JP2007070308A - 動的カチオン感受性部位を挿入した新規ヌクレオシド誘導体 - Google Patents
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- 0 CP(N(*)*)O* Chemical compound CP(N(*)*)O* 0.000 description 1
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Abstract
Description
本発明は、動的カチオン感受性部位を挿入した新規ヌクレオシド誘導体に関する。この新規ヌクレオシド誘導体は、相補的DNAが存在する時のみ蛍光や電気化学応答を示すDNAの合成などに利用可能である。
プローブDNAとターゲットDNAのハイブリダイゼーションを利用したDNA検出技術は遺伝子診断、遺伝子検出、遺伝子解析などの分野で有用である。これらの技術には、ターゲットDNAもしくはプローブDNAを蛍光物質もしくは電気化学活性物質でラベル化する方法が用いられる。
しかし、ターゲットDNAをラベルするには生体内より抽出したDNAやRNAのサンプルをPCR法や逆転写法を用いてcDNAやcRNAに変換する必要があり、金銭的ならびに時間的にコストを要する。またこれらの酵素反応には別途合成したラベル化DNAプライマーを準備しなければならず、これも高コストの原因になる。
一方、電気化学的検出においては、ターゲットをラベル化することなく、非標識のプローブとターゲットをハイブリダイゼーションさせた後、二重鎖選択的電気化学リガンドを結合させ、それに由来する電気化学シグナルを検出する方法もある。しかし、この手法では一組のプローブ/ターゲット二重鎖に複数のリガンドが不定数個結合するため、複数の遺伝子の発現を解析する場合には定量的な評価ができない。
以上の問題を解決するには用いるプローブDNAを蛍光物質もしくは電気化学活性物質で標識し、それに由来するシグナルを検出することが最適である。しかし、この方法の問題点は、プローブDNAからターゲットDNAの存在の有無に無関係にシグナルが発せされる点にある。
従って、この目的のためには、ターゲットDNAが存在する時のみに、蛍光シグナルもしくは電気化学シグナルを発する新しいプローブDNAの開発が必要である。
これまでにも、このような性質を有するプローブDNAはいくつか報告がある。例えば、ヘアピン型DNAプローブを用いた例が報告されている(非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3)。しかし、この手法ではプローブがヘアピン構造を形成する必要があるために分子内に相補的な配列を持たなければならず、用いるDNA配列に制限が生じる。
Molecular beacons, Weihong Tan , Kemim Wang and Timothy J Drake, Current Opinion in Chemical Biology, 2004, 8, 547-553
Molecular beacon DNA probes and their bioanalytical applications, Timothy J. Drake and Weihong Tan, APPLIED SPECTROSCOPY, 2004, 58, 269A-280A
Stem-loop oligonucleotides: a robust tool for molecular biology and biotechnology, Natalia E.Broude, TRENDS in Biotechnology, Vol.20, 2002
本発明は、任意のターゲット配列に対して、ターゲットDNAが存在する時のみに、蛍光シグナルもしくは電気化学シグナルを発する新しいプローブDNAを開発を目的とする。
本発明者は、上記目的を達成するために、鋭意検討を重ねた結果、蛍光物質または電気化学的に活性な物質にカチオン結合部位を結合した物質は、適当なカチオンが結合した時のみで蛍光を発したり、特徴的な電気化学応答を示すことに着目した。
そこで、プローブDNAをカチオン結合部位を有する蛍光物質もしくは電気化学的に活性な物質で修飾し、さらにこのカチオン結合部位がターゲットDNAの存在下でのみ、カチオン結合能を有するように設計すれば、このプローブDNAとターゲットとのハイブリダイゼーションを適当なカチオンの存在下行うことで、所望のハイブリダイゼーション応答性の蛍光シグナルや電気化学シグナルが検出できると考えた。
これら着想を実現するために、さらに検討を重ね、カチオン結合部位を有するプローブDNAとして、DNAバックボーンそのものをカチオン結合性構造に置き換えた新規DNAを用いれば、プローブとターゲットとのハイブリダイゼーションに伴い、この部分の構造が変化し、カチオン結合性が増大すると考え、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の(1)〜(16)を提供するものである。
(1)一般式(I)
で表わされる基を表わし、nは1から5の整数を表わし、各nに対応してXnは同一または異なって酸素原子、硫黄原子、又は一般式(III)
で表わされる基を表わし、B1、B2は同一または異なって保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。〕
で表わされる化合物。
(2)一般式(I)におけるR1が、水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、4−メトキシトリチル基、又は4,4’−ジメトキシトリチル基を表わすことを特徴とする(1)に記載の化合物。
(3)一般式(I)におけるR1が、4,4’−ジメトキシトリチル基を表わすことを特徴とする(1)に記載の化合物。
(4)一般式(I)におけるR2が、水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、又はトリイソプロピルシリル基を表わすことを特徴とする(1)乃至(3)のいずれかに記載の化合物。
(5)一般式(I)におけるR2が、水素原子、又はtert−ブチルジメチルシリル基を表わすことを特徴とする(1)乃至(3)のいずれかに記載の化合物。
(6)一般式(II)におけるR3が、メチル基、2−シアノエチル基、4−ニトロフェニルエチル基、又はトリメチルシリルエチル基を表わすことを特徴とする(1)乃至(3)のいずれかに記載の化合物。
(7)一般式(II)におけるR3が、2−シアノエチル基を表わすことを特徴とする(1)乃至(3)のいずれかに記載の化合物。
(8)一般式(II)におけるR4、R5が、エチル基、イソプロピル基、又はR4、R5が互いに結合して窒素原子ともに、ピロリジン−1−イル基、モルホリン−1−イル基、もしくはピペリジン−1−イル基を形成する基を表わすことを特徴とする(1)乃至(3)のいずれかに記載の化合物。
(9)一般式(II)におけるR4、R5が、イソプロピル基を表わすことを特徴とする(1)乃至(3)のいずれか一項に記載の化合物。
(10)一般式(I)におけるnが4であり、X1及びX4が一般式(IV)
(11)一般式(I)におけるnが4であり、X1、X4のいずれかが一般式(IV)
(12) 一般式(I)におけるnが4であり、X1が一般式(IV)
(13)一般式(I)におけるB1、B2が、同一又は異なってチミン−1−イル基、シトシン−1−イル基、アデニン−9−イル基、グアニン−9−イル基、又はウラシル−1−イル基〔但し、チミンまたはウラシルの3位のアミノ基、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンのアミド部位の6−O酸素もしくは2位のアミノ基にアシル基、又はアリールカルバモイル基を有していてもよく、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンの2位のアミノ基にジアルキルアミノメチレン基、又はジアルキルアミノエチレン基を有していてもよい。〕を表わすことを特徴とする(1)乃至(12)のいずれかに記載の化合物。
(14)一般式(I)におけるB1、B2が、同一又は異なってチミン−1−イル基、シトシン−1−イル基、アデニン−9−イル基、グアニン−9−イル基、又はウラシル−1−イル基〔但し、チミンまたはウラシルの3位のアミノ基、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンのアミド部位の6−O酸素もしくは2位のアミノ基にアセチル基、ベンゾイル基、フェノキシアセチル基、(4−tert−ブチルフェニル)オキシアセチル基、(4−イソプロピルフェニル)オキシアセチル基、又は2−ニトロフェニルカルバモイル基を有してもよく、また、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンの2位のアミノ基にジメチルアミノメチレン基、又はジメチルアミノエチレン基を有していてもよい。〕を表わすことを特徴とする(1)乃至(12)のいずれかに記載の化合物。
(15)一般式(I)におけるB1、B2がチミン−1−イル基を表わすことを特徴とする(1)乃至(12)のいずれかに記載の化合物。
(16)一般式(I)
本発明の化合物を含むDNAとターゲットDNAもしくはターゲットRNAとを適当なカチオンの存在下で共存させ、ハイブリダイゼーションによって発せされる特徴的な蛍光シグナルもしくは電気化学シグナルを指標としてターゲットDNA等を検出することができる。これにより遺伝子検出、遺伝子診断、遺伝子解析を迅速かつ高感度に行うことができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
上記一般式(I)において、R1は、アシル基、同一または異なる3つの置換基を有してもよいシリル基、アリール基上に同一または異なる置換基を有してもよいトリアリールメチル基、アルキル基上に置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、アリール基上に置換基を有してもよいアリールオキシカルボニル基、アリール基上に同一または異なる置換基を有してもよいトリアリールメチルチオ基を表わす。ここで、アシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピル基、ブチリル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、ベンゾイル基などを例示でき、イソプロピル基などのように分岐構造を有するものや、シクロヘキシルカルボニル基などのように環構造を有するものも含まれる。同一または異なる3つの置換基を有してもよいシリル基としては、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基などを例示できる。アリール基上に同一または異なる置換基を有してもよいトリアリールメチル基としては、4−メトキシトリチル基、4,4’−ジメトキシトリチル基を例示できる。アルキル基上に置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基としては、2−シアノエトキシカルボニル基、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル基を例示できる。アリール基上に置換基を有してもよいアリールオキシカルボニル基としては、フェノキシカルボニル基、ニトロフェニルオキシカルボニル基を例示できる。アリール基上に同一または異なる置換基を有してもよいトリアリールメチルチオ基としては、トリチルチオ基、4−メトキシトリチルチオ基を例示できる。R1は、好適には、水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、4−メトキシトリチル基、又は4,4’−ジメトキシトリチル基を表わし、より好適には、4,4’−ジメトキシトリチル基を表わす。
上記一般式(I)において、R2は水素原子、アシル基、同一または異なる3つの置換基を有してもよいシリル基、アリール基上に同一または異なる置換基を有してもよいトリアリールメチル基、アルキル基上に置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、アリール基上に置換基を有してもよいアリールオキシカルボニル基、アリール基上に同一または異なる置換基を有してもよりトリアリールメチルチオ基、又は一般式(II)で表わされる基を表わす。アシル基、同一または異なる3つの置換基を有してもよいシリル基、アリール基上に同一または異なる置換基を有してもよいトリアリールメチル基、アルキル基上に置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、アリール基上に置換基を有してもよいアリールオキシカルボニル基、及びアリール基上に同一または異なる置換基を有してもよいトリアリールメチルチオ基の意味は上記と同様である。R2は、好適には、水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、又は一般式(II)で表される基を表わし、より好適には、水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、又は一般式(II)で表される基を表わす。
上記一般式(I)において、nは1から5の整数を表わし、各nに対応してXnは同一または異なって酸素原子、硫黄原子、又は一般式(III)で表わされる基を表わす。nは、好適には、4であり、この場合、X1〜X4は、好適には、(1)X1及びX4が一般式(IV)で表わされる基を表わし、X2及びX3が酸素原子を表わすか、(2)X1、X4のいずれかが一般式(IV)で表わされる基を表わし、他方が一般式(V)で表わされる基を表わし、X2及びX3が酸素原子を表わす。なお、Xnの番号は、一般式(I)における上側に位置するヌクレオシド誘導体から近い順に付すものとする。
上記一般式(I)において、B1、B2は同一または異なって保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。B1、B2は、好適には、同一または異なってチミン−1−イル基、シトシン−1−イル基、アデニン−9−イル基、グアニン−9−イル基、又はウラシル−1−イル基〔但し、チミンまたはウラシルの3位のアミノ基、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンのアミド部位の6−O酸素もしくは2位のアミノ基にアシル基、又はアリールカルバモイル基を有していてもよく、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンの2位のアミノ基にジアルキルアミノメチレン基、又はジアルキルアミノエチレン基を有していてもよい。〕を表わし、より好適には、同一又は異なってチミン−1−イル基、シトシン−1−イル基、アデニン−9−イル基、グアニン−9−イル基、又はウラシル−1−イル基〔但し、チミンまたはウラシルの3位のアミノ基、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンのアミド部位の6−O酸素もしくは2位のアミノ基にアセチル基、ベンゾイル基、フェノキシアセチル基、(4−tert−ブチルフェニル)オキシアセチル基、(4−イソプロピルフェニル)オキシアセチル基、又は2−ニトロフェニルカルバモイル基を有してもよく、また、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンの2位のアミノ基にジメチルアミノメチレン基、又はジメチルアミノエチレン基を有していてもよい。〕を表わし、更に好適には、チミン−1−イル基を表わす。
上記一般式(II)において、R3は置換基を有してもよいアルキル基を表わす。R3は、好適には、メチル基、2−シアノエチル基、4−ニトロフェニルエチル基、又はトリメチルシリルエチル基を表わし、より好適には、2−シアノエチル基を表わす。
上記一般式(II)において、R4、R5は置換基を有してもよい同一または異なるアルキル基を表わし、また、R4、R5の置換基が互いに結合して環を形成してもよい。R4、R5は、好適には、エチル基、イソプロピル基、又はR4、R5が互いに結合して窒素原子ともに、ピロリジン−1−イル基、モルホリン−1−イル基、もしくはピペリジン−1−イル基を形成する基を表わし、より好適にはイソプロピル基を表わす。
一般式(III)において、R6は水素原子、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、アリールアルキル基を表わす。ここで、置換基を有してもよいアシル基としては、トリフルオロアセチル基を例示でき、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基としては、2−シアノエトキシカルボニル基を例示でき、置換基を有してもよいアリールアルキル基としては、9−アントラセニルメチル基、1−ピレニルメチル基を例示できる。R6は、好適には、トリフルオロアセチル基、9−アントラセニルメチル基を表わす。
一般式(I)で表わされる化合物の中で好適なものとしては、例えば、以下の(1)〜(6)の化合物を挙げることができる。
(1)一般式(I)において、R1が水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、4−メトキシトリチル基、又は4,4’−ジメトキシトリチル基を表わし、R2が水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、又は一般式(II)(一般式(II)中、R3はメチル基、2−シアノエチル基、4−ニトロフェニルエチル基、トリメチルシリルエチル基を表わし、R4、R5はエチル基、イソプロピル基、R4、R5が互いに結合して窒素原子ともに、ピロリジン−1−イル基、モルホリン−1−イル基、ピペリジン−1−イル基を形成する基を表わす。)で表わされる基を表わし、nが1からの5の整数を表わし、各nに対応してXnが同一または異なって、酸素原子、硫黄原子、又は一般式(III)(一般式(III)中、R6は水素原子、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、又は置換基を有してもよいアリールアルキル基を表わす。)で表わされる基を表わし、B1、B2が同一又は異なってチミン−1−イル基、シトシン−1−イル基、アデニン−9−イル基、グアニン−9−イル基、又はウラシル−1−イル基〔但し、チミンまたはウラシルの3位のアミノ基、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンのアミド部位の6−O酸素もしくは2位のアミノ基にアセチル基、ベンゾイル基、フェノキシアセチル基、(4−tert−ブチルフェニル)オキシアセチル基、(4−イソプロピルフェニル)オキシアセチル基、又は2−ニトロフェニルカルバモイル基を有してもよく、また、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンの2位のアミノ基にジメチルアミノメチレン基、又はジメチルアミノエチレン基を有していてもよい。〕を表わす化合物。
(2)一般式(I)において、R1が水素原子、又は4,4’−ジメトキシトリチル基を表わし、R2が水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、又は一般式(II)(一般式(II)中、R3は2−シアノエチル基を表わし、R4、R5はイソプロピル基を表わす。)で表わされる基を表わし、nが4であり、X1、X4が一般式(IV)で表わされる基を表わし、X2、X3が酸素原子を表わし、B1、B2が、同一又は異なってチミン−1−イル基、シトシン−1−イル基、アデニン−9−イル基、グアニン−9−イル基、又はウラシル−1−イル基〔但し、チミンまたはウラシルの3位のアミノ基、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンのアミド部位の6−O酸素もしくは2位のアミノ基にアセチル基、ベンゾイル基、フェノキシアセチル基、(4−tert−ブチルフェニル)オキシアセチル基、(4−イソプロピルフェニル)オキシアセチル基、又は2−ニトロフェニルカルバモイル基を有してもよく、また、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンの2位のアミノ基にジメチルアミノメチレン基、又はジメチルアミノエチレン基を有していてもよい。〕を表わす化合物。
(3)一般式(I)において、R1が水素原子、又は4,4’−ジメトキシトリチル基を表わし、R2が水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、又は一般式(II)(一般式(II)中、R3は2−シアノエチル基を表わし、R4、R5はイソプロピル基を表わす。)で表わされる基を表わし、nが4であり、X1、X4のいずれかが一般式(IV)で表わされる基を表わし、他方が一般式(V)で表わされる基を表わし、X2、X3が酸素原子を表わし、B1、B2が、同一又は異なってチミン−1−イル基、シトシン−1−イル基、アデニン−9−イル基、グアニン−9−イル基、又はウラシル−1−イル基〔但し、チミンまたはウラシルの3位のアミノ基、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンのアミド部位の6−O酸素もしくは2位のアミノ基にアセチル基、ベンゾイル基、フェノキシアセチル基、(4−tert−ブチルフェニル)オキシアセチル基、(4−イソプロピルフェニル)オキシアセチル基、又は2−ニトロフェニルカルバモイル基を有してもよく、また、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンの2位のアミノ基にジメチルアミノメチレン基、又はジメチルアミノエチレン基を有していてもよい。〕を表わす化合物。
(4)一般式(I)において、R1が水素原子、又は4,4’−ジメトキシトリチル基を表わし、R2が水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、又は一般式(II)(一般式(II)中、R3は2−シアノエチル基を表わし、R4、R5はイソプロピル基を表わす。)で表わされる基を表わし、nが4であり、X1、X4が一般式(IV)であらわされる基を表わし、X2、X3が酸素原子をあらわし、B1、B2がチミン−1−イルを表わす化合物。
(5)一般式(I)において、R1が水素原子、又は4,4’−ジメトキシトリチル基を表わし、R2が水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、又は一般式(II)(一般式(II)中、R3は2−シアノエチル基を表わし、R4、R5はイソプロピル基を表わす。)で表わされる基を表わし、nが4であり、X1が一般式(V)であらわされる基を表わしX4が一般式(IV)で表わされる基を表わし、X2、X3が酸素原子を表わし、B1、B2がチミン−1−イルを表わす化合物。
(6)一般式(I)において、R1が水素原子、又は4,4’−ジメトキシトリチル基を表わし、R2が水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、又は一般式(II)(一般式(II)中、R3は2−シアノエチル基を表わし、R4、R5はイソプロピル基を表わす。)で表わされる基を表わし、nが4であり、X1が一般式(IV)で表わされる基を表わし、X4が一般式(V)で表わされる基を表わし、X2、X3が酸素原子を表わし、B1、B2がチミン−1−イルを表わす化合物。
一般式(I)で表わされる化合物は、後述する実施例の記載に従って合成することができる。
例えば、まず、5’水酸基に保護基が導入され、3’水酸基に2−オキソエチル基などが導入されているヌクレオシド誘導体を合成する(原料合成例3の化合物に相当する。)。
これとは別に、3’水酸基に保護基が導入され、5’水酸基に2−オキソエチル基などが導入されているヌクレオシド誘導体を合成する(原料合成例6の化合物に相当する。)。
これら二つのヌクレオシド誘導体の2−オキソエチル基を、3,6ジオキサノナンジアミンなどの鎖状化合物を介して結合させることにより、一般式(I)で表わされる化合物を得ることができる。鎖状化合物として、3,6ジオキサノナンジアミン以外の物質を用いたり、ヌクレオシド誘導体の3’水酸基の導入基として、2−オキソエチル基以外の基を用いたりすることにより、実施例に記載されている物質とは異なる物質を合成することもできる。
一般式(I)で表わされる化合物を含むDNAは、ターゲットDNAが存在する時にのみ、蛍光シグナルもしくは電気化学シグナルを発する。これは以下の理由による。
(A)蛍光シグナルを発する場合
ターゲットDNAが存在しないとき、蛍光分子が光により励起されても、蛍光分子と一般式(I)中のXnで表された原子間でPET(photoinduced electron transfer)が起こり、蛍光は発せられない。ターゲットDNAが存在するときは、一般式(I)で表わされる化合物を含むDNAは、ターゲットDNAと二重鎖を組む。その際、二重鎖を組むまでは鎖状として存在していた、一般式(I)の3'水酸基と5'水酸基間を繋ぐリンカー部分が環状構造へ固定される。環状構造をとるリンカー部はcryptand分子に似た構造をとるため、類似した性質を有していると推測できる。そのため系中に適当な金属イオンないし、カチオン分子を加えると、リンカー部分が加えたイオンと錯体を形成する。Xnで表される原子の非共有電子対が錯体形成に使われるため、PETが起きなくなる。そのため、蛍光が生じる。
ターゲットDNAが存在しないとき、蛍光分子が光により励起されても、蛍光分子と一般式(I)中のXnで表された原子間でPET(photoinduced electron transfer)が起こり、蛍光は発せられない。ターゲットDNAが存在するときは、一般式(I)で表わされる化合物を含むDNAは、ターゲットDNAと二重鎖を組む。その際、二重鎖を組むまでは鎖状として存在していた、一般式(I)の3'水酸基と5'水酸基間を繋ぐリンカー部分が環状構造へ固定される。環状構造をとるリンカー部はcryptand分子に似た構造をとるため、類似した性質を有していると推測できる。そのため系中に適当な金属イオンないし、カチオン分子を加えると、リンカー部分が加えたイオンと錯体を形成する。Xnで表される原子の非共有電子対が錯体形成に使われるため、PETが起きなくなる。そのため、蛍光が生じる。
(B)電気化学シグナルを発する場合
蛍光シグナルの場合と同様にターゲットDNAが存在すると、リンカー部分が環状を形成し、錯体形成能をもつようになる。適当なイオンと錯体を形成すると電気化学シグナルソース分子に隣接して、カチオンが存在することになる。そのため、電気化学シグナルソース分子の酸化が起こりにくくなり、酸化還元電位のシフトが起こる。観測される酸化還元電位の値の変化により、ターゲットDNAの有無を確認できる。
蛍光シグナルの場合と同様にターゲットDNAが存在すると、リンカー部分が環状を形成し、錯体形成能をもつようになる。適当なイオンと錯体を形成すると電気化学シグナルソース分子に隣接して、カチオンが存在することになる。そのため、電気化学シグナルソース分子の酸化が起こりにくくなり、酸化還元電位のシフトが起こる。観測される酸化還元電位の値の変化により、ターゲットDNAの有無を確認できる。
蛍光シグナルや電気化学シグナルを発する物質は特に限定されないが、蛍光シグナルを発する物質としては、アントラセン類縁体分子を例示でき、電気化学シグナルを発する物質としてはフェロセン類縁体分子を例示できる。これらの物質は、通常、一般式(I)中のXnで表される原子にアルキル鎖を介して標識するか、Xnの隣の炭素に、アルキル鎖を介してまたは直接標識する。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔原料合成例1〕 3’-O-(アリル)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン
5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン(5.0 g , 9.18 mmol)を46 mlのテトラヒドロフランに溶解させた。その溶液に65%油性水素化ナトリウム(717 mg , 19.4 mmol )、アリルブロミド(1.134 g , 9.18 mmol ,798 μl)を加えた。室温で3時間反応させ、メタノールでクエンチした。反応終了後、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を飽和食塩水で1回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、展開溶媒(ヘキサン/酢酸エチル系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色粉体の化合物(3.55 g , 66% )として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.46 (3H, s) , 2,17-2,23 (1H, m) , 2.46-2.51 (1H, m) , 3,30-3.33 (1H, m) , 3.48-3.51 (1H, m) , 3.80 (6H, s) , 3.90-3.94 (1H, m) , 3.97-4.02 (1H, m) , 4.13-4.15 (1H, m) , 4.25-4.27 (1H, m) , 5.18-5.27 (2H, m) , 5.82-5.90 (1H, m) , 6.34-6.37 (1H, m) , 6.82-6.85 (4H, m) , 7.23-7.31 (9H, m) , 7.38-7.41 (2H, m) , 7.62 (1H, s) , 8.23 (1H, s)
〔原料合成例2〕 3’-O-(2,3-ジヒドロキシプロピル)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン
3’-O-(アリル)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン(3.49 g , 5.97 mmol)を60 ml のアセトン:水=6:1混合溶媒に溶解させた。その溶液に四酸化オスミウム(1.45 ml , 119 μmol )、N-メチルモルホリン-N-オキシド50%水溶液(2.92 ml , 13.1 mmol )を加えた。 遮光して室温で3.5時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを用い濾過をし、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで2回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに0.2%のトリエチルアミンを添加した展開溶媒(ヘキサン/クロロホルム系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を透明べとべと状の化合物(2.50 g , 68% )として得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.44 (3H, s) , 3,17-3,26 (2H, m) , 3.42-3.56 (2H, m) , 3.74 (6H, s) , 4.00-4.04 (1H, m) , 4.20-4.22 (1H, m) , 4.52-4.54 (1H, t) , 4.70-4.72 (1H, t) , 6.13-6.16 (1H, t) , 6.89-6.91 (4H, m) , 7.22-7.26 (5H, m) , 7.30-7.33 (2H, t) , 7.38-7.39 (4H, d) , 7.51 (1H, s) , 11.35 (1H, s)
〔原料合成例3〕 5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-3’-O-(2-オキソエチル)チミジン
3’-O-(2,3-ジヒドロキシプロピル)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン
(1.99 g , 3.20 mmol)を32 ml のジオキサン:水=3:1混合溶媒に溶解させた。その溶液に過ヨウ素酸ナトリウム(0.82 g , 3.85 mmol )を加えた。 遮光して室温で6.5時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで1回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて、展開溶媒(クロロホルム/メタノール系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色粉体の化合物(1.80 g , 95% )として得た。
(1.99 g , 3.20 mmol)を32 ml のジオキサン:水=3:1混合溶媒に溶解させた。その溶液に過ヨウ素酸ナトリウム(0.82 g , 3.85 mmol )を加えた。 遮光して室温で6.5時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで1回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて、展開溶媒(クロロホルム/メタノール系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色粉体の化合物(1.80 g , 95% )として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.50-1.52 (H, d) , 2,17-2,25 (1H, m) , 2.47-2.52 (1H, m) , 3,31-3.56 (3H, m) , 3.80 (6H, s) , 4.01-4.11 (1H, q) , 4.16-4.23 (2H, m) , 6.35-6.37 (1H, m) , 6.83-6.85 (4H, d) , 7.23-7.32 (7H, m) , 7.37-7.40 (2H, m) , 7.58 (1H, d) , 9.65 (1H, s)
〔原料合成例4〕 5’-O-(アリル)-3’-O-(t−ブチルジメチルシリル)チミジン
3’-O-(t−ブチルジメチルシリル)チミジン(3.56 g , 13.9 mmol)を70 ml のテトラヒドロフランに溶解させた。その溶液に65%油性ソジウムハイドライド(1.139 g , 30.9 mmol )、アリルブロマイド(2.52 g , 20.9 mmol ,1.78 ml)を加えた。室温で4時間反応させ、メタノールでクエンチした。反応終了後、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を飽和食塩水で1回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、展開溶媒(ヘキサン/酢酸エチル系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色粉体の化合物(2.17 g , 39% )と原料(1.94 g , 39% )を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.07 (6H, s) , 0.89 (9H, s) , 1.89 (3H, s) , 2,09-2,15 (1H, m) , 2.23-2.27 (1H, m) , 3,57-3.60 (1H, dd) , 3.71-3.74 (1H, dd) , 3,97-3.99 (1H, q) , 4.04-4.07 (2H, m) , 4.44-4.46 (1H, m) , 5.22-5.32 (2H, m) , 5.89-5.95 (1H, m) , 6.32-6.34 (1H, t) , 7.65 (1H, d) , 8.62 (1H, s)
〔原料合成例5〕 5’-O-(2,3-ジヒドロキシプロピル)-3’-O-(t−ブチルジメチルシリル)チミジン
5’-O-(アリル)-3’-O-(t−ブチルジメチルシリル)チミジン(1.81 g , 4.57 mmol)を45 ml のアセトン:水=6:1混合溶媒に溶解させた。その溶液に四酸化オスミウム(0.93 g , 91.3 μmol )、N-メチルモルホリン-N-オキシド50%水溶液(2.09 ml , 10.0 mmol )を加えた。 遮光して室温で3時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを用い濾過し、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで1回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、展開溶媒(ヘキサン/クロロホルム系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色シラップの化合物(1.51 g , 77% )として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.00 (6H, s) , 0.81 (9H, s) , 1.81 (3H, s) , 2,05-2,18 (2H, m) , 2.23-2.27 (1H, m) , 3,46-3.57 (4H, m) , 3.62-3.69 (2H, m) , 3,82-3.89 (3H, m) , 4.00 (1H, s) , 4.33-4.35 (1H, m) , 6.16-6.20 (1H, m) , 7.43-7.44 (1H, m) , 10.18 (1H, s)
〔原料合成例6〕 3’-O-(t−ブチルジメチルシリル)-5’-O-(2-オキソエチル)チミジン
5’-O-(2,3-ジヒドロキシプロピル)-3’-O-(t−ブチルジメチルシリル)チミジン(1.38 g , 3.21 mmol)を32 ml のジオキサン:水=3:1混合溶媒に溶解させた。その溶液に過ヨウ素酸ナトリウム(0.82 g , 3.85 mmol )を加えた。 遮光して室温で1時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで1回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて、展開溶媒(ヘキサン/クロロホルム系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色粉体の化合物(1.13 g , 88% )として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.00 (6H, s) , 0.81 (9H, s) , 1.81 (3H, s) , 2,04-2,19 (2H, m) , 3,61-3.64 (1H, dd) , 3.71-3.74 (1H, dd) , 3.91-3.92 (1H, q) , 4.19 (2H, s) , 4.41-4.44 (1H, m) , 6.25-6.27 (1H, t) , 7.49 (1H, d) , 9.48 (1H, s) , 9.63 (1H, s)
〔原料合成例7〕 5’-O-[11-(4-メトキシトリチルアミノ)-3-アザ-6,9-ジオキサウンデカン-1-イル]-3’-O-(t−ブチルジメチルシリル)チミジン
8-(4-メトキシトリチルアミノ)-3,6-ジオキサノナンアミン(474.9 mg , 1.13 mmol)に11 ml のクロロホルムに溶解させた3’-O-(t−ブチルジメチルシリル)-5’-O-(2-オキソエチル)チミジン(450mg , 1.13 mmol)を加えた。更にその溶液にトリアセトキシヒドロホウ酸ナトリウム(478.6 mg , 2.26 mmol)を加えた。室温で10分反応させた。反応終了後、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで1回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をNHシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにて、展開溶媒(ヘキサン/クロロホルム系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色シラップの化合物(733 mg , 81% )として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.00 (6H, s) , 0.82 (9H, s) , 1.84 (3H, s) , 1.98-2.03 (1H, m) , 2.15-2.19 (1H, m) , 2.26-2.29 (2H, t) , 2.71-2.73 (2H, t) , 2.75-2.77 (2H, t) , 3,41-3.63 (12H, m) , 3.70 (1H, s) , 3.89-3.91 (1H, m) , 4.31-4.34 (1H, m) , 6.21-6.24 (1H, t) , 6.72-6.74 (2H, d) , 7.08-7.11 (2H, t) , 7.17-7.20 (4H, m) , 7.28-7.30 (2H, d) , 7.38-7.40 (2H, d) , 7.43(1H, s)
〔原料合成例8〕 5’-O-(11-アミノ-3-アザ-6,9-ジオキサウンデカン-1-イル)-3’-O-(ジメチルブチルシリル)チミジン
5’-O-[11-(4-メトキシトリチルアミノ)-3-アザ-6,9-ジオキサウンデカン-1-イル]-3’-O-(t−ブチルジメチルシリル)チミジン(590 mg , 735 mmol)に3%トリクロロ酢酸(25 ml , 7.35 mol)を加えた。室温で10分反応させた。反応終了後、クロロホルムを加え反応溶液を希釈した。有機層を飽和炭酸ナトリウムで4回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をNHシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにて、展開溶媒(クロロホルム/メタノール/トリエチルアミン系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色シラップの化合物(350 mg , 92% )として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.00 (6H, s) , 0.81 (9H, s) , 1.85 (3H, s) , 1.98-2.04 (1H, m) , 2.16-2.20 (1H, m) , 2.73-2.80 (6H, m) , 3.27 (3H, m) , 3.41-3.43 (2H, t) , 3,50-3.66 (10H, m) , 3.89-3.91 (1H, m) , 4.31-4.34 (1H, m) , 4.31-4.34 (1H, m) , 6.20-6.23 (1H, t) , 7.43(1H, s)
〔実施例1〕 3’-O-(ジメチル−t−ブチルシリル)-5’-O-[14-[(5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン-3’-O-イル]-3,12-ジアザ-6,9-ジオキサ-テトラデカン-1-イル]チミジン
5’-O-(3,12-ジアザ-6,9-ジオキサドデカン-1-イル)-3’-O-(ジメチル−t−ブチルシリル)チミジン(20 mg , 3.87 μmol)を2mlのクロロホルムに溶解させた。その溶液に2mlのクロロホルムに溶解させた5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-3’-O-(2-オキソエチル)チミジンを加えた。更にその溶液にトリアセトキシヒドロホウ酸ナトリウム(16.4 mg , 77.4 μmol)を加えた。室温で20分反応させた。反応終了後、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで2回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて、展開溶媒(クロロホルム/メタノール系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を黄色シラップの化合物(20 mg , 47% )として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.10 (6H, s) , 0.91 (9H, s) , 1.46 (3H, s) , 1.95 (3H, s) , 2.12-2.31 (3H, m) , 2.49-2.53 (1H, m) , 2.87-2.91 (8H, m) , 3.31-3.33 (1H, dd) , 3.50-3.52 (1H, dd) , 3,60-376 (12H, m) , 3.81 (6H, s) , 3.40-4.01 (1H, m) , 4.17-4.21 (2H, m) , 4.41-4.44 (1H, m) , 6.27-6.29 (1H, t) , 6.35-6.38 (1H, q) , 6.85-6.87 (4H, d) , 7.17-7.42 (10H, m) , 7.51 (1H, d) , 7.62 (1H, d) .
〔実施例2〕 5’-O-[14-[(5’-O-4,4’-ジメトキ シトリチル)チミジン-3’-O-イル]-3,12-ジアザ-6,9ジオキサ-テトラデカン-1-イル]チミジン
実施例1にて合成した3’-O-(ジメチルターシャルブチルシリル)-5’-O-[14-(5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン-3’-O-イル]-3,12-ジアザ-6,9-ジオキサ-テトラデカン-1-イル)]-チミジン(837 mg , 760 μmol)を7.6mlのテトラヒドロフランに溶解させた。その溶液に1mol/l のテトラブチルアンモニウムフルオライド(836 μl , 836μmol)を加えた。室温で2時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を食塩水で1回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をNHシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて、展開溶媒(クロロホルム/メタノール系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色シラップの化合物(680 mg , 85% )として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.36 (3H, s) , 1.82 (3H, s) , 2.05-2.15 (2H, m) , 2.23-2.27 (1H, m) , 2.39-2.42 (1H, m) , 2.71-2.77 (8H, m) , 3.21-3.23 (2H, m) , 3.40-3.43 (2H, m) , 3.51 (9H, s) , 3,58-3.67 (3H, m) , 3.70 (6H, s) , 3.94 (1H, m) , 4.06 (1H, m) , 4.10 (1H, m) , 4.42 (1H, m) , 6.24-6.29 (2H, m) , 6.75-6.77 (4H, d) , 7.13-7.22 (7H, m) , 7.31-7.32 (2H, d) , 7.48 (1H, d) , 7.52 (1H, d) 。
〔実施例3〕 5’-O-[14-[(5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン-3’-O-イル]-3, 12-ビス(トリフルオロアセチル)-3,12-ジアザ-6,9-ジオキサ-テトラデカン-1-イル]チミジン
実施例2で合成した5’-O-[14-[(5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン-3’-O-イル]-3,12-ジアザ-6,9ジオキサ-テトラデカン-1-イル]チミジン (510 mg , 507 μmol)を5.0mlのジクロロメタンに溶解させた。その溶液にジイソプロピルエチルアミン(584 μl , 3.41 mmol)を加えた。その溶液に無水トリフルオロ酢酸(233 μl , 1.67 mmol)を加えた。室温で10分反応させた。反応終了後、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を食塩水で1回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて、展開溶媒(クロロホルム/メタノール系)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色粉体の化合物(507 mg , 83% )として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.41-1.48 (3H, d) , 1.90-1.92 (3H, d) , 2.13-2.24 (2H, m) , 2.35-2.44 (2H, m) , 3,29-3.76 (24H, m) , 3.79 (6H, s) , 4.01-4.14 (3H, m) , 4.40-4.45 (1H, d) , 6.29-6.36 (2H, m) , 6.84-6.86 (4H, d) , 7.22-7.31 (7H, m) , 7.38-7.40 (2H, d) , 7.47 (1H, s) , 7.59 (1H, s) 。
〔実施例4〕 3’-O-(ジメチル-t-ブチルシリル)-5’-O-[14-[(5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル) チミジン-3’-O-イル]-,3, 12-ビス(トリフルオロアセチル)-3,12-ジアザ-6,9-ジオキサ -テトラデカン-1-イル]チミジン 3'-(2-シアノエチル N, N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)
実施例3にて合成した5’-O-[14-[(5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン-3’-O-イル]-3, 12-ビス(トリ フルオロアセチル)-3,12-ジアザ-6,9-ジオキサ-テトラデカン-1-イル]チミジン(193 mg , 164 μmol)を656μlのジクロロメタンに溶解させた。その溶液に2-シアノエチル-ビス(N,N’-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト(62.4 μl , 196 μmol)を加えた。その溶液にテトラゾール-ジイソプロピルアミン塩(11.1 mg , 65.5 μmol)を加えた。室温で6時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを加え反応溶液を希釈した。有機層を炭酸水素ナトリウムで1回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をゲル濾過にて、展開溶媒(酢酸エチル)で精製し目的とするヌクレオシド誘導体を白色粉体の化合物(171 mg , 76% )として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ1.18-1.20 (12H, m) , 1.25-1.27 (2H, t) , 1.44-1.44 (3H, d) , 1.91-1.94 (3H, d) , 2.05 (2H, s) , 2.14-2.23 (2H, m) , 2.35-2.45 (2H, m) , 2.63-2.66 (2H, t) , 3,27-3.78 (26H, m) , 3.80 (6H, s) , 4.09-4.18 (3H, m) , 4.47-4.56 (1H, m) , 6.24-6.36 (2H, m) , 6.83-6.85 (4H, d) , 7.23-7.31 (7H, m) , 7.37-7.38 (2H, d) , 7.47 (1H, d) , 7.58 (1H, s) ,
〔実施例5〕 オリゴヌクレオチド合成
実施例4にて合成したホスホロアミダイト化合物と、市販のDNAホスホロアミダイトユニットを用いて、DNA/RNA自動合成機(Applied Bio System)を用い合成した。反応修了後、28%アンモニア水を用い脱保護を行った。その後、逆相カラムカートリッジを用い精製した。逆相カラムカートリッジで脱塩操作を行った後、凍結乾燥処理を行い、目的のオリゴヌクレオチドを得た(収率16%)。このオリゴヌクレオチドをイオン交換HPLCで分析した。分析条件は下記の通りである。
実施例4にて合成したホスホロアミダイト化合物と、市販のDNAホスホロアミダイトユニットを用いて、DNA/RNA自動合成機(Applied Bio System)を用い合成した。反応修了後、28%アンモニア水を用い脱保護を行った。その後、逆相カラムカートリッジを用い精製した。逆相カラムカートリッジで脱塩操作を行った後、凍結乾燥処理を行い、目的のオリゴヌクレオチドを得た(収率16%)。このオリゴヌクレオチドをイオン交換HPLCで分析した。分析条件は下記の通りである。
緩衝液A :25 mM NaH2PO4−Na2HPO4(pH =6.0)−10%アセトニトリル
緩衝液B: 25 mM NaH2PO4−Na2HPO4(pH =6.0)−10%アセトニトリル, M NaCl
濃度勾配:B濃度を0%から60%へ30分で変え、30分から40分まではカラム洗浄のため、B緩衝液80%、A緩衝液10%で洗浄を行った。
緩衝液B: 25 mM NaH2PO4−Na2HPO4(pH =6.0)−10%アセトニトリル, M NaCl
濃度勾配:B濃度を0%から60%へ30分で変え、30分から40分まではカラム洗浄のため、B緩衝液80%、A緩衝液10%で洗浄を行った。
ターゲットオリゴヌクレオチドのピークは16.5分に観測さた(図1)。また、生成物のUVスペクトルを測定し、λmax =258nmを得た(図2)。
〔実施例6〕 Tm測定
実施例5で合成したオリゴヌクレオチドとその相補鎖からなる下記の二本のオリゴヌクレオチド鎖を10 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.0)−100mM NaClに各一本鎖の濃度が3μMに溶解した、280 nmでの吸光度を温度を5℃から90℃まで、1℃刻みで測定し、UV−融解曲線を得た。得られた融解曲線微分係数が極大になる温度から、二本鎖融解温度を計算し、Tm=48.4℃を得た。
実施例5で合成したオリゴヌクレオチドとその相補鎖からなる下記の二本のオリゴヌクレオチド鎖を10 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.0)−100mM NaClに各一本鎖の濃度が3μMに溶解した、280 nmでの吸光度を温度を5℃から90℃まで、1℃刻みで測定し、UV−融解曲線を得た。得られた融解曲線微分係数が極大になる温度から、二本鎖融解温度を計算し、Tm=48.4℃を得た。
5’-GCTCAGXXGCTCGAG3’
3’-CGAGTCAACTAGCTC-5’
3’-CGAGTCAACTAGCTC-5’
Claims (16)
- 一般式(I)
で表わされる基を表わし、nは1から5の整数を表わし、各nに対応してXnは同一または異なって酸素原子、硫黄原子、又は一般式(III)
で表わされる基を表わし、B1、B2は同一または異なって保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。〕
で表わされる化合物。 - 一般式(I)におけるR1が、水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、4−メトキシトリチル基、又は4,4’−ジメトキシトリチル基を表わすことを特徴とする請求項1に記載の化合物。
- 一般式(I)におけるR1が、4,4’−ジメトキシトリチル基を表わすことを特徴とする請求項1に記載の化合物。
- 一般式(I)におけるR2が、水素原子、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、又はトリイソプロピルシリル基を表わすことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の化合物。
- 一般式(I)におけるR2が、水素原子、又はtert−ブチルジメチルシリル基を表わすことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の化合物。
- 一般式(II)におけるR3が、メチル基、2−シアノエチル基、4−ニトロフェニルエチル基、又はトリメチルシリルエチル基を表わすことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の化合物。
- 一般式(II)におけるR3が、2−シアノエチル基を表わすことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の化合物。
- 一般式(II)におけるR4、R5が、エチル基、イソプロピル基、又はR4、R5が互いに結合して窒素原子ともに、ピロリジン−1−イル基、モルホリン−1−イル基、もしくはピペリジン−1−イル基を形成する基を表わすことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の化合物。
- 一般式(II)におけるR4、R5が、イソプロピル基を表わすことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の化合物。
- 一般式(I)におけるB1、B2が、同一又は異なってチミン−1−イル基、シトシン−1−イル基、アデニン−9−イル基、グアニン−9−イル基、又はウラシル−1−イル基〔但し、チミンまたはウラシルの3位のアミノ基、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンのアミド部位の6−O酸素もしくは2位のアミノ基にアシル基、又はアリールカルバモイル基を有していてもよく、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンの2位のアミノ基にジアルキルアミノメチレン基、又はジアルキルアミノエチレン基を有していてもよい。〕を表わすことを特徴とする請求項1乃至12のいずれか一項に記載の化合物。
- 一般式(I)におけるB1、B2が、同一又は異なってチミン−1−イル基、シトシン−1−イル基、アデニン−9−イル基、グアニン−9−イル基、又はウラシル−1−イル基〔但し、チミンまたはウラシルの3位のアミノ基、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンのアミド部位の6−O酸素もしくは2位のアミノ基にアセチル基、ベンゾイル基、フェノキシアセチル基、(4−tert−ブチルフェニル)オキシアセチル基、(4−イソプロピルフェニル)オキシアセチル基、又は2−ニトロフェニルカルバモイル基を有してもよく、また、シトシンの4位のアミノ基、アデニンの6位のアミノ基、グアニンの2位のアミノ基にジメチルアミノメチレン基、又はジメチルアミノエチレン基を有していてもよい。〕を表わすことを特徴とする請求項1乃至12のいずれか一項に記載の化合物。
- 一般式(I)におけるB1、B2がチミン−1−イル基を表わすことを特徴とする請求項1乃至12のいずれか一項に記載の化合物。
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JP2005261657A JP2007070308A (ja) | 2005-09-09 | 2005-09-09 | 動的カチオン感受性部位を挿入した新規ヌクレオシド誘導体 |
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