和62；
v. 分别为SEQ ID NO: 85、86、87、88、89和90；
vi. 分别为SEQ ID NO: 110、111、112、113、114和115；
vii. 分别为SEQ ID NO: 135、136、137、138、139和140；
viii. 分别为SEQ ID NO: 191、192、193、194、195和196；
ix. 分别为SEQ ID NO: 244、245、246、247、248和249；
x. 分别为SEQ ID NO: 263、264、265、266、267和268；
xi. 分别为SEQ ID NO: 345、346、347、348、349和350；
xii. 分别为SEQ ID NO: 355、356、357、358、359和360；
xiii. 分别为SEQ ID NO: 365、366、367、368、369和370；
xiv. 分别为SEQ ID NO: 375、376、377、378、379和380；
xv. 分别为SEQ ID NO: 385、386、387、388、389和390；
xvi. 分别为SEQ ID NO: 395、396、377、398、399和400；
xvii. 分别为SEQ ID NO: 405、406、407、408、409和410；
xviii. 分别为SEQ ID NO: 415、416、417、418、419和420；
xix. 分别为SEQ ID NO: 425、426、427、428、429和430；
xx. 分别为SEQ ID NO: 435、436、437、438、439和440；
xxi. 分别为SEQ ID NO: 445、446、447、448、449和450；
xxii. 分别为SEQ ID NO: 455、456、457、458、459和460；
xxiii. 分别为SEQ ID NO: 465、466、467、468、469和470；
xxiv. 分别为SEQ ID NO: 475、476、477、478、479和480；
xxv. 分别为SEQ ID NO: 485、486、487、488、489和490；
xxvi. 分别为SEQ ID NO: 495、496、497、498、499和500；
xxvii. 分别为SEQ ID NO: 505、506、507、508、509和510；
xxviii. 分别为SEQ ID NO: 515、516、517、518、519和520；
xxix. 分别为SEQ ID NO: 525、526、527、528、529和530；
xxx. 分别为SEQ ID NO: 535、536、537、538、539和540；或
xxxi. 分别为SEQ ID NO: 545、546、547、548、549和550；或者
(2) 重链单一可变结构域(VHH)，其包含具有以下氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3：
i. 分别为SEQ ID NO: 7、8和9；
ii. 分别为SEQ ID NO: 317、318和319；
iii. 分别为SEQ ID NO: 324、325和326；
iv. 分别为SEQ ID NO: 331、332和333；或
v. 分别为SEQ ID NO: 338、339和340。
4. 实施方案3的抗体或其抗原结合片段，其为包含与SEQ ID NO: 6、316、323、330或337具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VHH片段。
4a. 实施方案2的抗体或其抗原结合片段，其中VHH片段包含SEQ ID NO: 6、316、323、330或337的氨基酸序列。
5. 实施方案3的抗体或其抗原结合片段，其为包含通过接头与轻链可变区(VL)共价连接的重链可变区(VH)的单链可变片段(scFv)，所述接头例如具有约10-约25个氨基酸长度的肽接头。
5a. 实施方案5的抗体或其抗原结合片段，其中在scFv中VH通过接头连接至VL的氨基末端。
5b. 实施方案5的抗体或其抗原结合片段，其中在scFv中VH通过接头连接至VL的羧基末端。
5c. 实施方案5a或5b的抗体或其抗原结合片段，其中接头包含Gly和Ser中的一个或多个，以及一个或多个穿插的Glu、Thr和Lys残基，优选地接头具有SEQ ID NO: 314的氨基酸序列。
5d. 实施方案5c的抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含分别具有SEQ IDNO: 279、280、281、282、283和284的氨基酸序列或分别具有SEQ ID NO: 292、293、294、295、296和297的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
5e. 实施方案5的抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含与SEQ ID NO: 278、291、28、56、84、109、134、162、190、218、243、262、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534或544的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列。
5f. 实施方案5e的抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含SEQ ID NO: 278、291、28、56、84、109、134、162、190、218、243、262、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534或544的氨基酸序列。
5g. 实施方案5e的抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含SEQ ID NO: 278、291、162或218的氨基酸序列。
5h. 抗体或其抗原结合片段，其结合实施方案3-5g中任一项的抗体或其抗原结合片段的相同表位。
5i. 抗体或其抗原结合片段，其与实施方案3-5g中任一项的抗体或其抗原结合片段竞争结合至TfR。
5j. 实施方案3-5i中任一项的抗体或其抗原结合片段，其以在pH7.4下1至500nM，例如1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、200 nM、300 nM、400 nM、500 nM或其之间任何值的解离常数KD结合至人TfR1。
5k. 实施方案3-5j中任一项的抗体或其抗原结合片段，其以在pH5下10-4至10-1sec-1，例如10-4、10-3、10-2、10-1 sec-1或其之间任何值的解离速率常数kd结合至人TfR1。
6. 一种复合物，其包含与治疗剂或诊断剂偶联的实施方案1-5k中任一项的抗体或其抗原结合片段。
6a. 实施方案6的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与治疗剂或诊断剂非共价偶联。
6b. 实施方案6的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与治疗剂或诊断剂共价偶联以形成缀合物。
6c. 实施方案6的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段通过接头与治疗剂或诊断剂共价连接。
6d. 实施方案6c的复合物，其中所述接头是非肽接头，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯醚、可生物降解聚合物、聚合脂质、壳多糖和透明质酸或其衍生物，或其组合。
6e. 实施方案6c的复合物，其中所述接头是肽接头，例如由通过肽键连接的1-50个氨基酸组成的肽链或其衍生物。
6f. 实施方案6-6e中任一项的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与用于检测神经学病症的诊断剂偶联，优选地所述诊断剂是用于正电子发射断层扫描(PET)的药剂或用于IDK的药剂。
6g. 实施方案6-6e中任一项的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与治疗剂、优选地神经学病症药物偶联。
6h. 实施方案6g的复合物，其中所述神经学病症药物选自小分子化合物、抗体、肽、蛋白质、一种或多种CNS靶标的天然配体、一种或多种CNS靶标的天然配体的修饰形式、适体、抑制性核酸(即，小抑制性RNA (siRNA)和短发夹RNA (shRNA))、核酶和前述药物的活性片段。
6i. 实施方案6g的复合物，其中所述神经学病症药物选自抗体、适体、蛋白质、肽、抑制性核酸和小分子和任何前述药物的活性片段，其本身是或特异性识别和/或作用于(即，抑制、激活或检测) CNS抗原或靶标分子，例如但不限于，淀粉样前体蛋白或其部分、β淀粉样蛋白、β-分泌酶、γ-分泌酶、tau、α-突触核蛋白、parkin、亨廷顿蛋白、DR6、早老素、ApoE、胶质瘤或其它CNS癌症标志物和神经营养因子。神经学病症药物和它们可用于治疗的相应病症的非限制性实例：脑源性神经营养因子(BDNF)、慢性脑损伤(神经发生)、成纤维细胞生长因子2 (FGF-2)、抗-表皮生长因子受体、脑癌症、(EGFR)-抗体、胶质细胞系衍生神经因子、帕金森病、(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、肌萎缩侧索硬化、抑郁症、溶酶体酶、脑的溶酶体贮积症、睫状神经营养因子(CNTF)、肌萎缩侧索硬化、神经调节蛋白-1、精神分裂症、抗-HER2抗体(例如曲妥珠单抗)、从HER2阳性癌症的脑转移。
7. 实施方案6的复合物，其是包含结合TfR的第一抗原结合区和结合脑抗原(或脑靶标)的第二抗原结合区的多特异性抗体，其中第一抗原结合区包含实施方案1-5k中任一项的其抗原结合片段。
7a. 实施方案7的多特异性抗体，其中所述脑靶标选自β-分泌酶1 (BACE1)、β淀粉样蛋白(Abeta)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2 (HER2)、Tau、载脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、亨廷顿蛋白、朊蛋白(PrP)、富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受体6 (DR6)、淀粉样前体蛋白(APP)、p75神经营养因子受体(p75NTR)和胱天蛋白酶6。
7b. 实施方案7a的多特异性抗体，其中第二抗原结合区结合BACE1或Tau。
7c. 实施方案7-7b中任一项的多特异性抗体，其中第一抗原结合区与第一Fc共价连接，并且第二抗原结合区与第二Fc共价连接。
7d. 实施方案7c的多特异性抗体，其中第一Fc在一个或多个氨基酸残基上不同于第二Fc，以促进在第一Fc和第二Fc之间异二聚体的形成。
8. 实施方案7-7d中任一项的多特异性抗体，其是包含共价连接结合脑抗原(或脑靶标)的第二抗体或其抗原结合片段的实施方案1-5k中任一项的抗体或其抗原结合片段的融合构建体。
8a. 实施方案8的融合构建体，其中实施方案1-5k中任一项的抗体或其抗原结合片段与第二抗体或其抗原结合片段的重链的氨基末端共价连接，优选地通过接头。
8b. 实施方案8的融合构建体，其中实施方案1-5k中任一项的抗体或其抗原结合片段与第二抗体或其抗原结合片段的轻链的氨基末端共价连接，优选地通过接头。
8c. 实施方案8的融合构建体，其中实施方案1-5k中任一项的抗体或其抗原结合片段与第二抗体或其抗原结合片段的轻链的羧基末端共价连接，优选地通过接头。
8d. 实施方案8的融合构建体，其中实施方案1-5k中任一项的抗体或其抗原结合片段与第二抗体或其抗原结合片段的重链的羧基末端共价连接，优选地通过接头。
9. 实施方案8d的融合构建体，其中实施方案1-5k中任一项的抗体或其抗原结合片段通过接头与第二抗体或抗原结合片段的两条重链中任一条的羧基末端共价连接。
9a. 实施方案8a-9中任一项的融合构建体，其中所述接头是包含Gly和Ser中的一个或多个的肽接头，优选地所述接头具有SEQ ID NO: 312或SEQ ID NO: 313的氨基酸序列。
9b. 实施方案8-9a中任一项的融合构建体，其中所述第二抗体或其抗原结合片段包含在其第一重链中的第一Fc和在其第二重链中的第二Fc，并且第一Fc在一个或多个氨基酸残基上不同于第二Fc，以促进在第一Fc和第二Fc之间异二聚体的形成。
9c. 实施方案7d的多特异性抗体或实施方案9b的融合构建体，其中第一Fc含有一个或多个“旋钮”突变和第二Fc含有一个或多个相应的“孔”突变，或反之亦然(对于“旋钮入孔”突变，参见例如，美国专利号5,731,168；Ridgway等, Protein Eng., 9(7): 617-621,1996，其通过引用以其整体并入本文)，优选地，T366W的旋钮突变和T366S、L368A或Y407V的孔突变。
9d. 实施方案7d的多特异性抗体或实施方案9b的融合构建体，其中与野生型CH3结构域多肽相比，第一Fc和第二Fc各自包含修饰的异二聚体CH3结构域，优选地所述修饰的异二聚体CH3结构域包含US10,457,742中描述的一个或多个突变。
9e. 实施方案9d的多特异性抗体或融合构建体，其中第一Fc的修饰的异二聚体CH3结构域包含位置T350、L351、F405和Y407的氨基酸修饰，并且第二Fc的修饰的异二聚体CH3结构域包含位置T350、T366、K392和T394的氨基酸修饰。
9f. 实施方案9e的多特异性抗体或融合构建体，其中位置T350的氨基酸修饰是T350V、T350I、T350L或T350M；位置L351的氨基酸修饰是L351Y；位置F405的氨基酸修饰是F405A、F405V、F405T或F405S；位置Y407的氨基酸修饰是Y407V、Y407A或Y407I；位置T366的氨基酸修饰是T366L、T366I、T366V或T366M；位置K392的氨基酸修饰是K392F、K392L或K392M；和位置T394的氨基酸修饰是T394W。
9g. 实施方案9e的多特异性抗体或融合构建体，其中第一Fc的修饰的异二聚体CH3结构域包含突变T350V、L351Y、F405A和Y407V，和第二Fc的修饰的异二聚体CH3结构域包含突变T350V、T366L、K392L和T394W，或反之亦然。
10. 实施方案7-9g中任一项的多特异性抗体或融合构建体，其中多特异性抗体或融合构建体的Fc区进一步包含改变(增加或减少)，优选地增加第二抗体或其抗原结合片段与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的置换。
10a. 实施方案10的多特异性抗体或融合构建体，其中第二抗体或其抗原结合片段包含Fc结构域中的一个或多个突变，其增强融合物与新生儿Fc受体(RcRn)的结合。
10b. 实施方案10或10a的多特异性抗体或融合构建体，其中所述一个或多个突变增强在酸性pH下的结合。
10c. 实施方案10b的多特异性抗体或融合构建体，其中第二抗体的Fc具有M252Y/S254T/T256E (YTE)突变，其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。
11. 实施方案7-10c中任一项的多特异性抗体或融合构建体，其中多特异性抗体或融合构建体的Fc区进一步包含改变(增加或减少)，优选地减少或消除效应子功能的置换。
11a. 实施方案11的多特异性抗体或融合构建体，其中第二抗体或其抗原结合片段包含Fc结构域中的一个或多个突变，其减少或消除效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
11b. 实施方案11a的多特异性抗体或融合构建体，其中第二抗体的Fc具有位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329的一个或多个氨基酸修饰，其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。
11c. 实施方案11b的多特异性抗体或融合构建体，其中第二抗体的Fc具有L234A、L235A和P331S (AAS突变)中的一个、两个或三个突变。
12. 实施方案7-11c中任一项的多特异性抗体或融合构建体，其中第一抗原结合区或抗体或其抗原结合片段不含有半胱氨酸。
13. 实施方案7-12的多特异性抗体或融合构建体，其中第二抗原结合区或第二抗体或其抗原结合片段结合Tau，优选地包含分别具有SEQ ID NO: 554-559的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，优选地所述第二抗体是包含具有SEQ ID NO:310的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO: 311的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体。
14. 实施方案9的融合构建体，包含：
(1) 第一重链，其具有与选自SEQ ID NO: 301、304、307、285 、288、298、10、13、16、19、22、25、35、38、41、44、47、50、53、63、66、69、72、75、78、81、91、94、97、100、103、106、116、119、122、125、128、131、141、144、147、150、153、156、159、169、172、175、178、181、184、187、197、200、203、206、209、212、215、225、228、231、234、237、240、250、252、256、259、269、272、275、320、327、334、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461和471的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列；
(2) 两条轻链，各自独立地具有分别与选自302、305、308、286、289、299、11、14、17、20、23、26、36、39、42、45、48、51、54、64、67、70、73、76、79、82、92、95、98、101、104、107、117、120、123、126、129、132、142、145、148、151、154、157、160、170、173、176、179、182、185、188、198、201、204、207、210、213、216、226、229、232、235、238、241、251、253、257、260、270、273、276、321、328、335、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462和472的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列；和
(3) 第二重链，其具有分别与选自303、306、309、287、290、300、12、15、18、21、24、27、37、40、43、46、49、52、55、65、68、71、74、77、80、83、93、96、99、102、105、108、118、121、124、127、130、133、143、146、149、152、155、158、161、171、174、177、180、183、186、189、199、202、205、208、211、214、217、227、230、233、236、239、242、252、254、258、261、271、274、277、322、329、336、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463和473的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列。
14a. 实施方案14的融合构建体，其中两条轻链具有相同的氨基酸序列。
14b. 实施方案14的融合构建体，其中两条轻链具有不同的氨基酸序列。
14c. 实施方案14的融合构建体，其中：
(1) 第一重链具有选自SEQ ID NO: 301、304、307、285 、288、298、10、13、16、19、22、25、35、38、41、44、47、50、53、63、66、69、72、75、78、81、91、94、97、100、103、106、116、119、122、125、128、131、141、144、147、150、153、156、159、169、172、175、178、181、184、187、197、200、203、206、209、212、215、225、228、231、234、237、240、250、252、256、259、269、272、275、320、327、334、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461和471的氨基酸序列；
(2) 两条轻链各自具有分别选自302、305、308、286、289、299、11、14、17、20、23、26、36、39、42、45、48、51、54、64、67、70、73、76、79、82、92、95、98、101、104、107、117、120、123、126、129、132、142、145、148、151、154、157、160、170、173、176、179、182、185、188、198、201、204、207、210、213、216、226、229、232、235、238、241、251、253、257、260、270、273、276、321、328、335、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462和472的氨基酸序列；和
(3) 第二重链具有分别选自303、306、309、287、290、300、12、15、18、21、24、27、37、40、43、46、49、52、55、65、68、71、74、77、80、83、93、96、99、102、105、108、118、121、124、127、130、133、143、146、149、152、155、158、161、171、174、177、180、183、186、189、199、202、205、208、211、214、217、227、230、233、236、239、242、252、254、258、261、271、274、277、322、329、336、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463和473的氨基酸序列。
14d. 实施方案14的融合构建体，其中：
(1) 第一重链具有SEQ ID NO: 285、288、298或301的氨基酸序列；
(2) 两条轻链各自具有分别为286、289、299或302的氨基酸序列；和
(3) 第二重链具有分别为287、290、300或303的氨基酸序列。
15. 分离的核酸，其编码实施方案1-5k中任一项的抗体或抗原结合片段或实施方案7-14d中任一项的融合构建体。
16. 载体，其包含权利要求15的分离的核酸。
17. 宿主细胞，其包含实施方案15的核酸或实施方案16的载体。
18. 一种产生实施方案1-5k中任一项的抗体或抗原结合片段或实施方案7-14d中任一项的融合构建体的方法，其包括在产生抗体或抗原结合片段或融合构建体的条件下培养包含编码抗体或抗原结合片段或融合构建体的核酸的细胞，和从细胞或细胞培养物回收抗体或抗原结合片段、缀合物或融合构建体。
19. 药物组合物，其包含实施方案1-5k中任一项的抗体或抗原结合片段、实施方案6-6i中任一项的复合物或实施方案7-14d中任一项的多特异性抗体或融合构建体和药学上可接受的载剂。
20. 一种治疗或检测有需要的受试者的神经学病症的方法，其包括给予所述受试者有效量的实施方案1-5k中任一项的抗体或抗原结合片段、实施方案6-6i中任一项的复合物或实施方案7-14d中任一项的多特异性抗体或融合构建体或实施方案19的药物组合物。
21. 一种增加治疗剂或诊断剂递送至有需要的受试者的脑的方法，其包括给予所述受试者包含与实施方案1-5k中任一项的抗体或其抗原结合片段偶联的治疗剂或诊断剂的缀合物。
22. 一种跨越血脑屏障(BBB)运输治疗剂或诊断剂的方法，其包括将与治疗剂或诊断剂偶联的实施方案1-5k中任一项的抗-TfR抗体或其抗原结合片段暴露于血脑屏障，使得所述抗体或其抗原结合片段跨越血脑屏障运输与其偶联的药剂。
23. 一种跨越有需要的受试者的血脑屏障(BBB)递送治疗剂或诊断剂的方法，其包括给予所述受试者包含与实施方案1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段偶联、优选地共价缀合的治疗剂或诊断剂的复合物。
24. 一种在有需要的受试者中诱导抗体依赖性吞噬作用(ADP)而不刺激促炎细胞因子的分泌的方法，其包括给予所述受试者包含与实施方案1-5中任一项的其抗原结合片段偶联、优选地共价缀合的治疗性抗体或其抗原结合片段的复合物，其中所述治疗性抗体或其抗原结合片段在Fc结构域中包含一个或多个突变，其减少或消除效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
24a. 实施方案23的方法，其中所述治疗性抗体或其抗原结合片段包含位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329的一个或多个氨基酸修饰，其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。
24b. 实施方案24a的方法，其中所述治疗性抗体或其抗原结合片段包含L234A、L235A和P331S中的一个、两个或三个突变。
25. 实施方案20-24b中任一项的方法，其中所述受试者需要治疗神经学病症，优选地所述神经学病症选自神经退行性疾病(例如路易体病、脊髓灰质炎后综合征、Shy-Draeger综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩)、tau蛋白病(例如阿尔茨海默病和核上性麻痹)、朊病毒病(例如牛海绵状脑病、羊搔症、克雅氏综合征、库鲁病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、慢性消耗病和致命性家族性失眠症)、延髓麻痹、运动神经元病和神经系统异变性疾病(例如卡纳万病、亨廷顿氏病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大病、图雷特综合征、门克斯扭结发综合征、科凯恩综合征、Hallervorden-Spatz综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、Lesch-Nyhan综合征和Unverricht-Lundborg综合征)、痴呆(例如皮克氏病和脊髓小脑性共济失调)和CNS和/或脑的癌症(例如身体别处的癌症导致的脑转移)。
26. 实施方案20-25中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段、复合物、多特异性抗体、融合构建体或药物组合物经静脉内给予。
27. 实施方案21-26中任一项的方法，其中所述治疗剂或治疗性抗体或其抗原结合片段是神经学病症药物。
28. 实施方案21-23中任一项的方法，其中所述药剂是成像剂或用于检测神经学病症的药剂。
29. 实施方案20-28中任一项的方法，其中所述抗-TfR抗体或其抗原结合片段、其复合物或融合物不损害TfR与其天然配体转铁蛋白的结合。
30. 实施方案20-29中任一项的方法，其中所述给予减少Fc介导的效应子功能。
31. 实施方案21-30中任一项的方法，其中所述给予不诱导快速网织红细胞耗竭。
32. 实施方案31的方法，其中所述治疗性抗体或其抗原结合片段特异性结合tau聚集体。
33. 实施方案20-32中任一项的方法，其中所述受试者是灵长类动物，例如人，更优选地具有神经学病症的人。
34. 实施方案33的方法，其中所述神经学病症选自阿尔茨海默氏病(AD)、中风、痴呆、肌营养不良症(MD)、多发性硬化症(MS)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、囊性纤维化、安格曼综合征、里德尔综合征、帕金森病、皮克氏病、佩吉特病、癌症和创伤性脑损伤。
本发明的以下实施例进一步说明本发明的性质。应理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由随附权利要求确定。
实施例
实施例1
尽管血脑屏障(BBB)阻止有害物质进入脑，并且对于脑稳态是必需的，但对于有效递送药物至脑，它呈现出强大的阻碍。为此，开发了单克隆抗体(mAb)脑穿梭载体平台，其穿过BBB并且导致比单独的mAb显著更高的脑浓度。
抗体产生(OMT大鼠和Ablexis小鼠)
OMT大鼠(OmniRat®，来自Ligand Pharmaceuticals)和Ablexis小鼠(Ablexis,LLC, San Diego, CA)用人(SEQ ID NO: 1)、食蟹猴(SEQ ID NO: 2)和狨猴(SEQ ID NO:3)转铁蛋白受体(TfR)，使用重复免疫多个位点(RIMMS)方案免疫，持续46天(Ablexis)、49天(OMT)或50天(OMT)。简言之，在区域引流淋巴结近端的多个皮下位点处重复免疫动物。在第32天(OMT)或第35天(Ablexis)进行血清滴定(ELISA，酶联免疫吸附测定)，并且所有动物总体上对人、食蟹猴和狨猴TfR显示低至中等的效价，并且对阴性对照没有效价。从血清阳性的大鼠和小鼠收获淋巴结，并融合以产生杂交瘤。
首先对于与HEK293T huTfR (人转铁蛋白受体)表达细胞的结合，通过Meso ScaleDiscovery (MSD)或ELISA筛选杂交瘤。然后在验证性筛选中测试所有这些命中。在基于荧光激活细胞分选(FACS)的验证性筛选中，使用MDCK-huTfR细胞(Madin-Darby犬肾细胞)和pBECs (微血管内皮细胞，内源性huTfR表达)，并且MDCK (亲本)细胞用作阴性细胞系。在验证性筛选后，鉴定了616种TfR特异性细胞结合剂(结合任一或两种huTfR表达细胞)。从这616种命中，340种在pBECS和MDCK-huTfR细胞上结合，16种仅在pBECS上结合和260种仅在MDCK-huTfR上结合。
然后对于结合大鼠TfR (SEQ ID NO: 4)和小鼠TfR (SEQ ID NO: 5)，筛选结合pBECs和MDCK-huTfR细胞的杂交瘤，检查在pBECs中的内化和与TfR的竞争。对那些具有人、食蟹猴和狨猴交叉反应性和在不竞争TfR的情况下内化的mAb，制备RNA裂解物。获得抗体V-区测序数据。
抗体产生(美洲驼)
为了产生与食蟹猴、小鼠和大鼠具有交叉反应性的针对人TfR的单结构域(VHH)抗体，在项目452L中在Abcore使用两只美洲驼进行免疫(动物1663L和1663L)。通过ELISA使用TfR蛋白(1 µg/ml)测定抗体效价。测试了来自两只动物的三次采血，并且两只动物均显示良好的早期效价。
在Abcore使用其标准方案进行噬菌体展示。制备两个文库：文库1 (452L-1)来自两只动物的第二次采血，和文库2 (452L-2)来自第二次和第三次采血。来自12个随机个体克隆的质粒DNA被测序，并且>80%含有具有正确阅读框的VHH插入物。用人TfR使用标准Abcore淘选程序，筛选两个噬菌体展示文库。用10 µg/ml的人TfR进行三轮淘选。淘选后，通过噬菌体ELISA筛选94个个体克隆对蛋白酶激活受体1 (Par1) N-末端结构域的特异性结合和对BSA (牛血清白蛋白)的非特异性结合。测量与食蟹猴、小鼠和大鼠TfR的交叉反应性。选择94个克隆进行序列分析。
噬菌体抗体产生
针对与转铁蛋白复合的生物素化huTfR，淘选噬菌体文库。生物素化的复合物在链霉亲和素磁珠(Dynal)上捕获，并暴露于重新的pIX Fab文库，所述文库用终浓度100 nM(第1和2轮)或50 nM (第3和4轮)的转铁蛋白蛋白质预孵育。在PBS-Tween中洗掉非特异性噬菌体，并且结合的噬菌体通过感染MC1061F’大肠杆菌细胞回收。从这些细胞扩增噬菌体过夜，并重复淘选总共四轮。在四轮生物淘选后，对于结合人转铁蛋白受体在ELISA中筛选单克隆Fab。在重链和轻链可变区中，对证实结合转铁蛋白受体的克隆测序。
本发明的TfR抗体或抗原结合片段的实例在下表1a中概述。
作为下文更详细描述的三足融合构建体(BBBB构建体)的一部分的抗-TfR mAb在中性pH (7.4)和酸性pH (5)下对TfR的结合亲和力(KD、kon或ka和koff或kdis或kd)使用以下生物层干涉方法测量。结果显示在下表1b中。
表1b
三足构建体设计
通过免疫啮齿动物和美洲驼产生针对TfR的抗体。在三足mAb (亦称为TTP mAb)结构中筛选得到的mAb与转铁蛋白和作为scFv或纳米抗体格式的非竞争性mAb的结合竞争并表征。三足用于递送感兴趣的物质(例如，单克隆抗体)至脑。更特别地，开发了含有针对TfR的抗体的抗原结合片段和感兴趣的单克隆抗体(mAb)的融合物的三足构建体(图1)，以帮助mAb穿过BBB和导致比单独的mAb显著更高的mAb脑浓度。
例如，三足mAb由治疗性mAb与使用短的柔性接头附接到一条抗体重链的C-末端的TfR结合scFv或纳米抗体组成。针对之前描述为增强转胞吞作用的特征(综述于Goulatis和Shusta 2017)：价位、结合亲和力、pH依赖性结合和在脑内皮细胞中的快速内化，分析三足mAb (图2-4)。
针对TfR的抗体的重链和轻链可变序列使用以下格式在单一基因构建体中作为单链可变片段(scFv)融合：Hc_GTEGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO: 314)_Lc。然后使用GGSGGS(SEQ ID NO: 312)或GGAGGA (SEQ ID NO: 313)接头，将针对TfR的scFv或VHH融合至感兴趣的抗体的重链(Hc)的C-末端。在抗体Hc中利用CH3中的Zymeworks异二聚化突变(Hc A:T350V_L351Y_F405A_Y407V; Hc B: T350V_T366L_K392L_T394W)以产生三足构建体(图1)，其亦称为三足mAb。三足mAb含有具有相同氨基酸序列的两条轻链和具有不同氨基酸序列的两条重链。两条重链中仅一条与本发明的TfR抗体的scFv或VHH融合，并且两条重链在其恒定区中也不同以促进两条重链之间的异二聚化。因此，根据本申请的实施方案的各三足mAb与三个氨基酸序列相关：与TfR抗体的抗原结合片段融合的第一重链的氨基酸序列、轻链的氨基酸序列和没有与TfR抗体的抗原结合片段融合的第二重链的氨基酸序列。
三足表达和纯化
三足mAb在CHO-Expi细胞中表达和使用蛋白A亲和色谱接着尺寸排阻色谱或离子交换色谱纯化。
制备的三足mAb的实例在表2a中提供：
表2a
细胞结合和TfR特异性
针对之前已经描述为增强转胞吞作用的特征(综述于Goulatis和Shusta 2017)：价位、结合亲和力、pH依赖性结合和在脑内皮细胞中的快速内化，分析三足mAb (图2-4)。
将人脑内皮细胞(hCMECD3，50,00个细胞)用10 ug/mL纯化的三足mAb孵育，并在4℃下在10x摩尔浓度的huTfR1 ECD (SEQ ID NO: 1)的存在或不存在下使之孵育过夜。第二天早上将细胞固定和洗涤，用第二抗体(Jackson Immunosciences Cat# 109-546-170)孵育，再次洗涤，然后通过FACS分析。将阳性结合剂定义为具有同种型对照的大于2倍的结合信号以及结合信号/具有TfR ECD的结合信号比率≳ 2 (表2b)。
表2b：三足mAb的hCMECD3细胞结合和特异性。
进行另外的hCMECD3细胞结合测定以测量对于另外的三足mAb的特异性，其结果显示在下表2c中：
表2c
转铁蛋白竞争
将表达重组人转铁蛋白受体的MDCK细胞以10,000个细胞/孔铺板到MA6000 384HB板中，并在补充有10% FBS和500 μg/mL遗传霉素的DMEM培养基中培养18小时。在测定前，细胞在补充有5μM莫能菌素的无血清DMEM培养基中在37℃ CO2孵化器中孵育1h，然后用补充有5μM莫能菌素的StartingBlock (PBS)在室温下孵育30分钟。在板的间隔行中的细胞在室温下用2.7mg/mL在补充有5μM莫能菌素的无血清DMEM培养基中制备的人全铁转铁蛋白孵育30分钟。试验抗体在补充有5μM莫能菌素的无血清DMEM培养基中稀释至5μg/mL，并加入含有全铁转铁蛋白的重复孔或未接收转铁蛋白的重复孔中，然后在室温下孵育1h。除去上清液，并将2 μg/mL Sulfo-TAG标记的抗-人抗体加入各孔和在室温下孵育30分钟。所有孔用PBS洗涤和加入无表面活性剂MSD读数缓冲液T。在MSD SECTOR® S600成像仪上将板读出。
在Excel中进行统计学分析，包括平均值、标准偏差和RSD。RSD>25%的任何样品被排除。在转铁蛋白的存在下孵育的试验抗体的平均值与在不存在转铁蛋白的情况下的平均值比较。在转铁蛋白的存在下的值≤在不存在转铁蛋白的情况下的值的70%的抗体被考虑为配体竞争(表3)。
表3：选择的三足mAb不与转铁蛋白竞争。
样品ID SEQ ID NO:
BBBB434 10、11、12 1758 1762 100.3
BBBB501 35、36、37 1348 1618 120.0
BBBB509 63、64、65 282 447 158.6
BBBB520 91、92、93 1369 1798 131.3
BBBB534 116、117、118 1350 1141 84.5
BBBB537 141、142、143 1504 1851 123.1
BBBB543 169、170、171 225 233 103.8
BBBB556 197、198、199 1246 1531 122.9
BBBB557 225、226、227 598 530 88.7
内化
将人脑内皮细胞(hCMEC/D3)以10,000个细胞/孔铺板到胶原蛋白包被的384孔Cell Carrier Ultra板(Perkin Elmer)中，并允许在37℃下在湿培养箱中贴壁16小时。然后将细胞(50,00个细胞)用200 ug/mL纯化的三足mAb孵育，并允许在37℃下孵育1小时。将细胞固定，洗涤和用荧光标记的第二抗体孵育1小时。然后再次洗涤细胞和用荧光标记的肌动蛋白染色剂鬼笔环肽和核染色剂Hoeschst 33342孵育。再次洗涤细胞和使用ImageXpress Micro (Molecular Devices)以40x物镜成像。使用MetaXpress 6.0，基于与鬼笔环肽共定位来鉴定内化mAb。来自表2和3的所有mAb对于内化是阳性的。
亲和力分析和pH依赖性结合、物种交叉反应性
亲和力和pH依赖性初始使用Forte Bio Octet平台测量。将生物素化的huTfR固定在链霉亲和素传感器上并在0.1M磷酸盐pH 7.4中mAb缔合180秒。在0.1M磷酸盐pH 7.4或0.1M磷酸盐pH 5中进行解离300秒(表4)。优选地，感兴趣的三足mAb具有在pH7.4下的高结合亲和力和在pH5下的低结合亲和力，例如在pH 5下KD ≥ 1nM和kd ≥ 10-4 sec-1，优选地约10-3，使得三足mAb在中性pH (例如，pH7.4)下结合TfR和在酸性pH (例如，pH5)下从TfR解离。优选地，在酸性pH和中性pH下的KD是相似的，例如酸性KD/中性KD的比率为约1.5。
表4：使用Octet平台对huTfR测量的动力学速率常数。
为了对于亲和力测量获得另外的准确性，在BioRad Proteon仪器ProteOn XPR36系统上使用表面等离子共振(SPR)测定三足mAb对于huTfR的亲和力。通过使用胺偶联化学(BioRad)将抗-IgG Fc mAb (Jackson ImmunoResearch)偶联至GLC芯片(BioRad)，产生Fc捕获表面。对于目标密度120 RU，使用浓度0.3 ug/mL以60 uL/min流过30秒，捕获三足mAb。然后以3.125 – 800 nM (4倍连续稀释)的浓度将huTfR流过固定的三足mAb，持续3分钟(50µL/min)缔合，接着以50 uL/min解离10分钟。以100 µL/min用2个18秒100 mM H3PO4(Sigma)的脉冲使芯片表面再生。收集的数据使用ProteOn Manager软件V3.1.0.6(BioRad)处理。首先，对于背景使用inter-spots校正数据。然后，对于分析物注入，通过使用缓冲液注入进行数据的双重参考减法。使用Langmuir 1:1结合模型进行数据的动力学分析。对于各mAb的结果以Ka (结合速率)、Kd (解离速率)和KD (平衡解离常数)的格式报告(表5)。
表5：当融合至B21M mAb或BACE mAb时抗-TfR脑穿梭载体对于TfR的结合亲和力。
使用上述SPR (proteon)方法评价pH依赖性结合，不同之处在于在解离期间缓冲液pH从7.4至6.5至6.0步减。如果解离速率随着pH降低而增加，针对pH依赖性结合，评价并评分各传感图(图3中的实例)。
使用与测定结合亲和力相同的方法评价物种交叉反应性，不同之处在于使用的TfR是食蟹猴(SEQ ID NO: 2)、狨猴(SEQ ID NO: 3)、大鼠(SEQ ID NO: 4)和小鼠(SEQ IDNO: 5)。没有鉴定出大鼠或小鼠交叉反应性mAb。鉴定了食蟹猴和狨猴交叉反应性三足mAb(表6)。
表6：对于选择的三足mAb的物种交叉反应性
本发明的抗-TfR抗体或抗原结合片段可用于递送任何类型的免疫球蛋白。用通过三足结构递送的IgG1和IgG4治疗性mAb已观察到类似的结果(数据未显示)。
小鼠药代动力学和药效学和抗-BACE mAb脑穿梭载体
为了分析结合性质对转胞吞作用的影响，在小鼠中进行体内PK/PD研究。通过IV推注(13 mg/kg，10mL/kg)，给予C57BL/6-Tfrctm2618(TFRC)Arte小鼠(Taconic Artemis)试验物。在预定的时间点，通过吸入异氟烷麻醉小鼠。通过心脏穿刺采集血液，并处理血浆。在用5 mL的0.9%盐水溶液全身输注后收集小鼠脑。将收集的脑样品(没有小脑)分成右/左半球，在液氮中速冻，和在-70℃下贮存，直至组织匀浆和毛细管耗尽处理。
TfR结合分子都没有与鼠TfR交叉反应，因此人TfR KI小鼠用于评价转胞吞作用。三足mAb用抗-β分泌酶1 (BACE1)拮抗剂mAb格式化以允许在转胞吞至脑中后mAb的药效学评价。BACE1切割β-淀粉样蛋白以释放Aβ1-40。BACE1的抑制通过量化产物Aβ1-40在脑中的浓度测量。静脉内给予小鼠两种三足mAb，BBBB383和BBBB426，以及对照mAb，BBBB456。BBBB456是单独的抗-BACE1拮抗剂mAb。BBBB383和BBBB426的不同之处仅在于它们对TfR的亲和力，分别为KD = 18 nM和130 nM。输注和毛细管耗尽以减少来自血液中或保留在血管内皮内的mAb的干扰后，测定脑暴露(Johnsen, Burkhart等2017)。与BBBB456相比在所有时间点，BBBB383和BBBB426二者的脑浓度提高，其中BBBB383具有大于BBBB426的mAb脑浓度。观察到强PK/PD关系，其中mAb脑浓度与Aβ1-40水平减少相关。两种含有TfR的mAb的较低血浆暴露通过结合外周中的TfR而归因于TMDD。
然后，选择的抗-TfR脑穿梭载体融合至原型抗-BACE (β-分泌酶) mAb，并使用上述的相同方法再次评价结合亲和力。如表5所示，当融合至B21M mAb (抗-人呼吸道合胞病毒)和抗-BACE拮抗剂mAb时，抗-TfR脑穿梭载体的亲和力是类似的。对于选择的分子评价内化，并且发现与当抗-TfR脑穿梭载体融合至B21M mAb时观察到的内化没有变化。
由于没有抗-TfR脑穿梭载体结合至小鼠或大鼠TfR，在huTfR敲入小鼠(C57BL/6-Tfrctm2618(TFRC)Arte小鼠(Taconic Artemis))中使用原型抗-BACE拮抗剂mAb(BBBB456，SEQ ID NO: 307、308和309)进行体内啮齿动物研究。选择抗-BACE拮抗剂mAb作为模型PD系统用于测量BACE1的抑制(通过其产物肽Aβ1-40的浓度)，其反映了运输至脑的mAb的量。
首次体内研究评价了在huTfR小鼠的脑中的PK/PD关系。 i.v.给予敲入(KI)小鼠13mg/kg的BBBB383 (SEQ ID NO: 256、257和258)、BBBB426 (SEQ ID NO: 275、276和277)和BBBB456 (SEQ ID NO: 307、308和309)。在4、24和72小时收获脑和血浆。在预定的时间点，通过吸入异氟烷麻醉小鼠。在全身输注5 mL的0.9%盐水溶液后，收集来自KI小鼠的小鼠脑。将收集的脑样品(缺少小脑)分成右/左半球，在液氮中速冻，和在-70℃下贮存直到组织匀浆和毛细管耗尽处理。
对于毛细管耗尽的脑组织裂解物的样品制备，对于脑半球获得个体重量以测量药物浓度。脑组织样品加入至计算体积的含有蛋白酶抑制剂(Pierce; A32955)的改良dPBS缓冲液(2.5-3 μL缓冲液/1 mg组织)并转移至Lysing Matrix D (MP Biomedicals™; 6913-100)管。使用Bead Ruptor 24 Elite (Omni International)将组织样品以2.9 m/s匀化15秒。将全部细胞悬浮液转移至新管并与等体积的26%葡聚糖缓冲液混合(13%最终葡聚糖浓度)。在4℃下将混合的组织匀浆以2,000 g离心10分钟。仔细地，上层(毛细管耗尽部分)从剩余样品分离并转移至含有10x RIPA裂解缓冲液(Millipore™; 20-188)的新管。毛细管耗尽的样品加裂解缓冲液被充分涡旋，在4℃下以14,000 rpm离心30分钟，并将上清液转移至新管。脑组织样品裂解物在-70℃下冷冻贮存或使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce™;23227)测量蛋白质浓度。在免疫测定法测定BBB有效的mAb之前，将最终的脑组织样品裂解物标准化至7 mg/mL总蛋白质浓度。
对于PK评价，在小鼠脑组织中的BBB有效mAb的浓度使用以典型的夹心免疫测定格式开发的MesoScale Discovery (MSD®; Gaithersburg, MD) ECLIA技术测定。在MSDGold™ Small Spot Streptavidin 96孔板(Cat: L45SA)上进行测定。简言之，在室温下将链霉亲和素包被的板用1%牛血清白蛋白(BSA)/1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭30分钟。在50%幼稚C57BL/6小鼠脑组织裂解物中通过连续稀释新制作标准曲线。随每个测定稀释和测试以2x工作测定浓度在幼稚C57BL/6小鼠脑组织裂解物中制备的冷冻质量控制(QC)。含有捕获(生物素化的抗-人Fc mAb，1 μg/mL)和检测(钌标记的抗-人Fc mAb，0.5 μg/mL)试剂的主混合物与稀释的标准品、QC和样品以1:1体积比在测定板中组合。将混合物在室温下孵育1小时，同时摇动。洗涤测定板，和将MSD T读数缓冲液(1x)加入所有孔。原始数据值在MSDSECTOR® S600成像仪上读出。对于测定的标准曲线范围以1 – 512 ng/mL测试，其中最小所需样品稀释度(MRD)是1:2，得到脑组织裂解物的灵敏度限值2 ng/mL。将具有原始ECL计数的MSD输出文件输入Watson LIMS (Thermo Scientific)，然后以5-参数逻辑斯蒂拟合以及1/F2加权回归。
对于PK评价，在小鼠血浆中的BBB有效mAb的浓度使用上述的类似方案测定。在10%合并小鼠血浆中通过连续稀释新制作标准曲线。随每个测定稀释和测试以10x工作测定浓度在合并小鼠血浆中制备的冷冻QC。含有捕获(生物素化的抗-人Fc mAb，1 μg/mL)和检测(钌标记的抗-人Fc mAb，0.5 μg/mL)试剂的主混合物与稀释的标准品、QC和样品以1:1体积比在测定板中组合。将混合物在室温下孵育1小时，同时摇动。洗涤测定板，和将MSD T读数缓冲液(1x)加入所有孔。原始数据值在MSD SECTOR® S600成像仪上读出。对于测定的标准曲线范围以2 – 512 ng/mL测试，其中MRD是1:10，得到血浆基质中的灵敏度限值20 ng/mL。将具有原始ECL计数的MSD输出文件输入Watson LIMS (Thermo Scientific)，并以5-参数逻辑斯蒂拟合以及1/F2加权回归。
通过在2 ml裂解基质D管中均化小鼠脑进行BACE活性测量(每mg的脑重量，8 μl0.4% DEA/50mM NaCl，Fast Prep-24，6/摇动/秒，持续20秒)。然后在设定至最大速度的Eppendorf Centrifuge中在4℃下将管离心5分钟。然后将匀浆(上清液)转移至预冷的管，其然后以13,000 rpm在4℃下离心70分钟。上清液然后转移至含有10%的0.5 M Tris/HCL的管，并在-80℃冷冻直至测定。Aβ 1-40肽标准品和解冻处理的脑匀浆与钌(Meso ScaleDiscovery (MSD)，R91AN-1)标记的抗-Aβ抗体以1:1预复合。将50 ul的复合物加入含有Aβ1-40的捕获抗体的封闭板。在2-8℃不摇动下过夜孵育后，洗涤板和加入2x读数缓冲液(MSD，R92TC-1)。使用Meso Sector S 600 (MSD，IC0AA)将板读数。
观察到含有脑穿梭载体的mAb BBBB383和BBBB426具有比单独的抗-BACE mAbBBBB456更快的血浆清除率(图5A)。然而，在脑中相反，在所有时间点观察到BBBB383和BBBB426具有比对照BBBB456增加的脑浓度。当测量BACE抑制的PD效果时，观察到两种脑穿梭载体mAb都比单独的对照抗-BACE mAb在更大程度上抑制BACE的活性(图5B)。
在13 mg/kg  i.v.给药后4和24小时，类似评价另外的含有脑穿梭载体的mAb (图7A-B)。类似于首次研究，观察到所有脑穿梭载体mAb具有比对照抗-BACE mAb更快的血浆清除率。对于脑穿梭载体mAb观察到一定范围的脑浓度，其中对于除了BBBB974之外的全部，脑浓度提高。假设BBBB974由于其结合动力学，不有效运输至脑。特别地，BBBB974具有缓慢的中性结合速率，其可能在体内阻止与TfR的有效缔合。对于除了BBBB983之外的所有三足mAb还观察到Aβ1-40水平的三足mAb浓度依赖性降低，BBBB983与对照BBBB456相比具有脑浓度增加，但不影响Aβ1-40浓度(图8)。该观察结果可能归因于结合动力学，因为BBBB983具有非常缓慢的中性解离速率，其可能在脑中阻止有效扩散，这对于BACE抑制是必需的。这些数据强调了对于治疗性mAb的递送和功能二者，TfR结合动力学的重要性。
亲和力和转胞吞作用效率之间的关系之前已经描述为转胞吞作用随对于TfR的亲和力降低而提高(Yu, Zhang等2011)，该结论与上述数据不一致。为了更详细探查转胞吞作用亲和力关系，在上述小鼠模型中评价了9种三足mAb的脑PK/PD。这些三足mAb在对于TfR的亲和力方面相差大约100倍(KD范围为0.2nM-81nM)。在IV给药后24小时测量脑浓度(Cmax脑)(图17)。如预期的，观察到一定范围的转胞吞作用效率，与对照mAb相比从无增强到10倍提高。该数据表明与之前所述相比，亲和力和转胞吞作用效率之间更有细微差别的关系，其中来自结合和解离速率二者的影响对脑浓度产生影响。例如，与对照mAb相比，对于BBBB946没有观察到脑暴露的增强，尽管其在pH 6下具有KD = 65nM和快速解离速率。该mAb是独特的，但是具有比研究中的其它mAb更慢的结合速率(ka ≈ 103 M−1 s−1，与ka ≈ 105 M−1 s−1相比)。实际上，当与具有类似KD (KD = 81nM)但100x更快结合速率的另一三足抗体BBBB969比较时，对比是明显的。BBBB969增强了脑浓度至5.5倍，证实了足够快速结合速率对于有效脑递送的重要性。对于研究的其它8种mAb的转胞吞作用的效率可通过其解离速率最佳描述，其中最佳脑递送在既不太快也不太慢的解离速率(2x10-3 s-1的最佳中性kd)下发生。对于除了BBBB983之外的所有三足mAb观察到强PK/PD关系，BBBB983具有5.5x脑浓度增强，但不影响Aβ1-40水平。该mAb具有缓慢的中性解离速率(<8x10-5 s-1)，我们假设这影响其在脑中扩散至靶标的能力。总之，数据证实了优化中性结合和解离速率二者对于最佳脑PK和PD的重要性。在研究中我们没有观察到结合表位对TfR的影响(数据未显示)。
选择mAb用于食蟹猴研究和评价与抗-Tau mAb融合的脑穿梭载体
确认在人中靶向TfR的三足mAb增强治疗性抗体脑暴露的能力的关键是在非人灵长类动物中证实增强的脑递送。在小鼠研究中最佳表现的三足mAb (BBBB979和BBBB978)不结合食蟹猴TfR，因此从进一步研究中排除。次最佳的BBBB970和BBBB969在抗-TfR脑穿梭载体(SEQ ID NO: 162和SEQ ID NO: 218)的轻链中都含有游离半胱氨酸残基。由于游离半胱氨酸残基可能有助于在制造过程中非理想的生物物理性质，因此游离半胱氨酸被突变为丝氨酸残基(SEQ ID NO: 278和SEQ ID NO: 291)。
将新的scFv融合至抗-Tau mAb PT1B844 (SEQ ID NO: 310和311)以产生BBBB1136 (SEQ ID NO: 285、286和287)/BBBB1134 (SEQ ID NO: 288、289和290)，和BBBB1133 (SEQ ID NO: 298、299和300)/BBBB1131 (SEQ ID NO: 301、302和303) (IgG1AAS YTE/IgG1)。测量对于huTfR的亲和力(表7)。
表7：具有Cys-Ser突变的与抗-Tau mAb融合的抗-TfR脑穿梭载体对于huTfR的结合亲和力
BBBB1134/BBBB1136保持与BBBB557/BBBB970非常类似的对huTfR的结合，表明Cys-Ser突变或与抗-Tau mAb融合都不干扰对huTfR的结合亲和力。然而，BBBB1131/BBBB1133的结合亲和力是BBBB543/BBBB969的大约1/2。为了确定亲和力的改变是否归因于cys-ser突变或与抗-Tau mAb的融合，产生没有突变但融合至抗-Tau的脑穿梭载体并评价结合(BBBB1048 (SEQ ID NO: 178、179和180)/BBBB1046 (SEQ ID NO: 181、182和183))。未突变的BBBB1048/BBBB1046的亲和力非常类似于BBBB543/BBB969，表明亲和力的损失归因于cys-ser突变而非归因于与Tau mAb的融合(表8)。
表8：与抗-Tau mAb融合的抗-TfR脑穿梭载体对于huTfR的结合亲和力
与之前的研究类似，还评价了内化，并且脑穿梭载体与抗-Tau mAb的融合不影响其在人脑内皮细胞中内化的能力(图9中的实例，测试的mAb在表9中)。
表9：评价抗-TfR脑穿梭载体在人脑内皮细胞中的内化。
mAb 内化
BBBB1046 是
BBBB1047 是
BBBB1048 是
BBBB1052 是
BBBB1053 是
BBBB1054 是
BBBB1055 是
BBBB1131 是
BBBB1132 是
BBBB1133 是
BBBB1134 是
BBBB1135 是
BBBB1136 是
抗-Tau脑穿梭载体mAb的食蟹猴药代动力学
通过IV注射(缓慢推注)用指定的剂量向食蟹猴给予测试物。在预定的时间点，用盐水上身灌注最少5分钟后，收集食蟹猴脑并用冷盐水溶液漂洗。分离预定的脑位置，在液氮中速冻和在-80℃下贮存，直至组织匀浆和毛细管耗尽处理。
在食蟹猴中以10 mg/kg经 i.v.给予BBBB1133、BBBB1136和BBBB1134以及非脑穿梭载体有效的mAb PT1B844 (图18)和PT1B916。在4、24和72小时采样血浆。用盐水上身灌注至少5分钟后，收集食蟹猴脑并用冷盐水溶液漂洗。分离预定的脑位置，在液氮中速冻和在-80℃下贮存，直至组织匀浆和毛细管耗尽处理。
对于毛细管耗尽的脑组织裂解物的样品制备，获得收集的脑位置的各组织重量。将脑组织样品加入计算体积的含有蛋白酶抑制剂(Pierce; A32955)的改良dPBS缓冲液(2.5 μL缓冲液/1 mg组织)和转移至Lysing Matrix D (MP Biomedicals™; 6913-100)管。使用Bead Ruptor 24 Elite (Omni International)，将组织样品以2.9 m/s匀浆15秒。将全部细胞悬浮液转移至新管中，并与等体积的26%葡聚糖缓冲液混合(13%终葡聚糖浓度)。将混合的组织匀浆物在4℃下以2,000g离心10分钟。仔细地，上层(毛细管耗尽部分)与剩余样品分离，并转移至含有10x RIPA裂解缓冲液(Millipore™; 20-188)的新管。毛细管耗尽样品加裂解缓冲液经充分涡旋，在4℃下以14,000 rpm离心30分钟，并将上清液转移至新管。脑组织样品裂解物在-70℃下冷冻贮存或使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce™;23227)测量蛋白质浓度。在免疫测定法测定BBB有效的mAb之前，将最终的脑组织样品裂解物标准化至7 mg/mL总蛋白质浓度。
对于PK评价，BBB有效的mAb在食蟹猴脑组织中的浓度使用以典型的夹心免疫测定格式开发的MSD® ECLIA技术测定。在MSD Gold™ Small Spot Streptavidin 96孔板上进行测定。在室温下将链霉亲和素包被的板用1%牛血清白蛋白(BSA)/1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭30分钟。在50%幼稚食蟹猴脑组织裂解物中通过连续稀释新制作标准曲线。随每个测定稀释和测试以2x工作测定浓度在幼稚食蟹猴脑组织裂解物中制备的冷冻QC。含有捕获(生物素化的抗-人Fc mAb，1 μg/mL)和检测(钌标记的抗-人Fc mAb，0.5 μg/mL)试剂的主混合物与稀释的标准品、QC和样品以1:1体积比在测定板中组合。将混合物在室温下孵育1小时，同时摇动。洗涤测定板，和将MSD T读数缓冲液(1x)加入所有孔。原始数据值在MSDSECTOR® S600成像仪上读出。对于测定的标准曲线范围以1 – 512 ng/mL测试，其中最小所需样品稀释度(MRD)是1:2，得到脑组织裂解物的灵敏度限值2 ng/mL。将具有原始ECL计数的MSD输出文件输入Watson LIMS (Thermo Scientific)，然后以5-参数逻辑斯蒂拟合以及1/F2加权回归。
对于PK评价，BBB有效的mAb在食蟹猴血浆中的浓度使用以典型的夹心免疫测定格式开发的MSD® ECLIA技术测定。在MSD Gold™ Streptavidin 96孔板上进行测定。在室温下将链霉亲和素包被的板用1%牛血清白蛋白(BSA)+ 0.5% Tween-20/1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭30分钟。在10%合并食蟹猴血浆中通过连续稀释新制作标准曲线。随每个测定稀释和测试以10x工作测定浓度在合并食蟹猴血浆中制备的冷冻QC。含有捕获(生物素化的抗-人Fc mAb，1 μg/mL)和检测(钌标记的抗-人Fc mAb，1 μg/mL)试剂的主混合物与稀释的标准品、QC和样品以1:1体积比在测定板中组合。将混合物在室温下孵育1小时，同时摇动。洗涤测定板，和将MSD T读数缓冲液(1x)加入所有孔。原始数据值在MSD SECTOR® S600成像仪上读出。对于测定的标准曲线范围以2 – 512 ng/mL测试，其中最小所需样品稀释度(MRD)是1:10，得到血浆基质中的灵敏度限值20 ng/mL。将具有原始ECL计数的MSD输出文件输入Watson LIMS (Thermo Scientific)，然后以5-参数逻辑斯蒂拟合以及1/y2加权回归。
对于mAb，跨各种区域测定脑浓度(图10)。脑浓度数据在动物中取平均值，并且每个符号表示脑的区域。与对照mAb相比，对于BBBB1134、BBBB1136和BBBB1133分别观察到7×、11×和11×脑浓度。与不含有脑穿梭载体的mAb相比，在脑的每个区域所有含有脑穿梭载体的mAb具有增加的脑暴露(图11)。
还测定了在血浆中的mAb浓度(图12)。在外周中观察到对于TMDD的证据，其中与对照mAb相比，三足mAb具有加速的清除率(图18)。在本研究中评价与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的影响，其中BBBB1134和BBBB1136相同，除了在Fc结构域中BBBB1136具有“YTE”突变(Dall’Acqua, K等2006)。“YTE”突变增强在酸性pH下与FcRn的结合，并且已经证实增加mAb在包括人在内的多个物种中的半衰期(Robbie, C等2013)。如所预期的，与BBBB1134相比，加入“YTE”突变导致对于BBBB1136增加的血浆浓度。尽管FcRn是在人中维持IgG稳态和延长IgG血清半衰期方面的关键受体(Roopenian和Akilesh 2007)，其还涉及作为从脑的反向转胞吞作用或流出受体(Cooper, C等2013)。我们对理解这两种对于FcRn的功能之间的相互作用感兴趣，因为通过增加对于FcRn的结合亲和力来改进半衰期可能以脑暴露为代价，具有增加的脑流出。有趣的是，血浆浓度的2倍增加被脑浓度的2倍增加所反映，提示任何可能的增加流出在该系统中是可以忽略的。
BBBB1133具有非常像没有脑穿梭载体的mAb PT1B844和PT1B916的外周半衰期。
食蟹猴中的网织红细胞耗竭
TfR靶向增强脑暴露的已知负累是由于网织红细胞以Fc依赖性方式的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)导致的网织红细胞耗竭( Science Translational Medicine 2013: Vol. 5, 183)。在食蟹猴PK研究中对于网织红细胞耗竭，用WT IgG1 (BBBB1134)和减少FcγR结合的突变“AAS” (BBBB1136和BBBB1133)测试mAb。如所预期的，对于WT IgG1三足mAb BBBB1134观察到快速网织红细胞耗竭，但对于BBBB1136、BBBB1133或非脑穿梭载体mAb PT1B844和PT1B916没有观察到(图13)，证实了Fc功能对TfR结合mAb和网织红细胞耗竭的影响。
第三种三足mAb BBBB1133被选择用于剂量反应和重复给药食蟹猴PK。静脉内给予食蟹猴2、10和30 mg/kg，并且48小时、7和14天后测定脑PK。在两周内评价血浆PK (图18A和B)。在2和10 mg/kg之间观察到线性脑PK，和在10和30 mg/kg之间观察到非线性脑PK。提议的递送机制是受体介导的，其是可饱和的，和数据表明30mg/kg在食蟹猴中是饱和剂量。在血浆和CSF中观察到线性PK，半衰期是大约6天。还使用每周给予的相同剂量范围，持续三周，进行重复给药(图18C和D)。观察到重复给予30mg/kg的累积证据，并且与30mg/kg是饱和剂量的之前观察结果一致。在外周中再次观察到线性PK，没有重复给药时PK耐受性的证据。
网织红细胞数据表明，效应子沉默Fc mAb是该脑递送平台的安全给药所必需的。尽管避免网织红细胞耗竭是对于治疗性mAb的安全性的重要特征，但该要求将阻止对于需要效应子功能例如ADP用于治疗性作用机制的任何治疗性mAb使用抗-TfR介导的脑递送。例如，一种可能的治疗性作用机制依赖于Tau聚集体的Fc依赖性小胶质细胞吞噬作用。通过抑制脑穿梭载体mAb结合FcγR以阻止网织红细胞耗竭的能力，mAb不能结合小胶质细胞上的FcγR以促进Tau聚集体的吞噬作用。
为了研究ADP的替代途径，我们在人IPSC来源的小胶质细胞中评价了效应子沉默三足mAb BBBB1133和BBBB1136诱导Tau寡聚物的吞噬作用的能力。两种三足mAb诱导比对照抗-Tau mAb PT1B844 (一种IgG1 mAb)更大的Tau寡聚物吞噬作用(图19A)。已经证实Tau寡聚物通过BBBB1133的ADP通过TfR介导的内化发生，并且可被加入过量的可溶性TfR细胞外结构域阻断。加入过量的可溶性Fc不影响ADP，证实了非经典的ADP利用TfR而非FcγR (图19B)。通过早期内体(EEA1)至中间内体(Rab17)和最终溶酶体(LAMP1)，对于BBBB1133观察到与对照mAb (PT1B844)类似的Tau细胞内运输(图19C)。
为了进一步证实非经典的ADP作为小胶质细胞的Tau降解的生理相关机制，我们评价了三足mAb诱导人尸检阿尔茨海默氏病脑源性tau原纤维(PHF-Tau)的吞噬作用的能力。在人单核细胞来源的巨噬细胞和人IPSC来源的小胶质细胞中测量PHF-Tau的ADP (图20)。PT1B844和BBBB1133均在早期时间点诱导PHF-Tau的吞噬作用。然而，在晚期时间点，BBBB1133继续诱导PHF-Tau的ADP，而PT1B844介导的ADP停止。这可能证明了巨噬细胞和小胶质细胞耗尽，如对于经典ADCP描述的(Church, VanDerMeid等2016)，以及BBBB1133利用的非经典ADP机制的潜在益处。类似于使用Tau寡聚物的之前所述实验，Tau的摄取通过加入过量的可溶性TfR被阻断，证实了这是一种TfR依赖性机制。为了探查非经典ADP超过经典ADP的另一潜在益处，在PHF Tau吞噬作用实验中测量促炎细胞因子。如预期的，由PT1B844介导的经典ADP导致促炎细胞因子的分泌，而由BBBB1133介导的非经典ADP并非如此。
为了评价AAS IgG1三足mAb促进Tau聚集体在小胶质细胞中的摄取的潜力，将源自诱导多能干细胞(iPSC)的人小胶质细胞以7000个细胞/孔的稀释度铺板到384孔PerkinElmer Cell Carrier Ultra板上，并在具有Glutamax+、青霉素/链霉素、IL34 (100ng/ml)和GMCSF (10ng/ml)的高级DMEM/F12培养基中维持。在测定当天，使生物素化的磷酸-tau寡聚物[序列：SCBiot-(dPEG4)GTPGSRSR(pT)PSLP(pT) PPTREPLL (SEQ ID NO: 315)-酰胺]以15倍摩尔过量与链霉亲和素Alexa Fluor 488 (AF488)复合。然后在室温下使标记的磷酸-tau寡聚物以大约2X摩尔过量结合试验mAb，持续30分钟。mAb:tau寡聚物复合物然后以20 µl/孔被递送至小胶质细胞。在孵育后2、4和8小时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次并在4%多聚甲醛的存在下在室温下固定15分钟。固定后，细胞再次在PBS中洗涤两次并与浓度4 µg/ml的LAMP1第一抗体(溶酶体的标志物)在4℃下在透化缓冲液(0.1%皂苷+1%鱼皮明胶)中孵育过夜。孵育后，细胞用PBS洗涤两次和在透化缓冲液中用1 µg/ml缀合至AlexaFluor 647的第二抗体在4℃下染色1小时。孵育后，细胞用PBS洗涤两次，在室温下在PBS中用1 µg/ml的Hoechst DNA染色剂复染10分钟。然后细胞在PBS中洗涤最后一次，重悬浮于20µl PBS/孔，和在Opera Phenix共聚焦高容量显微镜上成像。使用Harmony和ImageJ分析软件分析获得的图像。针对在吞噬溶酶体结构内并用LAMP1抗体标记的Tau寡聚物的存在，评分大约500个细胞/条件。
所有脑穿梭载体mAb比非脑穿梭载体mAb PT1B844促进更有效摄取至吞噬体中(图15)。在脑穿梭载体mAb内，具有完全效应子功能的那些(BBBB1131、1134和1046)比没有效应子功能的那些更有效。这些数据证实消除与FcγR的结合以降低网织红细胞耗竭的风险不应该影响抗-Tau mAb的治疗功效。实际上，TfR介导的内化和运输至吞噬溶酶体在小胶质细胞中似乎比传统的FcγR介导的吞噬作用更有效。
为了研究该观察结果是否可使用其它靶标和细胞重复，在人巨噬细胞中评价RSVF-蛋白的摄取。以大约6000个细胞/孔的稀释度将原代人巨噬细胞铺板到384孔PerkinElmer Cell Carrier Ultra板上，并在补充有10% FBS、50 mg/ml巨噬细胞集落刺激因子(mCSF) CSF和25 ng/ml干扰素γ (IFNγ)的X-VIVO 10无血清造血细胞培养基中培养。在测定当天，在室温下使大约7倍摩尔过量的RSV-F蛋白(与抗-His生物素化抗体和链霉亲和素Alexa Fluor 488复合的His标记F蛋白)结合抗-RSV mAb (1 ug/ml) 30分钟。mAb:F蛋白复合物然后以20 ul/孔递送至巨噬细胞。Alexa Fluor 488标记的大肠杆菌用作吞噬作用的阳性对照。孵育后3小时，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并在室温下在4%多聚甲醛的存在下固定15分钟。固定后，再次在PBS中洗涤细胞两次并在透化缓冲液(0.1%皂苷+1%鱼皮明胶)中在4℃下用LAMP1第一抗体(溶酶体的标志物)以4 ug/ml的浓度孵育过夜。孵育后，细胞用PBS洗涤两次和在4℃下在透化缓冲液中用1 ug/ml与Alexa Fluor 647缀合的第二抗体染色1小时。孵育后，细胞用PBS洗涤两次，在室温下在PBS中用1 ug/ml的HoechstDNA染料复染10分钟。细胞然后在PBS中洗涤最后一次，重悬浮于20 ul PBS/孔和在OperaPhenix共聚焦高容量显微镜中成像。使用Harmony和ImageJ分析软件分析得到的图像。针对在用LAMP1抗体标记的吞噬溶酶体结构内的F蛋白焦灶的存在，评分大约300个细胞/条件。
如对于Tau和小胶质细胞观察到的，所有脑穿梭载体mAb比非脑穿梭载体mAbB21M-IgG1促进更有效摄取至吞噬体中(图16)。然而，没有观察到IgG1 (BBBB932和BBBB934)和IgG1 AAS (BBBB354和BBBB368)脑穿梭载体mAb之间的摄取差异。B21M实验和Tau实验(图15和图16)之间的差异归因于靶标还是细胞仍待确定。然而，数据证实了其中TfR介导的内化和运输至吞噬溶酶体似乎至少与传统FcγR介导的吞噬作用一样有效的机制的稳健性。
据发明人所知，尚无任何出版物描述对于治疗性mAb利用该非经典ADP机制。尽管不希望受理论的约束，认为吞噬作用和内吞作用均可导致通过汇集吞噬溶酶体途径的降解，使得不管内化触发剂(FcγR介导的吞噬作用或TfR介导的内吞作用)如何，内化的货物被运输至吞噬溶酶体并被其降解。
在huTfR小鼠的视网膜中评价PK/PD关系
然后将选择的抗-TfR脑穿梭载体融合至原型抗-BACE (β-分泌酶) mAb和使用上述的相同方法再次评价结合亲和力。如表5所示，当融合至B21M mAb (抗-人呼吸道合胞病毒)和抗-BACE拮抗剂mAb时，抗-TfR脑穿梭载体的亲和力是类似的。对于选择的分子，评价内化(图4)，并且发现与当抗-TfR脑穿梭载体融合至B21M mAb时观察到的内化没有变化。
由于抗-TfR脑穿梭载体均未结合小鼠或大鼠TfR，在huTfR敲入小鼠(C57BL/6-Tfrctm2618(TFRC)Arte小鼠(Taconic Artemis))中使用原型抗-BACE拮抗剂mAb(BBBB970、BBBB978、BBBB983)进行体内啮齿动物研究。抗-BACE拮抗剂mAb选择作为模型PD系统用于测量BACE1的抑制(通过其产物肽Aβ1-40的浓度)，其反映了运输至脑的mAb的量。
首次体内研究在huTfR小鼠的视网膜中评价PK/PD关系。 i.v.给予敲入(KI)小鼠10mg/kg的BBBB970、BBBB978、BBBB983和对照BBBB456。在给药后4和24小时收获眼睛和血浆。在预定的时间点，通过吸入异氟烷将小鼠麻醉。在全身输注5 mL的0.9%盐水溶液后，收集来自KI小鼠的小鼠眼睛。收集的眼睛样品(减去视神经)在液氮中速冻，并在-70℃下贮存直到组织匀浆或准备用于免疫组织化学。
通过在裂解基质D管中均化小鼠眼睛进行BACE活性测量(每mg的脑重量，8 μl0.4% DEA/50mM NaCl，Fast Prep-24，6/摇动/秒，持续20秒)。然后在设定至最大速度的Eppendorf Centrifuge中在4℃下将管离心5分钟。然后将匀浆(上清液)转移至预冷的管，其然后以13,000 rpm在4℃下离心70分钟。上清液然后转移至含有10%的0.5 M Tris/HCL的管，并在-80℃冷冻直至测定。Aβ 1-40肽标准品和解冻处理的眼睛匀浆然后与钌(MesoScale Discovery (MSD)，R91AN-1)标记的抗-Aβ抗体以1:1预复合。将50 ul的复合物加入含有Aβ 1-40的捕获抗体的封闭板。在2-8℃不摇动下过夜孵育后，洗涤板和加入2x读数缓冲液(MSD，R92TC-1)。使用Meso Sector S 600 (MSD，IC0AA)将板读数。
细胞因子分泌分析
在对人iPSC来源的小胶质细胞进行不同处理后，在细胞上清液中分泌蛋白的相对浓度使用基于抗体的29-丛免疫测定(Luminex, R&D systems, Cat.# LXSAHM-29)测量。29种分泌蛋白是：BDNF、CCL3/MIP1α、CCL20/MIP3α、Groβ/MIP2、CXCL10/IP10/CRG2、GCSF、IFNα、IL1α、IL2、IL6、IL10、IL17/IL17α、MCSF、RAGE/AGER、TNFα、CCL2/JE/MCP1、CCL4/MIP1β、CXCL9/MIG、FGFb/FGF2、GMCSF、IFNγ、IL1β、IL4、IL8/CXCL8、IL12p70、IL23、MMP9、抵抗素。
PHF Tau
从5名组织学确认的AD患者(Braak阶段V-VI)获得的尸检皮质组织用于通过(Mercken等， Acta Neuropathologica (1992) 84:265–272; Greenberg等， J. biol.  Chem. (1992) 267: 564-569)的改良方法产生部分纯化的PHF库。通常，将5 g顶叶皮层或额叶皮层在10倍体积的冷缓冲液H (10 mM Tris、800 mM NaCl、1 mM EGTA和10%蔗糖/ pH7.4)中使用玻璃/Teflon Potter组织均质器(IKA Works, Inc; Staufen, Germany)以1000 rpm均化。将均化材料在4℃下以27000×g离心20 min。弃去沉淀，并将上清液调整至1% (w/v) N-月桂酰肌氨酸的终浓度和在37℃下孵育2 h。随后，在20℃下将上清液以184000×g离心90 min。在PBS中仔细洗涤沉淀和重悬浮于750uL PBS中，等分并在–80℃冷冻。通过使用AT8/AT8磷酸-聚集体选择性MSD ELISA评价PHF-tau制备物的质量。Tau含量通过蛋白质印迹使用hTau10 (Janssen R&D)测定，其中重组2N4R Tau作为校准物。
TfR TTP mAb体内增强ADP的能力的研究
TfR TTP mAb体内增强ADP的能力在Tau接种的小鼠模型中研究。小鼠模型使用表达具有P301L突变的最长人tau同种型(tau-4R/2N-P301L)的转基因Tau-P301L小鼠(Terwel等(2005) J Biol Chem; 280(5): 3963-73)。由于缺少TTP的小鼠TfR交叉反应性，开发与主要人TfR TTP具有类似结合性质的小鼠替代TTP并用于本研究。Tau接种模型包括PHF-Tau的立体定向海马注射，这引起tau聚集的剂量依赖性增加(Vandermeeren等, J AlzheimersDis. (2018); 65(1): 265-281)。共注射mAb后，Tau接种通过不同抗-tau mAb的中和已经证实了该模型部分依赖于Tau的Fc介导ADP (图21A)。尽管与同种型对照相比，两种抗-TaumAb中和了Tau接种，但在具有效应子功能的mAb (小鼠IgG2a)和没有效应子功能的mAb (小鼠IgG2aσ (Vafa等, Methods. 2014 Jan 1; 65(1): 114-26))之间观察到统计学显著差异，证实了该模型对于mAb效应子功能的部分依赖性。
进行类似研究，比较具有小鼠IgG2a Fc的抗-Tau mAb PT1B844与具有人IgG1 AASFc的PT1B844 TTP mAb。利用共注射mAb以标准化在所述mAb和TTP mAb之间PK性质的任何差异。与同种型对照相比，两种抗-Tau mAb中和了Tau接种。与具有完全Fc效应子功能的mAb相比，TTP mAb显示至少相同作用，提示非经典ADP机制在体内是有功能的(图21B)。
在P301L小鼠中PHF的立体定向注射
PHF tau接种研究，包括当前描述的研究，依从AAALAC指南，按照地方伦理委员会(628-Tau Spread, Janssen Pharmaceutica)和国家机构批准的方案进行。表达具有P301L突变的最长人tau同种型(tau-4R/2N-P301L)的小鼠(Terwel等, 2005; Peeraer等, 2015)在丰富环境的单独通风笼子中和12/12 h光照/黑暗周期(在6:00 AM光照打开)下被单独饲养。在90 +/-7日龄，将小鼠关于治疗组和性别随机化，并在右侧海马(CA1)中接受AD来源的PHF的单侧注射(存在抗-IgG2a (n= 19)；抗磷酸Tau小鼠IgG2a (n= 20)或抗磷酸Tau-TTE(n = 20)。
Tau.P301L小鼠用异氟烷(5%，在36%氧气中)深度麻醉并在立体定向框(Stoelting-Neurostar组合)中固定。在进一步的程序中，维持2%异氟烷水平。使用30G注射器(Hamilton)在右半球中以0.25μl/min的速度在选定的坐标处注射3μL：前后位-2.0、从前囟的中外侧+1.6、从硬脑膜的背腹侧1.4 mm。注射之前和注射之后每周监测体重，并且对于所有注射实验在治疗和对照组之间没有观察到差异(未显示)。
注射后两个月，通过断头处死小鼠，并将来自同侧半球的脑组织速冻。提取前，将组织称重和以600 µL缓冲液H/100 mg组织(10 mM Tris、800 mM NaCl、1 mM EGTA和10%蔗糖/ pH 7.4)均化。将匀浆以27 000 x g离心20 min和将上清液在-80℃冷冻。
生物化学分析MesoScale Discovery (MSD)
将包被抗体(AT8)在PBS中稀释(1 µg/mL)和等分到MSD板中(30 µL/孔) (L15XA,MSD, Rockville, MD, USA)，其在4℃孵育过夜。在用5 x 200 µL的PBS/0.5%Tween-20洗涤后，板用0.1%酪蛋白/PBS封闭和用5 x 200µl的PBS/0.5% Tween-20再次洗涤。在加入样品和标准品(均在0.1%酪蛋白/PBS中稀释)之后，将板在4℃孵育过夜。随后，用5 x 200 µL的PBS/0.5% Tween-20洗涤板，和加入在0.1%酪蛋白/PBS中的SULFO-TAG™缀合的检测抗体(AT8)并在室温下孵育2 h，同时以600 rpm摇动。在最后洗涤(5 x 200 µL的PBS/0.5%Tween-20)之后，加入150 µL的2 x缓冲液T (MSD)，和用MSD成像仪读出板。将原始信号针对由来自尸检AD脑的sarcosyl-不溶性制剂(PHF)的16个稀释度组成的标准曲线标准化，并表示为任意单位(AU) PHF。用GraphPad prism软件进行统计学分析(ANOVA以及Bonferroni校正，用于多重检验)。P值< 0.05被视为显著差异。
讨论
为了实现基于受体介导的转胞吞作用的优化脑递送平台，产生以一定亲和力范围以pH依赖性方式特异性结合人转铁蛋白受体(huTfR)的mAb。TfR结合亲和力和转胞吞作用效率之间的关系已在许多出版物中被广泛覆盖，关注点在于平衡解离常数KD上。尽管KD是重要度量，但本发明已经令人惊讶地证实结合动力学ka和kd对于转胞吞作用的关键性。发明人发现，对于递送的治疗性mAb的有效转胞吞作用和药效学活性，结合和解离速率二者需要被优化。基于该结果，当例如，ka ≥ 105 M−1 s−1和中性kd = 2×10-3 sec-1时最佳转胞吞作用发生。尽管不希望受到理论的约束，假设对于确保在极化细胞中通过负责蛋白质运输的多种细胞内囊泡的有效跨细胞运输，结合速率和解离速率之间的相互作用是关键的。
已证实，与对照mAb相比，在食蟹猴中给予三足mAb导致脑浓度的6-12x提高。增加酸性FcRn结合导致减少外周清除率和提高脑浓度。在正常生理条件下，FcRn介导的抗体从脑输出通过避免脑中不需要的炎症和免疫反应在维持脑稳态方面可能是关键的(Schlachetzki, Zhu等2002, Roopenian和Akilesh 2007)。尽管多数证据提示FcRn介导的抗体输出的强作用，但关于该清除机制，的确保持了一些争论(Garg和Balthasar 2009，Abuqayyas和Balthasar 2013)。发明人发现，增加对于FcRn的结合亲和力对于外周和脑浓度具有积极影响，提示任何增强的输出在该系统中是微不足道的。在食蟹猴中使用三足mAb的剂量应答实验证实了运输机制的饱和能力，其在该物种中以30mg/kg发生。还在食蟹猴中进行大量重复给药的剂量应答表征，并将极大地帮助预测人剂量和该平台对于特定的治疗性应用的效用。
网织红细胞耗竭是对于TfR结合抗体已知的安全性负累。发明人观察到，用效应子功能活性的mAb可观察到实际上急性和几乎完全的网织红细胞耗竭。已描述了大量方法来避免该耗竭，包括降低效应子功能{Couch, 2013 #589}和通过分子结构{Weber, 2018 #590}。尽管发明人利用与已经描述为在空间上能够减弱外周效应子功能的结构非常类似的结构，但他们用效应子功能活性的mAb观察到稳健的网织红细胞耗竭。
Fc诱变的明显缺点是从治疗性mAb消除效应子功能。对于脑中的许多治疗性靶标，例如β-淀粉样蛋白和Tau，认为ADP对于功效是重要的。之前的研究已经证实，再循环受体，包括TfR，可从分选小管排除并通过多价货物结合转移至溶酶体(Marsh, 1995,  J Cell  Biol (1995) 129 (6): 1509–1522; Weflen, 2013 Mol Biol Cell. 2013 Aug 1; 24(15): 2398–24050。发明人证实，多价货物的这种内源性转移可用作ADP的替代的非经典的非FcγR机制。通过非经典和经典的ADP内化的Tau在小胶质细胞中类似地运输，其中Tau聚集体通过内溶酶体系统运输至溶酶体以供降解。所述非经典的ADP可用于各种治疗性应用，其中ADP对于功效是必需的，但经典的ADP对于安全性是有害的。
数据表明，非经典的ADP比经典的ADP更有效，可能归因于在FcγR和TfR之间的结合和内化的固有差异。FcγR介导的内化要求受体被mAb簇集，而TfR快速内化和再循环，独立于mAb结合。第二种可能的解释是巨噬细胞和小胶质细胞耗竭(Zent, 2017 FEBS J.2017 Apr; 284(7):1021-1039)。巨噬细胞耗竭似乎依赖于巨噬细胞暴露于靶标的时间长度(Church, VanDerMeid等2016, Clin Exp Immunol. 2016 Jan;183(1):90-101)(Mukundan, 2009, Nat Med. 2009 Nov;15(11):1266-72)，这与我们的观察结果(经典ADP随时间而停止)一致。已在体外和患者中进行对于巨噬细胞耗竭的观察，表明这种耗竭表型可能影响具有效应子功能的mAb的治疗性功效。非经典的ADP提供功效益处，通过在不通过结合FcγR来激活小胶质细胞的情况下介导ADP而避免这种耗竭表型。
非经典的ADP的另一益处是通过避免小胶质细胞激活，ADP发生而不刺激促炎细胞因子产生。在治疗脑的疾病方面关于使用效应子功能活性的mAb的安全性仍存在争论，特别是围绕增加已经患有慢性神经炎症的患者中的神经炎症(综述于{Heneka, 2015 #591})。此外，越来越多地关注在涉及增加炎症的神经退行性疾病的病理发生中炎症起到的作用，以及仍在争论中的参与或进一步激活潜在已经耗竭的小胶质细胞的能力。例如，经典ADP对神经元的毒性影响已经被证实，并且假设效应子功能活性的mAb可能引起安全性风险{Lee,2016 #592}。此处描述的非经典的ADP机制通过增强Tau的有效清除而不需要激活小胶质细胞或刺激促炎细胞因子的释放，避免了可能的神经炎症负累。综上所述，稳健的脑递送平台已经针对药代动力学、药效学和安全性进行了表征，确立了推进临床试验所需的稳健临床前表征。
当作为scFv脑穿梭载体格式化和融合至原型抗-BACE (β-分泌酶)拮抗剂mAb时，相比于单独的抗-BACE mAb，在 i.v.给予表达huTfR的转基因小鼠后观察到脑浓度的4-10x提高。还注意到强PK:PD关系，其中检测到β-淀粉样蛋白的剂量依赖性降低。最佳性能的脑穿梭载体增强脑递送超过竞争分子，通过在脑穿梭载体和huTfR之间优化的结合相互作用实现同类最佳递送。
优化的脑穿梭载体然后与PT1B844 (Tau结合mAb)融合。当在食蟹猴中 i.v.给予时，脑穿梭载体融合的PT1B844证实脑浓度的6-16倍提高。与小鼠数据类似，脑浓度提高超过了文献中报道的最佳脑穿梭载体，除了优越的脑PK之外，脑穿梭载体还被改造以减少Fc介导的效应子功能并且在食蟹猴中不诱导快速网织红细胞耗竭，正如竞争者已经报道的。重要的是，Fc功能的丢失不影响治疗性Tau mAb的有效性，因为脑穿梭载体比单独的PT1B844更有效介导Tau的小胶质细胞摄取。
本领域技术人员将理解，在不脱离其广泛发明构思的情况下可对上述实施方案进行改变。因此应理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，而是意图涵盖在如随附权利要求所定义的本发明的精神和范围内的修改。
引用
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Claims (26)

1.用于递送药剂至有需要的受试者的脑的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗-TfR抗体或其抗原结合片段以在中性pH下至少1 nM、优选地1-500 nM的解离常数KD和在酸性pH、优选地pH 5下至少10-4 sec-1、优选地10-4至10-1 sec-1的解离速率常数kd，结合转铁蛋白受体(TfR)，优选地人TfR1。
2.权利要求1的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，其具有在中性pH下2 x 10-2至2 x 10-4sec-1、优选地2.0 x 10-3 sec-1的解离速率常数kd。
3.权利要求1或2的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1) 包含重链互补决定区(HCDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区和包含轻链互补决定区(LCDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有以下氨基酸序列：
(i) 分别为SEQ ID NO: 292、293、294、295、296和297；
(ii) 分别为SEQ ID NO: 279、280、281、282、283和284；
(iii) 分别为SEQ ID NO: 29、30、31、32、33和34；
(iv) 分别为SEQ ID NO: 57、58、59、60、61和62；
(v) 分别为SEQ ID NO: 85、86、87、88、89和90；
(vi) 分别为SEQ ID NO: 110、111、112、113、114和115；
(vii) 分别为SEQ ID NO: 135、136、137、138、139和140；
(viii) 分别为SEQ ID NO: 191、192、193、194、195和196；
(ix) 分别为SEQ ID NO: 244、245、246、247、248和249；
(x) 分别为SEQ ID NO: 263、264、265、266、267和268；
(xi) 分别为SEQ ID NO: 345、346、347、348、349和350；
(xii) 分别为SEQ ID NO: 355、356、357、358、359和360；
(xiii) 分别为SEQ ID NO: 365、366、367、368、369和370；
(xiv) 分别为SEQ ID NO: 375、376、377、378、379和380；
(xv) 分别为SEQ ID NO: 385、386、387、388、389和390；
(xvi) 分别为SEQ ID NO: 395、396、377、398、399和400；
(xvii) 分别为SEQ ID NO: 405、406、407、408、409和410；
(xviii) 分别为SEQ ID NO: 415、416、417、418、419和420；
(xix) 分别为SEQ ID NO: 425、426、427、428、429和430；
(xx) 分别为SEQ ID NO: 435、436、437、438、439和440；
(xxi) 分别为SEQ ID NO: 445、446、447、448、449和450；
(xxii) 分别为SEQ ID NO: 455、456、457、458、459和460；
(xxiii) 分别为SEQ ID NO: 465、466、467、468、469和470；
(xxiv) 分别为SEQ ID NO: 475、476、477、478、479和480；
(xxv) 分别为SEQ ID NO: 485、486、487、488、489和490；
(xxvi) 分别为SEQ ID NO: 495、496、497、498、499和500；
(xxvii) 分别为SEQ ID NO: 505、506、507、508、509和510；
(xxviii) 分别为SEQ ID NO: 515、516、517、518、519和520；
(xxix) 分别为SEQ ID NO: 525、526、527、528、529和530；
(xxx) 分别为SEQ ID NO: 535、536、537、538、539和540；或
(xxxi) 分别为SEQ ID NO: 545、546、547、548、549和550；或者
(2) 重链单一可变结构域(VHH)，其包含具有以下氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(i) 分别为SEQ ID NO: 7、8和9；
(ii) 分别为SEQ ID NO: 317、318和319；
(iii) 分别为SEQ ID NO: 324、325和326；
(iv) 分别为SEQ ID NO: 331、332和333；或
(v) 分别为SEQ ID NO: 338、339和340。
4.权利要求1-3中任一项的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，其为包含与SEQ ID NO: 6、316、323、330或337具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VHH片段。
5.权利要求1-3中任一项的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，其为包含通过接头共价连接至轻链可变区的重链可变区的单链可变片段(scFv)，优选地所述接头具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列，更优选地所述scFv包含与SEQ ID NO: 278、291、28、56、84、109、134、162、190、218、243、262、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534或544的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列。
6.一种缀合物，其包含与治疗剂或诊断剂偶联的权利要求1-5中任一项的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，优选地所述缀合物是包含第一抗原结合区和第二抗原结合区的多特异性抗体，所述第一抗原结合区结合TfR并包含权利要求1-5中任一项的抗原结合片段，所述第二抗原结合区结合脑靶标，例如选自β-分泌酶1 (BACE1)、β淀粉样蛋白(Abeta)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2 (HER2)、Tau、载脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、亨廷顿蛋白、朊蛋白(PrP)、富含亮氨酸的重复激酶2 (LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受体6 (DR6)、淀粉样前体蛋白(APP)、p75神经营养因子受体(p75NTR)和胱天蛋白酶6的脑靶标。
7.一种融合构建体，其包含与第二抗体或其抗原结合片段共价连接的权利要求1-5中任一项的抗-TfR抗体或其抗原结合片段，所述第二抗体或其抗原结合片段结合脑靶标，例如选自β-分泌酶1 (BACE1)、β淀粉样蛋白(Abeta)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2 (HER2)、Tau、载脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、亨廷顿蛋白、朊蛋白(PrP)、富含亮氨酸的重复激酶2 (LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受体6(DR6)、淀粉样前体蛋白(APP)、p75神经营养因子受体(p75NTR)和胱天蛋白酶6的脑靶标。
8.权利要求7的融合构建体，其中所述抗-TfR抗体或其抗原结合片段通过接头共价连接至所述第二抗体或其抗原结合片段的两条重链中仅一条的羧基末端，优选地所述接头具有SEQ ID NO: 312或SEQ ID NO: 313的氨基酸序列。
9.权利要求8的融合构建体，其中与野生型CH3结构域多肽相比，所述第二抗体或其抗原结合片段的两条重链各自包含一个或多个异二聚体突变，例如修饰的异二聚体CH3结构域，或一个或多个旋钮-孔突变。
10.权利要求9的融合构建体，其中所述异二聚体突变包含第一重链的修饰的异二聚体CH3结构域和第二重链的修饰的异二聚体CH3结构域，所述第一重链的修饰的异二聚体CH3结构域包含位置T350、L351、F405和Y407的氨基酸修饰，所述第二重链的修饰的异二聚体CH3结构域包含位置T350、T366、K392和T394的氨基酸修饰，其中位置T350的氨基酸修饰是T350V、T350I、T350L或T350M；位置L351的氨基酸修饰是L351Y；位置F405的氨基酸修饰是F405A、F405V、F405T或F405S；位置Y407的氨基酸修饰是Y407V、Y407A或Y407I；位置T366的氨基酸修饰是T366L、T366I、T366V或T366M；位置K392的氨基酸修饰是K392F、K392L或K392M；和位置T394的氨基酸修饰是T394W，并且其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。
11.权利要求10的融合构建体，其中第一重链的修饰的异二聚体CH3结构域包含突变T350V、L351Y、F405A和Y407V，并且第二重链的修饰的异二聚体CH3结构域包含突变T350V、T366L、K392L和T394W。
12.权利要求7-11中任一项的融合物，其中所述第二抗体或其抗原结合片段包含在Fc结构域中的一个或多个突变，其增强所述融合物与新生儿Fc受体(RcRn)的结合，优选地所述一个或多个突变增强在酸性pH下的结合，更优选地所述Fc具有M252Y/S254T/T256E(YTE)突变，其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。
13.权利要求7-12中任一项的融合物，其中所述第二抗体或其抗原结合片段包含在Fc结构域中的一个或多个突变，其减少或消除效应子功能，优选地所述Fc具有位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329的一个或多个氨基酸修饰，例如L234A、L235A和P331S中的一个、两个或三个突变，其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。
14.权利要求7-13中任一项的融合构建体，其中所述第二抗体或其抗原结合片段结合Tau并包含分别具有SEQ ID NO: 554-559的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，优选地所述第二抗体是包含具有SEQ ID NO: 310的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO: 311的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体。
15.权利要求7-14中任一项的融合构建体，其包含：
(1) 第一重链，其具有与选自SEQ ID NO: 301、304、307、285、288、298、10、13、16、19、22、25、35、38、41、44、47、50、53、63、66、69、72、75、78、81、91、94、97、100、103、106、116、119、122、125、128、131、141、144、147、150、153、156、159、169、172、175、178、181、184、187、197、200、203、206、209、212、215、225、228、231、234、237、240、250、252、256、259、269、272、275、320、327、334、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461和471的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列；
(2) 两条轻链，各自独立地具有分别与选自302、305、308、286、289、299、11、14、17、20、23、26、36、39、42、45、48、51、54、64、67、70、73、76、79、82、92、95、98、101、104、107、117、120、123、126、129、132、142、145、148、151、154、157、160、170、173、176、179、182、185、188、198、201、204、207、210、213、216、226、229、232、235、238、241、251、253、257、260、270、273、276、321、328、335、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462和472的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列；和
(3) 第二重链，其具有分别与选自303、306、309、287、290、300、12、15、18、21、24、27、37、40、43、46、49、52、55、65、68、71、74、77、80、83、93、96、99、102、105、108、118、121、124、127、130、133、143、146、149、152、155、158、161、171、174、177、180、183、186、189、199、202、205、208、211、214、217、227、230、233、236、239、242、252、254、258、261、271、274、277、322、329、336、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463和473的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列。
16.一种分离的核酸，其编码权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段、权利要求6的缀合物或权利要求7-15中任一项的融合构建体。
17.一种载体，其包含权利要求16的分离的核酸。
18.一种宿主细胞，其包含权利要求16的核酸或权利要求17的载体。
19.一种产生权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段、权利要求6的缀合物或权利要求7-15中任一项的融合构建体的方法，其包括在产生所述抗体或抗原结合片段、所述缀合物或所述融合构建体的条件下培养包含编码所述抗体或抗原结合片段、所述缀合物或所述融合构建体的核酸的细胞，并且从所述细胞或细胞培养物回收所述抗体或抗原结合片段、所述缀合物或所述融合构建体。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段、权利要求6的缀合物或权利要求7-15中任一项的融合构建体以及药学上可接受的载剂。
21.一种治疗或检测有需要的受试者的病症、优选地神经学病症的方法，其包括给予所述受试者权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段、权利要求6的缀合物或权利要求7-15中任一项的融合构建体、或权利要求20的药物组合物，优选地所述神经学病症选自神经退行性疾病(例如路易体病、脊髓灰质炎后综合征、Shy-Draeger综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩)、tau蛋白病(例如阿尔茨海默病和核上性麻痹)、朊病毒病(例如牛海绵状脑病、羊搔症、克雅氏综合征、库鲁病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、慢性消耗病和致命性家族性失眠症)、延髓麻痹、运动神经元病和神经系统异变性疾病(例如卡纳万病、亨廷顿氏病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大病、图雷特综合征、门克斯扭结发综合征、科凯恩综合征、Hallervorden-Spatz综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、Lesch-Nyhan综合征和Unverricht-Lundborg综合征)、痴呆(例如皮克氏病和脊髓小脑性共济失调)和CNS和/或脑的癌症(例如身体别处的癌症导致的脑转移)。
22.权利要求21的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段、所述缀合物或所述药物组合物经静脉内给予。
23.一种跨有需要的受试者的血脑屏障(BBB)递送治疗剂或诊断剂的方法，其包括给予所述受试者包含与权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段偶联、优选地共价缀合的治疗剂或诊断剂的复合物。
24.权利要求21-24中任一项的方法，其中所述给予减少Fc介导的效应子功能和/或不引起快速网织红细胞耗竭。
25.一种在有需要的受试者中诱导抗体依赖性吞噬作用(ADP)而不刺激促炎细胞因子的分泌的方法，其包括给予所述受试者包含与权利要求1-5中任一项的其抗原结合片段偶联、优选地共价缀合的治疗性抗体或其抗原结合片段的复合物，其中所述治疗性抗体或其抗原结合片段包含位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329的一个或多个氨基酸修饰，例如L234A、L235A和P331S中的一个、两个或三个突变，其中氨基酸残基的编号根据Kabat中所示的EU索引。
26.权利要求25的方法，其中所述治疗性抗体或其抗原结合片段与tau聚集体特异性结合。
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