TW202304974A

TW202304974A - 抗tau抗體及其用途

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Publication number: TW202304974A
Application number: TW111111454A
Authority: TW
Inventors: 魯佩什納裘達; 克里斯托夫汎科倫
Original assignee: 美商健生生物科技公司
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2023-02-01
Also published as: US20240150451A1; CA3214310A1; IL307170A; KR20230162790A; EP4314048A1; MX2023011339A; UY39699A; WO2022201123A1; BR112023019546A2; AU2022242135A1; JP2024512589A

Abstract

描述單株抗PHF-tau抗體及其抗原結合片段。亦描述編碼該等抗體之核酸、包含該等抗體之組成物、產生該等抗體之方法、及使用該等抗體治療或預防諸如tau蛋白病之病況的方法。

Description

抗TAU抗體及其用途

本發明係關於抗PHF-tau抗體、編碼該等抗體之核酸及表現載體、含有該等載體之重組細胞、及包含該等抗體之組成物。亦提供製作該等抗體之方法、使用該等抗體治療包括tau蛋白病之病況的方法、及使用該等抗體診斷諸如tau蛋白病之疾病的方法。 電子提交序列表之參照

本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式化序列表經由EFS-Web電子提交，檔案名稱係「065768.96US2_Sequence_Listing」，創建日期係2021年6月3日且大小係66 kb。經由EFS-Web提交之序列表係本說明書之一部分，其全文以引用方式併入本文中。

阿茲海默症(Alzheimer’s Disease, AD)是一種在臨床上藉由下列表徵的退化性腦部病症：逐漸喪失記憶、認知、推理、判斷及情緒穩定性，其逐漸導致極度心智衰退(profound mental deterioration)而最終死亡。AD是老年人類之進行性心智減退(progressive mental failure)（失智症）之極常見的原因，且據信代表美國第四位最常見的醫學上的死因。AD已在全世界族群中觀測到且代表目前及未來的主要公共健康問題。

患有AD的個體之腦部展現出特有病變，該等病變稱為類澱粉斑塊、類澱粉血管病變（血管中的類澱粉沉積）、及神經纖維纏結。大量此等病變，特別是類澱粉斑塊及成對螺旋絲(paired helical filament)之神經纖維纏結，通常在患有AD之患者中發現於人類腦部之對記憶及認知功能相當重要的若干區域。

當前AD治療情形僅包括經核准治療患有失智症之患者之認知症狀的療法。不存在改變或減慢AD進展之經核准療法。潛在疾病改質劑係抗類澱粉抗體，包括Eli Lilly之多納單抗(Donanemab)，其係識別Aβ之焦麩胺酸鹽形式Aβ(p3-42)之人源化IgG1單株抗體；及阿杜那單抗(aducanumab)，其係針對在Aβ上發現之構象表位之人類IgG1單株抗體。該等療法及接下來十年中可能推出之大部分其他潛在疾病改質劑靶向A _β(類澱粉斑塊之主要組分，類澱粉斑塊係AD之兩種「標誌性(hallmark)」病理徵象之一)。

神經纖維纏結係AD之第二標誌性病理徵象，其主要由超磷酸化tau蛋白之聚集物構成。tau之主要生理功能係微管聚合及穩定。tau與微管之結合係藉由介於tau之微管結合區中之正電荷與微管晶格(lattice)上之負電荷之間的離子交互作用而發生(Butner及Kirschner, J Cell Biol. 115(3):717-30, 1991)；tau蛋白含有85個可能的磷酸化位點且許多這些位點處之磷酸化干擾tau之主要功能。結合至軸突微管網格之tau處於低磷酸化狀態，而AD中聚集的tau是超磷酸化的，其提供不同於生理活性的taut池之獨特表位。

tau蛋白病(tauopathy)傳播及蔓延假說已得到描述，且係基於人類腦中tau蛋白病進展之Braak階段及臨床前tau模型中tau聚集物注射後之tau蛋白病蔓延(Frost等人， JBiol Chem. 284:12845-52, 2009；Clavaguera等人， Nat Cell Biol. 11:909-13, 2009)。

開發預防或清除tau聚集之治療劑多年來一直受到關注，且候選藥物(包括抗聚集化合物及激酶抑制劑)已進入臨床測試(Brunden等人， Nat Rev Drug Discov. 8:783-93, 2009)。已公開多個研究，該等研究顯示轉基因小鼠模型中主動及被動tau免疫兩者之有益的治療效應(Chai等人， J Biol Chem.286:34457-67, 2011；Boutajangout等人， J Neurochem.118:658-67, 2011；Boutajangout等人， J Neurosci.30:16559-66, 2010；Asuni等人， J Neurosci.27:9115-29, 2007)。已報導在磷酸化定向抗體及非磷酸化定向抗體兩者之情況下的活性(Schroeder等人， J Neuroimmune Pharmacol. 11(1):9-25, 2016)。

儘管有所進展，但仍需要預防tau聚集及tau蛋白病進展之有效治療劑，以治療諸如AD之tau蛋白病及其他神經退化性疾病。

本發明藉由提供抗PHF-tau抗體或其抗原結合片段來滿足此需要，該等抗體或其抗原結合片段對成對螺旋絲(PHF)-tau具有高結合親和力，且對磷酸化tau具有選擇性。本發明之抗體藉由小鼠PHF-tau特異性抗體之人類架構調適(human framework adaptation, HFA)來生成。認為該等抗體對磷酸化tau之選擇性實現針對致病性tau之功效而不干擾正常tau功能。本發明亦提供編碼該等抗體之核酸、包含該等抗體之組成物、及製作及使用該等抗體之方法。本發明之抗PHF-tau抗體或其抗原結合片段抑制tau種子(seed)，如藉由使用衍生自HEK細胞溶解產物或來自突變tau轉基因小鼠之脊髓溶解產物之tau種子進行之細胞檢定所測量。另外，具有本發明之抗PHF-tau抗體之可變區及小鼠Ig恆定區(諸如小鼠IgG2a恆定區)之嵌合抗體阻斷活體內突變tau轉基因小鼠模型中之播種(seeding)活性。

AD腦中tau蛋白病之進展遵循不同的特殊蔓延模式。在臨床前模型中已顯示細胞外磷酸化tau種子可以誘導神經元中之tau蛋白病（Clavaguera等人，PNAS 110(23):9535-40, 2013）。因此，據信tau蛋白病可以類普里昂蛋白之方式從一個腦部區域蔓延至下一個腦部區域。此蔓延過程將涉及可被附近神經元吸收且進一步誘導tau蛋白病之tau種子之外化。雖然不希望受到理論約束，但是認為本發明之抗PHF-tau抗體或其抗原結合片段藉由與磷酸化tau種子相互作用來預防腦中之tau聚集或tau蛋白病蔓延。

在一個大致態樣中，本發明係關於一種結合PHF-tau之單離單株抗體或其抗原結合片段。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其在由SEQ ID NO: 1之胺基酸序列組成或在該胺基酸序列內之tau蛋白表位結合至tau蛋白，其中抗體或其抗原結合片段結合成對螺旋絲(PHF)-tau，較佳的是人類PHF-tau。

根據一具體態樣，本發明係關於一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其中： (a) tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化S433或磷酸化S435中之任一者，但不包含磷酸化S433及磷酸化S435； (b) tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之一或多者，但不包含磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之全部； (c) tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化T427及磷酸化S433中之一或多者，但不包含磷酸化S435，且不包含磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之全部；或 (d) tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化T427，但不包含磷酸化S433或磷酸化S435。

根據另一具體態樣，單離單株抗體或其抗原結合片段包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 4、5及6之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 7、8及9之多肽序列； (b) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及19之多肽序列； (c) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 24、25及26之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 27、18及19之多肽序列； (d) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 32、33及34之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及35之多肽序列；或 (e) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 40、41及42之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及43之多肽序列。

根據另一具體態樣，單離單株抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 2、12、22、30或38至少90%同一之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO: 3、13、23、31或39至少90%同一之多肽序列的輕鏈可變區。

根據另一具體態樣，單離單株抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 2、12、22、30或38之多肽序列的重鏈可變區，或具有SEQ ID NO: 3、13、23、31或39之多肽序列的輕鏈可變區。

根據另一具體態樣，單離單株抗體或其抗原結合片段包含： (a) 具有SEQ ID NO: 2之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 3之多肽序列的輕鏈可變區； (b) 具有SEQ ID NO: 12之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 13之多肽序列的輕鏈可變區； (c) 具有SEQ ID NO: 22之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 23之多肽序列的輕鏈可變區； (d) 具有SEQ ID NO: 30之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 31之多肽序列的輕鏈可變區；或 (e) 具有SEQ ID NO: 38之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 39之多肽序列的輕鏈可變區。

根據另一具體態樣，單離單株抗體或其抗原結合片段包含： (a) 具有SEQ ID NO: 10之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 11之多肽序列的輕鏈； (b) 具有SEQ ID NO: 20之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 21之多肽序列的輕鏈； (c) 具有SEQ ID NO: 28之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 29之多肽序列的輕鏈； (d) 具有SEQ ID NO: 36之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 37之多肽序列的輕鏈；或 (e) 具有SEQ ID NO: 44之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 45之多肽序列的輕鏈。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 4、5及6之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 7、8及9之多肽序列； (b) 具有SEQ ID NO: 2之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 3之多肽序列的輕鏈可變區；或 (c) 具有SEQ ID NO: 10之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 11之多肽序列的輕鏈。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及19之多肽序列； (b) 具有SEQ ID NO: 12之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 13之多肽序列的輕鏈可變區；或 (c) 具有SEQ ID NO: 20之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 21之多肽序列的輕鏈。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種編碼本發明之單離單株抗體或其抗原結合片段的單離核酸。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種載體，其包含編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段的單離核酸。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種宿主細胞，其包含編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段的單離核酸。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，其包含本發明之單離單株抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種阻斷有需要之對象之tau播種之方法，其包含向該對象投予本發明之醫藥組成物。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種治療有需要之對象之tau蛋白病的方法，其包含向該對象投予本發明之醫藥組成物。tau蛋白病包括但不限於選自由以下所組成之群組之一或多者：家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症(Pick's disease)、進行性皮質下膠質增生(progressive subcortical gliosis)、僅纏結失智症(tangle only dementia)、彌漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵體肌炎、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系統萎縮症、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性泛腦炎、肌強直性營養不良、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、及拳擊手型失智症（拳擊疾病）。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種減少有需要之對象之病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法，其包含向該對象投予本申請之醫藥組成物。tau蛋白病包括但不限於選自由以下所組成之群組之一或多者：家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症(Pick's disease)、進行性皮質下膠質增生(progressive subcortical gliosis)、僅纏結失智症(tangle only dementia)、彌漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵體肌炎、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系統萎縮症、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性泛腦炎、肌強直性營養不良、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、及拳擊手型失智症（拳擊疾病）。

在另一大致態樣中，本申請係關於一種產生本發明之單株抗體或其抗原結合片段的方法，其包含：在產生該單株抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼該單株抗體或其抗原結合片段之核酸的細胞；及自該細胞或細胞培養物回收該單株抗體或其抗原結合片段。

在另一大致態樣中，本申請係關於一種偵測來自對象之生物樣本中PHF-tau之存在的方法，其包含使該生物樣本與本發明之單株抗體或其抗原結合片段接觸；及偵測該單株抗體或其抗原結合片段與來自該對象之該樣本中之PHF-tau的結合。生物樣本包括（但不限於）選自由以下組成之群組中之一或多者：血液、血清、血漿、間隙液、或腦脊髓液樣本。

根據本發明實施例之本發明之其他態樣、特徵及優點，自下文揭露（包括實施方式與其較佳實施例，以及附加之申請專利範圍）觀之，係顯而易見者。

各篇公開案、論文及專利已於先前技術及整份說明書引用或描述；此等參考文獻之各者全文係以引用方式併入本文中。在本說明書中所包括之對於文件、行動、材料、裝置、物品、或其類似者的論述，目的在於提供關於本發明的脈絡。此等論述並非承認，任一或所有此等情事形成了關於任何所揭示或請求之發明的先前技術部分。定義

除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語，均與本申請案有關技術領域中具有通常知識者所通常了解之意義相同。在其他方面，在本文中所使用的某些用語具有如本說明書所定之意義。在本文中所引用的所有專利、已公開專利申請案及公開案係以引用方式併入，猶如全文說明於本文中。必須注意的是，本文及附加之申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。

除非另有說明，在本文中描述之任何數值(諸如濃度或濃度範圍)應理解為在所有情況下皆受到用語「約(about)」之修飾。因此，數值一般包括記載值之± 10%。舉例而言，1 mg/mL之濃度包括0.9 mg/mL至1.1 mg/mL。同樣，1%至10% (w/v)之濃度範圍包括0.9% (w/v)至11% (w/v)。如本文中所使用，明示使用之數值範圍包括所有可能的子範圍、在該範圍內之所有個別數值，包括在該等範圍內之整數及數值之分數，除非上下文以其他方式清楚指示。

如本文中所使用，多個所述元件之間的連接用語「及/或(and/or)」係理解為涵蓋個別及組合選項兩者。例如，其中兩個元件係藉由「及/或」連接時，第一選項係指第一元件在沒有第二元件的情況下之適用性。第二選項係指第二元件在沒有第一元件的情況下之適用性。第三選項係指第一元件及第二元件一起之適用性。這些選項之任一者應理解為落入該含義內，並因此滿足如本文中所使用之用語「及/或」之要求。該等選項之多於一者的並行適用性亦應理解為落入該含義內，並因此滿足用語「及/或」之要求。

除非上下文另有要求，在整份說明書及附加之申請專利範圍中，詞語「包含(comprise)」及諸如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」之變化形式應理解為意指包括所述整數或步驟或多個整數或多個步驟之組，但並不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之組。在用於本文中時，用語「包含(comprising)」可用用語「含有(containing)」或「包括(including)」取代，或有時在用於本文中時用用語「具有(having)」取代。

在用於本文中時，「由…組成(consisting of)」不包括未在申請專利範圍要素中指定之任何要素、步驟、或成分。在用於本文中時，「基本上由…組成(consisting essentially of)」並不排除未實質上影響申請專利範圍之基本及新穎特徵的材料或步驟。上文所提及用語「包含(comprising)」、「含有(containing)」、「包括(including)」及「具有(having)」中之任一者每當在本文中用於本發明之一態樣或實施例之上下文中時可用用語「由…組成(consisting of)「基本上由…組成(consisting essentially of)」替代以改變本揭露之範圍。

如本文中所使用，用語「單離(isolated)」意指生物組分（諸如核酸、肽、或蛋白質）已經與該組分所天然出現於內之生物體中的其他生物組分（即其他染色體及染色體外DNA和RNA、及蛋白質）實質上分離、與該等其他生物組分分開生產、或自該等其他生物組分純化出來。因此，已經「單離(isolated)」之核酸、肽及蛋白質包括藉由標準純化方法純化之核酸及蛋白質。「單離」核酸、肽、及蛋白質可係組成物之一部分且仍為經單離的，只要此組成物並非該核酸、肽、及蛋白質之原生環境的一部分。該用語亦包含藉由在宿主細胞中重組表現所製備之核酸、肽及蛋白質以及化學合成之核酸。

如本文中所使用，用語「抗體(antibody)」或「免疫球蛋白(immunoglobulin)」以廣泛含義使用且包括免疫球蛋白或抗體分子，包括多株抗體、單株抗體，包括鼠類、人類、人類調適(human-adapted)、人源化及嵌合單株抗體、及抗體片段。

大致上，抗體是對特定抗原展現出結合特異性之蛋白質或肽鏈。抗體結構係熟知的。免疫球蛋白可分為五大類，即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，取決於重鏈恆定域(constant domain)胺基酸序列。IgA及IgG係進一步被細分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。本發明之抗體包括在其Fc區內具有變化的抗體，使得其與野生型Fc區相比具有改變的性質，該等改變的性質包括但不限於延長的半衰期、減小或增加的ADCC或CDC、及靜默的Fc效應(effector)功能。因此，本發明之抗體可以是五大類或對應子類中之任一者。較佳的是，本申請之抗體是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可分派為兩種截然不同類型（即κ及λ）中之一者，視其等恆定域的胺基酸序列而定。因此，本發明之抗體可含有κ或λ輕鏈恆定域。根據具體實施例，本發明之抗體包括來自小鼠抗體或人類抗體之重鏈及/或輕鏈恆定區。

除重鏈及輕鏈恆定域之外，抗體含有輕鏈及重鏈可變區。免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區係由被「抗原結合部位(antigen binding site)」中斷的「架構(framework)」區所組成。抗原結合部位係使用如下各種用語及編號方案定義： (i) Kabat：「互補決定區」或「CDR」係基於序列可變性(Wu及Kabat, J Exp Med. 132:211-50, 1970)。通常而言，抗原結合部位在各可變區內具有三個CDR（例如重鏈可變區(VH)中之HCDR1、HCDR2、及HCDR3及輕鏈可變區(VL)中之LCDR1、LCDR2、及LCDR3）； (ii) Chothia：用語「高度變異區(hypervariable region)」、「HVR」、或「HV」係指如Chothia及Lesk所定義般在結構上係高度變異之抗體可變域中的區域(Chothia及Lesk， J Mol Biol196:901-17, 1987)。通常而言，抗原結合部位在各VH（H1、H2、H3）及VL（L1、L2、L3）中具有三個高度變異區。編號系統以及CDR及HV之注釋已由Abhinandan及Martin修訂（Abhinandan及Martin， Mol Immunol45:3832-9, 2008）； (iii) IMGT：Lefranc已基於比較免疫球蛋白與T細胞受體之V結構域提出形成抗原結合部位之區域之另一定義(Lefranc等人， Dev Comp Immunol.27:55-77, 2003)。國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics, IMGT)資料庫提供了標準化編號及該等區域之定義。CDR、HV及IMGT定義之對應性描述於Lefranc等人，2003, Id中； (iv) AbM：Kabat與Chothia編號方案之間之折衷方案是由Martin(Martin ACR (2010) Antibody Engineering，編輯Kontermann R, Dubel S (Springer-Verlag, Berlin)，第2卷，第33至51頁)所描述之AbM編號常規； (v) 抗原結合部位亦可基於「特異性決定殘基用法」(SDRU) (Almagro, Mol Recognit.17:132-43, 2004)來描繪，其中SDR係指直接涉及抗原接觸之免疫球蛋白的胺基酸殘基。

「架構(framework)」或「架構序列(framework sequence)」係抗體之可變區內除定義為抗原結合部位序列之彼等序列外之剩餘序列。由於抗原結合部位之精確定義可藉由如上文所述之各種描繪來判定，精確架構序列取決於抗原結合部位之定義。架構區(FR)是可變域之更加高度保留的部分。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含四個由三個高度變異環連接之FR（分別是FR1、FR2、FR3、及FR4），其通常採用β褶板組態。各鏈中之高度變異環係藉由FR緊密靠近地固持在一起，且與來自另一條鏈之高度變異環一起促成抗體之抗原結合部位的形成。抗體之結構分析顯露由互補決定區形成之結合部位之序列與形狀之間的關係(Chothia等人， J. Mol. Biol. 227:799-817, 1992；Tramontano等人， J. Mol. Biol. 215:175-182, 1990)。儘管其存在高序列可變性，但六個環中之五者僅採用一小組主鏈構形，稱為「正則結構(canonical structure)」。該等構形首先藉由環之長度且其次藉由關鍵殘基在該等環及架構區中某些位置處之存在來決定，該等關鍵殘基透過其堆積、氫鍵、或承擔不常見主鏈構形之能力來決定構形。

如本文中所使用，用語「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」係指抗體片段，諸如例如雙鏈抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、(dsFv) ₂、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、雙硫鍵穩定性雙鏈抗體（ds雙鏈抗體）、單鏈抗體分子(scFv)、單域抗體(sdab)、scFv二聚體（雙價雙鏈抗體）、由包含一或多個CDR之抗體的一部分形成之多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體、域抗體、雙價域抗體、或任何其他結合至抗原但不包含完整抗體結構之抗體片段。抗原結合片段能夠結合至親本抗體(parent antibody)或親本抗體片段所結合之相同抗原。根據具體實施例，抗原結合片段包含輕鏈可變區、輕鏈恆定區、及重鏈恆定區之Fd區段。根據其他具體實施例，抗原結合片段包含Fab及F(ab')。

如本文中所使用，用語「人源化抗體(humanized antibody)」係指經修飾以增加與人類抗體之序列同源性的非人類抗體，使得抗體之抗原結合性質得以保留但其在人體內之抗原性減小。

如本文中所使用，用語「表位(epitope)」係指免疫球蛋白、抗體、或其抗原結合片段特異性結合之抗原上之位點。表位可以由鄰接胺基酸或藉由蛋白質之三級折疊所並置之非鄰接胺基酸形成。由鄰接胺基酸形成之表位一般在暴露於變性溶劑時保留，而由三級折疊形成之表位一般在用變性溶劑處理時損失。表位一般包括呈獨特空間構象之至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個胺基酸。判定表位之空間構象之方法包括例如x射線結晶學及2維核磁共振。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G. E. Morris編(1996)。

如本文中所使用，用語「tau」或「tau蛋白(tau protein)」係指具有多種異構體之豐富的中樞神經及周邊神經系統蛋白。在人類中樞神經系統(CNS)中，由於選擇性剪接而存在大小範圍在長度為352至441個胺基酸之六種主要的tau異構體(Hanger et al., Trends Mol Med.15:112-9, 2009)。該等異構體藉由調控地包括0至2個N端插入及3或4個串聯排列之微管結合重複而彼此不同，且稱為0N3R (SEQ ID NO: 46)、1N3R (SEQ ID NO: 47)、2N3R (SEQ ID NO: 48)、0N4R (SEQ ID NO: 49)、1N4R (SEQ ID NO: 50)、及2N4R (SEQ ID NO: 51)。如本文中所使用，用語「對照tau」係指SEQ ID NO: 51之不含磷酸化及其他轉譯後修飾之tau異構體。如本文中所使用，用語「tau」包括包含突變之蛋白質，該等突變例如全長野生型tau之點突變、片段、插入、缺失、及剪接變體。用語「tau」亦涵蓋tau胺基酸序列之轉譯後修飾。轉譯後修飾包括但不限於磷酸化。如本文中所使用，片語「tau蛋白之磷酸化S433 (phosphorylated S433 of the tau protein)」及類似片語係指在全長野生型tau蛋白之某一位置磷酸化之胺基酸，例如433位之絲胺酸。

tau結合微管且調控貨物(cargo)穿過細胞之運輸，其係可以藉由tau磷酸化而調節之過程。在AD及相關病症中，tau之異常磷酸化是普遍的且認為先於及/或觸發tau聚集成原纖維，其稱為成對螺旋絲(PHF)。PHF之主要組分是超磷酸化tau。如本文中所使用，用語「成對螺旋絲-tau (paired helical filament-tau)」或「PHF-tau」係指呈成對螺旋絲之形式的tau聚集物。PHF結構中之兩個主要區域在電子顯微鏡下係明顯的，即毛被(fuzzy coat)及核心絲(core filament)；毛被對蛋白水解敏感且位於多個絲之外部，並且多個絲之耐蛋白酶核心形成PHF之主鏈(Wischik等人， Proc Natl Acad Sci USA.85:4884-8, 1988)。

如本文中所使用，「結合PHF-tau之單離單株抗體(isolated monoclonal antibody that binds PHF-tau)」或「單離單株抗PHF-tau抗體(isolated monoclonal anti-PHF-tau antibody)」意欲指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的單株抗PHF-tau抗體（例如，單離單株抗PHF-tau抗體實質上不含特異性結合PHF-tau以外之抗原的抗體）。然而，單離單株抗PHF-tau抗體可以與其他相關抗原例如來自其他物種之抗原（諸如PHF-tau物種同源物）具有交叉反應性。

如本文中所使用，用語「特異性結合(specifically binds)」或「特異結合(specific binding)」係指本申請之抗約PHF-tau抗體以約1×10 ^-6M或更緊，例如，約1×10 ^-7M或更小、約1×10 ^-8M或更小、約1×10 ^-9M或更小、約1×10 ^-10M或更小、約1×10 ^-11M或更小、約1×10 ^-12M或更小、或約1×10 ^-13M或更小之解離常數(K _D)結合至預定標靶的能力。KD係獲自Kd對Ka之比率（即Kd/Ka），且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可使用本揭露所屬技術領域中之方法判定。例如，抗PHF-tau抗體之KD值可以藉由使用表面電漿共振判定，諸如藉由使用生物感測器系統，例如Biacore®系統、Proteon儀器(BioRad)、KinExA儀器(Sapidyne)、ELISA、或所屬技術領域中具有通常知識者已知之競爭性結合檢定。一般而言，抗PHF-tau抗體以K _D結合至預定標靶（即PHF-tau），該K _D較其對非特異性標靶之K _D小至少十倍，如藉由使用例如ProteOn儀器(BioRad)之表面電漿共振所測量。然而，特異性結合至PHF-tau之抗PHF-tau抗體可與其他相關標靶具有交叉反應性，例如與來自其他物種之相同預定標靶(同源物)。

如本文中所使用，用語「多核苷酸(polynucleotide)」同義地稱為「核酸分子(nucleic acid molecule)」、「核苷酸(nucleotide)」、或「核酸(nucleic acid)」，係指任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸，其可為未經修飾之RNA或DNA、或經修飾之RNA或DNA。「多核苷酸(polynucleotide)」包括但不限於單股及雙股DNA、為單股及雙股區之混合物的DNA、單股及雙股RNA、及為單股及雙股區之混合物的RNA、包含可為單股或（更典型地）雙股或單股及雙股區之混合物的DNA及RNA之混成分子。此外，「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三股區。用語多核苷酸亦包括含有一或多個經修飾鹼基之DNA或RNA及具有為了穩定性或其他理由經修飾之主鏈的DNA或RNA。「經修飾(modified)」鹼基包括例如三苯甲基化(tritylated)鹼基及不常見鹼基諸如肌苷(inosine)。可對DNA及RNA進行各種修飾；因此，「多核苷酸(polynucleotide)」包含典型在自然界所發現之經化學、酶、或代謝修飾之多核苷酸形式，以及病毒和細胞所特有之DNA及RNA的化學形式。「多核苷酸(polynucleotide)」亦包含相對短之核酸鏈，其通常稱為寡核苷酸。

如本文中所使用，用語「載體(vector)」是一種複製子(replicon)，可將另一個核酸區段可操作地插入其中，從而使該區段複製或表現。

如本文中所使用，用語「宿主細胞(host cell)」係指包含本發明之核酸分子之細胞。「宿主細胞(host cell)」可為任何類型的細胞，例如初代細胞、培養中之細胞、或來自細胞系之細胞。在一個實施例中，「宿主細胞」是用本發明之核酸分子轉染之細胞。在另一實施例中，「宿主細胞」係該經轉染細胞之後代或潛在後代。細胞的後代可能因為例如發生在後繼世代或核酸分子整合至宿主細胞基因體時可能發生的突變或環境影響，而與親代細胞同一或不同一。

如本文所使用，用語「表現(expression)」係指基因產物之生物合成。該用語涵蓋將基因轉錄成RNA。該用語亦涵蓋將RNA轉譯成一或多種多肽，並且進一步涵蓋所有天然發生之轉錄後及轉譯後修飾。結合PHF-tau之經表現單株抗體或其抗原結合片段可以在宿主細胞之細胞質之內、進入細胞外環境(諸如細胞培養物之生長培養基)、或錨定至細胞膜。

本文中所使用之用語「載劑(carrier)」係指任何賦形劑、稀釋劑、填充料、鹽、緩衝劑、穩定劑、助溶劑、油、脂質、含脂質囊泡、微球、脂質體包封、或其他所屬技術領域中已知用於醫藥配方之材料。將理解載劑、賦形劑或稀釋劑之特徵將取決於特定應用之投予途徑而定。本文中所使用之用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」係指不干擾根據本發明之組成物的有效性或根據本發明之組成物的生物活性之非毒性材料。根據鑒於本揭露之具體實施例，任何適合用於抗體醫藥組成物之醫藥上可接受之載劑皆可用於本發明。

如本文中所使用，用語「對象(subject)」係指動物，且較佳地是哺乳動物。根據具體實施例，對像是哺乳動物，包括非靈長類動物（例如，駱駝、驢、斑馬、奶牛、豬、馬、山羊、羊、貓、狗、大鼠、兔、天竺鼠、或小鼠）或靈長類動物（例如，猴子、黑猩猩、或人類）。在具體實施例中，對象係人類。

如本文中所使用，用語「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指活性成分或組分在對象中引起所欲生物或醫學反應之量。治療有效量可以憑經驗且以常規方式參考所述目的來判定。舉例而言，可以可選地採用體外檢定以協助鑒別最佳劑量範圍。具體有效劑量之選擇可以（例如經由臨床試驗）由所屬技術領域中具有通常知識者基於若干因素之考慮來判定，該等因素包括待治療或預防之疾病、所涉及之症狀、患者身體質量、患者免疫狀態、及具有通常知識者已知之其他因素。配方中所採用之精確劑量亦會取決於投予途徑、及疾病嚴重性，並且應根據執業醫師之判斷及各患者之情況來決定。有效劑量可從衍生自體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外插而來。

如本文中所使用，用語「治療(treat、treating、及treatment)」皆意欲指改善或逆轉至少一個與tau蛋白病有關的可測量物理參數，該物理參數未必可在對象中覺察，但可以是可在對象中覺察的。用語「治療」亦可指造成疾病、病症、或病況消退、預防疾病、病症、或病況進展、或至少延緩疾病、病症、或病況之進展。在一具體實施例中，「治療」係指減輕一或多個與tau蛋白病相關之症狀、預防一或多個與tau蛋白病相關之症狀的發展或開始、或減少一或多個與tau蛋白病相關之症狀的期間。在一具體實施例中，「治療」係指預防疾病、病症、或病況之復發。在一具體實施例中，「治療」係指增加具有疾病、病症、或病況之對象的存活。在一具體實施例中，「治療」係指排除對象之疾病、病症、或病況。

如本文中所使用，「tau蛋白病(tauopathy)」涵蓋涉及tau在腦內之病理性聚集的任何神經退化性疾病。除家族性及偶發性AD之外，其他例示性tau蛋白病是連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症(Pick’s disease)、進行性皮質下膠質增生(progressive subcortical gliosis)、僅纏結失智症(tangle only dementia)、彌漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵體肌炎、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系統萎縮症、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性泛腦炎、肌強直性營養不良、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、及慢性創傷性腦病變（諸如拳擊手型失智症（拳擊疾病））(Morris et al., Neuron,70:410-26, 2011)。

本文中所使用之在向對象投予二或更多種療法上下文中之用語「組合(in combination)」係指使用超過一種療法。用語「組合」之使用並不限制向對象投予療法之順序。例如，第一療法（例如本文描述之組成物）可在向對象投予第二療法之前（例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週以前）、之同時或之後（例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週之後）投予。抗 PHF-tau抗體

在一個大致態樣中，本發明係關於結合PHF-tau之單離單株抗體或其抗原結合片段。此等抗PHF-tau抗體可以具有結合PHF-tau上之磷酸化表位或結合至PHF-tau上之非磷酸化表位的性質。抗PHF-tau抗體可以用作治療劑，且用作偵測生物樣本（例如組織或細胞）中之PHF-tau的研究或診斷試劑。

根據一具體態樣，本發明係關於一種單離抗體或其抗原結合片段，其在tau蛋白之C端結構域中之表位結合至tau蛋白。在一些實施例中，單離單株抗體或其抗原結合片段在具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或在該序列內之tau蛋白表位結合至tau蛋白，其中抗體或其抗原結合片段結合PHF-tau，較佳的是人類PHF-tau。較佳的是，單離單株抗體或其抗原結合片段在由SEQ ID NO: 1之胺基酸序列組成或在該胺基酸序列內之tau蛋白表位結合至tau蛋白，其中抗體或其抗原結合片段結合PHF-tau，較佳的是人類PHF-tau。

在一些實施例中，tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化S433或磷酸化S435中之任一者，但不包含磷酸化S433及磷酸化S435；或tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之一或多者，但不包含磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之全部；或tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化T427及磷酸化S433中之一或多者，但不包含磷酸化S435，且不包含磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之全部；或tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化T427，但不包含磷酸化S433或磷酸化S435。

本發明之抗體可藉由多種技術、例如藉由融合瘤方法來製造(Kohler及Milstein, Nature. 256:495-7, 1975)。含有衍生自供體抗體（一般是鼠類）之輕鏈及重鏈可變區連同衍生自受體抗體（一般是另一種哺乳動物物種，諸如人類）之輕鏈及重鏈恆定區的嵌合單株抗體可藉由US4816567所揭示之方法製備。具有衍生自非人類供體免疫球蛋白（一般是鼠類）之CDR且分子之其餘免疫球蛋白衍生部分係衍生自一種或多種人類免疫球蛋白的CDR移植單株抗體可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知之技術製備，諸如US5225539中所揭示者。缺乏任何非人類序列之完全人類單株抗體可藉由以下中提及之技術由人類免疫球蛋白轉基因小鼠製備(Lonberg等人， Nature. 368:856-9, 1994；Fishwild等人， Nat Biotechnol. 14:845-51, 1996；及Mendez等人， Nat Genet. 15:146-56, 1997。人類單株抗體亦可自噬菌體展示文庫製備及最佳化(參見例如Knappik等人， J Mol Biol. 296:57-86, 2000；Krebs等人， J Immunol Methods. 254:67-84, 2001；Shi等人， J Mol Biol. 397:385-96, 2010)。

根據一具體態樣，本發明係關於單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 4、5及6之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 7、8及9之多肽序列； (b) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及19之多肽序列； (c) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 24、25及26之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 27、18及19之多肽序列； (d) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 32、33及34之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及35之多肽序列；或 (e) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 40、41及42之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及43之多肽序列。

本文提供單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有與SEQ ID NO: 2、12、22、30或38至少90%同一之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO: 3、13、23、31或39至少90%同一之多肽序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，單離單株抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 2、12、22、30或38之多肽序列的重鏈可變區，或具有SEQ ID NO: 3、13、23、31或39之多肽序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，單離單株抗體或其抗原結合片段包含由SEQ ID NO: 2、12、22、30或38之多肽序列組成的重鏈可變區，或由SEQ ID NO: 3、13、23、31或39之多肽序列組成的輕鏈可變區。

根據一具體態樣，本發明係關於單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 重鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；及輕鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列； (b) 重鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 12之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；及輕鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 13之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列； (c) 重鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；及輕鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列； (d) 重鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；及輕鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；或 (e) 重鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 38之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；及輕鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 39之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列。

根據另一具體態樣，本發明係關於單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 具有SEQ ID NO: 2之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 3之多肽序列的輕鏈可變區； (b) 具有SEQ ID NO: 12之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 13之多肽序列、較佳的是由其組成的輕鏈可變區； (c) 具有SEQ ID NO: 22之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 23之多肽序列、較佳的是由其組成的輕鏈可變區； (d) 具有SEQ ID NO: 30之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 31之多肽序列、較佳的是由其組成的輕鏈可變區；或 (e) 具有SEQ ID NO: 38之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 39之多肽序列、較佳的是由其組成的輕鏈可變區。

根據另一具體態樣，本發明係關於單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 重鏈，其具有與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；及輕鏈，其具有與SEQ ID NO: 11之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列； (b) 重鏈，其具有與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；及輕鏈，其具有與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列； (c) 重鏈，其具有與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；及輕鏈，其具有與SEQ ID NO: 29之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列； (d) 重鏈，其具有與SEQ ID NO: 36之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；及輕鏈，其具有與SEQ ID NO: 37之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；或 (e) 重鏈，其具有與SEQ ID NO: 44之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列；及輕鏈，其具有與SEQ ID NO: 45之胺基酸序列至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的多肽序列。

根據另一具體態樣，本發明係關於單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 具有SEQ ID NO: 10之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈，及具有SEQ ID NO: 11之多肽序列的輕鏈； (b) 具有SEQ ID NO: 20之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈，及具有SEQ ID NO: 21之多肽序列的輕鏈； (c) 具有SEQ ID NO: 28之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈，及具有SEQ ID NO: 29之多肽序列的輕鏈； (d) 具有SEQ ID NO: 36之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈，及具有SEQ ID NO: 37之多肽序列的輕鏈；或 (e) 具有SEQ ID NO: 44之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈，及具有SEQ ID NO: 45之多肽序列的輕鏈。

在一些實施例中，本發明之單離單株抗體或其抗原結合片段包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 4、5及6之多肽序列，較佳的是由其組成；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 7、8及9之多肽序列，較佳的是由其組成； (b) 具有SEQ ID NO: 2之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 3之多肽序列、較佳的是由其組成的輕鏈可變區；或 (c) 具有SEQ ID NO: 10之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈，及具有SEQ ID NO: 11之多肽序列、較佳的是由其組成的輕鏈。

在一些實施例中，本發明之單離單株抗體或其抗原結合片段包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之多肽序列，較佳的是由其組成；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及19之多肽序列，較佳的是由其組成； (b) 具有SEQ ID NO: 12之多肽序列、較佳的是由其組成的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 13之多肽序列、較佳的是由其組成的輕鏈可變區；或 (c) 具有SEQ ID NO: 20之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 21之多肽序列的輕鏈。

根據另一具體態樣，本發明係關於單離單株抗體或其抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段以5×10−9 M或更低之解離常數(KD)、較佳的是1×10−9 M或更低或1×10−10 M或更低之KD結合至PHF-tau，其中KD係藉由表面電漿共振分析、諸如藉由使用Biacore或ProteOn系統來量測。

結合PHF-tau之單株抗體及其抗原結合片段之功能性活性可以藉由所屬技術領域中已知及如本文所述之方法表徵。用於表徵結合PHF-tau之抗體及其抗原結合片段之方法包括但不限於親和力及特異性檢定，包括Biacore、ELISA、及FACS分析；免疫組織化學分析；判定抗體在抑制tau播種方面之功效之活體外細胞檢定及活體內注射檢定；偵測抗體之抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性(ADCC)、及補體依賴性細胞毒性(CDC)活性之存在的細胞毒性檢定；等。根據具體實施例，用於表徵結合PHF-tau之抗體及其抗原結合片段的方法包括下文實例中所述之彼等方法。結合PHF-tau但不結合對照tau之單株抗體之例示性小鼠親本抗體係抗體PT3，其描述於美國專利第9,371,376號中，該美國專利之內容之全文皆以引用方式併入本文中。

可以採用若干熟知方法以判定本發明之抗體之結合表位。例如，當兩種個別組分之結構已知時，可以進行電腦蛋白質-蛋白質對接(protein-protein docking)以鑒別相容性相互作用位點。氫-氘(H/D)交換可用抗原及抗體複合物進行，以映射(map)抗原上由抗體結合之區域。抗原之區段及點誘變可用於定位對於抗體結合而言重要的胺基酸。抗體-抗原複合物之共晶結構係用於鑒別形成表位及互補位之殘基。根據具體實施例，用於判定本發明抗體之結合表位之方法包括下文實例中所述之彼等方法。

本發明之抗體可係雙特異性或多特異性抗體。例示性雙特異性抗體可以結合PHF-tau上之兩個不同表位或者可以結合PHF-tau及β類澱粉蛋白(Aβ)。另一例示性雙特異性抗體可以結合PHF-tau及內源性血腦障壁胞吞轉送受體，諸如胰島素受體、轉鐵蛋白受體、類胰島素生長因子-1受體、及脂蛋白受體。例示性抗體是IgG1型。

本發明之抗體之免疫效應性質可透過以所屬技術領域中具有通常知識者習知之技術所進行Fc修飾來增強或靜默(silenced)。舉例而言，Fc效應功能（諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、向下調控細胞表面受體（例如B細胞受體；BCR）等）可藉由修飾Fc中負責這些活性之殘基來提供及/或控制。亦可藉由突變Fc結構域中之殘基從而延長抗體半衰期來增強藥物動力學性質(Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20:685-91, 2009)。

另外，本發明之抗體可藉由下列過程而經轉譯後修飾：諸如醣基化、異構化、去醣基化、或非天然發生之共價修飾(諸如加入聚乙二醇部分及脂質化)。該等修飾可在活體內或活體外進行。舉例而言，本發明之抗體可與聚乙二醇共軛(聚乙二醇化(PEGylated))以改善其藥物動力學特性。共軛可藉由所屬領域中具有通常知識者已知之技術進行。已顯示治療性抗體與PEG之共軛會增強藥效學，同時不會干擾功能(Knight等人， Platelets.15:409-18, 2004；Leong等人， Cytokine.16:106-19, 2001；Yang等人， Protein Eng.16:761-70, 2003)。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段的單離多核苷酸。所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解的是，可以改變（例如，置換、刪除、插入等）蛋白質之編碼序列而不改變該蛋白質之胺基酸序列。因此，所屬技術領域中具有通常知識者將理解的是，可以改變編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段之核酸序列而不改變該等蛋白質之胺基酸序列。例示性單離多核苷酸係編碼包含實例中所述之免疫球蛋白重鏈及輕鏈之多肽(例如SEQ ID NO: 10、11、20、21、28、29、36、37、44、45)的多核苷酸，及編碼包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之多肽(例如SEQ ID NO: 2、3、12、13、22、23、30、31、38、39)的多核苷酸。考慮到一給定表現系統中之基因密碼簡併性或密碼子偏好，其他編碼本發明之抗體之多核苷酸亦在本發明之範疇內。本發明之單離核酸可使用熟知重組或合成技術製成。編碼單株抗體之DNA使用所屬技術領域中已知之方法容易地單離及定序。當生產融合瘤時，該等細胞可做為該等DNA的來源。替代地，可使用其中編碼序列與轉譯產物相連結的顯示技術，諸如噬菌體或核糖體顯示庫。

在另一大致態樣中，本申請係關於一種載體，其包含編碼本申請之單株抗體或其抗原結合片段的單離多核苷酸。鑒於本揭露，可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何載體，諸如質體、黏質體、噬菌體載體、或病毒載體。在一些實施例中，載體是重組表現載體，諸如質體。該載體可包括建立表現載體之習知功能的任何元件，例如啟動子、核糖體結合元件、終止子、增強子、篩選標記、及複製起點。啟動子可以是組成型、誘導型、或阻抑型啟動子。許多能夠將核酸遞送至細胞之表現載體是所屬技術領域中已知的，且可在本文中用於在細胞中生產抗體或其抗原結合片段。習知選殖技術或人工基因合成可以用於生成根據本發明之實施例的重組表現載體。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種宿主細胞，其包含編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段的單離多核苷酸。鑒於本揭露，所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何宿主細胞可以用於重組表現本發明之抗體或其抗原結合片段。此類宿主細胞可以是真核細胞、細菌細胞、植物細胞、或古菌(archeal)細胞。例示性真核細胞可以是哺乳動物、昆蟲、鳥類、或其他動物來源。哺乳動物真核細胞包括永生化細胞系(immortalized cell line)，諸如融合瘤或骨髓瘤細胞系，諸如SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va., CRL-1581)、NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503)、FO (ATCC CRL-1646)、及Ag653 (ATCC CRL-1580)鼠類細胞系。例示性人類骨髓瘤細胞系為U266 (ATTC CRL-TIB-196)。其他實用之細胞系包括衍生自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞者，諸如CHO-K1 SV (Lonza Biologics)、CHO-K1 (ATCC CRL-61, Invitrogen)、或DG44。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種產生本發明之單株抗體或其抗原結合片段的方法，其包含：在產生該單株抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼該單株抗體或其抗原結合片段之核酸的細胞；及自該細胞或細胞培養物（例如，自上清液）回收該抗體或其抗原結合片段。經表現抗體或其抗原結合片段可自細胞收穫且根據所屬技術領域中已知之習知技術純化。 醫藥組成物及治療方法

本發明之抗PHF-tau抗體或本發明之其片段可以用於治療、減少、或預防患有神經退化性疾病或tau蛋白病之患者（諸如罹患AD之患者）之症狀，該神經退化性疾病涉及tau在腦內之病理性聚集。

因此，在另一大致態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，其包含本發明之單離單株抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種阻斷有需要之對象之tau播種之方法，其包含向該對象投予本發明之醫藥組成物。如本文中所使用之「tau種子」係指在由細胞內化時、或在活體外暴露於單體tau時，能夠成核或「播種」細胞內tau聚集之tau聚集物。Tau播種活性可在如本文所述之細胞tau聚集檢定中來評定(亦參見例如美國專利第9,834,596號，其全文皆以引用方式併入)。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種治療或減少有需要之對象之疾病、病症、或病況(諸如tau蛋白病)之症狀的方法，其包含向該對象投予本發明之醫藥組成物。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種減少有需要之對象之病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法，其包含向該對象投予本申請之醫藥組成物。

根據本發明之實施例，醫藥組成物包含治療有效量的單株抗PHF-tau抗體或其抗原結合片段。如本文中關於單株抗PHF-tau抗體或其抗原結合片段所使用，治療有效量意指單株抗PHF-tau抗體或其抗原結合片段的以下量：導致疾病、病症、或病況之治療；預防或減緩疾病、病症、或病況的進展；或者減少或完全緩解與免疫疾病、病症、或病況相關之症狀。

根據具體實施例，治療有效量係指足以達成一、二、三、四、或更多個下列效應之療法之量：(i)減少或改善待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的嚴重性；(ii)減少待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的持續時間；(iii)預防待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的進展；(iv)使待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀消退；(v)預防待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的發展或發作；(vi)預防待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的復發；(vii)減少患有待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀之對象的住院；(viii)減少患有待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀之對象的住院時間；(ix)增加患有待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀之對象的存活期；(xi)抑制或減輕對象之待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀；及/或(xii)增強或改善另一療法的（多種）疾病預防或治療效應。

根據具體實施例，待治療之疾病、病症、或病況是tau蛋白病。根據更具體實施例，待治療之疾病、病症、或病況包括(但不限於)家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症、進行性皮質下膠質增生、僅纏結失智症、彌漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵體肌炎、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系統萎縮症、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性泛腦炎、肌強直性營養不良、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、或拳擊手型失智症（拳擊疾病）。

tau蛋白病相關之行為表型包括但不限於認知障礙、早期人格改變及抑制解除、冷漠、意志缺失、緘默症、失用症、持續言語(perseveration)、刻板動作/行為、口部過度活動(hyperorality)、紊亂(disorganization)、不能計劃或組織順序的任務、自私/麻木、反社會型特質、缺乏同理心、猶豫不決、失語法型言語伴隨頻繁的言語錯亂但相對保留理解力、受損理解力及詞彙提取不足、緩慢進行性步態不穩、後退步態(retropulsion)、僵硬、頻繁跌倒、非左旋多巴反應性軸向僵直(non-levodopa responsive axial rigidity)、核上性凝視麻痹、方形波痙攣(square wave jerk)、緩慢垂直掃視運動、假性延髓麻痹(pseudobulbar palsy)、肢體失用症(limb apraxia)、緊張不足、皮質性感覺喪失(cortical sensory loss)、及震顫。

適於治療之患者包括但不限於處於AD或其他tau蛋白病風險之無症狀個體、以及目前展示出症狀之患者。適於治療之患者包括具有已知AD遺傳風險之個體，諸如AD家族病史或在基因組中存在遺傳風險因子。例示性風險因子是類澱粉前驅蛋白(APP)中之突變，尤其是在位置717以及位置670及671處（分別是Hardy及Swedish突變）。其他風險因子是早老素基因PS1及PS2中以及ApoE4中之突變、高膽固醇血症或動脈粥樣硬化之家族病史。目前罹患AD之個體可以藉由以上所述之風險因子之存在自特徵性失智症識別。另外，許多診斷測試可用於鑒別患有AD之個體。該等診斷測試包括量測腦脊髓液tau及Aβ 42水準。升高的tau及降低的Aβ 42水準表明AD之存在。罹患AD之個體亦可藉由AD及相關病症協會(AD and Related Disorders Association)標準來診斷。

本發明之抗PHF-tau適合作為用於治療或預防涉及tau之病理性聚集之神經退化性疾病(諸如AD或其他tau蛋白病)的治療劑及預防劑。在無症狀患者中，治療可在任何年齡（例如，約10、15、20、25、30歲）開始。然而，通常，直到患者達到約40、50、60、或70歲才有必要開始治療。治療一般在一個時間段內需要多個劑量。治療可藉由隨時間推移評定抗體、或經活化T細胞或B細胞對治療劑之反應來監測。若反應降低，可以指示追加劑量。

在預防性應用中，向易患AD或以其他方式處於AD風險之患者投予醫藥組成物或藥劑，其量足以消除或減少該風險、減輕嚴重性、或延遲疾病之發作，包括疾病之生化、組織學及/或行為症狀、其併發症及在疾病發展期間存在之中間病理表型。在治療性應用中，向易患、或已經罹患此一疾病之患者投予組成物或藥劑，其量足以減少、阻止、或延遲該疾病之任何症狀（生化、組織學、及/或行為）。治療劑之投予可以減少或消除尚未發展特徵性阿茲海默氏病理之患者之輕度認知障礙。

治療有效量或劑量可根據各種因子變化，諸如所欲治療之疾病、病症或病況、投予手段、標靶部位、對象之生理狀態（包括例如年齡、體重、健康）、對象係人類抑或動物、其他投予藥物、及治療係疾病預防性抑或治療性。治療劑量經最佳地滴定以最佳化安全性及功效。

本發明之抗體可被製備成醫藥組成物，其在醫藥上可接受之載劑中含有治療有效量的抗體作為活性成分。該載劑可以是液體，諸如水及油，包括來自石油、動物、蔬菜或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、及類似者。舉例而言，可使用0.4%鹽水及0.3%甘胺酸。這些溶液係無菌且通常不含顆粒物質。彼等可藉由習知、熟知的滅菌技術（例如過濾）來滅菌。該等組成物可含有如用以接近生理條件所需之醫藥上可接受的輔助物質，諸如pH調整及緩衝劑、穩定、增稠、潤滑、及著色劑等。在此類醫藥配方中本發明抗體之濃度可有廣泛變化，即從以重量計小於約0.5%，通常在或至少約1%至多達15或20%，並且將主要基於所需劑量、流體體積、黏度等，根據所選擇之具體投予模式來選擇。

針對本發明之抗體之治療性用途的投予模式可以是將該藥劑遞送至宿主的任何合適途徑。例如，本文所述之組成物可經調配以適用於腸胃外投予，例如皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、或顱內投予，或者可將其投予至腦部或脊髓之腦脊髓液中。

治療可以單一劑量排程、或呈多劑量排程給予，其中治療的主要療程可以是1至10個單獨劑量，接著其他劑量以維持及或強化反應所需的後續時間間隔給予，例如第二劑量在1至4個月，且需要時於數個月後給予（多個）後續劑量。合適治療療程的實例包括：(i) 0、1個月及6個月，(ii) 0、7日及1個月，(iii) 0及1個月，(iv) 0及6個月，或其他排程足以引出所期望的回應，期望降低疾病症候或降低疾病嚴重性。

本發明之抗體可經凍乾儲存且在使用前在合適載劑中復原。已顯示此技術在使用抗體及其他蛋白質製劑的情況下係有效的且可採用本領域已知之凍乾及復原技術。

根據具體實施例，用於治療tau蛋白病之組成物可以與其他有效治療相關神經退化性疾病之藥劑組合使用。在AD之情況下，本發明之抗體可以與減少或預防β類澱粉蛋白(amyloid-beta, Aβ)之沉積的藥劑組合投予。PHF-tau及Aβ病理可能是協同的。因此，同時靶向PHF-tau及Aβ兩者之清除、及Aβ相關病理之組合療法可比個別靶向各者更有效。在巴金森氏症及相關神經退化性疾病之情況下，清除α-突觸核蛋白之聚集形式的免疫調節亦是新出現的療法。同時靶向tau及α-突觸核蛋白兩者之清除的組合療法可比個別靶向任一蛋白更有效。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種產生包含本發明之單株抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物之方法，該方法包含將單株抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。 診斷方法及套組

本發明之單株抗PHF-tau抗體可用於診斷對象之AD或其他tau蛋白病之方法。

因此，在另一大致態樣中，本發明係關於偵測對象中PHF-tau之存在的方法、及藉由使用本發明之單株抗體或其抗原結合片段偵測對象中PHF-tau之存在來診斷對象之tau蛋白病的方法。

可藉由使生物樣本與診斷抗體試劑接觸、及偵測該診斷抗體試劑與來自對象之生物樣本(例如，血液、血清、血漿、組織間隙液、或腦脊髓液樣本)中之磷酸化tau之結合來偵測來自該對象之樣本中之磷酸化tau。用於實施偵測之檢定包括熟知之方法，諸如ELISA、免疫組織化學、西方墨點、或體內成像。

診斷抗體或類似試劑可藉由靜脈內注射到患者體內、或由將藥劑遞送至宿主之任何合適途徑直接注射到腦中來投予。抗體之劑量應在與治療方法之範圍相同的範圍內。一般而言，抗體經標記，但是在一些方法中，對磷酸化tau具有親和力之一級抗體未經標記，且使用二級標記試劑以結合至該一級抗體。標記之選擇取決於偵測手段。例如，螢光標記適用於光學偵測。順磁標記之使用適用於在無手術干預之情況下的斷層攝影偵測。放射性標記亦可使用PET或SPECT偵測。

診斷係藉由比較來自對象之樣本中或對象中經標記PHF-tau、tau聚集物、及/或神經纖維纏結之數目、大小、及/或強度與相應基線值來實施。基線值可代表健康個體之群體中之平均水準。基線值亦可代表在同一對象中判定之先前水準。

以上所述之診斷方法亦可用於藉由在治療之前、期間、或之後偵測磷酸化tau在對象中之存在來監測對象對療法之反應。值相對於基線之降低示意對治療之正向反應。當病理性tau自腦部清除時，值亦可在生物流體中暫時增加。

本發明進一步關於一種套組，其用於執行以上所述之診斷及監測方法。一般而言，此等套組含有診斷試劑(諸如本發明之抗體)、及可選地可偵測標記。診斷抗體本身可含有可偵測標記（例如，螢光分子、生物素等），其係可直接偵測的或經由二級反應（例如，與鏈黴親和素之反應）而為可偵測的。替代地，可使用含有可偵測標記之第二試劑，其中該第二試劑對一級抗體具有結合特異性。在適用於測量生物樣本中之PHF-tau之診斷套組中，該套組之抗體可以預結合至固定相之形式供應，固定相諸如微量滴定盤之孔。

本申請案通篇引用之所有引用的參考文獻（包括文獻參考、公告之專利、公開之專利申請案、及同在審查中之專利申請案）之內容特此以引用方式明確地併入本文中。 實施例

本發明亦提供以下非限制性實施例。

實施例1係一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其在具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或在該胺基酸序列內之tau蛋白表位結合至tau蛋白，其中抗體或其抗原結合片段結合成對螺旋絲(PHF)-tau，較佳的是人類PHF-tau。

實施例1a係一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其在由SEQ ID NO: 1之胺基酸序列組成或在該胺基酸序列內之tau蛋白表位結合至tau蛋白，其中抗體或其抗原結合片段結合成對螺旋絲(PHF)-tau，較佳的是人類PHF-tau。

實施例2係如實施例1或1a所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中： (a) tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化S433或磷酸化S435中之任一者，但不包含磷酸化S433及磷酸化S435； (b) tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之一或多者，但不包含磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之全部； (c) tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化T427及磷酸化S433中之一或多者，但不包含磷酸化S435，且不包含磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之全部；或 (d) tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化T427，但不包含磷酸化S433或磷酸化S435。

實施例3係如實施例1至2中任一者所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中單株抗體或其抗原結合片段包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 4、5及6之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 7、8及9之多肽序列； (b) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及19之多肽序列； (c) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 24、25及26之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 27、18及19之多肽序列； (d) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 32、33及34之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及35之多肽序列；或 (e) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 40、41及42之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及43之多肽序列。

實施例3a係實施例1至3中任一者之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中單株抗體或其抗原結合片段包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別由SEQ ID NO: 4、5及6之多肽序列組成；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別由SEQ ID NO: 7、8及9之多肽序列組成； (b) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別由SEQ ID NO: 14、15及16之多肽序列組成；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別由SEQ ID NO: 17、18及19之多肽序列組成； (c) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別由SEQ ID NO: 24、25及26之多肽序列組成；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別由SEQ ID NO: 27、18及19之多肽序列組成； (d) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別由SEQ ID NO: 32、33及34之多肽序列組成；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別由SEQ ID NO: 17、18及35之多肽序列組成；或 (e) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別由SEQ ID NO: 40、41及42之多肽序列組成；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別由SEQ ID NO: 17、18及43之多肽序列組成。

實施例4係如實施例1至3a中任一者所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有與SEQ ID NO: 2、12、22、30或38至少90%同一之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO: 3、13、23、31或39至少90%同一之多肽序列的輕鏈可變區。

實施例5係如實施例1至4中任一者所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 2、12、22、30或38之多肽序列的重鏈可變區，或具有SEQ ID NO: 3、13、23、31或39之多肽序列的輕鏈可變區。

實施例5a係如實施例1至5中任一者所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含由SEQ ID NO: 2、12、22、30或38中任一者之多肽序列組成的重鏈可變區，或由SEQ ID NO: 3、13、23、31或39中任一者之多肽序列組成的輕鏈可變區。

實施例6係如實施例1至5a中任一者所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 具有SEQ ID NO: 2之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 3之多肽序列的輕鏈可變區； (b) 具有SEQ ID NO: 12之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 13之多肽序列的輕鏈可變區； (c) 具有SEQ ID NO: 22之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 23之多肽序列的輕鏈可變區； (d) 具有SEQ ID NO: 30之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 31之多肽序列的輕鏈可變區；或 (e) 具有SEQ ID NO: 38之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 39之多肽序列的輕鏈可變區。

實施例6a係實施例1至6中任一者之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 由SEQ ID NO: 2之多肽序列組成的重鏈可變區，及由SEQ ID NO: 3之多肽序列組成的輕鏈可變區； (b) 由SEQ ID NO: 12之多肽序列組成的重鏈可變區，及由SEQ ID NO: 13之多肽序列組成的輕鏈可變區； (c) 由SEQ ID NO: 22之多肽序列組成的重鏈可變區，及由SEQ ID NO: 23之多肽序列組成的輕鏈可變區； (d) 由SEQ ID NO: 30之多肽序列組成的重鏈可變區，及由SEQ ID NO: 31之多肽序列組成的輕鏈可變區；或 (e) 由SEQ ID NO: 38之多肽序列組成的重鏈可變區，及由SEQ ID NO: 39之多肽序列組成的輕鏈可變區。

實施例7係實施例1至6a中任一者之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 具有SEQ ID NO: 10之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 11之多肽序列的輕鏈； (b) 具有SEQ ID NO: 20之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 21之多肽序列的輕鏈； (c) 具有SEQ ID NO: 28之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 29之多肽序列的輕鏈； (d) 具有SEQ ID NO: 36之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 37之多肽序列的輕鏈；或 (e) 具有SEQ ID NO: 44之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 45之多肽序列的輕鏈。

實施例7a係如實施例1至7中任一者所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 由SEQ ID NO: 10之多肽序列組成的重鏈，及由SEQ ID NO: 11之多肽序列組成的輕鏈； (b) 由SEQ ID NO: 20之多肽序列組成的重鏈，及由SEQ ID NO: 21之多肽序列組成的輕鏈； (c) 由SEQ ID NO: 28之多肽序列組成的重鏈，及由SEQ ID NO: 29之多肽序列組成的輕鏈； (d) 由SEQ ID NO: 36之多肽序列組成的重鏈，及由SEQ ID NO: 37之多肽序列組成的輕鏈；或 (e) 由SEQ ID NO: 44之多肽序列組成的鏈，及由SEQ ID NO: 45之多肽序列組成的輕鏈。

實施例8係如實施例1至7a中任一者所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 4、5及6之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 7、8及9之多肽序列； (b) 具有SEQ ID NO: 2之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 3之多肽序列的輕鏈可變區；或 (c) 具有SEQ ID NO: 10之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 11之多肽序列的輕鏈。

實施例9係如實施例1至7a中任一者所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及19之多肽序列； (b) 具有SEQ ID NO: 12之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 13之多肽序列的輕鏈可變區；或 (c) 具有SEQ ID NO: 20之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 21之多肽序列的輕鏈。

實施例10係一種單離核酸，其編碼實施例1至9中任一者之單株抗體或其抗原結合片段。

實施例11係一種載體，其包含實施例10之單離核酸。

實施例12係一種宿主細胞，其包含實施例10之單離核酸。

實施例13係一種醫藥組成物，其包含實施例1至9中任一者之單離單株抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。

實施例14係一種阻斷有需要之對象之tau播種之方法，其包含向該對象投予實施例13之醫藥組成物。

實施例15係一種治療有需要之對象之tau蛋白病的方法，其包含向該對象投予實施例13之醫藥組成物。

實施例16係一種減少有需要之對象之病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法，其包含向該對象投予實施例13之醫藥組成物。

實施例17係如實施例15或16所述之方法，其中該tau蛋白病係選自由下列所組成之群組：家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症(Pick’s disease)、進行性皮質下膠質增生(progressive subcortical gliosis)、僅纏結失智症(tangle only dementia)、彌漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵體肌炎、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系統萎縮症、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性泛腦炎、肌強直性營養不良、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、及拳擊手型失智症（拳擊疾病）。

實施例17a係如實施例15至17中任一者所述之方法，其進一步包含向有需要之對象投予用於治療該對象之tau蛋白病的另一劑。

實施例18係一種產生如實施例1至9中任一者所述之單株抗體或其抗原結合片段的方法，其包含在多個條件下培養包含編碼單株抗體或其抗原結合片段之核酸的細胞，以產生單株抗體或其抗原結合片段；及自細胞或細胞培養物回收單株抗體或其抗原結合片段。

實施例19係一種偵測來自對象之生物樣本中PHF-tau之存在的方法，其包含使生物樣本與實施例1至9中任一者之單離單株抗體或其抗原結合片段接觸；及偵測單株抗體或其抗原結合片段與來自對象之樣本中之PHF-tau的結合。

實施例20係如實施例19所述之方法，其中生物樣本係血液、血清、血漿、間隙液、或腦脊髓液樣本。

實施例21係一種產生包含如實施例1至9中任一者所述之單離單株抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物之方法，該方法包含將該單株抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。

實施例22係如實施例1至9中任一者所述之單離單株抗體或抗原結合片段，其用於治療有需要之對象之tau蛋白病。

實施例23係如實施例1至9中任一者所述之單離單株抗體或抗原結合片段、或實施例13之醫藥組成物，其用於治療有需要之對象之tau蛋白病，諸如家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症、進行性皮質下膠質增生、僅纏結失智症、彌漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵體肌炎、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系統萎縮症、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性泛腦炎、肌強直性營養不良、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、或拳擊手型失智症（拳擊疾病）。

實施例24係一種如實施例1至9中任一者所述之單離單株抗體或抗原結合片段之用途，其用於製造治療有需要之對象之tau蛋白病的藥劑。

實施例25係一種如實施例1至9中任一者所述之單離單株抗體或抗原結合片段之用途，其用於製造用於治療有需要之對象之tau蛋白病的藥劑，該tau蛋白病諸如家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症、進行性皮質下膠質增生、僅纏結失智症、彌漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵體肌炎、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系統萎縮症、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性泛腦炎、肌強直性營養不良、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、或拳擊手型失智症(拳擊疾病)。

實施例26係一種藉由偵測來自對象之生物樣本中PHF-tau之存在來診斷對象之tau蛋白病之方法，其包含使生物樣本與如實施例1至9中任一者所述之單離單株抗體或其抗原結合片段接觸；及偵測抗體或抗原結合片段與來自對象之樣本中之PHF-tau的結合。實例

本發明的下列實例是要進一步說明本發明的本質。應理解，以下實例並不限制本發明且本發明之範圍欲由附加之申請專利範圍來判定。實例 1 – 抗體生成

在Tau基因剔除(KO)小鼠中使用標準融合瘤技術生成抗PHF-tau (PT/53、PT/66、PT/69、PT/81)及抗體外聚集之tau抗體(hTau/60) (Kohler及Milstein Nature256:495-7, 1975)。將所獲得融合瘤播種於96孔板中且在10天後在直接ELISA中在25 ng/孔包被之PHF-tau上進行篩選，如下文所述。以用在大腸桿菌( E. Coli)BL21細胞中表現且藉由熱處理及硫酸銨沈澱純化之對照tau (SEQ ID NO: 51)包被的10 ng/孔測試陽性細胞之交叉反應性。發現PT/53、PT/66、PT/69、PT/81及hTau60結合至PHF tau及對照tau (SEQ ID NO: 51)二者。PT/66、PT/69及hTau/60優先用於V-區選殖及人源化。

立即對陽性細胞進行亞選殖且將陽性純系冷凍於液氮中。所有融合瘤皆是在達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle's Medium)中生長，其補充有10%胎牛血清(Hyclone, Europe)、融合瘤融合與選殖補充物(Hybridoma Fusion Cloning Supplement) (2%) (Roche, Brussels, Belgium)、2% HT (Sigma, USA)、1 mM丙酮酸鈉、2 mM L-麩醯胺酸及青黴素(100 U/ml)、及鏈黴素(50 mg/ml)。

將抗體可變區自選擇融合瘤細胞選殖至小鼠IgG1/IgG2/κ背景上，並且使用常規方法表現並純化。簡而言之，在RLT緩衝液（Qiagen目錄號79216）中溶裂融合瘤細胞，並冷凍於-70℃。將溶裂物在37℃下解凍，並且使用RNeasy 96套組（Qiagen目錄號74182）單離RNA。

使用基因特異性反向引子混合物（使用的引子經設計用於與小鼠IgG重鏈、小鼠κ輕鏈、和小鼠λ輕鏈的恆定區黏合(anneal)），使用等分試樣的RNA來合成cDNA。

將等分試樣的cDNA用於PCR反應，其中小鼠引子組設計用於擴增IgG重鏈可變區、κ輕鏈可變區、或λ輕鏈可變區。由多個引子所組成之正向引子係經設計以黏合至架構1，且反向引子係經設計以黏合至恆定區。PCR產物的等分試樣在2%瓊脂糖凝膠上跑膠，並且重鏈和κ之PCR產物顯示出正確尺寸的可見條帶。

使用設計用於與相應恆定區黏合的重鏈或κ輕鏈反向引子對重鏈和κ輕鏈PCR產物進行定序（Sanger方法）。將序列分析並比對，以識別最接近匹配的小鼠生殖系。使用匹配的生殖系序列替換重鏈和κ鏈架構1序列的前十個胺基酸。對IgG重鏈和κ可變區胺基酸序列進行密碼子最佳化和合成。合成密碼子最佳化的IgG重鏈和κ輕鏈可變區，並將片段選殖到小鼠IgG2a同型重鏈和κ輕鏈同型表現載體中。

將抗體可變區自選定的融合瘤細胞選殖，使用標準方法定序，並且次選殖到針對mAb和Fab的表現載體中。Mab在小鼠IgG2a/κ背景上製備並表現，且藉由親和力層析法（蛋白質A）純化。Fab係經製備為嵌合型式，具有融合至人類IgG1/κ恆定域的小鼠可變域及在重鏈的C端處的His標籤。Fab在HEK293F細胞中暫時表現並且藉由親和力層析法(HisTrap)純化。實例 2 – 抗體表徵 ELISA及西方墨點

藉由ELISA分析與重組WT (2N4R) tau之結合。將全長Tau蛋白(1 ng/mL或10 ng/mL)直接包被至板且與不同濃度之重組產生或融合瘤產生之PT/66、PT/69或hTau/60抗體一起培養(圖1)。如預期，Tau之較低塗佈濃度產生較低之最大值。在重組和融合瘤產生的抗體的結合曲線之間未觀察到實質差異。

藉由評估抗體與來自不同物種（小鼠、狗、猴、及人類）之腦樣本中之tau的結合來實施抗體之進一步剖析。對於人類tau，區分可溶性Tau（來自非AD人類腦之熱穩定提取物）與聚集之PHF Tau (來自人類AD腦之月桂醯基肌胺酸鈉(sarcosyl)不溶性製劑)。為能夠偵測與非Tau相關蛋白之較低親和相互作用，在1 µg/mL下測試抗體，且將相對較高量之腦均質物（20 µg總蛋白）加載於凝膠上。該等特性之綜述顯示於圖2中。藉由表面電漿共振 (SPR)進行之結合評定

藉由ProteOn (Bio-Rad, Hercules, CA)儀器上之SPR評定PT66、PT69、hTau60抗tau抗體及其相應Fab片段與PHF-tau及重組tau之相互作用。由於PHF-tau與多個表位複製物之多聚/聚集本質及IgG之二價本質，在此研究形式中mAb親和力受到結合性影響。Fab親和力提供關於抗體固有親和力之資訊。mAb及其Fab片段與PHF Tau結合之代表性感測圖顯示於圖3中且匯總表示於下表1中。使用HT7作為參考。表 1.hTau60、PT66、PT69及其Fab片段與PHF及重組Tau之SPR結合親和力

	PHF-tau	Rec. Tau
抗體名稱	mAb K _D(pM)*	Fab K _D(pM)	Fab K _D(pM)
HT7 (參考mAb)	291	n.a	n.a
hTau60 (PT1B469)	69	427	26
PT66 (PT1B545)	56	514	40
PT69 (PT1B548)	102	437	69

*因IgG之二價本質及PHF-tau之多聚體/聚集本質，所報告親和力應處理為表觀親和力 n.a =不可得(not available) Rec. =重組使用 IHC之抗體剖析

對AD及非AD腦之冷凍切片實施免疫組織化學分析以確認與原位生理學及藥理生理學tau之反應性。PT66、PT69/PT87及hTau60顯示與可溶性tau (非AD及AD腦)及聚集tau (AD腦)二者之強烈結合(圖4)。對來自WT、Tau基因剔除(KO)、及P301S (5個月)小鼠腦之福馬林固定石蠟包埋之組織實施額外IHC分析。來自Tau KO小鼠之腦切片中信號之缺乏確認抗體之特異性。在來自WT及P301S小鼠之切片中偵測到非聚集tau，同時亦藉由PT/66、PT/69及hTau/60對P301S小鼠之腦幹中之聚集tau染色(圖5)。實例 3 – 細胞檢定中之功能測試

在免疫耗竭檢定中測試PT/66、PT/69及hTau/60之tau播種之抑制，該免疫耗竭檢定利用表現兩個帶發色團標籤之K18 tau片段之HEK細胞，該兩個片段在因聚集而緊密靠近時生成信號。當用衍生自不同來源之聚集且磷酸化的全長tau之種子處理細胞時，K18聚集物經誘導，此可藉由使用螢光活化細胞分選(FACS)計數螢光共振能量轉移(FRET)陽性細胞來量化(Holmes等人，2014, PNAS. 111(41): E4376-85)。藉由hTau60/hTau60自身夾心MSD檢定進行經免疫耗竭之樣本之生物化學分析。

為研究最大抑制百分比值係與種子上之表位密度相關抑或與含有PT/66、PT/69及hTau/60表位之種子數目相關，實施免疫耗竭檢定。將AD tau種子與測試抗體一起培養，且將其自具有蛋白G珠粒之溶液中移除。測試經耗竭上清液之在含有發色團-K18之HEK細胞中的剩餘播種能力，且如先前所述藉由FACS進行分析(Holmes等人， PNAS. 111(41):E4376-85, 2014)。

用於免疫耗竭之含有tau種子之均質物係由來自22至23週大的P301S轉基因動物之脊髓或由經凍存之人類AD腦組織生成。在人類AD腦免疫耗竭檢定中，在轉染試劑Lipofectamine2000之存在下測試耗竭後之上清液，以獲得可接受之檢定窗口。在來自人類AD腦之總均質物中及在來自P301S轉基因小鼠之脊髓均質物中，使用C端抗體可完全減少tau播種(及hTau60/hTau60聚集信號)，但使用N端抗體PT93不能(其已描述於Vandermeeren等人， J Alzheimers Dis,2018; 65(1):265-281中，該文獻之相關內容以引用方式併入本文中) (＞ 95%抑制；圖6A至圖6B及表2，顯示與陰性對照相比之抑制%，至少2次獨立實驗之平均值)。表 2.細胞檢定中之免疫耗竭

抗體	濃度(nM)	免疫耗竭FRET生物感測器細胞_AD池	免疫耗竭FRET生物感測器細胞_P301S脊髓
PT66	3	38.6 ± 4.8	46.5 ± 4.5
	300	98.6 ± 0.6	99.7 ± 0.2
PT69	3	40.3 ± 4.2	45.8 ± 24.1
	300	97.9 ± 1.6	99.8 ± 0.1
hTau60	3	17.7 ± 6.7	22 ± 13.7
	300	97.2 ± 1.1	99.7 ± 0.05
PT26	3	47.6 ± 5.9	79.1 ± 2.1
	300	80.4 ± 2.1	99.5 ± 0.2

在單獨實驗中顯示，在順序免疫耗竭檢定中，在使用N端抗體PT93之初始免疫耗竭後，C端抗體hTau60進一步使所有剩餘PHF聚集物耗竭，而使用PT93或PT51 (HT7樣)分別觀察到無進一步耗竭或一定的進一步耗竭(其描述於Vandermeeren等人， J Alzheimers Dis,2018; 65(1):265-281中，該文獻之相關內容以引用方式併入本文中) (圖6C)。

tau抗體療法之作用機制仍是爭論之話題，且已提出多種機制。最近已表明藉由小神經膠細胞之細胞外種子的抗體媒介之清除為一種主導的作用機制(Funk等人， J Biol Chem. 290(35):21652-62, 2015以及McEwan等人，2017, PNAS 114:574-9）。在此上下文中，人腦衍生之播種材料的免疫耗竭可視為大部分轉譯細胞結果，且在此種類型之細胞檢定中C端抗體PT66、PT68/PT87及hTau60之高功效表明該等抗體之HFA版本將係有效治療劑。實例 4 – PT/66 、 PT/69 及 hTau/60 在 ePHF 注射模型中之活體內功效引言

為評估活體內tau抗體功效，展示腦tau病理之小鼠是必要的模型系統(Julien等人， Methods Mol Biol. 849:473-91, 2012)。已描述該等模型中的若干種，且其大致上可分成三組：1)過表現WT或突變體(例如，P301L或P301S) tau之tau轉基因小鼠，其中該等突變體在5至9個月之後展現出嚴重病理，此取決於品系(Allen等人， J Neurosci. 22(21):9340-51, 2002；Scattoni等人， Behav Brain Res. 208(1):250-7, 2010；Terwel等人， J Biol Chem. 280(5):3963-73, 2005；Yoshiyama等人， Neuron. 53(3):337-51, 2007)；具有以下之時空調控性表現之小鼠：突變tau (例如P301L) (Liu等人，Brain Imaging Behav. 6(4):610-20, 2012)或促聚集片段(例如K18) (Mocanu等人， J Neurosci. 28(3):737-48, 2008)；以及3)具有突變tau及APP兩者之表現且展示斑塊及tau病理兩者之小鼠(Oddo等人， J Neurochem. 102(4):1053-63, 2007)。

雖然表現突變tau之小鼠發展嚴重病理，但是病理發作在動物之間可能有所不同，造成研究的可變性，且細胞自發性tau聚集及蔓延對總體tau聚集信號之相對貢獻並不清楚。因此，可用於有效地研究tau播種及蔓延之模型(例如，de Calignon等人，2012, Neuron. 73(4):685-97, 2012；Liu等人， Id.)具有高價值。此類模型之轉譯值係藉由以下發現進一步加強：用衍生自不同tau蛋白病之腦均質物注射ALZ17小鼠（表現正常人類tau之品系）誘導具有類似於人腦中之tau蛋白病之形態的tau內含物之形成。例如，用來自嗜銀顆粒病樣本的物質注射小鼠產生具有疾病本身之球狀體或逗號狀結構特徵之沉積物，且在用AD物質注射之小鼠中觀測到類AD之tau病理(Clavaguera等人，2013, PNAS 110(23):9535-40)。

因此，已建立轉基因P301L小鼠注射模型，其中將tau之促聚集片段(諸如合成K18原纖維(Li及Lee， Biochemistry. 45(51):15692-701, 2006）或衍生自人類AD腦之PFH-tau種子）注射在細胞自發性聚集尚未開始之年齡的P301L轉基因小鼠模型之皮質或海馬迴區域中。注射模型旨在模擬tau蔓延之重要細胞外播種組分。所注射之K18或PHF-tau種子在注射部位且在較小程度上在連接的對側區域處誘導tau蛋白病(Peeraer等人， Neurobiol Dis. 73:83-95, 2015)。當與AD腦衍生之PHF-tau種子或K18原纖維共注射時，該模型使測試抗體(諸如本發明之抗tau抗體)之抗播種潛力成為可能(Iba等人，2015, J Neurosci. 33(3):1024-37, 2013；Iba等人， Acta Neuropathol. 130(3):349-62)。

簡言之，皮質注射死後AD腦之十二烷基肌胺酸鈉不溶性流份引發tau聚集之緩慢進行性增加。在經注射半球中，在注射之後1個月測量第一信號，且其在注射之後3個月進一步進展。在注射之後五個月，一些動物開始形成由P301L突變所驅動之纏結(Terwel等人，2005, Id.)。AT8染色水準在1個月與3個月之間增加（美國專利第10,766,953號），因此在共注射後2個月分析抗體功效實驗。另外，海馬迴注射死後AD腦之十二烷基肌胺酸鈉不溶性流份引起tau聚集之劑量依賴性進行性增加，這係藉由對來自經注射半球之十二烷基肌胺酸鈉不溶性流份所進行之MesoScale Discoveries (MSD)分析來測量。動物處理及顱內注射

對於注射研究，將表現具有P301L突變之最長人類tau異構體(tau-4R/2N-P301L)之轉基因tau-P301L小鼠(Terwel等人，2005, Id.)在3個月大時用於手術。按照當地倫理委員會所核准之規程執行所有實驗。對於立體定位手術，小鼠在單株抗體存在或不存在下，在海馬迴(AP -2.0，ML +2.0 (來自前囟)、DV 1.8 mm (來自硬腦膜))中接收3 µl (速度0.25 µl/min)來自死後AD組織之十二烷基肌胺酸鈉不溶性製劑(富集成對螺旋絲，ePHF)之單側(右半球)注射。將小鼠殺死用於解剖(在顱內注射後2個月)。提取程序

將來自經注射半球之小鼠組織稱重，且在6個體積的均質化緩衝液(10 mM Tris HCl (pH7.6)中均質化。0.8 M NaCl；10% w/v蔗糖；1 mM EGTA；PhosStop磷酸酶抑制劑混合劑；完全無EDTA微小蛋白酶抑制劑)。將均質物在28,000 × g下離心20分鐘，且在自所得上清液(總均質物)獲取等分試樣之後，添加1% N-十二烷基肌胺酸。在90分鐘(900 rpm，37℃)之後，將溶液在184,000 × g下再次離心1小時。將上清液保持為十二烷基肌胺酸鈉可溶性流份，而將含有十二烷基肌胺酸鈉不溶性物質之團塊再懸浮於均質化緩衝液中。生化分析

將塗佈抗體(AT8)稀釋於PBS (1 µg/ml)中且等分至多個MSD板（30 µL/孔）(L15XA, Mesoscale Discoveries)中，將該等板在4℃下培養過夜。在用5 × 200 µl之PBS/0.5%Tween-20洗滌後，用PBS中之0.1%酪蛋白封閉板且再用5 × 200 µl之PBS/0.5%Tween-20洗滌。加入樣本和標準品（均稀釋在0.1%酪蛋白之PBS液中）後，將該等盤在4℃培育過夜。隨後，用5 × 200 µl的PBS/0.5% Tween-20洗滌該等盤，且添加在0.1%於PBS中之酪蛋白中的SULFO-TAG™共軛偵測抗體(AT8)，且在室溫下培育2小時以600 rpm振盪。在最終洗滌(5 × 200 µl PBS/0.5%Tween-20)之後，添加150 µl 2 X緩衝液T，且用MSD成像器讀取盤。將原始信號針對標準曲線正規化，該標準曲線係由來自死後AD腦之十二烷基肌胺酸鈉不溶性製劑(ePHF)之16個稀釋液組成，且將該等信號表示為任意單位(AU) ePHF。用GraphPad prism軟體執行統計學分析(用Bonferroni事後檢驗之ANOVA)。結果

已在此共注射模型中評估若干種內部抗Tau抗體(參見例如美國專利第10,766,953號及Vandermeeren等人，J. Alzheimers Dis. 65(1):265-81, 2018)；根據下表3比較該等抗體（重組表現為IgG2a）在海馬迴共注射模型下之活性。Tau抗體之共注射減弱P301L小鼠中ePHF誘導之tau聚集(圖7A)。AT120描述於Vandermeeren等人， J Alzheimers Dis,2018; 65(1):265-281中，該文獻之相關內容以引用方式併入本文中，且其結合至Tau之富含脯胺酸之結構域(PRD)。PT/76描述於Vandermeeren等人， J Alzheimers Dis,2018; 65(1):265-281中，該文獻之相關內容以引用方式併入本文中，且其緊密結合至tau中之微管結合結構域(MTBD)。表 3.ePHF共注射組

組	表位	皮莫耳 ePHF	皮莫耳 Ab	n
IgG	非Tau	0.6	4.5	15
AT120	PRD	0.6	4.5	15
hTau/60	C-端	0.6	4.5	15
PT/69	C-端	0.6	4.5	15
PT/53	C-端	0.6	4.5	14
PT/76	MTBD	0.6	4.5	15

數據匯總於表4中。表 4.共注射研究之結果之匯總

抗體	表位	相對於對照之抑制%	P-值*
AT120	mid-端	82	＜ 0001
PT/76	MTBD	86	＜ 0001
PT/53	C-端	73	＜ 0001
PT/69	C-端	92	＜ 0001
hTau/60	C-端	75	＜ 0001

*使用Bonferroni校正進行多重測試之單因子ANOVA。

在單獨實驗中，比較海馬迴共注射小鼠模型中C端抗體PT66及PT81之活性與結合至PHF Tau之N端部分及中間部分之內部Janssen抗tau抗體的活性。將抗體與ePHF tau (0.6皮莫耳)共注射至皮質中。C端抗體之共注射對P301L小鼠中ePHF誘導之tau聚集之減弱顯著大於其他抗體（圖7B）。

在隨訪研究中，在顱內共注射抗體+PHF後在各抗體之外周給藥(20 mg/kg；2×/週)時比較PT66、hTau60及PT3之功效(參見US 10,633,435，其內容以引用方式併入本文中)。外周給藥開始於顱內注射PHF前2週且在實驗之生命期中持續。與第一項研究同一，PT66、hTau60及PT3中之各者之共投與減少ePHF誘導之聚集信號且抑制ePHF誘導之播種(圖7C)。實例 5– C 端抗體之表位定位材料及方法。 陣列肽之合成

為重建標靶分子之表位，合成涵蓋Tau 441序列之肽(具有18個胺基酸重疊之20聚體)文庫。藉由接枝專有親水性聚合物調配物、然後使用二環己基碳化二亞胺(DCC)與N-羥基苯并三唑(HOBt)與第三丁氧基羰基-六亞甲基二胺(BocHMDA)反應、且隨後使用三氟乙酸(TFA)裂解Boc基來獲得胺基官能化聚丙烯支撐物。使用標準Fmoc-肽合成藉由定制之經修改JANUS液體處理站(Perkin Elmer)在胺基官能化固體支撐物上合成肽。使用Scaffolds上之Pepscan專有化學連接肽(CLIPS)技術來合成結構模擬物。CLIPS技術允許肽結構化成單環、雙環、三環、片樣折疊、螺旋樣折疊、及其組合。CLIPS模板偶合至半胱胺酸殘基。肽中多個半胱胺酸之側鏈偶合至一或兩個CLIPS模板。舉例而言，將0.5 mM P2 CLIPS (2,6-雙(溴甲基)吡啶)溶液溶解於碳酸氫銨(20 mM, pH 7.8)/乙腈(1:3(v/v))中。將此溶液添加至肽陣列上。CLIPS模板將結合至如存在於肽陣列(具有3 µl孔之455孔板)之固相結合肽中的兩個半胱胺酸之側鏈。將肽陣列在溶液中輕輕振蕩30至60分鐘，同時完全覆蓋於溶液中。最後，用過量H ₂O充分洗滌肽陣列，且在70℃下在含有PBS (pH 7.2)中之1% SDS/0.1% β-巰基乙醇的破裂緩衝液中進行超音波處理30分鐘，然後在H ₂O中再超音波處理45分鐘。攜帶T3 CLIPS之肽係以類似方式製造，但現具有三個半胱胺酸。 Elisa 篩選

在基於pepscan之ELISA中測試抗體(重組表現為IgG2a)與各合成肽之結合。將肽陣列與一級抗體溶液一起培養(在4℃下過夜)。洗滌後，將肽陣列與適當抗體過氧化物酶共軛物(SBA；表4)之1/1000稀釋液在25℃下一起培育1小時。洗滌後，加入過氧化物酶基質2,2’-次偶氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸鹽(ABTS)和20 µl/ml的百分之3的22。1小時後，量測顯色。用電荷耦合裝置(CCD)相機及影像處理系統量化顯色。結果

數據顯示五種相關抗體PT/66、PT/53、hTau60、PT/81及PT/69與自1開始直至殘基441之一系列肽的結合（圖8）。為便於解釋，僅顯示前2種N端肽及自411直至441之一系列肽。對於該等抗體，未觀察到與其他Tau肽之結合（即Tau上之其他位置）。詳細定位顯示於下表5中。表 5.表位定位

抗體	表位	SEQ ID NO:	耐受磷酸	不耐受磷酸
hTau60	431EVSASLAKQG440	52	S433, S435	S433+S435
PT50/PT53	426ATLADEVSASLAK438	53	T427, S433	S435, T427+S433+S435
PT66	426ATLADEVSASL436	54	T427, S433, S435	T427+S433+S435
PT69/PT87	422SPQLATLADEVSASLAK438	55	T427, S433	S435, T427+S433+S435
PT81	428LADEVSASL436	56	T427	S433, S435, T427+S433+S435

實例 6 – 表位處理

儘管不希望受限於理論，人們認為，C端抗體（諸如PT66）改良之功效、及N端抗體較低之功效可藉由廣泛處理PHF-tau N端之表位來解釋。此係基於藉由用西方墨點篩選分析人類AD腦源性PHF樣本獲得之西方墨點特性（圖9）。在此實驗中，將大量樣本加載於1孔凝膠上。使用墨點後，將個別長條與一組結合至不同表位之抗tau mAb一起培養。將泳道10、21及24之長條與C端tau mAb一起培養，其顯示較低分子量條帶之廣泛染色。相比之下，將泳道13、18及20之長條與C端tau mAb一起培養，其不顯示較低分子量條帶之廣泛染色。進一步合理化描述於(Vandermeeren等人，2018, J Alzheimers Dis,2018; 65(1):265-281)中。

雖然本發明之實施例已參照其特定實施例詳加說明，而在未悖離本發明之精神與範疇下可於其中進行各種變更與修改，此對於所屬技術領域中具有通常知識者而言將係顯而易見。序列

SEQ ID NO:	描述	序列
1	Tau表位 (aa422-438)	SPQLATLADEVSASLAK
2	hTau60 VH	EVQLQQSGPELVKPGTSVKISCKVFGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPDNGETTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAKGATFVYWGQGTLVTVSA
3	hTau60 VL	DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCISSQSLVHSTGTTFLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGFYFCSQSTYFPLTFGSGTKLEIK
4	hTau60 HCDR1	GYTFTDYYMN
5	hTau60 HCDR2	DINPDNGETTYNQKFKG
6	hTau60 HCDR3	GATFVY
7	hTau60 LCDR1	ISSQSLVHSTGTTFLH
8	hTau60 LCDR2	KVSNRFS
9	hTau60 LCDR3	SQSTYFPLT
10	hTau60 HC	EVQLQQSGPELVKPGTSVKISCKVFGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPDNGETTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAKGATFVYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
11	hTau60 LC	DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCISSQSLVHSTGTTFLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGFYFCSQSTYFPLTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
12	PT/66 VH	QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWITWVKQRPGQGLEWIGDIHPGRGSTKSNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCARRWGFDYWGQGTTLTVSS
13	PT/66 VL	DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGAGTKLELK
14	PT/66 HCDR1	GYTFTSYWIT
15	PT/66 HCDR2	DIHPGRGSTKSNEKFKS
16	PT/66 HCDR3	RWGFDY
17	PT/66 LCDR1	RSSKSLLYKDGKTYLN
18	PT/66 LCDR2	LMSTRAS
19	PT/66 LCDR3	QQLVDYPLT
20	PT/66 HC	QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWITWVKQRPGQGLEWIGDIHPGRGSTKSNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCARRWGFDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
21	PT/66 LC	DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
22	PT/69 VH	QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGRTKSNEKFKNKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRRWGLDYWGQGTTLTVSS
23	PT/69 VL	DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSNKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGAGTKLELK
24	PT/69 HCDR1	GYTFTNYWIT
25	PT/69 HCDR2	DIYPGSGRTKSNEKFKN
26	PT/69 HCDR3	RWGLDY
27	PT/69 LCDR1	RSNKSLLYKDGKTYLN
18	PT/69 LCDR2	LMSTRAS
19	PT/69 LCDR3	QQLVDYPLT
28	PT/69 HC	QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGRTKSNEKFKNKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRRWGLDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
29	PT/69 LC	DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSNKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
30	PT/53 VH	EVKLMESGGGLVQPGASLRLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKAPEWLALIRNKANGYTTKYAASVKGRFTISRDNSQNILYLQMNTLRAEDSATYYCVKAVWFAYWGQGTLVTVSA
31	PT/53 VL	DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCLQLVEYPYTFGGGTKLEIK
32	PT/53 HCDR1	GFTFTDYYMS
33	PT/53 HCDR2	LIRNKANGYTTKYAASVKG
34	PT/53 HCDR3	AVWFAY
17	PT/53 LCDR1	RSSKSLLYKDGKTYLN
18	PT/53 LCDR2	LMSTRAS
35	PT/53 LCDR3	LQLVEYPYT
36	PT/53 HC	EVKLMESGGGLVQPGASLRLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKAPEWLALIRNKANGYTTKYAASVKGRFTISRDNSQNILYLQMNTLRAEDSATYYCVKAVWFAYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
37	PT/53 LC	DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCLQLVEYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
38	PT/81 VH	QVQLQQPGAELVRPGASVILSCKASGYTFTNSWIHWVKQRPGRVLEWIGRIDPNSGGTRYNENFKSKATLTVDKPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCSRGVLHDYWGQGTTLTVSS
39	PT/81 VL	DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSVSGSGTDFTLEISRVQAEDVGVYYCQQLVEYPYTFGGGTKLEIK
40	PT/81 HCDR1	GYTFTNSWIH
41	PT/81 HCDR2	RIDPNSGGTRYNENFKS
42	PT/81 HCDR3	GVLHDY
17	PT/81 LCDR1	RSSKSLLYKDGKTYLN
18	PT/81 LCDR2	LMSTRAS
43	PT/81 LCDR3	QQLVEYPYT
44	PT/81 HC	QVQLQQPGAELVRPGASVILSCKASGYTFTNSWIHWVKQRPGRVLEWIGRIDPNSGGTRYNENFKSKATLTVDKPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCSRGVLHDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
45	PT/81 LC	DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSVSGSGTDFTLEISRVQAEDVGVYYCQQLVEYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
46	Tau異構體0N3R	MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL
47	Tau異構體1N3R	MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL
48	Tau異構體2N3R	MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL
49	Tau異構體0N4R	MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL
50	Tau異構體1N4R	MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL
51	Tau異構體2N4R	MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL

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無

前述發明內容以及下文實施方式在結合附圖閱讀時可更有利理解。應理解的是，本發明並不受限於圖式中所示確切實施例。〔圖 1 〕顯示藉由ELISA分析之重組表現之PT66、PT69/PT87、hTau60與重組2N4R tau的結合。〔圖 2 〕顯示（自左至右）：WT（槽1）及Tau -/-（槽2）小鼠腦、狗腦（槽3）、猴腦（槽4）、及人類腦（槽5）之腦提取物、及衍生自死後AD腦之PHF製劑（槽6）上的PT66、hTau60及PT69/PT87之西方墨點(western blot)特性。〔圖 3 〕顯示PT66、hTau60及PT69/PT87單株抗體(mAb)與PHF-Tau及其各別Fab片段與PHF-Tau及重組Tau的代表性SPR結合資料。針對PHF-Tau及全長rec. Tau蛋白之抗tau抗體及其相應Fab片段之SPR結合感測圖。各感測圖內之各別軌跡代表所注射抗體或Fab之不同濃度。個別軌跡自頂部至底部對應於75 nM、15 nM、3 nM、0.6 nM及0.12 nM。對於HT7，頂部軌跡(濃度)係15 nM。黑色實線指示使用二價分析物模型(對於使用PHF-Tau之mAb)或1:1朗繆爾模型(Langmuir model，對於使用PHF-Tau及重組Tau之Fab)擬合之全局動力學。對於HT7，Fab片段係不可得的。〔圖 4 〕顯示PT66、hTau60及PT69/PT87之AD及非AD腦之冷凍切片上之結合資料。〔圖 5 〕顯示PT66、hTau60及PT69/PT87之IHC剖析資料。呈現來自WT、Tau -/-及P301S小鼠之石蠟切片上之結合。〔圖 6A 〕顯示免疫耗竭檢定之示意圖。〔圖 6B 〕顯示所測試抗體(hTau60、PT69、PT66及衍生自人類AD腦組織(正方形)及P301S脊髓(三角形)的內部N-端結合tau mAb (PT26) tau種子)之免疫耗竭檢定之結果。PT66、hTau60及PT69/PT87比N-端抗體更有效地抑制tau播種，如使用FRET檢定所判定。亦使用hTau60/hTau60 tau聚集物特異性MSD檢定(圓形)分析來自人類AD腦均質物之經免疫耗竭之部分。〔圖 6C 〕顯示順序免疫耗竭(ID)檢定之結果，其中使用抗體PT93 (靶向Tau之N端部分)、PT51 (HT7樣抗體)及hTau60 (靶向Tau之C端部分)中之各者或不使用任何抗體(無mAb)實施第一輪免疫耗竭檢定(ID1)，且使用與針對ID1所用相同或不同之抗體實施第二輪免疫耗竭檢定(ID2)。顯示，使用與針對ID1所用相同之抗體的ID2並不使其他聚集物耗竭，且在使用PT93之ID1後，使用PT51（HT7樣）及hTau60 (C-端)之ID2產生Tau聚集物之額外耗竭且hTau60使所有剩餘聚集物耗竭。〔圖 7A 〕顯示在ePHF注射模型（參見例如美國專利第10,766,953號）中，與Tau PHF及測試抗體共同注射之AT120、PT/76及PT53抗體相比，hTau60及PT69/PT87之功效。*** P＜0.0001 Bonferroni多重比較。〔圖 7B 〕顯示在ePHF注射模型中，與結合至Tau之N端(N-端)或中間(Mid)部分中之其他表位的抗體相比，結合至C端PHF-tau (C-端) PT81及PT66之抗體之功效。C端抗體顯示活體內tau播種之強烈減少。〔圖 7C 〕顯示，C端抗體(PT66及hTau60)及PT3在 i.p.給藥後皆保留活體內活性。向小鼠注射20 mg/kg抗體2x/週。〔圖 8 〕顯示使用內部C端抗體之線性肽定位之表位定位資料。〔圖 9 〕顯示，N端抗體之較低功效可藉由在PHF-tau之N端進行更廣泛的處理來解釋：在分析PHF-tau之西方印跡篩選中比較C端PHF-tau抗體PT66及hTau60 (C-端)與N端PHF-tau抗體(PT93)。

Claims

一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其在由SEQ ID NO: 1之胺基酸序列組成或在該胺基酸序列內之tau蛋白之表位結合至該tau蛋白，其中該抗體或其抗原結合片段結合成對螺旋絲(paired helical filament, PHF)-tau，較佳的是人類PHF-tau。
如請求項1所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中： (a) 該tau蛋白之該表位包含該tau蛋白之磷酸化S433或磷酸化S435中之任一者，但不包含磷酸化S433及磷酸化S435； (b) 該tau蛋白之該表位包含該tau蛋白之磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之一或多者，但不包含磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之全部； (c) 該tau蛋白之該表位包含該tau蛋白之磷酸化T427及磷酸化S433中之一或多者，但不包含磷酸化S435，且不包含磷酸化T427、磷酸化S433及磷酸化S435中之全部；或 (d) 該tau蛋白之該表位包含該tau蛋白之磷酸化T427，但不包含磷酸化S433或磷酸化S435。
如請求項1或2所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 4、5及6之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 7、8及9之多肽序列； (b) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及19之多肽序列； (c) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 24、25及26之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 27、18及19之多肽序列； (d) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 32、33及34之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及35之多肽序列；或 (e) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 40、41及42之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及43之多肽序列。
如請求項1至3中任一項所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 2、12、22、30或38至少90%同一(identical)之多肽序列；或輕鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 3、13、23、31或39至少90%同一之多肽序列。
如請求項1至4中任一項所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其具有SEQ ID NO: 2、12、22、30或38之多肽序列；或輕鏈可變區，其具有SEQ ID NO: 3、13、23、31或39之多肽序列。
如請求項1至5中任一項所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 具有SEQ ID NO: 2之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 3之多肽序列的輕鏈可變區； (b) 具有SEQ ID NO: 12之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 13之多肽序列的輕鏈可變區； (c) 具有SEQ ID NO: 22之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 23之多肽序列的輕鏈可變區； (d) 具有SEQ ID NO: 30之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 31之多肽序列的輕鏈可變區；或 (e) 具有SEQ ID NO: 38之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 39之多肽序列的輕鏈可變區。
如請求項1至6中任一項所述之單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 具有SEQ ID NO: 10之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 11之多肽序列的輕鏈； (b) 具有SEQ ID NO: 20之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 21之多肽序列的輕鏈； (c) 具有SEQ ID NO: 28之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 29之多肽序列的輕鏈； (d) 具有SEQ ID NO: 36之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 37之多肽序列的輕鏈；或 (e) 具有SEQ ID NO: 44之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 45之多肽序列的輕鏈。
一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 4、5及6之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 7、8及9之多肽序列； (b) 具有SEQ ID NO: 2之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 3之多肽序列的輕鏈可變區；或 (c) 具有SEQ ID NO: 10之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 11之多肽序列的輕鏈。
一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 免疫球蛋白重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之多肽序列；及免疫球蛋白輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別具有SEQ ID NO: 17、18及19之多肽序列； (b) 具有SEQ ID NO: 12之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO: 13之多肽序列的輕鏈可變區；或 (c) 具有SEQ ID NO: 20之多肽序列的重鏈，及具有SEQ ID NO: 21之多肽序列的輕鏈。
一種單離核酸，其編碼如請求項1至9中任一項所述之單離單株抗體或其抗原結合片段。
一種載體，其包含如請求項10所述之單離核酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項10所述之單離核酸。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至9中任一項所述之單離單株抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
一種阻斷有需要之對象之tau播種(seeding)之方法，其包含向該對象投予如請求項13所述之醫藥組成物。
一種治療有需要之對象之tau蛋白病(tauopathy)之方法，其包含向該對象投予如請求項13所述之醫藥組成物。
一種減少有需要之對象之病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延之方法，其包含向該對象投予如請求項13所述之醫藥組成物。
如請求項15或16所述之方法，其中該tau蛋白病係選自由以下組成之群組：家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症(Pick’s disease)、進行性皮質下膠質增生(progressive subcortical gliosis)、僅纏結失智症(tangle only dementia)、彌漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵體肌炎、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系統萎縮症、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性泛腦炎、肌強直性營養不良、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、及拳擊手型失智症（拳擊疾病）。
一種產生如請求項1至9中任一項所述之單離單株抗體或其抗原結合片段的方法，其包含：在產生該單株抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼該單株抗體或其抗原結合片段之核酸的細胞，及自該細胞或細胞培養物回收該單株抗體或其抗原結合片段。
一種偵測來自對象之生物樣本中PHF-tau之存在的方法，其包含使該生物樣本與如請求項1至9中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段接觸；及偵測該單株抗體或其抗原結合片段與來自該對象之該樣本中PHF-tau的結合。
如請求項19所述之方法，其中該生物樣本係血液、血清、血漿、組織間隙液、或腦脊髓液樣本。