CN103923641B

CN103923641B - 一种检测线粒体中一氧化氮的荧光探针及其应用

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Publication number: CN103923641B
Application number: CN201410189357.9A
Authority: CN
Inventors: 于海波; 宋有涛; 李红玲; 王杰琼; 王宁; 曹珍
Original assignee: Liaoning University
Current assignee: Liaoning University
Priority date: 2014-05-06
Filing date: 2014-05-06
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2034-05-06
Also published as: CN103923641A

Abstract

本发明涉及一种检测线粒体中一氧化氮的荧光探针及其应用。所述的荧光探针具有分子通式为BDP-NO或BDP-NO-T，BDP-NO的结构通式如(Ⅰ)所示。本发明的荧光探针能够快速的定位于线粒体中，并能够对其中的一氧化氮进行原位实时的检测，另外，该探针还具有较好的化学、光稳定性，较好的溶解性和生物兼容性，较高的一氧化氮选择性，不受其他活性氧和活性氮等物种的干扰。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无明显的毒副作用。

Description

一种检测线粒体中一氧化氮的荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及一类可定位于线粒体，并检测线粒体中一氧化氮的荧光探针。

背景技术

一氧化氮在生命科学中扮演重要角色，是一个重要的信使分子。自20世纪80年代，科学家们发现在生物体生命活动中会产生一氧化氮分子。一氧化氮不仅具有免疫调节、神经传递、血压生理调控和血小板凝聚的抑制等生理功能，而且还与很多疾病，包括基因突变、癌变、动脉硬化等疾病密切相关。然而，生物体中产生的一氧化氮由于其生成量较少并且半衰期较短，对其进行实时、原位、定量的检测，将有助于我们进一步了解一氧化氮的生理功能，有助于了解某些疾病的致病原因，并最终找到合适的治疗方法。

生命体中的一氧化氮主要由处于线粒体中的一氧化氮合成酶生成，线粒体中的一氧化氮对于心脑血管系统、免疫系统以及神经系统具有非常重要的调节作用。目前对一氧化氮进行检测的荧光探针种类很多，例如商品化的一氧化氮探针DAF-FM(InvitrogenTM)，但是所有的这些探针都不具有线粒体定位功能，更无法实现对线粒体中所产生的一氧化氮进行检测。为了实现对线粒体中产生的一氧化氮进行实时原位的检测，急需开发具有线粒体定位功能的一氧化氮荧光探针。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种可以检测线粒体中一氧化氮的高灵敏度荧光探针。

本发明采用的技术方案是：一种检测线粒体中一氧化氮的荧光探针，所述的荧光探针的分子通式是BDP-NO或BDP-NO-T，BDP-NO的结构通式如(Ⅰ)所示，BDP-NO-T的结构通式如(Ⅱ)所示：

其中，R₁＝-H、-CH₂CH₃、-COOC₂H₅、-COOCH₃、-COOCH(CH₃)₃、-COOCH₂Ph、-COOH、-CH₂CH₂COOCH₃、-CH₂CH₂COOCH₂Ph、-CH₂CH₂COOCH(CH₃)₃、-CH₂CH₂COOC₂H₅、或-CH₂CH₂COOH。

上述的BDP-NO荧光探针的制备方法包括如下步骤：将3-硝基-4-氨基苯酚与氟硼吡咯(BODIPY)类化合物(以下简写为BDP-X)加入到四氢呋喃(THF)中，再加入碘化钾和碳酸钾，加热回流反应22-26小时，除去溶剂四氢呋喃，用二氯甲烷为洗脱剂进行硅胶柱层析，得到中间产物；将中间产物溶于四氢呋喃和甲醇的混合液中，在还原剂存在下，反应4-24小时，得到目标产物BDP-NO；或者，在2.5MPa的氢气和催化剂催化下，反应4-24小时，得到目标产物BDP-NO。所述的催化剂为钯碳或雷尼镍，所述的还原剂为铁粉和盐酸的混合物，或氯化亚锡和盐酸的混合物。

上述的BDP-NO-T的制备方法包括如下步骤：将BDP-NO溶于甲醇和水的混合液中，加入饱和一氧化氮水溶液，室温搅拌20-40分钟，以二氯甲烷或甲醇为洗脱剂，经硅胶柱层析，得到目标产物BDP-NO-T。

本发明检测线粒体中一氧化氮的荧光探针的制备反应式如下：

本发明的检测线粒体中一氧化氮的荧光探针可用于生理体系中一氧化氮的检测。主要的用于检测活细胞线粒体中的一氧化氮。所述的活细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株或RAW264.7细胞株。

本发明的有益效果是：本发明的荧光探针能够快速的定位于线粒体中，并能够对其中的一氧化氮进行原位实时的检测，另外，该探针还具有较好的化学、光稳定性，较好的溶解性和生物兼容性，较高的一氧化氮选择性，不受其他活性氧和活性氮等物种的干扰。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。

附图说明

图1是实施例1制备的BDP-NO-1对活性氧ROS、活性氮RON的选择性。

图2是实施例1制备的BDP-NO-1荧光探针对NO水溶液的荧光光谱响应。

图3是实施例1制备的BDP-NO-1荧光探针对RAW264.7细胞内线粒体中一氧化氮的激光共聚焦成像。

具体实施方式

实施例1BDP-NO-1荧光探针和BDP-NO-T1荧光探针

(一)BDP-NO-1荧光探针的制备

将370mg2,4-二甲基吡咯溶于干燥的二氯甲烷中，0℃条件下缓慢滴加217mg氯乙酰氯，氩气保护下，室温搅拌5小时，再缓慢滴加8ml BF₃·OEt₂和4ml三乙胺，继续搅拌5小时，水洗后用无水碳酸钾干燥二氯甲烷，经硅胶柱层析分离提纯，得到BDP-Cl150mg，MS：319。

将100mg的3-硝基-4-氨基苯酚和等摩尔量的氟硼吡咯类化合物BDP-Cl溶解在干燥的THF中，再加入氟硼吡咯类化合物BDP-Cl摩尔量5倍摩尔量的KI和10倍摩尔量的无水碳酸钾，加热回流反应24小时，减压除去溶剂，以二氯甲烷为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的固体180mg，MS:414.1654。

将上步骤所得到的亮黑色化合物100mg,溶于20mL四氢呋喃和甲醇(按体积比，四氢呋喃：甲醇＝5:1)的混合液中，于密闭容器中通入氢气，在2.5MPa的氢气存在下，50mg钯碳(Pd/C)催化下，室温搅拌24小时，得到80mg亮黑色固体BDP-NO-1荧光探针，MS:384.1944。

(二)BDP-NO-T1荧光探针的制备

将上步骤所得到的80mg亮黑色固体BDP-NO-1溶于甲醇和水(按体积比，甲醇：水＝2:1)的混合液中，加入等摩尔量的一氧化氮的饱和水溶液，室温搅拌30分钟，以二氯甲烷为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到85mg红色的固体BDP-NO-T1，MS:395.1710。

实施例2BDP-NO-2荧光探针和BDP-NO-T2荧光探针

(一)BDP-NO-2荧光探针的制备

将370mg3-乙基-2,4-二甲基吡咯溶于干燥的二氯甲烷中，0℃条件下缓慢滴加300mg氯乙酰氯，氩气保护下，室温搅拌5小时，再缓慢滴加8ml BF₃·OEt₂和4ml三乙胺，继续搅拌5小时，水洗后用无水碳酸钾干燥二氯甲烷，经硅胶柱层析分离提纯，得到BDP-2145mg，MS：352。

将100mg的3-硝基-4-氨基苯酚和等摩尔量的氟硼吡咯类化合物BDP-2溶解在干燥的THF中，再加入氟硼吡咯类化合物BDP-2摩尔量5倍摩尔量的KI和10倍摩尔量的无水碳酸钾，加热回流反应24小时，减压除去溶剂，以二氯甲烷为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的固体175mg，MS:470.2301。

将上步骤所得到的亮黑色化合物100mg,溶于20mL四氢呋喃和甲醇(按体积比，四氢呋喃：甲醇＝5:1)的混合液中，于密闭容器中通入氢气，在2.5MPa的氢气，和50mg雷尼镍(Raney Ni)催化下，室温搅拌24小时，得到60mg目标产物BDP-NO-2荧光探针，MS:440.2544。

(二)BDP-NO-T2荧光探针的制备

将上步骤所得50mg的BDP-NO-2溶于甲醇和水(按体积比，甲醇：水＝2:1)的混合液中，加入等摩尔量的一氧化氮饱和水溶液，室温搅拌30分钟，以二氯甲烷为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到55mg红色的固体BDP-NO-T2荧光探针，MS：451.2347。

实施例3BDP-NO-3荧光探针和BDP-NO-T3荧光探针

(一)BDP-NO-3荧光探针的制备

将370mg2,4-二甲基-3-甲氧酰基吡咯溶于干燥的二氯甲烷中，0℃条件下缓慢滴加250mg氯乙酰氯，氩气保护下，室温搅拌5小时，再缓慢滴加8ml BF3·OEt2和4ml三乙胺，继续搅拌5小时，水洗后用无水碳酸钾干燥二氯甲烷，经硅胶柱层析分离提纯，得到BDP-3150mg，MS：412。

将100mg的3-硝基-4-氨基苯酚和等摩尔量的氟硼吡咯类化合物BDP-3溶解在干燥的THF中，再加入氟硼吡咯类化合物BDP-3摩尔量5倍摩尔量的KI和10倍摩尔量的无水碳酸钾，加热回流反应24小时，减压除去溶剂，以二氯甲烷为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的固体140mg，MS:530.1782。

将上步骤所得到的亮黑色化合物100mg,溶于20mL四氢呋喃和甲醇(按体积比，四氢呋喃：甲醇＝5:1)的混合液中，加入100mg铁粉与2mL盐酸，0℃反应4小时，得到76mg目标产物BDP-NO-3，MS:500.2021。

(二)BDP-NO-T3荧光探针的制备

将上步骤所得70mg的BDP-NO-3溶于甲醇和水(按体积比，甲醇：水＝2:1)的混合液中，加入等摩尔量一氧化氮水溶液，室温搅拌30分钟，以二氯甲烷为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到60mg红色的固体BDP-NO-T3荧光探针，MS：511.1672。

实施例4BDP-NO-4荧光探针和BDP-NO-T4荧光探针

(一)BDP-NO-4荧光探针的制备

将370mg2,4-二甲基-3-甲氧酰乙基吡咯溶于干燥的二氯甲烷中，0℃条件下缓慢滴加320mg氯乙酰氯，氩气保护下，室温搅拌5小时，再缓慢滴加8ml BF3·OEt2和4ml三乙胺，继续搅拌5小时，水洗后用无水碳酸钾干燥二氯甲烷，经硅胶柱层析分离提纯，得到BDP-4167mg，MS：468。

将100mg的3-硝基-4-氨基苯酚和等摩尔量的氟硼吡咯类化合物BDP-4溶解在干燥的THF中，再加入氟硼吡咯类化合物BDP-4摩尔量5倍摩尔量的KI和10倍摩尔量的无水碳酸钾，加热回流反应24小时，减压除去溶剂，以二氯甲烷为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的固体100mg，MS:586.2439。

将上步骤所得到的亮黑色固体90mg,溶于20mL四氢呋喃和甲醇(按体积比，四氢呋喃：甲醇＝5:1)的混合液中，加入100mg SnCl₂和3mL浓HCl，0℃反应4小时，得到56mg目标产物BDP-NO-4，MS:556.2413。

(二)BDP-NO-T4荧光探针的制备

将上步骤所得50mg的BDP-NO-4溶于甲醇和水(按体积比，甲醇：水＝2:1)的混合液中，加入等摩尔量一氧化氮水溶液，室温搅拌30分钟，以甲醇为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到50mg红色的固体BDP-NO-T4荧光探针，MS：567.2312。

实施例5BDP-NO-5荧光探针和BDP-NO-T5荧光探针

(一)BDP-NO-5荧光探针的制备

将370mg2,4-二甲基-3-羧基吡咯溶于干燥的二氯甲烷中，0℃条件下缓慢滴加230mg氯乙酰氯，氩气保护下，室温搅拌5小时，再缓慢滴加8ml BF3·OEt2和4ml三乙胺，继续搅拌5小时，水洗后用无水碳酸钾干燥二氯甲烷，经硅胶柱层析分离提纯，得到BDP-5134mg，MS：384。

将100mg的3-硝基-4-氨基苯酚和等摩尔量的氟硼吡咯类化合物BDP-5溶解在干燥的THF中，再加入氟硼吡咯类化合物BDP-5摩尔量5倍摩尔量的KI和10倍摩尔量的无水碳酸钾，加热回流反应24小时，减压除去溶剂，以甲醇为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的固体120mg，MS:502.1421。

将上步骤所得到的亮黑色化合物100mg,溶于20mL四氢呋喃和甲醇(按体积比，四氢呋喃：甲醇＝5:1)的混合液中，于密闭容器中通入氢气，在2.5MPa的氢气，和50mg钯碳(Pd/C)催化下，室温搅拌24小时，得到58mg目标产物BDP-NO-5荧光探针，MS:472.1730。

(二)BDP-NO-T5荧光探针的制备

将上步骤所得50mg的BDP-NO-5溶于甲醇和水(按体积比，甲醇：水＝2:1)的混合液中，加入等摩尔量一氧化氮水溶液，室温搅拌30分钟，以甲醇为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到52mg红色的固体BDP-NO-T5荧光探针，MS：483.1542。

实施例6BDP-NO-6荧光探针和BDP-NO-T6荧光探针

(一)BDP-NO-6荧光探针的制备

将370mg2,4-二甲基-3-羧丙基吡咯溶于干燥的二氯甲烷中，0℃条件下缓慢滴加250mg溴乙酰氯，氩气保护下，室温搅拌5小时，再缓慢滴加8ml BF3·OEt2和4ml三乙胺，继续搅拌5小时，水洗后用无水碳酸钾干燥二氯甲烷，经硅胶柱层析分离提纯，得到BDP-6112mg，MS：484。

将100mg的3-硝基-4-氨基苯酚和等摩尔量的氟硼吡咯类化合物BDP-6溶解在干燥的THF中，再加入氟硼吡咯类化合物BDP-6摩尔量5倍摩尔量的KI和10倍摩尔量的无水碳酸钾，加热回流反应24小时，减压除去溶剂，以甲醇为展开剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的固体130mg，MS:558.2132。

将上步骤所得到的亮黑色化合物100mg,溶于20mL四氢呋喃和甲醇(按体积比，四氢呋喃：甲醇＝5:1)的混合液中，于密闭容器中通入氢气，在2.5MPa的氢气，和50mg钯碳(Pd/C)催化下，室温搅拌24小时，得到78mg目标产物BDP-NO-6荧光探针，MS:528.1425。

(二)BDP-NO-T6荧光探针的制备

将上步骤所得70mg的BDP-NO-6溶于甲醇和水(按体积比，甲醇：水＝2:1)的混合液中，加入等摩尔量一氧化氮水溶液，室温搅拌30分钟，以甲醇为洗脱剂，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到68mg红色的固体BDP-NO-T6荧光探针，MS：539.2154。

实施例7BDP-NO-1(实施例1制备)荧光探针对活性氧ROS和活性氮RON的选择性检测

配制浓度为10uM的BDP-NO-1溶液(乙醇/NaH₂PO₄缓冲溶液,体积比1:4,pH＝7.4),加入100倍摩尔当量的不同活性氧(H₂0₂、·OH、¹O₂)和活性氮(NO、NO₃ ^-、NO₂ ^-、ONOO^-)的水溶液，分别进行荧光分光光度法测试，并绘制BDP-NO-1对不同活性氧和活性氮水溶液响应的荧光光谱，然后取530nm处的荧光强度作为纵坐标，以不同的活性氧和活性氮作为横坐标作图，结果如图1所示。

BDP-NO-1表现出对NO较高的选择性和光谱响应，当加入100倍摩尔量的NO水溶液后，荧光明显增强，荧光增加大约30倍；其他活性氧和活性氮的加入并未引起荧光强度发生任何变化，这表明BDP-NO-1能够从其他活性氧和活性氮中区分并检测一氧化氮。

实施例8BDP-NO-1(实施例1制备)对NO水溶液的荧光光谱响应

配制浓度为10uM的BDP-NO-1溶液(乙醇/NaH₂PO₄缓冲溶液,体积比1:4,pH＝7.4),加入不同摩尔量的NO水溶液(1uM、3uM、5uM、7uM、9uM、11uM、15uM)，分别进行荧光分光光度法测试，并绘制BDP-NO-1对不同浓度的NO水溶液响应的荧光光谱，结果如图2所示。

BDP-NO-1表现出对NO快速的光谱响应，随着NO浓度的增加，溶液荧光不断增强。当加入5uM的NO后，溶液呈现出较强的绿色荧光。结果表明BDP-NO-1能够用于对NO实时在线的监测。

实施例9BDP-NO-1对线粒体中NO的荧光显微成像

向含有RAW264.7细胞株的培养皿中，加入浓度为0.05-0.1M的BDP-NO-1的二甲基亚砜溶液，与细胞培养液混合均匀后，使BDP-NO-1在培养液中的终浓度达到10uM。染色5min后，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液进行清洗三次，然后将该培养皿置于37℃恒温培养箱中进行孵育24小时，最后将该培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。结果如图3所示。

实验结果发现，染有BDP-NO-1的细胞线粒体中呈现出较强的绿色荧光，实验结果表明BDP-NO-1具有较好的细胞膜透过性，能够定位于细胞的线粒体中。BDP-NO-1能够用于线粒体中内源性的NO进行检测。

Claims

1.一种检测线粒体中一氧化氮的荧光探针，其特征在于：所述的荧光探针的分子通式是BDP-NO或BDP-NO-T，BDP-NO的结构通式如(Ⅰ)所示，BDP-NO-T的结构通式如(Ⅱ)所示：

其中，R₁＝-H、-CH₂CH₃、-COOC₂H₅、-COOCH₃、-COOCH₂Ph、-COOH、-CH₂CH₂COOCH₃、-CH₂CH₂COOCH₂Ph、-CH₂CH₂COOC₂H₅、或-CH₂CH₂COOH。

2.如权利要求1所述的检测线粒体中一氧化氮的荧光探针，其特征在于：所述的BDP-NO荧光探针的制备方法包括如下步骤：将3-硝基-4-氨基苯酚和氟硼吡咯类化合物加入到四氢呋喃中，再加入KI和碳酸钾，加热回流反应22-26小时，除去溶剂，用二氯甲烷或甲醇为洗脱剂进行硅胶柱层析，得到中间产物；将中间产物溶于四氢呋喃和甲醇的混合液中，在还原剂存在下，反应4-24小时，得到目标产物BDP-NO；或者，在2.5MPa的氢气和催化剂催化下，反应4-24小时，得到目标产物BDP-NO。

3.如权利要求2所述的检测线粒体中一氧化氮的荧光探针，其特征在于：所述的催化剂为钯碳或雷尼镍；所述的还原剂为铁粉和盐酸的混合物，或氯化亚锡和盐酸的混合物。

4.如权利要求1所述的检测线粒体中一氧化氮的荧光探针，其特征在于：所述的BDP-NO-T的制备方法包括如下步骤：将BDP-NO溶于甲醇和水的混合液中，加入饱和一氧化氮水溶液，室温搅拌20-40分钟，以二氯甲烷或甲醇为洗脱剂，经硅胶柱层析，得到目标产物BDP-NO-T。