TW202204413A - 用於血腦障壁遞送之組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

描述單株抗TfR抗體及其抗原結合片段，其用於將劑遞送至有需要之對象的腦部。亦描述接合物及融合建構體，其含有偶合至治療劑或診斷劑（諸如第二抗體及其抗原結合片段）之抗TfR抗體或其抗原結合片段，其用於治療或偵測神經病症及/或將治療劑或診斷劑遞送跨過血腦障壁。亦描述編碼該抗體、接合物、及融合建構體之核酸及相關之重組宿主細胞。

Description

用於血腦障壁遞送之組成物及方法
本發明關於一種結合至轉鐵蛋白受體(TfR)之血腦障壁穿梭劑(blood-brain barrier shuttle)及其使用方法。
雖然血腦障壁(BBB)防止有害物質進入腦部且對於腦內恆定(brain homeostasis)是不可或缺的，其也會對於將藥物有效率遞送至腦部造成難以克服的障礙。大分子（諸如單株抗體及其他生物治療劑）對於治療/偵測中樞神經系統(CNS)中之病理學具有相當大的治療/診斷潛力。然而，其等進入腦部之途徑受到BBB阻礙。先前研究已說明，注射在血流中之IgG只有極小百分比（大約0.1%）能夠穿透BBB進入CNS隔室(Felgenhauer,Klin. Wschr . 52: 1158-1164, 1974))。由於抗體在CNS內之低濃度，這將會限制任何藥理作用。
已研究許多方法以改善治療性單株抗體(mAb)之腦部遞送，包括受體介導之胞吞轉送(RMT)的使用。RMT利用BBB內腔側上大量表現之受體以輸送通過腦部內皮細胞。產生用於將治療性mAb遞送至腦部中之臨床上可行平台的先前努力已著重在抗體工程改造，以提高胞吞轉送之效率，並透過對於結合價、pH依賴性、及親和力之觀察而獲得進展（綜述於Goulatis et al., 2017,Curr Opin Struct Biol 45: 109-115中）。然而，轉用於NHP及臨床上已受到下列限制：由於目標介導之藥物動向(target-mediated drug disposition, TMDD)所致之快速末梢清除及由於急性網狀紅血球耗盡所致之安全性(Gadkar, 2016, Eur J Pharm Biopharm. 2016 Apr; 101:53-61)。轉鐵蛋白受體(TfR)（尤其是TfR1）介導裝載鐵之轉鐵蛋白(Tf)自血液輸送至腦部及耗盡鐵之Tf返回血液(Kawabata,Free Radical Biology & Medicine, 133, 46–54, 2019)。已將抗TfR1單株抗體用於將藥物遞送至腦部(Burkhart, et al.Progress in neurobiology, 181, 101665, 2019)。然而，抗TfR1單株抗體之安全性阻礙及藥物動力學(PK)不佳已妨礙其作為BBB載劑之臨床發展。
因此，需要一種抗TfR單株抗體或其抗原結合片段，其可用於將藥物有效率穿梭進入腦部且其安全性及PK經改善。
本申請案關於一種用於腦部遞送之經最佳化平台，其不僅考量所遞送之劑（諸如治療性單株抗體(mAb)）的腦部濃度，亦考量mAb之治療相關特性（包括mAb之末梢藥物動力學、安全性、及藥效動力學）。平台採用TfR結合分子，尤其是結合至轉鐵蛋白受體(TfR)、較佳地人類轉鐵蛋白受體1 (huTfR1)之抗體或其抗原結合片段，其中TfR結合分子在6.8至7.8之中性pH（諸如生理pH（例如7.4））及4.5至6.5之酸性pH（諸如常見於內體隔室(endosomal compartment)中之酸性pH）兩者下，具有經最佳化之輸送功能，其由結合速率ka 及解離速率kd 值定義。
發明人出乎意料地發現，最佳值不單純是最快的結合速率ka 值及最慢的解離速率kd 值，如在典型抗體-目標交互作用中可能預期的。亦即，對於此系統，不必然會想要使用以相對高速率與TfR「結合」及締合、然後更慢地自TfR解離的分子以具有最長之抗體-目標複合體壽命。而是，在一個實施例中，本文所述之TfR結合劑的經最佳化輸送功能較佳地在生理pH（例如，7.4）及較低pH（例如，6.5或6.0）兩者下具有類似（例如，在相同的數量級內）的ka 速率，但是在較低pH（例如，6.5或6.0）下具有比在生理pH（例如，7.4）下之kd 速率快的解離速率kd 。
在一個大致態樣中，本申請案描述一種抗TfR抗體或其抗原結合片段，其用於將治療劑或診斷劑遞送至有需要之對象的腦部，其中該抗TfR抗體或其抗原結合片段在中性pH下以至少1 nM、較佳地1 nM至500 nM之解離常數KD 且在酸性pH、較佳地pH 5下以至少10-4 sec-1 、較佳地10-4 至10-1 sec-1 之解離速率常數kd 結合至轉鐵蛋白受體(TfR)、較佳地人類TfR1。
在一些實施例中，請求項1之抗TfR抗體或其抗原結合片段在中性pH下具有2 × 10-2 至2 × 10-4 sec-1 、較佳地2.0 × 10-3 sec-1 之解離速率常數kd 。
在另一實施例中，本文所述之某些TfR結合劑的經最佳化輸送功能較佳地在生理酸性pH（例如，7.4）下，具有至少1.05 × 105 之ka 速率及至少2.0 × 10-3 s-1 或更快之kd 速率。前述pH、KD、ka 、及kd 參數僅反映經最佳化之胞吞轉送條件，且絕不會對吾人的發現造成限制，即接合至本文中某些TfR結合劑之某些分子的TfR介導之輸送仍可能在超出所述之較佳參數的情況下發生。
在一個大致態樣中，本申請案關於一種抗體或其抗原結合片段，其用於將劑遞送至有需要之對象的腦部，其中該抗體或其抗原結合片段結合至轉鐵蛋白受體(TfR)、較佳地人類轉鐵蛋白受體1 (huTfR1)，該抗體或其抗原結合片段包含 (1)    包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2、及HCDR3之重鏈可變區及包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2、及LCDR3之輕鏈可變區，其中該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3具有下列之胺基酸序列： (i)      分別為SEQ ID NO: 292、293、294、295、296、及297； (ii)     分別為SEQ ID NO: 279、280、281、282、283、及284； (iii)        分別為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、及34； (iv)        分別為SEQ ID NO: 57、58、59、60、61、及62； (v)         分別為SEQ ID NO: 85、86、87、88、89、及90； (vi)    分別為SEQ ID NO: 110、111、112、113、114、及115； (vii)   分別為SEQ ID NO: 135、136、137、138、139、及140； (viii)  分別為SEQ ID NO: 191、192、193、194、195、及196； (ix)    分別為SEQ ID NO: 244、245、246、247、248、及249； (x)     分別為SEQ ID NO: 263、264、265、266、267、及268； (xi)    分別為SEQ ID NO: 345、346、347、348、349、及350； (xii)   分別為SEQ ID NO: 355、356、357、358、359、及360； (xiii)  分別為SEQ ID NO: 365、366、367、368、369、及370； (xiv)  分別為SEQ ID NO: 375、376、377、378、379、及380； (xv)   分別為SEQ ID NO: 385、386、387、388、389、及390； (xvi)  分別為SEQ ID NO: 395、396、377、398、399、及400； (xvii) 分別為SEQ ID NO: 405、406、407、408、409、及410； (xviii) 分別為SEQ ID NO: 415、416、417、418、419、及420； (xix)  分別為SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及430； (xx)   分別為SEQ ID NO: 435、436、437、438、439、及440； (xxi)  分別為SEQ ID NO: 445、446、447、448、449、及450； (xxii) 分別為SEQ ID NO: 455、456、457、458、459、及460； (xxiii) 分別為SEQ ID NO: 465、466、467、468、469、及470； (xxiv) 分別為SEQ ID NO: 475、476、477、478、479、及480； (xxv) 分別為SEQ ID NO: 485、486、487、488、489、及490； (xxvi) 分別為SEQ ID NO: 495、496、497、498、499、及500； (xxvii) 分別為SEQ ID NO: 505、506、507、508、509、及510； (xxviii) 分別為SEQ ID NO: 515、516、517、518、519、及520； (xxix) 分別為SEQ ID NO: 525、526、527、528、529、及530； (xxx) 分別為SEQ ID NO: 535、536、537、538、539、及540；或 (xxxi) 分別為SEQ ID NO: 545、546、547、548、549、及550；或 (2)    重鏈上之單可變域(VHH)，其包含具有下列之胺基酸序列的重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2、及HCDR3： (i)          分別為SEQ ID NO: 7、8、及9； (ii)         分別為SEQ ID NO: 317、318、及319； (iii)        分別為SEQ ID NO: 324、325、及326； (iv)        分別為SEQ ID NO: 331、332、及333；或 (v)         分別為SEQ ID NO: 338、339、及340。
在某些實施例中，本申請案關於一種抗TfR VHH片段，其包含與SEQ ID NO: 6、316、323、330、或337具有至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%序列同一性之胺基酸序列。
在其他實施例中，本申請案關於一種抗TfR單鏈可變片段(scFv)，其包含經由連接子共價連接至輕鏈可變區之重鏈可變區，較佳地該連接子具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列。更佳地，scFv包含與下列之胺基酸序列具有至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%序列同一性之胺基酸序列：SEQ ID NO: 278、291、28、56、84、109、134、162、190、218、243、262、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、或544。
本申請案之另一態樣關於一種接合物，其包含偶合至治療劑或診斷劑（諸如神經病症藥物或用於偵測神經病症之劑）之本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段。較佳地，治療劑或診斷劑係結合至腦部目標之第二抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，本申請案關於一種融合建構體，其包含共價連接至第二抗體或其抗原結合片段的本申請案之抗TfR抗體或其抗 原結合片段，該第二抗體或其抗原結合片段結合至腦部目標，諸如選自由下列所組成之群組的腦部目標：β-分泌酶1 (BACE1)、β類澱粉蛋白(Aβ)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、Tau、載脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、亨丁頓蛋白(huntingtin)、普里昂蛋白(PrP)、富白胺酸重複激酶2 (LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6 (DR6)、類澱粉蛋白前驅蛋白(APP)、p75神經營養因子受體(p75NTR)、及凋亡蛋白酶6。
在某些實施例中，本申請案之融合建構體包含第二抗體或其抗原結合片段，該第二抗體或其抗原結合片段結合至Tau且包含分別具有SEQ ID NO: 554至559之胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。較佳地，第二抗體係單株抗體，該單株抗體包含具有SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的輕鏈。
在一個實施例中，本申請案之融合建構體包含本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段、較佳地抗huTfR1 VHH或scFv片段，該抗TfR抗體或其抗原結合片段經由連接子共價連接至結合至腦部目標之第二抗體或其抗原結合片段之兩個重鏈中僅一者之羧基端。較佳地，連接子具有SEQ ID NO: 312或SEQ ID NO: 313之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗體或其抗原結合片段之兩個重鏈的各者包含經修飾恆定重鏈3 (CH3)域（相較於野生型CH3域），以促進兩個重鏈之間的異二聚體形成。可使用促進兩個重鏈之間的異二聚體形成之任何突變。較佳地，第一重鏈之經修飾CH3域在位置T350、L351、F405、及Y407包含胺基酸修飾，且第二重鏈之經修飾CH3域在位置T350、T366、K392、及T394包含胺基酸修飾。較佳地，在位置T350之胺基酸修飾係T350V、T350I、T350L、或T350M；在位置L351之胺基酸修飾係L351Y；在位置F405之胺基酸修飾係F405A、F405V、F405T、或F405S；在位置Y407之胺基酸修飾係Y407V、Y407A、或Y407I；在位置T366之胺基酸修飾係T366L、T366I、T366V、或T366M，在位置K392之胺基酸修飾係K392F、K392L、或K392M，且在位置T394之胺基酸修飾係T394W。更佳地，第一重鏈之經修飾異二聚體CH3域包含突變T350V、L351Y、F405A、及Y407V，且第二重鏈之經修飾異二聚體CH3域包含突變T350V、T366L、K392L、及T394W。在整份說明書中，抗體中胺基酸殘基之編號係根據如下列中所述之EU索引執行：Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)，除非另有明確說明。
在某些實施例中，第二抗體或其抗原結合片段之可結晶片段區（fragment crystallizable region，Fc區）含有改變（增加或減少）、較佳地消除效應功能（諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)）的取代。較佳地，第二抗體或其抗原結合片段之Fc區包含降低或除去第二抗體或其抗原結合片段與Fcγ受體(FcγR)之結合且避免效應功能介導之毒性的一或多個胺基酸修飾。例如，第二抗體或其抗原結合片段之Fc區可在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329包含一或多個胺基酸修飾，諸如L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。
在某些實施例中，第二抗體或其抗原結合片段之Fc區含有改變（增加或減少）、較佳地增加第二抗體或其抗原結合片段與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的取代。較佳地，一或多個突變增強在酸性pH下之結合，更佳地Fc具有M252Y/S254T/T256E (YTE)突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。
在某些實施例中，本申請案之融合建構體包含： (1)   第一重鏈，其具有與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：SEQ ID NO: 301、304、307、285、288、298、10、13、16、19、22、25、35、38、41、44、47、50、53、63、66、69、72、75、78、81、91、94、97、100、103、106、116、119、122、125、128、131、141、144、147、150、153、156、159、169、172、175、178、181、184、187、197、200、203、206、209、212、215、225、228、231、234、237、240、250、252、256、259、269、272、275、320、327、334、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、及471； (2)   兩個輕鏈，其等各獨立地具有分別與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：302、305、308、286、289、299、11、14、17、20、23、26、36、39、42、45、48、51、54、64、67、70、73、76、79、82、92、95、98、101、104、107、117、120、123、126、129、132、142、145、148、151、154、157、160、170、173、176、179、182、185、188、198、201、204、207、210、213、216、226、229、232、235、238、241、251、253、257、260、270、273、276、321、328、335、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、及472；及 (3)   第二重鏈，其具有分別與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：303、306、309、287、290、300、12、15、18、21、24、27、37、40、43、46、49、52、55、65、68、71、74、77、80、83、93、96、99、102、105、108、118、121、124、127、130、133、143、146、149、152、155、158、161、171、174、177、180、183、186、189、199、202、205、208、211、214、217、227、230、233、236、239、242、252、254、258、261、271、274、277、322、329、336、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463、及473。
本申請案之另一大致態樣關於一種經單離的核酸，其編碼本申請案之抗體或抗原結合片段、接合物、或融合建構體。亦提供一種包含本申請案之經單離的核酸的載體、一種包含本申請案之核酸或載體的宿主細胞。
本申請案之另一大致態樣關於一種生產本申請案之抗體或抗原結合片段、接合物、或融合建構體的方法。該方法包含在生產該抗體或抗原結合片段、該接合物、或該融合建構體之條件下，培養包含本申請案之核酸的細胞；及自該細胞或細胞培養物回收該抗體或抗原結合片段、該接合物、或該融合建構體。
進一步提供一種醫藥組成物，其包含本申請案之接合物或融合建構體及醫藥上可接受之載劑。
本申請案之另一大致態樣關於一種治療或偵測有需要之對象的神經病症之方法，其包含向該對象投予有效量的本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段、接合物、或融合建構體、或醫藥組成物。較佳地，神經病症係選自由下列所組成之群組：神經退化性疾病（諸如路易氏體病(Lewy body disease)、脊髓灰質炎後症候群、Shy-Draeger症候群、橄欖體橋腦小腦萎縮、巴金森氏症、多系統萎縮、紋狀體與黑質體退化症、脊髓小腦性失調症、脊髓性肌萎縮）、tau蛋白病(tauopathy)（諸如阿茲海默症及核上神經麻痺症）、普里昂疾病（諸如牛海綿狀腦病、羊搔癢症、庫賈氏症候群(Creutz-feldt-Jakob syndrome)、庫魯病、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、慢性消耗病、及致死性家族性失眠症）、延髓性麻痺、運動神經元疾病、及神經系統異退化性病症(nervous system heterodegenerative disorder)（諸如Canavan病、亨丁頓舞蹈症(Huntington's disease)、神經元蠟樣脂褐質儲積症、亞歷山大氏病(Alexander's disease)、妥瑞氏症候群(Tourette's syndrome)、Menkes氏捲髮症候群、柯凱因氏症候群(Cockayne syndrome)、Halervorden-Spatz氏症候群、拉弗拉病(lafora disease)、雷特氏症候群(Rett syndrome)、肝豆狀核變性、Lesch-Nyhan氏症候群、及Unverricht-Lundborg氏症候群）、失智症（諸如匹克症(Pick's disease)及脊髓小腦性失調症）、及CNS及/或腦部之癌症（諸如身體其他地方之癌症所致的腦部轉移）。
較佳地，本申請案之抗體或其抗原結合片段、接合物、融合建構體、或醫藥組成物經靜脈內投予。
亦描述一種將治療劑或診斷劑遞送至有需要之對象的腦部之方法，其包含向該對象投予接合物，該接合物包含偶合至本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段的治療劑或診斷劑。較佳地，治療劑或診斷劑係結合至腦部目標之第二抗體或其抗原結合片段。更佳地，將偶合至本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段的治療劑或診斷劑投予至對象的腦部導致Fc介導之效應功能降低且/或不誘發快速網狀紅血球耗盡，如相較於投予未偶合至抗TfR抗體或其抗原結合片段之治療劑或診斷劑。
本發明之又另一大致態樣關於一種在有需要之對象中誘發抗體依賴性吞噬作用(ADP)而不刺激促發炎細胞介素的分泌之方法，其包含向該對象投予複合體，該複合體包含偶合至、較佳地共價接合至根據本發明之一實施例之其抗原結合片段的治療性抗體或其抗原結合片段，其中該治療性抗體或其抗原結合片段不具有效應功能，例如該治療性抗體或其抗原結合片段在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329包含一或多個胺基酸修飾，諸如L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。較佳地，治療性抗體或其抗原結合片段特異性結合至tau聚集物(tau aggregate)。
本發明之其他態樣、特徵、及優點將由於下列揭露（包括本發明之實施方式及其較佳實施例、及隨附之申請專利範圍）而為顯而易見的。
相關申請案之交互參照
本申請案主張美國臨時專利申請案第63/006,998號（2020年4月8日提出申請）及美國臨時專利申請案第63/036,020號（2020年6月8日提出申請）之優先權，該等專利申請案之揭露全文以引用方式併入本文中。
各篇公開案、論文、及專利已於先前技術及整份說明書引用或描述；此等參考文獻之各者全文係以引用方式併入本文中。本說明書中所包括之對於文件、行動、材料、裝置、物品、或類似者的論述，其目的在於提供關於本發明的脈絡。此等論述並非承認，任一或所有此等情事形成了關於任何所揭示或請求之發明的先前技術部分。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語，均與本發明有關技術領域中具有通常知識者所通常了解之意義相同。在其他方面，在本文中所使用的某些用語具有如本說明書所定之意義。在本文中所引用的所有專利、已公開專利申請案及公開案係以引用方式併入，猶如全文說明於本文中。必須注意的是，本文及附加之申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。
除非另有說明，在本文中描述之任何數值（諸如濃度或濃度範圍）應理解為在所有情況下皆受到用語「約(about)」之修飾。因此，數值一般包括記載值之± 10%。例如，10 mg之劑量包括9 mg至11 mg。如本文中所使用，數值範圍之使用明確包括所有可能的子範圍、在該範圍內之所有個別數值，包括在此類範圍內之整數及該等值之分數，除非上下文另有明確指示。
如本文中所使用，多個所述元件之間的連接用語「及/或(and/or)」係理解為涵蓋個別及組合選項兩者。例如，其中兩個元件係藉由「及/或」連接時，第一選項係指第一元件在沒有第二元件的情況下之適用性。第二選項係指第二元件在沒有第一元件的情況下之適用性。第三選項係指第一元件及第二元件一起之適用性。這些選項之任一者應理解為落入該含義內，並因此滿足如本文中所使用之用語「及/或」之要求。該等選項之多於一者的並行適用性亦應理解為落入該含義內，並因此滿足用語「及/或」之要求。
在整份說明書及隨附之申請專利範圍中，除非上下文另有規定，否則詞語「包含(comprise)」及諸如「包含(comprises/comprising)」的變化形式，將被理解為暗示包括所述整數或步驟或整數或步驟之群組，但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群組。當用於本文中時，用語「包含(comprising)」可用用語「含有(containing)」或「包括(including)」取代，或有時候當用於本文中時可用用語「具有(having)」取代。
當用於本文中時，「由…所組成(consisting of)」排除所請元件中未指定之任何元件、步驟、或成分。當用於本文中時，「基本上由…所組成(consisting essentially of)」不排除不會實質影響申請專利範圍之基本及新穎特徵的材料或步驟。當任何前述用語「包含(comprising)」、「含有(containing)」、「包括(including)」、及「具有(having)」在本文中用於本發明之態樣或實施例的上下文時，可用用語「由…所組成(consisting of)」或「基本上由…所組成(consisting essentially of)」置換，以改變本揭露之範疇。
用語「抗體(antibody)」在本文中係以最廣泛的意義使用，且具體包括全長單株抗體、多株抗體、及（除非上下文中另有說明或牴觸）其抗原結合片段、抗體變體、及多特異性分子，只要其等展現所欲之生物活性。通常而言，全長抗體係一種醣蛋白，其包含由雙硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈，或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區（在本文中縮寫為VH）及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域，即CH1、CH2、及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（在本文中縮寫為VL）及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域，即CL。VH區及VL區可進一步細分成多個高度變異區（稱為互補決定區(CDR)），其間穿插多個更加保守之區（稱為架構區(FR)）。各VH及VL係由三個CDR及四個FR構成，按照下列順序從胺基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原交互作用之結合域。與抗體生產相關之抗體分子結構及各種技術的一般原理係提供於例如Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1988)。
取決於其重鏈之恆定域的胺基酸序列，全長抗體可被指派至不同的「類別」。全長抗體有五大類：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且這些類別中的數種可進一步分成「子類別」（同型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及IgA2。對應於不同抗體類別之重鏈恆定域分別稱為α (alpha)、δ (delta)、ε (epsilon)、γ (gamma)、及µ (mu)。不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維構形係熟知的。
「抗體」亦可為重鏈(VHH)抗體上之單可變域，亦稱為僅重鏈抗體(HcAb)，其沒有輕鏈且可由駱駝科動物或鯊魚自然生產。HcAb之抗原結合部分包含VHH片段。
如本文中所使用，用語「重組抗體(recombinant antibody)」係指一種抗體（例如，嵌合、人源化、或人類抗體或其抗原結合片段），其係由包含編碼該抗體之核酸的重組宿主細胞表現。用於生產重組抗體之「宿主細胞」的實例包括：(1)哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤細胞（包括YO及NSO細胞）、幼倉鼠腎臟(BHK)、Hela、及Vero細胞；(2)昆蟲細胞，例如sf9、sf21、及Tn5；(3)植物細胞，例如屬於菸草(Nicotiana )屬之植物（例如，菸草(Nicotiana tabacum )）；(4)酵母細胞，例如屬於酵母菌(Saccharomyces )屬者（例如，釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )）或屬於麴菌(Aspergillus )屬者（例如，黑麴菌(Aspergillus niger )）；(5)細菌細胞，例如大腸桿菌(Escherichia. coli )細胞或枯草桿菌(Bacillus subtilis )細胞等。
抗體之「抗原結合片段」係一種分子，其包含全長抗體能夠可偵測地結合至抗原的部分，一般包含至少VH區之一或多個部分。抗原結合片段包括多價分子（包含抗體之一、二、三、或更多個抗原結合部分）及單鏈建構體，其中VL區及VH區（或其所選部分）係藉由合成連接子或藉由重組方法連接，以形成功能性、抗原結合分子。抗原結合片段亦可係單域抗體(sdAb)（亦稱為奈米抗體(nanobody)），其係由單一單體可變抗體域(VHH)所組成之抗體片段。雖然抗體之一些抗原結合片段可藉由使較大抗體分子實際斷裂（例如，酶切割）來獲得，但大多數一般係藉由重組技術生產。本發明之抗體可製備為全長抗體或其抗原結合片段。抗原結合片段之實例包括Fab、Fab′、F(ab)2 、F(ab′)2 、F(ab)3 、Fv（一般為抗體之單臂的VL域及VH域）、單鏈Fv（scFv，請參見例如Bird et al., Science 1988; 242:423-426；及Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883）、dsFv、Fd（一般為VH域及CH1域）、及dAb（一般為VH域）片段；VH域、VL域、VHH域、及V-NAR域；包含單一VH及單一VL鏈之單價分子；微抗體(minibody)、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、及κ抗體(kappa body)（請參見例如，Ill et al., Protein Eng 1997; 10:949-57）；駱駝IgG；IgNAR；以及一或多種經單離CDR或功能性互補位(paratope)，其中可將經單離CDR或抗原結合殘基或多肽聯結或連接在一起，以形成功能性抗體片段。各種類型的抗體片段已描述或綜述於例如Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23:1126-1136；WO2005040219、及已公開之美國專利申請案20050238646及20020161201。抗體片段可使用習知重組或蛋白質工程改造技術獲得，且該等片段可以與完整抗體相同之方式針對抗原結合或其他功能進行篩選。
已針對抗體片段之生產開發出各種技術。傳統上，這些片段係經由全長抗體之蛋白水解消化得到（請參見例如Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)；及Brennan et al., Science, 229:81 (1985)）。然而，這些片段現在可直接由重組宿主細胞生產。替代地，Fab′-SH片段可直接自大腸桿菌(E. coli )回收並經化學偶合，以形成F(ab′)2片段(Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992))。根據另一方法，F(ab′)2片段可直接自重組宿主細胞培養物中單離出來。在其他實施例中，選用之抗體係單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 1993/16185；美國專利第5,571,894號；及美國專利第5,587,458號。例如，抗體片段亦可係「線性抗體」，例如美國專利第5,641,870號中所述。此類線性抗體片段可係單特異性或雙特異性的。
如本文中所使用，用語「抗體衍生物(antibody derivative)」係指包含全長抗體或其抗原結合片段之分子，其中一或多個胺基酸經化學修飾或取代。可用於抗體衍生物之化學修飾包括例如烷化、聚乙二醇化(PEGylation)、醯化、酯形成或醯胺形成、或類似者，例如用於將抗體連接至第二分子。例示性修飾包括聚乙二醇化（例如，半胱胺酸聚乙二醇化）、生物素化、放射性標示、及與第二劑（諸如細胞毒性劑）之接合。
本文中之抗體包括抗原結合或生物活性經改變之「胺基酸序列變體」。此類胺基酸改變之實例包括對於抗原之親和力增強的抗體（例如，「親和力成熟」抗體）及Fc區（如果存在）經改變（例如，抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)經改變（增加或減少）（請參見例如，Presta, L.之WO 00/42072及Iduosogie等人之WO 99/51642）；及/或血清半衰期經增加或減少（請參見例如，Presta, L.之WO00/42072））之抗體。
「多特異性分子」包含一種抗體或其抗原結合片段，其係聯結或連接至至少一個其他功能性分子（例如，另一個肽或蛋白質，諸如另一個抗體或受體之配體），藉以形成結合至至少兩種不同結合部位或目標分子之分子。例示性多特異性分子包括雙特異性抗體及連接至可溶受體片段或配體之抗體。
如本文中所使用，用語「人類抗體(human antibody)」意欲包括具有架構區及CDR區兩者均衍生自（即，同一於或基本上同一於）人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區的抗體。此外，如果抗體含有恆定區，則恆定區亦「衍生自」人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（例如，藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入之突變）。然而，如本文中所使用，用語「人類抗體」不意欲包括衍生自另一哺乳動物物種（諸如小鼠）之生殖系的CDR序列已移植至人類架構序列的抗體。
「人源化(humanized)」抗體係含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的人類/非人類嵌合抗體。在大多數情況下，人源化抗體係人類免疫球蛋白（受體抗體(recipient antibody)），其中來自受體之高度變異區的殘基經來自具有所欲特異性、親和力、及能力之非人類物種（諸如小鼠、大鼠、兔、或非人類靈長類）（供體抗體）之高度變異區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基經對應之非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包含在接受者抗體中或在供體抗體中未發現的殘基。進行這些修飾以進一步精進抗體性能。通常而言，人源化抗體將包含實質上所有至少一個（且一般而言兩個）可變域，其中所有或實質上所有高度變異環對應於非人類免疫球蛋白之高度變異環，且所有或實質上所有FR殘基係人類免疫球蛋白序列之FR殘基。人源化抗體可選地亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，一般為人類免疫球蛋白之恆定區。關於進一步細節，請參見例如Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；及Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、WO 92/02190、美國專利申請案20060073137、及美國專利第6,750,325、6,632,927、6,639,055、6,548,640、6,407,213、6,180,370、6,054,297、5,929,212、5,895,205、5,886,152、5,877,293、5,869,619、5,821,337、5,821,123、5,770,196、5,777,085、5,766,886、5,714,350、5,693,762、5,693,761、5,530,101、5,585,089、及5,225,539號。
當用於本文中時，用語「高度變異區(hypervariable region)」係指抗體負責抗原結合之胺基酸殘基。高度變異區通常包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基（輕鏈可變域中之殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、及89-97 (L3)，及重鏈可變域中之殘基31-35 (H1)、50-65 (H2)、及95-102 (H3)；(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)）及/或來自「高度變異環」之殘基（輕鏈可變域中之殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、及91-96 (L3)，及重鏈可變域中之殘基26-32 (H1)、53-55 (H2)、及96-101 (H3)；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196:901-917）。一般而言，此區中之胺基酸殘基的編號係藉由上述Kabat et al.中所述之方法執行。諸如「Kabat位置」、「如Kabat中之可變域殘基編號」、及「根據Kabat」之片語在本文中係指用於重鏈可變域或輕鏈可變域之此編號系統。使用Kabat編號系統，肽之實際線性胺基酸序列可含有較少或額外的對應於可變域之FR或CDR的縮短或插入之胺基酸。例如，重鏈可變域可包括CDR H2之殘基52後的單一胺基酸插入（根據Kabat之殘基52a）及重鏈FR殘基82後的插入殘基（例如，根據Kabat之殘基82a、82b、及82c等）。給定抗體之Kabat殘基編號可藉由比對抗體序列之同源性區與「標準」Kabat編號序列來判定。
「架構區」或「FR」殘基係本文中所定義之CDR以外的VH或VL殘基。
「表位」或「結合部位」係抗原上的區域或區，抗原結合肽（諸如抗體）特異性結合至這些區域或區。蛋白質表位可包含直接涉及結合之胺基酸殘基（亦稱為表位之免疫優勢(immunodominant)組分）及其他非直接涉及結合之胺基酸殘基，諸如被特異性抗原結合肽有效阻斷之胺基酸殘基（換言之，該胺基酸殘基係在特異性抗原結合肽之「溶劑排除表面(solvent-excluded surface)」及/或「足跡」內）。
「互補位」係抗體之抗原結合部分特異性結合抗原的區域或區。除非上下文中另有說明或明顯抵觸，互補位可包含直接涉及表位結合之胺基酸殘基（其中數個一般位於CDR中）及其他非直接涉及結合之胺基酸殘基，諸如被特異性結合抗原有效阻斷之胺基酸殘基（換言之，該胺基酸殘基係在特異性結合抗原之「溶劑排除表面」及/或「足跡」內）。
作為參考抗體之「結合至相同表位之抗體」係指在競爭檢定中阻斷參考抗體與其抗原之結合達50%或更多的抗體，且相反地，參考抗體在競爭檢定中阻斷抗體與其抗原之結合達50%或更多。
「經單離」抗體係已與其自然環境之組分分離者。在一些實施例中，抗體經純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳（例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳）或層析（例如，離子交換或逆相HPLC）所判定。關於抗體純度評估方法之綜述，請參見例如Flatman et al, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
與本發明之方法有關的用語「投予(administering)」，意指藉由使用本發明之接合物或其形式、組成物、或藥劑來治療性地或疾病預防性地預防、治療、或改善如本文所述之症候群、病症、或疾病的方法。此類方法包括在療程期間的不同時間投予有效量的該抗體、其抗原結合片段、或接合物、或其形式、組成物、或藥劑，或者以組合形式並行投予有效量的該抗體、其抗原結合片段、或接合物、或其形式、組成物、或藥劑。本發明之方法應被理解為包括所有習知的治療性治療方案。
目標抗體「阻斷」目標分子與天然目標配體之結合的能力，意指該抗體（在使用可溶或細胞-表面相關目標及配體分子之檢定中）可以劑量依賴性方式可偵測地降低目標分子與配體之結合，其中目標分子於該抗體不存在下會可偵測地結合至配體。
「血腦障壁」或「BBB」係指末梢循環與腦部及脊髓之間的生理障壁，其係由腦部微血管內皮質膜內之緊密連接形成，從而產生限制分子輸送進入腦部的緊密障壁。BBB可限制甚至極小分子（諸如脲，60道耳頓）輸送進入腦部。BBB之實例包括腦內之BBB、脊髓內之血脊髓障壁、及視網膜內之血視網膜障壁，這些全都是CNS內之鄰近微血管障壁。BBB亦涵蓋血CSF障壁（脈絡叢），其中障壁係由室管膜細胞構成而非微血管內皮細胞。
「血腦障壁受體」（在本文中縮寫為「R/BBB」）係表現在腦部內皮細胞上之胞外膜連接受體蛋白，其能夠將分子輸送跨過BBB或用於輸送外源投予之分子。R/BBB之實例包括但不限於轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、類胰島素生長因子受體(IGF-R)、低密度脂蛋白受體（包括但不限於低密度脂蛋白受體相關蛋白1 (LRP1)及低密度脂蛋白受體相關蛋白8 (LRP8)）、及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。例示性R/BBB在本文中係轉鐵蛋白受體(TfR)。
「中樞神經系統」或「CNS」係指控制身體機能之神經組織複合體，且包括腦部及脊髓。
如本文中所使用，「接合物(conjugate)」係指共價連接至一或多個異源分子（包括但不限於治療性肽或蛋白質、抗體、標示、或神經病症藥物）之蛋白質。
如本文中所使用，用語「偶合(coupled)」係指將二或更多個物件接合或連接在一起。當用於化學或生物化合物時，偶合可指二或更多個化學或生物化合物之間的共價連接。舉非限制性實例來說，本發明之抗體可與受到關注的肽偶合以形成抗體偶合肽。抗體偶合肽可透過經設計以將抗體接合至肽的特定化學反應形成。在某些實施例中，本發明之抗體可與本發明之肽經由連接子共價偶合。連接子可例如先共價連接至抗體或肽，接著再共價連接至肽或抗體。
劑（例如醫藥配方）之「有效量(effective amount)」或「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指有效達到所欲治療或疾病預防結果所需之劑量及時間段的量。
如本文中所使用，「連接子(linker)」係指共價連接兩個不同實體之化學連接子或單鏈肽連接子。連接子可用於連接本發明之抗體或其片段、血腦障壁穿梭劑、融合蛋白、及接合物中的任兩者。連接子可連接例如scFv中之VH及VL、或單株抗體或其抗原結合片段與治療性分子（諸如第二抗體）。在一些實施例中，如果單價結合實體包含針對TfR（較佳地huTfR1）之scFv，且治療性分子包含針對CNS目標（諸如Tau）之抗體，則連接子可將scFv連接至針對Tau之抗體。可使用包含由肽鍵連接之1至25個胺基酸（諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25個胺基酸）的單鏈肽連接子。在某些實施例中，胺基酸係選自二十個天然存在的胺基酸。在某些其他實施例中，胺基酸之一或多者係選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、及離胺酸。亦可使用化學連接子，諸如烴連接子、聚乙二醇(PEG)連接子、聚丙二醇(PPG)連接子、多醣連接子、聚酯連接子、由PEG及嵌入式雜環所組成之混成連接子、及烴鏈。
如本文中所使用，「神經病症(neurological disorder)」係指影響CNS及/或具有CNS中之病因的疾病或病症。例示性CNS疾病或病症包括但不限於神經病變、類澱粉變性、癌症、眼部疾病或病症、病毒或微生物感染、發炎、缺血、神經退化性疾病、癲癇、行為障礙、及溶體儲積症。為了本申請案之目的，CNS將理解為包括眼睛，其正常係由血視網膜障壁而與身體其他地方隔離。神經病症之具體實例包括但不限於神經退化性疾病（包括但不限於路易氏體病、脊髓灰質炎後症候群、Shy-Draeger症候群、橄欖體橋腦小腦萎縮、巴金森氏症、多系統萎縮、紋狀體與黑質體退化症、脊髓小腦性失調症、脊髓性肌萎縮）、tau蛋白病（包括但不限於阿茲海默症及核上神經麻痺症）、普里昂疾病（包括但不限於牛海綿狀腦病、羊搔癢症、庫賈氏症候群、庫魯病、吉斯曼-史特斯勤-先克病、慢性消耗病、及致死性家族性失眠症）、延髓性麻痺、運動神經元疾病、及神經系統異退化性病症（包括但不限於Canavan病、亨丁頓舞蹈症、神經元蠟樣脂褐質儲積症、亞歷山大氏病、妥瑞氏症候群、Menkes氏捲髮症候群、柯凱因氏症候群、Halervorden-Spatz氏症候群、拉弗拉病、雷特氏症候群、肝豆狀核變性、Lesch-Nyhan氏症候群、及Unverricht-Lundborg氏症候群）、失智症（包括但不限於匹克症及脊髓小腦性失調症）、癌症（例如，CNS及/或腦部之癌症，包括身體其他地方之癌症所致的腦部轉移）。
「神經病症藥物」係一種藥物或治療劑，其可用於治療或改善一或多種神經病症之影響。本發明之神經病症藥物包括但不限於小分子化合物、抗體、肽、蛋白質、一或多種CNS目標之天然配體、一或多種CNS目標之天然配體的經修飾版本、適體(aptamer)、抑制性核酸（即，小型抑制性RNA (siRNA)及短髮夾RNA (shRNA)）、核酶(ribozyme)、或任何前述者之活性片段。本發明之例示性神經病症藥物係描述於本文中且包括但不限於：抗體、適體、蛋白質、肽、抑制性核酸及小分子、及本身係CNS抗原或目標分子或特異性辨識且/或作用於（即，抑制、活化、或偵測）CNS抗原或目標分子的任何前述者之活性片段，諸如但不限於類澱粉蛋白前驅蛋白或其部分、β類澱粉蛋白、β-分泌酶、γ-分泌酶、tau、α-突觸核蛋白、parkin、亨丁頓蛋白、DR6、早老素、ApoE、神經膠質瘤或其他CNS癌症標記、及神經營養因子。神經病症藥物及其等可用於治療之對應病症的非限制性實例：腦部衍生神經營養因子(BDNF)、慢性腦部傷害（神經生成）、纖維母細胞生長因子2 (FGF-2)、抗表皮生長因子受體腦部癌症、(EGFR)-抗體、神經膠細胞系衍生神經因子巴金森氏症、(GDNF)、腦部衍生神經營養因子(BDNF)肌萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)、憂鬰、腦部之溶體酶溶體儲積症、睫狀神經營養因子(CNTF)肌萎縮性脊髓側索硬化症、神經調節蛋白1思覺失調症、抗HER2抗體（例如，曲妥珠單抗(trastuzumab)）自HER2陽性癌症之腦部轉移。
用語「醫藥配方(pharmaceutical formulation)」係指一種製劑，其呈允許其中所含有之活性成分的生物活物具備有效性之形式，且該製劑不含有對該配方所投予之對象具有不可接受之毒性的額外組分。
如本文中所使用，「醫藥上可接受之載劑或稀釋劑(pharmaceutically accep表carrier or diluent)」意指任何適用於投予至個體之物質。例如，醫藥上可接受之載劑可係無菌水溶液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或注射用水。
如本文中所使用，「醫藥上可接受之鹽(pharmaceutically acceptable salt)」意指化合物（諸如寡聚化合物或寡核苷酸）的生理上及醫藥上可接受之鹽，即保留母化合物之所欲生物活性且不會對其產生非所欲之毒理效應的鹽。
用於本發明中之醫藥上可接受之酸性/陰離子性鹽包括但不限於：乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、依地酸鈣(calcium edetate)、樟腦磺酸鹽(camsylate)、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二氫氯化物、依地酸鹽(edetate)、乙二磺酸鹽(edisylate)、丙酸酯十二烷硫酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽(esylate)、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽(glyceptate)、葡萄糖酸鹽(gluconate)、麩胺酸鹽(glutamate)、羥乙醯胺基苯砷酸鹽(glycollylarsanilate)、己基間苯二酚鹽(hexylresorcinate)、海巴明(hydrabamine)、氫溴酸鹽、氫氯酸鹽、羥基萘甲酸鹽(hydroxynaphthoate)、碘化物、2-羥乙磺酸鹽(isethionate)、乳酸鹽、乳糖酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、苯乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、黏酸鹽(mucate)、萘磺酸鹽(napsylate)、硝酸鹽、巴摩酸鹽(pamoate)、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、次乙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、單寧酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽(teoclate)、甲苯磺酸鹽以及三碘化物。有機或無機酸亦包括但不限於：氫碘酸、過氯酸、硫酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、甲磺酸、羥乙基磺酸、草酸、2-萘磺酸、對甲苯磺酸、環己磺醯胺酸、醣酸或三氟乙酸。醫藥上可接受之鹼性/陽離子性鹽包括且不限於鋁、2-胺基-2-羥甲基-丙烷-1,3-二醇（亦稱為參(羥基甲基)胺基甲烷、托美滇(tromethane)或「TRIS」）、氨、苯札辛(benzathine)、三級丁胺、鈣、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、環己胺、二乙醇胺、乙二胺、鋰、L-離胺酸、鎂、美古明(meglumine)、N-甲基-D-還原葡糖胺、哌啶、鉀、普魯卡因(procaine)、奎寧、鈉、三乙醇胺、或鋅。
「多肽(polypeptide)」或「蛋白質(protein)」意指包含至少二個以肽鍵連接之胺基酸殘基以形成多肽的分子。少於50個胺基酸的小型多肽可稱為「肽(peptide)」。
當用於指稱胺基酸序列時，用語「序列同一性(sequence identity)」、或「)序列同一性百分比(%) (percent (%) sequence identity)」、或「同一性% (% identity)」、或「與…%同一(% identical to)」描述相較於構成胺基酸序列總長度的胺基酸殘基數目，二或更多個經比對胺基酸序列之同一胺基酸的匹配（「命中(hit)」）數目。換言之，使用比對，針對二或更多個序列，當比較該等序列並對其進行比對以獲得最大對應性（如使用所屬技術領域中已知的序列比較演算法所測得）時，或者當手動比對且目視檢查時，可判定胺基酸殘基相同之百分比（例如，在胺基酸序列之全長上有90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%、或100%同一性）。判定序列同一性所比較的序列可能因胺基酸的（多個）取代、（多個）添加、或（多個）缺失而不同。用於比對蛋白質序列之合適程式係所屬技術領域中具有通常知識者所習知。例如，蛋白質序列的序列同一性百分比可用諸如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA、或BLAST之程式，例如使用NCBI BLAST演算法判定(Altschul SF, et al (1997),Nucleic Acids Res . 25:3389-3402)。
在兩個胺基酸序列之上下文中，用語「實質上同一(substantially identical)」意指該等序列當經最佳比對（諸如藉由GAP或BESTFIT程式使用預設缺口權重(gap weight)）時共有至少約50百分比之序列同一性。一般而言，實質上同一之序列將展現至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、至少約95、至少約98、或至少約99百分比之序列同一性。
「特異性結合(specific binding/specifically bind)」或「結合(bind)」係指抗體以比對其他抗原更大的親和力結合至抗原或抗原內之表位。一般而言，抗體以下列解離常數(KD )結合至抗原或抗原內之表位：約1×10-8 M或更小，例如約1×10-9 M或更小、約1×10-10 M或更小、約1×10-11 M或更小、或約1×10-12 M或更小，一般以比其結合至非特異性抗原（例如，BSA、酪蛋白）之KD 小至少一百倍的KD 。KD 係平衡解離常數，即抗體與其抗原之間的koff /kon 比率。KD 與親和力是負相關的。「結合速率(on-rate)」(kon )係用於表徵抗體多快結合至其目標的常數。「解離速率(off-rate)」(koff )係用於表徵抗體多快與其目標解離的常數。解離常數KD 可使用標準程序測量。例如，抗體之KD 可藉由使用表面電漿共振（諸如藉由使用生物感測器系統，例如Biacore®系統）、或藉由使用生物層干涉技術（諸如Octet RED96系統）判定。抗體之KD 值越小，抗體結合至目標抗原的親和力越高。然而，特異性結合至抗原或抗原內之表位的抗體可能對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種（諸如人類或猴）的相同抗原（同源物(homolog)）具有交叉反應性，例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis , cynomolgus, cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes , chimpanzee, chimp)、或狨(Callithrix jacchus , common marmoset, marmoset)。當單特異性抗體特異性結合一種抗原或一種表位時，雙特異性抗體特異性結合二種不同的抗原或二種不同的表位。
如本文中所使用，用語「對象(subject)」係指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物（例如，牛、綿羊、貓、狗、及馬）、靈長類（例如，人類及非人類靈長類，諸如猴）、兔、及囓齒動物（例如，小鼠及大鼠）。在某些實施例中，個體或對象係人類。當對象係人類時，其亦可稱為「患者」。
如本文中所使用，用語「轉鐵蛋白受體(transferrin receptor)」或「TfR」係指受體介導之胞吞過程所致之細胞鐵吸收所需的細胞表面受體。用於轉鐵蛋白之載體蛋白。TfR涉及脊椎動物中之鐵吸收，且回應於細胞內鐵濃度而受到調控。其藉由透過受體介導之胞吞將轉鐵蛋白-鐵複合體內化來輸入鐵。已表徵人類中之兩種轉鐵蛋白受體（轉鐵蛋白受體1及轉鐵蛋白受體2）。這兩種受體均是跨膜醣蛋白。TfR1係高親和力普遍表現之受體。TfR2結合至轉鐵蛋白之親和力比TfR1小25至30倍。TfR2之表現限於某些細胞類型且不受細胞內鐵濃度影響。例如，在一個實施例中，TfR係人類TfR，其包含如Schneider et al. Nature 311: 675-678 (1984)中之胺基酸序列。其可具有約180,000道耳頓之分子量，具有兩個表觀分子量各為約90,000道耳頓之次單元。較佳地，TfR係人類TfR1。
如本文中所使用，「目標抗原(target antige)」或「腦部目標(brain target)」係指表現於CNS（包括腦部）中之抗原及/或分子，其可用抗體或小分子加以靶向。此類抗原及/或分子之實例包括但不限於：β-分泌酶1 (BACE1)、β類澱粉蛋白(Aβ)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、Tau、載脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、亨丁頓蛋白、普里昂蛋白(PrP)、富白胺酸重複激酶2 (LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6 (DR6)、類澱粉蛋白前驅蛋白(APP)、p75神經營養因子受體(p75NTR)、及凋亡蛋白酶6。在一些實施例中，目標抗原係BACE1。在一些實施例中，目標抗原係Tau。
如本文中所使用，「治療(treatment)」（及其英文文法變化型，諸如「treat」或「treating」）係指試圖改變受治療個體之自然病程的臨床介入，且可出於疾病預防或在臨床病理病程期間執行。所欲治療效果包括但不限於預防疾病發生或再發、減輕症狀、減少疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態、及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體係用於延緩疾病發展或減慢疾病進展。
抗體或免疫球蛋白可分為五大類，即IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，取決於重鏈恆定域胺基酸序列。IgG係五種免疫球蛋白中最穩定的一種，在人類的血清半衰期約為23天。IgA及IgG係進一步次分為下列同型(isotype)：IgA1 、IgA2 、IgG1 、IgG2 、IgG3 及IgG4 。四種IgG亞型各具有不同的生物功能稱為效應功能。這些效應功能通常透過與Fc受體(FcγR)交互作用且/或藉由結合C1q及固定補體介導。結合至FcγR可導致抗體依賴性細胞介導之細胞裂解或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，而結合至補體因子可導致補體介導之細胞裂解或補體依賴性細胞毒性(CDC)。本發明之抗TfR抗體（或待接合或融合至抗TfR抗體之治療性或診斷性抗體）可不具有或具有極少的效應功能，但仍保留其結合FcRn之能力，此結合可為抗體藉以具有延長之體內半衰期的主要手段。
FcγR或補體（例如，C1q）與抗體之結合係由所謂Fc部分結合部位處之已界定蛋白質-蛋白質交互作用造成。此類Fc部分結合部位在所屬技術領域中係已知的。此類Fc部分結合部位包括例如特徵在於胺基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329（編號根據Kabat之EU索引）者。在一些實施例中，本發明之抗TfR抗體（或待接合或融合至抗TfR抗體之治療性或診斷性抗體）在一或多個Fc部分結合部位含有一或多個取代，以消除效應功能。例如，本發明之抗TfR抗體（或待接合或融合至抗TfR抗體之治療性或診斷性抗體）可含有含一或多個下列取代之Fc區：以脯胺酸取代殘基233處之麩胺酸、以丙胺酸或纈胺酸取代殘基234處之苯丙胺酸、及以丙胺酸或麩胺酸取代殘基235處之白胺酸（EU編號，Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., NIH Publication no. 91-3242）。較佳地，所關注之抗體含有L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變（EU編號，Kabat）。
子類別IgG1、IgG2、及IgG3之抗體通常會顯示補體活化（包括C1q及C3結合），而IgG4不會活化補體系統且不會結合C1q及/或C3。人類IgG4 Fc區相較於其他IgG亞型具有減少之結合FcγR及補體因子的能力。較佳地，本發明之抗TfR抗體（或待接合或融合至抗TfR抗體之治療性或診斷性抗體）包含衍生自人類IgG4 Fc區之Fc區。更佳地，Fc區含有具有消除效應功能之取代的人類IgG4 Fc區。例如，藉由以Ala取代殘基297處（EU編號）之Asn來移除IgG4 Fc區中之N-連接醣基化部位係另一種確保消除殘餘效應活性之方法。抗TfR 抗體及其抗原結合片段
在一個大致態樣中，本申請案關於一種結合至靈長類TfR（諸如人類TfR或猴TfR）之抗體或其抗原結合片段，且該抗體或其抗原結合片段針對將劑遞送至有需要之對象的腦部經最佳化。抗TfR抗體與TfR之結合親和力與胞吞轉送效率之間的關係先前已描述為隨著對TfR之親和力降低，胞吞轉送會有所提升(Yu, Zhang et al. 2011, Sci Transl Med 3(84): 84ra44)。本發明之發明人驚訝地發現，在結合速率及解離速率兩者均會影響腦部濃度的作用下，親和力與胞吞轉送效率之間比先前已描述者更細微的關係。具體而言，必須有不會太快或太慢的中性解離速率才能獲得劑（諸如mAb）的最佳腦部PK及PD，以讓抗TfR抗體或其抗原結合片段有效率遞送。
較佳地，本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段係pH敏感的，例如其在不同pH下具有不同之TfR結合親和力。例如，本申請案之抗TfR抗體在中性pH（諸如生理pH（例如pH 7.4））下可以高親和力結合至細胞表面TfR，但在內化至內體隔室中之後，其在酸性pH（諸如相對較低之pH（pH 5.0至6.0））下會自TfR解離。親和力係兩個部份（例如，抗體及抗原）之間的結合強度之量度。親和力可以數種方式表示。一種方式是以交互作用之解離常數(KD )表示。KD 可藉由常規方法（包括平衡透析）測量，或藉由分別直接測量抗原-抗體解離及締合之速率，即koff （kd或kdis ）及kon （或ka）速率（請參見例如Nature, 1993 361:186-87）。koff /kon 之比率消去所有與親和力無關之參數，且等於解離常數KD （大致上請參見Davies et al.,Annual Rev Biochem, 1990 59:439-473）。因此，較小的KD 意指較高的親和力。親和力的另一種表示方式是Ka ，其為KD 之倒數、或kon /koff 。因此，較高的Ka 意指較高的親和力。例如，用於本申請案之組成物及/或方法的抗體或其抗原結合片段可係在中性pH（例如，pH 6.8至7.8）、諸如生理pH（例如，pH 7.4）下以1奈莫耳(nM, 10−9 M)或更大之KD 結合至TfR且在酸性pH（例如，pH 4.5至6.0，諸如pH5.0）下以10-4 sec-1 或更大之kdis 自TfR解離的抗體或其片段。
因此，本申請案之一個大致態樣關於一種抗TfR抗體或其抗原結合片段，其用於將劑遞送至有需要之對象的腦部，其中該抗TfR抗體或其抗原結合片段在中性pH下以至少1 nM、較佳地1 nM至500 nM之解離常數KD 且在酸性pH、較佳地pH 5下以至少10-4 sec-1 、較佳地10-4 至10-1 sec-1 之解離速率常數kd 結合至轉鐵蛋白受體(TfR)、較佳地人類TfR1。
在一個實施例中，本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段在中性pH下具有2 × 10-2 至2 × 10-4 sec-1 、諸如2 × 10-2 、1 × 10-2 、9 × 10-3 、8 × 10-3 、7 × 10-3 、6 × 10-3 、5 × 10-3 、4 × 10-3 、3 × 10-3 、2 × 10-3 、1 × 10-3 、9 × 10-4 、8 × 10-4 、7 × 10-4 、6 × 10-4 、5 × 10-4 、4 × 10-4 、3 × 10-4 、2 × 10-4 sec-1 、或任何其間之值的解離速率常數kd 。
在某些實施例中，結合至人類TfR之抗體或其抗原結合片段係重鏈(VHH)抗體上之單可變域，其包含具有下列之胺基酸序列的重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2、及HCDR3： (i)     分別為SEQ ID NO: 7、8、及9； (ii)    分別為SEQ ID NO: 317、318、及319； (iii)   分別為SEQ ID NO: 324、325、及326； (iv)   分別為SEQ ID NO: 331、332、及333；或 (v)    分別為SEQ ID NO: 338、339、及340。
較佳地，其係包含與SEQ ID NO: 6、316、323、330、或337具有至少80%、諸如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性之胺基酸序列的VHH片段。
在其他實施例中，結合至人類TfR之抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2、及HCDR3，該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2、及LCDR3，其中該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3具有下列之胺基酸序列： (i)         分別為SEQ ID NO: 292、293、294、295、296、及297； (ii)        分別為SEQ ID NO: 279、280、281、282、283、及284； (iii)       分別為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、及34； (iv)       分別為SEQ ID NO: 57、58、59、60、61、及62； (v)        分別為SEQ ID NO: 85、86、87、88、89、及90； (vi)       分別為SEQ ID NO: 110、111、112、113、114、及115； (vii)      分別為SEQ ID NO: 135、136、137、138、139、及140； (viii)     分別為SEQ ID NO: 191、192、193、194、195、及196； (ix)       分別為SEQ ID NO: 244、245、246、247、248、及249； (x)        分別為SEQ ID NO: 263、264、265、266、267、及268； (xi)       分別為SEQ ID NO: 345、346、347、348、349、及350； (xii)      分別為SEQ ID NO: 355、356、357、358、359、及360； (xiii)     分別為SEQ ID NO: 365、366、367、368、369、及370； (xiv)     分別為SEQ ID NO: 375、376、377、378、379、及380； (xv)      分別為SEQ ID NO: 385、386、387、388、389、及390； (xvi)     分別為SEQ ID NO: 395、396、377、398、399、及400； (xvii)    分別為SEQ ID NO: 405、406、407、408、409、及410； (xviii)   分別為SEQ ID NO: 415、416、417、418、419、及420； (xix)     分別為SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及430； (xx)      分別為SEQ ID NO: 435、436、437、438、439、及440； (xxi)     分別為SEQ ID NO: 445、446、447、448、449、及450； (xxii)    分別為SEQ ID NO: 455、456、457、458、459、及460； (xxiii)   分別為SEQ ID NO: 465、466、467、468、469、及470； (xxiv)   分別為SEQ ID NO: 475、476、477、478、479、及480； (xxv)    分別為SEQ ID NO: 485、486、487、488、489、及490； (xxvi)   分別為SEQ ID NO: 495、496、497、498、499、及500； (xxvii)  分別為SEQ ID NO: 505、506、507、508、509、及510； (xxviii) 分別為SEQ ID NO: 515、516、517、518、519、及520； (xxix)   分別為SEQ ID NO: 525、526、527、528、529、及530； (xxx)    分別為SEQ ID NO: 535、536、537、538、539、及540；或 (xxxi)   分別為SEQ ID NO: 545、546、547、548、549、及550。
在其他實施例中，本申請案之抗體或其抗原結合片段與本文中所例示之抗體或抗原結合片段競爭。抗體或抗原之結合部位可藉由已知方法（諸如ELISA、西方墨點法等）判定。在某些實施例中，此一競爭抗體結合至例示抗體或其抗原結合片段所結合之相同表位（例如，線性或構象表位(conformational epitope)）。用於定位(mapping)抗體所結合之表位的詳細例示性方法係提供於Morris, G. E., (ed.),“Epitope Mapping Protocols,” In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, N.J. (1996)。作為參考抗體之「結合至相同表位之抗體」係指在競爭檢定中阻斷參考抗體與其抗原之結合達50%或更多的抗體，且相反地，參考抗體在競爭檢定中阻斷抗體與其抗原之結合達50%或更多。
較佳地，抗體或其抗原結合片段係單鏈可變片段(scFv)，其包含經由可撓性連接子共價連接至輕鏈可變區(LV )之重鏈可變區(HV )。儘管移除了恆定區並引入了連接子，scFv仍可保留原始免疫球蛋白之特異性。在scFv中，域之順序可為HV -連接子- LV 、或LV -連接子- HV 。連接子可從頭(de novo )設計或衍生自已知蛋白質結構，以在橋聯scFv之可變域時提供相容之長度及構形而不會有嚴重之立體干擾。連接子可具有10至約25個胺基酸的長度。較佳地，連接子係在可變域之羧基端與其他域之胺基端之間橫跨約3.5 nm (35 Å)而不會影響該等域摺疊及形成完整抗原結合部位之能力的肽連接子（Huston et al.,Methods in Enzymology , vol. 203, pp. 46–88, 1991，其全文以引用方式併入本文中）。連接子較佳地包含親水性序列，以避免肽在整個蛋白摺疊過程中嵌入(intercalation)可變域內或可變域之間(Argos,Journal of Molecular Biology , vol. 211, no. 4, pp. 943–958, 1990)。例如，連接子可包含Gly及Ser殘基及/或連同穿插之帶電荷殘基（諸如Glu、Thr、及Lys）以增強溶解度。在一個實施例中，連接子具有SEQ ID NO: 314 (GTEGKSSGSGSESKST)之胺基酸序列。亦可鑑於本揭露而使用任何其他合適的連接子。
在一些實施例中，scFv包含與下列之胺基酸序列具有至少80%、諸如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的胺基酸序列：SEQ ID NO: 278、291、28、56、84、109、134、162、190、218、243、262、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、或544。
在一較佳實施例中，結合至TfR（較佳地人類TfR1）之抗體或其抗原結合片段不含有游離半胱胺酸。
抗TfR抗體或其抗原結合片段（諸如VHH或scFv片段）可鑑於本揭露而使用所屬技術領域中之合適方法生產。例如，VHH或scFv片段可藉由使重組宿主細胞（諸如細菌、酵母菌、或哺乳動物細胞）在適於生產抗體片段之條件下生長，且自細胞培養物回收該片段而重組生產。 腦部穿梭劑建構體
經最佳化之RMT腦部遞送平台係使用轉鐵蛋白受體(TfR)藉由下列方式開發：提升內在胞吞轉送效率，擴展末梢藥物動力學，且針對可接受之安全性概況進行工程改造同時維持治療性mAb之效力。對人類TfR敲入小鼠中胞吞轉送受體親和力與腦部濃度之間的相互作用進行研究。結合動力學之徹底研究展示，為了獲得mAb之最佳腦部PK及PD，需要不會太快或太慢的中性解離速率。在小鼠中觀察到的腦部遞送增強在食蟹獼猴中獲得證實。
亦發現，與新生兒Fc受體(FcRn)之結合增加的經工程改造抗體恆定區會導致末梢清除降低及腦部濃度提升。
將額外Fc突變引入，以除去與Fcγ受體(FcγR)之結合並避免效應功能介導之毒性。當與高親和力抗Tau結合mAb偶合時，這些突變會透過針對小神經膠細胞吸收及目標降解之新穎、非FcγR機制來防止末梢中的效應功能介導之毒性，同時仍維持抗體依賴性吞噬作用(ADP)。此機制係依賴於透過TfR受體之內化，且在促進目標降解上比傳統FcγR介導之ADP更有效率，而不會刺激促發炎細胞介素之分泌。就發明人所知，此為非FcγR介導之ADP的首次報導，代表針對吞噬作用之新穎、有效率、非發炎性機制，其可用於各種治療應用。
因此，在一個大致態樣中，本申請案關於一種抗體靶向之腦部遞送系統，其包含本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段。抗TfR抗體或其抗原結合片段可用於將治療劑或診斷劑遞送至細胞（例如，癌細胞）或BBB系統中。可遞送之劑包括任何神經病症藥物或可用於偵測或分析神經病症藥物之劑。例如，此類劑可係神經營養因子，包括但不限於神經生長因子(NGF)、腦部衍生神經營養因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、神經膠細胞系神經營養因子(GDNF)、及類胰島素生長因子(IGF)；神經肽，包括但不限於P物質、神經肽Y、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)、γ-胺基丁酸(GABA)、多巴胺、膽囊收縮素(CCK)、腦內啡(endorphin)、腦啡肽(enkephalin)、及促甲狀腺素釋放激素(TRH)；細胞介素；抗焦慮劑；抗驚厥劑；多核苷酸及轉殖基因，包括例如小干擾RNA及/或反義寡核苷酸；或結合至腦部目標之抗體或其抗原結合片段。本申請案之抗hTfR抗體或其抗原結合片段可係增強所關注之劑自血液遞送至腦部中並在腦部中發揮功能的有效手段。
具體而言，所關注之劑可呈組合形式或連接至本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段經腸胃外（例如，靜脈內）遞送。例如，劑可非共價附接至抗TfR抗體或其抗原結合片段。劑亦可共價附接至抗TfR抗體或其抗原結合片段以形成接合物。在某些實施例中，接合係藉由蛋白質融合之建構（即，藉由基因融合兩個編碼抗TfR抗體或其抗原結合片段之基因與神經病症藥物並表現為單一蛋白質）。可鑑於本揭露而使用已知方法來將劑連接至抗體或其抗原結合片段。請參見例如Wu et al.,Nat Biotechnol ., 23(9):1137-46, 2005；Trail et al.,Cancer Immunol Immunother ., 52(5):328-37, 2003；Saito et al.,Adv Drug Deliv Rev ., 55(2):199-215, 2003；Jones et al.,Pharmaceutical Research , 24(9):1759-1771, 2007。
在一些實施例中，待遞送至腦部之治療劑或診斷劑及抗TfR抗體或其抗原結合片段可經由非肽連接子或肽連接子共價連接在一起（或接合）。非肽連接子之實例包括但不限於聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、右旋糖酐、聚乙烯醚、可生物降解聚合物、經聚合脂質、幾丁質、及玻尿酸、或其衍生物、或其組合。肽連接子可係由1至50個由肽鍵連接之胺基酸所組成的肽鏈或其衍生物，其N端及C端可共價連接至抗TfR抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，本申請案之接合物係多特異性抗體，其包含結合TfR之第一抗原結合區及結合腦部抗原（諸如β-分泌酶1 (BACE1)、tau、及本文所揭示之其他腦部抗原）之第二抗原結合區。用於製造多特異性抗體之技術包括但不限於兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現（請參見Milstein and Cuello,Nature 305: 537, 1983、WO 93/08829、及Traunecker et al,EMBO J . 10: 3655, 1991）、及「杵臼(knob-in-hole)」工程改造（請參見例如美國專利第5,731,168號）。多特異性抗體亦可藉由下列方式製造：工程改造靜電操縱(electrostatic steering)效應(WO 2009/089004A1)；交聯二或更多個抗體或片段（請參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan et al,Science , 229: 81, 1985）；使用白胺酸拉鏈（請參見例如Kostelny et al,J. Immunol ., 148(5): 1547-1553,1992）；使用「雙鏈抗體」技術（請參見例如Hollinger et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448, 1993）；使用單鏈Fv (sFv)二聚體（請參見例如Gruber et al,J. Immunol , 152:5368 (1994)）；及製備三特異性抗體，如例如Tutt et al.J. Immunol . 147: 60, 1991中所述。本申請案之多特異性抗體亦涵蓋具有三或更多個功能性抗原結合部位之抗體，包括「章魚狀抗體(Octopus antibody)」或「雙可變域免疫球蛋白」(DVD)（請參見例如US 2006/0025576A1及Wu et al.Nature Biotechnology , 25(11):1290-7, 2007）。本申請案之多特異性抗體亦涵蓋「雙作用Fab (Dual Acting Fab)」或「DAF」，其包含結合至TfR以及腦部抗原（例如，BACE1或Tau）之抗原結合區（例如，請參見US 2008/0069820）。在一個實施例中，抗體係抗體片段，各種此類片段已揭示在本文中。
在一個實施例中，本申請案之多特異性抗體係融合建構體，其包含共價連接（或融合）至第二抗體或其抗原結合片段的本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段。較佳地，第二抗體或其抗原結合片段結合至腦部目標，諸如BACE、tau、或其他腦部抗原，諸如本文所述者。抗TfR抗體或其抗原結合片段可直接或經由連接子融合至第二抗體或其抗原結合片段之輕鏈及/或重鏈的羧基端及/或胺基端。
在一個實施例中，抗TfR抗體或其抗原結合片段係直接或經由連接子融合至第二抗體或其抗原結合片段之輕鏈的羧基端。
在另一實施例中，抗TfR抗體或其抗原結合片段係直接或經由連接子融合至第二抗體或其抗原結合片段之輕鏈的胺基端。
在另一實施例中，抗TfR抗體或其抗原結合片段係直接或經由連接子融合至第二抗體或其抗原結合片段之重鏈的羧基端。
在另一實施例中，抗TfR抗體或其抗原結合片段係直接或經由連接子融合至第二抗體或其抗原結合片段之重鏈的胺基端。
在一較佳實施例中，本申請案之融合建構體包含本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段、較佳地抗huTfR1 VHH或scFv片段，該抗TfR抗體或其抗原結合片段經由連接子共價連接至結合至腦部目標之第二抗體或其抗原結合片段之兩個重鏈中僅一者之羧基端。較佳地，連接子具有SEQ ID NO: 312或SEQ ID NO: 313之胺基酸序列。
為了促進在兩個重鏈（例如，一個具有與抗TfR抗體或其抗原結合片段之融合而一個則沒有，或者一個含有針對抗TfR臂之Fc而一個則針對抗腦部目標臂）之間形成異二聚體，將異二聚體突變引入這兩個重鏈之Fc中。此類Fc突變之實例包括但不限於Zymework突變（請參見例如US 10,457,742）及「杵臼(knob in hole)」突變（請參見例如Ridgway et al., Protein Eng., 9(7): 617-621, 1996）。其他異二聚體突變亦可用於本發明中。在一些實施例中，使用如本文所述之經修飾CH3，以促進在兩個重鏈之間形成異二聚體。
除了異二聚體突變以外，亦可引入其他突變。在一些實施例中，融合建構體或雙特異性抗體之Fc區進一步包含改變（增加或減少）、較佳地消除ADCC/CDC的一或多個突變（諸如本文所述之AAS突變）、及/或改變（增加或減少，較佳地增加）融合建構體或雙特異性抗體與FcRn之結合的一或多個突變（諸如本文所述之YTE突變）。在一些實施例中，將融合建構體或雙特異性抗體中之一或多個半胱胺酸殘基用其他胺基酸取代，諸如絲胺酸。
在某些實施例中，本申請案之融合建構體包含： (1)    第一重鏈，其具有與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：SEQ ID NO: 301、304、307、285、288、298、10、13、16、19、22、25、35、38、41、44、47、50、53、63、66、69、72、75、78、81、91、94、97、100、103、106、116、119、122、125、128、131、141、144、147、150、153、156、159、169、172、175、178、181、184、187、197、200、203、206、209、212、215、225、228、231、234、237、240、250、252、256、259、269、272、275、320、327、334、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、及471； (2)    兩個輕鏈，其等各獨立地具有分別與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：302、305、308、286、289、299、11、14、17、20、23、26、36、39、42、45、48、51、54、64、67、70、73、76、79、82、92、95、98、101、104、107、117、120、123、126、129、132、142、145、148、151、154、157、160、170、173、176、179、182、185、188、198、201、204、207、210、213、216、226、229、232、235、238、241、251、253、257、260、270、273、276、321、328、335、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、及472；及 (3)    第二重鏈，其具有分別與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：303、306、309、287、290、300、12、15、18、21、24、27、37、40、43、46、49、52、55、65、68、71、74、77、80、83、93、96、99、102、105、108、118、121、124、127、130、133、143、146、149、152、155、158、161、171、174、177、180、183、186、189、199、202、205、208、211、214、217、227、230、233、236、239、242、252、254、258、261、271、274、277、322、329、336、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463、及473。
本申請案之接合物（諸如多特異性抗體或融合建構體）可鑑於本揭露而藉由任何所屬技術領域中已知之數種技術生產。例如，其可表現自重組宿主細胞，其中藉由標準技術將編碼融合建構體或多特異性抗體之重鏈及輕鏈的（多個）表現載體轉染至宿主細胞中。宿主細胞可係原核或真核宿主細胞。
在一例示性系統中，藉由轉染或電穿孔將編碼本申請案之融合建構體的異二聚體兩個重鏈及輕鏈之一或多個重組表現載體引入宿主細胞中。培養所選之轉化體(transformant)宿主細胞，以允許重鏈及輕鏈在足以生產融合建構體之條件下表現，並自培養基中回收融合建構體。使用標準分子生物學技術製備重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉化體，培養宿主細胞，並自培養基中回收蛋白質建構體。
本申請案提供一種經單離的核酸，其編碼抗TfR抗體或其抗原結合片段（單獨或作為本文所述之任何實施例中或任何請求項中之融合建構體或多特異性抗體的一部分）之胺基酸序列。經單離的核酸可係載體（較佳地表現載體）之一部分。
在另一態樣中，本申請案關於一種宿主細胞，其經本文所揭示之載體轉化。在一實施例中，宿主細胞係原核細胞，例如大腸桿菌。在另一實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。在一實施例中，宿主細胞係哺乳動物細胞，包括但不限於CHO、COS、NS0、SP2、PER.C6、或真菌細胞（諸如釀酒酵母菌）、或昆蟲細胞（諸如Sf9）。醫藥組成物及相關方法
本發明亦關於醫藥組成物、其製備方法及使用其之方法。
在另一大致態樣中，本發明關於一種醫藥組成物，其包含本發明之抗TfR抗體或其抗原結合片段或其接合物及醫藥上可接受之載劑。本發明之抗TfR抗體或其抗原結合片段或接合物（諸如多特異性抗體或融合建構體）亦可用於製造用於本文提及之治療應用的藥劑。醫藥上可接受之載劑可係任何合適的賦形劑、稀釋劑、填料、鹽、緩衝劑、穩定劑、助溶劑、油、脂質、含脂質囊泡、微球、脂質體包封(liposomal encapsulation)、或其他所屬技術領域中熟知用於醫藥配方之材料。將理解載劑、賦形劑或稀釋劑之特徵將取決於特定應用之投予途徑而定。
因此，在一個實施例中，本申請案關於一種將治療劑或診斷劑輸送跨過血腦障壁(BBB)之方法，其包含使偶合至該治療劑或診斷劑之抗TfR抗體或其抗原結合片段暴露於血腦障壁，使得該抗體或其抗原結合片段將偶合至其之該劑輸送跨過血腦障壁。在一個實施例中，劑係神經病症藥物。在另一實施例中，劑係顯影劑或用於偵測神經病症之劑。較佳地，抗TfR抗體或其抗原結合片段或其接合物不會阻礙TfR與其天然配體轉鐵蛋白之結合。抗體以不會抑制TfR與轉鐵蛋白之結合的方式特異性結合至TfR。在一些實施例中，BBB係在哺乳動物（較佳地靈長類，諸如人類，更佳地患有神經病症之人類）中。在一個實施例中，神經病症係選自由下列所組成之群組：阿茲海默症(AD)、中風、失智症、肌肉失養症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊腫纖維化、Angelman氏症候群、Liddle氏症候群、巴金森氏症、匹克症、柏哲德氏症(Paget' s disease)、癌症、及創傷性腦部傷害。
在一個實施例中，本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段、或其接合物係用於在症狀發作之前偵測神經病症及/或評估疾病或病症之嚴重性或持續時間。抗體、其抗原結合片段或接合物允許神經病症之偵測及/或造影，包括藉由放射線攝影術、斷層造影、或磁振造影(MRI)進行造影。
在另一實施例中，抗TfR抗體或其抗原結合片段、或其接合物係用於治療神經病症（例如，阿茲海默症），其包含向需要該治療之對象投予有效量的抗TfR抗體或其抗原結合片段、或其接合物。在一些實施例中，該方法進一步包含向對象投予有效量的至少一種額外治療劑。
在另一實施例中，本申請案關於一種本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段或接合物在製造或製備藥劑中之用途。在一個實施例中，藥劑係用於治療神經疾病或病症。在一進一步實施例中，藥劑係用於治療神經疾病或病症之方法中，該方法包含向患有神經疾病或病症之個體投予有效量的該藥劑。
本申請案之另一大致態樣關於一種在有需要之對象中誘發抗體依賴性吞噬作用(ADP)而不刺激促發炎細胞介素的分泌之方法，其包含向該對象投予複合體，該複合體包含偶合至、較佳地共價接合至根據本申請案之一實施例的抗TfR抗體結合片段之其抗原結合片段的治療性抗體或其抗原結合片段，其中該治療性抗體或其抗原結合片段不具有效應功能。例如，治療性抗體或其抗原結合片段可包含降低或消除效應功能（諸如ADCC或CDC）之一或多個胺基酸修飾，諸如降低或除去與Fcγ受體之結合的突變。此類突變可在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329，諸如L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。在一個實施例中，治療性抗體或其抗原結合片段特異性結合至tau聚集物。
在一些實施例中，該方法進一步包含向對象投予有效量的至少一種額外治療劑。在某些實施例中，額外治療劑係有效治療與抗TfR抗體或其抗原結合片段或接合物所用來治療之神經病症相同或不同的神經病症之治療劑。例示性額外治療劑包括但不限於：各種上述神經藥物、膽鹼酯酶抑制劑（諸如多奈派齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)、卡巴拉汀(rovastigmine)、及塔克寧(tacrine)）、NMDA受體拮抗劑（諸如美金剛(memantine)）、β類澱粉蛋白肽聚集抑制劑、抗氧化劑、γ-分泌酶調節劑、神經生長因子(NGF)模擬物或NGF基因療法、PPARy促效劑、HMS-CoA還原酶抑制劑（斯他汀(statin)）、安帕金(ampakine)、鈣通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、肝醣合成酶激酶抑制劑、靜脈注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin)、蕈毒鹼受體促效劑、菸鹼受體調節劑、主動或被動β類澱粉蛋白肽免疫、磷酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑、及抗β類澱粉蛋白肽抗體。在某些實施例中，至少一種額外治療劑係針對其減輕神經藥物之一或多種副作用來加以選擇。額外治療劑可以相同或分開之配方投予，且與抗TfR抗體或其抗原結合片段或接合物一起或分開投予。本申請案之抗TfR抗體或抗原結合片段或接合物可在投予額外治療劑及/或佐劑之前、同時、及/或之後投予。本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段或接合物亦可與其他介入性療法（諸如但不限於放射療法、行為療法、或所屬技術領域中已知且適用於待治療或預防之神經病症的其他療法）組合使用。
本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段或接合物（及任何額外治療劑）可藉由任何合適手段投予，包括腸胃外、肺內、及鼻內，且如果需要局部治療則包括病灶內投予。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、或皮下投予，部分取決於投予係短期或長期。本文中已設想到各種給藥排程，包括但不限於在各種時間點之單次或多次投予、推注(bolus)投予、及脈衝輸注。
為了預防或治療疾病，本申請案之抗TfR抗體或其抗原結合片段或接合物（當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時）的適當劑量將取決於各種因素，諸如待治療之疾病的類型、抗體或接合物的類型、疾病之嚴重性及病程、抗體、其抗原結合片段或接合物是為了預防性或治療性目的而投予、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應、對象之生理狀態（包括例如，年齡、體重、健康）、及主治醫師之判斷。治療劑量經最佳地滴定以最佳化安全性及療效。抗體、其抗原結合片段或接合物係一次性或經過一系列的治療而合適地投予至患者。
根據具體實施例，治療有效量係指足以達成一、二、三、四、或更多個下列效應之療法之量：(i)減少或改善待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的嚴重性；(ii)減少待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的持續期間；(iii)預防待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的進展；(iv)造成待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的消退；(v)預防待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的發展或發作；(vi)預防待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的復發；(vii)減少患有待治療之疾病、病症、或病況或具有與其相關之症狀的對象之住院；(viii)減少患有待治療之疾病、病症、或病況或具有與其相關之症狀的對象之住院長度；(ix)增加患有待治療之疾病、病症、或病況或具有與其相關之症狀的對象之存活；(xi)抑制或減少對象之待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀；及/或(xii)增強或改善另一療法的（多種）疾病預防或治療效應。
在另一態樣中，本申請案關於一種製品（諸如套組），其含有可用於治療、預防、及/或診斷上述病症之材料。製品包含容器及在該容器上或與該容器相關聯之標示或藥品仿單(package insert)。合適容器包括例如瓶子(bottle)、小瓶(vial)、注射器、IV溶液袋等。容器可形成自各種材料，諸如玻璃或塑膠。容器容納組成物（組成物本身或與其他有效用於治療、預防、及/或診斷病況之組成物組合），且可具有無菌出入孔（例如，容器可係靜脈內溶液袋或具有塞子的小瓶，塞子可被皮下注射針頭刺穿）。組成物中之至少一種活性劑係本申請案之抗體、其抗原結合片段、或接合物。標示或藥品仿單指示組成物係用於治療所選病況。此外，製品可包括(a)第一容器，其含有組成物於其中，其中該組成物包含本申請案之抗體、其抗原結合片段、或接合物；及(b)第二容器，其含有組成物於其中，其中該組成物包含額外細胞毒性劑或另外的治療劑。本發明之此實施例中的製品可進一步包括藥品仿單，其指示組成物可用於治療特定病況。可選地，製品可進一步包含第二（或第三）容器，其包含醫藥上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏液(Ringer's solution)、及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所欲之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭、及注射器。實施例
本發明亦提供以下非限制性實施例。 1.      一種抗TfR抗體或其抗原結合片段，其用於將劑遞送至有需要之對象的腦部，其中該抗TfR抗體或其抗原結合片段在中性pH下以至少1 nM之解離常數KD 且在酸性pH、較佳地pH 5下以至少10-4 sec-1 之解離速率常數kd結合至轉鐵蛋白受體(TfR)、較佳地人類TfR1。 1a.    如實施例1之抗TfR抗體或其抗原結合片段，其在中性pH下具有1 nM至500 nM、諸如1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、200 nM、300 nM、400 nM、500 nM、或任何其間之值的解離常數KD。 1b.    如實施例1或1a之抗TfR抗體或其抗原結合片段，其在酸性pH下具有10-4 sec-1 至10-1 sec-1 、諸如10-4 、10-3 、10-2 、10-1 sec-1 、或任何其間之值的解離速率常數kd。 2.      如實施例1至1b中任一者之抗TfR抗體或其抗原結合片段，其在中性pH下具有2 × 10-2 至2 × 10-4 sec-1 、較佳地2.0 × 10-3 sec-1 之解離速率常數kd。 2a.    如實施例2之抗TfR抗體或其抗原結合片段，其中在中性pH下之該解離速率常數kd係2 × 10-2 至2 × 10-4 sec-1 、諸如2 × 10-2 、1 × 10-2 、9 × 10-3 、8 × 10-3 、7 × 10-3 、6 × 10-3 、5 × 10-3 、4 × 10-3 、3 × 10-3 、2 × 10-3 、1 × 10-3 、9 × 10-4 、8 × 10-4 、7 × 10-4 、6 × 10-4 、5 × 10-4 、4 × 10-4 、3 × 10-4 、2 × 10-4 sec-1 、或任何其間之值。 3.      如實施例1至2a中任一者之抗TfR抗體或其抗原結合片段，其包含： (1)包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2、及HCDR3之重鏈可變區及包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2、及LCDR3之輕鏈可變區，其中該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3具有下列之胺基酸序列： i.             分別為SEQ ID NO: 292、293、294、295、296、及297； ii.            分別為SEQ ID NO: 279、280、281、282、283、及284； iii.           分別為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、及34； iv.           分別為SEQ ID NO: 57、58、59、60、61、及62； v.            分別為SEQ ID NO: 85、86、87、88、89、及90； vi.           分別為SEQ ID NO: 110、111、112、113、114、及115； vii.          分別為SEQ ID NO: 135、136、137、138、139、及140； viii.         分別為SEQ ID NO: 191、192、193、194、195、及196； ix.           分別為SEQ ID NO: 244、245、246、247、248、及249； x.            分別為SEQ ID NO: 263、264、265、266、267、及268； xi.           分別為SEQ ID NO: 345、346、347、348、349、及350； xii.          分別為SEQ ID NO: 355、356、357、358、359、及360； xiii.         分別為SEQ ID NO: 365、366、367、368、369、及370； xiv.         分別為SEQ ID NO: 375、376、377、378、379、及380； xv.          分別為SEQ ID NO: 385、386、387、388、389、及390； xvi.         分別為SEQ ID NO: 395、396、377、398、399、及400； xvii.        分別為SEQ ID NO: 405、406、407、408、409、及410； xviii.       分別為SEQ ID NO: 415、416、417、418、419、及420； xix.         分別為SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及430； xx.          分別為SEQ ID NO: 435、436、437、438、439、及440； xxi.         分別為SEQ ID NO: 445、446、447、448、449、及450； xxii.        分別為SEQ ID NO: 455、456、457、458、459、及460； xxiii.       分別為SEQ ID NO: 465、466、467、468、469、及470； xxiv.       分別為SEQ ID NO: 475、476、477、478、479、及480； xxv.        分別為SEQ ID NO: 485、486、487、488、489、及490； xxvi.       分別為SEQ ID NO: 495、496、497、498、499、及500； xxvii.      分別為SEQ ID NO: 505、506、507、508、509、及510； xxviii.     分別為SEQ ID NO: 515、516、517、518、519、及520； xxix.       分別為SEQ ID NO: 525、526、527、528、529、及530； xxx.        分別為SEQ ID NO: 535、536、537、538、539、及540；或 xxxi.       分別為SEQ ID NO: 545、546、547、548、549、及550；或 (2)重鏈上之單可變域(VHH)，其包含具有下列之胺基酸序列的重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2、及HCDR3： i.     分別為SEQ ID NO: 7、8、及9； ii.    分別為SEQ ID NO: 317、318、及319； iii.   分別為SEQ ID NO: 324、325、及326； iv.   分別為SEQ ID NO: 331、332、及333；或 v.    分別為SEQ ID NO: 338、339、及340。 4.      如實施例3之抗體或其抗原結合片段，其係VHH片段，該VHH片段包含與SEQ ID NO: 6、316、323、330、或337具有至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%序列同一性之胺基酸序列。 4a.    如實施例2之抗體或其抗原結合片段，其中該VHH片段包含SEQ ID NO: 6、316、323、330、或337之胺基酸序列。 5.  如實施例3之抗體或其抗原結合片段，其係單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段包含經由連接子、諸如長度為約10至約25個胺基酸之肽連接子共價連接至該輕鏈可變區(VL)的該重鏈可變區(VH)。 5a.    如實施例5之抗體或其抗原結合片段，其中該VH係經由該scFv中之該連接子連接至該VL之胺基端。 5b.    如實施例5之抗體或其抗原結合片段，其中該VH係經由該scFv中之該連接子連接至該VL之羧基端。 5c.    如實施例5a或5b之抗體或其抗原結合片段，其中該連接子包含Gly及Ser中之一或多者、及一或多個穿插之Glu、Thr、及Lys殘基，較佳地該連接子具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列。 5d.    如實施例5c之抗體或其抗原結合片段，其中該scFv包含分別具有SEQ ID NO: 279、280、281、282、283、及284之胺基酸序列、或分別具有SEQ ID NO: 292、293、294、295、296、及297之胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3； 5e.    如實施例5之抗體或其抗原結合片段，其中該scFv包含與下列之胺基酸序列具有至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%序列同一性之胺基酸序列：SEQ ID NO: 278、291、28、56、84、109、134、162、190、218、243、262、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、或544。 5f.    如實施例5e之抗體或其抗原結合片段，其中該scFv包含下列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 278、291、28、56、84、109、134、162、190、218、243、262、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、或544。 5g.    如實施例5e之抗體或其抗原結合片段，其中該scFv包含SEQ ID NO: 278、291、162、或218之胺基酸序列。 5h.    一種抗體或其抗原結合片段，其結合至如實施例3至5g中任一者之抗體或其抗原結合片段的相同表位。 5i.     一種抗體或其抗原結合片段，其與如實施例3至5g中任一者之抗體或其抗原結合片段競爭結合至該TfR。 5j.     如實施例3至5i中任一者之抗體或其抗原結合片段，其在pH7.4下以1至500 nM、諸如1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、200 nM、300 nM、400 nM、500 nM、或任何其間之值的解離常數KD結合至人類TfR1。 5k.    如實施例3至5j中任一者之抗體或其抗原結合片段，其在pH5下以10-4 至10-1 sec-1 、諸如10-4 、10-3 、10-2 、10-1 sec-1 、或任何其間之值的解離速率常數kd結合至人類TfR1。 6.      一種複合體，其包含偶合至治療劑或診斷劑的如實施例1至5k中任一者之抗體或其抗原結合片段。 6a.    如實施例6之複合體，其中該抗體或其抗原結合片段係非共價偶合至該治療劑或診斷劑。 6b.    如實施例6之複合體，其中該抗體或其抗原結合片段係共價偶合至該治療劑或診斷劑以形成接合物。 6c.    如實施例6之複合體，其中該抗體或其抗原結合片段係經由連接子共價連接至該治療劑或診斷劑。 6d.    如實施例6c之複合體，其中該連接子係非肽連接子，諸如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、右旋糖酐、聚乙烯醚、可生物降解聚合物、經聚合脂質、幾丁質、及玻尿酸、或其衍生物、或其組合。 6e.    如實施例6c之複合體，其中該連接子係肽連接子，諸如由1至50個由肽鍵連接之胺基酸所組成的肽鏈或其衍生物。 6f.    如實施例6至6e中任一者之複合體，其中該抗體或其抗原結合片段係偶合至用於偵測神經病症之該診斷劑，較佳地該診斷劑係用於正子發射斷層造影(PET)之劑、或用於IDK之劑。 6g.    如實施例6至6e中任一者之複合體，其中該抗體或其抗原結合片段係偶合至治療劑、較佳地神經病症藥物。 6h.    如實施例6g之複合體，其中該神經病症藥物係選自由下列所組成之群組：小分子化合物、抗體、肽、蛋白質、一或多種CNS目標之天然配體、一或多種CNS目標之天然配體的經修飾版本、適體、抑制性核酸（即，小型抑制性RNA (siRNA)及短髮夾RNA (shRNA)）、核酶、及前述者之活性片段。 6i.     如實施例6g之複合體，其中該神經病症藥物係選自由下列所組成之群組：抗體、適體、蛋白質、肽、抑制性核酸及小分子、及本身係CNS抗原或目標分子或特異性辨識且/或作用於（即，抑制、活化、或偵測）CNS抗原或目標分子的任何前述者之活性片段，諸如但不限於類澱粉蛋白前驅蛋白或其部分、β類澱粉蛋白、β-分泌酶、γ-分泌酶、tau、α-突觸核蛋白、parkin、亨丁頓蛋白、DR6、早老素、ApoE、神經膠質瘤或其他CNS癌症標記、及神經營養因子。神經病症藥物及其等可用於治療之對應病症的非限制性實例：腦部衍生神經營養因子(BDNF)、慢性腦部傷害（神經生成）、纖維母細胞生長因子2 (FGF-2)、抗表皮生長因子受體腦部癌症、(EGFR)-抗體、神經膠細胞系衍生神經因子巴金森氏症、(GDNF)、腦部衍生神經營養因子(BDNF)肌萎縮性脊髓側索硬化症、憂鬰、腦部之溶體酶溶體儲積症、睫狀神經營養因子(CNTF)肌萎縮性脊髓側索硬化症、神經調節蛋白1思覺失調症、抗HER2抗體（例如，曲妥珠單抗）自HER2陽性癌症之腦部轉移。 7.      如實施例6之複合體，其係多特異性抗體，該多特異性抗體包含結合TfR之第一抗原結合區及結合腦部抗原（或腦部目標）之第二抗原結合區，其中該第一抗原結合區包含如實施例1至5k中任一者之其抗原結合片段。 7a.    如實施例7之多特異性抗體，其中該腦部目標係選自由下列所組成之群組：β-分泌酶1 (BACE1)、β類澱粉蛋白(Aβ)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、Tau、載脂蛋白E4 (ApoE4)、α -突觸核蛋白、CD20、亨丁頓蛋白、普里昂蛋白(PrP)、富白胺酸重複激酶2 (LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6 (DR6)、類澱粉蛋白前驅蛋白(APP)、p75神經營養因子受體(p75NTR)、及凋亡蛋白酶6。 7b.    如實施例7a之多特異性抗體，其中該第二抗原結合區結合BACE1或Tau。 7c.    如實施例7至7b中任一者之多特異性抗體，其中該第一抗原結合區係共價連接至第一Fc，且該第二抗原結合區係共價連接至第二Fc。 7d.    如實施例7c之多特異性抗體，其中該第一Fc與該第二Fc在一或多個胺基酸殘基上不同，以促進在該第一Fc與該第二Fc之間形成異二聚體。 8.      如實施例7至7d中任一者之多特異性抗體，其係融合建構體，該融合建構體包含共價連接結合該腦部抗原（或腦部目標）之第二抗體或其抗原結合片段的如實施例1至5k中任一者之抗體或其抗原結合片段。 8a.    如實施例8之融合建構體，其中如實施例1至5k中任一者之抗體或其抗原結合片段係共價連接、較佳地經由連接子連接至該第二抗體或其抗原結合片段之重鏈的胺基端。 8b.    如實施例8之融合建構體，其中如實施例1至5k中任一者之抗體或其抗原結合片段係共價連接、較佳地經由連接子連接至該第二抗體或其抗原結合片段之輕鏈的胺基端。 8c.    如實施例8之融合建構體，其中如實施例1至5k中任一者之抗體或其抗原結合片段係共價連接、較佳地經由連接子連接至該第二抗體或其抗原結合片段之輕鏈的羧基端。 8d.    如實施例8之融合建構體，其中如實施例1至5k中任一者之抗體或其抗原結合片段係共價連接、較佳地經由連接子連接至該第二抗體或其抗原結合片段之重鏈的羧基端。 9.      如實施例8d之融合建構體，其中如實施例1至5k中任一者之抗體或其抗原結合片段係經由連接子共價連接至該第二抗體或抗原結合片段之兩個重鏈中僅一者之羧基端。 9a.    如實施例8a至9中任一者之融合建構體，其中該連接子係包含Gly及Ser中之一或多者的肽連接子，較佳地該連接子具有SEQ ID NO: 312或SEQ ID NO: 313之胺基酸序列。 9b.    如實施例8至9a中任一者之融合建構體，其中該第二抗體或其抗原結合片段包含第一Fc在其第一重鏈及第二Fc在其第二重鏈，且該第一Fc與該第二Fc在一或多個胺基酸殘基上不同，以促進在該第一Fc與該第二Fc之間形成異二聚體。 9c.    如實施例7d之多特異性抗體或如實施例9b之融合建構體，其中該第一Fc含有一或多個「杵(knob)」突變，且該第二Fc含有一或多個對應「臼(hole)」突變，或反之亦然（關於「杵臼」突變，請參見例如美國專利第5,731,168號、Ridgway et al., Protein Eng., 9(7): 617-621, 1996，該等文獻之全文以引用方式併入本文中），較佳地T366W之杵突變及T366S、L368A、或Y407V之臼突變。 9d.    如實施例7d之多特異性抗體或如實施例9b之融合建構體，其中該第一Fc及該第二Fc之各者包含相較於野生型CH3域多肽之經修飾異二聚體CH3域，較佳地該經修飾異二聚體CH3域包含一或多個如US10,457,742中所述之突變。 9e.    如實施例9d之多特異性抗體或融合建構體，其中該第一Fc之該經修飾異二聚體CH3域在位置T350、L351、F405、及Y407包含胺基酸修飾，且該第二Fc之該經修飾異二聚體CH3域在位置T350、T366、K392、及T394包含胺基酸修飾。 9f.    如實施例9e之多特異性抗體或融合建構體，其中在位置T350之胺基酸修飾係T350V、T350I、T350L、或T350M；在位置L351之胺基酸修飾係L351Y；在位置F405之胺基酸修飾係F405A、F405V、F405T、或F405S；在位置Y407之胺基酸修飾係Y407V、Y407A、或Y407I；在位置T366之胺基酸修飾係T366L、T366I、T366V、或T366M，在位置K392之胺基酸修飾係K392F、K392L、或K392M，且在位置T394之胺基酸修飾係T394W。 9g.    如實施例9e之多特異性抗體或融合建構體，其中該第一Fc之該經修飾異二聚體CH3域包含突變T350V、L351Y、F405A、及Y407V，且該第二Fc之該經修飾異二聚體CH3域包含突變T350V、T366L、K392L、及T394W，或反之亦然。 10.    如實施例7至9g中任一者之多特異性抗體或融合建構體，其中該多特異性抗體或融合建構體之該Fc區進一步包含改變（增加或減少）、較佳地增加該第二抗體或其抗原結合片段與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的取代。 10a.  如實施例10之多特異性抗體或融合建構體，其中該第二抗體或其抗原結合片段在該Fc域中包含增強該融合與該新生兒Fc受體(RcRn)之結合的一或多個突變。 10b.  如實施例10或10a之多特異性抗體或融合建構體，其中該一或多個突變增強在酸性pH下之該結合。 10c.  如實施例10b之多特異性抗體或融合建構體，其中該第二抗體之該Fc具有M252Y/S254T/T256E (YTE)突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。 11.    如實施例7至10c中任一者之多特異性抗體或融合建構體，其中該多特異性抗體或融合建構體之該Fc區進一步包含改變（增加或減少）、較佳地降低或消除效應功能的取代。 11a.  如實施例11之多特異性抗體或融合建構體，其中該第二抗體或其抗原結合片段在該Fc域中包含降低或消除效應功能的一或多個突變，效應功能諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。 11b.  如實施例11a之多特異性抗體或融合建構體，其中該第二抗體之該Fc在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329具有一或多個胺基酸修飾，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。 11c.  如實施例11b之多特異性抗體或融合建構體，其中該第二抗體之該Fc具有L234A、L235A、及P331S（AAS突變）中之一、二、或三個突變。 12.    如實施例7至11c中任一者之多特異性抗體或融合建構體，其中該第一抗原結合區或該抗體或其抗原結合片段不含有半胱胺酸。 13.    如實施例7至12之多特異性抗體或融合建構體，其中該第二抗原結合區或該第二抗體或其抗原結合片段結合Tau，較佳地其包含分別具有SEQ ID NO: 554至559之胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，較佳地該第二抗體係單株抗體，該單株抗體包含具有SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的輕鏈。 14.    如實施例9之融合建構體，其包含： (1)    第一重鏈，其具有與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：SEQ ID NO: 301、304、307、285、288、298、10、13、16、19、22、25、35、38、41、44、47、50、53、63、66、69、72、75、78、81、91、94、97、100、103、106、116、119、122、125、128、131、141、144、147、150、153、156、159、169、172、175、178、181、184、187、197、200、203、206、209、212、215、225、228、231、234、237、240、250、252、256、259、269、272、275、320、327、334、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、及471； (2)    兩個輕鏈，其等各獨立地具有分別與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：302、305、308、286、289、299、11、14、17、20、23、26、36、39、42、45、48、51、54、64、67、70、73、76、79、82、92、95、98、101、104、107、117、120、123、126、129、132、142、145、148、151、154、157、160、170、173、176、179、182、185、188、198、201、204、207、210、213、216、226、229、232、235、238、241、251、253、257、260、270、273、276、321、328、335、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、及472；及 (3)    第二重鏈，其具有分別與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：303、306、309、287、290、300、12、15、18、21、24、27、37、40、43、46、49、52、55、65、68、71、74、77、80、83、93、96、99、102、105、108、118、121、124、127、130、133、143、146、149、152、155、158、161、171、174、177、180、183、186、189、199、202、205、208、211、214、217、227、230、233、236、239、242、252、254、258、261、271、274、277、322、329、336、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463、及473。 14a.  如實施例14之融合建構體，其中該兩個輕鏈具有相同胺基酸序列。 14b.  如實施例14之融合建構體，其中該兩個輕鏈具有不同胺基酸序列。 14c.  如實施例14之融合建構體，其中： (1)    該第一重鏈具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 301、304、307、285、288、298、10、13、16、19、22、25、35、38、41、44、47、50、53、63、66、69、72、75、78、81、91、94、97、100、103、106、116、119、122、125、128、131、141、144、147、150、153、156、159、169、172、175、178、181、184、187、197、200、203、206、209、212、215、225、228、231、234、237、240、250、252、256、259、269、272、275、320、327、334、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、及471； (2) 該兩個輕鏈分別各具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：302、305、308、286、289、299、11、14、17、20、23、26、36、39、42、45、48、51、54、64、67、70、73、76、79、82、92、95、98、101、104、107、117、120、123、126、129、132、142、145、148、151、154、157、160、170、173、176、179、182、185、188、198、201、204、207、210、213、216、226、229、232、235、238、241、251、253、257、260、270、273、276、321、328、335、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、及472；且 (3)    該第二重鏈分別具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：303、306、309、287、290、300、12、15、18、21、24、27、37、40、43、46、49、52、55、65、68、71、74、77、80、83、93、96、99、102、105、108、118、121、124、127、130、133、143、146、149、152、155、158、161、171、174、177、180、183、186、189、199、202、205、208、211、214、217、227、230、233、236、239、242、252、254、258、261、271、274、277、322、329、336、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463、及473。 14d.  如實施例14之融合建構體，其中： (1)    該第一重鏈具有SEQ ID NO: 285、288、298、或301之胺基酸序列； (2)    該兩個輕鏈分別各具有286、289、299、或302之胺基酸序列；且 (3)    該第二重鏈分別具有287、290、300、或303之胺基酸序列。 15.    一種經單離的核酸，其編碼如實施例1至5k中任一者之抗體或抗原結合片段、或如實施例7至14d中任一者之融合建構體。 16.    一種載體，其包含如請求項15所述之經單離的核酸。 17. 一種宿主細胞，其包含如實施例15之核酸或如實施例16之載體。 18.    一種生產如實施例1至5k中任一者之抗體或抗原結合片段、或如實施例7至14d中任一者之融合建構體的方法，其包含在生產該抗體或抗原結合片段、該融合建構體之條件下，培養包含編碼該抗體或抗原結合片段、或該融合建構體之核酸的細胞；及自該細胞或細胞培養物回收該抗體或抗原結合片段、該接合物、或該融合建構體。 19.    一種醫藥組成物，其包含如實施例1至5k中任一者之抗體或抗原結合片段、如實施例6至6i中任一者之複合體、或如實施例7至14d中任一者之多特異性抗體或融合建構體、及醫藥上可接受之載劑。 20.    一種治療或偵測有需要之對象的神經病症之方法，其包含向該對象投予有效量的如實施例1至5k中任一者之抗體或抗原結合片段、如實施例6至6i中任一者之複合體、或如實施例7至14d中任一者之多特異性抗體或融合建構體、或如實施例19之醫藥組成物。 21.    一種增加治療劑或診斷劑遞送至有需要之對象的腦部之方法，其包含向該對象投予接合物，該接合物包含偶合至如實施例1至5k中任一者之抗體或其抗原結合片段的該治療劑或診斷劑。 22.    一種將治療劑或診斷劑輸送跨過血腦障壁(BBB)之方法，其包含使偶合至該治療劑或診斷劑之如實施例1至5k中任一者之抗TfR抗體或其抗原結合片段暴露於該血腦障壁，使得該抗體或其抗原結合片段將偶合至其之該劑輸送跨過該血腦障壁。 23.    一種將治療劑或診斷劑遞送跨過有需要之對象的血腦障壁(BBB)之方法，其包含向該對象投予複合體，該複合體包含偶合至、較佳地共價接合至如實施例1至5中任一者之抗體或其抗原結合片段的該治療劑或診斷劑。 24.    一種在有需要之對象中誘發抗體依賴性吞噬作用(ADP)而不刺激促發炎細胞介素的分泌之方法，其包含向該對象投予複合體，該複合體包含偶合至、較佳地共價接合至如實施例1至5中任一者之其抗原結合片段的治療性抗體或其抗原結合片段，其中該治療性抗體或其抗原結合片段在該Fc域中包含降低或消除效應功能的一或多個突變，該效應功能諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。 24a.  如實施例23之方法，其中該治療性抗體或其抗原結合片段在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329包含一或多個胺基酸修飾，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。 24b.  如實施例24a之方法，其中該治療性抗體或其抗原結合片段包含L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變。 25.    如實施例20至24b中任一者之方法，其中該對象需要治療神經病症，較佳地該神經病症係選自由下列所組成之群組：神經退化性疾病（諸如路易氏體病、脊髓灰質炎後症候群、Shy-Draeger症候群、橄欖體橋腦小腦萎縮、巴金森氏症、多系統萎縮、紋狀體與黑質體退化症、脊髓小腦性失調症、脊髓性肌萎縮）、tau蛋白病（諸如阿茲海默症及核上神經麻痺症）、普里昂疾病（諸如牛海綿狀腦病、羊搔癢症、庫賈氏症候群、庫魯病、吉斯曼-史特斯勤-先克病、慢性消耗病、及致死性家族性失眠症）、延髓性麻痺、運動神經元疾病、及神經系統異退化性病症（諸如Canavan病、亨丁頓舞蹈症、神經元蠟樣脂褐質儲積症、亞歷山大氏病、妥瑞氏症候群、Menkes氏捲髮症候群、柯凱因氏症候群、Halervorden-Spatz氏症候群、拉弗拉病、雷特氏症候群、肝豆狀核變性、Lesch-Nyhan氏症候群、及Unverricht-Lundborg氏症候群）、失智症（諸如匹克症及脊髓小腦性失調症）、及CNS及/或腦部之癌症（諸如身體其他地方之癌症所致的腦部轉移）。 26.    如實施例20至25中任一者之方法，其中該抗體或其抗原結合片段、該複合體、該多特異性抗體、該融合建構體、或該醫藥組成物經靜脈內投予。 27.    如實施例21至26中任一者之方法，其中該治療劑或治療性抗體或其抗原結合片段係神經病症藥物。 28.    如實施例21至23中任一者之方法，其中該劑係顯影劑或用於偵測神經病症之劑。 29.    如實施例20至28中任一者之方法，其中該抗TfR抗體或其抗原結合片段、其複合體或融合不會阻礙TfR與其天然配體轉鐵蛋白之結合。 30.    如實施例20至29中任一者之方法，其中該投予降低Fc介導之效應功能。 31.    如實施例21至30中任一項之方法，其中該投予不誘發快速網狀紅血球耗盡。 32.    如實施例31之方法，其中該治療性抗體或其抗原結合片段特異性結合至tau聚集物 33.    如實施例20至32中任一者之方法，其中該對象係靈長類，諸如人類，更佳地患有神經病症之人類。 34.    如實施例33之方法，其中該神經病症係選自由下列所組成之群組：：阿茲海默症(AD)、中風、失智症、肌肉失養症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊腫纖維化、Angelman氏症候群、Liddle氏症候群、巴金森氏症、匹克症、柏哲德氏症、癌症、及創傷性腦部傷害。
本發明的下列實例是要進一步說明本發明的本質。應了解的是，下列實例不會對本發明造成限制，且本發明之範疇係由隨附之申請專利範圍決定。實例 實例1
雖然血腦障壁(BBB)防止有害物質進入腦部且對於腦內恆定(brain homeostasis)是不可或缺的，其也會對於將藥物有效率遞送至腦部造成難以克服的障礙。為此目的，開發了穿透BBB並導致明顯比單獨mAb高之腦部濃度的單株抗體(mAb)腦部穿梭劑平台。 抗體產生（OMT 大鼠及Ablexis 小鼠）
將OMT大鼠（OmniRat®，來自Ligand Pharmaceuticals）及Ablexis小鼠(Ablexis, LLC, San Diego, CA)用人類(SEQ ID NO: 1)、食蟹獼猴(SEQ ID NO: 2)、及狨(SEQ ID NO: 3)轉鐵蛋白受體(TfR)，並使用重複免疫多部位(RIMMS)規程免疫46天(Ablexis)、49天(OMT)、或50天(OMT)。簡言之，在鄰近區域引流淋巴結之多個皮下部位將動物重複免疫。在第32天(OMT)或第35天(Ablexis)進行血清效價測量(titration)（ELISA，酶聯免疫吸附檢定），且所有動物在人類、食蟹獼猴、及狨TfR上均顯示大致上低至中度的效價而在陰性對照組上則未顯示效價。自血清陽性大鼠及小鼠中採集淋巴結並將其融合以產生融合瘤。
先將融合瘤藉由Meso Scale Discovery (MSD)或ELISA針對與HEK293T huTfR（人類轉鐵蛋白受體）表現性細胞之結合進行篩選。接著在確認篩選中對所有這些命中者進行測試。在螢光活化細胞分選(FACS)之確認篩選中，使用MDCK-huTfR細胞（馬丁-達比(Madin-Darby)犬腎細胞）及pBEC（微血管內皮細胞，內源huTfR表現），並使用MDCK（親本）細胞作為陰性細胞株。在確認篩選後，識別出616個TfR特異性細胞結合劑（結合huTfR表現性細胞之任一者/或/兩者）。在這616個命中者中，340個係結合於pBEC及MDCK-huTfR細胞上，16個僅結合於pBEC上，且260個僅結合於MDCK-huTfR上。
接著對結合pBEC及MDCK-huTfR細胞之融合瘤針對與大鼠TfR (SEQ ID NO: 4)及小鼠TfR (SEQ ID NO: 5)之結合進行評估，檢查在pBEC中之內化及與TfR之競爭。針對與人類、食蟹獼猴、及狨具有交叉反應性且內化而不競爭TfR之mAb製備RNA裂解物(lysate)。獲得抗體V區定序數據。 抗體產生(Llama)
為了產生對抗人類TfR且與食蟹獼猴、小鼠、及大鼠具有交叉反應性之單域(VHH)抗體，在專案452L中在Abcore使用兩隻駱馬（動物1663L及1663L）進行免疫。抗體效價係藉由ELISA使用TfR蛋白(1 µg/ml)判定。對來自這兩隻動物的三次採血進行測試，且兩隻動物均顯示良好的早期效價。
噬菌體展示係在Abcore使用其標準規程完成。製作出兩個庫：來自兩隻動物的第二次採血之庫1 (452L-1)及來自第二次及第三次採血之庫2 (452L-2)。對來自12個隨機個別殖株之質體DNA進行定序，且＞80%含有具有正確讀框之VHH插入。對兩個噬菌體展示庫以人類TfR使用標準Abcore淘選程序進行篩選。以人類TfR在10 µg/ml下進行三輪淘選。在淘選之後，對94個個別殖株藉由噬菌體ELISA針對與蛋白酶活化受體1 (Par1) N端域之特異性結合及與BSA（牛血清白蛋白）之非特異性結合進行篩選。測量與食蟹獼猴、小鼠、及大鼠TfR之交叉反應性。選出94個殖株以進行序列分析。 噬菌體抗體產生
將噬菌體庫針對生物素化huTfR（與轉鐵蛋白複合）進行淘選。將生物素化複合體捕捉於鏈黴親和素磁珠(Dynal)上並暴露於從頭pIX Fab庫，其係與轉鐵蛋白預培養，最終濃度為100 nM（第1及2輪）或50 nM（第3及4輪）。在PBS-Tween中洗去非特異性噬菌體，並藉由感染MC1061F’大腸桿菌(E. coli)細胞回收結合的噬菌體。自這些細胞擴增噬菌體整夜，並重複淘選總共四輪。在四輪生物淘選之後，對單株Fab針對與人類轉鐵蛋白受體之結合在ELISA中進行篩選。對展示與轉鐵蛋白受體結合之殖株在重鏈及輕鏈可變區中進行定序。
本發明之TfR抗體或抗原結合片段的實例係彙總於下表1a中。 抗TfR mAb（作為以下更詳細描述之三腳架融合建構體（BBBB建構體）之一部分）在中性pH (7.4)及酸性pH (5)下與TfR之結合親和力（KD、kon或ka及koff或kdis或kd）係使用下列生物層干涉法測量。結果係示於下表1b中。 表1a
名稱 序列 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
TfR1 (VHH) SEQ ID NO: 6   SEQ ID NO: 7 GLTFSNYA SEQ ID NO: 8 IGGSGGTW SEQ ID NO: 9 AADQRAGSYSS GWYTRSSDSLY      
TfR2 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 GFTFRNAW SEQ ID NO: 30 IKRKIDGGT SEQ ID NO: 31 TTDPSRIPVAGAFDY SEQ ID NO: 32 QSVSSTY SEQ ID NO: 33 GASSRAT SEQ ID NO: 34 QQYGSSPYT
TfR3 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57 GFTFSSYNMNW SEQ ID NO: 58 SSISSSSSYI SEQ ID NO: 59 AREGISAYDALNV SEQ ID NO: 60 SSSNIGNNY SEQ ID NO: 61 DNNKRPS SEQ ID NO: 62 GTWDSSLSAVV
TfR4 SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 85 GFTFSSYAMNW SEQ ID NO: 86 SGISGSGVSTN SEQ ID NO: 87 AKEDYDSSGYYPFDY SEQ ID NO: 88 HKLGDKF SEQ ID NO: 89 QDRKRPS SEQ ID NO: 90 QTWYSSTVI
TfR5 SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 GFTFSSDAMHW SEQ ID NO: 111 AVIWYDGSNKY SEQ ID NO: 112 ARDRQWLAFDY SEQ ID NO: 113 SSDVGGYNF SEQ ID NO: 114 EVSKRPS SEQ ID NO: 115 SYRDSNNFDVL
TfR6 SEQ ID NO: 134 SEQ ID NO: 135 GFTFNNYVMNW SEQ ID NO: 136 ISGSGGTT SEQ ID NO: 137 AKEDDDSTGYYPFDY SEQ ID NO: 138 KLGDKFV SEQ ID NO: 139 QDSKRPS SEQ ID NO: 140 QTWDRSTVV
TfR7 SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 163 GFTFSSYAMNW SEQ ID NO: 164 ISGSGGHT SEQ ID NO: 165 AREGYDSSGYNPFDY SEQ ID NO: 166 KLGDKYA SEQ ID NO: 167 QDSKRPS SEQ ID NO: 168 QAWDSSTVV
TfR8 SEQ ID NO: 190 SEQ ID NO: 191 GGSISSTSYY SEQ ID NO: 192 IYYSGNT SEQ ID NO: 193 ARHDWYGGSYGWFDP SEQ ID NO: 194 SLRSYY SEQ ID NO: 195 AKNNRPS SEQ ID NO: 196 NSRDSSGNHMV
TfR9 SEQ ID NO: 218 SEQ ID NO: 219 GGSFSGYY SEQ ID NO: 220 FIHSGST SEQ ID NO: 221 ARGSMDSSGFYSFDF SEQ ID NO: 222 KLGDKF SEQ ID NO: 223 QDRKRP SEQ ID NO: 224 QTWYSSTVI
TfR10 SEQ ID NO: 243 SEQ ID NO: 244 GYSFTSYW SEQ ID NO: 245 IDPSDSYT SEQ ID NO: 246 ARMYKGRGHLFDY SEQ ID NO: 247 QSVSKA SEQ ID NO: 248 AASNRAT SEQ ID NO: 249 QQYYRAPYT
TfR11 SEQ ID NO: 262 SEQ ID NO: 263 GYSFTSYW SEQ ID NO: 264 IDPSDSYT SEQ ID NO: 265 ARMYKGHGHLFDY SEQ ID NO: 266 QSVSKA SEQ ID NO: 267 AASNRAT SEQ ID NO: 268 QQYYRAPYT
TfR12 SEQ ID NO: 278 SEQ ID NO: 279 GGSFSGYY SEQ ID NO: 280 FIHSGST SEQ ID NO: 281 ARGSMDSSGFYSFDF SEQ ID NO: 282 KLGDKF SEQ ID NO: 283 QDRKRP SEQ ID NO: 284 QTWYSSTVI
TfR13 SEQ ID NO: 291 SEQ ID NO: 292 GFTFSSYAMNW SEQ ID NO: 293 ISGSGGHT SEQ ID NO: 294 AREGYDSSGYNPFDY SEQ ID NO: 295 KLGDKYA SEQ ID NO: 296 QDSKRPS SEQ ID NO: 297 QAWDSSTVV
TfR14 (VHH) SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 317 GLTFSNYA SEQ ID NO: 318 IGGSGGTW SEQ ID NO: 319 AADQRAGSYSSGWYTRSSDSLY      
TfR15 (VHH) SEQ ID NO: 323 SEQ ID NO: 324 GLTFSSYV SEQ ID NO: 325 INGDGKF SEQ ID NO: 326 ASDQRAGSLSSGWYSRRSYDTLY      
TfR16 (VHH) SEQ ID NO: 330 SEQ ID NO: 331 GFTFSSYA SEQ ID NO: 332 ISWSGRW SEQ ID NO: 333 VSDQRPGTLSSGWYSRSSDTLY      
TfR17 (VHH) SEQ ID NO: 337 SEQ ID NO: 338 VRISSANVV SEQ ID NO: 339 SISGGDP SEQ ID NO: 340 NYWNEGIRY      
TfR18 SEQ ID NO: 344 SEQ ID NO: 345 GFTFSSYW SEQ ID NO: 346 INNIGNSR SEQ ID NO: 347 ARAGNWDRDTFDI SEQ ID NO: 348 QSVLYSSNNKIY SEQ ID NO: 349 WAS SEQ ID NO: 350 QQYYSTPYT
TfR19 SEQ ID NO: 354 SEQ ID NO: 355 GFTFSRYS SEQ ID NO: 356 ISSSSTNI SEQ ID NO: 357 ARDYMWKVFDY SEQ ID NO: 358 QSLLDSDDGNIF SEQ ID NO: 359 TLS SEQ ID NO: 360 MQRIEFPIT
TfR20 SEQ ID NO: 364 SEQ ID NO: 365 GFTFSRYS SEQ ID NO: 366 ISSSSTNI SEQ ID NO: 367 AREYMWKVFDY SEQ ID NO: 368 QSLLDSDDGNIF SEQ ID NO: 369 TVS SEQ ID NO: 370 MQRIEFPIT
TfR21 SEQ ID NO: 374 SEQ ID NO: 375 GFTFNSYD SEQ ID NO: 376 IDTAGDT SEQ ID NO: 377 ARDRLGYYGLDV SEQ ID NO: 378 QSVSSSY SEQ ID NO: 379 GAS SEQ ID NO: 380 QQYDRSPIT
TfR22 SEQ ID NO: 384 SEQ ID NO: 385 GLTFNNHN SEQ ID NO: 386 ISSSSSYK SEQ ID NO: 387 ARDGIAAFDAFD SEQ ID NO: 388 QSLVYSDGITY SEQ ID NO: 389 KVS SEQ ID NO: 390 MQGTHWPPT
TfR23 SEQ ID NO: 394 SEQ ID NO: 395 GFSLSTSGMS SEQ ID NO: 396 IDWRDDK SEQ ID NO: 397 AGIPGY SEQ ID NO: 398 QNVATN SEQ ID NO: 399 SAS SEQ ID NO: 400 QQYNNYPFT
TfR24 SEQ ID NO: 404 SEQ ID NO: 405 GFTFSTYD SEQ ID NO: 406 IWYDGTNR SEQ ID NO: 407 ARDHGYTKFSDAFDF SEQ ID NO: 408 QGISNY SEQ ID NO: 409 AAS SEQ ID NO: 410 LQHNSYPLT
TfR25 SEQ ID NO: 414 SEQ ID NO: 415 GGSISAYY SEQ ID NO: 416 IYASGTT SEQ ID NO: 417 ARQETDTTGYDYFDY SEQ ID NO: 418 KLGDKF SEQ ID NO: 419 QDN SEQ ID NO 420 QTWDRSDAV
TfR26 SEQ ID NO: 424 SEQ ID NO: 425 GFTFSYYW SEQ ID NO: 426 ISSDGSST SEQ ID NO: 427 AREQRWLKSYYYGMDV SEQ ID NO: 428 QGINSY SEQ ID NO: 429 AAS SEQ ID NO: 430 QQLNSYPLT
TfR27 SEQ ID NO: 434 SEQ ID NO: 435 AFRFSNFN SEQ ID NO: 436 ITSTGTYI SEQ ID NO: 437 ARQGIPAWDAFDL SEQ ID NO: 438 QGISNY SEQ ID NO: 439 ASS SEQ ID NO: 440 LQHNSYPYT
TfR28 SEQ ID NO: 444 SEQ ID NO: 445 GFTFSSYN SEQ ID NO: 446 ISSSSSYI SEQ ID NO: 447 AREGISAYDALNV SEQ ID NO: 448 QGISNF SEQ ID NO: 449 AAS SEQ ID NO: 450 LQHDSYPLT
TfR29 SEQ ID NO: 454 SEQ ID NO: 455 GFTFSSYN SEQ ID NO: 456 ISSSSSYI SEQ ID NO: 457 AREGISAYDALNV SEQ ID NO: 458 SSNIGNNY SEQ ID NO: 459 DNN SEQ ID NO: 460 GTWDSSLSAVV
TfR30 SEQ ID NO: 464 SEQ ID NO: 465 GFTFSDYY SEQ ID NO: 466 ISSSSVTI SEQ ID NO: 467 AREDSDTSGYDPFDH SEQ ID NO: 468 QSVSSN SEQ ID NO: 469 GAS SEQ ID NO: 470 QQYNNWPYT
TfR31 SEQ ID NO: 474 SEQ ID NO: 475 GFTLSDYD SEQ ID NO: 476 INSGGNII SEQ ID NO: 477 ARLYYDTSGYSSFDY SEQ ID NO: 478 KLGDKF SEQ ID NO: 479 QDR SEQ ID NO: 480 QTWYSSTVI
TfR32 SEQ ID NO: 484 SEQ ID NO: 485 GFTFSSYA SEQ ID NO: 486 ISAGGGST SEQ ID NO: 487 AKREDDTTGYHYFDY SEQ ID NO: 488 KLGDKF SEQ ID NO: 489 QDT SEQ ID NO: 490 QAWDRTTVV
TfR33 SEQ ID NO: 494 SEQ ID NO: 495 GYSISSSNWW SEQ ID NO: 496 IYFSGST SEQ ID NO: 497 ARKKGAYDYADAFDI SEQ ID NO: 498 KIGSKS SEQ ID NO: 499 DDS SEQ ID NO: 500 QVWDSSSDHVV
TfR34 SEQ ID NO: 504 SEQ ID NO: 505 GDSITNSNFY SEQ ID NO: 506 IFHGGNT SEQ ID NO: 507 ARYVAAPDYFDY SEQ ID NO: 508 NLGNKF SEQ ID NO: 509 QDR SEQ ID NO: 510 QAWDSSTVV
TfR35 SEQ ID NO: 514 SEQ ID NO: 515 GFTFSSYV SEQ ID NO: 516 ISGSGGNT SEQ ID NO: 517 AKLDYDTSGYDPFDF SEQ ID NO: 518 KLGDKF SEQ ID NO: 519 QDN SEQ ID NO: 520 QAWVSSTAI
TfR36 SEQ ID NO: 524 SEQ ID NO: 525 GFTFSSDG SEQ ID NO: 526 IWYDGSNK SEQ ID NO: 527 ARDRQWLAFDY SEQ ID NO: 528 SSDVGGYNF SEQ ID NO: 529 EVS SEQ ID NO: 530 SSYTDSNNFDVL
TfR37 SEQ ID NO: 534 SEQ ID NO: 535 GYTFTSYD SEQ ID NO: 536 MNPNSGDT SEQ ID NO: 537 MKMYYDTTGYHSFDS SEQ ID NO: 538 RLGDRF SEQ ID NO: 539 QDT SEQ ID NO: 540 QTWVATTVV
TfR38 SEQ ID NO: 544 SEQ ID NO: 545 GGSISNSNYY SEQ ID NO: 546 IFHGGNT SEQ ID NO: 547 ARYVAAPDYFDY SEQ ID NO: 548 KLGDKF SEQ ID NO: 549 QDR SEQ ID NO: 550 QAWDSSTVV
  中性pH 酸性pH
scFv mAb KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
TfR14 SEQ ID: 316 BBBB432 SEQ ID: 320、321、322 1.13E-08 1.67E+05 1.89E-03 1.44E-08 1.81E+05 2.59E-03
TfR15 SEQ ID: 323 BBBB435 SEQ ID: 327、328、329 1.52E-08 1.63E+05 2.46E-03 7.76E-09 1.83E+05 1.42E-03
TfR16 SEQ ID: 330 BBBB436 SEQ ID: 334、335、336 9.88E-09 1.50E+05 1.48E-03 6.87E-09 1.72E+05 1.18E-03
TfR17 SEQ ID: 337 BBBB439 SEQ ID: 341、342、343 3.65E-08 2.06E+05 7.51E-03 4.02E-08 2.01E+05 8.07E-03
TfR18 SEQ ID: 344 BBBB459 SEQ ID: 351、352、353 1.08E-09 1.24E+05 1.34E-04 9.44E-09 1.44E+05 1.35E-03
TfR19 SEQ ID: 354 BBBB464 SEQ ID: 361、362、363 5.29E-09 5.09E+04 2.69E-04 6.44E-08 5.29E+04 3.40E-03
TfR20 SEQ ID: 364 BBBB467 SEQ ID: 371、372、373 1.03E-08 6.95E+04 7.14E-04 9.25E-08 6.66E+04 6.16E-03
TfR21 SEQ ID: 374 BBBB476 SEQ ID: 381、382、383 6.98E-09 1.67E+05 1.17E-03 1.13E-08 1.79E+05 2.02E-03
TfR22 SEQ ID: 384 BBBB478 SEQ ID: 391、392、393 1.17E-09 1.03E+05 1.21E-04 3.58E-08 1.08E+05 3.85E-03
TfR23 SEQ ID: 394 BBBB479 SEQ ID: 401、402、403 2.68E-08 3.01E+04 8.05E-04 6.2E-08 3.94E+04 2.44E-03
TfR24 SEQ ID: 404 BBBB482 SEQ ID: 411、412、413 4.63E-09 2.68E+04 1.24E-04 2.78E-08 3.75E+04 1.04E-03
TfR25 SEQ ID: 414 BBBB486 SEQ ID: 421、422、423 ＜1.0E-12 9.79E+04 ＜1.0E-07 1.36E-08 1.14E+05 1.56E-03
表1b
TfR26 SEQ ID: 424 BBBB500 SEQ ID: 431、432、433 8.72E-09 6.96E+04 6.07E-04 2.62E-08 8.03E+04 2.11E-03
TfR27 SEQ ID: 343 BBBB504 SEQ ID: 441、442、443 6.96E-09 8.82E+04 6.14E-04 5.58E-08 8.51E+04 4.75E-03
TfR28 SEQ ID: 444 BBBB508 SEQ ID: 451、452、453 5.64E-09 1.09E+05 6.14E-04 5.57E-08 1.12E+05 6.24E-03
TfR29 SEQ ID: 454 BBBB509 SEQ ID: 63、64、65 6.45E-08 7.10E+03 4.58E-04 1.53E-05 3.41E+02 5.22E-03
TfR30 SEQ ID: 464 BBBB522 SEQ ID: 471、472、473 5.29E-08 5.27E+03 2.79E-04 1.66E-05 3.80E+02 6.30E-03
TfR31 SEQ ID: 474 BBBB529 SEQ ID: 481、482、483 2.11E-09 1.10E+05 2.31E-04 4.6E-08 1.09E+05 5.01E-03
TfR32 SEQ ID: 484 BBBB530 SEQ ID: 491、492、493 3.92E-09 1.21E+05 4.76E-04 2.92E-07 6.79E+04 1.98E-02
TfR33 SEQ ID: 494 BBBB532 SEQ ID: 501、502、503 5.1E-09 2.00E+05 1.02E-03 2.24E-08 2.14E+05 4.78E-03
TfR34 SEQ ID: 504 BBBB538 SEQ ID: 511、512、513 1.62E-08 2.07E+05 3.35E-03 2.96E-07 1.07E+05 3.17E-02
TfR35 SEQ ID: 514 BBBB539 SEQ ID: 521、522、523 2.76E-10 9.35E+04 2.59E-05 5.03E-08 8.92E+04 4.49E-03
TfR36 SEQ ID: 524 BBBB540 SEQ ID: 531、532、533 1.19E-08 7.15E+04 8.48E-04 1.2E-07 6.32E+04 7.56E-03
TfR37 SEQ ID: 534 BBBB546 SEQ ID: 541、542、543 1.68E-09 8.51E+04 1.43E-04 3.62E-08 9.40E+04 3.40E-03
TfR38 SEQ ID: 544 BBBB547 SEQ ID: 551、552、553 3.18E-09 1.90E+05 6.05E-04 5.98E-08 1.77E+05 1.06E-02
抗體係針對TfR藉由免疫囓齒動物及駱馬而產生。對所得mAb針對與轉鐵蛋白之結合競爭進行篩選，且將非競爭性mAb格式化為三腳架mAb（亦稱為TTP mAb）架構中之scFv或奈米抗體並表徵。使用三腳架以將所關注物質（例如，單株抗體）遞送至腦部。更具體而言，開發含有針對TfR之抗體的抗原結合片段與所關注單株抗體(mAb)之融合的三腳架建構體（圖1），以協助mAb穿透BBB並導致明顯比單獨mAb更高的mAb腦部濃度。
例如，由治療性mAb與TfR結合scFv或奈米抗體所組成之三腳架mAb使用短、可撓性連接子附接至一個抗體重鏈之C端。對三腳架mAb針對先前已描述增強胞吞轉送之特性（綜述於Goulatis and Shusta 2017）進行分析：價、結合親和力、pH依賴性結合、及腦部內皮細胞中之快速內化（圖2至圖4）。
將針對TfR之抗體的重鏈及輕鏈可變序列融合於單一基因建構體中作為單鏈可變片段(scFv)，其使用下列格式：Hc_GTEGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 314)_Lc。接著將針對TfR之scFv或VHH融合至所關注抗體之重鏈(Hc)的C端，其使用GGSGGS (SEQ ID NO: 312)或GGAGGA (SEQ ID NO: 313)連接子。在抗體Hc中採用CH3中之Zymeworks異二聚化突變(Hc A: T350V_L351Y_F405A_Y407V; Hc B: T350V_T366L_K392L_T394W)，以產生三腳架建構體（圖1），其亦稱為三腳架mAb。三腳架mAb含有兩個具有相同胺基酸序列之輕鏈及兩個具有不同胺基酸序列之重鏈。這兩個重鏈中僅一者係融合至本發明之TfR抗體的scFv或VHH，且這兩個重鏈亦在其恆定區中有所不同，以促進這兩個重鏈之間的異二聚化。因此，根據本申請案之實施例的各三腳架mAb係與三個胺基酸序列相關聯：融合至TfR抗體之抗原結合片段的第一重鏈之胺基酸序列、輕鏈之胺基酸序列、及未融合至TfR抗體之抗原結合片段的第二重鏈之胺基酸序列。 三腳架表現及純化
將三腳架mAb表現於CHO-Expi細胞中，並使用Protein A親和力層析法接著粒徑篩析層析法或離子交換層析法來純化。
所製造之三腳架mAb的實例係提供於表2a中：表2a
三腳架名稱 mAb組分名稱（目標） scFv組分名稱 VHH組分名稱 VL SEQ ID NO VH SEQ ID NO VHH/scFv SEQ ID NO
BBBB434 B21M (IgG1 AAS)   TfR1 11 12/10 6
BBBB978 BACE (IgG1AAS)   TfR1 14 13/15 6
BBBB1009 Tau (IgG1)   TfR1 17 16/18 6
BBBB1011 Tau (IgG1 AASYTE)   Tfr1 20 19/21 6
BBBB1073 B類澱粉蛋白   Tfr1 23 22/24 6
BBBB1215 B21M (IgG4 PAA)   TfR1 26 25/27 6
BBBB501 B21M (IgG1 AAS) TfR2   36 35/37 28
BBBB951 B21M (IgG1) TfR2   39 38/40 28
BBBB979 BACE (IgG1AAS) TfR2   42 41/43 28
BBBB1520 Tau (IgG1 AASYTE) TfR2   45 44/46 28
BBBB1018 Tau (IgG1) TfR2   48 47/49 28
BBBB1076 B類澱粉蛋白 TfR2   51 50/52 28
BBBB1216 B21M (IgG4 PAA) TfR2   54 53/55 28
BBBB509 B21M (IgG1 AAS) TfR3   64 65/65 56
BBBB946 B21M (IgG1) TfR3   67 66/68 56
BBBB947 BACE (IgG1AAS) TfR3   70 69/71 56
BBBB1023 Tau (IgG1 AASYTE) TfR3   73 72/74 56
BBBB1021 Tau (IgG1) TfR3   76 75/77 56
BBBB1079 B類澱粉蛋白 TfR3   79 78/80 56
BBBB1217 B21M (IgG4 PAA) TfR3   82 81/83 56
BBBB520 B21M (IgG1 AAS) TfR4   92 91/93 84
BBBB975 BACE (IgG1AAS) TfR4   95 94/96 84
BBBB1026 Tau (IgG1 AASYTE) TfR4   98 97/99 84
BBBB1024 Tau (IgG1) TfR4   101 100/102 84
BBBB1082 B類澱粉蛋白 TfR4   104 103/105 84
BBBB1218 B21M (IgG4 PAA) TfR4   107 106/108 84
BBBB534 B21M (IgG1 AAS) TfR5   117 116/118 109
BBBB945 B21M (IgG1) TfR5   120 119/121 109
BBBB973 BACE (IgG1AAS) TfR5   123 122/124 109
BBBB1035 Tau (IgG1 AASYTE) TfR5   126 125/127 109
BBBB1033 Tau (IgG1) TfR5   129 128/130 109
BBBB1219 B21M (IgG4 PAA) TfR5   132 131/133 109
BBBB537 B21M (IgG1 AAS) TfR6   142 141/143 134
BBBB989 B21M (IgG1) TfR6   145 144/156 134
BBBB977 BACE (IgG1AAS) TfR6   148 147/149 134
BBBB1038 Tau (IgG1 AASYTE) TfR6   151 150/152 134
BBBB1036 Tau (IgG1) TfR6   154 153/155 134
BBBB1085 B類澱粉蛋白 TfR6   157 156/158 134
BBBB1220 B21M (IgG4 PAA) TfR6   160 159/161 134
BBBB543 B21M (IgG1 AAS) TfR7   170 169/171 162
BBBB1112 B21M (IgG1) TfR7   173 172/174 162
BBBB969 BACE (IgG1AAS) TfR7   176 175/177 162
BBBB1048 Tau (IgG1 AASYTE) TfR7   179 178/180 162
BBBB1046 Tau (IgG1) TfR7   182 181/183 162
BBBB1088 B類澱粉蛋白 TfR7   185 184/186 162
BBBB1221 B21M (IgG4 PAA) TfR7   188 187/189 162
BBBB556 B21M (IgG1 AAS) TfR8   198 197/199 190
BBBB993 B21M (IgG1) TfR8   201 200/202 190
BBBB983 BACE (IgG1AAS) TfR8   204 203/205 190
BBBB1051 Tau (IgG1 AASYTE) TfR8   207 206/208 190
BBBB1049 Tau (IgG1) TfR8   210 209/211 190
BBBB1091 B類澱粉蛋白 TfR8   213 212/214 190
BBBB1222 B21M (IgG4 PAA) TfR8   216 215/217 190
BBBB557 B21M (IgG1 AAS) TfR9   226 225/227 218
BBBB970 BACE (IgG1AAS) TfR9   229 228/230 218
BBBB1055 Tau (IgG1 AASYTE) TfR9   232 231/233 218
BBBB1053 Tau (IgG1) TfR9   235 234/236 218
BBBB1094 B類澱粉蛋白 TfR9   238 237/239 218
BBBB1223 B21M (IgG4 PAA) TfR9   241 240/242 218
BBBB354 B21M (IgG1 AAS) TfR10   251 250/252 243
BBBB932 B21M (IgG1) TfR10   254 253/255 243
BBBB383 BACE (IgG1AAS) TfR10   257 256/258 243
BBBB1224 B21M (IgG4 PAA) TfR10   260 259/261 243
BBBB368 B21M (IgG1 AAS) TfR11   270 269/271 262
BBBB934 B21M (IgG1) TfR11   273 273/274 262
BBBB426 BACE (IgG1AAS) TfR11   276 275/277 262
BBBB1136 Tau (IgG1 AASYTE) TfR12   286 285/287 278
BBBB1134 Tau (IgG1) TfR12   289 288/290 278
BBBB1133 Tau (IgG1 AASYTE) TfR13   299 298/300 291
BBBB1131 Tau (IgG1) TfR13   302 301/303 291
BBBB1166 B類澱粉蛋白 TfR13   305 304/306 291
BBBB432 B21M (IgG1 AAS TfR14   321 320/322 316
BBBB435 B21M (IgG1 AAS TfR15   328 327/329 323
BBBB436 B21M (IgG1 AAS TfR16   335 334/336 330
BBBB439 B21M (IgG1 AAS TfR17   342 341/343 337
BBBB459 B21M (IgG1 AAS TfR18   352 351/353 344
BBBB464 B21M (IgG1 AAS TfR19   362 361/363 354
BBBB467 B21M (IgG1 AAS TfR20   372 371/373 364
BBBB476 B21M (IgG1 AAS TfR21   382 381/383 374
BBBB478 B21M (IgG1 AAS TfR22   392 391/393 384
BBBB479 B21M (IgG1 AAS TfR23   402 401/403 394
BBBB482 B21M (IgG1 AAS TfR24   412 411/413 404
BBBB486 B21M (IgG1 AAS TfR25   422 421/423 414
BBBB500 B21M (IgG1 AAS TfR26   432 431/433 424
BBBB504 B21M (IgG1 AAS TfR27   442 441/443 434
BBBB508 B21M (IgG1 AAS TfR28   452 451/453 444
BBBB509 B21M (IgG1 AAS TfR29   462 461/463 454
BBBB522 B21M (IgG1 AAS TfR30   472 471/473 464
BBBB529 B21M (IgG1 AAS TfR31   482 481/483 474
BBBB530 B21M (IgG1 AAS TfR32   492 491/493 484
BBBB532 B21M (IgG1 AAS TfR33   502 501/503 494
BBBB538 B21M (IgG1 AAS TfR34   512 511/513 504
BBBB539 B21M (IgG1 AAS TfR35   522 521/523 514
BBBB540 B21M (IgG1 AAS TfR36   532 531/533 524
BBBB546 B21M (IgG1 AAS TfR37   542 541/543 534
BBBB547 B21M (IgG1 AAS TfR38   552 551/553 544
細胞結合及TfR 特異性
對三腳架mAb針對先前已描述增強胞吞轉送之特性（綜述於Goulatis and Shusta 2017）進行分析：價、結合親和力、pH依賴性結合、及腦部內皮細胞中之快速內化（圖2至圖4）。
將人類腦部內皮細胞（hCMECD3，50,00個細胞）與10 ug/mL經純化三腳架mAb培養，然後使其在4℃下於10x莫耳濃度的huTfR1 ECD (SEQ ID NO: 1)存在或不存在下培養整夜。在隔天早上將細胞固定並洗滌，與二級抗體(Jackson Immunosciences Cat# 109-546-170)培養，再次洗滌，接著藉由FACS分析。陽性結合劑係定義為結合信號比同型對照組大2倍以上且結合信號/有TfR ECD之結合信號的比率≳ 2（表2b）。表2b ： 三腳架mAb之hCMECD3細胞結合及特異性。
  抗體結合無TfR 抗體結合有TfR 比率
蛋白質批次ID SEQ ID NO: Rep 1 Rep 2 平均信號 Rep 1 Rep 2 平均信號
BBBB434 10、11、12 1749 1405 1577 808 834 821 1.9
BBBB501 35、36、37 2281 1848 2065 507 790 649 3.18
BBBB509 63、64、65 1921 1814 1868 632 626 629 2.97
BBBB520 91、92、93 3413 3588 3501 766 874 820 4.27
BBBB534 116、117、118 3378 3246 3312 782 849 816 4.06
BBBB537 141、142、143 3667 3531 3599 841 803 822 4.38
BBBB543 169、170、171 1490 1291 1391 776 738 757 1.84
BBBB556 197、198、199 3262 3539 3401 711 749 730 4.66
BBBB557 225、226、227 2394 2204 2299 327 361 344 6.68
進行額外hCMECD3細胞結合檢定以測量額外三腳架mAb之特異性，且其結果係示於下表2c中：表2c.
IgG4 版本            
名稱 結合目標 描述 ELN ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
BBBB1215 (n=6) TfR B21M lqG4 ZW BBBB434 BBB-00735 (4.56±0.26)E+05 (2.83±0.25)E-03 (6.24±0.75)E-09
BBBB1217 (n=3) TfR B21M lqG4 ZW BBBB509 BBB-00735 無結合    
BBBB1224 (n=6) TfR B21M lqG4 ZW BBBB354 BBB-00735 (9.90±0.96)E+05 (1.10±0.21)E-02 (1.11±0.23)E-08
BBBB1227 (n=3) CD98hc B21M lqG4 ZW BBBB445 BBB-00718 (4.40±0.17)E+05 (2.42±0.64)E-03 (5.49±1.23)E-09
BBBB1228 (n=3) CD98hc B21M lqG4 ZW BBBB448 BBB-00718 (4.26±1.13)E+05 (1.77±0.71)E-03 (4.21±2.34)E-09
BBBB1229 (n=3) CD98hc B21M lqG4 ZW BBBB449 BBB-00718 (4.82±1.34)E+05 (3.36±2.38)E-03 (6.88±3.14)E-09
        結果為平均 ± 95%CI  
轉鐵蛋白競爭
將表現重組人類轉鐵蛋白受體之MDCK細胞以每孔10,000個細胞接種於MA6000 384 HB盤中，並在補充有10% FBS及500 µg/mL遺傳黴素(Geneticin)之DMEM培養基中培養18小時。在檢定之前，在37℃ CO2 培養箱中將細胞在補充有5 µM莫能菌素(Monensin)之無血清DMEM培養基中培養1h，接著在室溫下與補充有5 µM莫能菌素之StartingBlock (PBS)培養30分鐘。在室溫下將盤之交替列中的細胞與2.7 mg/mL人類holo轉鐵蛋白培養30分鐘，該轉鐵蛋白係製備於補充有5 µM莫能菌素之無血清DMEM培養基中。將測試抗體在補充有5 µM莫能菌素之無血清DMEM培養基中稀釋至5 µg/mL，然後將其添加至含有holo轉鐵蛋白之重複孔中或添加至未接收轉鐵蛋白之重複孔中，接著在室溫下培養1h。將上清液移除，然後將2 µg/mL Sulfo-TAG標示之抗人類抗體添加至各孔中並在室溫下培養30分鐘。將所有孔用PBS洗滌，然後添加無界面活性劑之MSD讀取緩衝劑T。在MSD SECTOR® S600成像器上讀取盤。
在Excel中執行統計分析，包括平均、標準偏差、及RSD。將任何RSD ＞25%之樣本排除。將轉鐵蛋白存在下培養之測試抗體的平均值與轉鐵蛋白不存在下之平均值進行比較。將轉鐵蛋白存在下之值≤轉鐵蛋白不存在下之值的70%之抗體視為具配體競爭性（表3）。表3 ： 所選三腳架mAb不與轉鐵蛋白競爭。
樣本ID SEQ ID NO: 無Tf 之平均值 有Tf 之平均值 相對Ab 結合%
BBBB434 10、11、12 1758 1762 100.3
BBBB501 35、36、37 1348 1618 120.0
BBBB509 63、64、65 282 447 158.6
BBBB520 91、92、93 1369 1798 131.3
BBBB534 116、117、118 1350 1141 84.5
BBBB537 141、142、143 1504 1851 123.1
BBBB543 169、170、171 225 233 103.8
BBBB556 197、198、199 1246 1531 122.9
BBBB557 225、226、227 598 530 88.7
內化
將人類腦部內皮細胞(hCMEC/D3)以10,000個細胞/孔接種於經膠原蛋白塗佈之384孔Cell Carrier Ultra盤(Perkin Elmer)中，然後使其在37℃下在加濕培養箱中附接16小時。接著將細胞（50,00個細胞）與200 ug/mL經純化三腳架mAb培養，並使其在37℃下培養一小時。將細胞固定、洗滌，然後與經螢光標示之二級抗體培養一小時。接著將細胞再次洗滌，然後與經螢光標示之肌動蛋白染料鬼筆環肽(Phalloidin)及核染料Hoeschst 33342培養。將細胞再次洗滌，然後使用ImageXpress Micro (Molecular Devices)以40x物鏡進行成像。基於與鬼筆環肽之共定位使用MetaXpress 6.0識別內化mAb。所有來自表2及表3之mAb均為內化陽性。 親和力分析及pH 依賴性結合、物種交叉反應性
使用Forte Bio Octet平台初步測量親和力及pH依賴性。將生物素化huTfR固定在鏈黴親和素感測器上，並在0.1M磷酸鹽pH 7.4中使mAb締合180秒。在0.1M磷酸鹽pH 7.4或0.1M磷酸鹽pH 5中完成解離歷時300秒（表4）。較佳地，所關注三腳架mAb在pH7.4下具有高結合親和力且在pH5下具有低結合親和力，例如在pH 5下KD ≥ 1nM且kd ≥ 10-4 sec-1 、較佳地約10-3 ，使得三腳架mAb在中性pH（例如，pH7.4）下結合至TfR且在酸性pH（例如，pH5）下自TfR解離。較佳地，在酸性pH及中性pH下之KD係類似的，諸如KD酸性/KD中性之比率為約1.5。表4 ：使用Octet平台測得之對huTfR的動力學速率常數。
pH 7.4 解離 pH 5 解離 比率
樣本ID KD (M) kon (1/Ms) kdis (1/s) KD (M) kon (1/Ms) kdis (1/s) pH 5/pH 7.4
BBBB434 1.73E-08 1.53E+05 2.64E-03 2.45E-08 1.66E+05 4.06E-03 1.54
BBBB501 1.60E-08 1.47E+05 2.35E-03 1.68E-08 1.53E+05 2.57E-03 1.09
BBBB509 6.45E-08 7.10E+03 4.58E-04 1.53E-05 3.41E+02 5.22E-03 11.39
BBBB520 3.28E-09 1.53E+05 5.00E-04 7.32E-08 1.39E+05 1.02E-02 20.41
BBBB534 1.15E-08 7.52E+04 8.63E-04 7.14E-08 7.67E+04 5.48E-03 6.35
BBBB537 3.77E-10 1.38E+05 5.22E-05 4.42E-08 1.37E+05 6.05E-03 115.81
BBBB543 8.29E-08 2.63E+05 2.18E-02 1.62E-05 9.86E+03 1.60E-01 7.33
BBBB556 ＜1.0E-12 8.57E+04 ＜1.0E-07 1.99E-08 1.07E+05 2.13E-03 較快
BBBB557 2.94E-08 2.28E+05 6.69E-03 2.13E-06 2.97E+04 6.33E-02 9.46
為了獲得額外的親和力測量精確度，三腳架mAb對huTfR之親和力係使用表面電漿共振(SPR)在BioRad Proteon儀器ProteOn XPR36系統上判定。Fc捕捉表面係藉由使用胺偶合化學(BioRad)將抗IgG Fc mAb (Jackson ImmunoResearch)偶合至GLC晶片(BioRad)來產生。三腳架mAb係使用0.3 ug/mL之濃度，以60 uL/min流動30秒（針對120 RU之目標密度）來捕捉。然後使huTfR流過經固定之三腳架mAb（濃度從3.125至800 nM，以4倍連續稀釋）以進行3 min（以50 µL/min）締合，接著以50 uL/min進行解離10分鐘。將晶片表面用兩次18秒的100 mM H3 PO4 (Sigma)脈衝以100 µL/min再生。將所收集之數據使用ProteOn Manager軟體V3.1.0.6 (BioRad)處理。首先，用間點將數據針對背景校正。接著，數據之雙參考減法係藉由使用緩衝液注射用於分析物注射來執行。使用Langmuir 1:1結合模型執行數據之動力學分析。各mAb之結果係以Ka（結合速率）、Kd（解離速率）、及KD（平衡解離常數）之格式記述（表5）。表5 ：抗TfR腦部穿梭劑對TfR之結合親和力（當融合至B21M mAb或BACE mAb時）。
  B21M mAb BACE mAb
mAb (B21M/BACE) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
BBBB434/BBBB978 5.39E+05 2.34E-03 4.34E-09 (4.23±0.14)E+05 (2.67±0.06)E-03 (6.31±0.10)E-09
BBBB501/BBBB979 2.45E+05 2.45E-03 1.00E-08 (2.60±0.15)E+05 (2.67±0.05)E-03 (1.03±0.06)E-08
BBBB520/BBBB975 6.31E+05 6.28E-04 9.95E-10 (5.91±0.44)E+05 (6.59±0.11)E-04 (1.12±0.09)E-09
BBBB534/BBBB973 1.03E+05 5.50E-04 5.35E-09 (1.08±0.06)E+05 (4.34±0.35)E-04 (4.03±0.46)E-09
BBBB537/BBBB977 7.34E+05 2.55E-04 3.48E-10 (6.75±0.50)E+05 (1.52±0.08)E-04 (2.27±0.28)E-10
BBBB543/BBBB969 3.27E+05 1.90E-02 5.80E-08 (2.73±0.03)E+05 (2.23±0.21)E-02 (8.16±0.92)E-08
BBBB556/BBBB983 1.94E+05 1.70E-04 8.78E-10 (1.99±0.10)E+05 ＜8.67E-05 ＜4.36E-10
BBBB557/BBBB970 4.22E+05 6.43E-03 1.52E-08 (3.45±0.09)E+05 (7.21±0.30)E-03 (2.09±0.05)E-08
BBBB354/BBBB383 (14.4±0.59)E+05 (2.21±0.19)E-02 (1.54±0.2)E-08 (11.1±0.29)E+05 (2.00±0.18)E-02 (1.79±0.2)E-08
BBBB368/ BBBB426 (5.98±0.27)E+05 (6.06±1.49)E-02 (1.1±0.21)E-07 (8.55±0.15)E+05 (11.1±0.65)E-02 (1.3±0.68)E-07
pH依賴性結合係使用上述SPR (proteon)方法評估，除了在解離期間，緩衝劑pH係從7.4逐步下降至6.5再至6.0。評估個別感測圖，如果解離速率隨著pH降低而變快則針對pH依賴性結合給分（圖3中之實例）。
物種交叉反應性係使用與判定結合親和力相同之方法評估，除了所使用之TfR係食蟹獼猴(SEQ ID NO: 2)、狨(SEQ ID NO: 3)、大鼠(SEQ ID NO: 4)、及小鼠(SEQ ID NO: 5)。未識別出大鼠或小鼠交叉反應性mAb。識別出食蟹獼猴及狨交叉反應性三腳架mAb（表6）。表6 ： 所選三腳架mAb之物種交叉反應性
食蟹獼猴 狨
mAB ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
BBBB520 5.29E+05 2.52E-04 4.77E-10 3.73E+05 3.66E-04 9.81E-10
BBBB534 2.44E+05 7.78E-03 3.19E-08 2.10E+05 4.99E-04 2.38E-09
BBBB537 6.18E+05 8.83E-05 1.43E-10 2.66E+05 6.56E-05 2.46E-10
BBBB543 2.50E+05 2.91E-02 1.17E-07 2.04E+05 7.73E-03 3.80E-08
BBBB556 8.68E+04 2.05E-03 2.36E-08 4.73E+04 1.04E-03 2.20E-08
BBBB557 2.95E+05 1.86E-02 6.31E-08 1.91E+05 1.53E-02 8.03E-08
本發明之抗TfR抗體或抗原結合片段可用於遞送任何類型的免疫球蛋白。已對由三腳架結構所遞送之IgG1及IgG4治療性mAb觀察到類似結果（數據未顯示）。 小鼠藥物動力學及藥效動力學及抗BACE mAb 腦部穿梭劑
為了分析結合性質對胞吞轉送之影響，在小鼠中完成體內PK/PD研究。藉由IV推注注射對C57BL/6-Tfrctm2618(TFRC)Arte小鼠(Taconic Artemis)投予測試物品(13 mg/kg, 10 mL/kg)。在排定之時間點，藉由吸入異氟烷將小鼠麻醉。經由心臟穿刺收集血液，並處理血漿。在用5 mLs的0.9%鹽水溶液進行全身灌注後收集小鼠腦部。將所收集之腦部樣本（除去小腦）分成右/左半球，在液態氮中急凍，然後儲存在-70℃下，直到組織均質化及微血管耗盡(capillary depletion)處理。
TfR結合分子對鼠類TfR均沒有交叉反應性，所以使用人類TfR KI小鼠來評估胞吞轉送。將三腳架mAb用抗β分泌酶1 (BACE1)拮抗劑mAb格式化，以能夠進行胞吞轉送進入腦部後mAb之藥效動力學評估。BACE1切割β類澱粉蛋白以釋放Aβ1-40 。BACE1之抑制係藉由定量產物Aβ1-40 在腦部中之濃度來測量。對小鼠靜脈內給藥兩種三腳架mAb（BBBB383及BBBB426）、連同對照組mAb（BBBB456）。BBBB456係單獨抗BACE1拮抗劑mAb。BBBB383及BBBB426僅在其對TfR之親和力有所不同，分別為KD = 18 nM及130 nM。腦部暴露係在灌注及微血管耗盡以減少來自血液中或留在血管內皮內之mAb的干擾之後進行判定(Johnsen, Burkhart et al. 2017)。BBBB383及BBBB426兩者之腦部濃度相較於BBBB456在所有時間點均有所提升，其中BBBB383具有比BBBB426高之mAb腦部濃度。對mAb腦部濃度觀察到強烈的PK/PD關係，且與Aβ1-40 水平降低相關。兩種含TfR之mAb的較低血漿暴露係歸因於TMDD，其透過在末梢中與TfR結合。
接著將所選抗TfR腦部穿梭劑融合至原型抗BACE（β-分泌酶）mAb，並使用與上述相同之方法重新評估結合親和力。如表5中所示，當融合至B21M mAb（抗人類呼吸道融合病毒）及抗BACE拮抗劑mAb時，抗TfR腦部穿梭劑之親和力是類似的。針對所選分子評估內化，且發現其與當將抗TfR腦部穿梭劑融合至B21M mAb時所觀察到之內化並無變化。
因為抗TfR腦部穿梭劑皆未結合至小鼠或大鼠TfR，在huTfR敲入小鼠（C57BL/6-Tfrctm2618(TFRC)Arte小鼠(Taconic Artemis)）中使用原型抗BACE拮抗劑mAb（BBBB456，SEQ ID NO: 307、308、及309）進行體內囓齒動物研究。選擇抗BACE拮抗劑mAb作為用於測量BACE1之抑制（透過其產物肽Aβ1-40之濃度）的模型PD系統，該抑制反映了運輸至腦部的mAb量。
第一體內研究評估huTfR小鼠腦部中之PK/PD關係。對敲入(KI)小鼠用BBBB383（SEQ ID NO: 256、257、及258）、BBBB426（SEQ ID NO: 275、276、及277）、及BBBB456（SEQ ID NO: 307、308、及309）以13 mg/kgi.v. 給藥。在4、24、及72小時採集腦部及血漿。在排定之時間點，藉由吸入異氟烷將小鼠麻醉。在用5 mL的0.9%鹽水溶液進行全身灌注後收集來自KI小鼠之小鼠腦部。將所收集之腦部樣本（除去小腦）分成右/左半球，在液態氮中急凍，然後儲存在-70℃下，直到組織均質化及微血管耗盡(capillary depletion)處理。
為了進行經微血管耗盡之腦部組織裂解物的樣本製備，獲得腦部半球之個別重量以測量藥物濃度。將腦部組織樣本添加至計算體積的經修飾dPBS緩衝劑（每1 mg組織2.5至3 µL緩衝劑）中，該緩衝劑含有蛋白酶抑制劑(Pierce; A32955)，然後將其轉移至裂解基質D (MP Biomedicals™; 6913-100)管中。使用Bead Ruptor 24 Elite (Omni International)將組織樣本以2.9 m/s均質化15秒。將總細胞懸浮液轉移至新的管中，然後與等體積的26%右旋糖酐緩衝劑混合（13%最終右旋糖酐濃度）。將經混合組織均質物在4℃下以2,000 g離心10分鐘。小心地將上層（經微血管耗盡之部分）與剩餘樣本分離，然後轉移至含有10x RIPA裂解緩衝劑(Millipore™; 20-188)之新的管中。將經微血管耗盡之樣本加上裂解緩衝劑充份漩渦震盪，在4℃下以14,000 rpm離心30分鐘，然後將上清液轉移至新的管中。將腦部組織樣本裂解物冷凍儲存在-70℃下或使用BCA蛋白質檢定套組(Pierce™; 23227)測量蛋白質濃度。將最終腦部組織樣本裂解物標準化至7 mg/mL總蛋白質濃度，之後再進行BBB開啟(BBB-enabled) mAb之免疫檢定判定。
BBB開啟mAb在小鼠腦部組織中之濃度（用於PK評估）係使用MesoScale Discovery (MSD®; Gaithersburg, MD) ECLIA技術判定，該技術係以典型三明治免疫檢定格式開發。檢定係在MSD Gold™ Small Spot Streptavidin 96孔盤(Cat: L45SA)上執行。簡言之，將經鏈黴親和素塗佈之盤在室溫下用於1x磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之1%牛血清白蛋白(BSA)阻斷30分鐘。標準曲線係在50%初始(naïve) C57BL/6小鼠腦部組織裂解物中藉由連續稀釋來新鮮製備。將以2x的工作檢定濃度製備於初始C57BL/6小鼠腦部組織裂解物中的冷凍品管品(QC)稀釋並用各檢定進行測試。將含有捕捉（生物素化抗人類Fc mAb，1 µg/mL）及偵測（經釕標示之抗人類Fc mAb，0.5 µg/mL）試劑之預混物與經稀釋之標準品、QC、及樣本以1:1體積比率組合在檢定盤中。將混合物在室溫下振盪培養1小時。將檢定盤洗滌，並將MSD T讀取緩衝劑(1x)添加至所有孔中。在MSD SECTOR® S600成像器上讀取原始數據值。檢定之標準曲線範圍係在1至512 ng/mL下測試，且最小所需樣本稀釋(MRD)為1:2，從而在腦部組織裂解物中產生2 ng/mL之靈敏度限制。將具有原始ECL計數之MSD輸出檔案匯入Watson LIMS (Thermo Scientific)，然後以5參數邏輯擬合使用1/F2加權進行迴歸。
BBB開啟mAb在小鼠血漿中之濃度（用於PK評估）係使用如上所述之類似規程判定。標準曲線係在10%匯集小鼠血漿中藉由連續稀釋來新鮮製備。將以10x的工作檢定濃度製備於匯集小鼠血漿中的冷凍QC稀釋並用各檢定進行測試。將含有捕捉（生物素化抗人類Fc mAb，1 µg/mL）及偵測（經釕標示之抗人類Fc mAb，0.5 µg/mL）試劑之預混物與經稀釋之標準品、QC、及樣本以1:1體積比率組合在檢定盤中。將混合物在室溫下振盪培養1小時。將檢定盤洗滌，並將MSD T讀取緩衝劑(1x)添加至所有孔中。在MSD SECTOR® S600成像器上讀取原始數據值。檢定之標準曲線範圍係在2至512 ng/mL下測試，且MRD為1:10，從而在血漿基質中產生20 ng/mL之靈敏度限制。將具有原始ECL計數之MSD輸出檔案匯入Watson LIMS (Thermo Scientific)，然後以5參數邏輯擬合使用1/F2加權進行迴歸。
BACE活性測量係藉由將小鼠腦部在2 ml裂解基質D管中均質化來進行（每mg腦部重量8 µl的0.4% DEA/50 mM NaCl，Fast Prep-24在6/振盪/sec下進行20 sec）。接著在設定為最高速度之Eppendorf離心機中將管在4℃下離心5 min。接著將均質物（上清液）轉移至經預冷之管中，接著將其在4℃下以13,000 rpm離心70分鐘。接著將上清液轉移至含有10%的0.5 M Tris/HCL之管中，然後冷凍在-80℃下直到進行檢定。將Aβ1-40肽標準品及解凍之經處理腦部均質物與經釕(Meso Scale Discovery (MSD), R91AN-1)標示之抗Aβ抗體以1:1預複合。將50 ul的複合體添加至含有針對Aβ1-40之捕捉抗體的經阻斷盤中。在2至8℃下無振盪培養整夜之後，將盤洗滌並添加2x讀取緩衝劑(MSD, R92TC-1)。使用Meso Sector S 600 (MSD, IC0AA)讀取盤。
觀察到含腦部穿梭劑之mAb BBBB383及BBBB426具有比單獨抗BACE mAb BBBB456快之血漿清除（圖5A）。然而，在腦部中則為相反情況，觀察到BBBB383及BBBB426相對於對照組BBBB456在所有時間點均具有增加之腦部濃度。在測量BACE抑制之PD效應時，觀察到這兩種腦部穿梭劑mAb抑制BACE活性之程度均比單獨對照抗BACE mAb大。（圖5B）。
對額外的含腦部穿梭劑之mAb在13 mg/kgi.v. 給藥後4及24小時進行類似評估（圖7A至B）。類似於第一研究，觀察到所有腦部穿梭劑mAb均具有比對照抗BACE mAb快之血漿清除。針對腦部穿梭劑mAb觀察一範圍的腦部濃度，所有者的腦部濃度均有所提升，除了BBBB974以外。假定BBBB974由於其結合動力學而不會有效率地運輸至腦部。具體而言，BBBB974具有緩慢的中性結合速率，其可能防止與TfR在體內之有效率結合。針對所有三腳架mAb亦觀察到Aβ1-40水平之三腳架mAb濃度依賴性降低，除了BBBB983以外，其腦部濃度相對於對照組BBBB456有所增加但對Aβ1-40濃度沒有影響（圖8）。此觀察可能由於結合動力學所致，因為BBBB983具有極緩慢的中性解離速率，其可能防止在腦部中有效率地擴散，此對BACE抑制而言是必要的。這些數據強調了TfR結合動力學對於治療性mAb之遞送及功能兩者的重要性。
親和力與胞吞轉送效率之間的關係先前已描述為隨著對TfR之親和力降低，胞吞轉送會有所提升(Yu, Zhang et al. 2011)，此為與上述數據矛盾的結論。為了更詳細探查胞吞轉送親和力關係，對九個三腳架mAb針對腦部PK/PD在上述小鼠模型中進行評估。這些三腳架mAb在對TfR之親和力上有大約100倍的差異（KD 範圍在0.2nM至81nM）。在IV給藥後24小時測量腦部濃度（Cmax 腦部 ）（圖17）。如預期，觀察到一範圍的胞吞轉送效率，從相對於對照mAb無提升至有十倍提升。該數據指示，在結合速率及解離速率兩者均會影響腦部濃度的作用下，親和力與胞吞轉送效率之間有比先前已描述者更細微的關係。例如，未觀察到BBBB946之腦部暴露相對於對照mAb有所提升，雖然其在pH 6下具有KD = 65nM及快速的解離速率。然而此mAb是獨特的，其結合速率比其他研究中之mAb慢（ka ≈ 103 M−1 s−1 ，相較於ka ≈ 105 M−1 s−1 ）。事實上，當相較於另一具有類似KD (KD = 81nM)但結合速率快100x之三腳架抗體BBBB969時，對比是相當明顯的。BBBB969提升了腦部濃度達5.5倍，證明足夠快速之結合速率對於有效率腦部遞送之重要性。其他八種所研究mAb之胞吞轉送效率可最佳地藉由其解離速率描述，其中最佳腦部遞送發生在解離速率不會太快或太慢時（最佳中性kd 為2×10-3 s-1 ）。觀察到所有三腳架mAb均有強烈的PK/PD關係，除了BBBB983以外，其腦部濃度具有5.5x的提升但對Aβ1-40 水平沒有影響。此mAb具有緩慢的中性解離速率(＜8×10-5 s-1 )，吾人假設此會影響其在腦部中擴散至目標的能力。綜上所述，數據證明將中性結合速率及解離速率兩者均最佳化對於最佳腦部PK及PD之重要性。吾人在研究中未觀察到結合表位對TfR之影響（數據未顯示）。 選擇用於食蟹獼猴研究的mAb 及評估融合至抗Tau mAb 之腦部穿梭劑
對確認靶向TfR之三腳架mAb在人類中提升治療性抗體腦部暴露之能力而言，關鍵的是在非人類靈長類中展現出增強之腦部遞送。小鼠研究中表現最佳的三腳架mAb（BBBB979及BBBB978）不會結合至食蟹獼猴TfR，因而將其等自進一步研究中排除。次佳的BBBB970及BBBB969兩者在抗TfR腦部穿梭劑之輕鏈中均含有游離半胱胺酸（SEQ ID NO: 162及SEQ ID NO: 218）。因為游離半胱胺酸殘基可能在製造期間促成不理想的生物物理性質，將游離半胱胺酸突變為絲胺酸殘基（SEQ ID NO: 278及SEQ ID NO: 291）。
將新的scFvs融合至抗Tau mAb PT1B844（SEQ ID NO: 310及311），以產生BBBB1136（SEQ ID NO: 285、286、及287）/BBBB1134（SEQ ID NO: 288、289、及290）、及BBBB1133（SEQ ID NO: 298、299、及300）/BBBB1131（SEQ ID NO: 301、302、及303）(IgG1 AAS YTE/IgG1)。測量對huTfR之親和力（表7）。表7 ：抗TfR腦部穿梭劑（具有Cys-Ser突變且融合至抗Tau mAb）對huTfR之結合親和力
  ka (1/Ms) ka (1/Ms) KD (M)
BBBB1131 (2.53±0.08)E+05 (3.17±0.05)E-02 (1.25±0.05)E-07
BBBB1133 (2.38±0.04)E+05 (3.23±0.29)E-02 (1.36±0.15)E-07
BBBB1134 (2.12±0.10)E+05 (2.49±0.11)E-03 (1.18±0.10)E-08
BBBB1136 (2.08±0.15)E+05 (2.26±0.06)E-03 (1.09±0.11)E-08
BBBB1134/BBBB1136維持與BBBB557/BBBB970非常類似的與huTfR之結合，指示Cys-Ser突變或與抗Tau mAb之融合均不會干擾對huTfR之結合親和力。然而，BBBB1131/BBBB1133之結合親和力相較於BBBB543/BBBB969弱上大約2倍。為了判定親和力偏移是由於cys-ser突變還是與抗Tau mAb之融合，產生沒有該突變但融合至抗Tau之腦部穿梭劑並評估結合（BBBB1048（SEQ ID NO: 178、179、及180）/BBBB1046（SEQ ID NO: 181、182、及183））。未突變BBBB1048/BBBB1046之親和力與BBBB543/BBB969非常類似，指示親和力損失是由於cys-ser突變而不是由於與Tau mAb之融合（表8）。表8 ： 抗TfR腦部穿梭劑（融合至抗Tau mAb）對huTfR之結合親和力
ka (1/Ms) ka (1/Ms) KD (M)
BBBB1046 (2.63±0.03)E+05 (1.82±0.15)E-02 (6.91±0.50)E-08
BBBB1048 (2.57±0.14)E+05 (2.06±0.25)E-02 (7.99±0.71)E-08
與先前研究類似，亦對內化進行評估，且腦部穿梭劑與抗Tau mAb之融合不會影響其在人類腦部內皮細胞中內化之能力（圖9中之實例，所測試之mAb係在表9中）。表9 ： 對抗TfR腦部穿梭劑針對在人類腦部內皮細胞中之內化進行評估。
mAb 經內化
BBBB1046 是
BBBB1047 是
BBBB1048 是
BBBB1052 是
BBBB1053 是
BBBB1054 是
BBBB1055 是
BBBB1131 是
BBBB1132 是
BBBB1133 是
BBBB1134 是
BBBB1135 是
BBBB1136 是
抗Tau 腦部穿梭劑mAb 之食蟹獼猴藥物動力學
藉由IV注射（緩慢推注）對食蟹獼猴以所指示之劑量投予測試物品。在排定之時間點，在上身用鹽水灌注最少5分鐘後收集食蟹獼猴腦部並用冷鹽水溶液潤洗。將預定之腦部位置單離出來，在液態氮中急凍，然後儲存在-80℃下，直到組織均質化及微血管耗盡處理。
將BBBB1133、BBBB1136、及BBBB1134連同非腦部穿梭劑開啟之mAb PT1B844（圖18）及PT1B916以10 mg/kg在食蟹獼猴中i.v. 給藥。在4、24、及72小時採樣血漿。在上身用鹽水灌注最少5分鐘後收集食蟹獼猴腦部並用冷鹽水溶液潤洗。將預定之腦部位置單離出來，在液態氮中急凍，然後儲存在-80℃下，直到組織均質化及微血管耗盡處理。
為了進行經微血管耗盡之腦部組織裂解物的樣本製備，獲得所收集腦部位置之個別重量。將腦部組織樣本添加至計算體積的經修飾dPBS緩衝劑（2.5 µL緩衝劑/1 mg組織）中，該緩衝劑含有蛋白酶抑制劑(Pierce; A32955)，然後將其轉移至裂解基質D (MP Biomedicals™; 6913-100)管中。使用Bead Ruptor 24 Elite (Omni International)將組織樣本以2.9 m/s均質化15秒。將總細胞懸浮液轉移至新的管中，然後與等體積的26%右旋糖酐緩衝劑混合（13%最終右旋糖酐濃度）。將經混合組織均質物在4℃下以2,000g離心10分鐘。小心地將上層（經微血管耗盡之部分）與剩餘樣本分離，然後轉移至含有10x RIPA裂解緩衝劑(Millipore™; 20-188)之新的管中。將經微血管耗盡之樣本加上裂解緩衝劑充份漩渦震盪，在4℃下以14,000 rpm離心30分鐘，然後將上清液轉移至新的管中。將腦部組織樣本裂解物冷凍儲存在-70℃下或使用BCA蛋白質檢定套組(Pierce™; 23227)測量蛋白質濃度。將最終腦部組織樣本裂解物標準化至7 mg/mL總蛋白質濃度，之後再進行BBB開啟(BBB-enabled) mAb之免疫檢定判定。
BBB開啟mAb在食蟹獼猴腦部組織中之濃度（用於PK評估）係使用MSD® ECLIA技術判定，該技術係以典型三明治免疫檢定格式開發。檢定係在MSD Gold™ Small Spot Streptavidin 96孔盤上執行。將經鏈黴親和素塗佈之盤在室溫下用於1x磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之1%牛血清白蛋白(BSA)阻斷30分鐘。標準曲線係在50%初始食蟹獼猴腦部組織裂解物中藉由連續稀釋來新鮮製備。將以2x的工作檢定濃度製備於初始食蟹獼猴腦部組織裂解物中的冷凍QC稀釋並用各檢定進行測試。將含有捕捉（生物素化抗人類Fc mAb，1 µg/mL）及偵測（經釕標示之抗人類Fc mAb，0.5 µg/mL）試劑之預混物與經稀釋之標準品、QC、及樣本以1:1體積比率組合在檢定盤中。將混合物在室溫下振盪培養1小時。將檢定盤洗滌，並將MSD T讀取緩衝劑(1x)添加至所有孔中。在MSD SECTOR® S600成像器上讀取原始數據值。檢定之標準曲線範圍係在1至512 ng/mL下測試，且最小所需樣本稀釋(MRD)為1:2，從而在腦部組織裂解物中產生2 ng/mL之靈敏度限制。將具有原始ECL計數之MSD輸出檔案匯入Watson LIMS (Thermo Scientific)，然後以5參數邏輯擬合使用1/F2加權進行迴歸。
BBB開啟mAb在食蟹獼猴血漿中之濃度（用於PK評估）係使用MSD® ECLIA技術判定，該技術係以典型三明治免疫檢定格式開發。檢定係在MSD Gold™ Streptavidin 96孔盤上執行，將經鏈黴親和素塗佈之盤在室溫下用於1x磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之1%牛血清白蛋白(BSA) + 0.5% Tween-20阻斷30分鐘。標準曲線係在10%匯集食蟹獼猴血漿中藉由連續稀釋來新鮮製備。將以10x的工作檢定濃度製備於匯集食蟹獼猴血漿中的冷凍QC稀釋並用各檢定進行測試。將含有捕捉（生物素化抗人類Fc mAb，1 µg/mL）及偵測（經釕標示之抗人類Fc mAb，1 µg/mL）試劑之預混物與經稀釋之標準品、QC、及樣本以1:1體積比率組合在檢定盤中。將混合物在室溫下振盪培養1小時。將檢定盤洗滌，並將MSD T讀取緩衝劑(1x)添加至所有孔中。在MSD SECTOR® S600成像器上讀取原始數據值。檢定之標準曲線範圍係在2至512 ng/mL下測試，且最小所需樣本稀釋(MRD)為1:10，從而在血漿基質中產生20 ng/mL之靈敏度限制。將具有原始ECL計數之MSD輸出檔案匯入Watson LIMS (Thermo Scientific)，然後以5參數邏輯擬合使用1/y2加權進行迴歸。
跨各種區域判定mAb之腦部濃度（圖10）。跨動物對腦部濃度數據進行平均，且各符號代表一個腦部區。相較於對照mAb，針對BBBB1134、BBBB1136、及BBBB1133分別觀察到腦部濃度之7×、11×、及11x提高。所有含腦部穿梭劑之mAb的腦部暴露相對於不含腦部穿梭劑之mAb在每一個腦部區均有所增加（圖11）。
亦判定mAb在血漿中之濃度（圖12）。在末梢中觀察到TMDD之證據，其中三腳架mAb相對於對照mAb具有加速之清除（圖18）。在此研究中評估與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的影響，其中BBBB1134與BBBB1136除了Fc域以外是相同的，且BBBB1136具有「YTE」突變(Dall’Acqua, K, et al. 2006)。「YTE」突變會增強在酸性pH下的與FcRn之結合，且已證明會增加mAb在多個物種（包括人類）中之半衰期(Robbie, C, et al. 2013)。如所預期，添加「YTE」突變會導致BBBB1136之血漿濃度相較於BBBB1134有所增加。雖然FcRn在維持IgG恆定及延長IgG在人類中之血清半衰期上是關鍵受體(Roopenian and Akilesh 2007)，其亦被認為是自腦部之逆向胞吞轉送（或外排(efflux)）受體(Cooper, C, et al. 2013)。吾人對於瞭解FcRn這兩個功能之間的相互作用感興趣，因為藉由提高對FcRn之結合親和力來改善半衰期可能會以腦部外排增加之腦部暴露作為代價。有趣的是，血漿濃度之2倍增加是由腦部濃度之2倍增加反映，這意味著任何潛在增加外排在此系統中是可忽略的。
BBBB1133具有與無腦部穿梭劑之mAb（PT1B844及PT1B916）最相近的末梢半衰期。 食蟹獼猴中之網狀紅血球耗盡
TfR靶向提升腦部暴露之已知阻礙是網狀紅血球耗盡，此係由於網狀紅血球以Fc依賴性方式的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)(Science Translational Medicine 2013: Vol. 5, 183)。在食蟹獼猴PK研究中，將具有WT IgG1 (BBBB1134)及突變「AAS」（BBBB1136及BBBB1133）之mAb針對網狀紅血球耗盡以減少FcγR結合進行測試。如預期，針對WT IgG1三腳架mAb BBBB1134觀察到快速網狀紅血球耗盡，但針對BBBB1136、BBBB1133、或非腦部穿梭劑mAb PT1B844及PT1B916則未觀察到（圖13），證實Fc功能對TfR結合mAb及網狀紅血球耗盡之影響。
針對劑量反應及重複給藥食蟹獼猴PK選出第三個三腳架mAb BBBB1133。對食蟹獼猴以2、10、及30 mg/kg靜脈內給藥，且在之後48小時、7天、及14天進行腦部PK判定。評估血漿PK兩週（圖18A及B）。在2與10 mg/kg之間觀察到線性腦部PK，且在10與30 mg/kg之間觀察到非線性腦部PK。所提出之遞送機制係受體介導的，其將會是可飽和的，且數據指示在食蟹獼猴中30 mg/kg係飽和劑量。在血漿中觀察到線性PK及半衰期大約6天之CSF。亦使用相同劑量範圍每週給藥三週來完成重複給藥（圖18C及D）。觀察到對重複給藥30 mg/kg之累積的證據，其與30 mg/kg係飽和劑量之先前觀察相符。在末梢中再一次觀察到線性PK，且沒有對於重複給藥之PK耐受的證據。
網狀紅血球數據顯示，效應靜默Fc mAb對於此腦部遞送平台之安全給藥而言是必要的。雖然避免網狀紅血球耗盡對於治療性mAb之安全性而言是重要特徵，然而此要求也會阻止使用任何需要效應功能（像是ADP）以發揮治療性作用機制之治療性mAb的抗TfR介導之腦部遞送。例如，一種可能的治療性作用機制依靠Tau聚集物之Fc依賴性小神經膠細胞吞噬作用。藉由抑制腦部穿梭劑mAb結合至FcγR之能力以防止網狀紅血球耗盡，mAb便無法結合小神經膠細胞上之FcγR以促進Tau聚集物之吞噬作用。
為了探索ADP之替代路徑，吾人評估了效應靜默三腳架mAb（BBBB1133及BBBB1136）在人類IPSC衍生之小神經膠細胞中誘發Tau聚集物之吞噬作用的能力。相較於對照抗Tau mAb PT1B844（一種IgG1 mAb），這兩個三腳架mAb均會誘發較強的Tau聚集物之吞噬作用（圖19A）。已證明BBBB1133所致的Tau聚集物之ADP會透過TfR介導之內化發生，且可用過量可溶TfR胞外域之添加來阻斷。過量可溶Fc之添加不會影響ADP，證實非典型ADP利用TfR而非FcγR（圖19B）。針對BBBB1133觀察到與對照mAb (PT1B844)類似的Tau之細胞內運輸，其通過初級內體(EEA1)至中間內體(Rab17)且最終至溶體(LAMP1)（圖19C）。
為了進一步驗證非典型ADP作為小神經膠細胞所致的Tau降解之生理相關機制，吾人評估了三腳架mAb誘發人類死後阿茲海默症腦部衍生之tau原纖維(PHF-Tau)之吞噬作用的能力。PHF-Tau之ADP係在人類單核球衍生之巨噬細胞及人類IPSC衍生之小神經膠細胞兩者中測量（圖20）。PT1B844及BBBB1133兩者在早期時間點均會誘發PHF-Tau之吞噬作用。然而，在後期時間點，BBBB1133會繼續誘發PHF-Tau之ADP，而PT1B844介導之ADP則停頓。此可能是如已針對典型ADCP描述之巨噬細胞及小神經膠細胞耗竭的證據(Church, VanDerMeid et al. 2016)及BBBB1133所利用之非典型ADP機制的潛在優點。與使用Tau寡聚物之先前所述實驗類似，Tau之吸收係用過量可溶TfR之添加來阻斷，證明此係TfR依賴性機制。為了探查非典型ADP相對於典型ADP之另一潛在優點，在PHF Tau吞噬作用實驗中測量促發炎細胞介素。如預期，由PT1B844介導之典型ADP會導致促發炎細胞介素的分泌，而由BBBB1133介導之非典型ADP則不會。
為了評估AAS IgG1三腳架mAb促進Tau聚集物在小神經膠細胞中吸收的潛力，將衍生自誘發性多能幹細胞(iPSC)之人類小神經膠細胞以每孔7000個細胞之稀釋液接種至384孔Perkin Elmer Cell Carrier Ultra盤上，並維持在具有Glutamax+、青黴素/鏈黴素、IL34 (100 ng/ml)、及GMCSF (10 ng/ml)之進階DMEM/F12培養基中。在檢定當天，使生物素化磷酸化tau聚集物[序列：SCBiot-(dPEG4)GTPGSRSR(pT)PSLP(pT)PPTREPLL (SEQ ID NO: 315)-醯胺]與鏈黴親和素Alexa Fluor 488 (AF488)以15倍莫耳過量複合。接著使經標示之磷酸化tau寡聚物以大約2X莫耳過量在室溫下結合測試mAb 30分鐘。接著將mAb:tau聚集物複合體以20 ul/孔遞送至小神經膠細胞。在培養後2、4、及8小時，將細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌兩次，然後在室溫下於4%多聚甲醛存在下固定15分鐘。在固定後，將細胞再次在PBS中洗滌兩次，然後與LAMP1一級抗體（一種溶體之標記）以4 ug/ml之濃度在4℃下於透化緩衝劑（0.1%皂素+1%魚皮明膠）中培養整夜。在培養後，將細胞用PBS洗滌兩次，然後用1 ug/ml接合至Alexa Fluor 647之二級抗體在4℃下於透化緩衝劑中染色1小時。在培養後，將細胞用PBS洗滌兩次，用Hoechst DNA染料以1 ug/ml在室溫下於PBS中對比染色10分鐘。接著將細胞在PBS中洗滌最後一次，再懸浮於每孔20 ul的PBS中，然後在Opera Phenix共焦高通量顯微鏡上成像。使用Harmony及ImageJ分析軟體來分析所獲取之影像。針對在吞噬溶體結構內且經LAMP1抗體標示的Tau聚集物之存在，對每條件大約500個細胞評分。
相較於非腦部穿梭劑mAb (PT1B844)，所有腦部穿梭劑mAb均促進更有效率之吸收進入吞噬體（圖15）。在腦部穿梭劑mAb內，具有完整效應功能者（BBBB1131、1134、及1046）比沒有效應功能者更有效率。這些數據證明，消除與FcγR之結合以降低網狀紅血球耗盡之風險應該不會影響抗Tau mAb之治療效力。事實上，TfR介導之內化及運輸至吞噬溶體似乎在小神經膠細胞中比傳統FcγR介導之吞噬作用更有效率。
為了探索該觀察是否能夠使用其他目標及細胞重複，在人類巨噬細胞中評估RSV F蛋白之吸收。將初級人類巨噬細胞以大約每孔6000個細胞之稀釋液接種至384孔Perkin Elmer Cell Carrier Ultra盤上，並在補充有10% FBS、50 mg/ml巨噬細胞群落刺激因子(mCSF) CSF、及25 ng/ml干擾素γ (IFNγ)之X-VIVO 10無血清造血細胞培養基中培養。在檢定當天，使7倍莫耳過量RSV-F蛋白（與抗His生物素化抗體及鏈黴親和素Alexa Fluor 488複合的His標記F蛋白）在室溫下結合抗RSV mAb (1 ug/ml) 30分鐘。接著將mAb:F蛋白複合體以20 ul/孔遞送至巨噬細胞。經Alexa Fluor 488標示之大腸桿菌作為吞噬作用之陽性對照組。在培養後3小時，將細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌兩次，然後在RT下於4%多聚甲醛存在下固定15分鐘。在固定後，將細胞再次在PBS中洗滌兩次，然後與LAMP1一級抗體（一種溶體之標記）以4 ug/ml之濃度在4℃下於透化緩衝劑（0.1%皂素+1%魚皮明膠）中培養整夜。在培養後，將細胞用PBS洗滌兩次，然後用1 ug/ml接合至Alexa Fluor 647之二級抗體在4℃下於透化緩衝劑中染色1小時。在培養後，將細胞用PBS洗滌兩次，用Hoechst DNA染料以1 ug/ml在室溫下於PBS中對比染色10分鐘。接著將細胞在PBS中洗滌最後一次，再懸浮於每孔20 ul的PBS中，然後在Opera Phenix共焦高通量顯微鏡上成像。使用Harmony及ImageJ分析軟體來分析所獲取之影像。針對在吞噬溶體結構內且經LAMP1抗體標示的F蛋白點(foci)之存在，對每條件大約300個細胞評分。
如針對Tau及小神經膠細胞所觀察到的，相較於非腦部穿梭劑mAb (B21M-IgG1)，所有腦部穿梭劑mAb均促進更有效率之吸收進入吞噬體（圖16）。然而，在IgG1（BBBB932及BBBB934）與IgG1 AAS（BBBB354及BBBB368）腦部穿梭劑mAb之間未觀察到吸收差異。B21M實驗與Tau實驗（圖15及圖16）之間的差異是由於目標還是細胞仍待判定。無論如何，數據證實其中TfR介導之內化及運輸至吞噬溶體似乎至少與傳統FcγR介導之吞噬作用一樣有效率的機制之穩健性。
就發明人所知，尚未有任何出版物描述利用治療性mAb之此非典型ADP機制。儘管不希望受理論束縛，據信吞噬作用及胞吞作用均可透過吞噬溶體路徑之會聚(convergence)而導致降解，使得無論內化觸發之作用（FcγR介導之吞噬作用或TfR介導之胞吞作用）為何，經內化之貨物(cargo)係運輸至吞噬溶體並由吞噬溶體降解。 評估huTfR 小鼠視網膜中之PK/PD 關係
接著將所選抗TfR腦部穿梭劑融合至原型抗BACE（β-分泌酶）mAb，並使用與上述相同之方法重新評估結合親和力。如表5中所示，當融合至B21M mAb（抗人類呼吸道融合病毒）及抗BACE拮抗劑mAb時，抗TfR腦部穿梭劑之親和力是類似的。針對所選分子評估內化（圖4），且發現其與當將抗TfR腦部穿梭劑融合至B21M mAb時所觀察到之內化並無變化。
因為抗TfR腦部穿梭劑皆未結合至小鼠或大鼠TfR，將在huTfR敲入小鼠（C57BL/6-Tfrctm2618(TFRC)Arte小鼠(Taconic Artemis)）中使用原型抗BACE拮抗劑mAb（BBBB970、BBBB978、BBBB983）進行體內囓齒動物研究。選擇抗BACE拮抗劑mAb作為用於測量BACE1之抑制（透過其產物肽Aβ1-40之濃度）的模型PD系統，該抑制反映了運輸至腦部的mAb量。
第一體內研究將評估huTfR小鼠視網膜中之PK/PD關係。將對敲入(KI)小鼠用BBBB970、BBBB978、BBBB983、及對照組BBBB456以10 mg/kgi.v. 給藥。將在給藥後4及24小時採集眼睛及血漿。在排定之時間點，將藉由吸入異氟烷將小鼠麻醉。將在用5 mL的0.9%鹽水溶液進行全身灌注後收集來自KI小鼠之小鼠眼睛。將所收集之眼睛樣本（除去視神經）在液態氮中急凍，然後儲存在-70℃下，直到組織均質化或準備用於免疫組織化學。
BACE活性測量將藉由將小鼠眼睛在裂解基質D管中均質化來進行（每mg腦部重量8 µl的0.4% DEA/50 mM NaCl，Fast Prep-24在6/振盪/sec下進行20 sec）。接著將在設定為最高速度之Eppendorf離心機中將管在4℃下離心5 min。接著將均質物（上清液）轉移至經預冷之管中，接著將其在4℃下以13,000 rpm離心70分鐘。接著將上清液轉移至含有10%的0.5 M Tris/HCL之管中，然後冷凍在-80℃下直到進行檢定。接著將Aβ1-40肽標準品及解凍之經處理眼睛均質物與經釕(Meso Scale Discovery (MSD), R91AN-1)標示之抗Aβ抗體以1:1預複合。將50 ul的複合體添加至含有針對Aβ1-40之捕捉抗體的經阻斷盤中。在2至8℃下無振盪培養整夜之後，將盤洗滌並添加2x讀取緩衝劑(MSD, R92TC-1)。將使用Meso Sector S 600 (MSD, IC0AA)讀取盤。 細胞介素分泌分析
在對人類iPSC衍生之小神經膠細胞進行不同之治療後，細胞上清液中之分泌蛋白質的相對濃度係使用基於抗體之29-plex免疫檢定(Luminex, R&D systems, Cat.# LXSAHM-29)測量。29種分泌蛋白質為：BDNF、CCL3/MIP1 α、CCL20/MIP3 α、Groβ/MIP2、CXCL10/IP10/CRG2、GCSF、IFN α、IL1 α、IL2、IL6、IL10、IL17/IL17 α、MCSF、RAGE/AGER、TNF α、CCL2/JE/MCP1、CCL4/MIP1β、CXCL9/MIG、FGFb/FGF2、GMCSF、IFNγ、IL1β、IL4、IL8/CXCL8、IL12p70、IL23、MMP9、阻抗素(resistin)。PHF Tau
使用獲自5位組織學上證實之AD患者（Braak分期V至VI）的來自皮質之死後組織，以產生部分純化PHF之池，此係藉由下列之修改後方法：(Mercken et al.,Acta Neuropathologica (1992) 84: 265–272; Greenberg, et al.J. biol. Chem. (1992) 267: 564-569)。一般而言，將5 g頂葉或額葉皮質在10倍體積冷緩衝劑H（10 mM Tris、800 mM NaCl、1 mM EGTA、及10%蔗糖/ pH 7.4）中均質化，其使用玻璃/鐵氟龍Potter組織均質機(IKA Works, Inc; Staufen, Germany)以1000 rpm進行。將經均質化之材料在4℃下以27000×g離心20 min。將沉澱物丟棄，並將上清液調整至1% (w/v) N-月桂醯基肌胺酸之最終濃度，然後在37℃下培養2 h。隨後，將上清液在20℃下以184000×g離心90 min。將沉澱物在PBS中小心洗滌，並再懸浮於750uL PBS中，將其等分，然後冷凍在–80℃下。PHF-tau製劑之品質係藉由使用AT8/AT8磷酸化聚集物選擇性MSD ELISA評估。Tau含量係藉由西方墨點法使用hTau10 (Janssen R&D)並使用重組2N4R tau作為校正物來判定。 關於TfR TTP mAb 在體內強化ADP 之能力的研究
在Tau接種之小鼠模型中研究TfR TTP mAb在體內強化ADP之能力。小鼠模型採用基因轉殖Tau-P301L小鼠，其表現具有P301L突變之最長人類tau同功型(tau-4R/2N-P301L) (Terwel, et al. (2005) J Biol Chem; 280(5): 3963-73)。由於缺乏TTP之小鼠TfR交叉反應性，開發出小鼠替代TTP以具有類似於前導人類TfR TTP之結合性質，並將其用於此研究中。Tau接種之模型涉及PHF-Tau之立體定位海馬迴注射，其會誘發tau聚集之劑量依賴性增加(Vandermeeren, et al., J Alzheimers Dis.(2018); 65(1): 265-281)。在mAb之共注射後，不同抗tau mAb所致之Tau接種中和已證明，該模型係部分依賴於Fc介導之Tau的ADP（圖21A）。雖然這兩個抗Tau mAb相較於同型對照組均會中和Tau接種，但在具有效應功能之mAb（小鼠IgG2a）與沒有效應功能之mAb（小鼠IgG2a (Vafa, et al., Methods. 2014 Jan 1; 65(1): 114-26)）之間觀察到統計上顯著之差異，證明該模型對於mAb效應功能之部分依賴性。
完成類似研究以將具有小鼠IgG2a Fc之抗Tau mAb（PT1B844）與具有人類IgG1 AAS Fc之PT1B844 TTP mAb進行比較。利用mAb之共注射以標準化mAb與TTP mAb之間的任何PK性質差異。相較於同型對照組，這兩種抗Tau mAb均會中和Tau接種。TTP mAb展示相較於具有完整Fc效應功能之mAb至少部分相同，這意味著非典型ADP機制在體內發揮作用（圖21B）。PHF 在P301L 小鼠中之立體定位注射
PHF tau接種研究（包括目前所述之研究）之執行符合當地倫理委員會(628-Tau Spread, Janssen Pharmaceutica)及國家機構所核准之規程（遵守AAALAC指南）。將表現具有P301L突變之最長人類tau同功型(tau-4R/2N-P301L) (Terwel et al., 2005; Peeraer et al., 2015)之小鼠單獨安置在豐富的環境中，在個別通風的籠子中並在12/12 h光/暗循環下（在6:00 AM點亮）。在90 +/- 7天齡時，將小鼠依治療組及性別隨機化，並在右海馬廻(CA1)接受AD衍生之PHF的單側注射（於抗IgG2a (n= 19)；抗磷酸化Tau小鼠IgG2a (n= 20)；或抗磷酸化Tau-TTE (n = 20)存在下）。
將Tau.P301L小鼠用異氟烷（5%於36%氧氣中）深度麻醉，然後固定在立體定位架（Stoelting-Neurostar組合）中。在進一步程序期間，維持2%異氟烷水平。使用30G注射器(Hamilton)在右半球中注射3 µL，速度為0.25 µl/min，注射的選定座標為：前後側(anteroposterior) -2.0、自前囟之內外側(mediolateral) +1.6、自硬腦膜之背腹側(dorsoventral) 1.4 mm。在注射前及注射後每週監測體重，針對所有注射實驗在治療組與對照組之間未觀察到差異（未顯示）。
在注射後兩個月，藉由斷頭術將小鼠犧牲，並將來自同側半球之腦部組織急凍。在擷取前，將組織稱重並在每100 mg組織600 µL的緩衝劑H（10 mM Tris、800 mM NaCl、1 mM EGTA、及10%蔗糖/ pH 7.4）中均質化。將均質物以27 000 × g離心20 min，然後將上清液冷凍在-80℃下。 生物化學分析MesoScale Discovery (MSD)
將塗佈抗體(AT8)稀釋於PBS (1 µg/ml)中並等分至MSD盤（每孔30 µL）(L15XA, MSD, Rockville, MD, USA)中，將盤在4℃下培養整夜。在用5 × 200 µl的PBS/0.5%Tween-20洗滌後，將盤用0.1%於PBS中之酪蛋白阻斷，然後用5 × 200 µl的PBS/0.5%Tween-20再次洗滌。在添加樣本及標準品（兩者均稀釋於0.1%於PBS中之酪蛋白）之後，將盤在4℃下培養整夜。隨後，將盤用5 × 200 µL的PBS/0.5% Tween-20洗滌，然後添加在0.1%於PBS中之酪蛋白中的SULFO-TAG™接合偵測抗體(AT8)，並在室溫下培養2 h同時以600 rpm振盪。在最終洗滌（5 × 200 µL的PBS/0.5%Tween-20）之後，添加150 µL 2 x緩衝劑T (MSD)，且用MSD成像器讀取盤。將原始信號對標準曲線進行標準化，該標準曲線係由來自死後AD腦部之月桂醯基肌胺酸鈉(sarcosyl)不溶性製劑(PHF)之16個稀釋液所組成，且將該等信號表示為任意單位(AU) PHF。用GraphPad prism軟體執行統計分析（使用Bonferroni校正之ANOVA，用於多重檢定）。將P值＜ 0.05視為有顯著差異。 討論
為了達到基於受體介導之胞吞轉送的最佳化腦部遞送平台，產生以一範圍的親和力以pH依賴性方式特異性結合至人類轉鐵蛋白受體(huTfR)之mAb。TfR結合親和力與胞吞轉送效率之間的關係在許多出版物中已被廣泛提及，其著重於平衡解離常數KD 。雖然KD 是一個重要的量度，但在本發明中已令人驚訝地證明結合動力學ka 及kd 對於胞吞轉送之關鍵性。發明人發現，結合速率及解離速率兩者均需要針對有效率胞吞轉送及所遞送治療性mAb之藥效動力學活性進行最佳化。基於這些結果，最佳胞吞轉送會發生在例如ka ≥ 105 M−1 s−1 且中性kd = 2×10-3 sec-1 時。儘管不希望受理論束縛，假定結合速率與解離速率之間的相互作用對於確保有效率之跨細胞輸送通過各式各樣負責極化細胞中之蛋白質運輸的細胞內囊泡是關鍵的。
已證明在食蟹獼猴中給藥三腳架mAb會導致腦部濃度相對於對照mAb有6至12x提升。酸性FcRn結合增加會導致末梢清除降低及腦部濃度提升。在正常生理條件下，FcRn介導之抗體自腦部外排可能藉由在腦部中避免非所要的發炎及免疫反應而對維持腦內恆定是關鍵的(Schlachetzki, Zhu et al. 2002, Roopenian and Akilesh 2007)。雖然優勢證據意味著FcRn介導之抗體外排扮演了重大角色，但關於此清除機制仍有一些爭議(Garg and Balthasar 2009, Abuqayyas and Balthasar 2013)。發明人發現，增加對FcRn之結合親和力對末梢及腦部濃度兩者皆具有正面影響，這意味著任何增強之外排在此系統中是不重要的。在食蟹獼猴中使用三腳架mAb之劑量反應實驗證明輸送機制之可飽和性，其在此物種中在30 mg/kg下會發生。亦在食蟹獼猴中完成大量的重複給藥、劑量反應表徵，且其將會對預測人類劑量及此平台對於特異性治療應用之實用性有很大的幫助。
網狀紅血球耗盡對於TfR結合抗體而言是已知的安全性阻礙。發明人觀察到，對於效應功能健全之mAb的確可觀察到急性且幾乎完全的網狀紅血球耗盡。已描述許多避免此耗盡之方法，包括降低效應功能{Couch, 2013 #589}及透過分子架構{Weber, 2018 #590}。雖然發明人利用與已描述為空間上能夠減弱末梢效應功能者非常類似的架構，發明人對效應功能健全之mAb仍觀察到穩健之網狀紅血球耗盡。
Fc誘變的明顯缺點是將效應功能自治療性mAb消除。對於腦部中之許多治療目標（像是β類澱粉蛋白及Tau）而言，據信ADP對於效力而言至關重要。先前工作已證明，可將再循環受體（包括TfR）自分選小管(sorting tubule)排除，且可藉由多價貨物結合將其轉向至溶體(Marsh, 1995,J Cell Biol (1995) 129 (6): 1509–1522; Weflen, 2013 Mol Biol Cell. 2013 Aug 1; 24(15): 2398–24050。發明人證明，多價貨物之此內源轉向可用作為ADP之替代、非典型、非FcγR機制。透過非典型及典型ADP內化之Tau係以類似方式在小神經膠細胞中運輸，其中Tau聚集物運輸通過內溶體(endolysosomal)系統至溶體以進行降解。可將所述之非典型ADP用於各種治療應用，其中ADP對於效力是必要的但典型ADP對安全性有害。
數據指示，非典型ADP比典型ADP更有效率，這可能是由於FcγR與TfR之間的結合及內化之固有差異。FcγR介導之內化需要mAb所致之受體群集，而TfR則獨立於mAb結合而快速內化及再循環。第二種可能的解釋是巨噬細胞及小神經膠細胞耗竭(Zent, 2017 FEBS J. 2017 Apr; 284(7):1021-1039)。巨噬細胞耗竭似乎取決於巨噬細胞暴露於目標之時間長度(Church, VanDerMeid et al. 2016, Clin Exp Immunol. 2016 Jan; 183(1):90-101) (Mukundan, 2009, Nat Med. 2009 Nov; 15(11):1266-72)，此與吾人對於典型ADP隨時間停頓之觀察相符。已在體外及患者中觀察到巨噬細胞耗竭，指示此耗竭表型可能影響具有效應功能之mAb的治療效力。非典型ADP提供效力優點，藉由介導ADP而不活化小神經膠細胞（藉由結合FcγR）來避免此耗竭表型。
非典型ADP之另一優點是藉由避免小神經膠細胞活化，ADP之發生不會刺激促發炎細胞介素的生產。對於使用效應功能健全之mAb在治療腦部中之疾病上的安全性仍有爭議，尤其是關於在已罹患慢性神經發炎之患者中增加神經發炎（綜述於{Heneka, 2015 #591}中）。此外，對於下列之關注正在不斷增加：發炎在涉及發炎增加之神經退化性疾病的致病機制中所扮演的角色、以及接合或進一活化可能已經耗竭之小神經膠細胞的爭論中能力。例如，已證明典型ADP對於神經元之毒性影響，並假定效應功能健全之mAb可能帶來安全性風險{Lee, 2016 #592}。本文所述之非典型ADP機制藉由強化有效率之Tau清除而不需要活化小神經膠細胞或刺激促發炎細胞介素釋放，而避免了可能的神經發炎阻礙。總而言之，已對穩健之腦部遞送平台針對藥物動力學、藥效動力學、及安全性進行表徵，從而建立進展至臨床試驗所需之穩健臨床前表徵。
當格式化為scFv腦部穿梭劑並融合至原型抗BACE（β-分泌酶）拮抗劑mAb時，在對表現huTfR之基因轉殖小鼠i.v. 給藥後，相對於單獨抗BACE mAb觀察到4至10x之腦部濃度提升。亦注意到強烈的PK:PD關係，且偵測到β類澱粉蛋白之劑量依賴性減少。表現最佳之腦部穿梭劑的腦部遞送增強得比競爭者分子還要多，從而透過腦部穿梭劑與huTfR之間的經最佳化結合交互作用而達到同級最佳之遞送。
接著將經最佳化之腦部穿梭劑融合至PT1B844（一種Tau結合mAb）。當在食蟹獼猴中i.v .給藥時，與腦部穿梭劑融合之PT1B844展示6至16倍之腦部濃度提升。類似於小鼠數據，腦部濃度之提升超過文獻中所報導之最佳腦部穿梭劑。除了優越的腦部PK以外，腦部穿梭劑經工程改造以降低Fc介導之效應功能，且在食蟹獼猴中不誘發快速網狀紅血球耗盡（如競爭者所曾報導）。重要的是，Fc功能之喪失不會影響治療性Tau mAb之有效性，因為腦部穿梭劑在介導Tau之小神經膠細胞吸收上比單獨PT1B844更有效率。
所屬技術領域中具有通常知識者將領會的是，能夠對以上所述的實施例進行變更而不違背其廣義的發明概念。因此，應了解本發明不限於所揭示之特定實施例，而是意欲涵蓋如隨附之申請專利範圍所定義的本發明之精神及範疇內的修改。
引用： Abuqayyas, L. and J. P. Balthasar (2013).“Investigation of the role of FcgammaR and FcRn in mAb distribution to the brain.”Mol Pharm10 (5): 1505-1513. Church, A. K., K. R. VanDerMeid, N. A. Baig, A. M. Baran, T. E. Witzig, G. S. Nowakowski and C. S. Zent (2016).“Anti-CD20 monoclonal antibody-dependent phagocytosis of chronic lymphocytic leukaemia cells by autologous macrophages.”Clin Exp Immunol183 (1): 90-101. Cooper, P. R., G. J. Ciambrone, C. M. Kliwinski, E. Maze, L. Johnson, Q. Li, Y. Feng and P. J. Hornby (2013).“Efflux of monoclonal antibodies from rat brain by neonatal Fc receptor, FcRn.”Brain Res1534 : 13-21. Dall'Acqua, W. F., P. A. Kiener and H. Wu (2006).“Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor (FcRn).”J Biol Chem281 (33): 23514-23524. Garg, A. and J. P. Balthasar (2009).“Investigation of the influence of FcRn on the distribution of IgG to the brain.”AAPS J11 (3): 553-557. Goulatis, L. I. and E. V. Shusta (2017).“Protein engineering approaches for regulating blood-brain barrier transcytosis.”Curr Opin Struct Biol45 : 109-115. Johnsen, K. B., A. Burkhart, F. Melander, P. J. Kempen, J. B. Vejlebo, P. Siupka, M. S. Nielsen, T. L. Andresen and T. Moos (2017).“Targeting transferrin receptors at the blood-brain barrier improves the uptake of immunoliposomes and subsequent cargo transport into the brain parenchyma.”Sci Rep7 (1): 10396. Robbie, G. J., R. Criste, W. F. Dall'acqua, K. Jensen, N. K. Patel, G. A. Losonsky and M. P. Griffin (2013).“A novel investigational Fc-modified humanized monoclonal antibody, motavizumab-YTE, has an extended half-life in healthy adults.”Antimicrob Agents Chemother57 (12): 6147-6153. Roopenian, D. C. and S. Akilesh (2007).“FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age.”Nat Rev Immunol7 (9): 715-725. Schlachetzki, F., C. Zhu and W. M. Pardridge (2002).“Expression of the neonatal Fc receptor (FcRn) at the blood-brain barrier.”J Neurochem81 (1): 203-206. Vandermeeren, M., M. Borgers, K. Van Kolen, C. Theunis, B. Vasconcelos, A. Bottelbergs, C. Wintmolders, G. Daneels, R. Willems, K. Dockx, L. Delbroek, A. Marreiro, L. Ver Donck, C. Sousa, R. Nanjunda, E. Lacy, T. Van De Casteele, D. Van Dam, P. P. De Deyn, J. A. Kemp, T. J. Malia and M. H. Mercken (2018).“Anti-Tau Monoclonal Antibodies Derived from Soluble and Filamentous Tau Show Diverse Functional Properties in vitro and in vivo.”J Alzheimers Dis65 (1): 265-281. Yu, Y. J., J. K. Atwal, Y. Zhang, R. K. Tong, K. R. Wildsmith, C. Tan, N. Bien-Ly, M. Hersom, J. A. Maloney, W. J. Meilandt, D. Bumbaca, K. Gadkar, K. Hoyte, W. Luk, Y. Lu, J. A. Ernst, K. Scearce-Levie, J. A. Couch, M. S. Dennis and R. J. Watts (2014).“Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates.”Sci Transl Med6 (261): 261ra154. Yu, Y. J., Y. Zhang, M. Kenrick, K. Hoyte, W. Luk, Y. Lu, J. Atwal, J. M. Elliott, S. Prabhu, R. J. Watts and M. S. Dennis (2011).“Boosting brain uptake of a therapeutic antibody by reducing its affinity for a transcytosis target.”Sci Transl Med3 (84): 84ra44. Zent, C. S. and M. R. Elliott (2017).“Maxed out macs: physiologic cell clearance as a function of macrophage phagocytic capacity.”FEBS J284 (7): 1021-1039.
無
前述發明內容以及下文實施方式在結合附圖閱讀時可更有利理解。出於說明本發明之目的，圖式中顯示目前較佳的實施例。然而應理解的是，本發明並不限於圖式中所示之確切實施例。
本專利或申請文件至少含有一個以彩色製成的圖式。在提出申請並支付必要費用後，專利局會提供具有彩色圖式的本專利或專利申請公開案副本。 ［圖1］係用於腦部遞送平台之三腳架(tripod) mAb格式（亦稱為TTP mAb）的圖示。 ［圖2］係顯示三腳架mAb在人類腦部內皮細胞中之內化(internalization)的影像。三腳架mAb係染成紅色，核係染成藍色，且肌動蛋白係染成綠色。 ［圖3］係顯示pH依賴性結合之圖，該結合係藉由將在pH 7.4下之解離速率與當將pH降低至6.5及6.0時之解離速率進行比較來評估。如果解離速率隨著pH降低而變快，則三腳架mAb得分為正。 ［圖4］係顯示三腳架mAb BBBB383在人類腦部內皮細胞中之內化的影像。三腳架mAb係染成紅色，核係染成藍色，且肌動蛋白係染成綠色。 ［圖5A］至［圖5B］係顯示BBBB383及BBBB426之血漿（圖5A）及腦部（圖5B）PK的圖。將含有腦部穿梭劑之抗BACE mAb（BBBB383及BBBB426）與BBBB456（不具有腦部穿梭劑之抗BACE mAb）進行比較。符號代表4隻小鼠（在4及24小時）或5隻小時（在72小時）之平均。 ［圖6］係顯示在用BBBB383及BBBB426治療後腦部中Aβ1-40濃度的圖。將含有腦部穿梭劑之抗BACE mAb（BBBB383及BBBB426）與BBBB456（不具有腦部穿梭劑之抗BACE mAb）進行比較。符號代表4隻小鼠（在4及24小時）或5隻小時（在72小時）之平均。 ［圖7A］至［圖7B］係顯示腦部穿梭劑抗BACE mAb之血漿（圖7A）及腦部（圖7B）PK的圖。將含有腦部穿梭劑之抗BACE mAb與BBBB456（不具有腦部穿梭劑之抗BACE mAb，虛線實心菱形）進行比較。各符號代表每個時間點兩隻小鼠之平均。 ［圖8］係顯示在用腦部穿梭劑mAb治療後腦部中Aβ1-40濃度的圖。將含有腦部穿梭劑之抗BACE mAb與BBBB456（不具有腦部穿梭劑之抗BACE mAb，虛線實心菱形）進行比較。針對所有腦部穿梭劑（除了BBBB983以外）均觀察到AB水平之劑量依賴性降低。各符號代表每個時間點兩隻小鼠之平均。 ［圖9］係顯示三腳架mAb BBB-00489在人類腦部內皮細胞中之內化的影像。三腳架mAb係染成紅色，且肌動蛋白係染成綠色。 ［圖10］係顯示食蟹獼猴中之腦部藥物動力學的圖。對食蟹獼猴用三種TTP mAb（BBBB1134及BBBB1136（左邊）及BBBB1133（右邊））靜脈內給藥10 mg/kg，並將其與對照mAb (PT1B844)進行比較。在給藥後72小時測量腦部暴露（n= 3隻食蟹獼猴/mAb）。跨各種區域判定mAb之腦部濃度並跨動物進行平均。各符號代表一個腦部區。 ［圖11］係顯示含腦部穿梭劑mAb相較於非腦部穿梭劑對照組在不同區中之腦部濃度的圖。個別的點代表各個動物(n=3)。 ［圖12］係顯示i .v .給藥之mAb在4、24、及72小時之血漿濃度的圖。所有腦部穿梭劑mAb均具有比非腦部穿梭劑mAb快的清除。個別的點代表各個動物(n=3)。 ［圖13］係顯示在食蟹獼猴(cyno)研究期間針對BBBB1134觀察到網狀紅血球耗盡但針對其他mAb則未觀察到的圖，此證實Fc功能對於TfR結合mAb及網狀紅血球耗盡的影響。 ［圖14A］至［圖14C］：三腳架mAb在huTfR敲入(knock-in)小鼠中之腦部藥物動力學及藥效動力學，對人類TfR敲入小鼠用一小組三腳架mAb (BBBBx)靜脈內給藥10 mg/kg，將其與一個對照mAb進行比較，並在24小時評估腦部暴露： ［圖14A］：觀察到一範圍的暴露提升，從無提升（BBBB974，空心方形）至10.5x（BBBB978，空心三角形）（n= 2隻小鼠，符號代表各個個別動物，且長條代表平均而誤差槓代表標準偏差）。 ［圖14B］：三腳架mAb解離速率與腦部暴露具有良好相關性，並觀察到不會太快或太慢的解離速率是最佳的。 ［圖14C］：評估mAb（抗BACE拮抗劑mAb）之腦部藥效動力學，且針對所有三腳架mAb（除了BBBB983以外）在腦部中均觀察到強烈的PK/PD關係。BBBB983具有提升之腦部暴露(5.5x)但Aβ1-40 濃度與對照mAb類似（各個三角形代表一個個體）。假定緩慢的中性解離速率防止在腦部中擴散至目標。 ［圖15］係顯示mAb介導之吸收進入小神經膠細胞吞噬體的圖。相較於非腦部穿梭劑mAb (PT1B844)，所有腦部穿梭劑mAb均促進更有效率之吸收進入吞噬體。在腦部穿梭劑mAb內，具有完整效應功能者（BBBB1131、1134、及1046）比沒有效應功能者更有效率。 ［圖16］係顯示mAb介導之吸收進入巨噬細胞吞噬體的圖。相較於非腦部穿梭劑mAb (B21M-IgG1)，所有腦部穿梭劑mAb均促進更有效率之吸收進入吞噬體。 ［圖17A］至［圖17F］：食蟹獼猴中之腦部藥物動力學展示治療性mAb之腦部遞送提升。 ［圖17A］：對食蟹獼猴用兩種三腳架mAb（BBBB1134及BBBB1136）及一種對照mAb (PT1B844)靜脈內給藥10 mg/kg。在給藥後72小時測量腦部暴露（n= 3隻食蟹獼猴/mAb。符號代表各個個別動物，且長條代表平均而誤差槓代表標準偏差）。針對這兩種腦部穿梭劑mAb在所評估之所有腦部區之間均觀察到腦部暴露提升。 ［圖17B］：相較於對照mAb，針對BBBB1134及BBBB136分別觀察到7x及11x腦部濃度提升。 ［圖17C］：72小時內之血漿暴露展示，相較於對照mAb，三腳架mAb之目標介導之藥物動向清除加速。三腳架mAb在其等對於FcRn之結合親和力上有所不同，其中BBBB1136含有高結合親和力「YTE」突變；相較於BBBB1134（空心方形），BBBB1136（三角形）在72小時具有大約2x的提升血漿濃度。 ［圖17D］：三腳架mAb（BBBB1134及BBBB1136）相較於陽性對照組（BBBB175高親和力抗TfR結合IgG1 mAb）及陰性對照組（CNTO3930，一種不結合目標細胞之IgG1 mAb）之體外ADCC活性。BBBB1134 (IgG1 mAb)增強人類及食蟹獼猴PBMC兩者對目標細胞之穩健ADCC。觀察到BBBB1136（一種效應功能靜默IgG1 mAb）沒有ADCC活性。 ［圖7E］：BBBB1134及BBBB1136對於補體成分1q (C1q)之SPR結合數據。BBBB1134會結合C1q而BBBB1136則不會。 ［圖17F］：在食蟹獼猴PK研究中觀察到網狀紅血球耗盡。針對對照mAb或BBBB1136在給藥後2天未觀察到網狀紅血球損失，而在用BBBB1134治療後觀察到穩健的耗盡（符號代表個別動物，長條代表平均而誤差槓代表標準偏差）。 ［圖18A］至［圖18D］：BBBB1133在食蟹獼猴中之重複給藥的腦部及血清藥物動力學及劑量反應： ［圖18A］：對食蟹獼猴用BBBB1133以2 mg/kg、10 mg/kg、或30 mg/kg靜脈內給藥，並在之後的1、7、或15天評估腦部暴露（n=3隻獼猴/mAb及時間點。符號代表平均腦部濃度，且誤差槓代表標準偏差）。在2與10 mg/kg之間觀察到線性腦部PK但在10與30 mg/kg之間觀察到非線性PK，這意味著30 mg/kg對於TfR而言係飽和劑量。 ［圖18B］：在整個研究期間測量BBBB1133之血清濃度（給藥後1、6小時及在第1、2、4、10、及14天）。在所有三種劑量下均觀察到線性藥物動力學。針對血清中之BBBB1133判定T1/2 = 6天。 ［圖18C］：對食蟹獼猴用BBBB1133以2 mg/kg、10 mg/kg、或30 mg/kgs每週靜脈內給藥三週。在給藥後1、7、15、或21天評估腦部暴露（n=3隻獼猴/mAb及時間點。符號代表平均腦部濃度，且誤差槓代表標準偏差）。在2與10 mg/kg之間觀察到線性腦部PK但在10與30 mg/kg之間觀察到非線性PK，這意味著30 mg/kg對於TfR而言係飽和劑量。在30 mg/kg劑量下觀察到累積的證據。 ［圖18D］：在整個研究期間測量BBBB1133之血清濃度（第一次給藥後1、6小時及在第1、2、4、10、14、14.02、14.25、15、16、18、及21天）。在所有三種劑量下均觀察到線性藥物動力學，且沒有對於重複給藥之PK耐受的證據。 ［圖19A］至［圖19C］：非典型、非FcγR介導之ADP會促進人類小神經膠細胞中Tau聚集物之有效率吞噬作用： ［圖19A］：為了評估效應功能受阻礙之IgG1三腳架mAb（BBBB1133及BBBB1136）促進小神經膠細胞中吸收Tau聚集物的潛力，將人類iPSC衍生之小神經膠細胞與mAb及生物素化磷酸化tau寡聚物（標示有鏈黴親和素Alexa Flour 488 (AF488)）培養。在培養後4小時，將細胞洗滌、固定、透化(permeabilized)、染色，然後使用共焦顯微術成像。將含有與經Lamp-1染色之溶體共定位的tau聚集物之細胞定量。BBBB1133及BBBB1136相較於抗Tau WT IgG1 mAb (PT1B844)促進更有效率之吸收及溶體運輸(lysosomal trafficking)。 ［圖19B］：Tau聚集物之吸收可用過量可溶TfR ECD阻斷，但不會受到可溶Fc之添加影響，證明吸收透過TfR發生。 ［圖19C］：將人類iPSc衍生之小神經膠細胞與經Alexa Fluor 488標示之磷酸化Tau肽（綠色）於PT1B844或BBBB1133存在下培養4小時。在固定後，將細胞用抗體對網格蛋白(Clathrin)、EEA1、Rab17、或Lamp1進行染色，然後用Alexa Fluor 647-二級抗體（紅色）進行偵測。使用Perkin Elmer Opera Phenix，60x放大率，共焦模式使細胞成像。顯示2 µm平面之代表性細胞影像。比例尺= 10 µm。共定位區域處之箭頭點詳細顯示於插圖中。各磷酸化Tau抗體治療之第三欄係其他兩欄之合併結果。亦使用DAPI對細胞進行染色及成像以偵測核，並使用hcs Cellmask橘色以偵測細胞質（未顯示）。 ［圖20A］至［圖20E］：非典型、非FcγR介導之ADP會促進人類巨噬細胞及小神經膠細胞中衍生自人類AD患者腦部之Tau聚集物之有效率吞噬作用： ［圖20A］：將人類單核球衍生之巨噬細胞與Tau聚集物及BBBB1133（空心方形）及對照抗Tau mAb（PT1B844，圓形）培養。將培養上清液中剩餘之pTau量隨時間定量。在長達8小時內觀察到類似之pTau降解，在此時間點PT1B844介導之ADP停頓，而BBBB1133介導之ADP則繼續促進降解。 ［圖20B］：使用人類iPSC衍生之小神經膠細胞觀察到類似趨勢，且相較於PT1B844，BBBB1133（空心方形）賦予更穩健的隨時間之pTau降解。藉由使用過量可溶TfR ECD阻斷降解，證明BBBB1133介導之pTau降解的機制透過TfR發生。 ［圖20C］至［圖20E］：針對細胞介素濃度評估來自小神經膠細胞實驗之上清液。PT1B844介導之pTau ADP會刺激促發炎細胞介素TFN α（圖20C）、IL6（圖20D）、及IL1β（圖20E）的釋放，而BBBB1133則不會刺激類似的釋放。 ［圖21］：PHF與所指示tau抗體之共注射降低tau病理之誘發： ［圖21A］：模型對Fc依賴性活性之部分依賴性係藉由小鼠IgG2a所致之Tau中和的統計上顯著差異而展示。 ［圖21B］：相較於同型對照組，這兩種抗Tau mAb均會中和Tau接種。在mAb與TTP mAb之間未觀察到統計上的差異，且TTP mAb相較於mAb具有稍微改善之中和，證明非典型ADP機制在體內發揮作用。
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Claims (26)

  1. 一種抗TfR抗體或其抗原結合片段，其用於將劑遞送至有需要之對象的腦部，其中該抗TfR抗體或其抗原結合片段在中性pH下以至少1 nM、較佳地1至500 nM之解離常數KD 且在酸性pH、較佳地pH 5下以至少10-4 sec-1 、較佳地10-4 至10-1 sec-1 之解離速率常數kd 結合至轉鐵蛋白受體(TfR)、較佳地人類TfR1。
  2. 如請求項1所述之抗TfR抗體或其抗原結合片段，其在中性pH下具有2 × 10-2 至2 × 10-4 sec-1 、較佳地2.0 × 10-3 sec-1 之解離速率常數kd。
  3. 如請求項1或2所述之抗TfR抗體或其抗原結合片段，其包含： (1)   包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2、及HCDR3之重鏈可變區及包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2、及LCDR3之輕鏈可變區，其中該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3具有下列之胺基酸序列： (i)         分別為SEQ ID NO: 292、293、294、295、296、及297； (ii)        分別為SEQ ID NO: 279、280、281、282、283、及284； (iii)       分別為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、及34； (iv)       分別為SEQ ID NO: 57、58、59、60、61、及62； (v)        分別為SEQ ID NO: 85、86、87、88、89、及90； (vi)       分別為SEQ ID NO: 110、111、112、113、114、及115； (vii)      分別為SEQ ID NO: 135、136、137、138、139、及140； (viii)     分別為SEQ ID NO: 191、192、193、194、195、及196； (ix)       分別為SEQ ID NO: 244、245、246、247、248、及249； (x)        分別為SEQ ID NO: 263、264、265、266、267、及268； (xi)       分別為SEQ ID NO: 345、346、347、348、349、及350； (xii)      分別為SEQ ID NO: 355、356、357、358、359、及360； (xiii)     分別為SEQ ID NO: 365、366、367、368、369、及370； (xiv)     分別為SEQ ID NO: 375、376、377、378、379、及380； (xv)      分別為SEQ ID NO: 385、386、387、388、389、及390； (xvi)     分別為SEQ ID NO: 395、396、377、398、399、及400； (xvii)    分別為SEQ ID NO: 405、406、407、408、409、及410； (xviii)   分別為SEQ ID NO: 415、416、417、418、419、及420； (xix)     分別為SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及430； (xx)      分別為SEQ ID NO: 435、436、437、438、439、及440； (xxi)     分別為SEQ ID NO: 445、446、447、448、449、及450； (xxii)    分別為SEQ ID NO: 455、456、457、458、459、及460； (xxiii)   分別為SEQ ID NO: 465、466、467、468、469、及470； (xxiv)   分別為SEQ ID NO: 475、476、477、478、479、及480； (xxv)    分別為SEQ ID NO: 485、486、487、488、489、及490； (xxvi)   分別為SEQ ID NO: 495、496、497、498、499、及500； (xxvii)  分別為SEQ ID NO: 505、506、507、508、509、及510； (xxviii) 分別為SEQ ID NO: 515、516、517、518、519、及520； (xxix)   分別為SEQ ID NO: 525、526、527、528、529、及530； (xxx)    分別為SEQ ID NO: 535、536、537、538、539、及540；或 (xxxi)   分別為SEQ ID NO: 545、546、547、548、549、及550；或 (2)   重鏈上之單可變域(VHH)，其包含具有下列之胺基酸序列的重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2、及HCDR3： (i)      分別為SEQ ID NO: 7、8、及9； (ii)     分別為SEQ ID NO: 317、318、及319； (iii)    分別為SEQ ID NO: 324、325、及326； (iv)    分別為SEQ ID NO: 331、332、及333；或 (v)     分別為SEQ ID NO: 338、339、及340。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之抗TfR抗體或其抗原結合片段，其係VHH片段，該VHH片段包含與SEQ ID NO: 6、316、323、330、或337具有至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%序列同一性之胺基酸序列。
  5. 如請求項1至3中任一項所述之抗TfR抗體或其抗原結合片段，其係單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段包含經由連接子共價連接至該輕鏈可變區之該重鏈可變區，較佳地該連接子具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列，更佳地該scFv包含與下列之胺基酸序列具有至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%序列同一性之胺基酸序列：SEQ ID NO: 278、291、28、56、84、109、134、162、190、218、243、262、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、或544。
  6. 一種接合物，其包含偶合至治療劑或診斷劑的如請求項1至5中任一項所述之抗TfR抗體或其抗原結合片段，較佳地該接合物係包含第一抗原結合區及第二抗原結合區之多特異性抗體，該第一抗原結合區結合該TfR且包含如請求項1至5中任一項所述之抗原結合片段，該第二抗原結合區結合腦部目標，諸如選自由下列所組成之群組的腦部目標：β-分泌酶1 (BACE1)、β類澱粉蛋白(Aβ)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、Tau、載脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、亨丁頓蛋白(huntingtin)、普里昂蛋白(PrP)、富白胺酸重複激酶2 (LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6 (DR6)、類澱粉蛋白前驅蛋白(APP)、p75神經營養因子受體(p75NTR)、及凋亡蛋白酶6。
  7. 一種融合建構體，其包含共價連接至第二抗體或其抗原結合片段的如請求項1至5中任一項所述之抗TfR抗體或其抗原結合片段，該第二抗體或其抗原結合片段結合至腦部目標，諸如選自由下列所組成之群組的腦部目標：β-分泌酶1 (BACE1)、β類澱粉蛋白(Aβ)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、Tau、載脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、亨丁頓蛋白、普里昂蛋白(PrP)、富白胺酸重複激酶2 (LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6 (DR6)、類澱粉蛋白前驅蛋白(APP)、p75神經營養因子受體(p75NTR)、及凋亡蛋白酶6。
  8. 如請求項7所述之融合建構體，其中該抗TfR抗體或其抗原結合片段經由連接子共價連接至該第二抗體或其抗原結合片段之該兩個重鏈中僅一者之羧基端，較佳地該連接子具有SEQ ID NO: 312或SEQ ID NO: 313之胺基酸序列。
  9. 如請求項8所述之融合建構體，其中該第二抗體或其抗原結合片段之該兩個重鏈的各者包含一或多個異二聚體突變或一或多個杵臼(knob and hole)突變，該異二聚體突變諸如經修飾異二聚體CH3域，如相較於野生型CH3域多肽。
  10. 如請求項9所述之融合建構體，其中該等異二聚體突變包含該第一重鏈之該經修飾異二聚體CH3域在位置T350、L351、F405、及Y407包含胺基酸修飾，且該第二重鏈之該經修飾異二聚體CH3域在位置T350、T366、K392、及T394包含胺基酸修飾，其中在位置T350之胺基酸修飾係T350V、T350I、T350L、或T350M；在位置L351之胺基酸修飾係L351Y；在位置F405之胺基酸修飾係F405A、F405V、F405T、或F405S；在位置Y407之胺基酸修飾係Y407V、Y407A、或Y407I；在位置T366之胺基酸修飾係T366L、T366I、T366V、或T366M，在位置K392之胺基酸修飾係K392F、K392L、或K392M，且在位置T394之胺基酸修飾係T394W，且其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。
  11. 如請求項10所述之融合建構體，其中該第一重鏈之該經修飾異二聚體CH3域包含突變T350V、L351Y、F405A、及Y407V，且該第二重鏈之該經修飾異二聚體CH3域包含突變T350V、T366L、K392L、及T394W。
  12. 如請求項7至11中任一項所述之融合，其中該第二抗體或其抗原結合片段在該Fc域中包含增強該融合與該新生兒Fc受體(RcRn)之結合的一或多個突變，較佳地該一或多個突變增強在酸性pH下之該結合，更佳地該Fc具有M252Y/S254T/T256E (YTE)突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。
  13. 如請求項7至12中任一項所述之融合，其中該第二抗體或其抗原結合片段在該Fc域中包含降低或消除效應功能的一或多個突變，較佳地該Fc在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329具有一或多個胺基酸修飾，諸如L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。
  14. 如請求項7至13中任一項所述之融合建構體，其中該第二抗體或其抗原結合片段結合至Tau且包含分別具有SEQ ID NO: 554至559之胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，較佳地該第二抗體係單株抗體，該單株抗體包含具有SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的輕鏈。
  15. 如請求項7至14中任一項所述之融合建構體，其包含： (1)        第一重鏈，其具有與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：SEQ ID NO: 301、304、307、285、288、298、10、13、16、19、22、25、35、38、41、44、47、50、53、63、66、69、72、75、78、81、91、94、97、100、103、106、116、119、122、125、128、131、141、144、147、150、153、156、159、169、172、175、178、181、184、187、197、200、203、206、209、212、215、225、228、231、234、237、240、250、252、256、259、269、272、275、320、327、334、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、及471； (2)        兩個輕鏈，其等各獨立地具有分別與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：302、305、308、286、289、299、11、14、17、20、23、26、36、39、42、45、48、51、54、64、67、70、73、76、79、82、92、95、98、101、104、107、117、120、123、126、129、132、142、145、148、151、154、157、160、170、173、176、179、182、185、188、198、201、204、207、210、213、216、226、229、232、235、238、241、251、253、257、260、270、273、276、321、328、335、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、及472；及 (3)        第二重鏈，其具有分別與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列至少80%、諸如至少85%、90%、95%、或100%同一之胺基酸序列：303、306、309、287、290、300、12、15、18、21、24、27、37、40、43、46、49、52、55、65、68、71、74、77、80、83、93、96、99、102、105、108、118、121、124、127、130、133、143、146、149、152、155、158、161、171、174、177、180、183、186、189、199、202、205、208、211、214、217、227、230、233、236、239、242、252、254、258、261、271、274、277、322、329、336、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463、及473。
  16. 一種經單離的核酸，其編碼如請求項1至5中任一項所述之抗體或抗原結合片段、如請求項6所述之接合物、或如請求項7至15中任一項所述之融合建構體。
  17. 一種載體，其包含如請求項16所述之經單離的核酸。
  18. 一種宿主細胞，其包含如請求項16所述之核酸或如請求項17所述之載體。
  19. 一種生產如請求項1至5中任一項所述之抗體或抗原結合片段、如請求項6所述之接合物、或如請求項7至15中任一項所述之融合建構體的方法，其包含在生產該抗體或抗原結合片段、該接合物、或該融合建構體之條件下，培養包含編碼該抗體或抗原結合片段、該接合物、或該融合建構體之核酸的細胞；及自該細胞或細胞培養物回收該抗體或抗原結合片段、該接合物、或該融合建構體。
  20. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至5中任一項所述之抗體或抗原結合片段、如請求項6所述之接合物、或如請求項7至15中任一項所述之融合建構體、及醫藥上可接受之載劑。
  21. 一種治療或偵測有需要之對象的病症、較佳地神經病症之方法，其包含向該對象投予如請求項1至5中任一項所述之抗體或抗原結合片段、如請求項6所述之接合物、或如請求項7至15中任一項所述之融合建構體、或如請求項20所述之醫藥組成物，較佳地該神經病症係選自由下列所組成之群組：神經退化性疾病（諸如路易氏體病(Lewy body disease)、脊髓灰質炎後症候群、Shy-Draeger症候群、橄欖體橋腦小腦萎縮、巴金森氏症、多系統萎縮、紋狀體與黑質體退化症、脊髓小腦性失調症、脊髓性肌萎縮）、tau蛋白病(tauopathy)（諸如阿茲海默症及核上神經麻痺症）、普里昂疾病（諸如牛海綿狀腦病、羊搔癢症、庫賈氏症候群(Creutz-feldt-Jakob syndrome)、庫魯病、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、慢性消耗病、及致死性家族性失眠症）、延髓性麻痺、運動神經元疾病、及神經系統異退化性病症(nervous system heterodegenerative disorder)（諸如Canavan病、亨丁頓舞蹈症(Huntington's disease)、神經元蠟樣脂褐質儲積症、亞歷山大氏病(Alexander's disease)、妥瑞氏症候群(Tourette's syndrome)、Menkes氏捲髮症候群、柯凱因氏症候群(Cockayne syndrome)、Halervorden-Spatz氏症候群、拉弗拉病(lafora disease)、雷特氏症候群(Rett syndrome)、肝豆狀核變性、Lesch-Nyhan氏症候群、及Unverricht-Lundborg氏症候群）、失智症（諸如匹克症(Pick's disease)及脊髓小腦性失調症）、及CNS及/或腦部之癌症（諸如身體其他地方之癌症所致的腦部轉移）。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段、該接合物、或該醫藥組成物經靜脈內投予。
  23. 一種將治療劑或診斷劑遞送跨過有需要之對象的血腦障壁(BBB)之方法，其包含向該對象投予複合體，該複合體包含偶合至、較佳地共價接合至如請求項1至5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段的該治療劑或診斷劑。
  24. 如請求項21至24中任一項所述之方法，其中該投予降低Fc介導之效應功能且/或不誘發快速網狀紅血球耗盡。
  25. 一種在有需要之對象中誘發抗體依賴性吞噬作用(ADP)而不刺激促發炎細胞介素的分泌之方法，其包含向該對象投予複合體，該複合體包含偶合至、較佳地共價接合至如請求項1至5中任一項所述之其抗原結合片段的治療性抗體或其抗原結合片段，其中該治療性抗體或其抗原結合片段在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329包含一或多個胺基酸修飾，諸如L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。
  26. 如請求項25所述之方法，其中該治療性抗體或其抗原結合片段特異性結合至tau聚集物。
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