CN110546155A - 肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种合成大量的肽的新型的多肽固相合成法。本发明的目的在于提供一种合成纯度高的长链肽的新型的多肽固相合成法。本发明的目的在于提供一种副反应少的新型的多肽固相合成法。本发明涉及一种肽的制备方法，其特征在于，在无叶片离心式搅拌体的搅拌下固相合成肽。

Description

肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种肽的制备方法。更详细而言，本发明涉及一种基于固相合成法的长链肽的大量合成方法。
背景技术
作为在长链肽的固相合成法中通常使用的搅拌手段，已知有振荡搅拌、氮气鼓泡搅拌、搅拌器搅拌等。
另一方面，离心式搅拌体为公知(专利文献1～4等)，虽然有将其作为脂质体的制备装置的部件而进行应用的例子(专利文献5)，但迄今为止，还没有将离心式搅拌体作为有机合成领域中的多肽固相合成装置的部件而进行应用的例子的报告。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2010/150656号册
专利文献2：日本特开2014-124540号公报
专利文献3：日本特开2015-171695号公报
专利文献4：日本特开2015-47540号公报
专利文献5：日本特开2016-117005号公报
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供合成大量的肽的新型的多肽固相合成法、合成纯度高的长链肽的新型的多肽固相合成法以及副反应少的新型的多肽固相合成法中的任意一种以上的固相合成法。
解决技术问题的技术手段
本申请的发明人为了解决上述技术问题，进行了仔细研究，结果发现，通过将离心式搅拌体应用于多肽固相合成法中，能够大量合成纯度高的长链肽，根据该见解进一步推进研究，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下的发明。
[1]一种肽的制备方法，其特征在于，在无叶片离心式搅拌体的搅拌下固相合成肽。
[2]根据所述[1]所述的制备方法，其中，所述无叶片离心式搅拌体为搅拌用旋转体，其特征在于，其具备：
在中心旋转旋转轴的主体、
设置在所述主体表面的吸入口、
设置在所述主体表面的吐出口、
连接所述吸入口与所述吐出口的流动通道，
与所述吐出口相比，所述吸入口配置在更靠近所述旋转轴的位置，
与所述吸入口相比，所述吐出口配置在从所述旋转轴起的离心方向的外侧的位置。
[3]一种无叶片离心式搅拌体在基于固相法的肽合成中的应用。
[4]一种多肽固相合成用反应容器，其中，装载有无叶片离心式搅拌体。
[5]根据所述[4]所述的多肽固相合成用反应容器，其具备玻璃过滤器。
发明效果
本发明能够提供合成大量的肽的新型的多肽固相合成法、合成纯度高的长链肽的新型的多肽固相合成法、及副反应(例如，在树脂的切割反应中，片段肽在最终偶联反应前的不优选的侧链脱保护反应等)少的新型的多肽固相合成法中的任意一种以上的固相合成法。
另外，在固相合成法的反应中，包含偶联反应前的保护基引入反应、肽的参与偶联反应的羧基或氨基在偶联反应前的活化反应、偶联反应、树脂的切割反应、偶联反应及树脂的切割反应后的脱保护反应等反应。
附图说明
图1为装载有无叶片离心式搅拌体的容器的构成例。
图2的(a)为本发明的实施方式的搅拌用旋转体的俯视图；图2的(b)为搅拌用旋转体的主视图(引用日本专利第4418019号公报的图1)。
图3的(a)为表示搅拌用旋转体运作的俯视图；图3的(b)为表示搅拌用旋转体运作的主视图(引用日本专利第4418019号公报的图2)。
图4为表示搅拌机主体的一个形态的透视图(引用日本特开2014-124540号公报的图2，一部分存在变更)。
图5为表示搅拌机主体的一个形态的透视图(引用日本特开2014-124540号公报的图4，一部分存在变更)。
图6为表示搅拌机主体的一个形态的透视图(引用日本特开2014-124540号公报的图6，一部分存在变更)。
图7为表示搅拌装置的一个形态的主视图(侧视图)(引用日本特开2015-171695号公报的图1，一部分存在变更)。
图8示出比较例1的产物的HPLC色谱图。
图9示出比较例2的产物的HPLC色谱图。
图10示出实验例3的产物的HPLC色谱图。
图11示出实验例5的产物的乙腈溶液的HPLC色谱图。
图12示出比较例3的产物的HPLC色谱图。
图13示出实验例6(在第5个残基的偶联工序以后使用了M-Revo的合成品)的产物的HPLC色谱图。
图14示出实验例6(振荡机合成品)的产物的HPLC色谱图。
图15示出实验例7的产物的HPLC色谱图。
图16示出实验例8的产物的HPLC色谱图。
图17示出比较例4的产物的HPLC色谱图。
图18示出比较例5的产物的HPLC色谱图。
图19示出实验例9的产物的HPLC色谱图。
图20示出比较例6的产物的HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明提供一种肽的制备方法，其特征在于，在无叶片离心式搅拌体的搅拌下，固相合成肽。
无叶片离心式搅拌体
无叶片离心式搅拌体是指，例如在外观上搅拌体本身无叶片，具有利用离心力搅拌流体的功能的搅拌体。另外，流体优选含有树脂或目标肽构成氨基酸或这些物质的组合。无叶片离心式搅拌体的结构例如可以为靠近旋转轴的吸入口与远离旋转轴的吐出口连接而形成流道的旋转体。搅拌的原理可以为例如通过搅拌体的旋转，离心力作用在流道内，流体横向吐出，纵流道变成负压，在下方产生负压吸引流。
将装载有无叶片离心式搅拌体的容器的构成例示于图1。若使无叶片离心式搅拌体旋转，则在吐出口(a)产生离心力，由(a)横向吐出流体。伴随于此，在吸入口(b)产生吸力，产生龙卷风状的涡流(c)。纵流道变成负压，在下方产生负压吸引流，产生“推拉”流。脉动(pulse)由无叶片离心式搅拌体传递至搅拌流，遍及搅拌流整体。
作为无叶片离心式搅拌体，可使用MEDEC Co.,Ltd制造的M-Revo(注册商标)、E-REVO等。
作为无叶片离心式搅拌体，例如可使用WO2010/150656号册、日本专利第4418019号公报、日本特开2014-124540号公报等中记载的搅拌体。
即，无叶片离心式搅拌体可以为：
(1)一种搅拌用旋转体(例如参考图2及3)，其特征在于，其具备：
在中心旋转旋转轴的主体、
设置在所述主体的表面的吸入口、
设置在所述主体的表面的吐出口、
连接所述吸入口与所述吐出口的流动通道，
与所述吐出口相比，所述吸入口配置在更靠近所述旋转轴的位置，
与所述吸入口相比，所述吐出口配置在从所述旋转轴起的离心方向的外侧的位置；
(2)一种搅拌用旋转体(例如参考图2及3)，其特征在于，其具备：
垂直于旋转轴方向的截面被构成为圆形的主体、
设置在所述主体的表面的吸入口、
设置在所述主体的表面的吐出口、
连接所述吸入口与所述吐出口的流动通道，
与所述吐出口相比，所述吸入口配置在更靠近所述旋转轴的位置，
与所述吸入口相比，所述吐出口配置在从所述旋转轴起的半径方向的外侧的位置；或
(3)一种搅拌机主体，其通过固定在顶板上的旋转驱动轴，使作为被上述顶板堵塞上端的圆筒壳体的圆筒旋转构件，以该圆筒壳体的中心轴为中心进行旋转，其特征在于，
上述圆筒旋转构件具有：
贯穿设置在上述圆筒壳体的外周表面上的多个放出开口、
以向内方突出的方式设置在上述圆筒壳体的内周表面上的多个挤出突板部、
设置在上述圆筒壳体的下端的吸入开口，
上述圆筒旋转构件在旋转时，通过上述挤出突板部，引发使存在于内部的搅拌液在上述中心轴的周围循环的内部循环流，通过离心力将形成该内部循环流的上述搅拌液的一部分作为外部放出流，从上述放出开口放出至外部，同时，外部的搅拌液作为吸入流而从上述吸入开口进入至内部(例如参考图4～6)。
搅拌条件
作为搅拌装置，可使用装载有上述搅拌体的容器等。“装载”是指作为装置的一部分而安装。
此外，作为搅拌装置，可使用一种搅拌装置(例如参考图7)，其特征在于，其具备相互邻接而配置的搅拌用旋转体及阻流器，
所述搅拌用旋转体具备：
在中心旋转旋转轴的主体；
设置在所述主体的表面的吸入口；
设置在所述主体的表面且与所述吸入口相比，设置在从所述旋转轴起的离心方向的外侧的位置的吐出口；
连接所述吸入口与所述吐出口的流动通道，
所述阻流器具备：
在中心旋转阻流器旋转轴的阻流器主体；
设置在所述阻流器主体的表面的阻流器吸入口；
设置在所述阻流器主体的表面且比起所述阻流器吸入口，设置在从所述阻流器旋转轴起的离心方向的外侧的位置的阻流器吐出口；
连接所述阻流器吸入口与所述阻流器吐出口的阻流器流动通道，
所述阻流器主体以与所述搅拌用旋转体的所述主体不同的形状或不同的大小构成，或以与所述搅拌用旋转体的所述主体不同的姿势配置(参考日本特开2015-171695号公报)。
上述搅拌装置作为多肽固相合成用反应容器是有用的。
此外，多肽固相合成用反应容器优选装载了圆柱状的容器及无叶片离心式搅拌体(例如参考图1)。圆柱状的容器的底面及侧面可以由塑料或玻璃形成。圆柱状的容器在上部可以具有、也可以不具有塑料或玻璃制的盖子。只要能够在该容器内进行多肽固相合成，则可将无叶片离心式搅拌体配置在圆柱状的容器的任意位置，优选配置在圆柱状的容器的中央下部。可从圆柱状的容器的上部加入反应物、反应液和/或洗涤液。
此外，多肽固相合成用反应容器优选在圆柱状的容器的外侧进一步装载热介质夹套(罩壳)、热介质吸入口及热介质吐出口(例如，参考图1)。例如，可从热介质吸入口向热介质夹套中加入约5～80℃左右的循环水，并通过循环水夹套通路，从热介质吐出口排出该循环水。
多肽固相合成用反应容器优选进一步装载了玻璃过滤器。玻璃过滤器例如可以为坩埚型，也可以为布氏漏斗型，还可以为板状，例如可通过购入市售品而获得。玻璃过滤器的板径没有特别限定，可进行适当变更。玻璃过滤器的细孔的大小只要为比用于固相合成的树脂(固相载体)小，能够以在过滤器上保持树脂的状态过滤液体的大小即可。玻璃过滤器优选配置在比多肽固相合成用反应容器的底面靠上和/或比无叶片离心式搅拌体靠下的位置(例如参考图1)。通过装载玻璃过滤器，能够简便且迅速地实施树脂与反应液或洗涤液等液体的分离操作，提高多肽固相合成的操作效率。
多肽固相合成用反应容器优选装载了旋塞(栓塞)，例如可通过购入市售品而获得。旋塞(栓塞)优选配置在多肽固相合成用反应容器的底面及玻璃过滤器的下侧(例如参考图1)。通过装载旋塞(栓塞)，能够随时使多肽固相合成用反应容器内部的液体以所期望的量流出，因此能够更简便地实施树脂与反应液或洗涤液等液体的分离操作。
多肽固相合成用反应容器进一步优选装载了玻璃过滤器及旋塞(栓塞)。
离心式搅拌体的转子的尺寸及离心力没有特别限定，可适当进行变更。
离心式搅拌体优选在圆周部具有多个(例如，2～10个)吐出口。作为转子的搅拌能力的指标的吐出量系数(吐出口的开口面积合计×圆周长)优选为60cm3～6000cm3，更优选为200cm3～2000cm3。
肽
肽例如可以为氨基酸残基数为5～150的肽，可以为氨基酸残基数为5～34的肽，可以为氨基酸残基数为15～100的肽，可以为氨基酸残基数为10～80的肽，可以为氨基酸残基数为15～80的肽，可以为氨基酸残基数为10～60的肽，也可以为氨基酸残基数为15～60的肽。
肽例如可以为阿巴瑞克(Abarelix)、胰岛素(Insulin)及其类似物、内皮素(Endothelin)、β-内啡肽(β-Endorphin)、催产素(Oxytocin)、降钙素(Calcitonin)、卡培立肽(Carperitide)、胰高血糖素(Glucagon)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、胃饥饿素(Ghrelin)、戈舍瑞林(Goserelin)、缩胆囊素(Cholecystokinin)、西那普肽(Sinapultide)、心房钠尿肽(ANP)、促胰液素(Secretin)、西曲瑞克(Cetrorelix)、生长抑素(Somatostatin)、地加瑞克(Degarelix)、去氨加压素(Desmopressin)、替度鲁肽(Teduglutide)、特立帕肽(Teriparatide)、脑钠肽(BNP)、血管升压素(Vasopressin)、甲状旁腺激素(Parathormone)、缓激肽(Bradykinin)、培奈萨肽(Peginesatide)、兰乐肽(Lanreotide)、β-促脂解素(β-Lipotropin)、γ-促脂解素(γ-Lipotropin)、亮丙瑞林(Leuprorelin)、利那洛肽(Linaclotide)、或利拉鲁肽(Liraglutide)等肽或其盐等。盐只要为药学中允许的盐即可，没有特别限定。例如可列举出药学中允许的酸加成盐、金属盐、铵盐、有机胺加成盐等。作为酸加成盐，可列举出盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；草酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、抗坏血酸盐、对甲苯磺酸等有机酸盐。作为金属盐，可列举出钠盐、钾盐等碱金属盐；镁盐、钙盐等碱土类金属盐；铝盐、锌盐等。作为铵盐，可列举出铵、四甲基氢氧化铵等盐。作为有机胺加成盐，可列举出哌啶等加成盐。其中，优选酸加成盐、有机酸盐等，更优选乙酸盐。
固相合成法
固相合成法的工艺条件由于在以往已被充分确立，因此除了使用无叶片离心式搅拌体作为搅拌体以外没有特别限制，可采用公知方法(例如，Merrifield固相合成法等)。固相合成法中的反应包含偶联反应前的保护基引入反应、肽的参与偶联反应的羧基或氨基在偶联反应前的活化反应、偶联反应、树脂的切割反应、偶联反应及树脂的切割反应后的脱保护反应等反应。在脱Fmoc基团(9-芴甲氧羰酰基)反应中可使用DMF/20％哌啶。脱Boc基团(叔丁氧羰基)反应中可使用三氟乙酸。此外，可通过茚三酮(Kaiser)检测等方法，利用茚三酮反应确认有无未反应的氨基。
关于固相合成法的例子，请参考实施例项。
效果
根据本发明的肽的制备方法，例如能够合成大量的肽。能够合成的肽的量优选多于以未使用无叶片离心式搅拌体的肽的制备方法合成的肽的量，例如，可以为1g以上，可以为10g以上，可以为100g以上，可以为200g以上，还可以为300g以上。
使用本发明的肽的制备方法合成的肽的纯度优选高于以未使用无叶片离心式搅拌体的肽的制备方法合成的肽的纯度。优选HPLC纯度例如为60％以上、70％以上、80％以上或90％以上等。
使用本发明的肽的制备方法合成的肽中的脱三苯甲基体等副反应产物优选少于以未使用无叶片离心式搅拌体的肽的制备方法合成的肽中的脱三苯甲基体等副反应产物。脱三苯甲基体的含有率例如优选为5％以下、3％以下或1％以下。
只要起到本发明的效果，那么本发明在本发明的技术范围内包括上述构成的各种组合形态。
实施例
以下，列举实施例对本发明进行进一步具体的说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定，在本发明的技术构思内，本领域技术人员可进行多种变形。
在实施例中，在以下的HPLC条件下进行测定。
色谱柱：Waters XBridge Shield18 3.5μm 4.6×150mm
移动相A：0.1％TFA水溶液
移动相B：0.08％TFA乙腈溶液
流速：1mL/min
检测器：UV 220nm
[表1]
梯度洗脱A
[表2]
梯度洗脱B
[表3]
梯度洗脱C
[表4]
梯度洗脱D
在本公开中，pseudo-pro表示伪脯氨酸，Trt表示三苯甲基，HOBt表示1-羟基-1H-苯并三唑一水合物，DMF表示N,N-二甲基甲酰胺，DIC表示二异丙基碳二亚胺，DIEA表示二异丙基乙胺，Oxyma表示氰基(羟基亚胺基)乙酸乙酯(ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate)，TFA表示三氟乙酸，TI表示三(异丙基)硅烷，EDT表示乙烷二硫醇，Cleavage mixture表示乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷(体积比10/10/80)，IPE表示异丙醚，TFE表示2,2,2-三氟乙醇。
34残基肽的固相合成
[实验例1]A-片段-树脂(Boc-Ser(tBu)-Val-Ser(pseudo-pro)-Glu(tBu)-Il e-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂)(侧链保护型AFR-树脂)的合成(使用M-Revo(注册商标))
1.偶联反应
(1)向反应容器中添加H-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂(80.00g)、Fmoc(9-芴甲氧羰酰基)-氨基酸(2.5eq.)、活化剂HOBt(22.42g,2.5eq.)、反应溶剂DMF(800mL)、DIC(25.70mL)。
(2)使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌2小时以上。
(3)去除反应溶剂，使用M-Revo(注册商标)，用DMF(800mL)、二氯甲烷(800mL)、DMF(800mL)洗涤导入了Fmoc-氨基酸的树脂。
(4)少量取样导入了Fmoc-氨基酸的树脂，使用茚三酮检测，确认到树脂未显色。若树脂珠粒通过茚三酮检测发生显色时，重复操作(1)～(3)直至不显色。
2.Fmoc基团的脱保护
(5)向得到的导入了Fmoc-氨基酸的树脂中添加20％哌啶/DMF(800m L)。
(6)使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌20分钟以上。
(7)去除反应溶剂，使用M-Revo(注册商标)(DMF 800mL)，用二氯甲烷(800mL)、DMF(800mL)洗涤。
(8)通过茚三酮检测确认到树脂珠粒显色。
(9)实施操作(1)～(8)，直至得到以下的侧链保护型AFR-树脂(230g)。其中，导入丝氨酸(伪脯氨酸)残基作为用Fmoc基团保护N末端的二肽的Fmoc-缬氨酸-丝氨酸(伪脯氨酸)。
[化学式1]
[实验例2]B-片段-树脂(H-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂)(侧链保护型BFR-树脂)的合成(使用M-Revo(注册商标))
1.向树脂导入Fmoc-氨基酸
(1)在氩气气氛下向反应容器中添加Cl-Trt(2-Cl)-树脂(40.00g)、Fmoc-Phe-OH(56.17g)。
(2)添加二氯乙烷(400mL)及DIEA(25.25mL)。
(3)使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌3小时以上。
(4)去除反应溶剂，以可整体搅拌的容量份添加DIEA(5.05mL)、甲醇(40mL)及二氯乙烷。
(5)在氩气气氛下使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌1小时。
(6)去除反应溶剂，使用M-Revo(注册商标)，用DMF(400mL)、二氯甲烷(400mL)、DMF(400mL)洗涤。
(7)少量取样Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂，通过茚三酮检测确认到树脂珠粒未显色。
2.Fmoc基团的脱保护
(8)向得到的Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中添加20％哌啶/DMF(400mL)。
(9)使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌20分钟以上。
(10)去除反应溶剂，使用M-Revo(注册商标)，用DMF(400mL)、二氯甲烷(400mL)、DMF(400mL)洗涤。
(11)通过茚三酮检测确认到树脂珠粒显色。
(12)得到H-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
3.偶联反应
(13)向反应容器中添加在(12)中得到的H-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂、Fmoc-氨基酸(2.5eq.)、HOBt(19.59g,2.5eq.)、DMF(10～20v/w)、DIC(22.45mL,2.5eq.)。
(14)使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌2小时以上。
(15)去除反应溶剂，使用M-Revo(注册商标)，用DMF、二氯甲烷、DMF洗涤导入了Fmoc-氨基酸的树脂。
(16)少量取样导入了Fmoc-氨基酸的树脂，通过茚三酮检测确认到树脂珠粒未显色。若树脂珠粒通过茚三酮检测发生显色时，重复操作(13)～(15)直至不显色。
4.Fmoc基团的脱保护
(17)向得到的导入了Fmoc-氨基酸的树脂中添加20％哌啶/DMF(400mL)。
(18)使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌20分钟以上。
(19)去除反应溶剂，使用M-Revo(注册商标)，用DMF(400mL)、二氯甲烷(400mL)、DMF(400mL)洗涤。
(20)通过茚三酮检测确认到树脂珠粒显色。
(21)实施操作(13)～(20)直至得到以下的侧链保护型BFR-树脂(310g)。
[化学式2]
[实验例3]从侧链保护型BFR-树脂中切取保护肽(使用M-Revo(注册商标))
(1)向添加有侧链保护型BFR-树脂(80g)的容器中添加经过脱气的Cleavagemixture(800mL)。
(2)使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌2小时。
(3)过滤反应溶液，用Cleavage mixture(80mL)洗涤3次，进一步用二氯甲烷(160mL)洗涤。
(4)以外温25℃对过滤液进行减压浓缩。
(5)向浓缩残留物中添加二氯甲烷(160mL)，溶解结晶。
(6)向反应容器中添加IPE(4000mL)，滴加(5)的溶解液。
(7)在室温下搅拌1小时后，对结晶进行减压过滤，使用IPE(800mL)，进行洗涤。
(8)在室温下进行真空干燥，得到侧链保护型B-片段(67.95g)。
[化学式3]
[比较例1及2]
除了使用搅拌器代替M-Revo(注册商标)以外，以与实验例3相同的固相合成法得到侧链保护型B-片段。
[HPLC分析(比较例1及2以及实验例3)]
将比较例1及2以及实验例3的产物的乙腈溶液的HPLC分析结果示于表5～7及图8～10。表5、6及7分别表示在比较例1、比较例2及实验例3的产物的乙腈溶液的HPLC分析中，各产物(脱三苯甲基体副产物或B-片段)的保留时间及含有率。图8、9及10分别示出了比较例1、比较例2及实验例3的产物的乙腈溶液的HPLC色谱图(梯度洗脱A)。
[表5]
[表6]
[表7]
将实验例3以及比较例1及2的结果总结于表8。
[表8]
根据以上的结果可知，实验例3的B-片段的HPLC纯度为69.2％，与比较例1及2的该HPLC纯度相同，与此相对，作为副产物生成的脱三苯甲基体的含有率为4.79％，为比较例1及2的该含有率的二分之一以下。即，与使用搅拌器的固相合成法相比，通过使用M-Revo(注册商标)的固相合成法，可得到高纯度的B-片段，即不优选的脱三苯甲基体少的B-片段。
[实验例4]34残基肽的制备
通过与实验例3相同的方法对实验例1中得到的侧链保护型AFR-树脂进行处理，从树脂中切取侧链保护型A-片段，活化其C末端羧基后，使其与侧链保护型B-片段反应，合成34残基肽的侧链保护体，对该侧链保护基进行脱保护，得到目标肽。
[实验例5]侧链保护型A-片段-树脂(Boc-Ser(tBu)-Val-Ser(pseudo-pro)-Glu(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂)(侧链保护型AFR-树脂)的合成(使用M-Revo(注册商标))
1.在树脂中导入Fmoc-氨基酸
(1)在茄形瓶中加入Fmoc-Leu-OH(2.5eq.)、DMF、HOBt(2.5eq.)、DIC(2.5eq.)，搅拌30分钟。在加入了H-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂(80.00g)的反应容器中添加茄形瓶中的反应液，使用M-Revo(注册商标)，搅拌2小时以上。去除反应溶剂，用DMF、二氯甲烷、DMF洗涤树脂，得到Fmoc-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂。
2.Fmoc基团的脱保护
(2)向Fmoc-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液(10v/w)。使用M-Revo搅拌20分钟后，去除反应溶剂。使用DMF(10v/w×5次)、二氯甲烷(10v/w×5次)、DMF(10v/w×5次)进行洗涤，得到H-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂。
3.偶联反应
(3)以可搅拌的容量份(约10v/w)向H-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(2.5eq.)、HOBt(2.5eq.)、DIC(2.5eq.)、DMF。使用M-Revo(注册商标)搅拌2小时以上后，去除反应溶剂。用DMF、二氯甲烷、DMF进行洗涤，得到Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂。
(4)向Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液(10v/w)。使用M-Revo(注册商标)搅拌20分钟后，去除反应溶剂。用DMF、二氯甲烷、DMF进行洗涤，得到H-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂。
(5)然后，对于各个Fmoc-氨基酸的导入与Fmoc基团的脱保护，重复(1)与(2)的操作。另外，在导入Fmoc-Met-OH后，在搅拌开始前实施10分钟以上的氩气鼓泡。
(6)以与(2)相同的方法在第12个残基上偶联Boc-Ser(tBu)-OH(2.5eq.)之后，去除反应溶剂。用MeOH洗涤，进行减压干燥，得到侧链保护型AFR-树脂(144.12g)。
4.从树脂中切取保护肽与纯度测定
(7)向在(6)的操作中得到的侧链保护型AFR-树脂(取用一部分，约20～50mg)中加入乙酸/二氯甲烷(体积比乙酸/二氯甲烷＝1/9)，搅拌1～2小时。在使用乙腈稀释反应液后，进行HPLC分析。
其结果可知，作为目标产物的A-片段的纯度为94.1％(tR＝27.4)，与此相对，作为副产物产生的脱三苯甲基体的含有率为0.55％(tR＝21.5)(参照图11及表9，梯度洗脱B)。
[表9]
[比较例3]侧链保护型A-片段-树脂(Boc-Ser(tBu)-Val-Ser(pseudo-pr o)-Glu(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂)(侧链保护型AFR-树脂)的制备(使用全自动微波多肽合成装置(Biotage Japan制造，Initiator+Alstra))
1.向树脂中导入Fmoc-氨基酸
(1)向反应容器中加入H-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂(122mg)、DMF(4.5mL)，使其溶胀20分钟。过滤后，加入Fmoc-Leu-OH 0.5M DMF溶液(0.8mL,0.4mmol,4eq.)、DIC 0.5M DMF溶液(0.8mL)、HOBt 0.2M DMF溶液(2.0mL)。在75℃下微波(MW)照射5分钟，使其进行反应后，去除反应溶剂。用DMF(18mL)进行洗涤，得到Fmoc-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂。
2.Fmoc基团的脱保护
(2)向Fmoc-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液(4.5mL)。搅拌3分钟后，去除反应溶剂，加入20％哌啶/DMF溶液(4.5mL)。搅拌10分钟后，去除反应溶剂。用DMF(18mL)进行洗涤，得到H-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂。
3.偶联反应
(3)向H-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.5M DMF溶液(0.8mL)、DIC 0.5M DMF溶液(0.8mL)、HOBt 0.2M DMF溶液(2.0mL)。在75℃下MW照射5分钟，使其进行反应后，去除反应溶剂。用DMF(18mL)进行洗涤，得到Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-树脂。
(4)然后，同样通过(2)及(3)的方法重复脱保护与Fmoc氨基酸的偶联(Fmoc-His(Trt)-OH的偶联以50℃反应10分钟)。以与(1)相同的方法偶联最后的第12个残基的Boc-Ser(tBu)-OH(4.0eq.)后，去除反应溶剂，用MeOH(13.5mL)洗涤，进行减压干燥，得到侧链保护型AFR-树脂(350mg)。
4.从树脂中切取保护肽与纯度测定
(5)向侧链保护型AFR-树脂(取用一部分，约20～50mg)加入乙酸/TFE/二氯甲烷(体积比乙酸/TFE/二氯甲烷＝1/1/9)，搅拌2小时。使用乙腈稀释反应液后，进行HPLC分析。其结果可知，作为目标产物的A-片段的纯度为66.1％(tR＝27.9)，与此相对，作为副产物产生的脱三苯甲基体的含有率为7.5％(tR＝22.1)(参考图12及表10，梯度洗脱B)。
[表10]
[实验例6]15残基肽-树脂(H-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂)的合成(到导入第1-4个残基为止，使用振荡机(TOKYO RIKAKIKAI CO,LTD.制造的高速振荡机(Cute Mixier)CM-1000型或AS ONE Corporation.制造的高速振荡机ASCM-1)进行搅拌操作。然后，从导入第5个残基开始，将肽中间体树脂二等分，其中的一半量通过使用M-Revo(注册商标)的搅拌操作进行合成，并且另一半量通过使用振荡机的搅拌操作进行合成)
1.向树脂中导入Fmoc-氨基酸
(1)在氩气气氛下，向反应容器中加入Cl-Trt(2-Cl)-树脂(4.00g)、Fmoc-Phe-OH(6.32g)、DIEA(2.79mL)、二氯乙烷(28.0mL)。在室温下搅拌3.5小时后，用二氯乙烷(28.0mL)洗涤5次。
(2)在经过洗涤的树脂中加入MeOH(4.00mL)、DIEA(0.8mL)、二氯乙烷(28.0mL)。搅拌20分钟后，去除反应溶剂。使用DMF、二氯甲烷、DMF进行洗涤。得到Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
2.Fmoc基团的脱保护
(3)向Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液(40.0mL,10v/w)，搅拌20分钟后，去除反应溶剂。用DMF(28.0mL,7v/w×5次)、二氯甲烷(28.0mL,7v/w×5次)、DMF(28.0mL,7v/w×5次)进行洗涤，得到H-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
3.偶联反应
(4)向烧瓶中加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(9.73g,16.3mmol)、HOBt(2.20g)、DIC(2.52mL)、DMF(40.0mL)，搅拌30分钟后，向H-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入该溶液，使用DMF清洗烧瓶内部，将总量搅拌2小时后，去除反应溶剂。
(5)使用DMF洗涤树脂，得到Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
4.Fmoc基团的脱保护
(6)向Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液(40.0mL)，搅拌20分钟后，去除反应溶剂。用DMF、二氯甲烷、DMF进行洗涤，得到H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
5.偶联反应
(7)向H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入Fmoc-His(Trt)-OH(1.01g)、HOBt(2.20g)、DIC(2.52mL)及DMF(可进行搅拌的容量份)搅拌2小时以上后，去除反应溶剂。
(8)使用DMF、二氯甲烷、DMF洗涤树脂，得到Fmoc-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
(9)然后，通过与(4)及(5)相同的方法，重复脱保护与偶联。
(10)在偶联第15个残基的Fmoc-Arg(Pbf)-OH后，通过与(3)相同的方法对Fmoc基团进行脱保护，然后使用二氯甲烷、MeOH洗涤树脂，进行减压干燥，得到15残基肽-树脂(10.7g)。
6.从树脂中切取保护肽与纯度测定
(11)取用15残基肽-树脂(约20～50mg)的一部分，向其中加入乙酸/二氯甲烷(体积比乙酸/二氯甲烷＝1/1)，搅拌1～2小时。使用乙腈稀释反应液后，进行HPLC分析。将在工序的一部分(第5个残基的偶联工序之后)中使用了M-Revo(注册商标)的合成品的结果示于表11及图13(梯度洗脱A)，将振荡机合成品的结果示于表12及图14(梯度洗脱A)。由该结果可知，前者表现出的HPLC纯度比后者优异(HPLC纯度：在第5个残基的偶联工序之后使用了M-Revo(注册商标)的合成品为93.1％，振荡机合成品为89.4％)。
[表11]
[表12]
[实验例7]16残基肽-树脂(H-Glu(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂)的合成(使用全自动微波多肽合成装置(Biotage Japan制造的Initiator+Alstra))
1.向树脂中导入Fmoc-氨基酸
(1)向反应容器中加入H-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂(179mg)、DMF(4.5mL)，使其溶胀20分钟。去除DMF后，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.5M DMF溶液(0.8mL)、DIC 0.2M DMF溶液(2.0mL)、Oxyma 0.5M DMF溶液(0.8mL)。以75℃微波(MW)照射5分钟，使其进行反应后，去除反应溶剂。使用DMF(18mL)进行洗涤，得到Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
2.Fmoc基团的脱保护
(2)向Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液(4.5mL)。搅拌3分钟后，去除反应溶剂，加入20％哌啶/DMF溶液(4.5mL)。搅拌10分钟后，去除反应溶剂，使用DMF(18mL)进行洗涤，得到H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
3.偶联反应
(3)向H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入Fmoc-His(Trt)-OH 0.5M DMF溶液(0.8mL)、DIC 0.5M DMF溶液(0.8mL)、Oxyma 0.2M DMF溶液(2.0mL)。
(4)以50℃MW照射10分钟，使其进行反应后，去除反应溶剂。使用DMF(4.5mL×4次)洗涤树脂，得到Fmoc-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
(5)然后，通过与(2)～(4)相同的操作重复脱保护与Fmoc氨基酸的偶联(除了Fmoc-His(Trt)-OH以外的偶联以75℃MW照射5分钟来进行反应)。
(6)偶联第16个残基的Fmoc-Glu(tBu)-OH，接着对Fmoc基团进行脱保护后，使用二氯甲烷、MeOH洗涤树脂，进行减压干燥，得到16残基肽-树脂。
4.从树脂中切取脱保护肽与纯度测定
(7)在16残基肽-树脂(取用一部分，约20mg)中加入TFA/TIS/H2O/EDT(体积比TFA/TIS/H2O/EDT＝92.5/2.5/2.5/2.5)(2mL)，搅拌2小时。进行过滤，蒸馏去除TFA后，加入乙酸乙酯与水，进行分液。分离水层后，加入乙酸乙酯进行洗涤(2次)。使用纯水稀释水层后，进行HPLC分析(HPLC纯度为63.4％)(参考图15及表13，梯度洗脱C)。
[表13]
[实验例8]B-片段-树脂(H-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂)(侧链保护型BFR-树脂)的合成(使用M-Revo(注册商标))
1.向树脂中导入Fmoc-氨基酸
(1)在氩气气氛下，向反应容器中加入Cl-Trt(2-Cl)-树脂(10.0g)、Fmoc-Phe-OH(15.0g)、DIEA(6.75mL)、二氯乙烷(100mL)。使用M-Revo(注册商标)搅拌3小时以上后，去除反应溶剂。加入DIEA(1.35mL)、MeOH(10mL)、二氯甲烷(70.0mL)，在氩气气氛下，使用M-Revo(注册商标)搅拌20分钟。使用DMF、二氯甲烷、DMF进行洗涤，得到Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
2.Fmoc基团的脱保护
(2)向Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入可进行搅拌的容量份(约10v/w)的20％哌啶/DMF溶液。使用M-Revo(注册商标)搅拌20分钟后，去除反应溶剂。使用DMF、二氯甲烷、DMF进行洗涤，得到H-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
3.偶联反应
(3)向烧瓶中加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(23.1g)、HOBt(5.24g)、DIC(6.00mL)、DMF(70.0mL)，使用M-Revo(注册商标)，搅拌30分钟以上。
(4)向H-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入(3)的溶液，使用M-Revo(注册商标)，搅拌2小时以上。
(5)去除反应溶剂，使用DMF、二氯甲烷、DMF洗涤树脂，得到Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
(6)然后，通过与(2)～(5)相同的方法重复脱保护与偶联。对第10个残基(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)、第15个残基(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)、第17个残基(Fmoc-Met-OH)、第21个残基(Fmoc-His(Trt)-OH)、第22个残基(Fmoc-Lys(Boc)-OH)实施双偶联。此外，对第16个残基(Fmoc-Glu(tBu)-OH)进行三重偶联(triple coupling)，对第19个残基(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)进行4次偶联。
(7)在偶联第22个残基的Fmoc-Lys(Boc)-OH后，通过与(2)相同的方法对Fmoc基团进行脱保护，然后使用二氯甲烷、MeOH洗涤树脂，进行减压干燥，得到侧链保护型BFR-树脂(78.48g)。
4.从树脂中切取保护肽与纯度测定
(8)向侧链保护型BFR-树脂(取用一部分，约20mg)中加入乙酸/二氯甲烷(体积比乙酸/二氯甲烷＝1/9)，搅拌2小时。使用纯水/乙腈稀释反应液后，进行HPLC分析(HPLC纯度为92.0％)(参考图16及表14，梯度洗脱D)。
[表14]
[比较例4]B-片段-树脂(H-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂)(侧链保护型BFR-树脂)的合成(使用振荡机)
1.向树脂中导入Fmoc-氨基酸
(1)在氩气气氛下，向反应容器中加入Cl-Trt(2-Cl)-树脂(2.00g)、Fmoc-Phe-OH(2.5eq.)、DIEA(2.5eq.)、二氯乙烷(约10v/w)。使用振荡机搅拌3小时以上后，去除反应溶剂。加入DIEA(0.5eq.)、MeOH(2.0mL)、二氯甲烷(20mL)，使用振荡机搅拌20分钟。使用DMF(20mL)进行洗涤，得到Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
2.Fmoc基团的脱保护
(2)向Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液(14mL)。使用振荡机搅拌20分钟后，去除反应溶剂。使用DMF、二氯甲烷、DMF进行洗涤，得到H-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
3.偶联反应
(3)向烧瓶中加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(2.5eq.)、HOBt(2.5eq.)、DIC(2.5eq.)、DMF(18.0mL)，使用振荡机搅拌30分钟以上。
(4)向H-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入(3)的溶液，使用振荡机搅拌2小时以上，去除反应溶剂。使用DMF(20.0mL)洗涤树脂，得到Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
(5)然后，通过与(2)～(4)相同的操作重复脱保护与Fmoc-氨基酸的偶联。
(6)在偶联第22个残基的Fmoc-Lys(Boc)-OH后，通过与(2)相同的方法对Fmoc基团进行脱保护，然后使用MeOH(20mL)洗涤树脂，进行减压干燥，得到侧链保护型BFR-树脂(12.18g)。
4.从树脂中切取保护肽与纯度测定
(7)向侧链保护型BFR-树脂(7.59g)中添加经过脱气的Cleavage mixture(76mL)，在氩气气氛下使用振荡机搅拌2小时。
(8)进一步使用Cleavage mixture(38mL)、二氯甲烷(76mL)洗涤树脂。
(9)向反应液中添加己烷(760mL)，进行减压浓缩后，添加二氯甲烷(15mL)，溶解结晶。向该溶液中添加IPE(380mL)，使结晶析出后，通过加压过滤滤取结晶。
(10)在对结晶进行减压干燥后，使用纯水/乙腈溶解得到的侧链保护型B-片段的结晶，然后利用HPLC进行测定(HPLC纯度为63.8％)。其结果可知，作为目标产物的B-片段的纯度为63.8％(tR＝28.4)，与此相对，作为副产物产生的脱三苯甲基体的含有率为9.2％(tR＝24.2)(参考图17及表15，梯度洗脱A)。
[表15]
[比较例5]B-片段-树脂(H-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂)(侧链保护型BFR-树脂)的合成(使用全自动微波多肽合成装置(Biotage Japan制造的Initiator+Alstra))
1.向树脂中导入Fmoc-氨基酸
(1)向反应容器中加入H-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂(118mg)及DMF(4.5mL)，使其溶胀20分钟。去除DMF后，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.5M DMF溶液(0.8mL)、DIC 0.5M DMF溶液(0.8mL)、HOBt 0.2M DMF溶液(2.0mL)，以75℃微波(MW)照射5分钟，使其反应后，去除反应溶剂。使用DMF(18mL)洗涤树脂，得到Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
2.Fmoc基团的脱保护
(2)向Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液(4.5mL)，搅拌3分钟后，去除反应溶剂。进一步加入20％哌啶/DMF溶液(4.5mL)，搅拌10分钟后，去除反应溶剂。使用DMF(18mL)洗涤树脂，得到H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
3.偶联反应
(3)向H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂中加入Fmoc-His(Trt)-OH 0.5M DMF溶液(0.8mL)、DIC 0.5M DMF溶液(0.8mL)、HOBt 0.2M DMF溶液(2.0mL)。
(4)以50℃对总量进行MW照射10分钟，使其反应后，去除反应溶剂。使用DMF(18mL)洗涤树脂，得到Fmoc-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-树脂。
(5)然后，通过与(2)～(4)相同的操作重复脱保护与Fmoc-氨基酸的偶联(除了Fmoc-His(Trt)-OH以外的偶联以75℃MW照射5分钟来进行反应)。
(6)在偶联第22个残基的Fmoc-Lys(Boc)-OH后，通过与(2)相同的方法对Fmoc基团进行脱保护，然后使用二氯甲烷、MeOH洗涤树脂，进行减压干燥，得到侧链保护型BFR-树脂。
4.从树脂中切取保护肽与纯度测定
(7)向侧链保护型BFR-树脂(取用一部分，约20mg)中加入Cleavage mixture(2mL)，搅拌2小时。使用乙腈稀释反应液后，进行HPLC分析。其结果可知，作为目标产物的B-片段的纯度为75.5％(tR＝20.4)，与此相对，作为副产物生成的脱三苯甲基体的含有率为7.9％(tR＝7.9)(参考图18及表16，梯度洗脱D)。
[表16]
将实验例5～8及比较例3～5的结果总结于表17。
[表17]
(表中，-表示没有数据)
由上述结果可确认到，通过本发明的制备方法，可大量地得到高纯度的长链肽。此外可确认到，通过本发明的制备方法，多肽固相合成法中的中间体片段脱三苯甲基体的生成减少。即确认到，通过本发明的制备方法，能够抑制副反应，大量合成纯度高的长链肽。
[实验例9]五聚丙氨酸(H-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-OH)的合成(使用M-Revo(注册商标))
1.向树脂中导入Fmoc-氨基酸
(1)向反应容器中添加Wang树脂(对甲氧基苄醇树脂，5.0g)、DMF(35mL)，使树脂溶胀。去除DMF后，添加Fmoc-Ala-OH 2.41g(2.5eq.)、HOBt(1.05g,2.5eq.)、DMF(35mL)、DIC(1.2mL,2.5eq.)。
(2)使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌2小时以上。
(3)去除反应溶剂，使用M-Revo(注册商标)，使用DMF(35mL)、二氯甲烷(35mL)、DMF(35mL)洗涤导入了Fmoc-Ala-OH的树脂。
2.Fmoc基团的脱保护
(4)向得到的Fmoc-Ala-Wang-树脂中添加20％哌啶/DMF(35mL)。
(5)使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌20分钟以上。
(6)去除反应溶剂，使用M-Revo(注册商标)，使用DMF(35mL)、二氯甲烷(35mL)、DMF(35mL)进行洗涤。
(7)通过茚三酮检测，确认到树脂珠粒显色。
(8)得到H-Ala-Wang-树脂。
3.偶联反应
(9)向(8)的反应容器中添加Fmoc-Ala-OH(2.41g,2.5eq.)、HOBt(1.05g,2.5eq.)、DMF(35mL)、DIC(1.2mL,2.5eq.)。
(10)使用M-Revo(注册商标)，离心搅拌1小时以上。
(11)去除反应溶剂，使用M-Revo(注册商标)，使用DMF(35mL)、二氯甲烷(35mL)、DMF(35mL)洗涤导入了Fmoc-Ala-OH的树脂。
(12)少量取样导入了Fmoc-Ala-OH的树脂，通过茚三酮检测确认到树脂珠粒未显色。若树脂珠粒通过茚三酮检测发生显色时，重复操作(9)～(11)直至不显色。
(13)实施操作(4)～(12)，直至得到Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-树脂。其中，N末端氨基酸导入有Boc-Ala-OH。
(14)在偶联Boc-Ala-OH后，使用二氯甲烷(35mL)、MeOH(35mL)洗涤，进行减压干燥，得到以下的Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-树脂。
[化学式4]
4.从树脂中切取肽
(15)向Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-树脂中加入TFA/TIS/H2O(体积比TFA/TIS/H2O＝95/2.5/2.5)(35mL)，振荡2小时。
(16)对反应液进行减压浓缩，通过IPE(250mL)使其进行晶析。
(17)对结晶进行减压过滤。
(18)在室温下减压干燥，得到以下的H-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-OH〃TFA盐(604mg)。
[化学式5]
[比较例6]五聚丙氨酸(H-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-OH)的合成(使用振荡机)
1.向树脂中导入Fmoc-氨基酸
(1)向反应容器中添加Wang-树脂(0.50g)、DMF(5mL)，使树脂溶胀。去除DMF后，添加Fmoc-Ala-OH(775mg,6eq.)、HOBt(337mg,6eq.)、DMF(2.5mL)、DIC(386μL,6eq.)。
(2)使用振荡机，振荡2小时以上。
(3)去除反应溶剂，使用振荡机，使用DMF(5mL)、二氯甲烷(5mL)、DMF(5mL)洗涤导入了Fmoc-Ala-OH的树脂。
2.Fmoc基团的脱保护
(4)向得到的Fmoc-Ala-Wang-树脂中添加20％哌啶/DMF(5.5mL)。
(5)使用振荡机，振荡20分钟以上。
(6)去除反应溶剂，使用振荡机，使用DMF(5mL)、二氯甲烷(5mL)、DMF(5mL)进行洗涤。
(7)通过茚三酮检测确认到树脂珠粒显色。
(8)得到H-Ala-Wang-树脂。
3.偶联反应
(9)向(8)的反应容器中添加Fmoc-Ala-OH(386mg,2.5eq.)、HOBt(168mg,2.5eq.)、DMF(5.5mL)、DIC(206μL,2.5eq.)。
(10)使用振荡机，振荡1小时以上。
(11)去除反应溶剂，使用振荡机，使用DMF(5mL)、二氯甲烷(5mL)、DMF(5mL)洗涤导入了Fmoc-Ala-OH的树脂。
(12)少量取样导入了Fmoc-Ala-OH的树脂，通过茚三酮检测确认到树脂珠粒未显色。若树脂珠粒通过茚三酮检测发生显色时，重复操作(9)～(11)直至不显色。
(13)实施操作(4)～(12)，直至得到Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-树脂。对于最后的偶联反应中使用的保护氨基酸(N末端氨基酸)，使用Boc-Ala-OH。
(14)在偶联Boc-Ala-OH后，使用二氯甲烷(5mL)、MeOH(5mL)进行洗涤，进行减压干燥，得到Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-树脂(0.68g)。
4.从树脂中切取脱保护肽
(15)向Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-树脂中加入TFA/TIS/H2O(体积比TFA/TIS/H2O＝95/2.5/2.5)(5mL)，振荡2小时。
(16)滤去树脂后，对反应液进行减压浓缩，向残渣中加入IPE(25mL)，使其晶析。
(17)对结晶进行减压过滤。
(18)在室温下进行减压干燥，得到H-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-OH·TFA盐(60.7mg)。
[HPLC分析(实验例9及比较例6)]
将实验例9及比较例6的产物的乙腈溶液的HPLC分析结果示于表17以及图19及20。表17表示在实验例9及比较例6的产物的乙腈溶液的HPLC分析中，产物(五聚丙氨酸)的保留时间及含有率。图19及20分别示出了实验例9及比较例6的产物的乙腈溶液的HPLC色谱图。另外，本HPLC分析以下述HPLC条件进行分析。
HPLC条件
色谱柱：Waters X Bridge
移动相：0.1％TFA水溶液
分析时间：约10分钟
流速：1mL/min
检测器：UV 220nm
[表18]
实施例 搅拌方法 HPLC纯度(Area％)
比较例6 振荡机 91.52
实施例9 M-Revo 95.85
由上述结果可确认到，通过本发明的制备方法，大量得到了高纯度的长链肽。
工业实用性
本发明的制备方法在肽的制备上是有用的。特别是在抑制副反应、大量合成长链肽上是有用的。
附图标记说明
1：搅拌用旋转体；5：搅拌机主体；10：主体；11：旋转驱动轴；12：吸入口；13：圆筒旋转构件；13A：顶板；13B：底板；14：吐出口；16：流动通道；18：连接部；20：驱动轴；21：圆筒壳体；22A～22D：放出开口；23：吸入筒部；24A～24D：挤出突板部；25A～25D：吸入开口；30：连通孔；38：搅拌装置；40：搅拌用旋转体；41：搅拌用旋转体的主体；41a：搅拌用旋转体的主体的大致圆形的上表面；41b：搅拌用旋转体的主体的大致圆形状的底面；41c：作为搅拌用旋转体的主体的外周表面的侧面；42：搅拌用旋转体的吸入口；44：搅拌用旋转体的吐出口；46：搅拌用旋转体的流动通道；48：连接部；50：阻流器；51：阻流器的主体；51a：阻流器的主体的大致圆形的上表面；51b：阻流器的主体的大致圆形状的底面；51c：作为阻流器的主体的外周表面的侧面；52：阻流器的吸入口；54：阻流器的吐出口；56：阻流器的流动通道；60：驱动轴a：旋转驱动轴的旋转方向；b：圆筒旋转构件的旋转方向；d1、d4：外部放出流；e1～e3：吸入流；g1～g4、h1～h4：吸入流；C、L：中心轴。

Claims (5)

1.一种肽的制备方法，其特征在于，在无叶片离心式搅拌体的搅拌下固相合成肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述无叶片离心式搅拌体为搅拌用旋转体，其特征在于，其具备：
在中心旋转旋转轴的主体、
设置在所述主体表面的吸入口、
设置在所述主体表面的吐出口、
连接所述吸入口与所述吐出口的流动通道，
与所述吐出口相比，所述吸入口配置在更靠近所述旋转轴的位置，
与所述吸入口相比，所述吐出口配置在从所述旋转轴起的离心方向的外侧的位置。
3.一种无叶片离心式搅拌体在基于固相法的肽合成中的应用。
4.一种多肽固相合成用反应容器，其中，装载有无叶片离心式搅拌体。
5.根据权利要求4所述的多肽固相合成用反应容器，其具备玻璃过滤器。
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