KR102550717B1 - 펩타이드의 제조방법 - Google Patents

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테루히코 칸노
히로키 모리와키
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Abstract

본 발명은 대량의 펩타이드를 합성하는 신규의 펩타이드 고상 합성법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 순도가 높은 장쇄 펩타이드를 합성하는 신규의 펩타이드 고상 합성법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 부반응이 적은 신규의 펩타이드 고상 합성법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 임펠러가 없는 원심식 교반체의 교반하에서 펩타이드를 고상 합성하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.

Description

펩타이드의 제조방법
본 발명은 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 고상 합성법에 의한 장쇄 펩타이드의 대량 합성 방법에 관한 것이다.
장쇄 펩타이드의 고상 합성법에 있어서 통상 사용되는 교반의 수단으로서, 진탕 교반, 질소 버블링 교반, 스터러 교반 등이 알려져 있다.
한편, 원심식 교반체는 공지되어 있으며(특허문헌 1∼4 등), 리포솜의 제조 장치의 부품으로서 응용된 예가 있지만(특허문헌 5), 원심식 교반체가 유기합성의 분야에서의 펩타이드 고상 합성 장치의 부품으로서 응용된 예는 지금까지 보고되어 있지 않다.
특허문헌 1: WO2010/150656호 팸플릿 특허문헌 2: 일본특허공개 제2014-124540호 공보 특허문헌 3: 일본특허공개 제2015-171695호 공보 특허문헌 4: 일본특허공개 제2015-47540호 공보 특허문헌 5: 일본특허공개 제2016-117005호 공보
본 발명은 대량의 펩타이드를 합성하는 신규의 펩타이드 고상 합성법, 순도가 높은 장쇄 펩타이드를 합성하는 신규의 펩타이드 고상 합성법, 및 부반응이 적은 신규의 펩타이드 고상 합성법 중 어느 하나 이상의 고상 합성법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 원심식 교반체를 펩타이드 고상 합성법에 응용함으로써, 순도가 높은 장쇄 펩타이드를 대량 합성할 수 있다는 것을 발견하였으며, 이 지견에 기초하여 더욱 연구를 진척시켜, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 발명에 관한 것이다.
[1] 임펠러가 없는 원심식 교반체의 교반하에서 펩타이드를 고상 합성하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조방법.
[2] 임펠러가 없는 원심식 교반체가,
회전축을 중심으로 회전하는 본체,
상기 본체의 표면에 형성되는 흡입구,
상기 본체의 표면에 형성되는 토출구,
상기 흡입구와 상기 토출구를 연결하는 유통로를 구비하고,
상기 흡입구는 상기 토출구보다도 상기 회전축에 가까운 위치에 배치되고,
상기 토출구는 상기 흡입구보다도 상기 회전축으로부터 원심 방향 외측의 위치에 배치되는 것을 특징으로 하는 교반용 회전체인 상기 [1]에 기재된 제조방법.
[3] 임펠러가 없는 원심식 교반체의 고상법에 의한 펩타이드 합성을 위한 사용.
[4] 임펠러가 없는 원심식 교반체를 탑재한 펩타이드 고상 합성용 반응용기.
[5] 글라스 필터를 구비한 상기 [4]에 기재된 펩타이드 고상 합성용 반응용기.
본 발명은 대량의 펩타이드를 합성하는 신규의 펩타이드 고상 합성법, 순도가 높은 장쇄 펩타이드를 합성하는 신규의 펩타이드 고상 합성법, 및 부반응(예를 들면, 프래그먼트 펩타이드의 레진의 절단 반응에 있어서의, 최종 커플링 반응 전의 바람직하지 않은 측쇄 탈보호 반응 등)이 적은 신규의 펩타이드 고상 합성법 중 어느 하나 이상의 고상 합성법을 제공할 수 있다.
또한, 고상 합성법에 있어서의 반응에는 커플링 반응 전의 보호기 도입 반응, 커플링 반응 전의 펩타이드의 커플링 반응에 관여하는 카르복실기 또는 아미노기의 활성화 반응, 커플링 반응, 레진의 절단 반응, 커플링 반응 및 레진의 절단 반응 후의 탈보호 반응 등의 반응이 포함된다.
도 1은 임펠러가 없는 원심식 교반체를 탑재한 용기의 구성예이다.
도 2의 (a)는 본 발명의 실시 형태에 관한 교반용 회전체의 평면도이다. 도 2의 (b)는 교반용 회전체의 정면도이다(일본특허 제4418019호 공보의 도 1을 인용).
도 3의 (a)는 교반용 회전체의 작동을 나타내는 평면도이다. 도 3의 (b)는 교반용 회전체의 작동을 나타내는 정면도이다(일본특허 제4418019호 공보의 도 2를 인용).
도 4는 교반기 본체의 일 태양을 나타내는 사시도이다(일본특허공개 제2014-124540호 공보의 도 2를 인용, 일부변경 있음).
도 5는 교반기 본체의 일 태양을 나타내는 사시도이다(일본특허공개 제2014-124540호 공보의 도 4를 인용, 일부변경 있음).
도 6은 교반기 본체의 일 태양을 나타내는 사시도이다(일본특허공개 제2014-124540호 공보의 도 6을 인용, 일부변경 있음).
도 7은 교반 장치의 일 태양을 나타내는 정면도(측면도)이다(일본특허공개 제2015-171695호 공보의 도 1을 인용, 일부변경 있음).
도 8은 비교예 1의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 9는 비교예 2의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 10은 실험예 3의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 11은 실험예 5의 생성물의 아세토니트릴 용액의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 12는 비교예 3의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 13은 실험예 6(5잔기째 커플링 공정 이후에 M-Revo를 사용한 합성품)의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 14는 실험예 6(진탕기 합성품)의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 15는 실험예 7의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 16은 실험예 8의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 17은 비교예 4의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 18은 비교예 5의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 19는 실험예 9의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 20은 비교예 6의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
본 발명은 임펠러가 없는 원심식 교반체의 교반하에서 펩타이드를 고상 합성하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
임펠러가 없는 원심식 교반체
임펠러가 없는 원심식 교반체라 함은, 예를 들면, 외관상 교반체 자체에 임펠러가 없고, 원심력을 이용하여 유체를 교반하는 기능을 갖는 교반체를 말한다. 또한, 유체는 레진 혹은 목적 펩타이드 구성 아미노산, 또는 이들의 조합을 함유하는 것이 바람직하다. 임펠러가 없는 원심식 교반체의 구조는, 예를 들면 회전축에 가까운 흡입구과 회전축으로부터 먼 토출구가 연결되어 유로(流路)를 형성하는 회전체이어도 좋다. 교반의 원리는, 예를 들면 교반체의 회전에 의해 유로 내에 원심력이 작용하여, 횡방향으로 유체가 토출하고, 종유로(縱流路)가 부압(負壓)이 되어, 하방(下方)에 부압 흡인류(負壓吸引流)가 발생하는 것이어도 좋다.
임펠러가 없는 원심식 교반체를 탑재한 용기의 구성예를 도 1에 나타낸다. 임펠러가 없는 원심식 교반체를 회전시키면, 토출구(a)에 원심력이 발생하고, (a)로부터 횡방향으로 유체를 토출한다. 이에 따라, 흡입구(b)에 흡인력이 발생하고, 회오리 형태의 소용돌이류(c)가 발생한다. 종유로가 부압이 되어 하방향(下方向)에 부압 흡인류가 발생하여, 「푸쉬→풀」류가 발생한다. 임펠러가 없는 원심식 교반체로부터 교반류로 맥동(펄스)이 전해지고, 교반류가 전체적으로 널리 퍼지게 된다.
임펠러가 없는 원심식 교반체로는, 주식회사 메덱사제의 M-Revo(등록상표), E-REVO 등을 사용할 수 있다.
임펠러가 없는 원심식 교반체로서, 예를 들면 WO2010/150656호 팸플릿, 일본특허 제4418019호 공보, 일본특허공개 제2014-124540호 공보 등에 기재되어 있는 교반체를 사용해도 좋다.
즉, 임펠러가 없는 원심식 교반체는
(1) 회전축을 중심으로 회전하는 본체,
상기 본체의 표면에 형성되는 흡입구,
상기 본체의 표면에 형성되는 토출구,
상기 흡입구과 상기 토출구를 연결하는 유통로를 구비하고,
상기 흡입구는 상기 토출구보다도 상기 회전축에 가까운 위치에 배치되고,
상기 토출구는 상기 흡입구보다도 상기 회전축으로부터 원심 방향 외측의 위치에 배치되는 것을 특징으로 하는 교반용 회전체(예를 들면, 도 2 및 3을 참조)이어도 좋고,
(2) 회전축 방향에 수직인 단면이 원형상으로 구성되는 본체,
상기 본체의 표면에 형성되는 흡입구,
상기 본체의 표면에 형성되는 토출구,
상기 흡입구과 상기 토출구을 연결하는 유통로를 구비하고,
상기 흡입구는 상기 토출구보다도 상기 회전축에 가까운 위치에 배치되고,
상기 토출구는 상기 흡입구보다도 상기 회전축으로부터 반경 방향 외측의 위치에 배치되는 것을 특징으로 하는 교반용 회전체(예를 들면, 도 2 및 3을 참조)이어도 좋고, 또는
(3) 상단이 상부판에 의해 폐쇄된 원통형 하우징으로 되는 원통형 회전 부재를, 상기 상부판에 고착된 회전 구동축에 의해 당해 원통형 하우징의 중심축선을 중심으로 하여 회전하는 교반기 본체로서,
상기 원통형 회전 부재는,
상기 원통형 하우징의 주면(周面)에 천공되어 형성된 복수의 방출개구,
상기 원통형 하우징의 내주면(內周面)에 내부로 돌출하도록 형성된 복수의 압출돌판부(押出突板部),
상기 원통형 하우징의 하단에 형성된 흡입개구를 구비하고,
상기 원통형 회전 부재는, 회전 시, 상기 압출돌판부에 의해, 내재하는 교반액을 상기 중심축선의 주변으로 순환시키는 내부 순환류를 발생시켜 당해 내부 순환류를 형성하는 상기 교반액의 일부를 원심력에 의해 상기 방출개구로부터 외부 방출류로서 방출구로부터 외부로 방출시킴과 동시에, 외부의 교반액을 상기 흡입개구로부터 흡입류로서 내부로 받아들이게 하는 것을 특징으로 하는 교반기 본체(예를 들면, 도 4∼6을 참조)이어도 좋다.
교반 조건
교반 장치로서, 상기 교반체를 탑재한 용기 등을 사용할 수 있다. 「탑재」라 함은 장치의 일부로서 조합된 것 등을 말한다.
또한, 교반 장치로서,
서로 인접하여 배치된 교반용 회전체 및 유동 저항체를 구비하고,
상기 교반용 회전체는,
회전축을 중심으로 회전하는 본체,
상기 본체의 표면에 형성되는 흡입구,
상기 본체의 표면에 있어서 상기 흡입구보다도 상기 회전축으로부터 원심 방향 외측의 위치에 형성되는 토출구,
상기 흡입구과 상기 토출구을 연결하는 유통로를 구비하고,
상기 유동 저항체는,
저항체 회전축을 중심으로 회전하는 저항체 본체,
상기 저항체 본체의 표면에 형성되는 저항체 흡입구,
상기 저항체 본체의 표면에 있어서 상기 저항체 흡입구보다도 상기 저항체 회전축으로부터 원심 방향 외측의 위치에 형성되는 저항체 토출구,
상기 저항체 흡입구과 상기 저항체 토출구를 연결하는 저항체 유통로를 구비하고,
상기 저항체 본체는, 상기 교반용 회전체의 상기 본체와는 상이한 형상 혹은 상이한 크기로 구성되거나 또는 상기 교반용 회전체의 상기 본체와는 상이한 자세(姿勢)로 배치되는 것을 특징으로 하는 교반 장치(예를 들면, 도 7을 참조)를 사용해도 좋다(일본특허공개 제2015-171695호 공보 참조).
상기한 교반 장치는 펩타이드 고상 합성용 반응용기로서 유용하다.
또한, 펩타이드 고상 합성용 반응용기는 원주상의 용기 및 임펠러가 없는 원심식 교반체를 탑재하고 있는 것이 바람직하다(예를 들면 도 1을 참조). 원주상의 용기는, 그 저면(底面) 및 측면(側面)이 플라스틱 또는 유리로 된 것이어도 좋다. 원주상의 용기는, 상부에 플라스틱 또는 유리제의 뚜껑이 있어도 좋고, 없어도 좋다. 펩타이드 고상 합성을 당해 용기 내에서 행할 수 있다면, 임펠러가 없는 원심식 교반체를 원주상의 용기 어느 위치에 배치해도 좋지만, 원주상의 용기의 중앙하부에 배치하는 것이 바람직하다. 반응물, 반응액 및/또는 세정액을 원주상의 용기의 상부로부터 넣을 수 있다.
또한, 펩타이드 고상 합성용 반응용기는, 추가로 열매체 재킷(피복체), 열매체 흡입구 및 열매체 토출구를 원주상의 용기 외측에 탑재하고 있는 것이 바람직하다(예를 들면 도 1을 참조). 예를 들면 약 5∼80℃ 정도의 순환수를 열매체 흡입구로부터 열매체 재킷에 넣고, 해당 순환수를, 순환수 재킷 경유로, 열매체 토출구로부터 배출해도 좋다.
펩타이드 고상 합성용 반응용기는 추가로 글라스 필터를 탑재하고 있는 것이 바람직하다. 글라스 필터는, 예를 들면 도가니 형이어도 좋고, 부흐너 깔때기 형이여도 좋고, 판상이어도 좋고, 예를 들면 시판품을 구입하는 것으로 입수가능하다. 글라스 필터의 판크기는 특별히 한정되지 않고 적절히 변경가능하다. 글라스 필터의 세공의 크기는 고상 합성에 사용하는 레진(고상 담체)보다도 작고, 레진을 필터 위에 보지(保持)한 상태로 액체를 여과할 수 있는 크기라면 좋다. 글라스 필터는 펩타이드 고상 합성용 반응용기의 저면(底面)보다도 위에, 및/또는, 임펠러가 없는 원심식 교반체보다도 아래에 배치되어 있는 것이 바람직하다(예를 들면 도 1을 참조). 글라스 필터를 탑재하는 것에 의해, 레진과 반응액이나 세정액 등의 액체의 분리 조작을 간편하고 신속하게 실시할 수 있고, 펩타이드 고상 합성의 조작 효율을 향상시킬 수 있다.
펩타이드 고상 합성용 반응용기는 코크(마개)를 탑재하고 있는 것이 바람직하고, 예를 들면 시판품을 구입하는 것으로 입수가능하다. 코크(마개)는, 펩타이드 고상 합성용 반응용기의 저면 및 글라스 필터보다도 아래쪽에 배치되어 있는 것이 바람직하다(예를 들면 도 1을 참조). 코크(마개)를 탑재하는 것에 의해, 펩타이드 고상 합성용 반응용기 내부의 액체를 수시로 소망하는 양을 따라낼 수 있기 때문에, 레진과 반응액이나 세정액 등의 액체의 분리 조작을 보다 간편하게 실시할 수 있다.
펩타이드 고상 합성용 반응용기는 글라스 필터 및 코크(마개)를 탑재하고 있는 것이 더욱 바람직하다.
원심식 교반체의 로터의 치수 및 원심력은 특별히 한정되지 않고 적절히 변경가능하다.
원심식 교반체는, 원주부에 복수(예를 들면, 2∼10개)의 토출구를 갖는 것이 바람직하다. 로터의 교반 능력의 지표가 되는, 토출량 계수(토출구의 개구면적합계 X 원주길이)는 바람직하게는 60 cm3 ∼ 6000 cm3 이며, 더욱 바람직하게는 200 cm3 ∼ 2000 cm3 이다.
펩타이드
펩타이드는 예를 들면 아미노산 잔기수가 5∼150의 펩타이드이어도 좋고, 5∼34의 펩타이드이어도 좋고, 15∼100의 펩타이드이어도 좋고, 10∼80의 펩타이드이어도 좋고, 15∼80의 펩타이드이어도 좋고, 10∼60의 펩타이드이어도 좋고, 15∼60의 펩타이드이어도 좋다.
펩타이드는, 예를 들면 아바렐릭스(Abarelix), 인슐린(Insulin) 및 이의 유사체, 엔도세린(Endothelin), β-엔돌핀(β-Endorphin), 옥시토신(Oxytocin), 칼시토닌(Calcitonin), 카르페리티드(Carperitide), 글루카곤(Glucagon), 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 그렐린(Ghrelin), 고세렐린(Goserelin), 콜레시스토키닌(Cholecystokinin), 시나풀티드(Sinapultide), 심방성 나트륨 이뇨 펩타이드(ANP), 세크레틴(Secretin), 세트로렐릭스(Cetrorelix), 소마토스타틴(Somatostatin), 데가렐릭스(Degarelix), 데스모프레신(Desmopressin), 테두글루티드(Teduglutide), 테리파라티드(Teriparatide), 뇌성 나트륨 이뇨 펩타이드(BNP), 바소프레신(Vasopressin), 파라토르몬(Parathormone), 브라디키닌(Bradykinin), 페기네사티드(Peginesatide), 란레오티드(Lanreotide), β-리포트로핀(β-Lipotropin), γ-리포트로핀(γ-Lipotropin), 류프로렐린(Leuprorelin), 리나클로티드(Linaclotide), 혹은 리라글루티드(Liraglutide) 등의 펩타이드 또는 이의 염 등이어도 좋다. 염은 약학적으로 허용되는 염이라면 좋고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 약학적으로 허용되는 산부가염, 금속염, 암모늄염, 유기 아민 부가염 등을 들 수 있다. 산부가염으로서, 염산염, 질산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염; 옥살산염, 초산염, 트리플루오로초산염, 말레인산염, 푸마르산염, 주석산염, 구연산염, 젖산염, 사과산염, 호박산염, 글루콘산염, 아스코르빈산염, p-톨루엔술폰산염 등의 유기산염을 들 수 있다. 금속염으로서, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염; 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리 토금속염; 알루미늄염, 아연염 등을 들 수 있다. 암모늄염으로서, 암모늄, 테트라메틸암모늄 등의 염을 들 수 있다. 유기 아민 부가염으로서, 피페리딘 등의 부가염을 들 수 있다. 이중에서도, 산부가염, 유기산염 등이 바람직하고, 초산염이 더욱 바람직하다.
고상 합성법
고상 합성법의 프로세스 조건은 종래 충분히 확립되어 있으므로, 교반체로서 임펠러가 없는 원심식 교반체를 사용하는 것 이외는 특별히 제한되지 않고, 공지방법(예를 들면, 메리필드 고상 합성법 등)을 채용할 수 있다. 고상 합성법에 있어서의 반응은 커플링 반응 전의 보호기 도입 반응, 커플링 반응 전의 펩타이드의 커플링 반응에 관여하는 카르복실기 또는 아미노기의 활성화 반응, 커플링 반응, 레진의 절단 반응, 커플링 반응 및 레진의 절단 반응 후의 탈보호 반응 등의 반응이 포함된다. 탈 Fmoc기(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기) 반응에는 DMF/20% 피페리딘을 사용해도 좋다. 탈 Boc기(터셔리-부톡시카르보닐기) 반응에는 트리플루오로초산을 사용해도 좋다. 또한, 카이저(Kaiser) 테스트 등의 방법에 의해 닌히드린 반응을 이용하여 미반응의 아미노기 유무를 확인해도 좋다.
고상 합성법의 예에 대하여는 실시예의 항목을 참조하기 바란다.
효과
본 발명의 펩타이드의 제조법에 의하면, 예를 들면 대량의 펩타이드를 합성할 수 있다. 합성할 수 있는 펩타이드 양은, 임펠러가 없는 원심식 교반체를 사용하지 않은 펩타이드의 제조법을 사용하여 합성되는 펩타이드 양보다도 많은 것이 바람직하고, 예를 들면, 1 g 이상이어도 좋고, 10 g 이상이어도 좋고, 100 g 이상이어도 좋고, 200 g 이상이어도 좋고, 또한 300 g 이상이어도 좋다.
본 발명의 펩타이드의 제조법을 사용하여 합성되는 펩타이드는, 임펠러가 없는 원심식 교반체를 사용하지 않은 펩타이드의 제조법을 사용하여 합성되는 펩타이드보다도 순도가 높은 것이 바람직하다. 바람직한 HPLC 순도는 예를 들면 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 등이다.
본 발명의 펩타이드의 제조법을 사용하여 합성되는 펩타이드는, 임펠러가 없는 원심식 교반체를 사용하지 않은 펩타이드의 제조법을 사용하여 합성되는 펩타이드보다도 탈트리틸체 등의 부반응 생성물이 적은 것이 바람직하다. 탈트리틸체 함유율은, 예를 들면 5% 이하, 3% 이하, 또는 1% 이하인 것이 바람직하다.
본 발명은, 본 발명의 효과를 달성하는 한, 본 발명의 기술적 범위 내에 있어서, 상기의 구성을 각종 조합시킨 태양을 포함한다.
실시예
이어서, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것이 아니고, 많은 변형이 본 발명의 기술적 사상 내에서 당분야에 있어서 통상의 지식을 갖는 자에 의해 가능하다.
실시예에 있어서 이하의 HPLC 조건으로 측정하였다.
컬럼: Waters XBridge Shield18 3.5μm 4.6Х150 mm
이동상 A: 0.1% TFA 수용액
이동상 B: 0.08% TFA 아세토니트릴 용액
유속: 1 mL/min
검출기: UV 220 nm
글라디엔트 프로그램 A
시간(min) 0.00 10.00 40.00 40.10 50.00
이동상 A (%) 30 30 0 30 30
이동상 B (%) 70 70 100 70 70
글라디엔트 프로그램 B
시간(min) 0.00 10.00 40.00 40.10 50.00
이동상 A (%) 40 40 0 40 40
이동상 B (%) 60 60 100 60 60
글라디엔트 프로그램 C
시간(min) 0.00 10.00 40.00 40.10 50.00
이동상 A (%) 85 85 50 85 85
이동상 B (%) 15 15 50 15 15
글라디엔트 프로그램 D
시간(min) 0.00 10.00 40.00 40.10 50.00
이동상 A (%) 20 20 0 20 20
이동상 B (%) 80 80 100 80 80
본 개시에 있어서, pseudo-pro는 슈도 프롤린을, Trt는 트리틸기를, HOBt는 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 모노하이드레이트를, DMF는 N,N-디메틸포름아미드를, DIC는 디이소프로필카르보디이미드를, DIEA는 디이소프로필에틸아민을, Oxyma는 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트를, TFA는 트리플루오로초산을, TIS는 트리(이소프로필)실란을, EDT는 에탄디티올을, Cleavage mixture는 초산/트리플루오로에탄올/디클로로메탄(부피비 10/10/80)을, IPE는 이소프로필 에테르를, TFE는 2,2,2-트리플루오로에탄올을 나타낸다.
34잔기 펩타이드의 고상 합성
[실험예 1] A-프래그먼트-레진(Boc-Ser(tBu)-Val-Ser(pseudo-pro)-Glu(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진)(측쇄 보호형 AFR-레진)의 합성(M-Revo(등록상표)를 사용)
1. 커플링 반응
(1) 반응용기에 H-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진(80.00 g), Fmoc(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-아미노산(2.5 eq.), 활성화제 HOBt(22.42 g, 2.5 eq.), 반응용매 DMF(800 mL), DIC(25.70 mL)를 첨가하였다.
(2) M-Revo(등록상표)를 사용하여 2시간 이상 원심교반하였다.
(3) 반응용매를 제거하고, M-Revo(등록상표)를 사용하여 Fmoc-아미노산 도입 레진을 DMF(800 mL), 디클로로메탄(800 mL), DMF(800 mL)로 세정하였다.
(4) Fmoc-아미노산 도입 레진을 소량 샘플링하고, 카이저 테스트를 사용하여 수지가 정색하지 않는 것을 확인하였다. 만일 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색(呈色)한 경우는 정색하지 않게 될 때까지, 조작(1)∼(3)을 반복하였다.
2. Fmoc기의 탈보호
(5) 얻어진 Fmoc-아미노산 도입 레진에 20% 피페리딘/DMF(800 mL)를 첨가하였다.
(6) M-Revo(등록상표)를 사용하여 20분 이상 원심교반하였다.
(7) 반응용매를 제거하고, M-Revo(등록상표)를 사용하여 DMF(800 mL), 디클로로메탄(800 mL), DMF(800 mL)로 세정하였다.
(8) 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색하는 것을 확인하였다.
(9) 조작 (1)∼(8)을 이하의 측쇄보호형 AFR-레진(230 g)이 얻어질 때까지 실시하였다. 단, 세린(슈도 프롤린) 잔기는 N 말단을 Fmoc기로 보호한 디펩타이드인 Fmoc-발린-세린(슈도 프롤린)으로 하여 도입하였다.
[화학식 1]
Figure 112019103216311-pct00001
[실험예 2] B-프래그먼트-레진(H-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진)(측쇄보호형 BFR-레진)의 합성(M-Revo(등록상표)를 사용)
1. 레진으로의 Fmoc -아미노산의 도입
(1) 반응용기에 아르곤 가스 분위기하에서 Cl-Trt(2-Cl)-레진(40.00 g), Fmoc-Phe-OH(56.17 g)을 첨가하였다.
(2) 디클로로에탄(400 mL) 및 DIEA(25.25 mL)를 첨가하였다.
(3) M-Revo(등록상표)를 사용하여 3시간 이상 원심교반하였다.
(4) 반응용매를 제거하고, DIEA(5.05 mL), 메탄올(40 mL), 및 디클로로에탄을 전체가 교반가능하게 되는 용량분으로 첨가하였다.
(5) 아르곤 가스 분위기하에서 M-Revo(등록상표)를 사용하여 1시간 동안 원심교반하였다.
(6) 반응용매를 제거하고, M-Revo(등록상표)를 사용하여 DMF(400 mL), 디클로로메탄(400 mL), DMF(400 mL)로 세정하였다.
(7) Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 소량 샘플링하고, 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색하지 않는 것을 확인하였다.
2. Fmoc기의 탈보호
(8) 얻어진 Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 20% 피페리딘/DMF(400 mL)를 첨가하였다.
(9) M-Revo(등록상표)를 사용하여 20분 이상 원심교반하였다.
(10) 반응용매를 제거하고, M-Revo(등록상표)를 사용하여 DMF(400 mL), 디클로로메탄(400 mL), DMF(400 mL)로 세정하였다.
(11) 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색하는 것을 확인하였다.
(12) H-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
3. 커플링 반응
(13) 반응용기에 (12)에서 얻은 H-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진, Fmoc-아미노산(2.5 eq.), HOBt(19.59 g, 2.5 eq.), DMF(10∼20 v/w), DIC(22.45 mL, 2.5 eq.)를 첨가하였다.
(14) M-Revo(등록상표)를 사용하여 2시간 이상 원심교반하였다.
(15) 반응용매를 제거하고, M-Revo(등록상표)를 사용하여 Fmoc-아미노산 도입 레진을 DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하였다.
(16) Fmoc-아미노산 도입 레진을 소량 샘플링하고, 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색하지 않는 것을 확인하였다. 만일 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색한 경우는 정색하지 않게 될 때까지, 조작(13)∼(15)을 반복하였다.
4. Fmoc기의 탈보호
(17) 얻어진 Fmoc-아미노산 도입 레진에 20% 피페리딘/DMF(400 mL)를 첨가하였다.
(18) M-Revo(등록상표)를 사용하여 20분 이상 원심교반하였다.
(19) 반응용매를 제거하고, M-Revo(등록상표)를 사용하여 DMF(400 mL), 디클로로메탄(400 mL), DMF(400 mL)로 세정하였다.
(20) 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색하는 것을 확인하였다.
(21) 조작(13)∼(20)을 이하의 측쇄보호형 BFR-레진(310 g)이 얻어질 때까지 실시하였다.
[화학식 2]
Figure 112019103216311-pct00002
[실험예 3] 측쇄보호형 BFR-레진으로부터의 보호 펩타이드의 절단(M-Revo(등록상표)를 사용)
(1) 측쇄보호형 BFR-레진(80 g)을 첨가한 용기에 탈기한 Cleavage mixture( 800 mL)를 첨가하였다.
(2) M-Revo(등록상표)를 사용하여 2시간 동안 원심교반하였다.
(3) 반응 용액을 여과하고, Cleavage mixture(80 mL)로 3회, 추가로 디클로로메탄(160 mL)으로 세정하였다.
(4) 여과액을 외부온도 25℃에서 감압농축하였다.
(5) 농축 잔사에 디클로로메탄(160 mL)을 첨가하여 결정을 용해하였다.
(6) 반응용기에 IPE(4000 mL)을 첨가하고, (5)의 용해액을 적하하였다.
(7) 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 결정을 감압여과하고, IPE(800 mL)을 사용하여 세정하였다.
(8) 실온에서 진공건조하여, 측쇄보호형 B-프래그먼트(67.95 g)를 얻었다.
[화학식 3]
Figure 112019103216311-pct00003
[비교예 1 및 2]
M-Revo(등록상표) 대신 스터러를 사용한 것 이외는 실험예 3과 동일한 고상 합성법에 의해 측쇄보호형 B-프래그먼트를 얻었다.
[HPLC 분석(비교예 1 및 2와 실험예 3)]
비교예 1 및 2와 실험예 3의 생성물의 아세토니트릴 용액의 HPLC 분석한 결과를 표 5∼7 및 도 8∼10에 나타내었다. 표 5, 6 및 7은 각각 비교예 1, 비교예 2 및 실험예 3의 생성물의 아세토니트릴 용액의 HPLC 분석에 있어서의 각 생성물(탈트리틸체 부생성물 또는 B-프래그먼트)의 유지시간 및 함유율을 나타낸다. 도 8, 9 및 10은 각각 비교예 1, 비교예 2 및 실험예 3의 생성물의 아세토니트릴 용액의 HPLC 크로마토그램(글라디엔트 프로그램 A)을 나타낸다.
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
탈-트리틸체 부생성물
(de-Tritylated By-product)		 25.48 12.826
B-프래그먼트
(B-fragment)		 29.52 70.475
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
탈-트리틸체 부생성물
(de-Tritylated By-product)		 25.49 10.867
B-프래그먼트
(B-fragment)		 29.50 72.412
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
탈-트리틸체 부생성물
(de-Tritylated By-product)		 25.27 4.786
B-프래그먼트
(B-fragment)		 29.29 69.157
실험예 3와 비교예 1 및 2의 결과를 표 8에 정리하였다.
실험예 교반방법 HPLC 순도 (Area %)
B-프래그먼트 탈-트리틸체
실험예 3 M-Revo 69.2 4.8
비교예 1 스터러 70.5 12.8
비교예 2 스터러 72.4 10.9
이상의 결과에 의해, 실험예 3의 B-프래그먼트의 HPLC 순도는 69.2%로, 비교예 1 및 2의 순도와 동등한 것에 대하여, 부생한 탈트리틸체 함유율은 4.79%로, 비교예 1 및 2의 함유율의 2분의 1 이하인 것이 밝혀졌다. 즉, M-Revo(등록상표)를 사용하는 고상 합성법에 의해, 스터러를 사용한 고상 합성법보다도, 고순도의, 즉 바람직하지 않은 탈트리틸체가 적은 B-프래그먼트가 얻어졌다.
[실험예 4] 34잔기 펩타이드의 제조
실험예 1에서 얻은 측쇄보호형 AFR-레진을 실험예 3과 동일한 방법에 의해 처리하여 레진으로부터 측쇄보호형 A-프래그먼트를 절단하고, 이의 C 말단 카르복실기를 활성화한 후, 측쇄보호형 B-프래그먼트를 반응시켜, 34잔기 펩타이드의 측쇄보호체를 합성하고, 이 측쇄보호기를 탈보호하여, 목적 펩타이드를 얻었다.
[실험예 5] 측쇄보호형 A-프래그먼트-레진(Boc-Ser(tBu)-Val-Ser(pseudo-pro)-Glu(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진)(측쇄보호형 AFR-레진)의 합성(M-Revo(등록상표)를 사용)
1. 레진으로의 Fmoc -아미노산의 도입
(1) 플라스크(eggplant flask)에 Fmoc-Leu-OH(2.5 eq.), DMF, HOBt(2.5 eq.), DIC(2.5 eq.)를 가하여 30분 동안 교반하였다. H-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진(80.00 g)을 가한 반응용기에, 플라스크(eggplant flask) 중의 반응액을 첨가하고, M-Revo(등록상표)를 사용하여 2시간 이상 교반시켰다. 반응용매를 제거하고, 레진을 DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하여, Fmoc-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
2. Fmoc기의 탈보호
(2) Fmoc-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진에 20% 피페리딘/DMF 용액(10 v/w)을 가하였다. M-Revo를 사용하여 20분 동안 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DMF(10 v/w Х 5회), 디클로로메탄(10 v/w Х 5회), DMF(10 v/w Х 5회)로 세정하여, H-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
3. 커플링 반응
(3) H-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진에, Fmoc-Asn(Trt)-OH(2.5 eq.), HOBt(2.5 eq.), DIC(2.5 eq.), DMF를 교반가능하게 되는 용량분(약 10 v/w)으로 가하였다. M-Revo(등록상표)를 사용하여 2시간 이상 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하여, Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
(4) Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진에 20% 피페리딘/DMF 용액(10 v/w)을 가하였다. M-Revo(등록상표)를 사용하여 20분 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하여, H-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
(5) 이후, 각 Fmoc-아미노산의 도입과 Fmoc기의 탈보호에 대하여, (1)과 (2)의 조작을 반복하였다. 한편, Fmoc-Met-OH 도입 후는, 교반 개시 전에 10분 이상 아르곤 버블링을 실시하였다.
(6) 12잔기째에 Boc-Ser(tBu)-OH(2.5 eq.)을 (2)와 동일한 방법으로 커플링한 후, 반응용매를 제거하였다. MeOH로 세정하고, 감압건조하여, 측쇄보호형 AFR-레진(144.12 g)을 얻었다.
4. 레진으로부터의 보호 펩타이드의 절단과 순도 측정
(7) (6)의 조작에서 얻어진 측쇄보호형 AFR-레진(일부 채취한 것 약 20∼50 mg)에 초산/디클로로메탄(부피비 초산/디클로로메탄=1/9)을 가하여 1∼2시간 동안 교반하였다. 반응액을 아세토니트릴로 희석 후, HPLC 분석하였다.
그 결과, 목적물인 A-프래그먼트의 순도는 94.1%(tR=27.4)인 것에 대하여, 부생한 탈트리틸체 함유율은 0.55%(tR=21.5)인 것이 밝혀졌다(도 11 및 표 9를 참조, 글라디엔트 프로그램 B).
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
탈-트리틸체 부생성물
(de-Tritylated By-product)		 21.50 0.545
A-프래그먼트
(A-fragment)		 27.40 94.072
[비교예 3] 측쇄보호형 A-프래그먼트-레진(Boc-Ser(tBu)-Val-Ser(pseudo-pro)-Glu(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진)(측쇄보호형 AFR-레진)의 조제(전자동 마이크로웨이브 펩타이드 합성 장치(Biotage Japan사제 Initiator+ Alstra)을 사용)
1. 레진으로의 Fmoc -아미노산의 도입
(1) 반응용기에 H-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진(122 mg), DMF(4.5 mL)를 가하여 20분간 팽윤시켰다. 여과 후, Fmoc-Leu-OH 0.5M DMF 용액(0.8 mL, 0.4 mmol, 4 eq.), DIC 0.5M DMF 용액(0.8 mL), HOBt 0.2M DMF 용액(2.0 mL)을 가하였다. 75℃에서 5분간 마이크로웨이브(MW) 조사하여 반응시킨 후, 반응용매를 제거하였다. DMF(18 mL)로 세정하여, Fmoc-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
2. Fmoc기의 탈보호
(2) Fmoc-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진에 20% 피페리딘/DMF 용액(4.5 mL)를 가하였다. 3분 교반 후, 반응용매를 제거하고, 20% 피페리딘/DMF 용액(4.5 mL)을 가하였다. 10분 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DMF(18 mL)로 세정하여, H-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
3. 커플링 반응
(3) H-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진에 Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.5M DMF 용액(0.8 mL), DIC 0.5M DMF 용액(0.8 mL), HOBt 0.2M DMF 용액(2.0 mL)을 가하였다. 75℃에서 5분간 MW 조사하여 반응시킨 후, 반응용매를 제거하였다. DMF(18 mL)로 세정하여, Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Gly-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
(4) 이후, 동일하게 (2) 및 (3)의 방법에 따라 탈보호 및 Fmoc 아미노산의 커플링을 반복하였다(Fmoc-His(Trt)-OH의 커플링은 50℃에서 10분간 반응시켰다). 최후의 12잔기째의 Boc-Ser(tBu)-OH(4.0 eq.)을 (1)과 동일한 방법으로 커플링한 후, 반응용매를 제거하고, MeOH(13.5 mL)로 세정하고, 감압건조하여, 측쇄보호형 AFR-레진(350 mg)을 얻었다.
4. 레진으로부터의 보호 펩타이드의 절단 및 순도 측정
(5) 측쇄보호형 AFR-레진(일부 채취한 것 약 20∼50 mg)에 초산/TFE/디클로로메탄(부피비 초산/TFE/디클로로메탄=1/1/9)을 가하여 2시간 동안 교반하였다. 반응액을 아세토니트릴로 희석 후, HPLC 분석하였다. 그 결과, 목적물인 A-프래그먼트의 순도는 66.1%(tR=27.9)인 것에 대하여, 부생한 탈트리틸체 함유율은 7.5%(tR=22.1)인 것이 밝혀졌다(도 12 및 표 10을 참조, 글라디엔트 프로그램 B).
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
탈-트리틸체 부생성물
(de-Tritylated By-product)		 22.09 7.547
A-프래그먼트
(A-fragment)		 27.89 66.111
[실험예 6] 15잔기 펩타이드-레진(H-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O -Trt(2-Cl)-레진)의 합성 (1-4잔기째의 도입까지는 진탕기(EYELA사제 고속진탕기(Cute Mixier) CM-1000형 또는 As One사제 고속진탕기 ASCM-1)를 사용하여 교반 조작을 행하였다. 이 후, 5잔기째의 도입부터는 펩타이드 중간체 레진을 2분할하여 그 반량을 M-Revo(등록상표)를 사용하는 교반 조작에 의해, 또한, 나머지 반량을 진탕기를 사용하는 교반 조작에 의해 합성을 행하였다.)
1. 레진으로의 Fmoc -아미노산의 도입
(1) 아르곤 분위기하에서, 반응용기에 Cl-Trt(2-Cl)-레진(4.00 g), Fmoc-Phe-OH(6.32 g), DIEA(2.79 mL), 디클로로에탄(28.0 mL)을 가하였다. 실온에서 3.5시간 교반 후, 디클로로에탄(28.0 mL)으로 5회 세정하였다.
(2) 세정한 레진에 MeOH(4.00 mL), DIEA(0.8 mL), 디클로로에탄(28.0 mL)을 가하였다. 20분 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하여, Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
2. Fmoc기의 탈보호
(3) Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 20% 피페리딘/DMF 용액(40.0 mL, 10 v/w)을 가하여 20분 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DMF(28.0 mL, 7 v/w Х 5회), 디클로로메탄(28.0 mL, 7 v/w Х 5회), DMF(28.0 mL, 7 v/w Х 5회)로 세정하여, H-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
3. 커플링 반응
(4) 플라스크에 Fmoc-Asn(Trt)-OH(9.73 g, 16.3 mmol), HOBt(2.20 g), DIC(2.52 mL), DMF(40.0 mL)를 가하여 30분 교반 후, 이 용액을 H-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 가하여, 플라스크 내부를 DMF로 잘 세척하고, 전량을 2시간 교반 후, 반응용매를 제거하였다.
(5) 레진을 DMF로 세정하여 Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
4. Fmoc기의 탈보호
(6) Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 20% 피페리딘/DMF 용액(40.0 mL)을 가하여 20분 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하여, H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
5. 커플링 반응
(7) H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에, Fmoc-His(Trt)-OH(1.01 g), HOBt(2.20 g), DIC(2.52 mL), 및 DMF(교반가능하게 되는 용량분)를 가하여 2시간 이상 교반 후, 반응용매를 제거하였다.
(8) 레진을 DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하여, Fmoc-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
(9) 이후, (4) 및 (5)와 동일한 방법에 따라 탈보호와 커플링을 반복하였다.
(10) 15잔기째의 Fmoc-Arg(Pbf)-OH를 커플링 후, (3)과 동일한 방법에 따라 Fmoc기를 탈보호한 후, 레진을 디클로로메탄, MeOH로 세정하고, 감압건조하여, 15잔기 펩타이드-레진(10.7 g)을 얻었다.
6. 레진으로부터의 보호 펩타이드의 절단 및 순도측정
(11) 15잔기 펩타이드-레진(약 20∼50 mg)의 일부를 채취하고, 이것에 초산/디클로로메탄(부피비 초산/디클로로메탄=1/1)을 가하여 1∼2시간 교반하였다. 반응액을 아세토니트릴로 희석 후, HPLC 분석하였다. 공정의 일부(5잔기째 커플링 공정 이후)에 M-Revo(등록상표)를 사용한 합성품의 결과를 표 11 및 도 13(글라디엔트 프로그램 A)에, 진탕기 합성품의 결과를 표 12 및 도 14(글라디엔트 프로그램 A)에 나타내었다. 이 결과로부터 명백한 바와 같이, 전자는 후자보다도 뛰어난 HPLC 순도를 나타내었다(HPLC 순도: 5잔기째 커플링 공정 이후에 M-Revo(등록상표)를 사용한 합성품 93.1%, 진탕기 합성품 89.4%).
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
15-잔기 펩타이드
(15-AA Peptide)		 28.94 93.082
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
15-잔기 펩타이드
(15-AA Peptide)		 28.94 89.371
[실험예 7] 16잔기 펩타이드-레진(H-Glu(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진)의 합성(전자동 마이크로웨이브 펩타이드 합성 장치(Biotage Japan사제 Initiator+ Alstra)를 사용)
1. 레진으로의 Fmoc -아미노산의 도입
(1) 반응용기에 H-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진(179 mg), DMF(4.5 mL)를 가하여 20분간 팽윤시켰다. DMF를 제거후, Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.5M DMF 용액(0.8 mL), DIC 0.2M DMF 용액(2.0 mL), Oxyma 0.5M DMF 용액(0.8 mL)을 가하였다. 75℃에서 5분간 마이크로웨이브(MW) 조사하여 반응시킨 후, 반응용매를 제거하였다. DMF(18 mL)로 세정하여, Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
2. Fmoc기의 탈보호
(2) Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 20% 피페리딘/DMF 용액(4.5 mL)을 가하였다. 3분 교반 후, 반응용매를 제거하고, 20% 피페리딘/DMF 용액(4.5 mL)을 가하였다. 10분 교반 후, 반응용매를 제거하고, DMF(18 mL)로 세정하여, H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
3. 커플링 반응
(3) H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에, Fmoc-His(Trt)-OH 0.5M DMF 용액(0.8 mL), DIC 0.5M DMF 용액(0.8 mL), Oxyma 0.2M DMF 용액(2.0 mL)을 가하였다.
(4) 50℃에서 10분간 MW 조사하여 반응시킨 후, 반응용매를 제거하였다. 레진을 DMF(4.5 mL Х 4회)로 세정하여, Fmoc-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
(5) 이후, (2)∼(4)와 동일한 조작에 따라 탈보호 및 Fmoc 아미노산의 커플링을 반복하였다. (Fmoc-His(Trt)-OH 이외의 커플링은 75℃에서 5분 MW 조사하여 반응을 행하였다).
(6) 16잔기째의 Fmoc-Glu(tBu)-OH를 커플링하고, 계속하여 Fmoc기를 탈보호한 후, 레진을 디클로로메탄, MeOH로 세정하고, 감압건조하여, 16잔기 펩타이드-레진을 얻었다.
4. 레진으로부터의 탈보호 펩타이드의 절단 및 순도 측정
(7) 16잔기 펩타이드-레진(일부 채취한 것 약 20 mg)에 TFA/TIS/H2O/EDT(부피비 TFA/TIS/H2O/EDT=92.5/2.5/2.5/2.5)(2 mL)을 가하여 2시간 교반하였다. 여과하고, TFA를 증류제거한 후, 초산에틸과 물을 가하여 분액하였다. 수층을 분취한 후, 초산에틸을 가하여 세정하였다(2회). 수층을 정제수로 희석 후, HPLC 분석하였다(HPLC 순도 63.4%) (도 15 및 표 13을 참조, 글라디엔트 프로그램 C).
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
16-잔기 펩타이드
(16-AA Peptide)		 20.66 63.426
[실험예 8] B-프래그먼트-레진(H-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진)(측쇄보호형 BFR-레진)의 합성(M-Revo(등록상표)를 사용)
1. 레진으로의 Fmoc -아미노산의 도입
(1) 아르곤 분위기하에서, 반응용기에 Cl-Trt(2-Cl)-레진(10.0 g), Fmoc-Phe-OH(15.0 g), DIEA(6.75 mL), 디클로로에탄(100 mL)을 가하였다. M-Revo(등록상표)를 사용하여 3시간 이상 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DIEA(1.35 mL), MeOH(10 mL), 디클로로메탄(70.0 mL)을 가하고, 아르곤 분위기하에서, M-Revo(등록상표)를 사용하여 20분 교반하였다. DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하여, Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
2. Fmoc기의 탈보호
(2) Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 20% 피페리딘/DMF 용액을 교반가능하게 되는 용량분(약 10 v/w)으로 가하였다. M-Revo(등록상표)를 사용하여 20분 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하여, H-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
3. 커플링 반응
(3) 플라스크에 Fmoc-Asn(Trt)-OH(23.1 g), HOBt(5.24 g), DIC(6.00 mL), DMF(70.0 mL)를 가하여, M-Revo(등록상표)를 사용하여 30분 이상 교반하였다.
(4) (3)의 용액을 H-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 가하여, M-Revo(등록상표)를 사용하여 2시간 이상 교반하였다.
(5) 반응용매를 제거하고, 레진을 DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하여, Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
(6) 이후, (2)∼(5)와 동일한 방법에 따라 탈보호와 커플링을 반복하였다.
10잔기째(Fmoc-Arg(Pbf)-OH), 15잔기째(Fmoc-Arg(Pbf)-OH), 17잔기째(Fmoc-Met-OH), 21잔기째(Fmoc-His(Trt)-OH), 22잔기째(Fmoc-Lys(Boc)-OH)는 더블 커플링을 실시하였다. 또한, 16잔기째(Fmoc-Glu(tBu)-OH)는 트리플 커플링, 19잔기째(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)는 4회 커플링을 행하였다.
(7) 22잔기째의 Fmoc-Lys(Boc)-OH의 커플링 후, (2)와 동일한 방법에 따라 Fmoc기를 탈보호한 후, 레진을 디클로로메탄, MeOH로 세정하고, 감압건조하여 측쇄보호형 BFR-레진(78.48 g)을 얻었다.
4. 레진으로부터의 보호 펩타이드의 절단 및 순도 측정
(8) 측쇄보호형 BFR-레진(일부 채취한 것 약 20 mg)에 초산/디클로로메탄(부피비 초산/디클로로메탄=1/9)을 가하여 2시간 동안 교반하였다. 반응액을 정제수/아세토니트릴로 희석후, HPLC 분석하였다(HPLC 순도 92.0%)(도 16 및 표 14를 참조, 글라디엔트 프로그램 D).
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
B-프래그먼트
(B-Fragment)		 21.02 92.034
[비교예 4] B-프래그먼트-레진(H-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진)(측쇄보호형 BFR-레진)의 합성(진탕기를 사용)
1. 레진으로의 Fmoc -아미노산의 도입
(1) 아르곤 분위기하에서, 반응용기에 Cl-Trt(2-Cl)-레진(2.00 g), Fmoc-Phe-OH(2.5 eq.), DIEA(2.5 eq.), 디클로로에탄(약 10 v/w)을 가하였다. 진탕기를 사용하여 3시간 이상 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DIEA(0.5 eq.), MeOH(2.0 mL), 디클로로메탄(20 mL)을 가하고, 진탕기를 사용하여 20분 교반하였다. DMF(20 mL)로 세정하여, Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
2. Fmoc기의 탈보호
(2) Fmoc-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 20% 피페리딘/DMF 용액(14 mL)을 가하였다. 진탕기를 사용하여 20분 교반 후, 반응용매를 제거하였다. DMF, 디클로로메탄, DMF로 세정하여, H-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
3. 커플링 반응
(3) 플라스크에 Fmoc-Asn(Trt)-OH(2.5 eq.), HOBt(2.5 eq.), DIC(2.5 eq.), DMF(18.0 mL)를 가하고, 진탕기를 사용하여 30분 이상 교반하였다.
(4) (3)의 용액을 H-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 가하여, 진탕기를 사용하여 2시간 이상 교반하고, 반응용매를 제거하였다. 레진을 DMF(20.0 mL)로 세정하여, Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
(5) 이후, (2)∼(4)와 동일한 조작에 따라 탈보호와 Fmoc-아미노산의 커플링을 반복하였다.
(6) 22잔기째의 Fmoc-Lys(Boc)-OH의 커플링 후, (2)와 동일한 방법에 따라 Fmoc기를 탈보호한 후, 레진을 MeOH(20 mL)로 세정하고, 감압건조하여, 측쇄보호형 BFR-레진(12.18 g)을 얻었다.
4. 레진으로부터의 보호 펩타이드의 절단 및 순도 측정
(7) 측쇄보호형 BFR-레진(7.59 g)에 탈기한 Cleavage mixture(76 mL)를 첨가하고, 아르곤 분위기하에서 진탕기를 사용하여 2시간 교반하였다.
(8) 레진을 추가로 Cleavage mixture(38 mL), 디클로로메탄(76 mL)으로 세정하였다.
(9) 반응액에 헥산(760 mL)을 첨가하여 감압농축한 후, 디클로로메탄(15 mL)을 첨가하여 결정을 용해하였다. 이 용액에 IPE(380 mL)를 첨가하여 결정을 정석시킨 후, 가압여과에 의해 결정을 여과하여 취하였다.
(10) 결정을 감압건조시킨 후, 얻어진 측쇄보호형 B-프래그먼트의 결정을 정제수/아세토니트릴로 용해 후, HPLC로 측정하였다(HPLC 순도 63.8%). 그 결과, 목적물인 B-프래그먼트의 순도는 63.8%(tR=28.4)인 것에 대하여, 부생한 탈트리틸체 함유율은 9.2%(tR=24.2)인 것이 밝혀졌다(도 17 및 표 15를 참조, 글라디엔트 프로그램 A).
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
탈-트리틸체 부생성물
(de-Tritylated By-product)		 24.22 9.240
B-프래그먼트
(B-fragment)		 28.37 63.784
[비교예 5] B-프래그먼트-레진(H-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진)(측쇄보호형 BFR-레진)의 합성(전자동 마이크로웨이브 펩타이드 합성 장치(Biotage Japan사제 Initiator+ Alstra)을 사용)
1. 레진으로의 Fmoc -아미노산의 도입
(1) 반응용기에 H-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진(118 mg) 및 DMF(4.5 mL)를 가하여 20분간 팽윤시켰다. DMF를 제거 후, Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.5M DMF 용액(0.8 mL), DIC 0.5M DMF 용액(0.8 mL), HOBt 0.2M DMF 용액(2.0 mL)을 가하여 75℃에서 5분간 마이크로웨이브(MW) 조사하여 반응시킨 후, 반응용매를 제거하였다. 레진을 DMF(18 mL)로 세정하여, Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
2. Fmoc기의 탈보호
(2) Fmoc-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 20% 피페리딘/DMF 용액(4.5 mL)을 가하여 3분 교반 후, 반응용매를 제거하였다. 추가로, 20% 피페리딘/DMF 용액(4.5 mL)을 가하여 10분 교반 후, 반응용매를 제거하였다. 레진을 DMF(18 mL)로 세정하여, H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
3. 커플링 반응
(3) H-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진에 Fmoc-His(Trt)-OH 0.5M DMF 용액(0.8 mL), DIC 0.5M DMF 용액(0.8 mL), HOBt 0.2M DMF 용액(2.0 mL)을 가하였다.
(4) 전량을 50℃에서 10분간 MW 조사하여 반응시킨 후, 반응용매를 제거하였다. 레진을 DMF(18 mL)로 세정하여, Fmoc-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-O-Trt(2-Cl)-레진을 얻었다.
(5) 이후, (2)∼(4)와 동일한 조작에 따라 탈보호와 Fmoc-아미노산의 커플링을 반복하였다(Fmoc-His(Trt)-OH 이외의 커플링은 75℃에서 5분 MW 조사하여 반응을 행하였다).
(6) 22잔기째의 Fmoc-Lys(Boc)-OH의 커플링 후, (2)와 동일한 방법에 따라 Fmoc기를 탈보호한 후, 레진을 디클로로메탄, MeOH로 세정하고, 감압건조하여 측쇄보호형 BFR-레진을 얻었다.
4. 레진으로부터의 보호 펩타이드의 절단 및 순도 측정
(7) 측쇄보호형 BFR-레진(일부 채취한 것 약 20 mg)에 Cleavage mixture(2 mL)을 가하여 2시간 교반하였다. 반응액을 아세토니트릴로 희석 후, HPLC 분석하였다. 그 결과, 목적물인 B-프래그먼트의 순도는 75.5%(tR=20.4)인 것에 대하여, 부생한 탈트리틸체 함유율은 7.9%(tR=7.9)인 것이 밝혀졌다(도 18 및 표 16을 참조, 글라디엔트 프로그램 D).
피크(Peak) 유지시간(Retention Time) (분) 면적%(Area %)
탈-트리틸체 부생성물
(de-Tritylated By-product)		 7.91 7.872
B-프래그먼트
(B-fragment)		 20.35 75.518
실험예 5∼8 및 비교예 3∼5의 결과를 표 17에 정리하였다.
생성물 교반형식 스케일
(개시 레진량)		 목적물 순도
(Area %)		 탈Trt
함유율
A-프래그먼트 실험예 5 M-Revo 80.0 g 94.1% 0.55%
비교예 3 전자동 마이크로웨이브 펩타이드 합성 장치 0.122 g 66.1% 7.5%
15잔기
펩타이드		 실험예 6 진탕기→M-Revo 4 g
(도중부터의 2분할분)		 93.1% -
진탕기 4 g
(도중부터의 2분할분)		 89.4% -
16잔기
펩타이드		 실험예 7 전자동 마이크로웨이브 펩타이드 합성 장치 0.179 g 63.4% -
B-프래그먼트 실험예 8 M-Revo 10 g 92.0% -
비교예 4 진탕기 2 g 63.8% 9.2%
비교예 5 전자동 마이크로웨이브 펩타이드 합성 장치 0.118 g 75.5% 7.9%
(표 중, -는 데이터 없음을 나타낸다.)
상기 결과로부터, 본 발명의 제조방법에 의해 고순도의 장쇄 펩타이드가 대량으로 얻어진 것을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해, 펩타이드 고상 합성법에 있어서의 중간체 프래그먼트 탈트리틸체의 생성이 저감되는 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 제조방법에 의해 부반응이 억제되어, 순도가 높은 장쇄 펩타이드를 대량 합성할 수 있다는 것이 확인되었다.
[실험예 9] 펜타알라닌(H-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-OH)의 합성(M-Revo(등록상표)를 사용)
1. 레진으로의 Fmoc -아미노산의 도입
(1) 반응용기에 Wang 레진(파라메톡시벤질알코올 레진, 5.0 g), DMF(35 mL)를 첨가하여 레진을 팽윤시켰다. DMF를 제거 후, Fmoc-Ala-OH 2.41 g(2.5 eq.), HOBt(1.05 g, 2.5 eq.), DMF(35 mL), DIC(1.2 mL, 2.5 eq.)를 첨가하였다.
(2) M-Revo(등록상표)를 사용하여, 2시간 이상 원심교반하였다.
(3) 반응용매를 제거하고, M-Revo(등록상표)를 사용하여, Fmoc-Ala-OH 도입 레진을 DMF(35 mL), 디클로로메탄(35 mL), DMF(35 mL)로 세정하였다.
2. Fmoc기의 탈보호
(4) 얻어진 Fmoc-Ala-Wang-레진에 20% 피페리딘/DMF(35 mL)를 첨가하였다.
(5) M-Revo(등록상표)를 사용하여, 20분간 이상 원심교반하였다.
(6) 반응용매를 제거하고, M-Revo(등록상표)를 사용하여, DMF(35 mL), 디클로로메탄(35 mL), DMF(35 mL)로 세정하였다.
(7) 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색하는 것을 확인하였다.
(8) H-Ala-Wang-레진을 얻었다.
3. 커플링 반응
(9) (8)의 반응용기에 Fmoc-Ala-OH(2.41 g, 2.5 eq.), HOBt(1.05 g, 2.5 eq.), DMF(35 mL), DIC(1.2 mL, 2.5 eq.)를 첨가하였다.
(10) M-Revo(등록상표)를 사용하여, 1시간 이상 원심교반하였다.
(11) 반응용매를 제거하고, M-Revo(등록상표)를 사용하여, Fmoc-Ala-OH 도입 레진을 DMF(35 mL), 디클로로메탄(35 mL), DMF(35 mL)로 세정하였다.
(12) Fmoc-Ala-OH 도입 레진을 소량 샘플링하고, 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색하지 않는 것을 확인하였다. 만일 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색한 경우는 정색하지 않게 될 때까지, 조작 (9)∼(11)을 반복하였다.
(13) 조작 (4)∼(12)를 Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-레진이 얻어질 때까지 실시하였다. 단, N 말단 아미노산은 Boc-Ala-OH를 도입하였다.
(14) Boc-Ala-OH의 커플링 후, 디클로로메탄(35 mL), MeOH(35 mL)로 세정하고, 감압건조하여, 이하의 Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-레진을 얻었다.
[화학식 4]
Figure 112019103216311-pct00004
4. 레진으로부터의 펩타이드의 절단
(15) Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-레진에 TFA/TIS/H2O(부피비TFA/TIS/H2O=95/2.5/2.5)(35 mL)을 가하여 2시간 진탕하였다.
(16) 반응액을 감압농축하고, IPE(250 mL)로 정석시켰다.
(17) 결정을 감압여과하였다.
(18) 실온에서 감압건조하여, 이하의 H-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-OH·TFA염(604 mg)을 얻었다.
[화학식 5]
Figure 112019103216311-pct00005
[비교예 6] 펜타알라닌(H-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-OH)의 합성(진탕기를 사용)
1. 레진으로의 Fmoc -아미노산의 도입
(1) 반응용기에 Wang-레진(0.50 g), DMF(5 mL)를 첨가하여 레진을 팽윤시켰다. DMF를 제거 후, Fmoc-Ala-OH(775 mg, 6 eq.), HOBt(337 mg, 6 eq.), DMF(2.5 mL), DIC(386μL, 6 eq.)를 첨가하였다.
(2) 진탕기를 사용하여, 2시간 이상 진탕하였다.
(3) 반응용매를 제거하고, 진탕기를 사용하여, Fmoc-Ala-OH 도입 레진을 DMF(5 mL), 디클로로메탄(5 mL), DMF(5 mL)로 세정하였다.
2. Fmoc기의 탈보호
(4) 얻어진 Fmoc-Ala-Wang-레진에 20% 피페리딘/DMF(5.5 mL)를 첨가하였다.
(5) 진탕기를 사용하여, 20분간 이상 진탕하였다.
(6) 반응용매를 제거하고, 진탕기를 사용하여, DMF(5 mL), 디클로로메탄(5 mL), DMF(5 mL)로 세정하였다.
(7) 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색하는 것을 확인하였다.
(8) H-Ala-Wang-레진을 얻었다.
3. 커플링 반응
(9) (8)의 반응용기에 Fmoc-Ala-OH(386 mg, 2.5 eq.), HOBt(168 mg, 2.5 eq.), DMF(5.5 mL), DIC(206μL, 2.5 eq.)를 첨가하였다.
(10) 진탕기를 사용하여, 1시간 이상 진탕하였다.
(11) 반응용매를 제거하고, 진탕기를 사용하여, Fmoc-Ala-OH 도입 레진을 DMF(5 mL), 디클로로메탄(5 mL), DMF(5 mL)로 세정하였다.
(12) Fmoc-Ala-OH 도입 레진을 소량 샘플링하고, 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색하지 않는 것을 확인하였다. 만일 카이저 테스트에 의해 수지 비드가 정색한 경우는 정색하지 않게 될 때까지, 조작 (9)∼(11)을 반복하였다.
(13) 조작 (4)∼(12)를 Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-레진이 얻어질 때까지 실시하였다. 단, 최후의 커플링 반응에 사용하는 보호 아미노산(N 말단 아미노산)에는 Boc-Ala-OH를 사용하였다.
(14) Boc-Ala-OH의 커플링 후, 디클로로메탄(5 mL), MeOH(5 mL)로 세정하고, 감압건조하여 Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-레진(0.68 g)을 얻었다.
4. 레진으로부터의 탈보호 펩타이드의 절단
(15) Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Wang-레진에 TFA/TIS/H2O(부피비 TFA/TIS/H2O =95/2.5/2.5)(5 mL)을 가하여 2시간 진탕하였다.
(16) 레진을 여과한 후, 반응액을 감압농축하고, 잔사에 IPE(25 mL)을 가하여 정석시켰다.
(17) 결정을 감압여과하였다.
(18) 실온에서 감압건조하여, H-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-OH·TFA염(60.7 mg)을 얻었다.
[HPLC 분석(실험예 9 및 비교예 6)]
실험예 9 및 비교예 6의 생성물의 아세토니트릴 용액의 HPLC 분석한 결과를 표 17 및 도 19 및 20에 나타내었다. 표 17은 실험예 9 및 비교예 6의 생성물의 아세토니트릴 용액의 HPLC 분석에 있어서의 생성물(펜타알라닌)의 유지시간 및 함유율을 나타낸다. 도 19 및 20은 각각 실험예 9 및 비교예 6의 생성물의 아세토니트릴 용액의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 한편, HPLC 분석은 하기의 HPLC 조건으로 분석을 행하였다.
HPLC 조건
컬럼: Waters X Bridge
이동상: 0.1% TFA 수용액
분석시간: 약 10분
유속: 1 mL/min
검출기: UV 220 nm
실시예 교반방법 HPLC 순도 (Area %)
비교예 6 진탕기 91.52
실시예 9 M-Revo 95.85
상기 결과로부터, 본 발명의 제조방법에 의해 고순도의 장쇄 펩타이드가 대량으로 얻어진 것을 확인할 수 있었다.
산업상 이용가능성
본 발명의 제조방법은 펩타이드의 제조에 유용하다. 특히, 부반응을 억제하여, 장쇄 펩타이드를 대량 합성하는데 유용하다.
1 교반용 회전체
5 교반기 본체
10 본체
11 회전 구동축
12 흡입구
13 원통형 회전 부재
13A 상부판
13B 하부판
14 토출구
16 유통로
18 접속부
20 구동축
21 원통형 하우징
22A∼22D 방출개구
23 흡입 튜브부
24A∼24D 압출돌판부
25A∼25D 흡입개구
30 연통공
38 교반 장치
40 교반용 회전체
41 교반용 회전체의 본체
41a 교반용 회전체의 본체의 대략 원형상의 상면
4lb 교반용 회전체의 본체의 대략 원형상의 저면
41c 교반용 회전체의 본체의 외주면인 측면
42 교반용 회전체의 흡입구
44 교반용 회전체의 토출구
46 교반용 회전체의 유통로
48 접속부
50 유동 저항체
51 유동 저항체의 본체
51a 유동 저항체의 본체의 대략 원형상의 상면
5lb 유동 저항체의 본체의 대략 원형상의 저면
51c 유동 저항체의 본체의 외주면인 측면
52 유동 저항체의 흡입구
54 유동 저항체의 토출구
56 유동 저항체의 유통로
60 구동축
a 회전 구동축의 회전 방향
b 원통회전부재의 회전 방향
d1, d4 외부 방출류
e1∼e3 흡입류
g1∼g4, h1∼h4 흡입류
C, L 중심축선

Claims (5)

  1. 임펠러가 없는 원심식 교반체의 교반하에서 펩타이드를 고상 합성하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조방법으로서,
    상기 임펠러가 없는 원심식 교반체가
    회전축을 중심으로 회전하는 본체,
    상기 본체의 표면에 형성되는 흡입구,
    상기 본체의 표면에 형성되는 토출구,
    상기 흡입구와 상기 토출구를 연결하는 유통로를 구비하고,
    상기 흡입구는 상기 토출구보다도 상기 회전축에 가까운 위치에 배치되고,
    상기 토출구는 상기 흡입구보다도 상기 회전축으로부터 원심 방향 외측의 위치에 배치되는 것을 특징으로 하는 교반용 회전체인 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 임펠러가 없는 원심식 교반체를 탑재한 펩타이드 고상 합성 장치로서,
    상기 임펠러가 없는 원심식 교반체가
    회전축을 중심으로 회전하는 본체,
    상기 본체의 표면에 형성되는 흡입구,
    상기 본체의 표면에 형성되는 토출구,
    상기 흡입구와 상기 토출구를 연결하는 유통로를 구비하고,
    상기 흡입구는 상기 토출구보다도 상기 회전축에 가까운 위치에 배치되고,
    상기 토출구는 상기 흡입구보다도 상기 회전축으로부터 원심 방향 외측의 위치에 배치되는 것을 특징으로 하는 교반용 회전체인 펩타이드 고상 합성 장치.
  5. 제4항에 있어서, 글라스 필터를 구비한 펩타이드 고상 합성 장치.
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