CN103320122A

CN103320122A - 一种用于NO检测的大Stokes位移荧光探针及其合成方法

Info

Publication number: CN103320122A
Application number: CN2013102835580A
Authority: CN
Inventors: 王红; 张华山; 陈建波; 郭小峰
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2013-07-05
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-07-05
Also published as: CN103320122B

Abstract

本发明公开一种用于一氧化氮检测的荧光探针及其制备方法，属于生物检测技术领域。本发明探针为4,4-二氟-8-(3’,4’-二氨基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷（p-MOPB），其突出特点是：红色荧光（620nm）、大Stokes位移（38nm）、光稳定性好，在分析检测中能够避免生物样品自身荧光和散射光的干扰。本发明所述荧光探针可用于化学、生物、医学等样品中NO的定量分析与荧光成像。

Description

一种用于NO检测的大Stokes位移荧光探针及其合成方法

技术领域

本发明涉及一种用于NO检测的大Stokes位移荧光探针及其制备方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

NO作为活性氧自由基和活性氮自由基的核心和本源，广泛参与动植物的生理和病理过程。NO作为血管舒张因子，促进血管舒张和降低血压；作为信使分子，涉及神经信号的传递，具有加强记忆和增强学习能力。同时NO还参与免疫防护、调节炎症和抑制肿瘤细胞扩散等。对植物而言，NO打破种子的休眠、促进根部的发育、诱导叶的生长、延缓果实的成熟等，同时还参与干旱、机械损伤、抗病虫害等生物或非生物胁迫反应。因此，NO的检测在生物、医学等领域具有重要意义。

荧光探针在分析检测上具有专一性好、选择性高和识别响应快的特点；荧光探针在化学结构上易于设计、修饰和改进，能满足不同检测对象的需要；同时，荧光探针可与荧光光度计、高效液相色谱、毛细管电泳和高分辨显微镜结合，不仅提高分析检测的灵敏度和选择性，还能提供荧光成像和三维时空分布，极大拓宽了荧光探针的应用范围，非常适合NO的生物医学分析。

二氟化硼二吡咯甲烷（Boron dipyrromethene，简称BODIPY）作为有机小分子荧光探针的一员，不但秉承了有机小分子的较低生物毒性和良好的细胞膜透过性，而且还具有荧光量子产率高、光稳定性好、摩尔吸光系数大、不易受溶剂和pH值的影响等优点，在荧光标记和生物成像领域有着广阔的应用前景。然而，现有的BODIPY类荧光探针激发和发射大多处于可见光光谱区域（500-550nm），而且探针的Stokes位移一般只有10nm左右。在可见光谱区域，生物样品有较强的背景荧光和自吸收，会给检测与成像带来干扰，影响测量的准确性。同时，可见光的波长较短，在荧光成像中的辐射能量较大，易造成细胞和生物组织的光损伤。另外，探针的Stokes位移太小，会导致其吸收光谱和发射光谱的较大重叠，从而产生自吸收和散射光干扰。因此，发展激发和发射波长在长波长区域（600-900nm）、且Stokes位移较大的BODIPY荧光探针，在保持BODIPY固有优势的基础上，可克服以上不足，在NO的定量分析与荧光成像领域具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种红色荧光和大Stokes位移的BODIPY类NO荧光探针。

一种大Stokes位移NO荧光探针，其结构如下所示：

上述结构中，3,4-二氨基苯基可与NO发生反应，生成三氮唑类衍生产物。

本发明还提供上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）3,4-二硝基苯甲酰氯溶于1,2-二氯乙烷，在氮气保护下缓慢滴加2-(4-甲氧基苯基)-1氢-吡咯的1,2-二氯乙烷溶液，混合溶液加热回流；冷却至室温后，加入三乙胺，室温搅拌，接着加入三氟化硼乙醚，在氮气保护下加热回流；旋转蒸发除去有机溶剂，将得到的固体经硅胶柱层析纯化，得到蓝色固体4,4-二氟-8-(3’,4’-二硝基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷，其结构如下：

（2）在氮气保护下，4,4-二氟-8-(3’,4’-二硝基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷溶于乙醇，加入钯碳催化剂和水合肼，加热回流，冷却至室温，过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，粗产物经硅胶柱层析纯化，得到蓝色固体4,4-二氟-8-(3’,4’-二氨基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷p-MOPB。

本发明提供的探针基于BODIPY结构，其荧光性质具有BODIPY的特性，即光稳定性好、对pH和溶剂等均不敏感，同时探针与NO的衍生速度快，条件温和，非常适合液相色谱、毛细管电泳和荧光显微镜分析检测生物样品中NO的定量分析与荧光成像。

本发明提供的荧光探针可以用于化学样品、生物样品或医学样品中NO的定量分析与荧光成像。

本发明提供的探针，突出优点是：

1.BODIPY类荧光探针的荧光发射波长大多位于500nm附近，但基于BODIPY的本探针与NO衍生产物的荧光波长长，达到620nm，有利于避免生物样品背景荧光的干扰。

2.BODIPY类荧光探针的Stokes位移仅有10nm，但基于BODIPY的本探针与NO衍生产物Stokes的位移达到38nm，有利于避免分析检测中的散射光干扰。

3.合成简单，便于推广应用。

附图说明

图1.p-MOPB的合成路线。

图2.p-MOPB及其与NO反应产物的荧光光谱。a和b分别为p-MOPB的激发和发射光谱，A和B分别为NO反应产物的激发和发射光谱。

图3.p-MOPB的NO衍生产物的光稳定性。

图4.小鼠全血样品中NO衍生产物的色谱分离图。（a）小鼠全血样品，激发/发射波长为582/620nm；（b）小鼠全血样品加入探针p-MOPB，激发/发射波长为582/620nm；（c）小鼠全血样品，激发/发射波长为495/505nm。峰1：NO衍生产物。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的作进一步描述，仅在于说明本发明而决不限制本发明。

实施例1p-MOPB的合成。

400mg3,4-二硝基苯甲酰氯（1.73mmol）溶于100mL1,2-二氯乙烷，在氮气保护下缓慢滴加600mg2-(4-甲氧基苯基)-1氢-吡咯（3.47mmol）的20mL1,2-二氯乙烷溶液，混合溶液加热回流48h。冷却至室温后，加入0.72mL三乙胺（5.19mmol），室温搅拌10min，接着加入1.1mL三氟化硼乙醚（8.71mmol），在氮气保护下加热回流30min。旋转蒸发除去有机溶剂，将得到的固体经硅胶柱层析纯化（淋洗剂：石油醚/二氯甲烷/乙酸乙酯=2/1/0.3），得到蓝色固体4,4-二氟-8-(3’,4’-二硝基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷362mg（产率为36.7%）。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ8.55(s,1H),8.42(d,J=8.2Hz,1H),8.25(dd,J=8.2,1.7Hz,1H),7.91(d,J=8.8Hz,4H),7.07(t,J=6.9Hz,6H),6.94(d,J=4.4Hz,2H),3.84(s,6H)。¹³C NMR(150MHz,DMSO)δ161.46159.25,143.44,142.37,139.70,137.10,136.03,131.68,128.14,126.49,124.75,122.48,114.65,56.05。

在氮气保护下，100mg4,4-二氟-8-(3’,4’-二硝基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷（0.18mmol）溶于20mL乙醇，加入45mg10%钯碳催化剂和1mL水合肼（20mmol），加热回流1h后，冷却至室温，过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，粗产物经硅胶柱层析纯化（淋洗剂：二氯甲烷/甲醇=50/1），得到72mg蓝色固体4,4-二氟-8-(3’,4’-二氨基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷p-MOPB（产率为80%）。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ7.77(d,J=8.8Hz,4H),7.06(d,J=4.2Hz,2H),7.01(d,J=8.8Hz,4H),6.94(s,1H),6.81(d,J=8.0Hz,1H),6.77(d,J=4.1Hz,2H),6.70(d,J=7.9Hz,1H),5.42(s,2H),4.85(s,2H),3.81(s,6H)。¹³CNMR(150MHz,DMSO)δ160.71,155.79,145.88–144.87,140.38,135.65,131.40,125.74,123.22,114.37,55.93。HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₉H₂₄BF₂N₄O₂([M-H]^-):509.1966.Found:509.1952。

实施例2p-MOPB的荧光性质。

p-MOPB及其NO衍生产物的荧光光谱如图2所示，由于光诱导电子转移机理，荧光团的荧光受到抑制，荧光探针自身几乎没有荧光；当与NO反应生成三氮唑后，有明显荧光增强，其激发/发射波长为582/620nm，Stokes位移为38nm。由图3可以看出，在120W汞灯持续照射下，探针的NO衍生产物的荧光强度3h降低了1.0%，但在10h内始终保持在95.9%以上。研究表明，探针有足够好的光稳定性，完全能经受较长时间的强光照射并满足生物样品荧光成像的需要。

实施例3p-MOPB柱前衍生高效液相色谱分离荧光检测小鼠全血样品中的NO。

以p-MOPB为柱前衍生荧光探针，建立了高效液相色谱分离荧光检测小鼠全血和脑皮质组织中NO含量的分析方法。荧光探针p-MOPB与NO在pH9.0磷酸盐缓冲溶液中30℃时9min即可反应完全。在Kromasil C₁₈色谱柱上，流动相为甲醇:缓冲溶液=90:10（v/v，缓冲溶液：0.1M,pH4.5H₃Cit-NaOH）时，4min分离。线性范围为5.0×10^-9M–1.0×10^-6M；信噪比S/N=3时，检测限（LOD）达到0.3nM；方法的加标回收率在96.5–98.7%之间，R.S.D.(n=6)为1.92-3.17%。该方法具有灵敏度高、分离体系简单、分离时间短、衍生速度快等优点，可有效消除散射光和生物样品背景荧光的干扰，获得干净、基线平坦的样品色谱分析图，在复杂生物样品分析中显示了极大的潜力。

Claims

1.一种用于NO检测的荧光探针，其结构如下：

2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）3,4-二硝基苯甲酰氯溶于1,2-二氯乙烷，在氮气保护下缓慢滴加2-(4-甲氧基苯基)-1氢-吡咯的1,2-二氯乙烷溶液，混合溶液加热回流；冷却至室温后，加入三乙胺，室温搅拌，接着加入三氟化硼乙醚，在氮气保护下加热回流；旋转蒸发除去有机溶剂，将得到的固体经硅胶柱层析纯化，得到蓝色固体4,4-二氟-8-(3’,4’-二硝基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷；

3.权利要求1所述荧光探针用于化学样品、生物样品或医学样品中NO的定量分析与荧光成像。