JP2009528988A - 翻訳後修飾されたタンパク質の標識及び検出方法 - Google Patents

翻訳後修飾されたタンパク質の標識及び検出方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2009528988A
JP2009528988A JP2008553858A JP2008553858A JP2009528988A JP 2009528988 A JP2009528988 A JP 2009528988A JP 2008553858 A JP2008553858 A JP 2008553858A JP 2008553858 A JP2008553858 A JP 2008553858A JP 2009528988 A JP2009528988 A JP 2009528988A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
azide
modified
protein
biomolecule
alkyne
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2008553858A
Other languages
English (en)
Inventor
ブライアン アグニュー
カイル ジー
タマラ ニバーグ
Original Assignee
ライフ テクノロジーズ コーポレーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38440198&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2009528988(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ライフ テクノロジーズ コーポレーション filed Critical ライフ テクノロジーズ コーポレーション
Publication of JP2009528988A publication Critical patent/JP2009528988A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/13—Labelling of peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/583—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with non-fluorescent dye label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/17—Nitrogen containing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

特定の実施形態において、レポーター分子、担体分子、又は固体支持体のアジド修飾生体分子複合体を形成させる新規な方法が提供される。他の実施形態において、アジド基を有する生体分子を酵素的に標識する方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は２００６年２月１０日に出願の米国仮特許出願第６０／７７２２２１号及び２００６年６月１３日に出願の米国仮特許出願第６０／８０４６４０号の優先権を主張し、それらの全開示内容を、本願明細書に記載されているのと同様に援用する。
発明の分野
本発明は広義には、翻訳後修飾された生体分子の標識方法であって、アジド若しくはアルキン標識された高分子の代謝的、酵素的若しくは化学的取り込みを用い、その後、翻訳後のタンパク質に結合しているペアのアジド、アルキン、活性化アルキン若しくはトリアリールホスフィンレポーター分子との化学的コンジュゲーションを行うことを特徴とする、前記方法の提供に関する。
背景情報
タンパク質グリコシル化は、最も多く行われる翻訳後修飾の１つであって、生体系の制御時において基本的な役割を演ずる。例えば、糖質修飾は、宿主−病原相互作用、炎症、発生及び悪性にとって重要である（Ｖａｒｋｉ，Ａ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９３，３，９７−１３０（非特許文献１）；Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，６４，１１３−１３９（非特許文献２）（ｃ） Ｃａｐｉｌａ，Ｌ；Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，３９１−４１２（非特許文献３）；Ｒｕｄｄ，Ｐ．Ｍ．；Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｔ．；Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ，Ｐ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．；Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９１，２３７０−２３７６（非特許文献４））。かかる共有結合的修飾はＯ−ＧｌｃＮＡｃグリコシル化であり、セリン及びトレオニン残基へのＤ−Ｎアセチルグルコサミン（Ｗｅｌｌｓ，Ｌ．；Ｖｏｓｓｅｌｌｅｒ，Ｋ．；Ｈａｒｔ，Ｇ．Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９１，２３７６−２３７８（非特許文献５）；Ｚａｃｈａｒａ，Ｎ．Ｅ．；Ｈａｒｔ，Ｇ．Ｗ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００２，１０２，４３１（非特許文献６））による共有結合的修飾である。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾は線虫からヒトまで全てのより高等真核生物有機体に遍在し、誘導可能かつ非常に動的であることが示され、リン酸化に類似する調整的な役割が示唆されている。しかしながら、修飾（すなわち動的かつ低い細胞内レベル）による調整的な性質は、また、その検出及び解析が困難である。
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃを観察する一般的な方法では、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）（［３Ｈ］−ＧａｌをＵＤＰ−［３Ｈ］ガラクトースから末端のＧｌｃＮＡｃ基に転移させる触媒活性を有する酵素）によるタンパク質の標識を必要とする（Ｒｏｑｕｅｍｏｒｅ，Ｅ．Ｐ．；Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｙ．；Ｈａｒｔ，Ｇ．Ｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９４，２３０，４４３−４６０）（非特許文献７）。残念なことに、このアプローチは高価で、放射性物質の取扱いを必要とし、数日から数ヶ月の露出時間を必要とする。抗体及びレクチンは代替的な検出手段を提供するが、それらは弱い結合アフィニティ及び限られた特性しか有さない（Ｓｎｏｗ，Ｃ．Ｍ．；Ｓｅｎｉｏｒ，Ａ．；Ｇｅｒａｃｅ，Ｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８７，１０４，１１４３−１１５６（非特許文献８）；Ｃｏｍｅｒ，Ｆ．Ｌ；Ｖｏｓｓｅｌｌｅｒ，Ｋ．；Ｗｅｌｌｓ，Ｌ．；Ａｃｃａｖｉｔｔｉ，Ｍ．Ａ．；Ｈａｒｔ，Ｇ．Ｗ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１，２９３，１６９−１７７（非特許文献９））。
分離又は合成された抗体（例えばＩｇＧ）は、治療的用途、並びに診断及び研究目的で使用される。検出可能なラベル（例えばフルオロフォア）で抗体を標識することによって、抗体は、特に標的生体分子又は細胞の検出に使用できる。抗体に結合性の物質（例えばビオチン）をタグとして結合させてもよく、その結果、それらは特に標的生体分子又は細胞に結合し、更にタグを付与された抗体と結合する物質を（例えばストレプトアビジン）用いて生体分子又は細胞の精製を実施できる。抗体は通常、システイン若しくはリジン残基（Ｆａｂに存在しうる）、又は抗体の結合部位で標識してもよい。この部位へのタグ又はラベル付加により、抗体の結合特性が損なわれるか、又は少なくとも変化しうる。更に、各抗体に結合している標識分子の数を定量することは非常に困難である。
糖タンパク質の１つの重要な種類は、抗体である。治療用の単クローン抗体（Ｍａｂｓ）は現在、癌、リウマチ性関節炎、黄斑部変性及び他の疾患又は症状の治療・予防に不可欠な薬剤として用いられている。しかしながら、非ヒト細胞株において、産生させた抗体は抗原性特徴を有し、ヒトの免疫系によって、異物と認識され、それにより抗体の半減期及び有効性が制限されうる。ヒトのＩｇＧ配列をトランスジェニックマウスに導入することにより免疫原性の問題を軽減することにつながるが、但し完全に解消するには至らない。タンパク質の配列の他に、ＩｇＧに結合するオリゴ糖の性質もまた、免疫系による認識に顕著な影響を及ぼす。糖鎖形成は細胞のタイプに特異的であるため、異なる宿主細胞において、産生されたＩｇＧは異なるオリゴ糖パターンを有し、それにより生物学的機能に影響が及びうる。細胞（例えばヒトのＥＳ細胞）を、動物由来の血清代替物の存在下で、マウスフィーダ層上で増殖させる場合、当該細胞はヒト以外の、免疫原性のシアル酸を取り込み、細胞表面上に当該シアル酸が検出されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００５，１１：２２８−２３２）（非特許文献１０）。治療用抗体の製造業者は、非フコシル化されたオリゴ糖を用いて、抗原性の低いＩｇＧを産生させることによって、これらの課題を回避しようとしたが、非フコシル化抗体にはヒト化抗体と同等の性能を有さず、また依然として免疫源性の問題、並びに天然ヒト抗体とは異なる半減期を有するという問題が解消されていなかった。
代謝的オリゴ糖工学が存在し、それは、細胞のグリカン中の単糖残基に対してわずかな修飾を行うことを指す。研究者は代謝的工学を使用することにより、グリカン生合成系を破壊し、化学的に細胞表面を修飾し、細胞内部の代謝の流れを徹底調査し、プロテオームから特異的な糖タンパク質サブタイプを同定した（Ｄｕｂｅ，Ｄ．Ｈ．，ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，７：６１６−６２５（非特許文献１１）を参照）。
以上より、結合部位以外の部位でタグ又はラベルを有する抗体、及び単純かつ効率的な化学的反応により容易に標識できる抗体に対するニーズが存在する。また、よりヒト抗体と同様の翻訳後修飾を有する抗体に対するニーズも存在する。
Ｖａｒｋｉ，Ａ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９３，３，９７−１３０ Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，６４，１１３−１３９ Ｃａｐｉｌａ，Ｌ；Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，３９１−４１２ Ｒｕｄｄ，Ｐ．Ｍ．；Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｔ．；Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ，Ｐ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．；Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９１，２３７０−２３７６ Ｗｅｌｌｓ，Ｌ．；Ｖｏｓｓｅｌｌｅｒ，Ｋ．；Ｈａｒｔ，Ｇ．Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９１，２３７６−２３７８ Ｚａｃｈａｒａ，Ｎ．Ｅ．；Ｈａｒｔ，Ｇ．Ｗ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００２，１０２，４３１ Ｒｏｑｕｅｍｏｒｅ，Ｅ．Ｐ．；Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｙ．；Ｈａｒｔ，Ｇ．Ｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９４，２３０，４４３−４６０ Ｓｎｏｗ，Ｃ．Ｍ．；Ｓｅｎｉｏｒ，Ａ．；Ｇｅｒａｃｅ，Ｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８７，１０４，１１４３−１１５６； Ｃｏｍｅｒ，Ｆ．Ｌ；Ｖｏｓｓｅｌｌｅｒ，Ｋ．；Ｗｅｌｌｓ，Ｌ．；Ａｃｃａｖｉｔｔｉ，Ｍ．Ａ．；Ｈａｒｔ，Ｇ．Ｗ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１，２９３，１６９−１７７ Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００５，１１：２２８−２３２ Ｄｕｂｅ，Ｄ．Ｈ．，ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，７：６１６−６２５
発明の概要
本発明の具体的な実施形態では、酵素でアジド部分を有する糖タンパク質を標識する方法の提供に関する。１つの態様では、当該糖タンパク質を、適当な酵素の存在下でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚと接触させる。１つの態様では、当該酵素はＧａｌＴである。別の態様では、当該酵素は修飾されたＧａｌＴ酵素である。これらのアジド修飾糖タンパク質は更に、それらがアジド反応基を含む場合に、様々なレポーター分子、担体分子又は固体支持体と複合体させてもよい。１つの態様では、当該アジド反応基は末端アルキンであり、それにより、複合体反応においては銅（Ｉ）で触媒される環付加反応が行われる。別の態様では、当該アジド反応基はホスフィンであり、それにより、複合体反応においてシュタウディンガー連結反応が行われる。
他の実施形態では、レポーター分子−糖タンパク質複合体を、固定化されたアジド修飾糖タンパク質を用いて形成させる方法の提供に関する。糖タンパク質は、代謝的に、又は酵素的にアジド糖により修飾され、更に固体若しくは半固体のマトリックスに固定される。一実施例において、前記固体若しくは半固体のマトリックスは、スライド、アレイ、ポリマー粒子又はゲルマトリックスである。特定の態様において、アジド修飾糖タンパク質は、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動により分離される。固定化されたアジド修飾糖タンパク質をアジド反応性レポーター分子と接触させ、クリック（Ｃｌｉｃｋ）タイプの反応又はシュタウディンガータイプの連結反応を経て、複合体が形成される。その後、糖タンパク質複合体を、適当な波長による照射により検出する。
アジド−アルキン［３＋２］付加環化は、銅（Ｉ）の添加によって引き起こされる、化学構造選択的なライゲーション反応である。当該反応はこれまで、様々な異なるバイオ複合体反応に適用されたにもかかわらず、修飾タンパク質のゲルにおける蛍光検出にはこれまで適用されなかった。その手順は、タンパク質にアジド若しくはアルキン基を含む反応プローブを選択的に付加することが必要である。当該反応プローブは、あらゆる種類のタンパク質（例えばリジン又はシステインのような特定のアミノ酸を標識）であってもよく、又は、タンパク質内で翻訳後修飾（又は誘導体化）されたアミノ酸を標識（例えば燐酸アミノ酸又はグリコシル化されたアミノ酸）して調製してもよい。加えて、タンパク質修飾は、代謝的標識によってインビボで行ってもよい。この操作においては、培養細胞、バクテリア、植物又は動物に、細胞内酵素のメカニズムによって特定の分子に組み込まれる、タグを付けた代謝前駆体をフィードすることにより実施される。検出が当該ペアの交換により行われる限り、最初のタンパク質標識化はアジド又はアルキンプローブで実施してもよい。最初のタンパク質を標識する段階が完了した後、細胞抽出物（又はフラクション）を１次元又は２次元のゲル電気泳動により分離する。
ゲル中でのタンパク質検出方法は、３〜４時間以内に完了させることができる。当該方法は、ブロッティングによる抗体検出において頻出する典型的な課題、例えば一次抗体・二次抗体の濃度の最適化の必要性、及び抗体の非特異的結合の問題などの課題が存在しない。最後に、エレクトロブロットされたタンパク質より、ゲル中で分解されたタンパク質では、質量分析による検出に適することも利点として挙げられる。
発明の詳細な説明
定義及び略語
本発明を詳細に記載する前に、本発明が具体的な組成又は工程に限定されず、適宜変化させることができることを理解すべきである。単数形の「１つの」、「当該」という用語を本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、特に明記しない限りは、複数形をも包含するものとする。すなわち、例えば「リガンド」という用語には複数のリガンドが包含され、「抗体」という用語には複数の抗体が包含される。
特に明記しない限り、本願明細書において、用いられる全ての技術上及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、通常理解されているのと同じ意味を有する。本願明細書に記載する用語及び略語は、以下の表１のとおり定義される。
（表１）略語のリスト
Figure 2009528988
本発明の特定の化合物は、溶媒和（水和）の状態で存在してもよく、非溶媒和の状態で存在してよい。一般に、溶媒和形は、非溶媒和形と同等であり、本発明の範囲内に含まれる。本発明の特定の化合物は、複数の結晶状若しくはアモルファス状で存在してもよい。一般に、全ての物理的な形態は、本発明に包含される用途においては同等であり、当然本発明の範囲内に包含される。
本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学的中心）又は二重結合を有し、ラセミ化合物、ジアステレオマー混合物、幾何異性体及び個々の異性体が本発明の範囲内に包含される。
本願明細書に記載されている化合物は、単一の異性体（例えば鏡像異性体、シス−トランス（位置）ジアステレオ異性体）として、又は、異性体の混合物として調製されてもよい。好ましい実施例において、化合物は、実質的に単一の異性体として調製される。実質的に異性体的に純粋な化合物を調製する方法は、公知技術である。例えば、鏡像異性的に豊かな混合物及び純粋な鏡像異性化合物は、対掌性中心の立体化学を不変のままにするか又はその完全な逆転に結びつく反応と結合して鏡像異性的に純粋である合成中間体を用いて調製されてもよい。あるいは、合成ルートに沿った最終製品又は中間体は、単一の立体異性体に分解されてもよい。特定の立体中心を転移又は不変にする技術、及び立体異性体の混合物を分離する技術は公知であり、特定の状況に応じて方法を選択し、調整することは、当業者の技能の範囲内である。一般的な技術は、Ｆｕｒｎｉｓｓら（ｅｄｓ．），ＶＯＧＥＬ’Ｓ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ５ＴＨ ＥＤ．，Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｅｓｓｅｘ，１９９１，ｐｐ．８０９−８１６、及びＨｅｌｌｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０）などを参照のこと。
本願明細書において開示される化合物は、かかる化合物を構成する原子の１つまたは複数で、非天然の比率で同位元素を含有してもよい。例えば、化合物は、放射性同位元素（例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）又は炭素−１４（１４Ｃ）によって放射性同位元素識別されてもよい。本発明の化合物の全てのアイソトープ・バリエーションは、放射能を発生するか否かに関わらず、本発明の範囲内に包含される。
開示された化合物が共役環系を有する場合、共鳴安定化によって、分しない電子荷が全分子を通じて分配される。特定の電荷が、特定の環系又は特定のヘテロ原子に局所化されてもよいが、相当する共鳴構造が導入され、電荷が化合物中の別の部分に局所化されてもよいことが理解される。
正式な電荷を有する選択された化合物は、適当な生物学的に互換性を有する反イオンなしで示されてもよい。かかる反イオンは、化合物に存在する陽電荷及び陰電荷のバランスをとるのに有用である。本発明では、生物学的に互換性有する物質は有毒ではなく、生体分子に実質的に有害な影響を及ぼさない。負荷電の反イオンの例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸化物、アルカンスルホネート、アリールスルホネート、ホスフェート、過塩素酸化合物、テトラフルオロホウ酸化合物、テトラアリールホウ化物、硝酸化合物、並びに芳香族若しくは脂肪族カルボン酸のアニオンが挙げられる。好適な反イオンとしては、塩化物、ヨウ化物、過塩素酸化合物及び様々なスルホネートなどが挙げられる。正荷電の反イオンの例としては、アルカリ金属又はアルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン又はアルキルアンモニウムイオンなどが挙げられる。
置換基として機能する基を従来の化学式の表記方法で特定する（左から右に記載する）場合には、当然ながら化学的に同一の置換基も包含され、例えば、−ＣＨ２Ｏ−はまた、右から左に構造を記述することにより−ＯＣＨ２−として記載してもよい。
用語「アシル」又は「アルカノイル」（単独又は他の用語との組合せにおいて）とは、特に明記しない限り、安定な直鎖状若しくは分岐状若しくは環状の炭化水素ラジカル、又はそれらの組み合わせであって所定の炭素原子数、及びアルカンラジカルの少なくとも１つの末端上のアシル基を含む基のことを意味する。「アシル基（ラジカル）」は、カルボン酸からＯＨ基を除去することにより得られる基である。
用語「アルキル」（単独又は他の用語との組合せにおいて）とは、特に明記しない限り、直鎖状若しくは分岐状若しくは環状の炭化水素ラジカル、又はそれらの組み合わせであって、完全に飽和、１つ又は複数の不飽和結合を有し、二価（「アルキレン」）及び多価の、表示される炭素原子数を有する（すなわちＣ１−Ｃ１０は１〜１０の炭素を含む）基のことを意味する。例えば、飽和炭化水素基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同物及び異性体などの基が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合又は三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル基、並びにより高分子の相同物及び異性体が挙げられるが、これらに限定されない。用語「アルキル」は、特に明記しない限り、以下で更に詳細に定義されるアルキル基の派生物「ヘテロアルキル」などを包含する。炭化水素基に限定したアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
本発明の使用における典型的なアルキル基は、約１〜約２５の炭素原子（例えばメチル、エチルなど）を含む。８以下の炭素原子を有する直鎖状若しくは分岐状若しくは環状の炭化水素鎖は、本明細書において「低級アルキル」とも称する。加えて、本明細書で用いられる用語「アルキル」には更に、炭化水素鎖フラグメント中の１つまたは複数の炭素原子において１つまたは複数の置換を有する基も含まれる。
用語「アミノ」又は「アミン基」とは、−ＮＲ’Ｒ”（又はＮＲＲ’Ｒ”）基を指し、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリールからなる群から選択される。置換アミンとは、式中、Ｒ’又はＲ”が水素以外であるアミンのことを指す。第１級アミン基は、Ｒ’及びＲ”の両方が水素であるが、一方、第２級アミンは、そのどちらか一方が水素であり、もう一方が水素でない。更に、用語「アミン」及び「アミノ」には、プロトン化された及び４級化された窒素も含まれ、それは、−ＮＲＲ’Ｒ”及びその生物学的に互換性のあるアニオン性反イオンを含む。
本明細書で使用される「アリール」という用語は、２０以下の炭素原子を有する環状の芳香族炭素鎖（例えばフェニル、ナフチル、ビフェニル及びアントラセニル）を意味する。例えば、アリール基の１つまたは複数の炭素原子は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ニトロ、シアノ、水酸基、アルコキシル又はアリールオキシル、チオ又はメルカプト、アルキル若しくはアリールチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキル−、ジアリール若しくはアリールアルキルアミノ、アミノカルボニル（アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニル又はアリールアルキルアミノカルボニル）、カルボキシル、又はアルキル若しくはアリールオキシカルボニル、アルデヒド、アリール若しくはアルキルカルボニル、イミニル、又はアリール若しくはアルキルイミニル、スルホ、アルキル若しくはアルキルカルボニル、イミニル、又はアリール若しくはアルキルイミニル、スルホ、アルキル若しくはアリールスルホニル、ヒドロキシイミニル、又はアリール若しくはアルコキシイミニル基で置換されてもよい。更に、アリール基上の２つ以上のアルキル又はヘテロアルキル置換基は、融合してアリールアルキル又はアリールヘテロアルキル環系（例えばテトラヒドロナフチル）を形成してもよい。複素環基（例えばヘテロアリールオキシ及びヘテロアラルキルチオ）を含む置換基は、上記の定義と同様に定義される。
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）とは、それらの従来の意味において用いられ、それぞれ酸素原子、アミノ基又は硫黄原子を経て分子の残りの部分に結合しているアルキル基のことを指す。
用語「ヘテロアルキル」（単独又は他の用語との組合せにおいて）とは、特に明記しない限り、直鎖状若しくは分岐状若しくは環状の炭化含有ラジカル、又はそれらの組み合わせであって、所定の数の炭素原子数、及び少なくとも１つのヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ及びＳｅからなる群から選択される）を含んでなり、窒素、リン、硫黄及びセレン原子が任意に酸化されてもよく、窒素原子は任意に４級化されてもよい基のことを指す。ヘテロ原子のＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ及びＳｅは、ヘテロアルキル基のいかなる内部位置、又は、アルキル基が分子の残基に結合する位置に存在してもよい。例としては、限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ、（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ、ＣＨ３３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３である。例えば、最高２つのヘテロ原子が連続してもよい（例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３）。同様に、用語「ヘテロ」「アルキレン」は、それ自体、又は他の置換基の一部としての、ヘテロアルキル基に由来する二価の基を意味し、限定されないが−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、そして、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−などが挙げられる。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は鎖のいずれの末端（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）に存在してもよい。更に、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の方向は、連結基が反応式中に記載される方向に限定されるものではない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−であってもよく、また−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−であってもよい。
用語「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」はそれぞれ、それ自身、又は他の用語との組合せにおいて、特に明記しない限り「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状バージョンを表す。更に、ヘテロシクロアルキルの場合、ヘテロ原子は、複素環が分子の残基に結合する位置に存在してもよい。シクロアルキルの例としては、限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アリール」は、特に明記しない限り、単一環又は複数の環（好ましくは１〜３つの環）からなる、複数の不飽和結合を有する芳香族部分を意味し、それらは融合又は共有結合により連結されてもよい。用語「ヘテロアリール」は１〜４個の、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＳｅから選択されるヘテロ原子を含むアリール基（又は環）を指し、窒素、硫黄及びセレニウム原子は任意に酸化されてもよく、窒素原子は任意に４級化されてもよい。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残基に結合することができる。アリール基及びヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソル−５−イル及び６−キノリル基などが挙げられる。上記のアリール及びヘテロアリール環の各々の置換基は、後述する許容できる置換基の群から選択される。
簡潔には、他の用語と組み合わせて用語「アリール」を使用（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）するときは、上記の通りアリール及びヘテロアリール環が包含される。すなわち、用語「アリールアルキル」とは、アリール基がアルキル基に結合した基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチル基など）を指し、それらのアルキル基（例えばメチレン基）において、炭素原子が酸素原子と置き換えられた基（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）が例として挙げられる。
上記の用語（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」）の各々には、示される基の置換及び非置換形が含まれる。各タイプの基の好適な置換基を、以下に示す。
アルキル及びヘテロアルキル基の置換基（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基など）は、「アルキル置換基」と通常呼ばれ、それらは、限定されないが以下の群から選択される１つまたは複数（ゼロ〜（２ｍ’＋１）個。式中、ｍ’はかかる基に含まれる総炭素原子数）の基である：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ'−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ'''、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ'''）＝ＮＲ''''、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ'''、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ'''及びＲ''''は各々独立に、好ましくは水素、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換アリール（例えば１−３のハロゲンにより置換されるアリール）、置換若しくは非置換アルキル、アルコキ若しくはチオアルコキシル基、又はアリールアルキル基のことを指す。化合物が複数のＲ基を含むとき、例えば、これらの各Ｒ基は、これらの基が複数種存在する場合には、各々Ｒ’、Ｒ”Ｒ'''及びＲ''''基として選択される。Ｒ’及びＲ”が同じ窒素原子に結合する場合、それらは窒素原子と結合して５、６若しくは７員環を形成してもよい。例えば−ＮＲ’Ｒ”としては、限定されないが１−ピロリジニル及び４−モルホリニル基が挙げられる。置換基に関する上記説明から、当業者には、用語「アルキル」には、水素基以外の基が結合している炭素原子を含む基（例えばハロアルキル（例えば−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３）、及びアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など））が包含されると理解される。
アルキル基に関して記載されている置換基と同様、アリール及びヘテロアリール基のための置換基は「アリール置換基」と一般的に称される。その置換基は、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ'−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ'''、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ２）Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ'''）＝ＮＲ''''、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ” ）＝ＮＲ'''、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基から、ゼロから芳香環システム上の開いた原子価までの数で選択され、式中Ｒ’、Ｒ”、Ｒ'''及びＲ''''は、好ましくは水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換アリール、並びに置換若しくは非置換ヘテロアリールから独立に選択される。化合物が複数のＲ基を含むとき、例えば、これらの各Ｒ基は、これらの基が複数種存在する場合には、各々Ｒ’、Ｒ”Ｒ'''及びＲ''''基として選択される。以下の反応式において、シンボルＸは、上記の「Ｒ」を表す。
アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上の２つの置換基は、−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の式の置換基で任意に置換されてもよく、式中、Ｔ及びＵは各々独立に−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−若しくは単結合であってもよく、ｑは０から３までの整数である。あるいは、アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上の２つの置換基は、−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の式の置換基で任意に置換されてもよく、式中、Ａ及びＢは各々独立に−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−若しくは単結合であってもよく、ｒは１から４までの整数である。このように形成される環上の新規な単結合の１つは、任意に二重結合で置換されてもよい。あるいは、アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ”Ｒ'''）ｄ−の式の置換基で任意に置換されてもよく、式中、ｓ及びｄは各々独立に０から３までの整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−若しくは−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ”及びＲ'''は、好ましくは水素又は置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから各々独立に選択される。
本発明の用語「ヘテロ原子」としては、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、シリコン（Ｓｉ）及びセレニウム（Ｓｅ）などが挙げられる。
用語「アミノ」又は「アミン基」とは、−ＮＲ’Ｒ”（又はＮ＋ＲＲ’Ｒ”）基を指し、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリールからなる群から選択される。置換アミンとは、式中、Ｒ’又はＲ”が水素以外であるアミンのことを指す。第１級アミン基は、Ｒ’及びＲ”の両方が水素であるが、一方、第２級アミンは、そのどちらか一方が水素であり、もう一方が水素でない。更に、用語「アミン」及び「アミノ」には、プロトン化された及び４級化された窒素も含まれ、それは、−Ｎ＋ＲＲ’Ｒ”及びその生物学的に互換性のあるアニオン性反イオンを含む。
本明細書で使用される「水溶液」という用語は、水の溶液特性を保持する、主成分を水とする溶液のことを意味する。水溶液が水以外の溶媒を含有する場合であっても、典型的には水が主な溶媒である。
本明細書で使用される「カルボキシアルキル」という用語は、一般式−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨを有する基であり、ｎは１〜１８である。
本明細書で用いられる「活性化アルキン」という用語は、他の分子上のアジド反応基と選択的に反応してその活性化されたアルキン基と反応性アルキン基の間の共有結合を形成する化学基のことを指す。反応性アルキン基の例としてはアジドが挙げられる。「反応性アルキン」はまた、アルキン基と選択的に反応する化学基を有する分子であってもよい。
本明細書で用いられる「親和性」という用語は、２つの分子、例えば抗体と抗原との、又は正荷電基と負荷電基との結合相互作用の程度のことを指す。抗体などの二価の分子の場合、親和性は典型的には、抗原と１つの結合性領域との結合力（例えば抗原と１つのＦａｂフラグメントとの）として定義される。両方の結合ドメインと、抗原との間の結合力を「アビディティ」と称する。本発明では、「高い親和性」とは、リガンドが、阻害ＥＬＩＳＡよって算出したときに１０４Ｍ−１（典型的には１０５〜１１１１Ｍ−１）より大きい親和性定数（Ｋａ）で抗体と結合するか、又は相当する技術（例えばスキャッチャードプロット又はＫｄ／解離定数）を使用して測定される同様の親和性（その場合はＫａの逆数となる）で結合することを指す。
本明細書で用いられる「反応性アルキン」という用語は、他の分子上のアルキン修飾基と選択的に反応して、アルキン修飾基とアルキン反応基との間に共有結合を形成する化学基のことを指す。反応性アルキン基の例としてはアジドが挙げられる。「反応性アルキン」はまた、アルキン基と選択的に反応する化学基を有する分子であってもよい。
「抗体」（本明細書で用いられる）という用語は、形に非共有結合的に抗体−抗原複合体を特定の物質（例えば抗原及び免疫原）に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）超科のタンパク質をいう。抗体は内在性でありえる、又は動物がポリクローナル抗体反応を誘発するために予防接種を受けるポリクローナル抗体、又は、組換え型によって、単クローン抗体に結びついている方法は細胞又は他の細胞系をハイブリドーマから作り出した。本明細書で用いられる用語「抗体」がその範囲の中で従来は、使用する動物のいずれかに由来する免疫グロブリンの様々な種類又はサブクラスのいずれかを含むものと理解される。
本明細書で使用される「抗体フラグメント」という用語は、完全抗体中の、主要な選択的結合性を有する抗体断片のことを意味する。具体的な断片は当該技術分野においては公知（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２（様々なプロテアーゼ、ペプシン又はパパインとのインキュベートにより得られる））であり、完全抗体のＦｃフラグメントを欠く、又は「半分子」フラグメントと称されるものであり、完全抗体の重鎖部分を結合させているジスルフィド結合還元的に分解することにより得られる。また、かかる断片としては、軽鎖可変部からなる単離された断片、重鎖及び軽鎖の可変部からなる「Ｆｖ」断片、及び軽鎖及び重鎖可変部がペプチドリンカーで結合している組換え１本鎖ポリペプチド分子が挙げられる。他の結合断片の例としては、（ｉ）ＶＨ及びＣＨ１領域からなるＦｄフラグメント、（ｉｉ）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ，ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４（１９８９））（ＶＨ領域からなる）、（ｉｉｉ）単離されたＣＤＲ領域、及び（ｉｖ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（上記）が挙げられる。更に、組換え技術を使用して、抗原認識特性が保持されている任意の断片を作製することもできる。
本明細書で用いられる用語「抗原」とは、抗体の形成を誘導する若しくは誘導することができる分子、又は抗体が選択的に結合する分子のことを指し、限定されないが、生体物質が例として挙げられる。抗原はまた「免疫原」とも称される。標的結合性抗体は選択的に抗原（本願明細書では用語「標的」と同義的に用いられる）と結合する。
本明細書で使用される「抗領域抗体」という用語は、選択された部位（外部抗体の断片）を用いて動物を免疫化することにより得られた抗体を意味し、当該断片のみが免疫原として用いられていることを特徴とする。抗体の領域としては、Ｆｃ部位、ヒンジ領域、Ｆａｂ部位などが挙げられる。抗領域抗体には、モノクローナル及びポリクローナル抗体が包含される。本明細書で使用される「抗領域断片」という用語は、本発明の抗領域抗体から、酵素学的処理によって得られた一価の断片のことを意味する。
本明細書で使用される「水溶液」という用語は、水の溶液特性を保持する、主成分を水とする溶液のことを意味する。水溶液が水以外の溶媒を含有する場合であっても、典型的には水が主な溶媒である。
本明細書で使用される「アジド反応性基」という用語は、他の分子上のアジド修飾基と選択的に反応して、アジド修飾基とアジド反応基との間に共有結合を形成する化学基のことを意味する。アジド反応性基の例としては、アルキン及びホスフィン（例えばトリアリールホスフィン）が挙げられる。「アジド反応性」はまた、選択的にアジド基と反応する化学基を含有する分子であってもよい。
本明細書で用いられる用語「生体分子」とはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、糖、オリゴ糖、脂質、ホルモン、プロテオグリカン、糖質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類などの、生物中に存在する分子の典型的な形質を有する物質のことを指し、それらは天然由来であっても、人工的なもの（自然界に存在せず、自然界に存在する分子と同一でないもの）であってもよい。
本明細書で使用される「バッファー」という用語は、化学物質の付加又は欠失に対して、溶液の酸性度又は塩基性度の変化を最小化するためのシステムのことを意味する。
本明細書で使用される「担体分子」という用語は、本発明の化合物と共有結合する、生物学的又は非生物学的成分のことを意味する。かかる成分としては、限定されないがアミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬剤、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー性の微粒子、生物細胞、ウイルス及びそれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書で用いられる「化学ハンドル」という用語は、特異的な官能基（例えばアジド、アルキン、活性アルキン、亜リン酸エステル、ホスフィンなど）のことを指す。当該化学ハンドルとは、反応基（以下で定義される）とは別であり、当該化学ハンドルは天然に生じる生体分子には存在せず、生体分子（例えば未変性の細胞成分）に対しては化学的に不活性である化学基のことを指す。しかしながら、アジド−又はアルキン反応基と反応したとき、当該反応は生物学的な反応条件（例えば過剰な熱又は強力な反応物質の非存在下で細胞培養するときの条件）下で効率的に行われる。
本明細書で用いられる用語「クリックケミストリー」とは、アジド及び末端アルキンとの間のＨｕｉｓｇｅｎ環付加又は１，３−双極子環付加により１，２，４−トリアゾールが形成される反応のことを指す。かかる化学的反応においては、限定されないが、単純なヘテロ原子有機反応物質を用いることにより、信頼性が高く、選択的で、立体特異的で、発熱性の反応を実施することが可能となる。
本明細書で使用される「環付加」という用語は、２つ以上のπ（パイ）電子系（例えば不飽和分子又は同じ分子の不飽和部分）が結合して、結合の多様性の正味の減少を示す環式生成物を形成する化学反応のことを意味する。環付加においては、π（パイ）電子により新規なπ（パイ）結合が形成される。環付加による生成物のことを「付加物（アダクト）」又は「環付加物」と称する。異なるタイプの環付加が当該技術分野において公知であり、例えば［３＋２］環付加及びディールス−アルダー反応などが挙げられるがこれらに限定されない。［３＋２］環付加（１，３−双極子環付加とも呼ばれている）は１，３−双極子及び双極子親和性物質との間で生じ、５員の複素環の形成の際に典型的に用いられる。「［３＋２］環付加」の用語はまた、Ｂｅｒｔｏｚｚｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００４，１２６：１５０４６−１５０４７に記載されているアジド及びシクロオクチン誘導体及びジフルオロシクロオクチンとの間の「銅を含まない」［３＋２］環付加を包含する。
本明細書で用いられる用語「検出可能な反応」とは、シグナルの発生又は変化であって、観察又は機器の使用によって、直接又は間接的に検出可能なそれらのことを指す。典型的には、検出可能な反応はシグナルの発生であり、フルオロフォアが固有の蛍光を発し、金属イオン又は生物学的化合物との結合によっても即座にシグナルの変化を生じさせないことを特徴とする。あるいは、当該検出可能な反応は、吸光度若しくは蛍光の波長分布パターン若しくは強度の変化、又は軽い散乱、蛍光の持続時間、蛍光偏光の変化、又は上記パラメータの組合せをもたらす光学的反応であってもよい。他の検出可能な反応としては、例えば化学発光、リン光、放射性同位元素からの放射、磁力及び電子密度などが挙げられる。
本明細書で使用される「検出可能な程に顕著な」という用語とは、観察若しくは器具の使用によって、物理的性質を識別若しくは分離できるシグナルのことを指す。例えばフルオロフォアは、スペクトル特性、蛍光強度、生存期間、偏光、又はサンプル中の他のフルオロフォア及び任意にさせてもよい更なる物質による光減少速度によって、容易に識別できる。
本明細書で用いられる「直接検出可能な」という用語は、材料の存在、又は当該材料から発生するシグナルが、化学修飾又は更なる物質の存在を必要とせずに、観察、機器の使用又はフィルムによって、容易に検出できる状態のことを指す。
本明細書で用いられる用語「フルオロフォア」とは、固有に蛍光を発する組成物、又は生物学的化合物若しくは金属イオンと結合すると即座に蛍光の変化を示す蛍光発生組成物のことを指す。フルオロフォア中に、フルオロフォアの溶解性、分光特性又は物理的性質を変化させる置換基を含有させてもよい。多くのフルオロフォアが当業者に公知であり、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンズアゾール、ボラポリアザインダセン、フルオレセイン、ローダミン及びロードールなどのキサンテン、並びにＲＩＣＨＡＲＤ Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（１０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＤ−ＲＯＭ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００５）に記載の他のフルオロフォアなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる用語「糖タンパク質」とは、グリコシル化されたタンパク質、及びインビボ又はインビトロで酵素により修飾され、糖基を含有するに至ったタンパク質のことを指す。
本明細書で使用される「キット」という用語は、関連する成分、典型的には１つまたは複数の化合物又は組成物がパッケージされているセットのことを意味する。
本明細書で用いられる「ラベル（標識）」という用語は、標的又は化合物と結合し、本発明の方法において、用いられる、直接又は間接的に検出可能（例えばその分光特性、コンホメーション又は活性に関して）である化学部分又はタンパク質を指し、例としてはレポーター分子、固体支持体及び担体分子などが挙げられる。ラベルは、直接検出可能であってもよく（フルオロフォア）、又は間接的に検出可能であってもよい（ハプテン又は酵素）。かかるラベルとしては、限定されないが、放射線計数装置で測定できる標識用の放射性同位元素、分光光度計で視覚的に観察若しくは測定できる色素、染料又は他の色素源、スピンラベルアナライザで測定できるスピンラベル、並びに蛍光ラベル（フルオロフォア）、（出力シグナルは適切な分子アダクトの励起によって、生じ、またそれはが色素により吸収される光を用いた励起によって、視覚化できるか、又は例えば標準的な蛍光光度計又はイメージングシステムにより測定できる）などが挙げられる。当該標識は化学発光基質であってもよく、その場合、出力シグナルはシグナル化合物の化学修飾、金属含有物質又は酵素によって生じ、その場合、酵素依存性の二次シグナル（例えば無色の基質からの有色物質の形成）が生成する。標識という用語はまた、共役分子と選択的に結合できる「タグ」又はハプテンであってもよく、当該共役分子は、基質と共にその後添加されると、検出可能なシグナルを生成することを特徴とする。例えば、タグとしてビオチンを使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のアビジン又はストレプトアビジン複合体を使用してタグと結合させ、更に比色定量用の基質、例えばテトラメチルベンジジン、ＴＭＢ、又は蛍光基質、例えばＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製を使用してＨＲＰの存在を検出できる。多くの標識が当業者に公知であり、例えばＲＩＣＨＡＲＤ Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＰＲＯＤＵＣＴＳ（９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＤ−ＲＯＭ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００２）に記載の粒子、フルオロフォア、ハプテン、酵素及びそれと反応する比色定量用、蛍光及び化学発光基質、並びにその他の標識などが使用可能であるが、これらに限定されない。
本発明の用語「リンカー」又は「Ｌ」とは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰからなる群から選択される１〜３０の非水素原子からなる単一の共有結合又は一連の安定な共有結合のことを意味する。典型的なリンカー部材としては、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−などの部分が挙げられる。「切断可能なリンカー」とは、反応又は反応条件の結果、開裂されうる１つまたは複数の切断可能な基を有するリンカーのことを指す。「切断可能な基」という用語は、複合体の残基と放出部分との間の結合を切断することによって、複合体の残基から複合体の一部（例えばレポーター分子、担体分子又は固体支持体）を放出させることができる基のことを指す。かかる裂開は、自然のいずれの化学製品でもあるか、又は酵素で仲介した。典型的な酵素学的に切断可能な基としては、天然アミノ酸をその末端に有する天然アミノ酸又はペプチド配列が挙げられる。 酵素学的に切断可能な基に更に、酵素以外の物質による反応により切断される１つまたは複数の基も、本発明の範囲内に包含される。典型的な非酵素的な切断物質としては、限定されないが酸、塩基、光（例えばニトロベンジル誘導体、フェナシル基、ベンゾインエステル）及び熱が挙げられる。多くの切断可能な基が従来技術において公知である。例えば、Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７６１：１５２−１６２（１９８３）、Ｊｏｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１４５１８−１４５２５（１９９０）、Ｚａｒｌｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：９１３−９２０（１９８０）、Ｂｏｕｉｚａｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５５：１４１−１４７（１９８６）、Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：２０５−２１０（１９８６）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１８５９−１８６７（１９８９）を参照。更に、汎用性の切断可能な二官能性（ホモ−及びヘテロ二官能性）スペーサーアームが市販されている。典型的な切断可能な基（エステル）は、化学物質（例えば水酸化ナトリウム）により切断されて、カルボン酸含有断片及びヒドロキシル含有生成物を生じさせることができる化合物のことを指す。
本願明細書において用いられる用語「翻訳後部分」とは、組換型又は天然型の酵素によって、翻訳後修飾により、タンパク質に天然に結合されるあらゆる部分のことを指す。例としては、限定はされないが、酢酸、リン酸、様々な脂質及び糖質が挙げられる。本発明では、「アジド又はアルキン修飾された翻訳後部分」とは、アジド又はアルキン基を含んでなり、天然の生体系において滅多に存在しない基である、あらゆる翻訳後部分のことを意味する。
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の用語は、一般的な意味において、本願明細書において、用いられ、あらゆる長さのアミノ酸残基のポリマーが包含される。「ペプチド」という用語は、１００未満のアミノ酸残基（典型的には１０アミノ酸残基未満）を有するポリペプチドを指す用語として本願明細書で用いられる。当該用語には、天然のアミノ酸ポリマーのみならず、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的なアナログであるアミノ酸ポリマーも包含される。
本明細書で使用される「精製された」という用語は、糖タンパク質の調製物が、例えば血清タンパク質又は細胞溶解物のようなタンパク質又は複合体が内因的に存在する細胞混合物又は環境において、通常糖タンパク質に関連して存在するコンタミタンパク質を実質的に含まないことを指す。
本明細書で使用される「反応基」という用語は、他の化学基と反応して共有結合を形成できる（すなわち適切な反応条件下で共有結合反応を生じさせる）基のことを指し、一般には、他の物質との結合部位を表す基のことを意味する。本発明では、反応基とは一般に生物学的な系に存在する部分であって、通常の生物学的条件下で反応する化学基のことを指し、これらは本発明のアジド及び活性化アルキン部分とは区別されるものとして本願明細書において記載する。当該反応基は例えばカルボン酸又はスクシンイミジルエステル部分であり、異なる化合物に存在する官能基と反応して共有結合を形成することができる。反応基には一般に、求核試薬、求電子試薬及び光励起基が包含される。
「レポーター分子」という用語は、本発明の修飾された翻訳後修飾されたタンパク質に結合でき、直接又は間接的に検出できる部分のことを指す。当該レポーター分子としては、クロモフォア、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素及び放射性同位元素が挙げられるが、これらに限定されない。好適なレポーター分子としては、フルオロフォア、蛍光タンパク質、ハプテン及び酵素が挙げられる。
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、目的の検体又は本発明の修飾された翻訳後修飾タンパク質を含有する、あらゆる材料のことを意味する。検体は、例えば本発明の化合物を検体と複合体させることができる基などの反応基を含んでもよい。またサンプルには、希釈剤、バッファー、界面活性剤、並びに不純物、破片などの、通常標的と混合している物質が含まれていてもよい。例としては、尿、血清、血漿、全血液、唾液、涙液、脳脊髄液、乳首からの分泌液などが挙げられる。そのほか、液状材料（例えばバッファー、抽出液、溶媒など）中に溶解させた粘液、体組織、細胞などの固体状、ゲル状又はゾル状物質であってもよい。典型的には、サンプルは生存細胞、内因性の宿主細胞タンパク質含む生体液、核酸ポリマー、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド及び緩衝溶液である。当該サンプルは水溶液に存在してもよく、生存可能な細胞培養液であってもよく、又はポリアクリルアミドゲル、ブロット膜又はマイクロアレイなどの固体又は半固体表面に固定化してもよい。
本明細書で用いられる「固体支持体」という用語は、選択された溶媒システムにおいて、実質的に不溶若しくは、又は、それを溶解させる所定の溶媒システムから通常隔離されうる（例えば沈殿されている）材料のことを指す。本発明を実践する際に有用な固体支持体は、活性化される、または活性化可能であり、本明細書に記載の選択された一つまたは複数の化合物を固体支持体基に結合することを可能にする基を含むことができる。
本明細書で用いられる用語「シュタウディンガー結合反応」とは、Ｓａｘｏｎ及びＢｅｒｔｏｚｚｉにより開発された化学的反応（Ｅ．Ｓａｘｏｎ及びＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８７：２００７−２０１０）であって、古典的なシュタウディンガー反応の変形反応のことを指す。古典的なシュタウディンガー反応はホスフィン又は亜リン酸エステルとアジドの組合せによりアザ−イリド中間体を生じさせる化学的反応であり、それは加水分解時にホスフィンオキシド及びアミンを生じさせる。シュタウディンガー反応はアジドをアミンに還元する穏やかな方法であり、トリフェニルホスフィンが還元剤として通常用いられる。シュタウディンガー連結反応においては、求電子性のトラップ（通常メチルエステル）をトリアリールホスフィンに適切に配置（通常リン原子に対してオルト）し、アジドと反応させ、アザ−イリド中間体を調製し、更にそれを水性溶媒中で調製してアミド基及びホスフィンオキシド官能基を有する化合物を得る。シュタウディンガー連結反応は、２つの開始分子が結合（接触／共有結合）するためにかかる名称を有するが、古典的なシュタウディンガー反応では、２つの生成物は加水分解の後に共有結合しない。
本願明細書において使用される「［生体分子］の構造の統一性が損なわれていない」又は「［生体分子］の構造の統一性が維持されている」という用語は、１）ゲル電気泳動及び検出（例えば染色）により分析したとき、標識された生体分子に由来するバンド又はスポットの強度が２０％以上、好ましくは１０％以上減少していない（分析対象の標識された生体分子に由来する、同じ量の電気泳動された非標識の生体分子に起因する対応する、バンド又はスポットと比較した場合）こと、又は、２）ゲル電気泳動で分析したとき、標識された生体分子に由来するバンド又はスポットが、同一量の電気泳動された非標識の生体分子に由来する対応するバンド又はスポットより顕著に不明瞭である（「顕著に不明瞭である」（「顕著に拡散されている」と同義）とは、検出可能なバンド又はスポットが、対応する非標識の生体分子より、少なくとも５％超、好ましくは１０％超、更に好ましくは２０％超の面積でゲル中に現れていることを指す）ことを指す。標識された生体分子の構造統一性に関する他の再現性ある試験方法としては、放出されるアミノ酸又はペプチドの検出又は質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。
一般に、本発明を理解することの容易さ、アジド部分、アルキン部分又はホスフィンを有する生体分子の代謝及び酵素の標識化及びアジド反応性部分を有するかかる半分の化学標識化のために、アルキン反応性半分又はホスフィン反応性半分は、最初に詳述する。その後に、かかる標識生体分子が検出、分離及び／又は分析できることを示す若干の実施例を記載する。以下に例示的な方法を示す。
生体分子の修飾
糖タンパク質、リンタンパク質、イソプレニル化されたされたタンパク質を含む生体分子のタギング／標識化は、バイオオルトゴナル部分を生体分子に組み込み、標識（レポーター分子、固体支持体及び担体分子）との化学結合を形成させるための様々な翻訳後修飾を利用できる。代替法としては、バイオオルトゴナル部分を細胞の生合成経路又は代謝修飾を使用して生体分子に組み込むことである。これらのバイオオルトゴナル部分は非天然の、混乱を生じさせない化学ハンドルであり、非常に選択的な反応により修飾されうる特殊な化学的機能を有している。かかる部分の例としては、例えばヒラジド及びアミノオキシ誘導体、ホスフィン（シュタウディンガーライゲーション反応）によって選択的に修飾されうるアジド、活性化アルキンによって選択的に修飾されうるアジド及び末端アルキン（「クリック」ケミストリー）によって選択的に修飾されうるアジドが挙げられる。
翻訳後修飾とは、タンパク質が翻訳された後の、タンパク質の一次構造の変更のことを指す。翻訳の後、翻訳後修飾により、他の生化学官能基（例えば酢酸、リン酸、様々な脂質及び糖質）を、アミノ酸のそれに結合させることによって、タンパク質の機能範囲が拡張される。更に、タンパク質の機能範囲は、アミノ酸の化学性質を変える翻訳後修飾によって、又は、構造変化（例えばジスルファイド架橋構造）をもたらすことにより拡張されてもよい。他の翻訳後修飾は、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）からアミノ酸を除去するか、又はタンパク質鎖を切断する酵素の使用を含む。翻訳後修飾は、個々の残基に対して、特異的な部位における裂開、欠失、付加により、又は側鎖を変換若しくは修飾することにより作用する。
本発明の方法、及び本願明細書に記載されている組成物に使用できる様々な翻訳後修飾としては、裂開、Ｎ末端の延長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化（ビオチンによるリジン残基のアシル化）、Ｃ末端のアミド化、グリコシル化、ヨウ素化、補綴基の共有結合、アセチル化（アセチル基の付加、通常、タンパク質のＮ末端）、アルキル化（通常リジン又はアルギニン残基のアルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル）基の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰリボシル化、共有結合による架橋（ポリペプチド鎖内若しくは鎖間）、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性の修飾（プロリン及びリジンのヒドロキシル化及びカルボキシ末端のアミド化）、ビタミンＫ依存性の修飾（ビタミンＫがグルタミン酸残基のカルボキシル化の補因子として機能し、γ−カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ残基）を形成させる、グルタミル化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（グリシン残基の共有結合）、グリコシル化（グリコシル基のアスパラギン、ヒドロキシリシン、セリン又はトレオニンへの付加による糖タンパク質の形成）、イソプレニル化（イソプレノイド基（例えばファルネソール及びゲラニルゲラニオール）の付加）、リポイル化（リポエート基の結合）、ホスホパントテイニル化（補酵素Ａからの４’−ホスホパントテイニル部分の付加、脂肪酸、ポリケチド、非−リボソームペプチド及びロイシン生合成などにおける）、リン酸化（リン酸基の付加、通常セリン、チロシン、トレオニン又はヒスチジンに対する）及び硫酸化（スルフェート基の付加、通常チロシン残基に対する）などが挙げられる。アミノ酸の化学性質を変化させる翻訳後修飾としては、限定はされないが、シトルリン化（脱イミノ化によるアルギニンのシトルリンへの変換）及び非アミド化（グルタミンからグルタミン酸、又はアスパラギンからアスパラギン酸への変換）が挙げられる。構造変化を含む翻訳後修飾としては、限定はされないが、ジスルフィド架橋（２つのシステインアミノ酸の共有結合）の形成、及びタンパク質分解（ペプチド結合のタンパク質の裂開）が挙げられる。特定の翻訳後修飾では、他のタンパク質又はペプチドの付加（例えばＩＳＧ化（ＩＳＧ １５タンパク質（インターフェロン刺激された遺伝子）との共有結合）、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯタンパク質（小さいユビキチン関連の修飾因子）との共有結合）、及びユビキチン結合（タンパク質ユビキチンとの共有結合）を必要とする。一実施形態では、セレン含有タンパク質が、本願明細書に記載の方法及び組成物において用いられる。
糖タンパク質は、糖質が共有結合しているタンパク質を含む生体分子である。特定の翻訳後修飾はタンパク質上へ糖部分（糖質又はオリゴ糖）を付加し、それによって糖タンパク質を形成する。糖タンパク質に存在する通常の単糖類は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ、別名シアル酸）などが挙げられる、これらに限定されない。更に、糖部分はグリコシル基であってもよい。糖タンパク質において、糖質はＮ−グリコシル化又はＯ−グリコシル化によってタンパク質成分に結合してもよい。Ｎ−グリコシル化は通常、アスパラギンのアミド基を介してＮ−グリコシド結合を形成することによって生じる。Ｏ−グリコシル化では通常、ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、セリン又はトレオニンにおいてＯ−グリコシド結合が形成される。
アジド糖を有する糖タンパク質を代謝的に標識することに関する技術が公知であるが、現在周知の方法はかかるアジド修飾糖タンパク質を検出して、分離するための方法論が欠如している。本発明では、天然糖ではなく、非天然アジド糖の糖タンパク質への取り込み及び使用による、グリコシル化されたタンパク質及び検出、分離及び／又は分析のための方法及び組成物が提供される。特に、Ａ）溶液中でアジド修飾された生体分子を標識し、更にサイズ、重量及び／又は電荷に基づいて、公知技術の分離を使用して生体分子を単離する、Ｂ）固定化されたアジド修飾された生体分子を標識する、及びＣ）アジド基を有する生体分子を酵素的に標識する、新規な方法が提供される。これらのアジド修飾された生体分子は、公知の方法又は本発明の方法を用いて、アジドとの反応性を有する基を有するレポーター分子、担体分子又は固体支持体と複合体を形成することができる。
また、本願明細書において提供するグリコシル化されたタンパク質の検出、分離及び／又は分析のための方法及び組成物は、天然糖よりもむしろ、非天然のアルキン含有糖の使用及び糖タンパク質への取り込みによって可能となる。特に、Ａ）溶液中でアルキン修飾された生体分子を標識し、更にサイズ、重量及び／又は電荷に基づいて、公知技術の分離を使用して生体分子を単離する、Ｂ）固定化されたアルキン修飾された生体分子を標識する、及びＣ）アルキン基を有する生体分子を酵素的に標識する、新規な方法が提供される。これらのアルキン修飾された生体分子は、公知の方法又は本発明の方法を用いて、アジド基を有するレポーター分子、担体分子又は固体支持体と複合体を形成することができる。
本願明細書に記載の方法は、様々なサブクラスの糖タンパク質（細胞表面のＮ−及びＯ−結合糖タンパク質、及び細胞内のＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質など）の代謝的及び酵素的な、選択的標識化に使用できる。かかる標識により、クロマトグラフィー及び電気泳動技術（ゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析など）を使用して、標識された糖タンパク質の高感度な検出が可能となる。（Ｄｕｂｅ Ｄ．Ｈ．，Ｂｅｒｔｏｚｚｉ Ｃ．Ｒ．（２００３）．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． Ｏｃｔ；７（５）：６１６−２５；Ｂｏｅｇｇｅｍａｎ Ｅ．Ｅ．，ＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎＢ．，Ｑａｓｂａ Ｐ．Ｋ．（２００３）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ／Ａｕｇ；３０（２）：２１９−２９；Ｋｈｉｄｅｋｅｌ Ｎ．，Ａｒｎｄｔ Ｓ．，Ｌａｍａｒｒｅ−Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｎ．，Ｌｉｐｐｅｒｔ Ａ．，Ｐｏｕｌｉｎ−Ｋｉｒｓｔｉｅｎ Ｋ．Ｇ．，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｂ．，Ｑａｓｂａ Ｐ．Ｋ．，Ｈｓｉｅｈ−Ｗｉｌｓｏｎ Ｌ．Ｃ．（２００３）．ＪＡｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｄｅｃ ３１；１２５（５２）：１６１６２−３を参照）。一実施形態では、糖タンパク質はアジド修飾された糖部分で「標識」され、その一方で、他の実施形態では、糖タンパク質はアルキン修飾された糖部分で「標識」されている。これは代謝的（細胞に、非天然のアジド若しくはアルキンを含む糖を取り込ませる）に実施してもよく、又は酵素的な方法でインビトロで実施してもよい。かかる酵素的な方法の特定の実施形態では、ガラクトース−１−リン酸ウリジル転移酵素（ＧａｌＴ）酵素を用いて、タンパク質にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ部分を組み込む。
リンタンパク質は、１つまたは複数のセリン、トレオニン又はチロシン残基に共有結合するリン酸基を有するタンパク質を含む生体分子である。リン酸基はキナーゼによって、タンパク質に翻訳後付与され、ホスホリラーゼにより除去される。タンパク質のリン酸化状態の変化は、その構造及び機能に重要な影響を及ぼしうる。
リンタンパク質及びリンペプチドは、アジド又はアルキン基の付加により修飾されうる。例えば、リンタンパク質上の１つまたは複数のリン酸基は、塩基処理を用いてホスホセリンのリン酸基を除去するか、デヒドロアミノ−２−酪酸に変換するか、又はトレオニンのリン酸基を除去してデヒドロアラニンに変換することにより、アジド若しくはアルキンに変換させることができる。脱ホスホリル化されたタンパク質を更に、アジド又は末端アルキンを有するチオール又はアミン含有化合物と反応させて、アジド又はアルキン標識された（ホスホ）タンパク質を形成させることができる。かかる修飾リンタンパク質は、本明細書において、修飾されたリンタンパク質と称されるが、修飾されたリンタンパク質の全てのリン酸基は除去されてもよい。
ゆえに本発明は、アルキン又はアジド基でリンタンパク質を修飾する方法の提供に関する。当該方法は、少なくとも１つのホスホセリン残基又は少なくとも１つのホスホスレオニン残基を含むリンタンパク質を、塩基性溶液と接触させて、リン酸化されたタンパク質のトレオニン及びセリン残基からリン酸を除去し、少なくとも１つのデヒドロアラニン又は少なくとも１つのデヒドロアミノ−２−酪酸を含むタンパク質を形成させる段階と、前記デヒドロアラニン又はデヒドロアミノ−２−酪酸を、チオ又はアミン基を含み、アジド又は末端アルキンを有する化合物と接触させて、アジド又はアルキン修飾タンパク質を形成させる段階と、アジド若しくは末端アルキン修飾タンパク質を、アジド部分を有するレポーター分子、担体分子又は固体支持体と接触させる段階を含む方法であって、当該リンタンパク質が、末端アルキン、レポーター分子、担体分子又はアルキンを有する固体支持体で標識され、当該リンタンパク質がアジド基で修飾される方法である。アジド又はアルキン基を有する修飾されたリンタンパク質を、本願明細書において提供される標識方法に用いることができる。
代謝的修飾
本願明細書に記載の方法及び組成物において用いる修飾タンパク質は、インビボでの代謝的修飾により形成されてもよい。タンパク質のかかるインビボ代謝的修飾は、米国特許第６，９３６，７０１号に記載されている方法を使用して実施してもよい。一般に、細胞は、アジド部分及びアルキン部分及びホスフィン部分などの所望の官能基を有する非天然の糖を取り込む性質を有する。これらの非天然の糖は更に、タンパク質と結合して糖タンパク質複合体を形成し、更に細胞表面に現れる。修飾タンパク質は天然に分泌若しくは分離されるか、例えば細胞溶解物、細胞外物質、細胞フラクションに存在するか、又はタンパク質混合物から分離される。得られる修飾タンパク質は、本願明細書に記載の方法及び組成物に用いられる。
一実施形態では、かかる非天然の糖は、細胞への取り込み促進する部分（テトラアセチル部分など）を有する。ゆえに、非天然の糖基質（本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する、タンパク質への代謝的標識に使用）は、細胞メカニズムにより取り込まれそうな小さい基を含み、異物として認識されない。細胞代謝メカニズムにより、タンパク質に結合するＮ−若しくはＯ−結合グリカンに、基質が組み込まれる。
本願明細書において提供される方法の一態様は、タンパク質を、アジド基又はアルキン基を有する非天然の糖基質で代謝的に標識することを含んでなり、この方法論は、本願明細書に記載の「クリック」ケミストリーにおいて使用できる。本願明細書において提供される方法の他の態様は、タンパク質を、アジド基又はホスフィン基を有する非天然の糖基質で代謝的に標識することを含んでなり、この方法論は、本願明細書に記載のシュタウディンガーライゲーション反応において使用できる。かかる非天然の糖は、公知技術の方法を使用して合成されてもよい。特定の実施形態において、タンパク質を代謝的に標識するために用いる非天然の糖は、ＧｌｃＮＡｚ、ＧａｌＮＡｚ及びＭａｎＮＡｚなどの非天然のアジド含有糖、又はテトラアセチル化されたＧｌｃＮＡｚ、ＭａｎＮＡｚ及びＧａｌＮＡｚなどの非天然のアジド含有糖である。一実施形態では、糖タンパク質の代謝的標識に用いられる当該非天然の糖、又は培養細胞中の細胞内糖タンパク質の特定のサブセットは、ＧｌｃＮＡｚ、ＧａｌＮＡｚ及びＭａｎＮＡｚなどの非天然のアジド含有糖、又はテトラアセチル化されたＧｌｃＮＡｚ、ＭａｎＮＡｚ及びＧａｌＮＡｚなどの非天然のアジド含有糖である。非天然のアジド含有糖による代謝的標識の具体的実施形態を図１に示し、実施例１に記載する。そこでは、細胞を、本願明細書に記載の方法及び組成物を使用して、非天然のアジド含有糖でフィードし、修飾タンパク質（修飾糖タンパク質を含む）が得られる。図２は、Ｊｕｒｋａｔ細胞から得られた修飾タンパク質のゲルイメージを示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ又はＡｃ４ＧａｌＮＡｚで３日（Ａ）、又はＡｃ４ＧｌｃＮＡｚで一晩（Ｂ）フィードした。修飾タンパク質は回収された細胞から調製され、「クリック」ケミストリー（Ｃ）を使用して蛍光アルキンプローブで標識した。ゲルは更に、アルキンプローブとは異なる励起／放射特性を有するタンパク質染色液で染色し、それにより、糖タンパク質標識における「クリック」ケミストリーの選択性が示された。
代謝的に、非天然の糖で標識されたタンパク質（「クリック」ケミストリー又はシュタウディンガーライゲーション反応を使用して標識）を、二次元ゲル電気泳動を使用して検出してもよい。図３は、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚで処理し、クリックケミストリーを使用して蛍光アルキンプローブで標識した可溶性Ｊｕｒｋａｔ細胞から調製したタンパク質の二次元ゲル分離を示す。対照細胞ではＡｃ４ＧｌｃＮＡｚを取り込ませず、ゆえに蛍光アルキンプローブの存在が示されなかった。しかしながら、タンパク質染色においては、両方のゲルにおいてタンパク質の存在が示された。
本願明細書に記載されている非天然の糖は、糖タンパク質の様々な糖タンパク質及びサブクラスに組み込まれることができる。一実施形態では、糖タンパク質は、抗体産生細胞（例えば例えばハイブリドーマ細胞、並びに抗体又は組換え抗体を産生する他のいかなる細胞も）由来の抗体である。インビボ標識された抗体が放出された後、細胞から分離し、本願明細書に記載さの標識された抗体を、アジド反応性レポーター分子、固体支持体又は担体分子を使用して直接標識することができる。レポーター分子としては、限定されないがラベルなどが挙げられ、一方、固体支持体としては、限定されないが固体支持体樹脂、マイクロタイタープレート及びマイクロアレイスライドなどが挙げられる。担体分子としては、限定はされないが親和性タグ、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリマーが挙げられる。
酵素的修飾
本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する修飾タンパク質は、酵素による翻訳後修飾を使用して、インビトロで修飾されてもよい。具体的な実施形態では、本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する翻訳後修飾としては、グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化及びリン酸化が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、かかる翻訳後修飾を用いて、アジド部分、アルキン部分又はホスフィン部分でタンパク質を修飾する。かかるホスフィン部分としては、限定されないがトリアリールホスフィンが挙げられる。特定の実施形態では、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその変異体を利用し、アジド部分、アルキン部分又はホスフィン部分でグリコシル化タンパク質を修飾する。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）は、ウリジン二リン酸−ＧａｌＮＡｚ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ）から末端のＧｌｃＮＡｃ基へのガラクトース転移を触媒できる酵素である。すなわち、糖タンパク質は、アジド修飾された糖部分、アルキン修飾された糖部分又はホスフィン修飾子糖部分により、インビトロにおいて酵素的に標識される。他の実施形態では、ＧａｌＴを変異させ（例えば単一のＹ２８９Ｌ突然変異）、結合ポケットを拡張し、基質に対する触媒活性を強化する。ＧａｌＴに対する他の突然変異も、当該突然変異が基質に対する結合ポケットの拡大及び触媒活性の強化を提供する限りにおいて、本発明に包含される。図６Ａ−Ｂに示すように、β−ＧａｌＴ酵素（β−ＧａｌＴ１）の変異体は、アジド（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ）で、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃを含むタンパク質を酵素的に標識するのに使用できる。更に、図６Ａ−Ｂは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚが、非天然のアジド含有糖を糖タンパク質に酵素的に結合させる、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ１）変異体における適切な基質でもあることを示す。
アジド含有糖、アルキン含有糖又はホスフィン含有糖で糖タンパク質を酵素的に標識するための、本願明細書に記載の方法及び組成物は、翻訳後グリコシル化などの、翻訳後修飾タンパク質の迅速、選択的かつ高感度な検出方法を提供する。本願明細書に記載されているように、かかる検出方法は、「クリック」ケミストリー又はシュタウディンガーライゲーション反応の選択的な反応性を使用した標識を利用する。かかる標識方法は、他の技術を用いてかかる修飾が検知されなかったタンパク質における、翻訳後修飾を検出する際に使用できる。一実施形態では、かかる標識方法は、かかる修飾が他の技術を用いて検知されなかったタンパク質における、翻訳後Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾を検出するために使用できる。
一実施形態では、酵素の翻訳後修飾方法では、含有基質、アルキン含有基質又はホスフィン含有基質を使用して、タンパク質上にアジド、アルキン又はホスフィン官能基を選択的に転移させる。転移を受けた修飾タンパク質はその後、更に「クリック」ケミストリー、シュタウディンガーライゲーション反応又は活性化アルキンベースの反応を使用して、レポーター分子、固体支持体又は担体分子と複合体してもよく、それによって、修飾タンパク質の検出、分離及び／又は分析が可能となる。すなわち、特定の実施形態では、インビトロ酵素的標識は、細胞又は組織からの修飾タンパク質の高感度な検出が可能となる。
一実施形態では、かかる方法を用いて、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ変異体の能力を利用し、選択的に非天然のアジド含有糖を使用してアジド官能基をＯ−ＧｌｃＮＡｃグリコシル化されたタンパク質に、非天然のアルキン含有糖を使用してアルキン官能をＯ−ＧｌｃＮＡｃグリコシル化されたタンパク質に、又は非天然のホスフィンを含む糖を使用してホスフィン官能性をＯ−ＧｌｃＮＡｃグリコシル化されたタンパク質に転移させる。アジド修飾糖タンパク質、アルキン修飾された糖タンパク質又はホスフィン修飾された糖タンパク質を転移させた後、更に「クリック」ケミストリー、シュタウディンガーライゲーション反応又は活性化アルキンベースの反応を使用してレポーター分子、固体支持体又は担体分子に複合体してもよく、それにより修飾タンパク質の検出、分離及び／又は分析が可能となる。すなわち、特定の実施形態では、修飾されたβ−ＧａｌＴＩ酵素によるインビトロ標識により、細胞又は組織からのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の高感度な検出が可能となり、また同じタンパク質上の細胞Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾及びリン酸化の逆関係の評価が可能となる。
本願明細書に記載の方法及び組成物を用いることにより、抗体の標識に使用できるアジド含有糖、アルキン含有糖又はホスフィン含有糖で、抗体を酵素的にインビトロ標識することができる。インビトロ標識された抗体を得た後、標識された抗体を、本願明細書に記載されているアジド反応性、アルキン反応性又はホスフィン反応性レポーター分子、固体支持体又は担体分子で直接標識することができる。一実施形態では、図１１に示すように、抗体は、ＧａｌＴを使用して、抗体糖質に存在する末端のＯＧｌｃＮＡｃ分子の反応を経て、ＵＤＰＧａｌＮＡｚで酵素的に標識できる。「クリック」ケミストリー又はシュタウディンガーライゲーション反応は更に、結合させたアジド部分に色素又はハプテン（例えばビオチン）（又は他のレポーター分子、固体支持体又は担体分子）を複合体するために使用できる。具体的な実施形態では、ＯＧｌｃＮＡｃ糖が抗体に存在しない場合、エンド−Ｈ（エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ）酵素の使用により、１つのＮ−アセチルグルコサミン残基の末端を有する切除された鎖を調製してもよい（図１１Ｂ）。図１７は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚを有するヤギ抗体に酵素で標識し、更に「クリック」ケミストリーを使用してアルキン−ＴＡＭＲＡ色素と結合させる反応を示す。かかるコンジュゲーションの選択性及び特異性は、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質染色による対照及び全タンパク質染色により示される。
本発明にはまた、タンパク質にアジド又はアルキン修飾されたリン酸の結合を経て酵素的にタンパク質を標識する方法が包含される。セリン、トレオニン、更にはチロシン残基をリン酸化するキナーゼは従来技術において周知で、タンパク質にアジド又はアルキン基を結合させるために使用できる。本願明細書においては、末端アルキン修飾されたリン酸を有するリンタンパク質を構成する方法が包含され、詳細には、末端アルキン修飾されたリン酸塩をタンパク質へ転移させる酵素の存在下で、タンパク質を末端アルキン修飾されたリン酸塩と接触させて、末端アルキン修飾されたリンタンパク質を形成させることを含む。いくつかの実施形態では、当該タンパク質は少なくとも１つのセリン、トレオニン又はチロシン残基を有する。本発明にはまた、リンタンパク質複合体を形成するための方法が包含される。当該方法では、リンタンパク質複合体はレポーター分子、固体支持体又は担体分子に結合し、当該方法は、末端アルキン修飾されたリン酸塩をタンパク質へ転移させる酵素の存在下で、タンパク質を末端アルキン修飾されたリン酸塩と接触させて、末端アルキン修飾されたリンタンパク質を形成させる段階と、末端アルキン修飾されたリンタンパク質を、アジド部分を有するレポーター分子、担体分子又は固体支持体と接触させて、リンタンパク質とレポーター分子、担体分子又は固体支持体との複合体を形成させる段階を含む。
本願明細書においてはまた、アジド修飾されたリン酸をタンパク質へ転移させる酵素の存在下で、末端のアジド修飾されたリン酸を有するリンタンパク質を形成させる方法であって、タンパク質をアジド修飾されたリン酸と接触させて、アジド修飾されたリンタンパク質を形成させる方法が包含される。幾つかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも１つのセリン、トレオニン又はチロシン残基を有する。本発明にはまた、リンタンパク質複合体を形成するための方法が包含される。当該方法では、リンタンパク質複合体はレポーター分子、固体支持体又は担体分子に結合し、当該方法は、アジド修飾されたリン酸塩をタンパク質へ転移させる酵素の存在下で、タンパク質をアジド修飾されたリン酸塩と接触させて、アジド修飾されたリンタンパク質を形成させる段階と、アジド修飾されたリンタンパク質を、末端アルキン部分を有するレポーター分子、担体分子又は固体支持体と接触させて、リンタンパク質とレポーター分子、担体分子又は固体支持体との複合体を形成させる段階を含む。
本願明細書に記載の方法は、パルミトイル化及びミリソル化（ｍｙｒｉｓｏｌａｔｉｏｎ）などの翻訳後リポイル化によって、脂質修飾タンパク質の標識にも使用できる。かかる翻訳後修飾において、アジド含有脂質、アルキン含有脂質又はホスフィン含有脂質を用いてアジド部分、アルキン部分又はホスフィン部分をタンパク質へ転移させ、かかる部分を用いて、本願明細書に記載の方法により、レポーター分子、担体分子及び／又は固体支持体で修飾タンパク質を標識する。タンパク質のかかる標識の実施例は、実施例３２及び実施例３３に記載する。
本願明細書に記載の方法は、ファルネシル化及びゲラニルゲラニル化などの翻訳後イソプレニル化による、イソプレノイド基の修飾によるタンパク質の標識に使用できる。かかる翻訳後修飾において、アジド含有イソプレノイド、アルキン含有イソプレノイド又はホスフィン含有イソプレノイドを用いてアジド部分、アルキン部分又はホスフィン部分をタンパク質へ転移させ、かかる部分を用いて、本願明細書に記載の方法でレポーター分子、担体分子及び／又は固体基質による修飾タンパク質の標識を行う。タンパク質のかかる標識の実施例は、実施例３１に記載する。
アジド、アルキン又はホスフィン部分を有する生体分子の化学修飾
本願明細書に記載の方法を用いて化学的に修飾されうる生体分子としては、限定はされないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、糖、オリゴ糖、脂質、ホルモン、プロテオグリカン、糖質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び多糖類が挙げられる。かかる生体分子は、本願明細書に記載されているように、細胞生合成経路（代謝的標識）、又は酵素的標識を経て翻訳後修飾を使用して生体分子に組み込まれるアジド部分、アルキン部分又はホスフィン部分を含んでもよい。あるいは、本願明細書に記載のアジド部分、アルキン部分又はホスフィン部分は、化学合成手順を使用して生体分子に組み込まれてもよい。これらのアジド部分、アルキン部分及びホスフィン部分は非天然の、非撹乱性のバイオオルトゴナル化学部分であり、高度に選択的な反応により修飾されうる、特有の化学的機能を有する。本願明細書に記載の方法で使用するかかる反応としては、アジド部分又はアルキン部分を含む生体分子の化学修飾であって、銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環付加反応（また本明細書において、「クリック」ケミストリーと称される）を利用する反応、並びに、アジド部分又はホスフィン部分を含む生体分子の化学修飾であって、シュタウディンガーライゲーション反応を利用する反応、並びに、活性化アルキン部分又は活性化アルキン反応性部分を含む生体分子の化学修飾を利用する反応が挙げられる。
一実施形態では、本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する生体分子は、化学的に、酵素的に（例えばアジド基又は末端アルキンを含む部分の、生体分子へのインビトロによる酵素的取り込みによって）、又は細胞にアルキン又はアジド含有分子前駆体（例えばアミノ酸又は糖）を供給することによってインビボで生体分子に取り込ませることにより標識できる。かかる方法は、本願明細書に記載されている。
「クリック」ケミストリー
アジド及び末端若しくは内部アルキンは、１，３−二極性の付加環化（Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化）反応を受けて１，２，３−トリアゾールに変化できる。しかしながら、この反応は長い反応時間及び高い温度を必要とする。あるいは、アジド及び末端アルキンは、室温で銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環付加反応（ＣｕＡＡＣ）させることができる。かかる銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環付加（別名「クリック」ケミストリー）は、Ｈｕｉｓｇｅｎの１，３−二極性の環付加反応の変形であり、有機アジド及び末端アルキンが反応して１，４−レギオ異性体又は１，２，３−トリアゾールが形成される。「クリック」ケミストリーの例は、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓら（米国特許出願公開第２００５／０２２２４２７号（２００５年１０月６日に公開）、ＰＣＴ／ＵＳ０３／１７３１１、ルイスＷ Ｇら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔ’ｌ Ｅｄ．４１（６）：１０５３、Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．らの方法、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｅｄ．２００１、４０：２００４〜２０２１）に記載されており、それにより、高収量で、かつヘテロ原子結合（カーボン−カーボン結合以外）の副反応がほとんど生じない態様で反応する試薬が開発され、化合物のライブラリの作成に利用される。本願明細書に記載されているように、「クリック」ケミストリーは生体分子を標識する方法で用いられる。
生体分子の標識に、本願明細書に記載の方法で使用する「クリック」ケミストリーの際の触媒として使用する銅は、Ｃｕ（Ｉ）還元状態である。かかる銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン環付加において使用する銅（Ｉ）の供給源は、ハロゲン化第一銅（例えば臭化第一銅又はヨウ化第一銅）などのあらゆる第一銅の塩であってもよい。しかしながら、この部位選択的な環付加は、金属触媒及び還元剤の存在下で実施してもよい。一実施形態では、Ｃｕ（ＩＩ）の減少によってＣｕ（Ｉ）がインサイチューで形成される還元剤の存在下で、Ｃｕ（ＩＩ）還元条件において（例えば、Ｃｕ（ＮＯ３）２Ｃｕ（ＯＡｃ）２又はＣｕＳＯ４などの塩として）銅を使用してもよい。かかる還元剤としては、限定されないが、アスコルビン酸塩、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ硫酸塩、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ１、グルタチオン、システイン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋又は印加電位が挙げられる。他の実施態様において、還元剤は、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈ及びＷから選択される金属を含む。
生体分子を標識するための銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン環付加は、水及び様々な溶媒において実施してもよく、水と、アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ｔｅｒｔ−ブタノール（ｔＢｕＯＨ）及びアセトンなどの様々な（部分的に）混和性の有機溶剤との混合液であってもよい。
いかなる特定の機構にも限定されないが、Ｃｕ（Ｉ）状態の銅は、本願明細書に記載の方法で使用する銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン環付加、又は「クリック」ケミストリーのための好適な触媒である。ある特定の金属イオンは水性溶媒において不安定であるため、例えば、Ｃｕ（Ｉ）はリガンド／キレート剤を使用して安定化させて、反応効率を向上させてもよい。具体的な実施形態では、少なくとも１つの銅キレート剤が本願明細書に記載の方法で用いられ、かかるキレート剤はＣｕ（Ｉ）状態で銅と結合する。具体的な実施形態では、少なくとも１つの銅キレート剤が本願明細書に記載の方法で用いられ、かかるキレート剤はＣｕ（ＩＩ）状態で銅と結合する。一実施形態では、当該銅（Ｉ）キレート剤は、１，１０フェナントロリン含有銅（Ｉ）キレート剤である。かかるフェナントロリン含有銅（Ｉ）キレート剤の非限定的な例としては、バソフェナントロリンジスルホン酸（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸）及びバソクプロインジスルホン酸（ＢＣＳ、２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）などが挙げられる。かかる方法で使用する他のキレート剤としては、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ピリジン−２，６−ジカルボン酸（ＰＤＡ）、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン（ＳＣＭＣ）、トリエンチン（ｔｒｉｅｎｔｉｎｅ）、テトラエチレンポリアミン（ＴＥＰＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）、ＥＤＴＡ、ネオクプロイン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ピリジン−２，６−ジカルボン酸（ＰＤＡ）、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン（ＳＣＭＣ）、トリス−（ベンジル−トリアゾリルメチル）アミン（ＴＢＴＡ）又はその誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。大部分の金属キレート剤（その広いバラエティは化学、生化学及び医学において公知である）は、幾つかの金属をキレート化することが公知であり、ゆえに、一般の金属キレート剤を試験し、銅により触媒される１，３−環付加反応におけるそれらの機能を解析してもよい。一実施形態では、ヒスチジンがキレート剤として用いられ、一方、他の実施形態では、グルタチオンがキレート剤及び還元剤として用いられる。
本願明細書に記載されている「クリック」ケミストリーにおいて使用する還元剤の濃度は、μｍｏｌ〜ｍｍｏｌの範囲である。具体的な実施形態では、還元剤の濃度は、約１００μｍｏｌ〜約１００ｍｍｏｌである。他の実施形態では、還元剤の濃度は、約１０μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。他の実施形態では、還元剤の濃度は、約１μｍｏｌ〜約１ｍｍｏｌである。
一実施形態では、本願明細書において説明する、「クリック」ケミストリーを使用して生体分子を標識するための方法では、反応において使用する銅（ＩＩ）を還元剤と接触させたあとで、少なくとも１つの銅キレート剤を添加する。他の実施態様において、少なくとも１つの銅キレート剤は、還元剤と銅（ＩＩ）を接触さた直後に添加してもよい。他の実施態様において、１つまたは複数の銅キレート剤は、銅（ＩＩ）及び還元剤が反応混合物に組み込まれた約５秒〜約２４時間後に添加される。他の実施態様において、少なくとも１つの銅キレート剤は、任意の時点で銅（ＩＩ）及び還元剤を含む反応混合物に添加してもよく、例えば、反応混合液中で、銅（ＩＩ）及び還元剤を接触させた直後、又は銅（ＩＩ）及び還元剤を接触させてから約５分以内に添加してもよい。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの銅キレート剤は、銅（ＩＩ）及び還元剤を反応混合液中で反応させた後、約５秒〜約１時間、約１分〜約３０分、約５分〜約１時間、約３０分〜約２時間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜５時間、及び約２時間〜約８時間で添加してもよい。
他の実施態様において、１つまたは複数の銅キレート剤は、二回以上かかる「クリック」ケミストリーに添加してもよい。２つ以上の銅キレート剤が反応液に添加させる実施形態において、２つ以上の銅キレート剤はＣｕ（Ｉ）状態の銅と結合できるか、又は、銅キレート剤の１つまたは複数がＣｕ（Ｉ）状態の銅と結合でき、１つまたは複数の更なるキレート剤がＣｕ（ＩＩ）状態の銅と結合できる。一実施形態では、１つまたは複数の銅キレート剤は、銅キレート剤の「クリック」ケミストリーへ最初に添加した後、更に添加してもよい。一実施形態では、銅キレート剤の反応への最初の添加後、更なる１つまたは複数の銅キレート剤は同じものであってもよく、あるいは最初に反応に添加された銅キレート剤と異なるものであってもよい。
本願明細書に記載されている「クリック」ケミストリーにおいて使用する銅キレート剤の濃度は、公知技術の方法を使用して決定、最適化してもよく、例えば本願明細書において開示されるように、「クリック」ケミストリーを使用して生体分子を標識し、更に標識反応の効率及び標識される生体分子の健全性を決定するためにかかる標識された生体分子を検出してもよい（図５を参照）。一実施形態では、本願明細書に記載の方法で使用するキレート剤濃度は、μｍｏｌ〜ｍｍｏｌの範囲であってもよく、例えば１μｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌである。具体的な実施形態では、キレート剤濃度は、約１０μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。他の実施形態では、キレート剤濃度は、約５０μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。他の実施形態では、キレート剤は、水混和性の溶媒（例えばアルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ｔｅｒｔ−ブタノール（ｔＢｕＯＨ）及びアセトン）を含む溶液において提供されてもよい。他の実施形態では、キレート剤は、溶媒（例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））を含む溶液において提供されてもよい。
本願明細書に記載されている「クリック」ケミストリーを利用して生体分子を標識する方法の具体的な実施形態では、生体分子はアジド部分を有してもよく、当該標識はアルキン部分を有し、他の実施形態では、生体分子はアルキン部分を有し、当該標識はアジド部分を有してもよい。
シュタウディンガーライゲーション
シュタウディンガー反応（３価のリン含有化合物と有機アジドとの間の反応を含む）（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９１９，２，６３５）が、多くの用途に用いられている。（Ｇｏｌｏｌｏｂｏｖら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９８０、３７、４３７）、（Ｇｏｌｏｌｏｂｏｖら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２、４８、１３５３）。２つの反応物質の性質にほとんど限定されない。シュタウディンガーライゲーション反応は、求電子トラップ（通常メチルエステル）がトリアリールホスフィンに配置される、シュタウディンガー反応の変形である。シュタウディンガーライゲーション反応において、アザイリド中間体が、水性媒体中で再編成され、アミド結合及びホスフィン酸化物を生じさせ、共に２つの分子をライゲーションし、一方、シュタウディンガー反応では、２つの生成物が加水分解の後、共有結合しない。かかるライゲーション反応は、米国特許出願番号第２００６０２７６６５８号に記載されている。一実施形態では、ホスフィンはエステル、チオエステル又はＮ−アシルイミダゾールなどの隣接アシル基を有してもよく（すなわちホスフィノエステル、ホスフィノチオエステル、ホスフィノイミダゾール）、それにより、アザイリド中間体をトラップし、加水分解により安定なアミド結合が形成される。一実施形態では、当該ホスフィンは、ホスフィンを安定させるためにジ若しくはトリアリールホスフィンであってもよい。生体分子の標識のために本願明細書に記載されているシュタウディンガーライゲーション反応で使用するホスフィンは、環状若しくは非環状であってもよく、ハロゲン化されてもよく、ビスリン酸化されてもよく、又はポリマーであってもよく、特に限定されない。同様に、アジドはアルキル、アリール、アシル又はホスホリル化されてもよい。一実施形態では、かかるライゲーション反応は無酸素・無水条件下で実施される。本願明細書に記載されているタンパク質は、シュタウディンガー反応を使用して、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚなどの、本願明細書に記載されている修飾糖を使用して修飾されてもよい（例えば、Ｓａｘｏｎ，Ｅ．；Ｌｕｃｈａｎｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．；Ｈａｎｇ，Ｈ．Ｃ．；Ｙｕ，Ｃ．；Ｌｅｅ，Ｓ．Ｃ．；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．；２００２；１２４（５０）；１４８９３−１４９０２を参照されたい）。
本願明細書に記載されているシュタウディンガーライゲーション反応を利用して、生体分子を標識する方法の具体的な実施形態では、当該生体分子はアジド部分を有し、ラベルはホスフィン部分を有してもよく、一方、他の実施形態では、当該生体分子はホスフィン部分を有し、ラベルはアジド部分を有してもよい。
活性化アルキン化学反応
アジド及びアルキンは、活性化アルキンとアジドとの反応により、触媒フリーの［３＋２］環付加を行うことができる。かかる触媒フリーの環付加［３＋２］を用いて、本発明に記載の方法で、生体分子を標識することができる。例えば８員環構造などの環状基（かかるアルキン環に結合している電子吸引基）でアルキンを活性化してもよく、又は、ルイス酸（例えば例えばＡｕ（Ｉ）又はＡｕ（ＩＩＩ））の添加によってアルキンを活性化してもよい。
本願明細書に記載されている活性化アルキンを利用して生体分子を標識する方法の具体的な実施形態では、生体分子はアジド部分を有し、ラベルは活性化アルキン部分を有してもよく、一方、他の実施形態では、生体分子は活性化アルキン部分を有し、ラベルはアジド部分を有してもよい。
翻訳後修飾生体分子の化学修飾
タンパク質を含むがそれに限定されない生体分子が、アジド部分、アルキン部分又はホスフィン部分によって、代謝的又は酵素的に修飾されたあと、それらはレポーター分子、固体支持体又は担体分子と適当な条件下で反応し、複合体を形成することができる。一実施形態では、かかるコンジュゲーションに使用するタンパク質は、細胞可溶化物、単離されたタンパク質、及び／又は、ゲル電気泳動若しくは又は固体若しくは半固体のマトリックスで分離された、精製タンパク質として調製してもよい。一実施形態では、生体分子は、代謝的又は酵素的に、アジド含有糖、アルキン含有糖又はホスフィン含有糖により修飾された糖タンパク質である。
本願明細書に記載の方法及び組成物においては、アジド部分、アルキン部分又はホスフィン部分を、修飾された生体分子上の反応性官能基として用い、レポーター分子、固体支持体又は担体分子上のアジド反応性部分、又はレポーター分子、固体支持体又は担体分子上のアルキン反応性部分、又はレポーター分子、固体支持体又は担体分子上のホスフィン反応性部分を、修飾された生体分子と反応させて、当該生体分子と、少なくとも１つのレポーター分子、少なくとも１つの固体支持体及び／又は少なくとも１つの担体分子を含む共有結合複合体を形成させる。具体的な実施形態では、かかる生体分子はタンパク質であり、一方、他の実施形態では、かかるタンパク質は糖タンパク質である。
本願明細書に記載の方法及び組成物の具体的な実施形態では、アジド部分を含む糖タンパク質は、選択的に末端アルキン、活性化アルキン又はホスフィンなどのアジド反応性基を含むレポーター分子、固体支持体及び／又は担体分子で標識することができる。他の実施形態では、アルキン部分を含む糖タンパク質は、選択的にアジド部分などのアルキン反応性基を含むレポーター分子、固体支持体及び／又は担体分子で標識することができる。他の実施形態では、活性化アルキン部分を含む糖タンパク質は、選択的にアジド部分などのアルキン反応性基を含むレポーター分子、固体支持体及び／又は担体分子で標識することができる。
一実施形態では、２つのアジド反応性基を用いて生体分子を標識してもよく、第１は「クリック」ケミストリーにおいて使用するアルキン部分であり、第２はホスフィン（例えばトリアリールホスフィン）であり、シュタウディンガーライゲーション反応において使用する。一実施形態では、「クリック」ケミストリーを用いて、アジド部分を含む糖タンパク質とレポーター分子、固体支持体又は担体分子とを複合体させてもよく、当該レポーター分子、固体支持体及び担体分子はアルキン部分を含む。他の実施形態では、「クリック」ケミストリーを用いて、アルキン部分を含む糖タンパク質と、レポーター分子、固体支持体及び／又は担体分子とを複合体させてもよく、当該レポーター分子、固体支持体及び担体分子はアジド部分を含む。他の実施形態では、シュタウディンガーライゲーション反応を用いて、アジド部分を含む糖タンパク質と、レポーター分子、固体支持体及び／又は担体分子とを複合体させてもよく、当該レポーター分子、固体支持体及び担体分子はトリアリールホスフィン部分を含む。他の実施形態では、シュタウディンガーライゲーション反応を用いて、トリアリールホスフィン部分を含む糖タンパク質と、レポーター分子、固体支持体及び／又は担体分子とを複合体させてもよく、レポーター分子、固体支持体及び担体分子はアジド部分を含む。本願明細書に記載の方法はこれらの２つのアジド反応性基又は化学反応に限定されず、レポーター分子、固体支持体又は担体分子に結合するアジド反応基を利用する、いかなる化学反応を、本願明細書に記載されているアジド修飾糖タンパク質と共に用いてもよいことは自明である。
タンパク質は、タンパク質の表面上に通常存在するアミン、カルボン酸又はスルフヒドリル基で、求核置換反応を使用して修飾されてもよい。しかしながら、本願明細書に記載の方法は、環付加反応（求核置換反応よりむしろ）をタンパク質の選択的な修飾のために利用する。すなわち、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚなどの本願明細書に記載されている修飾された糖を用いることにより、極めて高い選択性によって本願明細書に記載されているタンパク質を修飾できる。かかる反応は、反応混合物への触媒的有効量のＣｕ（Ｉ）塩の添加によって、優れたレギオ選択性で、室温で、水性条件下で実施することができる。例えばＴｏｍｏｅら、（２００２） Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４、及びＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、（２００２） Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９を参照。「クリック」ケミストリー環付加から得られる５員環は、通常、還元条件下では可逆的ではなく、水性条件下での長期間の加水分解に対して安定である。ゆえに、かかる５員環を有を介して、標識物質、検出試薬、レポーター分子、固体支持体又は担体分子に結合した糖タンパク質は、還元条件下で安定である。
本願明細書に記載の方法及び組成物において使用するレポーター分子、固体支持体及び担体分子は、アジド部分と反応できる少なくとも１つのアルキン部分又は少なくとも１つのホスフィン部分を含んでもよい。本願明細書に記載の方法及び組成物において使用するレポーター分子、固体支持体及び担体分子は、アルキン部分又はホスフィン部分と反応できる少なくとも１つのアジド部分を含んでもよい。本願明細書に記載の方法及び組成物において使用するレポーター分子、固体支持体及び担体分子は、アジド部分と反応できる少なくとも１つのホスフィン部分を含んでもよい。一実施形態では、本願明細書に記載されているレポーター分子、固体支持体及び担体分子のホスフィン部分は、トリアリールホスフィン部分である。
一実施形態では、本願明細書に記載の方法及び組成物において使用するレポーター分子は、限定されないがラベルを含んでもよく、一方、固体支持体は、限定されないが固体支持体樹脂、マイクロタイタープレート及びマイクロアレイスライドを含んでもよい。担体分子としては、限定はされないが、親和性タグ、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリマーが挙げられる。
レポーター分子
本願明細書において提供される方法及び組成物で使用されるレポーター分子は、修飾された生体分子に共有結合できる、当業者に公知のいかなる直接的又は間接的に検出可能なレポーター分子であってもよく、タンパク質（例えば糖タンパク質）が例示される。かかる修飾された糖タンパク質は、アジド修飾糖タンパク質、アルキン修飾糖タンパク質、又はホスフィン修飾糖タンパク質であってもよい。一実施形態では、本願明細書において提供される方法及び組成物で使用されるレポーター分子は、直接的又は間接的、アジド修飾糖タンパク質、アルキン修飾糖タンパク質又はホスフィン修飾糖タンパク質と共有結合できる、当業者に公知の検出可能なレポーター分子であってもよい。
本願明細書に記載されている方法及び組成物で使用するレポーター分子は、例えば発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、蛍光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素及び放射性同位元素である。一実施形態では、かかるレポーター分子はフルオロフォア、蛍光タンパク質、ハプテン及び酵素である。
本願明細書に記載の方法及び組成物に係るレポーター分子において使用するフルオロフォアは、１つまたは複数の芳香族又は複素芳香族環を含んでもよく、限定されないが様々な１つまたは複数の置換基（ハロゲン、ニトロ、シアノ、アルキル、パーフルオロアルキル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリール環システム、ベンゾ又はフルオロフォアに典型的に存在する他の公知の置換基）で任意に置換されてもよい。
本願明細書に記載の方法及び組成物のレポーター分子において使用するフルオロフォアは、２８０ｎｍより大きい波長の最大吸収を示し、アジド及びアルキン又はホスフィンなどの標識試薬と共有結合してもそのスペクトル特性が維持される、いかなる化学部分であってもよい。本願明細書に記載されている方法及び組成物のレポーター分子で使用するフルオロフォアとしては、限定されないが、ピレン（米国特許５，１３２，４３２において開示される対応する派生化合物も含む）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール又はベンズインドール、オキサゾール又はベンゾキサゾール、チアゾール又はベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン（米国特許出願第０９／９６８，４０１号及び第０９／９６９，８５３号対応する化合物も含む）、カルボシアニン（米国特許出願第０９／５５７，２７５号、第０９／９６９，８５３号及び第０９／９６８，４０１号、米国特許第４，９８１，９７７号、第５，２６８，４８６号、第５，５６９，５８７号、第５，５６９，７６６号、第５，４８６，６１６号、第５，６２７，０２７号、第５，８０８，０４４号、第５，８７７，３１０号、第６，００２，００３号、第６，００４，５３６号、第６，００８，３７３号、第６，０４３，０２５号、第６，１２７，１３４号、第６，１３０，０９４号、第６，１３３，４４５号、及び国際公開公報第０２／２６８９１号、第９７／４０１０４号、第９９／５１７０２号、第０１／２１６２４号、欧州特許出願公開第１０６５２５０Ａ１に対応する化合物も含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチル酸、アントラニル酸、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（米国特許第４，７７４，３３９号、第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号、第５，２７４，１１３号及び第５，４３３，８９６号において開示される対応する化合物も含む）、キサンテン（米国特許第６，１６２，９３１号、第６，１３０，１０１号、第６，２２９，０５５号、第６，３３９，３９２号、第５，４５１，３４３号及び米国特許出願第０９／９２２，３３３号において開示される対応する化合物も含む）、オキサジン（米国特許第４，７１４，７６３号において開示される対応する化合物も含む）、又はベンゾオキサジン、カルバジン（米国特許第４，８１０，６３６号において開示される対応する化合物も含む）、フェナレノン、クマリン（米国特許第５，６９６，１５７号、第５，４５９，２７６号、第５，５０１，９８０号及び第５，８３０，９１２号において開示される対応する化合物を含む）、ベンゾフラン（米国特許第４，６０３，２０９号及び第４，８４９，３６２号において開示される対応する化合物を含む）、並びにベンズフェナレノン（米国特許第４，８１２，４０９号において開示される対応する化合物も含む）、並びにそれらの誘導体などが挙げられる。本発明では、オキサジンとしては、レゾルフィン（米国特許第５，２４２，８０５号において開示される対応する化合物も含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン及びそれらのベンゾ置換アナログが挙げられる。
本願明細書に記載の方法及び組成物のレポーター分子において使用するキサンテンタイプのフルオロフォアとしては、限定されないが、フルオレセイン、ロードール（ｒｈｏｄｏｌ）（米国特許第５，２２７，４８７号及び５，４４２，０４５において開示される対応する化合物も含む）又はローダミン（米国特許第５，７９８，２７６号、第５，８４６，７３７号、米国特許出願第０９／１２９，０１５号において開示される対応する化合物も含む）が挙げられる。本発明では、フルオレセインとしては、ベンゾ若しくはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセイン又はナフトフルオレセインなどが挙げられる。同様に、本発明に係るロードールとしてはセミナフトローダフルオール（米国特許第４，９４５，１７１号において開示される対応する化合物も含む）が挙げられる。一実施形態では、フルオロフォアは、キサンテンの９位における単一の共有結合を介して結合するキサンテンである。他の実施態様において、キサンテンには、９−位で結合する３Ｈ−キサンテン−６−オル−３−オンの派生物、９−位で結合する６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−３−オンの派生物、又は９−位で結合する６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−３−イミンの派生物が包含される。
一実施形態では、本願明細書に記載の方法及び組成物のレポーター分子において使用するフルオロフォアとしては、キサンテン（ロードール、ローダミン、フルオレセイン及びその誘導体）、クマリン、シアニン、ピレン、オキサジン及びボラポリアザインダセンが挙げられる。他の実施態様において、かかるフルオロフォアとしては、スルホン化キサンテン、フッ素化キサンテン、スルホン化クマリン、フッ素化クマリン、スルホン化シアニンが挙げられる。
他の実施形態では、本願明細書に記載されている方法及び組成物のレポーター分子において使用するフルオロフォアは、アジド部分又はアルキン部分で修飾されている。「クリック」ケミストリーにおいて使用する場合に、かかるフルオロフォアはトリアゾール生成物を形成し、ＵＶ励起が不要であり、蛍光πシステムへのアジド又はアルキン基の複合体に起因するいかなるクエンチング効果による影響も受けない。
標識試薬に結合させるフルオロフォアの選択により、標識試薬、修飾糖タンパク質及び免疫標識複合体の吸収及び蛍光放出特性が決定される。修飾された糖タンパク質及び免疫標識された複合体の検出に使用できるフルオロフォア標識の物理的性質としては、限定はされないが、スペクトル特徴（吸収、放出及びストークスシフト）、蛍光強度、寿命、分極化及び光減衰速度又はそれらの組み合わせが挙げられる。これらの物理的性質の全ては、１つのフルオロフォアと別のものとを区別するために用いることができ、それにより多重分析が可能となる。一実施形態では、フルオロフォアは、４８０ｎｍより大きい波長の最大吸収スペクトルを有する。他の実施態様において、フルオロフォアは、４８８ｎｍ〜５１４ｎｍ（特にＡｒイオンレーザ励起源からの出力による励起に適する）若しくはその付近の吸収スペクトル、又は５４６ｎｍ付近の吸収スペクトル（特に水銀アーク灯による励起に適する）を有する。
多くのフルオロフォアは発色団として機能することもでき、ゆえに、記載されているフルオロフォアは本願明細書に記載の方法及び組成物のレポーター分子において使用されうる発色団でもある。
フルオロフォアの他にも、酵素も、本願明細書に記載されている方法及び組成物において、検出試薬／レポーター分子のための標識として使用できる。酵素標識は、検出可能なシグナルを増幅して試験感度を向上させることができるため、望ましい標識である。酵素自体は、適当な基質と接触したとき、検出可能な反応を生じさせないが、基質を破壊する機能を有し、それにより変換された基質が蛍光若しくは比色定量若しくは発光シグナルを生じさせる。標識試薬上の１つの酵素が検出可能なシグナルに変化する複数の基質と結合できるため、酵素は検出可能なシグナルを増幅できる。これはサンプルに存在する標的の量が少ない場合や、酵素と同様若しくはより強いシグナルを与えるフルオロフォアが存在しない場合に有利である。しかしながら、フルオロフォアは、それらが追加的な分析処置を必要とせず、ゆえに分析をに要する全時間が少ないため、最も好まれる。好適な測定可能な生成物（例えば比色、蛍光又は化学発光）を生じさせる酵素基質を選択するのが好ましい。かかる基質は広範囲に使用されており、それの多くは上記のＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫに記載されている。
一実施形態では、例えば、比色若しくは蛍光発生基質及び酵素の組合せ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼような酸化還元酵素と、基質（例えば例えば３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）又は３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）を使用して、特徴的な発色（それぞれ茶色及び赤）をさせてもよい。本願明細書に記載されている酵素のレポーター分子と使用する他の酸化還元酵素の比色基質としては、限定されないが、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、４−クロロ−１−ナフトールなどが挙げられる。本願明細書に記載されている酵素のレポーター分子と共に使用する蛍光発生基質としては、限定されないが、ホモバニリン酸又は４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元型フェノキサジン、還元型ベンゾチアジン（Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ試薬及びその誘導体（米国特許第４３８４０４２号）、Ａｍｐｌｅｘ ＵｌｔｒａＲｅｄ及びその誘導体（国際公開公報第０５／０４２５０４号）を含む）、還元型ジヒドロキサンテン（ジヒドロフルオレセイン（米国特許第６，１６２，９３１号）を含む）、ヒドロローダミン（ジヒドロローダミン１２３を含む）などが挙げられる。ペルオキシダーゼ基質を、本願明細書に記載されている酵素のレポーター分子と共に使用できる。かかる過酸化物基質としては、限定されないがチラミド（米国特許第５，１９６，３０６号、第５，５８３，００１号及び第５，７３１，１５８号）が挙げられ、それらは、酵素反応前に本質的に検出可能であるというユニークな種類のペルオキシダーゼ基質であるが、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）と呼ばれる方法において、ペルオキシダーゼの作用によって「その場で固定される」ことを特徴とする。これらの基質を広範囲に用いて、細胞、組織又はアレイなどのサンプルを標的にして標識し、次に顕微鏡、フローサイトメトリ、光学的スキャニング及び蛍光光度分析によりそれらを検出することができる。
他の実施形態では、本願明細書に記載されているレポーター分子と共に使用する比色（場合によっては蛍光発生）基質及び酵素の組合せでは、ホスファターゼ酵素（例えば酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ又はかかるホスファターゼの組換え体）を使用してもよい。かかるホスファターゼとの組合せで使用する比色基質としては、限定されないが５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、６−クロロ−３−インドリルリン酸、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸又はｏ−ニトロフェニルリン酸、又は、リン酸Ａ−メチルウンベリフェリル、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニルリン酸（ＤｉＦＭＵＰ、米国特許第５，８３０，９１２号）、フルオレセイン二リン酸、３−Ｏ−メチルフルオレセインリン酸、リン酸レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ホスフェート（リン酸ＤＤＡＯ）若しくはＥＬＦ９７、ＥＬＦ３９、又は関連するホスフェート（米国特許番号５，３１６，９０６及び５，４４３，９８６）などの蛍光基質が挙げられる。
本願明細書に記載されているレポーター分子と共に使用する他の酵素としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ及びβ−グルコシダーゼなどのグリコシダーゼが挙げられる。かかる酵素によって使用する比色基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）及び類似のインドリルガラクトシド、グルコシド及びグルクロニド、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）及びｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適な蛍光発生基質としては、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド及びそれらの構造異性体（米国特許第５，２０８，１４８号、第５，２４２，８０５号、第５，３６２，６２８号、第５，５７６，４２４号及び第５，７７３，２３６号）、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド及びフッ化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（米国特許第５，８３０，９１２号）などが挙げられる。
本願明細書に記載されているレポーター分子において使用する更なる酵素としては、限定されないが、適切な基質が公知であるコリンエステラーゼ及びペプチダーゼのようなヒドロラーゼ、グルコースオキシダーゼ及びシトクロムオキシダーゼのようなオキシダーゼ及びレダクターゼなどが挙げられる。
化学ルミネセンスを生じる酵素及びそれらの適当な基質を、本願明細書に記載されているレポーター分子と共に使用できる。かかる酵素としては、例えば限定はされないが、天然型及び組換え型のルシフェラーゼ及びエクオリンが挙げられる。更に、安定なジオキセタン、ルミノール、イソルミノール及びアクリジニウムエステルを含有する、ホスファターゼ、グリコシダーゼ及びオキシダーゼ用の化学発光基質を、本願明細書に記載されているレポーター分子と共に使用してもよい。
酵素に加えて、本願明細書に記載されているラベル／レポーター分子においてハプテンを使用してもよい。一実施形態では、かかるハプテンとしては、ホルモン、天然及び合成薬剤、汚染物質、アレルゲン、影響因子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、中間体、ヌクレオチド、ビオチンなどが挙げられる。ビオチンは、酵素系において、更に検出可能なシグナルを増幅する機能を有するために有用であり、またそれはタグとして機能できるため、アフィニティクロマトグラフィーに使用することもできる。検出目的の場合、例えばアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのビオチン親和的な酵素複合体を使用する。その後、本発明のペルオキシダーゼ基質を添加して検出可能なシグナルを生じさせる。
本願明細書に記載の方法、組成物、及び標識試薬用に用いる、本願明細書に記載されているラベル／レポーター分子において、蛍光タンパク質を用いてもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質質（ＧＦＰ）及びフィコビリンタンパク質及びその誘導体が挙げられる。蛍光タンパク質（特にフィコビリンタンパク質）は、特にタンデムな色素標識を有する標識試薬の調製において、有用である。これらのタンデムな色素は蛍光タンパク質及びフルオロフォアを含んでなり、それにより、放出スペクトラムが蛍光タンパク質の吸収スペクトラムの波長から大きく離れ、より大きいストークシフトを得ることができる。これは特に、サンプル中に低レベルで存在する標的物質を検出する場合に有利である（放射された蛍光が最大限に最適化されている、言い換えると放射された光がほとんど蛍光タンパク質によって、再吸収されない）。蛍光タンパク質及びフルオロフォアはエネルギー移動ペアとして機能（蛍光タンパク質が光を放射し、フルオロフォアがその光の波長を吸収する）し、更にフルオロフォアは蛍光タンパク質によってのみ得られる波長で、蛍光タンパク質から放射させる。特に有用な組合せとしては、米国特許第４，５２０，１１０号、第４，８５９，５８２号、第５，０５５，５５６号で開示されるフィコビリンタンパク質、及び米国特許第５，７９８，２７６号で開示されるスルホローダミンフルオロフォア、又は米特許出願第０９／９６８／４０１号及び第０９／９６９／８５３号で開示されるスルホン化シアニンフルオロフォア、又は米国特許第６，１３０，１０１号で開示されるスルホン化キサンテン誘導体、並びに米国特許第４，５４２，１０４で開示されるそれらの組合せなどが挙げられる。あるいは、フルオロフォアがエネルギードナーとして機能し、蛍光タンパク質はエネルギーアクセプターとして機能してもよい。
担体分子：反応性アジド、反応性アルキン及び反応性ホスフィン
本願明細書に記載の方法及び組成物において、修飾された生体分子は、担体分子と複合体されてもよい。本願明細書において提供される具体的な実施形態では、タンパク質（例えば糖タンパク質）は、担体分子と共有結合して複合体される。これは、本願明細書において開示したアジド修飾されたいかなる糖タンパク質、また本願明細書において開示したいかなる担体分子も含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、糖タンパク質は、アジド部分を含む担体分子と反応できる少なくとも１つのアルキン部分又は少なくとも１つのホスフィン部分を含む。他の実施態様において、糖タンパク質は、アルキン部分又はホスフィン部分を含む担体分子と反応できる少なくとも１つのアジド部分を含む。他の実施態様において、糖タンパク質は、アジド部分を含む担体分子と反応できる少なくとも１つのホスフィン部分を含む。一実施形態では、糖タンパク質及び担体分子のホスフィン部分は、トリアリールホスフィン部分である。
抗原、ステロイド、ビタミン、薬剤、ハプテン、代謝物質、毒素、環境汚染物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、核酸ポリマー、糖質、脂質及びポリマーなどの様々な担体分子が、本願明細書に記載の方法及び組成物において使用できる。一実施形態では、担体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬剤、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー微粒子、生物細胞、ウイルス又はそれらの組み合わせを含む。
他の実施形態では、担体分子は、ハプテン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマー、タンパク質、ペプチド又は多糖類から選択される。更に他の実施形態では、担体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬剤、ホルモン、脂質、脂質集合体、チラミン、合成ポリマー、ポリマー微粒子、生物細胞、細胞構成要素、イオンキレート化部分、酵素基質又はウイルスである。更なる実施例において、担体分子は、抗体又はその断片、抗原、アビジン又はストレプトアビジン、ビオチン、デキストラン、ＩｇＧ結合タンパク質、蛍光タンパク質、アガロース及び非生物学的微粒子である。
担体分子が酵素の基質である具体的な実施形態では、酵素基質は、アミノ酸、ペプチド、糖、アルコール、アルカン酸、４−グアニジノ安息香酸、核酸、脂質、硫酸塩、リン酸塩、−ＣＨ２ＯＣＯ−アルキル及びそれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、かかる酵素基質は、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、デアルキラーゼ、エステラーゼ、グアニジノベンゾターゼ、スルファターゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、エキソヌクレアーゼ、還元酵素、エンドグリコセラミダーゼ及びエンドヌクレアーゼから選択される酵素により切断されてもよい。
他の実施態様において、当該担体分子は、アミノ酸（ホスフェート、糖質又はＣ１〜Ｃ２２カルボン酸により保護若しくは置換されているものを含む）又はアミノ酸のポリマー（例えばペプチド又はタンパク質）である。関連する実施形態では、当該担体分子は少なくとも５つのアミノ酸（好ましくは、５〜３６のアミノ酸）を含む。かかるペプチドとしては、限定はされないが、ニューロペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質及びプロテインキナーゼ基質が挙げられる。他の典型的なペプチドは、オルガネラ局在ペプチド（すなわち共役化合物を、細胞の輸送機構によって特定の細胞構造中に局在化させる機能（例えば核内局在化シグナル配列）を有するペプチド）として機能できる。一実施形態では、タンパク質担体分子としては、酵素、抗体、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、タンパク質Ｇ、フィコビリンタンパク質及び他の蛍光タンパク質（ホルモン、毒素及び成長因子）が挙げられる。他の実施態様において、タンパク質担体分子は、抗体、抗体断片、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、レクチン又は成長因子である。更なる実施例において、担体分子は、ビオチン、ジゴキシゲニン及びフルオロフォアなどのハプテンを含んでもよい。
本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する担体分子は、担体分子は核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド又は核酸ポリマーを含み、任意にフルオロフォア又は他のリガンドとの結合のための更なるリンカー又はスペーサー（例えばアルキニル結合（米国特許第５，０４７，５１９号）、アミノアリル結合（米国特許第４，７１１，９５５号）又は他の結合）を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド担体分子はヌクレオシド又はデオキシヌクレオシド又はジデオキシヌクレオシドであり、一方、他の実施形態では、当該担体分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）配列又はロックされた核酸（ＬＮＡ）配列を含む。一実施形態では、核酸ポリマー担体分子としては、一本鎖若しくは複数鎖の、天然若しくは合成ＤＮＡ又はＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよく（モルホリン誘導されたホスフェート（ＡｎｔｉＶｉｒａｌｓ社、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ ＯＲ）などの非天然リンカーを組み込んでもよい）、又はペプチド核酸（例えばＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位）（核酸が５０ヌクレオチド未満、好適には２５ヌクレオチド未満を含む）などが挙げられる。
本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する担体分子は糖質（通常多糖類（例えばデキストラン、フィコール、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、デンプン、アガロース及びセルロース））又はポリオール（通常ポリマー（例えばポリ（エチレングリコール）））を含む。一実施形態では、多糖担体分子としてはデキストラン、アガロース又はフィコールが用いられる。
本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する担体分子は、脂質を含有してもよく、例えば糖脂質、リン脂質及びスフィンゴ脂質などが挙げられる。一実施形態では、かかる脂質は６〜２５の炭素原子を含む。他の実施態様において、脂質嚢（例えばリポソーム）又はリポタンパク質（下記参照）を含有する。幾つかの親油性置換基が、細胞又は細胞オルガネラへの色素複合体の輸送の促進のために有用である。一実施形態では、親油性置換基を有する担体分子を用いて、膜の範囲内で、色素化合物の非共有結合性取り込みによる、生物学的膜又はリポソームのような脂質集合体のターゲッティングに使用してもよく、例えば、膜構造用のプローブ、又はリポソーム、リポタンパク質、フィルム、プラスチック、親油性微小球体又は同様の材料への取り込み用途に使用できる。
本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する担体分子は細胞、細胞システム、細胞性断片又は細胞関連粒子（ウイルス粒子、細菌粒子）、ウイルス構成要素、生物細胞（例えば動物性の細胞、植物細胞、細菌又は酵母）又は細胞オルガネラである。本願明細書に記載されている方法及び組成物の担体分子として有用な細胞オルガネラの例としては、リソソーム、エンドソーム、細胞質、核、ヒストン、糸粒体、ゴルジ装置、小胞体及び液胞が挙げられる。
本願明細書において記載した方法及び組成物で使用する担体分子は、非共有結合的に有機若しくは無機材料と結合する。
本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する担体分子は、特異的な結合ペア用部材を含んでなり、詳細には、本発明の化合物が特異的な結合ペア用部材と複合体し、結合ペアが形成されることを特徴とする。一実施形態では、標識された特異的結合ペア用部材の存在により、その特異的結合ペアの相補的部材の存在が示され、各特異的結合ペア用部材は、その表面上又はキャビティ内に、他の特定の立体構造及び極性を有する物質と、特異的に結合するか、又は相補的に結合するための領域を有する。一実施形態では、本発明の色素化合物（フルオロフォア又はクロモフォア）は、特異的結合ペアのためのレポーター分子として機能する。典型的な結合ペアを表２に示す。
（表２）代表的な特異的結合ペア
Figure 2009528988
＊ＩｇＧは、免疫グロブリンである。
†ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡは、ハイブリッド形成のために使用する相補鎖である。
特定の態様では、当該担体分子は抗体フラグメント（例えば抗Ｆｃ、抗Ｆｃアイソタイプ、抗Ｊ鎖、抗κ軽鎖、抗λ軽鎖又は単鎖断片可変タンパク質）、又は非抗体ペプチド又はタンパク質（例えば、限定されないが可溶性Ｆｃアクセプター、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、レクチン又はそれらの断片）などが挙げられる。１つの態様では、当該担体分子は標的結合性抗体のＦｃ部分、又は標的結合性抗体のＦｃ部分のサブタイプに特異的なＦａｂフラグメント（米国特許出願第１０／１１８，２０４号）である。一価のＦａｂフラグメントは典型的には、マウスモノクローナル抗体として産生させるか、種々の動物（例えば限定されないがウサギ又はヤギ）を用いてポリクローナル抗体として調製してもよい。これらのフラグメントは、いかなるアイソタイプ（例えばネズミＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３）から調製してもよい。
別の実施形態では、非抗体タンパク質又はペプチド（例えばプロテインＧ又は他の適切なタンパク質）は、単独で用いてもよく、又はアルブミンとの組合せで用いてもよい。好適なアルブミンとしては、ヒト及びウシ血清アルブミン又はオボアルブミンなどが挙げられる。プロテインＡ、Ｇ及びＬは当業者に公知の当該タンパク質又はその誘導体として定義され、それは少なくとも１つのＩｇＧとの結合領域を含む（すなわちＩｇＧとの親和性を有するタンパク質である）。これらのタンパク質は修飾されてもよいが、本発明の他の担体分子と同様に、反応性の標識と複合体させる必要はない。
別の態様では、本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する担体分子は無処理の完全抗体であってもよい。抗体は、抗原に応答して動物において、分泌又は産生される可溶性の物質又は分子であって、その産生を誘導した抗原と特異的に結合する特性を有する物質又は分子を意味する用語である。また、抗体はそれ自体糖タンパク質であり、ゆえに抗種抗体の調製用の抗原又は免疫原として利用することもできる。抗体（別名免疫グロブリン）は、５つの異なるクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）に分類される。基本的なＩｇＧ免疫グロブリン構造は、２つの同一の軽鎖ポリペプチド及び２つの同一の重鎖ポリペプチド（ジスルフィド結合で結合）から構成される。
ＩｇＧを酵素パパインで処理することにより一価の抗原結合フラグメントを単離することができ、それを本願明細書ではＦａｂフラグメントとして記載する。ＩｇＧがペプシン（他のタンパク質分解酵素）で処理されるときに、より大きな断片ができる（Ｆ（ａｂ’）２）。更にこのフラグメントを、穏やかな還元バッファーで処理することにより部分に切断でき、一価のＦａｂ’フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆａｂよりわずかに大きく、ヒンジ領域に由来する１つまたは複数の遊離スルフヒドリル基を含有する（それは小さいＦａｂフラグメントには存在しない）。用語「抗体フラグメント」とは、本願明細書では抗体のＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂ部分と定義される。抗体断片を生産するために抗体分子をペプシン及びパパインで処理することは、公知技術である（Ｇｏｒｅｖｉｃら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１６：３（１９８５））。
本願明細書に記載の方法及び組成物の担体分子として使用する一価のＦａｂフラグメントは任意のマウスモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体から調製してもよく、その場合、外部抗体又はそのフラグメントで種々の動物を免疫する（米国特許第４，１９６，２６５号ではモノクローナル抗体の調製方法を開示している）。典型的には、二次抗体はウサギ又はヤギにおいて産生させたポリクローナル抗体に由来するが、当然ながら、ポリクローナル抗体の調製に用いられる、当業者に公知のあらゆる動物を用いて抗種抗体を調製してもよい。用語「一次抗体」は、一次抗体の一部分と結合する「二次抗体」とは異なり、直接抗原と結合する抗体のことを指す。モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体と同等、場合によってはそれよりも好適であるが、その場合、リガンド結合抗体は、当業者に公知の方法を使用して調製されたマウスハイブリドーマ細胞株から典型的に産生されるモノクローナル抗体と互換性を有するのが好ましい。
１つの態様では、本願明細書に記載の方法及び組成物の担体分子として使用する抗体は、外部抗体のＦｃ部位のみを免疫源として調製された抗体である。基本的に、外部抗体（例えばマウス由来）のＦｃ領域フラグメントのみを用いて動物を免疫する。次に、採血を行い、ポリクローナル抗体を調製し、酵素、ペプシン又はパパインとインキュベートし、一価のフラグメントを調製する。当該フラグメントを更に、免疫した動物の全免疫グロブリンタンパク質、又はＦｃフラグメントのみを含有するカラムを用いてアフィニティ精製する。
固体支持体：反応性アジド、反応性アルキン又は反応性ホスフィン
本願明細書に記載の方法及び組成物の一態様では、修飾された生体分子は、固体支持体と共有結合して複合体してもよい。本願明細書において提供される具体的な実施形態では、タンパク質（例えば糖タンパク質）は固体支持体と共有結合して複合体される。これには、本願明細書において開示したいかなるアジド修飾糖タンパク質と、本願明細書において開示したいかなる固体支持体も包含されるが、これらに限定されない。一実施形態では、糖タンパク質は、アジド部分を含む固体支持体と反応できる少なくとも１つのアルキン部分又は少なくとも１つのホスフィン部分を含む。他の実施態様において、糖タンパク質は、アルキン部分又はホスフィン部分を含む固体支持体と反応できる少なくとも１つのアジド部分を含む。他の実施態様において、糖タンパク質は、アジド部分を含む固体支持体と反応できる少なくとも１つのホスフィン部分を含む。一実施形態では、糖タンパク質及び固体支持体のホスフィン部分はトリアリールホスフィン部分である。
様々な固体支持体が、本願明細書に記載の方法及び組成物において使用できる。かかる固体支持体は特定タイプの支持体に限定されず、したがって、多数の支持体が利用でき、それらは従来技術において当業者に公知である。かかる固体支持体としては、固体及び半固体のマトリックス（例えばエーロゲル及びヒドロゲル、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜コート付きバイオチップなど）、ミクロ流体チップ、シリコンチップ、マルチウェルプレート（またマイクロタイタープレート又はマイクロプレートとも呼ばれる）、膜、導電性及び非伝導性金属、ガラス（顕微鏡スライドガラスなど）、並びに磁性支持体などが挙げられる。本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する固体支持体の他の非限定的な例としては、シリカゲル、高分子膜、粒子、誘導体化されたプラスチック薄膜、誘導体化ガラス、誘導体化シリカ、ガラスビーズ、コットン、可塑性ビーズ、アルミナゲル、多糖（例えばセファロース）、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、アガー、セルロース、デキストラン、デンプン、フィコール、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）など）、ナイロン、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、パラ磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンなどが挙げられる。一実施形態では、本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する固体支持体は、液相において実質的に不溶性である。
特定の実施形態では、当該固体支持体は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カルボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシド基など（これらに限定されない）の、固体支持体上の反応性官能基を有してもよく、かかる官能基は本発明のアジド含有糖タンパク質と共有結合させて用いてもよい。他の実施形態では、当該固体支持体は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カルボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシド基など（これらに限定されない）の、固体支持体上の反応性官能基を有してもよく、かかる官能基は本発明のアルキン含有糖タンパク質と共有結合させて用いてもよい。他の実施形態では、当該固体支持体は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カルボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシド基など（これらに限定されない）の、固体支持体上の反応性官能基を有してもよく、かかる官能基は本発明のホスフィン含有糖タンパク質と共有結合させて用いてもよい。他の実施態様において、固体支持体は、かかる修飾された糖タンパク質と共有結合するために、アジド、アルキン又はホスフィン官能基を有する。
本願明細書に記載の方法及び組成物において使用する適切な固体支持体は、所望の最終用途、及び様々な合成手順における適合性などに基づいて適宜選択できる。アミド結合固体支持体に本願明細書に記載されている修飾された糖タンパク質を結合させることが望ましい場合には、ペプチド合成において通常有用な樹脂を使用し、当該樹脂としては例えばポリスチレン（ＰＡＭ樹脂、Ｂａｃｈｅｍ社、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社などから市販）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ（カナダ）社製）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ポリエチレングリコールとグラフトしたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（商標）、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）、ポリジメチル−アクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社（カリフォルニア））又はＰＥＧＡビーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）などが挙げられる。一実施形態では、本願明細書に記載されている修飾された糖タンパク質は、アレイフォーマットで、固体支持体上へ堆積されてもよい。一実施形態では、かかる堆積は、支持面と輸送メカニズム（例えばピン又はキャピラリー）間の直接的面接触によって、又は、圧電推進及び他の方式を利用したインクジェット技術によりミニチュアノズルから固体の表面へ液体を移動させることによって実施してもよい。接触プリンティング法の場合、ロボット制御システム及び多重化プリントヘッドを使用により、オートメーション化したマイクロアレイ製作が可能となる。圧電推進技術によるコンタクトレス堆積の場合も、ロボットシステムにより、連続操作型装置及びドロップ−オンデマンド装置を使用した自動マイクロアレイ製作が可能となる。
組成物
１つの態様では、本願明細書において提供される修飾された生体分子、レポーター分子及び担体分子を用いて、修飾された生体分子、第１レポーター分子及び担体分子を含む第１組成物を形成させてもよい。他の実施形態では、第２の生体分子は第２の複合体との組合せで第１組成物を含み、当該第２の複合体は第２のレポーター分子に共有結合する担体分子又は固体支持体を含む。第１及び第２のレポーター分子は異なる構造を有し、好ましくは異なる発光スペクトルを有する。他の実施態様において、それらの蛍光放出が基本的に重複しないように、第１及び第２のレポーター分子は選択される。他の実施形態では、レポーター分子は異なる励起スペクトルを有し、一方、他の実施形態では、レポーター分子は同程度の励起波長を有し、同じレーザーで励起される。かかる組成物において、第２組成物の複合体の担体分子（又は固体支持体）は、同じ又は異なる分子でもよい。様々な担体分子の特性に関連する本願明細書における考察は、通常、他の実施形態と同様に本発明の本実施形態にも適用できる。
一実施形態では、本願明細書において提供される修飾タンパク質（例えば糖タンパク質）、レポーター分子及び担体分子を用いて、修飾された糖タンパク質、第１レポーター分子及び担体分子を含む第１組成物を形成させてもよい。他の実施形態では、第２の糖タンパク質は第２の複合体との組合せで第１組成物を含み、当該第２の複合体は第２のレポーター分子に共有結合する担体分子又は固体支持体を含む。第１及び第２のレポーター分子は異なる構造を有し、好ましくは異なる発光スペクトルを有する。他の実施態様において、それらの蛍光放出が基本的に重複しないように、第１及び第２のレポーター分子は選択される。他の実施形態では、レポーター分子は異なる励起スペクトルを有し、一方、他の実施形態では、レポーター分子は同程度の励起波長を有し、同じレーザーで励起される。かかる組成物において、第２組成物の複合体の担体分子（又は固体支持体）は、同じ又は異なる分子でもよい。様々な担体分子の特性に関連する本願明細書における考察は、通常、他の実施形態と同様に本発明の本実施形態にも適用できる。
別の態様では、本願明細書において提供される修飾された生体分子、レポーター分子及び固体支持体を用いて、修飾された生体分子、第１レポーター分子及び固体支持体を含む第１組成物を形成させてもよい。別の実施形態では、第２の組成物は、第２の複合体との組合せで第１組成物を含む。第２の複合体は、第２のレポーター分子に共有結合している固体支持体又は担体分子（本願明細書に記載される）を含む。第１及び第２のレポーター分子は異なる構造を有し、好ましくは異なる発光スペクトルを有する。他の実施態様において、それらの蛍光放出が基本的に重複しないように、第１及び第２のレポーター分子は選択される。他の実施形態では、レポーター分子は異なる励起スペクトルを有し、一方、他の実施形態では、レポーター分子は同程度の励起波長を有し、同じレーザーで励起される。かかる構成において、第２の構成の複合体の固体支持体（又は担体分子）は、同じ又は異なる分子でもよい。様々な担体分子の特性に関連する本願明細書における考察は、通常、他の実施形態と同様に本発明の本実施形態にも適用できる。
別の態様では、本願明細書において提供される修飾タンパク質（例えば糖タンパク質）、レポーター分子及び固体支持体を用いて、修飾された糖タンパク質、第１レポーター分子及び固体支持体を含む第１組成物を形成させてもよい。別の実施形態では、第２の組成物は、第２の複合体との組合せで第１組成物を含む。第２の複合体は、第２のレポーター分子に共有結合している固体支持体又は担体分子（本願明細書に記載される）を含む。第１及び第２のレポーター分子は異なる構造を有し、好ましくは異なる発光スペクトルを有する。他の実施態様において、それらの蛍光放出が基本的に重複しないように、第１及び第２のレポーター分子は選択される。他の実施形態では、レポーター分子は異なる励起スペクトルを有し、一方、他の実施形態では、レポーター分子は同程度の励起波長を有し、同じレーザーで励起される。かかる構成において、第２の構成の複合体の固体支持体（又は担体分子）は、同じ又は異なる分子でもよい。様々な担体分子の特性に関連する本願明細書における考察は、通常、他の実施形態と同様に本発明の本実施形態にも適用できる。
溶液中で、修飾された生体分子を標識する方法
修飾された生体分子−レポーター分子複合体の調製方法を本願明細書に記載する。具体的な実施形態では、生体分子は、本願明細書に記載の方法を使用して代謝的に、酵素的に、又は化学的にアジド修飾された糖タンパク質である。１つの態様では、修飾された生体分子−レポーター分子複合体は、溶液において形成され、更に公知の方法を使用して分離される。一実施形態では、レポーター分子で標識した生体分子は、修飾された糖タンパク質である。他の実施態様において、レポーター分子で標識した生体分子はアジド修飾糖タンパク質、アルキン修飾糖タンパク質、又はホスフィン修飾糖タンパク質である。
「クリック」ケミストリー条件下で、溶液中で、アジド修飾された生体分子と、末端アルキンを有するレポーター分子とを用いて、複合体を形成する新規な方法を、本願明細書に記載する。他の実施形態では、「クリック」ケミストリーにより、アルキン修飾された生体分子と、アジドを有するレポーター分子とを用いて複合体を形成する。他の実施形態では、シュタウディンガーライゲーション反応により、アジド修飾された生体分子と、ホスフィンを有するレポーター分子とを用いて複合体を形成させ、一方、更に他の実施形態では、シュタウディンガーライゲーション反応により、ホスフィン修飾された生体分子と、アジドを有するレポーター分子とを用いて複合体を形成させる。更に他の実施形態では、活性化アルキン修飾された生体分子を使用して、アジドを有するレポーター分子と複合体を形成させ、又は、アジド修飾された生体分子を使用して、活性化アルキンを含むレポーター分子と複合体を形成させる。
予想外にも、銅キレート剤を「クリック」ケミストリー複合体反応に添加することによって、ゲル電気泳動の後の標識効率及び解像度が、銅キレート剤の添加のないそれらの反応と比較し改善されることを見出した。一実施形態では、「クリック」ケミストリーを使用して生体分子を標識する方法は、銅（ＩＩ）還元剤及び少なくとも１つの銅（Ｉ）キレート剤を含む混合物中で、アジド基を含む生体分子と、末端アルキンを含むラベルとを反応させ、それによって、標識された生体分子を調製する段階を含む。一実施形態では、かかる方法で標識される生体分子は、多糖類、核酸、タンパク質又はペプチドであってもよい。一実施形態では、本願明細書に記載されている標識方法で使用する生体分子は、糖タンパク質である
一実施形態では、本願明細書に記載されている標識方法で使用する生体分子は、タンパク質（例えば糖タンパク質）である。タンパク質（糖タンパク質を含む）を標識するために用いる標識方法は、「クリック」ケミストリー又はシュタウディンガーライゲーション反応を含む。一実施形態では、糖タンパク質の標識は、アジド基を含む糖タンパク質と、末端アルキンを含むラベルとを、銅（ＩＩ）、還元剤及び少なくとも１つの銅キレート剤を含む混合物において、「クリック」ケミストリーによって反応させて、標識された糖タンパク質を調製することを含む。一実施形態では、糖タンパク質の標識は、アルキン基を含む糖タンパク質と、アジドを含むラベルとを、銅（ＩＩ）、還元剤及び少なくとも１つの銅キレート剤を含む混合物において、「クリック」ケミストリーによって反応させて、標識された糖タンパク質を調製することを含む。
本願明細書において提供される他の態様では、「クリック」ケミストリーを使用して生体分子を標識する方法では、アジド基を含む生体分子と、末端アルキンを有するラベルとを、銅（ＩＩ）、還元剤、及び少なくとも１つの銅（Ｉ）キレート剤を含む混合物において反応させ、標識された生体分子を調製することにより、標識された生体分子の構造的完全性が維持される。他の実施形態では、かかる環付加反応において標識される生体分子は、多糖類、核酸、タンパク質又はペプチドであってもよい。一実施形態では、かかる方法で使用する生体分子は、タンパク質（例えば糖タンパク質）である。かかる方法において、アジド基を含む糖タンパク質と、末端アルキンを含むラベルとを、銅（ＩＩ）、還元剤及び少なくとも１つの銅（Ｉ）キレート剤を含む混合物において反応させて、標識された糖タンパク質を調製することにより、標識された糖タンパク質の構造的完全性が維持され、標識後の糖タンパク質の構造的完全性が低下しない。本願明細書に記載されているように、糖タンパク質は、例えば、アジド糖のインビボ取り込みによって、又はアジド糖のインビトロ酵素的付加によって誘導体化されてもよい。他の実施形態では、標識後の糖タンパク質の構造的完全性が減らされない、糖タンパク質の標識方法には、「クリック」ケミストリーが含まれ、それにより、末端アルキンを含む糖タンパク質と、アジド基を含むラベルを、銅（ＩＩ）、還元剤及び少なくとも１つの銅キレート剤を含む混合物において反応させて、標識された糖タンパク質を調製する。
本願明細書に記載されている「クリック」ケミストリーを使用して、アジド基を有する生体分子を標識する方法は、末端アルキンを有する生体分子のために用いてもよく、その場合、生体分子と反応するラベルはアジド基を有する。本願明細書に記載されている「クリック」ケミストリーを使用して、アジド基を有する生体分子を標識して検出する方法は、末端アルキンを有する生体分子のために用いてもよく、その場合、生体分子と反応するラベルはアジド基を有する。一実施形態では、本願明細書に記載されている「クリック」ケミストリーを使用して、生体分子−レポーター分子複合体を形成させる方法の提供に関し、詳細には、反応混合物は、アジド部分を有するレポーター分子、アルキン修飾された生体分子、銅（ＩＩ）イオン、少なくとも１つの還元剤及び銅キレート剤を含有する。一実施形態では、かかるアルキン修飾された生体分子はアルキン修飾された糖タンパク質であり、アジド部分を有するかかるレポーター分子は、本願明細書において記載したいかなるレポーター分子であってもよい。他の実施形態では、かかるアルキン修飾された生体分子はアルキン修飾された糖タンパク質であり、アジド部分を有するかかるレポーター分子は、本願明細書に記載されているいかなるフルオロフォアベースのレポーター分子であってもよい。
本願明細書において提供される他の方法は、本願明細書に記載されている「クリック」ケミストリー環付加反応を使用して、糖タンパク質などの分離されたタンパク質を標識して検出する方法である。当該方法は、反応混合物中で、アジド基を有する生体分子、末端アルキン基を含むラベル、銅（ＩＩ）、還元剤及び銅キレート剤を混合し、生体分子へのラベルの化学的コンジュゲーションを促進する条件下で反応混合物をインキュベートし、１つまたは複数の生化学的若しくは生物物理学的な分離技術を使用して生体分子を分離し、生体分子を検出すること含む。当該方法は、反応混合物中で、アルキン基を有する生体分子、アジド基を含むラベル、銅（ＩＩ）、還元剤及び銅キレート剤を混合し、生体分子へのラベルの化学的コンジュゲーションを促進する条件下で反応混合物をインキュベートし、１つまたは複数の生化学的若しくは生物物理学的な分離技術を使用して生体分子を分離し、生体分子を検出すること含む。
他の実施形態は、修飾された生体分子を検出するための方法であって、当該方法は、以下の段階を含む。
（ａ）末端のアルキン部分を有するレポーター分子、アジド修飾された生体分子、銅（ＩＩ）イオン、少なくとも１つの還元剤及び銅キレート剤を含む、アジド−アルキン環付加反応混合物を形成する段階；
（ｂ）アジド−アルキン環付加反応混合物を、充分な時間インキュベートし、生体分子−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｃ）生体分子−レポーター分子複合体を、サイズ及び／又は生体分子−レポーター分子の重量によって分離し、分離された生体分子−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｄ）分離された生体分子−レポーター分子複合体を適当な波長で照射し、照射された生体分子−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｅ）照射された生体分子−レポーター分子複合体を観察して、生体分子を検出する段階。
他の実施形態は、修飾された糖タンパク質を検出するための方法であって、当該方法は、以下の段階を含む。
（ａ）末端のアルキン部分を有するレポーター分子、アジド修飾された糖タンパク質、銅（ＩＩ）イオン、少なくとも１つの還元剤及び銅キレート剤を含む、アジド−アルキン環付加反応混合物を形成する段階；
（ｂ）アジド−アルキン環付加反応混合物を、充分な時間インキュベートし、糖タンパク質−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｃ）糖タンパク質−レポーター分子複合体を、サイズ及び／又は糖タンパク質−レポーター分子の重量によって分離し、分離された糖タンパク質−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｄ）分離された糖タンパク質−レポーター分子複合体を適当な波長で照射し、照射された糖タンパク質−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｅ）照射された糖タンパク質−レポーター分子複合体を観察して、生体分子を検出する段階。
他の実施形態は、修飾された生体分子を検出するための方法であって、当該方法は、以下の段階を含む。
（ａ）アジド部分を有するレポーター分子、アルキン修飾された生体分子、銅（ＩＩ）イオン、少なくとも１つの還元剤及び銅キレート剤を含む、アジド−アルキン環付加反応混合物を形成する段階；
（ｂ）アジド−アルキン環付加反応混合物を、充分な時間インキュベートし、生体分子−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｃ）生体分子−レポーター分子複合体を、サイズ及び／又は生体分子−レポーター分子の重量によって分離し、分離された生体分子−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｄ）分離された生体分子−レポーター分子複合体を適当な波長で照射し、照射された生体分子−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｅ）照射された生体分子−レポーター分子複合体を観察して、生体分子を検出する段階。
他の実施形態は、修飾された糖タンパク質を検出するための方法であって、当該方法は、以下の段階を含む。
（ａ）アジド部分を有するレポーター分子、アルキン修飾された糖タンパク質、銅（ＩＩ）イオン、少なくとも１つの還元剤及び銅キレート剤を含む、アジド−アルキン環付加反応混合物を形成する段階；
（ｂ）アジド−アルキン環付加反応混合物を、充分な時間インキュベートし、糖タンパク質−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｃ）糖タンパク質−レポーター分子複合体を、サイズ及び／又は糖タンパク質−レポーター分子の重量によって分離し、分離された糖タンパク質−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｄ）分離された糖タンパク質−レポーター分子複合体を適当な波長で照射し、照射された糖タンパク質−レポーター分子複合体を形成する段階；
（ｅ）照射された糖タンパク質−レポーター分子複合体を観察して、生体分子を検出する段階。
更に、かかる「クリック」ケミストリー混合物は、限定されないが、１つまたは複数のバッファー、ポリマー、塩、界面活性剤又は可溶化剤などを含有してもよい。反応は、例えば窒素又はアルゴンガス下で嫌気性条件下で実施してもよく、例えば１０分〜６時間、約２０分〜約３時間、又は約３０分〜約２時間のいかなる時間で実施されてもよい。反応は、例えば約４℃〜約５０℃、好ましくは約１０℃〜約４０℃、典型的には約１５℃〜約３０℃の広範囲にわたる温度で実施される。
分離及び検出
本願明細書において提供される他の態様は、修飾された生体分子を、「クリック」ケミストリー、Ｓａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション反応又は活性化アルキン反応を使用して標識し、例えば限定的ではないがクロマトグラフィー又はゲル電気泳動などの電気泳動を使用して分離したあと、修飾された生体分子を検出する方法である。本願明細書に記載の方法を用いて標識、分離及び検出できる修飾された生体分子としては、限定されないが多糖類、核酸、タンパク質又はペプチド及び糖タンパク質が挙げられる。具体的な実施形態では、かかる生体分子は本願明細書に記載の方法を使用して修飾される。かかる修飾された生体分子を分離するために用いる分離方法は、薄層又はカラムクロマトグラフィー（例えばサイズ除外、イオン交換又はアフィニティクロマトグラフィーを含む）又は等電点電気泳動、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動及びスラブゲル電気泳動などが挙げられるが、これらに限定されない。ゲル電気泳動は、変性若しくは非変性ゲル電気泳動であってもよく、変性ゲル電気泳動の後に非変性ゲル電気泳動（例えば「２Ｄ」ゲル）を行う方法であってもよい。一実施形態では、本願明細書に記載の方法を使用して分離する前に、修飾された生体分子を用いて、レポーター分子、担体分子及び／又は固体支持体と複合体を形成する。他の実施形態では、本願明細書に記載の方法を使用して分離した後、修飾された生体分子を用いて、レポーター分子、担体分子及び／又は固体支持体と複合体を形成する。
他の実施形態では、かかる分離及び検出方法で使用する分離方法は、生体分子のために使用するいかなる分離方法（例えばクロマトグラフィー、固体支持体への捕捉及び電気泳動）であってもよい。一実施形態では、ゲル電気泳動は、生体分子（例えばタンパク質）を分離するために用いる。ゲル電気泳動は公知技術であり、本発明においては変性若しくは非変性ゲル電気泳動であってもよく、１Ｄ又は２Ｄゲル電気泳動であってもよい。図３は、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚにより修飾され、クリックケミストリーを使用して蛍光アルキンプローブで標識されたタンパク質の、２−Ｄゲル電気泳動による検出結果を示す。
かかる分離及び検出方法の具体的な実施形態では、ゲル電気泳動はタンパク質（糖タンパク質を含む）を用いて分離し、分離されたタンパク質を添付のラベルによってゲルにおいて検出する。例えば、アジド糖を組み込んだ糖タンパク質を末端アルキン含有フルオロフォアと溶液中で反応させて、標識することができ、また当該タンパク質を任意に反応混合物から更に精製でき、１Ｄ又は２Ｄゲル電気泳動に供することができる。当該タンパク質を、適当な波長の光を使用してゲル中で視覚化し、フルオロフォアラベルを励起してもよい。
ゲル電気泳動は、トリス−酢酸、トリス−ホウ酸、トリス−グリシン、ビストリス及びビストリス−トリシンなどの、本願明細書に記載されているいかなる使用可能なバッファーシステムを使用してもよい。一実施形態では、本願明細書に記載の方法で使用する電気泳動ゲルは、例えば約２．５％〜約３０％の濃度のアクリルアミド、又は約５％〜約２０％の濃度のアクリルアミドを含有する。一実施形態では、かかるポリアクリルアミド電気泳動ゲルは、１％〜１０％の架橋剤（限定されないがビスアクリルアミド）を含有する。一実施形態では、本願明細書に記載の方法で使用する電気泳動ゲルは、アガロースを含有し、例えば約０．１％〜約５％の濃度のアガロース、又は約０．５％〜約４％、又は約１％〜約３％の濃度のアガロースを含有する。一実施形態では、本願明細書に記載の方法で使用する電気泳動ゲルはアクリルアミド及びアガロースを含有し、例えば、電気泳動ゲルは約２．５％〜約３０％のアクリルアミドと約０．１％〜約５％のアガロース、又は、約５％〜約２０％のアクリルアミドと約０．２％〜約２．５％のアガロースを含有する。一実施形態では、かかるポリアクリルアミド／アガロース電気泳動ゲルは、１％〜１０％の架橋剤（限定されないがビスアクリルアミド）を含有する。一実施形態では、生体分子を分離するために用いるゲルは勾配ゲルであってもよい。
本願明細書に記載の方法は、スラブゲル電気泳動又はキャピラリーのゲル電気泳動を使用した、「ゲル内」検出のための修飾された生体分子を検出するために使用できる。具体的な実施形態では、かかる修飾された生体分子は糖タンパク質である。１つの態様では、当該方法は、アジド修飾された生体分子、末端アルキンを含むラベル、銅（ＩＩ）、還元剤及び銅（Ｉ）キレート剤を反応混合物に組み込み、生体分子とラベルとの化学コンジュゲーションを促進する条件下で反応混合物をインキュベートし、１つまたは複数の生化学的分離技術を使用して生体分子を分離し、生体分子を検出する段階を含む。かかる方法で使用するラベルは、本願明細書に記載されているいかなるラベルであってもよい。かかる方法で使用する銅（Ｉ）キレート剤は、本願明細書に記載されているいかなるキレート剤であってもよい。一実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、１，１０フェナントロリン−銅（Ｉ）キレート剤などである。他の実施形態では、銅（Ｉ）キレート剤は、バソクプロインジスルホン酸（ＢＣＳ：２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である。他の実施形態では、かかる方法で使用する銅（Ｉ）キレート剤は、銅（ＩＩ）をキレート化するために使用できる。
特定の機構に限定されないが、銅は生体分子（例えばタンパク質及び核酸）の裂開を促進できることが知られている。かかる方法の銅キレート剤の添加により、「クリック」ケミストリーにおいて使用する銅の有害な効果を減少させ、このことにより生体分子の構造的完全性が維持される。このように、本願明細書に記載の方法は、標識された及び検出生体分子の構造的完全性を維持し、それにより「クリック」ケミストリーを使用して標識される生体分子を分離し、検出する改良された方法が提供される。更に、クリックケミストリーを使用して分離された生体分子を検出する方法（分離された分子の構造的完全性が維持される）により、かかる生体分子の検出が改善される。
「ゲル内」検出の他の実施形態では、当該方法は、反応混合物中で、末端アルキンを含むアルキン修飾された生体分子、アジド基を含むラベル、銅（ＩＩ）、還元剤及び銅（Ｉ）キレート剤を混合し、生体分子とラベルとの化学コンジュゲーションを促進する条件下で反応混合物をインキュベートし、１つまたは複数の生化学的分離技術を使用して標識された生体分子を分離し、生体分子を検出する段階を含む。これらの方法では、標識された及び検出生体分子の構造的完全性は維持される。かかる方法で使用するラベルは、本願明細書に記載されているいかなるラベルであってもよい。かかる方法で使用する銅（Ｉ）キレート剤は、本願明細書に記載されているいかなるキレート剤であってもよい。一実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、１，１０フェナントロリン−銅（Ｉ）キレート剤などである。他の実施形態では、銅（Ｉ）キレート剤は、バソクプロインジスルホン酸（ＢＣＳ：２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である。他の実施形態では、かかる方法で使用する銅（Ｉ）キレート剤は、銅（ＩＩ）をキレート化するために使用できる。
ゲル内蛍光検出により、異なる生物学的サンプル間の、タンパク質グリコシル化の定量的ディファレンシャル分析が可能となり、また他のタンパク質ゲル染色との多重解析が可能となる。本願明細書に記載の方法の特定の実施形態では、蛍光−及び／又はＵＶ励起性アルキン含有プローブ、又は蛍光−及び／又はＵＶ励起性アジド含有プローブの利用により、同じ１Ｄ又は２Ｄゲルにおける糖タンパク質、リンタンパク質及び全タンパク質の多重検出が可能となる。図４は、４０及び５０ｋＤアジド標識されたモデルタンパク質の「ゲル内」検出を示す。最初に蛍光アルキンタグで標識し、更にゲル分離した。
一実施形態では、かかる分離及び検出方法において使用するラベルは、本願明細書に記載され、アルキン、アジド又はホスフィンを有するように誘導体化されたいかなるフルオロフォアであってもよい。特定の実施形態では、かかるフルオロフォアとしてはフルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ色素、ＳＹＰＲＯ色素又はＢＯＤＩＰＹ色素などが挙げられるが、これらに限定されない。
本願明細書に記載の方法は、異なる特性の標識分子を有するタンパク質を標識することにより、生体分子（例えばタンパク質）の多重検出に使用できる。例えば、全タンパク質染色（ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙなど）を使用して、異なるスペクトル放出を有するフルオロフォアを使用して本発明の方法により標識される、タンパク質を含むゲルを染色することができる。他の特徴（例えば酸化タンパク質又はリン酸化タンパク質）を有するタンパク質を、ゲル染色に用いるリンタンパク質特異的ラベルを用いて、同じゲルにおいて検出してもよい。図９は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ及びコフィリンの多重ウエスタンブロット検出を示す。
他の態様では、タンパク質（例えば糖タンパク質）をアジドタグで標識し、ゲル電気泳動に供し、得られるゲルを、銅（Ｉ）の存在下でアルキンタグ（例えば蛍光アルキンタグ）とインキュベートすることができる。銅（Ｉ）は、その元々の形（例えばＣｕＢｒ）において添加してもよく、又は還元剤の添加により、銅（ＩＩ）化合物からインサイチューで生じさせてもよい。かかる方法における還元剤は、本願明細書に記載されているいかなる還元剤（限定されないがアスコルビン酸塩又はＴＣＥＰ）であってもよい。銅（Ｉ）を安定化させるキレート剤の添加により、化学ライゲーション反応を強化できる。かかる方法で使用するラベルは、本願明細書に記載されているいかなるラベルであってもよい。かかる方法で使用する銅（Ｉ）キレート剤は、本願明細書に記載されているいかなるキレート剤であってもよい。一実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、１，１０フェナントロリン−銅（Ｉ）キレート剤などである。他の実施形態では、銅（Ｉ）キレート剤は、バソクプロインジスルホン酸（ＢＣＳ：２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である。他の実施形態では、かかる方法で使用する銅（Ｉ）キレート剤は、銅（ＩＩ）をキレート化するために使用できる。ライゲーション反応段階の後、ゲルを洗浄し、タグ付きタンパク質を、標準的な蛍光スキャン装置を使用して視覚化する。
他の態様では、タンパク質（例えば糖タンパク質）をアルキンタグで標識し、ゲル電気泳動に供し、得られるゲルを、銅（Ｉ）の存在下でアジドタグ（例えば蛍光アジドタグ）とインキュベートすることができる。銅（Ｉ）は、その元々の形（例えばＣｕＢｒ）において添加してもよく、又は還元剤の添加により、銅（ＩＩ）化合物からインサイチューで生じさせてもよい。かかる方法における還元剤は、本願明細書に記載されているいかなる還元剤（限定されないがアスコルビン酸塩又はＴＣＥＰ）であってもよい。銅（Ｉ）を安定化させるキレート剤の添加により、化学ライゲーション反応を強化できる。かかる方法で使用するラベルは、本願明細書に記載されているいかなるラベルであってもよい。かかる方法で使用する銅（Ｉ）キレート剤は、本願明細書に記載されているいかなるキレート剤であってもよい。一実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、１，１０フェナントロリン−銅（Ｉ）キレート剤などである。他の実施形態では、銅（Ｉ）キレート剤は、バソクプロインジスルホン酸（ＢＣＳ：２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である。他の実施形態では、かかる方法で使用する銅（Ｉ）キレート剤は、銅（ＩＩ）をキレート化するために使用できる。ライゲーション反応段階の後、ゲルを洗浄し、タグ付きタンパク質を、標準的な蛍光スキャン装置を使用して視覚化する。
更なる実施形態では、タンパク質（例えば糖タンパク質）をアジドタグで標識し、ゲルに電気泳動に供し、得られるゲルを、シュタウディンガーライゲーション反応を用いて、ホスフィンタグ（例えば蛍光ホスフィン含有タグ）とインキュベートすることができる。ライゲーション反応段階の後、ゲルを洗浄し、タグ付きタンパク質を、標準的な蛍光スキャン装置を使用して視覚化する。かかる方法においては、銅の使用（タンパク質などの生体分子の分解に関与する）を回避できる。
別の態様では、本願明細書に記載の方法を用いて標識されるタンパク質の検出は、ウエスタンブロットによって実施してもよく、アジド基を含むように誘導体化された生体分子を、ゲル電気泳動の前に、検出可能なラベルで標識し、ブロッティング膜に転写する。アジド含有生体分子は、例えばアルキル−ビオチンで標識してもよく、電気泳動分離及びブロッティング膜への移動の後、色素生産性基質を変化させる酵素と結合したストレプトアビジンを使用して検出してもよい。当業者であれば、直接検出可能若しくは間接的に検出可能で、末端アルキン又はアジド基を含むようにに誘導体化できるいかなる使用可能なラベルを、アジド基又は末端アルキンを含む生体分子に結合させることができ、分離された生体分子（膜に転写された、当該分離された生体分子を含む）を検出するために使用できることを理解するであろう。
他の実施形態では、ウエスタンブロット分析により、低いフェムトモル範囲の糖タンパク質サブクラスの高感度な検出が可能となり、タンパク質特異的抗体による多重解析が可能となる。一実施形態では、ビオチン−アルキンプローブ、又はビオチン−アジドプローブの使用により、単クローン若しくは多クローン性抗体を使用した、糖タンパク質及び目標タンパク質の多重ウエスタンブロット検出が可能となる。本願明細書に記載されている糖タンパク質多重検出ストラテジーによって得られる結果から、一般的に用いられるレクチンベース及び抗体ベースの糖タンパク質検出技術によっては得られない、選択性及び感度が提供される。
銅の触媒による環付加反応を利用する本願明細書に記載の方法により、アジド又はアルキンにより修飾されるタンパク質の非常に高感度な検出が可能となり、その状況を、ゲル電気泳動及びウエスタンブロットにおける１Ｄ及び２Ｄ蛍光ゲル感度で示す（図８から１０を参照）。具体的な実施形態では、検出感度は低いピコモル範囲であり、一方、他の実施形態では、検出感度は中程度−低度のフェムトモル範囲及び標識効率である（図６Ｂを参照）。
一実施形態では、本願明細書において開示される銅（Ｉ）キレート剤との「クリック」ケミストリーを使用して生体分子（例えばタンパク質）に結合させたラベルは、生体分子の分離のために使用できる。例えば、アフィニティクロマトグラフィー又はビーズ捕捉技術を用いて、本願明細書に記載の方法を使用してビオチン又は他の親和性タグで標識した生体分子を分離してもよい。捕捉された分子は、親和性タグ又は他の手段を用いて検出されることができ、及び／又は構造若しくは機能のために更に分析できる。
「ゲル内」検出の他の態様は、「ユニバーサルクリック（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃｌｉｃｋ）」ケミストリーを使用した電気泳動ゲル又はウエスタンブロット膜における全タンパク質検出であり、フェニルホウ酸含有分子が、アジド部分又はアルキン部分にリンカーを介して連結されている。酸性条件の場合を除いて、フェニルホウ酸は、安定な糖タンパク質上のシスジオール部分と結合する。かかるラベルは、電気泳動分離の後アジド又はアルキン部分による糖タンパク質の修飾に使用でき、更に、「クリック」ケミストリー、シュタウディンガーライゲーション反応又は活性化アルキン化学を経てラベルを付加するために使用できる。ゲルは更に、標識された糖タンパク質を検出するために視覚化される。一実施形態では、目的の糖タンパク質はかかる標識の後、目的のバンドを切り出し、ゲル切片を酸性条件下で処理し、フェニルホウ酸と糖タンパク質上のシスジオール部分との結合を逆反応させることにより分離し、糖タンパク質を放出させることができる。放出された糖タンパク質は更に、ｍａｓ分光測定法を使用して同定されてもよい。
固定化修飾生体分子の標識方法
他の態様は、固体支持体に固定された修飾された生体分子の標識方法の提供に関する。かかる方法で使用する固体支持体は、本願明細書において記載される固体若しくは半固体のマトリックスであってもよい。かかる固体支持体としては、限定はされないが、ガラス、スライド、アレイ、シリカ粒子、ポリマー粒子、マイクロタイタープレート及び重合ゲルが挙げられる。この態様において、生体分子は、本願明細書に記載の方法を使用して修飾される。特定の態様において、最初に修飾された生体分子を固定化し、その後に、生体分子、レポーター分子、担体分子及び固体支持体を含む生体分子複合体を形成することが有利であり、当該レポーター分子、担体分子又は固体支持体は、複合体の形成に使用される反応基を含む。具体的な実施形態では、かかる反応性基はアジドと反応するアルキンである。具体的な実施形態では、かかる反応性基はアジドと反応する活性化アルキンである。具体的な実施形態では、かかる反応性基はアジドと反応するホスフィンである。具体的な実施形態では、かかる反応性基はアルキンと反応するアジドである。一実施形態では、複合体は「クリック」ケミストリー条件下で形成され、当該レポーター分子、担体分子又は固体支持体はアルキン又はアジドを有する。別の態様では、複合体はシュタウディンガーライゲーション反応条件下で形成され、当該レポーター分子、担体分子又は固体支持体はトリアリールホスフィン又はアジドを有する。別の態様では、複合体は活性化アルキンを使用して形成され、当該レポーター分子、担体分子又は固体支持体は活性化アルキン又はアジドを有する。
この態様では、生体分子は、本願明細書に記載の方法を使用して、アジド含有部分、アルキン含有部分又はホスフィン含有部分によって代謝的に、酵素的に又は化学的に修飾される。具体的な実施形態では、修飾された生体分子はアジド修飾された生体分子、アルキン修飾された生体分子、又はホスフィン修飾された生体分子である。一実施形態では、アジド修飾された生体分子はアジド修飾糖タンパク質である。一実施形態では、アルキン修飾された生体分子はアルキン修飾された糖タンパク質である。一実施形態では、ホスフィン修飾された生体分子はホスフィン修飾された糖タンパク質である。
一実施形態では、最初にアジド修飾された生体分子を固定化し、更にその後、レポーター分子、担体分子又は固体を有する生体分子複合体を形成させるのが有利である。その場合、当該レポーター分子、担体分子又は固体支持体は、複合体を形成する前にアジド反応基を有する。一実施形態では、当該複合体は「クリック」ケミストリー条件下で形成され、当該レポーター分子、担体分子又は固体支持体は末端アルキンを有する。別の態様では、当該複合体はシュタウディンガーライゲーション反応条件下で形成され、当該レポーター分子、担体分子又は固体支持体はトリアリールホスフィンを有する。一実施形態では、アジド修飾糖タンパク質は固体支持体上へ最初に固定化され、更にその後それを使用し、レポーター分子、担体分子又は固体支持体を含む修飾された糖タンパク質複合体を形成する。その場合、レポーター分子、担体分子又は固体支持体は、複合体を形成する前にアジド反応基を有する。一実施形態では、当該複合体は「クリック」ケミストリー条件下で形成され、レポーター分子、担体分子又は固体支持体は末端アルキンを有する。別の態様では、当該複合体はシュタウディンガーライゲーション反応条件下で形成され、レポーター分子、担体分子又は固体支持体はトリアリールホスフィンを有する。
別の態様では、修飾された生体分子は「クリック」ケミストリー又はシュタウディンガーライゲーション反応に使用する官能基以外の官能基を使用して、固体支持体に結合する。その場合、結合する修飾された生体分子を用いて、「クリック」ケミストリー条件下又はシュタウディンガーライゲーション反応条件下において、「クリック」ケミストリー又はシュタウディンガーライゲーション反応に使用する官能基を有するレポーター分子、担体分子、又は他の固体支持体と複合体を形成する。例えば、修飾された生体分子は、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルフォンアミド又はスルホキシド官能基を使用して固体支持体に固定化できる。
この態様では、生体分子は、本願明細書に記載の方法を使用してアジド含有部分、アルキン含有部分又はホスフィン含有部分により修飾される。具体的な実施形態では、修飾された生体分子はアジド修飾された生体分子、アルキン修飾された生体分子、又はホスフィン修飾生体分子である。一実施形態では、アジド修飾された生体分子はアジド修飾糖タンパク質である。一実施形態では、アルキン修飾された生体分子はアルキン修飾糖タンパク質である。一実施形態では、ホスフィン修飾された生体分子はホスフィン修飾糖タンパク質である。
一実施形態では、アジド修飾された生体分子はアジド反応性官能基以外の官能基を使用して固体支持体に結合し、当該結合したアジド修飾された生体分子は、クリックケミストリー条件下での複合体形成に用いられ、当該レポーター分子、担体分子又は他の固体支持体は末端アルキンを有する。別の実施形態では、アジド修飾された生体分子はアジド反応性官能基以外の官能基を使用して固体支持体に結合し、当該結合したアジド修飾された生体分子は、シュタウディンガーライゲーション反応条件下での複合体に用いられ、当該レポーター分子、担体分子又は他の固体支持体はトリアリールホスフィンを有する。一実施形態では、アジド修飾糖タンパク質はアジド反応性官能基以外の官能基を使用して固体支持体に結合し、当該結合したアジド修飾糖タンパク質は、クリックケミストリー条件下での複合体形成に用いられ、当該レポーター分子、担体分子又は他の固体支持体は末端アルキンを有する。別の実施形態では、アジド修飾糖タンパク質はアジド反応性官能基以外の官能基を使用して固体支持体に結合し、当該結合したアジド修飾糖タンパク質は、シュタウディンガーライゲーション反応条件下での複合体に用いられ、当該レポーター分子、担体分子又は他の固体支持体はトリアリールホスフィンを有する。
他の態様では、固定化されたアジド修飾された生体分子を検出する方法が提供される。当該方法は、以下の段階を含む。
（ａ）固体若しくは半固体マトリックス上にアジド修飾された生体分子を固定化して、固定化されたアジド修飾生体分子を形成する段階；
（ｂ）アルキン反応基を含むレポーター分子と固定化されたアジド修飾生体分子とを接触させて、接触されたアジド修飾生体分子を形成する段階；
（ｃ）接触されたアジド修飾生体分子を充分な時間インキュベートし、レポーター分子−生体分子複合体を形成する段階；
（ｄ）レポーター分子−生体分子複合体を適当な波長で照射し、照射されたレポーター分子−生体分子複合体を形成する段階；
（ｅ）照射されたレポーター分子−生体分子複合体を観察し、固定化されたアジド修飾生体分子の存在を検出する段階。具体的な実施形態では、アジド修飾生体分子はアジド修飾タンパク質であり、一方、他の実施形態では、アジド修飾生体分子はアジド修飾糖タンパク質である。
他の態様では、固定化されたアルキン修飾された生体分子を検出する方法が提供される。当該方法は、以下の段階を含む。
（ａ）固体若しくは半固体マトリックス上にアルキン修飾された生体分子を固定化して、固定化されたアルキン修飾生体分子を形成する段階；
（ｂ）アジド反応基を含むレポーター分子と固定化されたアルキン修飾生体分子とを接触させて、接触されたアルキン修飾生体分子を形成する段階；
（ｃ）接触されたアルキン修飾生体分子を充分な時間インキュベートし、レポーター分子−生体分子複合体を形成する段階；
（ｄ）レポーター分子−生体分子複合体を適当な波長で照射し、照射されたレポーター分子−生体分子複合体を形成する段階；
（ｅ）照射されたレポーター分子−生体分子複合体を観察し、固定化されたアジド修飾生体分子の存在を検出する段階。具体的な実施形態では、アルキン修飾生体分子はアルキン修飾タンパク質であり、一方、他の実施形態では、アルキン修飾生体分子はアルキン修飾糖タンパク質である。
サンプル及びサンプル調製
エンドユーザは、サンプル及びサンプルの調製方法を適宜選択する。本願明細書に記載されている方法及び組成物に使用できるサンプルとしては、限定されないが、生体分子を含むあらゆる生物学的材料又は水溶液が挙げられる。一実施形態では、当該サンプルにはまた、生体分子が添加された材料が包含される。本願明細書に記載されている方法に使用できるサンプル及び組成物は、全血、血漿、血清、鼻分泌物、痰、唾液、尿、汗、経真皮滲出液、脳脊髄液等の生体液であってもよい。他の実施形態では、当該サンプルは、組織を含む生体液、及び目的の生体分子が培地中に分泌された細胞培養培地である。かかる培養において使用する細胞としては、限定されないが原核細胞及び真核生物細胞が挙げられ、初代培養物及び不死化細胞なども包含される。かかる真核生物細胞としては、卵巣細胞、上皮細胞、循環免疫細胞、β細胞、肝細胞及び神経単位が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、当該サンプルは動物の全器官、組織又は細胞（筋肉、目、皮膚、性腺、リンパ節、心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、膵臓、固形腫瘍、大食細胞、乳腺、中皮など）であってもよい。
様々なバッファー（無機及び有機系バッファーを含む）を、本願明細書に記載の方法で使用してもよい。具体的な実施形態では、有機系バッファーは双性イオン性のバッファーである。例えば、本願明細書に記載の方法で使用できるバッファーとしては、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、マレアート、カコジル酸塩、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、２−（Ｎ−モルホリノリウム）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノリウム）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノリウム）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、（２−ヒドロキシ−１、１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ＴＲＩＳ−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）、グリシン、ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（ビストリス）又はそれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、かかるバッファーがゲル電気泳動分離において用いられる場合、そのバッファーにはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有させてもよい。
本願明細書に記載の方法で使用するかかるバッファーの濃度は、約０．１ｍＭ〜１Ｍである。具体的な実施形態では、１０ｍＭ〜約１Ｍの濃度である。具体的な実施形態では、約２０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度であり、他の実施形態では、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度である。一実施形態では、バッファー濃度は約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭであり、他の実施形態では、バッファー濃度は約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭである。
ｐＨは特定の分析システムによって変化し、通常、スルホン酸部分の１つまたは複数が非プロトン化される場合に、容易に決定できるｐＨ範囲となる。
一実施形態では、本願明細書に記載の方法で使用するバッファーは、常温で５〜９のｐＨを有する。具体的な実施形態では、バッファーは常温で６〜８．５のｐＨを有する。具体的な実施形態では、バッファーは常温で６〜８のｐＨを有する。具体的な実施形態では、バッファーは常温で６〜７のｐＨを有する。具体的な実施形態では、バッファーは２５℃で５〜９のｐＨを有する。具体的な実施形態では、バッファーは２５℃で６〜８．５のｐＨを有する。具体的な実施形態では、バッファーは２５℃で６〜８のｐＨを有する。具体的な実施形態では、バッファーは２５℃で６〜７のｐＨを有する。
一実施形態では、本願明細書に記載の方法で使用するサンプルは、サンプルに非イオン系界面活性剤を含有する。本願明細書に記載の方法で使用され、サンプルに添加されるかかる非イオン系界面活性剤の非限定的な例としては、ポリオキシアルキレンジオール、アルコールエトキシレート（Ｓｈｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社からのＮｅｏｄｏｌ及びユニオンカーバイド社からのターギトール）などの脂肪族アルコールエーテル、アルキルフェノールエトキシレート（Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｎｉｌｉｎｅ社及びＦｉｌｍ社からのＩｇｅｐａｌ界面活性剤）、エチレンオキシド／プロピレンオキシド・ブロックコポリマー（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ社からのＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）シリーズ）、ポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（モンサント社からのＳｔｅａｒｏｘ ＣＤ）、アルキルフェノール界面活性剤（トリトンＸ−１００、ローム＆ハース社、トリトンシリーズ）、アルコールエトキシレートのポリオキシエチレンメルカプタンアナログ（モンサント社からのＮｏｎｉｃ ２１８及びＳｔｅａｒｏｘ ＳＫ）、アルキルアミンのポリオキシエチレン付加物（Ａｒｍａｋ社からのＥｔｈｏｄｕｏｍｅｅｎ及びＥｔｈｏｍｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンアルキルアミド、ソルビタンエステル（例えばソルビットのモノラウリン酸エステル）及びアルコールフェノールエトキシレート（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社からのＳｕｒｆｏｎｉｃ）などが挙げられる。ソルビタンエステルの非限定的な例としては、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（ＴＷＥＥＮ４０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（ＴＷＥＥＮ６０）及びポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ ８０）などが挙げられる。一実施形態では、サンプルに添加されるかかる非イオン系界面活性剤の濃度は、０．０１〜０．５％である。他の実施形態では、濃度は約０．０１〜０．４体積％である。他の実施形態では、濃度は約０．０１〜０．３体積％である。他の実施形態では、濃度は約０．０１〜０．２体積％である。他の実施形態では、濃度は約０．０１〜０．１体積％である。
照射
本願明細書に記載されている化合物及び組成物は、分析の前、後又は間のいかなる時点においても、検出可能な光学反応をもたらす波長の光で照射でき、また光学反応を検出する装置で観察されてもよい。一実施形態では、かかる照射は、青紫光又は可視波長放出灯（アーク灯、レーザー又は日光又は通常の室光）によって行ってもよく、かかる光源からの波長は、本願明細書に記載の化合物又は組成物のフルオロフォア又はクロモフォアの吸収スペクトル間でオーバーラップする。一実施形態では、かかる照射は青紫色若しくは可視波長放出灯、アーク灯、レーザー、又は日光又は通常の室光によって行ってもよく、蛍光化合物（その特異的な相補結合ペア部材を含む）は、蛍光放出と、強い可視吸収を示す。
一実施形態では、本願明細書に記載の化合物又は組成物のフルオロフォア又はクロモフォアの照射に使用される光源としては、ハンディサイズの紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノン灯、アルゴンレーザー、レーザダイオード、青色レーザダイオード及びＹＡＧレーザーなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの照明光源は、レーザスキャナー、フローサイトメトリ、蛍光マイクロプレートリーダー、標準的若しくは小型蛍光測定器又はクロマトグラフィー探知器に任意に装備されてもよい。かかるフルオロフォアの蛍光放出は、視覚による点検によって実施してもよく、又は、以下の装置のいずれかを用いて任意に検出してもよい：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、フォトフィルム、レーザースキャニング装置、蛍光測定器、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、量子カウンタ、エピフロレッセンス顕微鏡、スキャン顕微鏡、フローサイトメトリ、蛍光マイクロプレートリーダー。或いは、シグナル増幅装置（例えば光電子倍増管）を用いてもよい。サンプルをフローサイトメトリ、蛍光顕微鏡又は蛍光測定器を使用して解析する場合、計測器を任意に用いて、本発明の蛍光化合物と、検出可能な異なる光学特性を有する第２のフルオロフォアとを区別、識別してもよく、典型的には、本発明の蛍光化合物の蛍光反応と第２のフルオロフォアのそれとを区別することによって実施する。フローサイトメトリを使用してサンプルを解析するばあい、サンプルの検査は、ソーティング装置を用いて、蛍光反応に基づくサンプル中の粒子を分離する段階を任意に含んでもよい。
一実施形態では、物理的若しくは化学的クエンチング剤を使用して、蛍光を任意にクエンチしてもよい。
本発明のキット
別の態様では、本発明はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ、ＧａｌＴ酵素、アジド反応性レポーター分子、担体分子又は固体支持体を含むキットの提供に関する。
１つの態様では、本発明は、末端アルキンを含む少なくとも１つのラベル、銅を含有する溶液及び銅（Ｉ）キレート剤を含む溶液を含む、生体分子を標識するためのキットが包含される。当該キットは、還元剤、１つまたは複数のバッファー又は１つまたは複数の界面活性剤を含有する溶液を更に含んでなってもよい。
一実施形態では、キットに提供されるアルキンラベルは、フルオロフォア（例えばキサンテン、クマリン、ボラポリアザインダセン、ピレン及びシアニン）である。一実施形態では、当該キットには２つ以上の異なる末端アルキンを含むラベルが含まれ、その１つまたは複数がフルオロフォアである。他の実施形態では、キットで提供されるアルキンラベルはタグであり、限定されないがペプチド又はハプテン（例えばビオチン）などのタグである。
他の好ましい実施形態では、キットに含まれる銅（Ｉ）キレート剤は１，１０フェナントロリン（好ましくはバソクプロインジスルホン酸）である。幾つかの実施形態では、硫酸銅又は銅の酢酸塩溶液の形で銅が提供される。幾つかの実施形態では、アスコルビン酸塩の形で還元剤が提供される。
別の態様では、本発明には、アジド基を含む少なくとも１つのラベル、銅含有溶液、及び銅（Ｉ）キレート剤含有溶液を含む、生体分子を標識するためのキットが包含される。当該キットは、還元剤、１つまたは複数のバッファー又は１つまたは複数の界面活性剤を含有する溶液を更に含んでなってもよい。
この態様の一実施形態では、キットに含まれるアジド含有ラベルは、フルオロフォア（例えばキサンテン、クマリン、ボラポリアザインダセン、ピレン及びシアニン）である。他の実施形態では、キットで提供されるアジドラベルはタグであり、限定されないがペプチド又はハプテン（例えばビオチン）などのタグである。
一実施形態では、当該キットには２つ以上の異なるアジド含有ラベルが含まれ、その１つまたは複数がフルオロフォアである。他の好ましい実施形態では、キットに含まれる銅（Ｉ）キレート剤は１，１０フェナントロリン（好ましくはバソクプロインジスルホン酸）である。幾つかの実施形態では、硫酸銅又は銅の酢酸塩溶液の形で銅が提供される。幾つかの実施形態では、アスコルビン酸塩の形で還元剤が提供される。
他の実施形態では、当該キットは、１つまたは複数の試薬及びウエスタンブロットにおける色素生成を検出するための溶液を更に含んでなってもよい。
発明の詳細な説明を上記し、本発明を例示するために以下に実施例を示すが、それらは本発明又は特許請求の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
実施例
実施例１：ＵＤＰＧａｌＮＡｚの合成
ＵＤＰＧａｌＮＡｚの合成を、以下の反応式で示す。
Figure 2009528988
アジド酢酸
ヨード酢酸（８．０ｇ、４３．０ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（１００ｍＬ）の溶液に、アジ化ナトリウム（５．６２ｇ、８６．０ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで撹拌し、光から保護した。４日後に、溶液を１ＮＨＣｌ（３０ｍＬ）で希釈し、ｐＨが２〜３の範囲となることを確認した。溶液をＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出し、そして、複合有機相を、飽和ＮａＨＳＯ３（１×５０ｍＬ）で洗浄し、塩水（１×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液をデカントし、濃縮し、粗アジド酢酸（３．３４ｇ、５３％）を更なる精製をせずに次の段階で直接使用した。
Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（アノマー混合物）
アジド酢酸（３．３４ｇ、３３．０６ｍｍｏｌ）のメタノール（１７０ｍＬ）中の溶液に、Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩（５．０９ｇ、２３．６２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（７．９０ｍＬ、５６．６８ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を５分間のＲＴで撹拌し、次に０℃に冷却した。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．１９ｇ、２３．６２ｍｍｏｌ）、塩酸（９．０５ｇ、４７．２４ｍｍｏｌ）Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドを添加した。氷を単独で融解させ、澄んだ薄い橙黄色の反応溶液をＲＴで一晩撹拌し、光から保護した。蜂蜜色の溶液を濃縮し、黄色の樹脂状物を得た。粗製の黄色の材料（２つのアノマー（１００％の変換とみなされる）の混合物）を、更なる精製をせずに次の反応において直接用いた。
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ、アノマー混合物）
Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（アノマー（２３．６２ｍｍｏｌ）の混合）のピリジン（１４０ｍＬ）中の溶液に、無水酢酸（７０ｍＬ）を添加した。濁った、橙黄色／茶色の溶液をＲＴで一晩撹拌し、光から保護した。溶液を濃縮し、茶色の粘稠性の油状物を得た。粗製の油状物を３３〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンと共にロードしてシリカゲルを経て精製し、生成物４．３５ｇ（６０％、２つのアノマーの混合物）を得た。
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（アノマー混合物）
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（アノマー、１．６０ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）中溶液にベンジルアミン（０．４９ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を５０℃で油浴において加熱し、光から保護した。１５時間後に、最初に澄んだカナリア色だった溶液が、茶色に変化した。溶液を油浴から取り出し、濃縮した。粗製の油状物をシリカカラムクロマトグラフィー（５０−１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を介して精製し、生成物（１．１８ｇ、８２％、茶色の油、２つのアノマーの混合物）を得た。
ジアリル（３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−アジドアセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェート
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（アノマー、０．３４ｇ、０．８８ｍｍｏｌの混合）のＣＨ２Ｃｌ２（９．０ｍＬ）中の溶液に、１Ｈ−テトラゾール（０．３１ｇ、４．４１ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を１０分間のＲＴで撹拌し、光から保護した。ジアリルジイソプロピルホスホロアミダイト（０．７０ｍＬ、２．６４ｍｍｏｌ）を滴下して添加し、反応液を３時間ＲＴで撹拌した。溶液をその後、アセトニトリル／ドライアイス浴及び３−クロロ過安息香酸（０．７６ｇ、４．４１ｍｍｏｌ）で−４０℃に冷却し、−４０℃で１０分間撹拌した。溶液を更に、徐々に、１時間以上かけてＲＴに加温した（−４０℃浴槽から、氷を詰め込んだ０℃浴槽に移した）。１時間後、氷はまだ現在のアイスバス中に存在したため、ＲＴで２０分間撹拌した。反応溶液をＣＨ２Ｃｌ２（４５ｍＬ）で希釈し、１０％のＮａ２ＳＯ３水溶液（２×４５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２×４５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（２×４５ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を更にＮａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、デカントし、濃縮した。粗製物質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（６０−１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を介して精製し、生成物（０．１８ｇ、３９％）を得た。
ＵＤＰＧａｌＮＡｚ
ジアリル（３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−アジドアセチアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェート（０．１０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ：ＭｅＯＨ（１：１、２．１ｍＬ：２．１ｍＬ）の溶液に、アルゴン下で、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム塩（０．１４ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、更にテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を光から保護し、ＲＴで３時間撹拌した。４日後に、反応溶液を真空濃縮し、トルエン（３×２０ｍＬ）によって共蒸発させた。粗製物質をＣＨ３ＣＮ（０．８６ｍＬ）中に懸濁し、トリエチルアミン（０．２７ｍＬ）を添加した。溶液を０℃に冷却し、ＣＨ３ＣＮ（１．７ｍＬ）中の調製直後のＵＭＰ−Ｎ−メチルイミダゾール（０．２２ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。得られる黄色溶液を０℃で３時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、更にＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：トリエチルアミン（５：２：１、１０ｍＬ）の溶液中に再懸濁し、ＲＴで２０時間撹拌した。溶液を真空濃縮し、粗製の黄色のシロップ状物を得た。この材料をＨ２Ｏ（１５ｍＬ）に溶解させ、有機副産物を除去するために、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍＬ）により抽出された。有機層を除去し、水性層を濃縮し、トルエンによって共蒸発させた。粘稠な、薄い橙黄色の澄んだ油状物を得た。粗製物質を、１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３ガスでパージしたバッファー（２．０ｍＬ）中に溶解させた。溶液は濁っており、清澄でなかったため、Ａｃｒｏｄｉｓｃ ＰＦ０．８／０．２ｍＭ Ｓｕｐｏｒ、滅菌済、使い捨てタイプの、非発熱性のフィルタ（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、＃４１８７）で濾過した。得られた透明な、薄い橙黄色の溶液を、ＢｉｏＧｅｌ Ｐ２、ｅｘｔｒａ ｆｉｎｅカラム（１．５ｃｍ×８０ｃｍ）にロードし、０．１３ｍＬ／分の流速でフラッシュした。カラムを１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３バッファーで一晩ランし、フラクション当たり２．６ｍＬを回収した。生成物を含むフラクションを回収した（ＴＬＣ５：３：１、ＥｔＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、Ｈ２Ｏ、Ｒｆ＝０．７０、ＵＶ活性化）。生成物を含有するフラクションを結合した後に、溶液を濃縮し、得られる白色固体を最小量の水に溶解させ、Ｄｏｗｅｘ（ＢｉｏＲａｄ ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８−２００樹脂、ナトリウム形において購入）を通過させた。全ての溶出液を回収し、ＵＶ活性化物質がカラムから溶出しなくなった後、濃縮させた。薄い黄褐色のフォーム状物が得られた。この材料を、最小量の水に溶解させ、凍結乾燥し、黄褐色の、結晶質の材料として生成物（０．１０ｇ、８３％）を得た。
実施例２：ＵＭＰ−Ｎ−メチルイミダゾリドの合成
ＵＭＰ−ＪＶ−メチルイミダゾリドの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
ウリジン５’−モノリン酸 トリエチルアンモニウム塩（５’−ＵＭＰ トリエチルアンモニウム塩）
ウリジン５’−モノリン酸 二ナトリウム塩（１．０ｇ）を、Ｈ２Ｏ（２ｍｌ）に溶解させ、溶出液としてＨ２Ｏを用いてＤｏｗｅｘ樹脂トリエチルアンモニウム塩（２．７ｃｍ×７．０ｃｍのカラムサイズ）を通過させた。全ての溶出液を回収し、ＵＶ活性化物質がカラムから溶出しなくなった後、濃縮させた。溶液を濃縮し、トルエンで共蒸発させ、白い結晶固体を得た（０．７８ｇ、８０％）。
ウリジンモノリン酸−Ｎ−メチルイミダゾール（ＵＭＰ−Ｎ−メチルイミダゾール）
ウリジン５’−モノリン酸 トリエチルアンモニウム塩（０．０９７ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（０．７０ｍＬ）中の懸濁液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（０．１１ｍＬ、０．８６４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．０３ｍＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を０℃に冷却した。別のフラスコにおいて、トリフルオロ酢酸無水物（０．１５ｍＬ、１．０８ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（０．２１ｍＬ）に添加し、０℃に冷却した。この溶液をマイクロシリンジを介して、ウリジン５’−モノリン酸トリエチルアンモニウム塩の０℃の懸濁液に滴下して添加し、黄色の澄んだ溶液を得た。５分後に溶液をアイスバスから除去し、ＲＴで３０分間撹拌した。溶液を真空内で濃縮し、乾燥したアルゴン下に配置した。ホスホリル無水物混合溶液を更に０℃に冷却した。別のフラスコにおいて、メチルイミダゾール（０．０５１ｍＬ、０．６５ｍｍｏｌ）を、ＣＨ３ＣＮ（０．２ｍＬ）及びトリエチルアミン（０．１５ｍＬ、１．０８ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。得られる澄んだ無色の溶液を０℃に冷却し、その後０℃で混合ホスホリル無水物溶液に滴下して添加した。溶液を更に５〜１０分、０℃で撹拌した。２０分後、黄色が暗色になり、ＴＬＣ（１０：１０：１、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：１ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ７））で解析し、生成物（Ｒｆ＝０．２８、ＵＶ活性化）への完全な変換が示された。ＣＨ３ＣＮ（１．７ｍＬ）を０℃で溶液に添加し、この粗製物質を、次の段階で直接用いた（１００％の変換と仮定）。
実施例３：Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）アルキンの合成
Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）アルキンの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）カルボン酸 スクシニミジルエステル（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．４ｍＬ）中溶液に、ＲＴで、プロパルギルアミン（４２μＬ、０．６１ｍｍｏｌ）を添加した。最初の澄んだ橙黄溶液が、濁った黄色の溶液に変化した。ＲＴで〜１５分反応させ、反応を完了させ、溶液を乾燥濃縮した。残余物をＨＰＬＣで精製し、生成物（３６ｍｇ、８４％）を得た。ＴＬＣ（１０％のＥｔＯＡｃ、ＣＨＣｌ３）Ｒｆ＝０．３０、ＥＳＩ ｍ／ｚ ３４６（Ｍ＋、Ｃ２１Ｈ１９Ｎ３Ｏ２、３４６必要）。
実施例４：５−カルボキシテトラメチルローダミンアルキン（５−ＴＡＭＲＡ−アルキン）の合成
５−カルボキシテトラメチルローダミンアルキン（５−ＴＡＭＲＡ−アルキン）の合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
５−カルボキシテトラメチルローダミン スクシニミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ、０．１０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）中溶液に、プロパルギルアミン（２５μＬ、０．３８ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）を添加した。ＲＴで３０分溶液を撹拌した後、溶液を真空濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液：２５−４０％のＣＨ３ＣＮ／２５ｍＭのＴＥＡＡ、ｐＨ４．７、１５ｍＬ／分の流速）で精製し、６８ｍｇの生成物（８２％、紫の固体）（ｔＲ＝２３〜３３分）を得た。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２）Ｒｆ＝０．６７。
実施例５：ビオチンアルキンの合成
ビオチンアルキンの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
ＥＺ−結合ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（２５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、ピアス）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（０．１ｍＬ）を添加した。ＲＴで９０分溶液を撹拌した後、若干の出発原料がまだ見られた。更にプロパルギルアミン（０．２ｍＬ）を添加し、溶液を更に６０分間撹拌した。溶液を真空濃縮した。粗製物質を、ＨＰＬＣで精製し、黄色の固体として生成物１４．４ｍｇ（６４％）を得た。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、７：１）Ｒｆ＝０．２３、ＥＳＩ ｍ／ｚ ５２９（Ｍ＋、Ｃ２４Ｈ４０Ｎ４Ｏ７Ｓ、５２９必要）。
実施例６：化合物１の合成
化合物１の合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８カルボン酸 スクシニミジルエステル、ジリチウム塩（混合異性体、５０ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．０ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（５４□Ｌ、０．７９ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで一晩撹拌した。最初の深い赤色溶液が淡黄色に変化し、透明になった。溶液を真空内で濃縮し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（調製済プレート、２０％のＨ２Ｏ、ＣＨ３ＣＮ）で精製し、橙色固体として生成物（２０ｍｇ、４４％）を得た。ＴＬＣ（３：１、ＣＨ３ＣＮｉＨ２Ｏ）Ｒｆ＝０．７０、ＥＳＩ ｎｅｇ ｍ／ｚ ５７０（Ｍ＋、Ｃ２４Ｈ１６Ｎ３Ｏ１０Ｓ２−、５７０必要）。
実施例７：化合物２の合成
化合物２の合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２カルボン酸 スクシニミジルエステル（５０ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．２ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（１００□Ｌ、１．４６ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで一晩撹拌した。Ｈ２Ｏ（１．０ｍＬ）を溶液に添加し、溶液を更に数時間撹拌した。溶液を真空濃縮し、粗製物質をＨＰＬＣで精製し、生成物（３０ｍｇ、６５％）を得た。ＴＬＣ（８：２、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ）Ｒｆ＝０．５８、ＥＳＩ ｍ／ｚ ６６４（Ｍ＋、Ｃ３３Ｈ３３Ｎ３Ｏ８Ｓ２、６６４必要）。
実施例８：化合物３の合成
化合物３の合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３カルボン酸 スクシニミジルエステル、ビス（トリエチルアンモニウム塩）（５０ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．０ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（２８μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで一晩撹拌した。Ｈ２Ｏ（１．０ｍＬ）を溶液に添加し、溶液を更に数時間撹拌した。溶液を真空濃縮し、生成物（３９ｍｇ、９９％）を得た。ＴＬＣ（８：２，ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ）Ｒｆ＝０．６６、ＥＳＩ ｍ／ｚ ９６３（Ｍ＋、Ｃ４０Ｈ３４Ｆ２Ｎ３Ｏ１１Ｓ６、９６３必要）。
実施例９：シュタウディンガーライゲーション用の、トリアリールホスフィン−ＴＡＭＲＡ色素の合成
トリアリールホスフィン−ＴＡＭＲＡ色素の合成を、下記の反応式に示す。
Figure 2009528988
酸溶液１（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００、２８７、２００７−２０１０）（８０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）／ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸（ＥＤＣＩ、７５ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、５ｍｇ）を添加した。溶液をＲＴで撹拌した。２．５ｈ後、アミン２（５０μＬ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を一晩撹拌した。溶液をＣＨＣｌ３（１５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（５ｍＬ）との間に分離させた。有機層を切り離し、水性層をＣＨＣｌ３（１５ｍＬ）によって再度抽出した。複合有機層を一度Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（５ｍＬ）で洗浄した。有機層を、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、デカントし、濃縮した。粗製の油状物を、クロマトグラフィー（シリカ、２％のＭｅＯＨ、ＣＨＣｌ３）で精製し、澄んだ黄色の油状物として生成物（９９ｍｇ、７１％）を得た。
溶液３（１０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）／ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、０．５ｍＬ）を添加し、溶液をＲＴで撹拌した。３０分後に溶液を濃縮し、トルエン（２×２ｍＬ）から再度蒸発させた。残余物（４、０．０１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２ｍＬ）中に溶解させ、Ｎ−エチルジイソプロピルａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ、１２ｕＬ、０．７２ｍｍｏｌ）及び５−カルボキシテトラメチルローダミン スクシニミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ、９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで２．５時間撹拌し、濃縮し、、シリカゲル（調製済プレート、ＣＨ３ＣＮの２０％のＨ２Ｏ）で精製し、生成物（７．４ｍｇ、４８％）を得た。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮの２０％のＨ２Ｏ）Ｒｆ＝０．２３、ＥＳＩ ｍ／ｚ ５２９（Ｍ＋、Ｃ２４Ｈ４０Ｎ４Ｏ７Ｓ、５２９必要）。
実施例１０：シュタウディンガーライゲーション用の、トリアリールホスフィン−ビオチンの合成
トリアリールホスフィン−ビオチンの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
溶液３（５．３ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）／ＣＨ２Ｃｌ２（１．２ｍＬ）に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、０．５ｍＬ）を添加し、溶液をＲＴで撹拌した。２ｈ後、溶液を濃縮し、トルエン（２×２ｍＬ）から再度蒸発させた。残余物（４、０．０１０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．１ｍＬ）に溶解させ、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ、３μＬ、０．０２ｍｍｏｌ）、及びＥＺ−結合ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（７ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を１時間ＲＴで撹拌し、飽和ＮＨ４＋Ｃｌ−でクエンチし、ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１ｍＬ）との間に分離させた。ＵＶスポットがＴＬＣにより観察されなくなるまで、水性層をＣＨＣｌ３（１抽出あたり１０ｍＬ）で繰り返し抽出した。複合有機層を濃縮し、シリカゲル（調製済プレート、７：１＝ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ）で精製し、生成物（２．２ｍｇ、２５％）を得た。ＴＬＣ（７：１＝ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、３回）Ｒｆ＝０．５０、ＥＳＩ ｍ／ｚ ９０９（Ｍ ＋ Ｈ＋、Ｃ４６Ｈ６３Ｎ５Ｏ１０ＰＳ、９０９必要）。
実施例１１：代謝的標識及び糖タンパク質サブクラスの「クリック」検出
ジャーカット細胞を、４０μＭ Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ又はＡｃ４ＧａｌＮＡｚで３日（Ａ）、又は２５０μＭ Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚで一晩（Ｂ）処理した。回収された細胞を５０ｍＭのトリスバッファー（プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を有する、ｐＨ８．０）中で超音波破壊し、溶解物を高速遠心沈降（１００Ｋ×ｇ）に供した。ＭａｎＮ Ａｚ−及びＧａｌＮＡｚ−処理した細胞からの膜ペレットタンパク質、およびＧｌｃＮＡｃ−処理細胞からの上澄の細胞溶解物をクロロホルム／メタノールにより沈殿させ、界面活性剤で溶解させ、１ｍＭのＣｕＳＯ４及び５ｍＭのアスコルビン酸（１）の存在下で、蛍光アルキンプローブで標識した。標識され、沈殿させたタンパク質１０μｇを、１−Ｄ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で電気泳動に供した。５３２ｎｍの励起を使用し、Ｆｕｊｉ ＦＬＡ−３０００スキャナ（Ｆｕｊｉ）によりイメージングした。次にゲルをＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により後染色し、４７３ｎｍで励起してイメージングした。対照のレーンは、未処理細胞（但し蛍光プローブによる処理）の抽出液を表す。図２を参照。
実施例１２：二次元ゲルによるＡｃ４ＧｌｃＮＡｚ処理させた可溶性のＪｕｒｋａｔ細胞タンパク質の分離
ジャーカット細胞を、２５０μＭ Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚと共に一晩培養した。可溶性の溶解物タンパク質は、超音波処理及び超遠心分離を用いた上記として調製されて、蛍光アルキンプローブを有する１時間標識された。標識されたタンパク質４０μｇを沈殿させ、７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、６５ｍＭのＤＴＴ、２％のＣＨＡＰＳ、１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１０、１％のｐＨ３〜１０の担体のアンホライトで再度溶解させ、ｐＨ３〜１０のＩＥＦ条片で第１のディメンション、及びＭＯＰＳバッファーを有する４−１２％のＢｉｓ−トリスゲルで第２のディメンションで分離させた。図３を参照。
実施例１３：４０及び５０ｋＤアジド標識されたモデルタンパク質のゲル内検出
１つのＮ末アジドを有する４０及び５０ｋＤモデルタンパク質それぞれ２５ｐｍｏｌを、ジャーカット細胞溶解物１００μｇに取り込ませた（上方パネル）場合と、そうでない場合（下方パネル）を示す。タンパク質を蛍光アルキンプローブで標識し、示すように連続希釈し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％ゲルで電気泳動させた。５３２ｎｍの励起を行い、ＦＬＡ−３０００スキャナでイメージを得た（左パネル）。ゲルは更に、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙステインで染色し、４７３ｎｍで励起し、イメージングした（右パネル）。標識されたタンパク質の検出感度は１０フェムトモル未満であった。図４を参照。
実施例１４：４０及び５０ｋｄのアジド標識モデルタンパク質の標識効率は、複合タンパク質抽出液において不変であった
アジド標識された１００ｎｇ（２５ｐｍｏｌ）若しくは１０ｎｇ（２．５ｐｍｏｌ）の各々４０Ｋｄ及び５０Ｋｄタンパク質を、１００、５０、２５、又は０μｇ対照Ｊｕｒｋａｔ溶解物（左パネル）のバックグラウンドにおいて、蛍光アルキンプローブで標識した（標識の後、１００μｇの対照の溶解物を「０溶解物」に添加し、沈殿による標識タンパク質の回収を促進した）。ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ全タンパク質染色によりゲルを後染色した。図５を参照。
実施例１５：細胞表面の選択的分析 対 全糖タンパク質サブクラスのゲル電気泳動
ヒーラ細胞に、４８時間、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＡｃ４ＭａｎＮＡｚ糖をフィードした。細胞表面糖タンパク質分析では、生細胞の表面を色素−アルキンで標識し、溶解させ、精製タンパク質をゲル電気泳動（レーン２及び５、説明を参照）により分析した。全な糖タンパク質サブクラス分析では、細胞を溶解させ、精製タンパク質を溶液中で標識し、ゲル電気泳動（レーン３及び６）した。対照の細胞（フィードなし）をゲルのレーン１及び４に示す。タンパク質２０μｇをゲルレーンにロードした。レーン２のＧａｌＮＡｚ組み込まれたタンパク質は、細胞表面にＯ結合した糖タンパク質のみを有し、一方、代謝的に糖タンパク質で標識した全ＧａｌＮＡｚをレーン３に示す。これらのタンパク質は、細胞表面Ｏ結合した糖タンパク質、ゴルジ体及び輸送小嚢に位置する細胞内ＧａｌＮＡｚ標識タンパク質、及びＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質（ＧａｌＮＡｚはＯ−ＧｌｃＮＡｃ生合成経路に取り込まれた）を示す。レーン５は細胞表面シアル酸含有糖タンパク質のＭａｎＮＡｚ標識を表すが、レーン６は細胞表面シアル酸含有糖タンパク質及び細胞内シアル酸含有糖タンパク質の標識がゴルジ体及び輸送小嚢に位置することを表す。
実施例１６：生存する動物における糖タンパク質サブクラスの代謝的標識、及びゲル中での標識された糖タンパク質のゲル蛍光検出
Ｏ結合及びシアル酸含有糖タンパク質の代謝的標識は、活性化Ｈｅｒ２／Ｎｅｕトランスジェニックマウスに、７日にわたり、非天然のテトラアセチル化アジド修飾糖前駆体、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＡｃ４ＭａｎＮＡｚの投与（７０％のＤＭＳＯ中、３００ｍｇ／ｋｇ）により実施した。７日後にマウスを安楽死させ、様々な器官組織を切除し、溶解させ、タンパク質抽出物を、２ｍＭのＣｕＳＯ４、２０ｍＭのアスコルビン酸塩、５ｍＭのＢＣＳ及び２５％のプロピレングリコールを有するトリスバッファー（ｐＨ８．０）中で、１０ｍＭの蛍光ＴＡＭＲＡアルキンと反応させた。標識された糖タンパク質を沈殿させ、１−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー中に溶解させ、ゲル電気泳動により分析し、蛍光レーザーリーダーで検出した。スキャンの後、ゲルをＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙは全タンパク質染色し、全タンパク質を観察した。下記の上パネルは、心筋（Ｈ）、肝臓（Ｌ）又は腎臓（Ｋ）に由来する、標識された組織タンパク質の１−Ｄゲルの結果を示す。下パネルは、同じゲルの、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙがタンパク質染色による後染色の結果を示す。
実施例１７：生存中の、固定された細胞の蛍光「クリック」標識：細胞表面 対 内部糖タンパク質の選択的標識
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、３０μＭ Ａｃ４ＨｅｘＮＡｚ糖、ＭａｎＮＡｚ、ＧａｌＮＡｚ又はＧｌｃＮＡｚで３日間フィードした。Ａ．生存Ｊｕｒｋａｔ細胞を、トリスバッファー（ｐＨ８．０）、２ｍＭのＣｕＳＯ４、２０ｍＭのアスコルビン酸塩及び５ｍＭのＢＣＳの存在下で３０分間、１０ｍＭのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８アルキンプローブで標識した。細胞を、更に１５分間４％のホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、フローサイトメトリにより分析した。Ｂ．細胞を固定して、透過可能にし、Ａと同じ条件下での標識の前に、フローサイトメトリで分析した。これらの結果から、選択的に細胞表面糖タンパク質のみ、又は細胞表層及び細胞内糖タンパク質のみを染色する能力を有することが示された。細胞透過化処理の後においてのみ、顕著なＧｌｃＮＡｚ染色が見られた。修飾が細胞の内部に特異的であったためであると考えられる。
実施例１８：α−クリスタリン Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの酵素的標識及び標識
α−クリスタリンＯ−ＧｌｃＮＡｃを、修飾されたｂ−ＧａｌＴ１酵素を使用して酵素的にアジド（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ）標識した。その後、上記のようにタンパク質を蛍光アルキンプローブと反応させた。タンパク質を、示される希釈度で、１−Ｄ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４−１２％ゲルで電気泳動させた（２−１０％のα−クリスタリンのみを、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾し、それゆえ、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ部分の検出感度は、中程度−低度のフェムトモル範囲（１０〜４５ｆｍｏｌ）であった）。図６を参照。
実施例１９：ａ−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃモノクローナル抗体ＣＴＤ１１０．６と、ＧａｌＴ１酵素標識との比較
Ａにおいては、α−クリスタリンを、修飾ＧａｌＴ１酵素で酵素学的に標識し、ビオチン−アルキンプローブとその後反応させた。タンパク質を、示される希釈度で、１−Ｄ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％ ＭＥＳゲルで電気泳動させ、ＰＶＤＦ膜上へブロットした。次にＰＶＤＦ膜をストレプトアビジン−ＨＲＰとインキュベートし、タンパク質をＥＣＬ Ｐｌｕｓ（商標）（ＧＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して検出した。レーン２（ＮＥ）は、８ｐｍｏＬの酵素無添加の対照を示す（Ａにおいて、ウエスタンブロットによるＯ−ＧｌｃＮＡｃの検出感度は、低度のフェムトモル範囲（３〜１０ｆｍｏｌ）である）。Ｂにおいては、無処理のα−クリスタリンを１−Ｄゲルで電気泳動させ、上記の通りブロットした。ＰＶＤＦ膜を、製造者の指示に従い、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃウエスタンブロット検出キッド（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を使用して処理した。キットでは、ＣＴＤ１１０．６α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃモノクローナル抗体を利用した。レーン２は、キットに添付の陽性対照（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−修飾ＢＳＡ）５ｎｇを含むレーンである。抗体検出システムを使用しても、α−クリスタリンは検出されなかった。図７参照。
実施例２０：同じ二次元ゲルにおける、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃタンパク質、リンタンパク質及び全タンパク質の多重検出
ＧｌｃＮＡｚでフィードしたジャーカット細胞から可溶性画分を抽出し、２時間にわたり、ＵＶ励起性のアルキン色素で標識した。上記のように、クロロホルム／メタノール沈殿させたタンパク質を二次元ゲルで電気泳動させた。ゲルを水でリンスし、Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ（商標）（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、ＵＶ照射及び６００／ｂｐ放出によりイメージングした。次にゲルを、Ｐｒｏ−Ｑ（登録商標）ダイアモンドリンタンパク質染色により染色し、ＦＬＡ−３０００レーザーイメージャーを用いて、５３２ｎｍの励起／５８０ ＬＰ放出によりイメージングし、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ全タンパク質染色により染色し、製造者の指示に従い、４７３ｎｍの励起及び５８０ｎｍのロングパス放出によって再度イメージングした。図８を参照。
実施例２１：Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ及びコフィリンの、多重ウエスタンブロット検出
実施例１２のジャーカット細胞の可溶性タンパク質２５μｇを上記のとおり二次元ゲル電気泳動に供し、更にＰＶＤＦ膜にブロットした。ＰＶＤＦ膜は、α−コフィリンポリクローナル抗体とインキュベートし、更にＧＡＲ−ＨＲＰ二次抗体を用い、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（商標）検出（ＧＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって検出した。イメージング後、ブロット膜を、ストレプトアビジンＡＰとインキュベートし、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃタンパク質を、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ（登録商標）化学発光検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して検出した。図９を参照。
実施例２２：対照及び阻害剤処理された培養細胞抽出液における、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のディファレンシャル検出
ジャーカット細胞をＡｃ４ＧｌｃＮＡｚで一晩培養し、ＰＵＧＮＡｃ処理の有無に関して解析した。ＰＵＧＮＡｃは、一般的に用いられるＯ−ＧｌｃＮＡｃアーゼの阻害剤である。可溶性のＪｕｒｋａｔ溶解物を、蛍光アルキンで標識した。レーン１）回収前の３時間、５０μＭ ＰＵＧＮＡｃ及び４ｍＭのグルコサミンで処理した細胞、レーン２）無処理、レーン３から５）２５０μＭ Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚで一晩培養した細胞、レーン６から８）２５０μＭ Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚで一晩培養し、更に回収前の３時間、５０μＭ ＰＵＧＮＡｃ及び更に２５０μＭ Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚで処理した細胞、ＰＵＧＮＡｃで処理したタンパク質（レーン６−８）は、未処理の対照（レーン３−５）よりも、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ染色の顕著な増加を示した。図１０を参照。
実施例２３：糖タンパク質のゲルにおけるライゲーション反応
ゲル中のライゲーション反応に用いる蛍光アルキン化合物を図１２（ＡからＤ）に示す。更に、２つの強力な蛍光発生アルキンをＥ及びＦに示す。ＴＡＭＲＡ−アルキン化合物（上の左側フレームに示す）をゲル中染色試験に用い、反応性アジドスクシンイミジルエステルを使用してインビトロで、又はフィード細胞にアジド修飾した糖をフィードしてインビボで、アジド基をタンパク質に組み込ませた。
実施例２４：ゲル中検出、又はウエスタンブロット検出における、アジド−アルキン反応条件
タンパク質を、５０ｍＭのトリス−ＨＣ１（ｐＨ８．０）、１．０％のＳＤＳ中に溶解させた。最終的な体積を２００ｕＬとした。
Figure 2009528988
全ての成分を混合し、最後にアスコルビン酸塩を加える。静かにボルテックスする。
１００ｍＭのＢＣＳを１０ｕＬ加える（ＣｕＩが存在すると橙黄色になる）。
静かにボルテックスする。
アルゴンとともに重層する。
室温で１時間、ローテータで混合する。
反応後、以下のプロトコルを用いて、タンパク質をクロロホルム／メタノール沈殿させる。
２００ｕＬ 反応
６００ｕＬ ＭｅＯＨ ２０秒間ボルテックス（タンパク質量が少ない場合３０分間凍結させる）
２００ｕＬ クロロホルム ２０秒間ボルテックス
４５０ｕＬ Ｈ２Ｏ ２０秒間ボルテックス
１８Ｋ×ｇで５分間回転
上相を除去してＭｅＯＨを４５０ｕＬ添加。２０秒間ボルテックス
１８Ｋ×ｇで５分間回転
上清を除去して廃棄
６００ｕＬ ＭｅＯＨのみを添加、ボルテックス、短く超音波処理してペレットを分散させる
１８Ｋ×ｇで５分間回転

１００ｍＭのアスコルビン酸Ｎａ（Ｍｗ１９８）希釈溶液
アスコルビン酸Ｎａ、無水、５ｍｇ
Ｈ２Ｏ ２５０ｕＬ
細胞可溶化物は、アジド修飾された糖をフィードされたＪｕｒｋａｔ細胞から調製した。図１３は、提供されるプロトコルを使用してＴＡＭＲＡ−アルキン化合物で標識したタンパク質の電気泳動の結果を示す。ゲルの左側上のレーン２、３及び４はアジド修飾された糖を組み込んだ細胞抜粋を表し、レーン１は対照（非アジド砂糖を細胞にフィード）である。右側では、対照のアジド標識タンパク質（オボアルブミン及びミオグロビン）（＋）、又は非標識の対照（−）を、濃度を変化させてアプライした際の結果を示す。結果は、アジド修飾タンパク質の非常に効果的な及び選択的なゲルの検出を示す。
実施例２５
アジドオボアルブミン及びアジド−ミオグロビンをそれぞれ２．５μｇずつ用い、８０μｇの非標識Ｊｕｒｋａｔ溶解物にスパイクした。次に溶解物を２時間にわたり、ＴＡＭＲＡアルキンで標識した。反応液の組成は、５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８）、２５％のプロピレングリコール、１ｍＭ ＣｕＳＯ４、５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、２０μＭ ＴＡＭＲＡアルキンとした。キレート剤（１０ｍＭのＴＰＥＮ、ＥＤＴＡ、バソクプロイン二スルホン酸（ＢＣＳ）又はネオクプロインのいずれか）の有無において、反応を実施した。対照反応を、ＣｕＳＯ４なしで実施した。標識後、サンプルを沈殿させ、各サンプル約３０μｇを、７ｍＭの尿素／２ｍＭのチオ尿素／６５ｍＭのＤＴＴ／２％のＣＨＡＰＳ／中に再度溶解させ、二次元ゲル（ｐＨ４〜７、ＩＥＦ条片、ＭＯＰＳバッファーを含む４〜１２％のビストリスゲル）で分析した。ＴＡＭＲＡシグナルを、Ｆｕｊｉ ＦＬＡ３０００を使用して、５３２ｎｍの励起、５８０のロングパス放出によりイメージングし、更にゲルをＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ全タンパク質ゲル染色で後染色した（図１４Ａ）。その結果、キレート剤の添加により、タンパク質分離の解像度が改善され、特にバソクプロイン二スルホン酸（ＢＣＳ）、Ｃｕ（Ｉ）キレート剤では最高の結果が得られた。全タンパク質染色（図１４Ｂ）を参照。
第２の実験を、同様のサンプル及びクリック標識条件で実施した。但し、キレート剤処理において、反応の最初に５ｍＭのＴＰＥＮ、ＢＣＳ又はネオクプロインの添加段階を追加したことを除く。標識後、サンプルを沈殿させ、ＬＤＳバッファー＋５ｍＭ ＴＣＥＰ中に再度溶解させ、連続２倍希釈系列を調製した。希釈液を、ＭＯＰＳランニングバッファーを用いて４〜１２％のビストリスゲル上にロードした（レーン１は各々２５０ｎｇのオボアルブミン及びミオグロビン）。図１５Ａは、キレート剤の添加により、感度を損なわせることなく、ＴＡＭＲＡシグナルのイメージのバックグラウンドが減少することを示す。図１５Ｂは、Ｓｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙ全タンパク質ゲル染色による後染色において、キレート剤を有するサンプルにおいて、バンド解像度が非常に良好であることを示す。
キレート剤処理において、７ｍＭ、５ｍＭ又は２ｍＭのＢＣＳ、又は７ｍＭ、５ｍＭ又は２ｍＭのネオクプロインを添加したことを除き、同じクリック標識条件を用いてキレート剤の効果を試験した。図１６の星印でマークしたレーンは、アスコルビン酸ナトリウムを添加する前にＣｕＳＯ４及びＢＣＳを反応液に添加し、ボルテックスした場合の反応の結果を示す。他の全ての反応において、ＢＣＳを添加する前にＣｕＳＯ４及びアスコルビン酸ナトリウムを添加し、ボルテックスした。ゲルを解析した結果、キレート剤を添加する前にアスコルビン酸ナトリウム及びＣｕＳＯ４を反応チューブに添加し、混合することが不可欠であることが示された。アスコルビン酸ナトリウムを添加する前にキレート剤及びＣｕＳＯ４を添加し、ボルテックスした場合、アジド−アルキン標識は進行せず、キレート剤がＣｕ（ＩＩ）からＣｕ（Ｉ）への還元を阻害することを示唆する。
実施例２６：クリックケミストリーを用いた抗体の酵素的標識
ヤギＩｇＧ抗体を還元し、アルキル化し、更に２つの別々のアリコートに分け、エンドＨｆ酵素を使用して脱グリコシル化した。脱グリコシル化された抗体（２つの別々の調製物）を更に１５０μＬ反応液中で、３３ｎｇ／μＬのＧａｌＴ１（Ｙ２８９Ｌ）酵素及び５００μＭのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ（０．５μｇ／μＬヤギ抗体）を使用して、ＧａｌＮＡｚ標識した。反応液を４℃で一晩インキュベートした。４〜５００ｎｇのヤギ抗体（図示するゲルを参照、ＧａｌＮＡｚを含まない対照か、又はアジド標識）を、４〜１２％のＢｉｓトリスゲルの各レーンにロードした。ＭＥＳバッファーを使用して、２００ｖで〜５０分間、電気泳動を実施した。ゲルをＴＡＭＲＡ−アルキン染色し、５３２ｎｍ（励起）及び５８０ｎｍの放出により、Ｆｕｊｉ ｉｍａｇｅｒを用いてイメージングした。一晩用のプロトコルを使用して、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙによって、ゲルを後染色した。図１７を参照。
実施例２７：Ｃｙ（商標）５．５アジドの合成
Figure 2009528988
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジド トリフルオロ酢酸塩（反応式１を参照、０．０３４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）及びＤＩＥＡ（６．０μＬ、０．０３４ｍｍｏｌ）中の溶液に、Ｃｙ（商標）５．５ スクシニミジルエステル（５ｍｇ、３．４ｎｍｏｌ）を添加した。ＲＴで１０分間溶液を撹拌した後、反応溶液を真空濃縮した。粗製の油状物をＨＰＬＣで精製した。
実施例２８：Ｃｙ（商標）３アジドの合成
Figure 2009528988
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジド トリフルオロ酢酸塩（反応式１を参照、０．０５２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）及びＤＩＥＡ（９．２μＬ、０．０５２ｍｍｏｌ）中の溶液に、Ｃｙ（商標）３ スクシニミジルエステル（５．０ｍｇ、５．２ｎｍｏｌ）を添加した。ＲＴで１０分間溶液を撹拌した後、反応溶液を真空濃縮した。粗製の油状物をＨＰＬＣで精製した。
実施例２９：Ｃｙ（商標）５．５アルキンの合成
Figure 2009528988
Ｃｙ（商標）５．５ スクシニミジルエステル（ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ、５．０ｍｇ、３．７ｎｍｏｌ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（２．５μＬ、０．０３７ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（０．２ｍＬ）を添加した。溶液を３０分ＲＴで撹拌し、更に真空濃縮した。粗製の油状物をＨＰＬＣで精製した。
実施例３０：Ｃｙ（商標）３ アルキンの合成
Figure 2009528988
Ｃｙ（商標）３ スクシニミジルエステル（ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ、５．０ｍｇ、５．７ｎｍｏｌ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（３．９μＬ、０．０５７ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（０．２ｍＬ）を添加した。溶液を３０分ＲＴで撹拌し、更に真空濃縮した。粗製の油状物をＨＰＬＣで精製した。
実施例３１：アジドファルネシルアルコールによる代謝的標識、及びＣｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＴＡＭＲＡ検出試薬による検出
ＣＯＳ７及びＪｕｒｋａｔ細胞にロバスタチン及びアジドファルネシルアルコール（ＦＮ３−ＯＨ）をフィードし、３６又は７２時間、内因性イソプレニル化を抑制した。投与量は、２５μＭロバスタチン及び２０μＭ ＦＮ３−ＯＨ、又は５０μＭロバスタチン及び５０μＭ ＦＮ３−ＯＨとした。培地は、７２時間培養、１セットのサンプルごとに交換した（ロバスタチンを含まず、ＦＮ３−ＯＨを含む）。溶解物は、ＰＢＳで３回細胞を洗浄し、１％のＳＤＳ／１００ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８）＋プロテアーゼ阻害剤（１００ｃｍの培養皿につき溶解緩衝液の１ｍＬ）で溶解させて調製した。溶解物を超音波破砕し、７０℃で１０分加熱し、２００μＬアリコートを沈殿させ、凍結させた。沈殿ペレットを、１％のＳＤＳ／１００ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８）５０μＬによって再度可溶化し、ＴＡＭＲＡ Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）検出キット（Ｃ３３３７０）で標識した。２０μｇを、ＭＯＰＳバッファーを使用して４−１２％のＢＩＳ−ＴＲＩＳゲルで解析した。５３２ｎｍのレーザーを使用して、ＢｉｏＲａｄＦＸ イメージャーでゲルをイメージングし、５５５ｎｍのロングパス発光フィルタを通過させた。ゲルをＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色し、４８８ｎｍのレーザー及び５５５ｎｍのロングパス発光フィルタを使用してイメージングした。
実施例３２：アジド脂肪酸のアナログによる代謝的標識、及び「クリック」試薬による検出
アジド標識された脂肪酸化合物（例えば下で示されるパルミチン酸塩化合物）又はアルキン標識された脂肪酸化合物を培養細胞に添加し、必要な時間、化合物を細胞に取り込ませ、脂肪酸修飾された高分子（タンパク質を含む）に組み込ませた。細胞へのアナログの侵入を容易にする化合物を用いてもよい。標識の後、細胞を溶解させ、細胞アジド若しくはアルキン修飾タンパク質を、銅（Ｉ）又は銅（ＩＩ）還元剤の存在下では銅（ＩＩ）、銅（Ｉ）キレート剤（例えばＢＣＳ）及び最適ｐＨ条件を維持する適当なバッファーの存在下で、適切なクリックパートナープローブを使用して標識した。
Figure 2009528988
実施例３３：アジド脂肪酸のアナログによる代謝的標識及び「クリック」試薬による検出
アジド標識された脂肪酸化合物（例えば下で示されるパルミチン酸塩化合物）又はアルキン標識された脂肪酸化合物を、インビトロ、又はインビトロ翻訳条件下で、細胞抽出液に添加した。脂肪アシル化されたタンパク質はアジド又はアルキン標識することにより検出し、銅（Ｉ）又は銅（ＩＩ）還元剤の存在下では銅（ＩＩ）、銅の（Ｉ）キレート薬（例えばＢＣＳ）及び最適ｐＨ条件を維持する適当なバッファーの存在下で、適切なクリックパートナープローブを使用しているタンパク質を修飾した。
Figure 2009528988
実施例３４：パルミチン酸アジド合成
パルミチン酸酸アジドの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
１６−ブロモヘキサデカン酸（０．５０ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中の溶液に、アジ化ナトリウム（０．１４ｇ、２．２４ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を一晩ＲＴで撹拌した。溶液を更にアイスバスにおいて冷却し、水（１０ｍＬ）でクエンチした。５分間撹拌した後、アイスバスを除去し、溶液を単独でＲＴに加温した。得られる溶液を更にジエチルエーテル（２×６０ｍＬ）で抽出し、有機層を結合し、飽和ＮａＣ１（３×１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させた。溶液をデカントし、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（１０−２５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１％の酢酸を含む））で精製し、澄んだ無色の油状物（０．３３ｇ、７５％）を得た。ＴＬＣ（２５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）Ｒｆ＝０．５４（かすかなＵＶ）褐色のスポット、ＰＰｈ３／トルエンで処理する場合、更にニンヒドリン染色。ＩＲ（ＫＢｒペレット）２１２６．９ ｃｍ−１。
実施例３５：スクシニミジルエステルアジド合成
スクシニミジルエステルアジドの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
６−（Ｂｏｃ−アミノ）−ヘキサニル−１−ｐ−トルエンスルホネート
Figure 2009528988
６−（Ｂｏｃ−アミノ）−１−ヘキサノール（３．０ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）中の溶液に、ＴＥＡ（３．８ｍＬ、２７．６ｍｍｏｌ）、塩化ｐ−トルエンｓｕｌｆｏｎｙｌ（３．９ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を一晩ＲＴで撹拌し、ＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（４×５０ｍＬ）で洗浄し、塩水（１×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させた。溶液をデカントし、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（６．０×４１ｃｍ、２０−７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、白色固体（３．５ｇ、６９％）として生成物を得た。ＴＬＣ（３５％のＥｔＯＡＣ／ヘキサン）Ｒｆ＝０．７２、ＵＶ活性化。
６−（Ｂｏｃ−アミノ）−ヘキサニル−１−アジド
Figure 2009528988
６−（Ｂｏｃ−アミノ）−ヘキサニル−１−ｐ−トルエンスルホネート（３．２ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２１ｍＬ）中の溶液に、アジ化ナトリウム（１．１２ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を一晩９５℃で還流した。ＲＴに冷却した後、溶液をＥｔ２Ｏ（１６０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）によって洗浄した。水性層はＥｔ２Ｏ（１００ｍＬ）によって二度目に抽出され、複合有機相はＮａ２ＳＯ４を通じて乾燥させた。デカント及び濃縮後、粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィー（６×２６ｃｍ、２５−３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、澄んだ、無色の油状物（２．０ｇ、９７％）として生成物を得た。ＴＬＣ、（３５％のＥｔＯＡＣ／ヘキサン）Ｒｆ＝０．７４、ニンヒドリン染色で褐色のスポット。
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩
Figure 2009528988
６−（Ｂｏｃ−アミノ）−ヘキサニル−１−アジド（０．２ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（１．０ｍＬ）を添加した。溶液を２時間ＲＴで撹拌し、乾燥蒸発させ、トルエンから二回再度蒸発させた。生成物の６−アミノ−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（０．８３ｍｍｏｌ）を更なる精製なしで直接用いた。
（Ｎ−６−アジド−ヘキサニル）グルタルアミド
Figure 2009528988
６−アミノ−ヘキサニル−１−アジド（０．８３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．０ｍＬ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２９ｍＬ、１．６５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を１０分間のＲＴで撹拌し、グルタル酸無水物（０．４７ｇ、４．１３ｍｍｏｌ）を添加した。薄い黄色の溶液を一晩ＲＴで撹拌した。反応溶液をＣＨＣｌ３（３０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で希釈し、１％のＨＣ１でｐＨ１に酸性化し、有機層を除去した。水性層を、ＣＨＣｌ３（２×３０ｍＬ）で更に２回抽出した。複合有機層を塩水（２×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させた。溶液をデカントし、濃縮した。粗製の油状物を、シリカゲルクロマトグラフィー（１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３、０．１％のＡｃＯＨを含む）で精製し、澄んだ無色の油状物（０．１６ｇ、７５％）として生成物を得た。１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３と共にカラムにアプライした。ＴＬＣ（０．１％のＡｃＯＨを有する１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）Ｒｆ＝０．４１、ｐ−アニスアルデヒド染色でピンク色（ＵＶ活性なし）。
（Ｎ−６−アジド−ヘキサニル）グルタルアミド、スクシニミジルエステル
Figure 2009528988
（Ｎ−６−アジド−ヘキサニル）グルタルアミド（７５ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４．０ｍＬ）中の溶液に、ピリジン（１１０μＬ、１．３６ｍｍｏｌ）、更にスクシニミジル トリフルオロ酢酸（２００ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を添加した。澄んだ無色の溶液を４時間ＲＴで撹拌した。反応溶液をＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）で希釈し、順次１％のＡｃＯＨ（２×５ｍＬ）Ｈ２Ｏ（２×５ｍＬ）及び塩水（１×５ｍＬ）で洗浄した。粗製の溶液をＮａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、デカントし、濃縮し、澄んだ無色の油状物（０．１０ｇ、９９％）として生成物を得た。ＴＬＣ（１：１、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）Ｒｆ＝０．６４、ニンヒドリンで橙黄色、ＵＶ活性化。
実施例３６：スクシニミジルエステルアルキンの合成
スクシニミジルエステルアルキンの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
１０−ウンデシノン酸性のスクシニミジルエステル
Figure 2009528988
１０−ウンデシノン酸（０．４０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）中溶液に、Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（０．９９ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで２分間撹拌した後、１％のＡｃＯＨによって、反応をクエンチし、ＣＨＣｌ３（１５０ｍＬ）で希釈した。有機溶液を更に１％のＡｃＯＨ（１０ｍＬ）により抽出し、Ｈ２Ｏ（２×４０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させた。溶液を更にデカントし、濃縮した。定量的収率を算出し、材料を次の段階に直接ロードした。ＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）Ｒｆ＝０．９０、ＵＶ活性化。
ｔｅｒｔ−ブチルアルキン
Figure 2009528988
１０−ウンデシノン酸のスクシニミジルエステル（０．６１ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（８ｍＬ）中の溶液に、ＲＴでアミノ−ｄＰＥＧ（商標）２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．４６ｇ、１．９７ｍｍｏｌ、Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）のＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）中溶液を添加した。２時間後に、溶液をＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）により抽出した。水性層を、ＣＨＣｌ３（２×５０ｍＬ）によって再度抽出した。複合有機相を、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、デカントし、濃縮した。粗製の油状物を、シリカゲルクロマトグラフィー（２．５％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製し、澄んだ淡黄色の油状物（０．４８ｇ、５５％）として生成物を得た。ＴＬＣ（９：１ ＣＨ３ＣＮｉＨ２Ｏ）Ｒｆ＝０．８１。
スクシニミジルエステルアルキン
Figure 2009528988
ｔｅｒｔ−ブチルアルキン（０．４８ｇ、１．２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（２．０ｍＬ）を添加した。溶液を１ｈ撹拌し、更に濃縮し、トルエン（２×１ｍＬ）から再度蒸発させた。得られる茶色の残余物を、ＣＨ３ＣＮ（５．０ｍＬ）中に溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８４ｍＬ４．８３ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで２分間撹拌し、次にＯ−（Ｎ−スクシニミジル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（０．４７ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を添加した。１５分後にｐＨ４〜５で反応をクエンチし、１％のＡｃＯＨによって酸性化した。溶液をＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）により抽出した。複合有機相は、Ｈ２Ｏ（１×１０ｍＬ）によって再抽出し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、デカントし、濃縮し、黄褐色の固体（０．４６ｇ、８７％）を得た。粗製物質は試験の結果充分な純度を有し、更なる精製を行わなかった。ＴＬＣ（８：２ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）Ｒｆ＝０．７９。
実施例３７：インドアセトアミドアジドの合成
インドアセトアミドアジドの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
６−（ヨードアセトアミド）−アミノヘキサニル−１−アジド
Figure 2009528988
６−アミノ−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（３５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）中の溶液に、暗所で、ヨード酢無水物（０．１０ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後に、反応は止められた、溶液をＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１０ｍＬ）との間に分離させた。有機層を除去し、水性層をＣＨＣｌ３（１×１０ｍＬ）によって再抽出した。複合有機相を飽和ＮａＣ１（１×５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、デカントし、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（０．１％のＡｃＯＨを含む２％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製し、黄色の油状物として生成物（３５ｍｇ、８１％）を得た。ＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）Ｒｆ＝０．７５。
実施例３８：インドアセトアミドアルキン合成
インドアセトアミドアルキンの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
Ｎ−（ヨードアセトアミド）−プロパルギルアミン
ＤＭＦのプロパルギルアミノ溶液に、暗所でヨード酢無水物を添加した。２時間後に反応を停止させ、溶液をＣＨＣｌ３及びＨ２Ｏとの間に分離させた。有機層を除去し、水性層をＣＨＣｌ３によって再抽出した。複合有機相を飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、デカントし、濃縮した。
実施例３９：マレイミドアルキン合成
マレイミドアルキンの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
プロパルギルアミンマレイミド
プロパルギルアミンと無水マレイン酸を、ＴＥＡの存在下で反応させた後、中間体の酸を７０℃で無水酢酸及びナトリウム酢酸塩の存在下で環化し、所望のプロパルギルアミン マレイミドを得た。
実施例４０：マレイミドアジド合成
マレイミドアジドの合成を、以下の反応式に示す。
Figure 2009528988
Ｎ−（６−アジド−アミノヘキシル）マレイミド
６−アミノ−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩及び無水マレイン酸を、ＴＥＡの存在下で反応させた後、中間体の酸を７０℃で無水酢酸及びナトリウム酢酸塩の存在下で環化し、所望のＮ−（６−アジド−アミノヘキシル）マレイミドを得た。
実施例４１：Ｂａ（ＯＨ）２の触媒によるＲＩＩリンペプチド（ＮＢ Ｂ８８３−９−ＴＮ）のβ−除去後の、チオアセテート−アジド及びアミノアジドの付加
ＲＩＩリンペプチド（ＤＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＳＶＡＡＥ、２１９２．０８Ｄａ）を、リン酸塩の同時β−除去及びチオアセテート−アジド又はアミノアジドを、得られるデヒドロアラニン残基へ付加することによって、アジド標識した。２ｎｍｏｌのペプチド及び３μｍｏｌのアジドタグを、３５℃で２時間、０．１Ｍの水酸化バリウム３０μＬ中でインキュベートした。培養の後、０．５Ｍの硫酸アンモニウム７μＬによってバリウムを沈殿させた。遠心分離後、上澄を氷酢酸３μＬで中和し、更にＶｉｖａｐｕｒｅ ＲＰマイクロフィルタで脱塩した。ペプチドを、９０％のアセトニトリル／０．１％のＴＦＡ溶液１０μＬを用いて溶出し、ポジティブｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎモード（溶離液０．５μＬ、及び６ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸０．５μＬをスポット）で、ＭＡＬＤＩで分析した。これらの条件下では、ペプチドの全ては追加試薬としてのチオアセテート−アジドにより付加生成物に変化するが、変換は追加試薬としてのアミノアジドでは不完全であった。図１８Ａ及び１８Ｂを参照。
（表３）
Figure 2009528988
他の触媒は塩基性ではないが、第三級アミン及びヒンダード第二級アミンを含む除去に用いる場合には更に効果的である。例えば、ホスファゼン化合物、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ＴＥＭＥＤ、トリエタノールアミン２，２，６，６−テラメチルピペリジン、Ｐｒｏｔｏｎ Ｓｐｏｎｇｅ ＤＡＢＣＯ、Ｎ−メチルモルホリン４−ジメチルアミノピリジン、４−ピロリジニルピリジン、Ｄｏｗｅｚ １ ヒドリキシドのようなイオン交換樹脂、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化ベンジルトリエチルアンモニウム又は他の相転移塩基である水酸化カルシウム、水酸化バリウム又は水酸化ガリウム（リン酸基と複合体を形成する）などが挙げられる。
実施例４２：ヌクレオチドアナログを使用したタグリンタンパク質
リンタンパク質は、アルキン又はアジドにタグを有するヌクレオチドを使用し、アジド又はアルキン部分をγリン酸に配置することよって、インビボ又はインビトロで標識できる。例えば、下で示されるヌクレオチドの１つを、プロテインキナーゼ及びキナーゼターゲット分子を含む反応混合物に添加する。タギングの後、当該分子を、計量、視覚化又は富化のため、適切なアルキン又はアジド検出又は親和性試薬と反応させる。１つの反応例において、修飾されたヌクレオチド基質は、タンパク質などの細胞高分子に、直接タグを有するγ−リン酸塩分子を代謝的に取り込ませる、ため培養細胞に添加してもよい。当該方法では、リン酸化の変更を検出するため、薬理学的物質で細胞処理してもよい。有効な培養細胞への化合物の取り込みは、透過性を向上させる機能を有するヌクレオチドを修飾することによって、又は細胞を透過可能にする物質を更に添加することにより強化してもよい。他の反応例において、キナーゼ及び基質の給源として細胞抽出液を使用して、キナーゼ反応液をインビトロで実施してもよい。修飾されたヌクレオチドを反応混合物に添加し、反応混合物を、目的の薬理学的物質の添加の有無においてインキュベートする。インビトロ反応液をヌクレオチドアナログに添加して、外生のキナーゼ又は基質源を細胞抽出液に更に添加してもよい。別の用途では、精製されたキナーゼ及びキナーゼ基質を用いて、細胞抽出液のない状態で、インビトロにおいて当該方法を実施してもよい。記載されている実施例の全てにおいて、反応混合物は、目的の特定のキナーゼのために最適化されたバッファー、キナーゼ源、金属イオン源、グリセロール、ヌクレオチドＡＴＰアナログ及びＡＴＰを含有してもよい。アルキンプローブによる「クリック」検出反応は、銅（Ｉ）又は銅（ＩＩ）還元剤の存在下には銅（ＩＩ）、銅（Ｉ）キレート剤及び最適ｐＨ条件を維持するための適当なバッファーの存在下で実施する。
ＡＴＰ−アルキン
Figure 2009528988
ＡＴＰ−アジド
Figure 2009528988
実施例４３：アジド及びアルキンレポーター分子
Figure 2009528988
５−ＴＡＭＲＡアジド
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（０．１９ｍｍｏｌ、反応式１を参照）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（３３μＬ、０．１９ｍｍｏｌ）中の溶液に、５−カルボキシテトラメチルローダミン（スクシニミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ、５０ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで１０分間溶液を撹拌した後、反応溶液を真空濃縮した。粗製の油状物を、シリカゲルクロマトグラフィー（調製済プレート、９：１ ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ）で精製し、ピンクの固体（４５．６ｍｇ、８７％）として生成物を得た。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２）Ｒｆ＝０．６１、ピンクの蛍光点、ＥＳＩ−ｐｏｓ ｍ／ｚ ５５５ Ｍ＋、Ｃ３１Ｈ３５Ｎ６Ｏ４（５５５必要）。
Figure 2009528988
ＰＥＧ−ビオチンアジド
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジド トリフルオロ酢酸塩（０．１７ｍｍｏｌ、反応式１を参照）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（６０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）中の溶液に、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社製、５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで一晩溶液を撹拌した後、溶液を真空濃縮した。粗製の油状物を、シリカゲルクロマトグラフィー（７：１ ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ）で精製し、濁った白い残余物（１２．３ｍｇ、１２％）として生成物を得た。ＴＬＣ（７：１、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、８：２）Ｒｆ＝０．５４、かすかなＵＶ活性化、ビオチン浸液でピンクに染色、ＥＳＩ−ｐｏｓ ｍ／ｚ ６１６ Ｍ＋、Ｃ２７Ｈ４９Ｎ７Ｏ７Ｓ（６１６必要）。
Figure 2009528988
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）アジド（５−及び６−異性体の混合）
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（０．２０ｍｍｏｌ、反応式１を参照）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（５０μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）中の溶液に、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）カルボン酸、スクシニミジルエステル、塩酸塩（５−及び６−異性体、５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌの混合）を添加した。ＲＴで２時間溶液を撹拌した後、溶液を真空濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液５〜５０％のＣＨ３ＣＮ（６０分以上）／２５ｍＭのＴＥＡＡ（ｐＨ＝４．７）、２０ｍＬ／分の流速）により２１．１ｍｇの生成物（４３％）を得た。ｔＲ＝４３−４７分、ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ：ＡｃＯＨ、８：１：１）Ｒｆ＝０．７４、蛍光黄色スポット、ＥＳＩ−ｐｏｓ ｍ／ｚ ４９９（Ｍ＋Ｈ、Ｃ２７Ｈ２７Ｎ６Ｏ４が、４９９必要）。
Figure 2009528988
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８アジド（５つの異性体）
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジド トリフルオロ酢酸塩（０．４４ｍｍｏｌ、反応式１）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（０．１１ｍＬ、０．８８ｍｍｏｌ）中の溶液に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ５−カルボン酸、２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステル、ビス（トリエチルアンモニウム塩）（２００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで１時間溶液を撹拌した後、溶液を真空濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液０〜６０％のＣＨ３ＣＮ（３０分以上）／２５ｍＭのＴＥＡＡ（ｐＨ＝４．７）、２０ｍＬ／分の流速）により、５８．１ｍｇの生成物（３０％）を得た。ｔＲ＝２３−２７分、ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２）Ｒｆ ＝０．５８（蛍光黄斑）、ＥＳＩ−ｎｅｇ ｍ／ｚ ６５７（Ｍ−、Ｃ２７Ｈ２５Ｎ６Ｏ１０Ｓ２−、６５７必要）。
Figure 2009528988
Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ（登録商標）５４６アジド
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジド トリフルオロ酢酸塩（０．０９３ｍｍｏｌ、反応式１）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（３２μＬ、０．１９ｍｍｏｌ）中の溶液に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６カルボン酸（スクシニミジルエステル）（５０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで２時間溶液を撹拌した後、溶液を真空濃縮した。
ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液１０〜６０％のＣＨ３ＣＮ（６０分以上）／２５ｍＭのＴＥＡＡ（ｐＨ＝４．７）、２０ｍＬ／分の流速）により、２７．２ｍｇの生成物（５４％）を得た。ｔＲ＝４８−５２分、ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、９：１）Ｒｆ＝０．２４（蛍光ピンクスポット）、ＥＳＩ−ｎｅｇ ｍ／ｚ １０８４（Ｍ−、Ｃ４６Ｈ５５Ｃｌ３Ｎ７Ｏ１１Ｓ３−、１０８４必要）。
Figure 2009528988
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４アジド（５つの異性体）
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジド トリフルオロ酢酸塩（０．１２ｍｍｏｌ、反応式１）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（４２μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）中の溶液に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４カルボン酸（スクシニミジルエステル＊５−ｉｓｏｍｅｒ＊（５０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで２時間溶液を撹拌した後、溶液を真空濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液２５〜６０％のＣＨ３ＣＮ（３０分以上）／２５ｍＭのＴＥＡＡ（ｐＨ＝４．７）、２０ｍＬ／分の流速）により、１６．５ｍｇの生成物（３２％）を得た。ｔＲ＝２３−２５分、ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、９：１）Ｒｆ＝０．３６（蛍光赤色スポット）、ＥＳＩ−ｎｅｇ ｍ／ｚ ８４５（Ｍ−、Ｃ４１Ｈ４５Ｎ６Ｏ１０Ｓ２−、８４５必要）。
Figure 2009528988
Ｄａｐｏｘｙｌアジド
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジド トリフルオロ酢酸塩（０．２５ｍｍｏｌ、反応式１）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（４３μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）中の溶液に、Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）カルボン酸（スクシニミジルエステル（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで１時間溶液を撹拌した後、溶液を真空濃縮した。ＳＰＥ（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃ１８ ＤＳＣ）で精製し、４１．６ｍｇの生成物（７８％）を得た。ＥＳＩ−ｐｏｓ ｍ／ｚ ４３３（Ｍ＋、Ｃ２４Ｈ２８Ｎ６Ｏ２、４３３必要）。
Figure 2009528988
Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８−アルキン
Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８カルボン酸 スクシニミジルエステル（５０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（０．２６μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（０．１ｍＬ）を添加した。ＲＴで１５分間撹拌した後、溶液を濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液１５−３０％のＣＨ３ＣＮ／２５ｍＭのＴＥＡＡ（ｐＨ４．７）、１５ｍＬ／分の流速）により、４４．５ｍｇの生成物（９９％）を得た。ｔＲ＝５〜１３分、ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２）Ｒｆ＝０．６０、蛍光黄色のスポット、ＥＳＩ−ｎｅｇ ｍ／ｚ ４４８（Ｍ−Ｈ＋、Ｃ２４Ｈ１２Ｆ２ＮＯ６−、４４８必要）。
Figure 2009528988
アルキニル−ＰＥＧ−ビオチン
ＲＴで、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ピアス、２５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（０．３ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を添加した。３時間撹拌した後、溶液を真空濃縮し、トルエンから二回再蒸発させた。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液３５−５０％のＭｅＯＨ／２５ｍＭのＮＨ４Ａｃ（ｐＨ６．５）、１５ｍＬ／分の流速）により、１４．４ｍｇ（６４％、白色固体）の生成物を得た。ｔＲ＝２６−３０分、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、７：１）Ｒｆ＝０．２０（ＵＶ活性化）、ＥＳＩ ｍ／ｚ ５２９（Ｍ＋Ｈ＋、Ｃ２４Ｈ４０Ｎ４Ｏ７Ｓ、５２９必要）。
アルキン色素
Figure 2009528988
５−ＴＡＭＲＡ−アルキン
５−カルボキシテトラメチルローダミン スクシニミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ、０．１０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（２５μＬ、０．３８ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）を添加した。ＲＴで３０分溶液を撹拌した後、溶液を真空濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液２５−４０％ＣＨ３ＣＮ／２５ｍＭのＴＥＡＡ（ｐＨ４．７）、１５ｍＬ／分の流速）により、６８ｍｇの生成物（８２％、紫の固体）を得た。ｔＲ＝２３−３３分、ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２）Ｒｆ＝０．６７（蛍光橙黄色スポット）、ＥＳＩ ｍ／ｚ ４６９（Ｍ＋Ｈ＋、Ｃ２８Ｈ２６Ｎ３Ｏ４、４６９必要）。
Figure 2009528988
Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８−アルキン
Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８カルボン酸 スクシニミジルエステル（５０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（０．２６μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（０．１ｍＬ）を添加した。ＲＴで１５分間撹拌した後、溶液を濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液１５−３０％のＣＨ３ＣＮ／２５ｍＭのＴＥＡＡ（ｐＨ４．７）、１５ｍＬ／分の流速）により、４４．５ｍｇ（９９％）の生成物を得た。ｔＲ＝５〜１３分、ＴＬＣ、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２Ｒｆ＝０．６０、蛍光黄色の点、ＥＳＩ−ｎｅｇ ｍ／ｚ ４４８（Ｍ−Ｈ＋、Ｃ２４Ｈ１２Ｆ２ＮＯ６−、４４８必要）。
Figure 2009528988
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２−アルキン
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２カルボン酸 スクシニミジルエステル（５１ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）のは、付加的なプロパルギルアミン（０．１ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１．０ｍＬ）であった。溶液を１ｈ、更に真空濃縮が粗生成物を得た。、ＲＴで撹拌した。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液２５−４０％ＣＨ３ＣＮ／２５ｍＭのＮＨ４Ａｃ（ｐＨ４．７）、１５ｍＬ／分の流速）により、３０ｍｇの生成物（６５％、赤い固体）を得た。ｔＲ＝２３−３０分、ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、１：１）Ｒｆ＝０．５８（蛍光赤い点）、ＥＳＩ ｍ／ｚ ６６４（Ｍ＋、Ｃ３３Ｈ３４Ｎ３Ｏ８Ｓ２、６６４必要）。
Figure 2009528988
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−アルキン
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８カルボン酸 スクシニミジルエステル ジリチウム塩（混合異性体）（５１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．０ｍＬ）中の溶液に、プロパルギルアミン（５４μＬ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで４時間撹拌し、更に真空濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２）を使用して精製し、２０ｍｇ（４４％、橙色固体）を得た。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、３：１）Ｒｆ＝０．６８、ＥＳＩ−ｎｅｇ ｍ／ｚ ５７０（Ｍ−２、Ｃ２４Ｈ１６Ｎ３Ｏ１０Ｓ２ ２−、５７０必要）。
Figure 2009528988
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８−アジド
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジド（０．０４ｍｍｏｌ、反応式１を参照）のＤＭＦ（０．２ｍＬ）及びＤＩＥＡ（７μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）中の溶液に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８カルボン酸 スクシニミジルエステル（異性体、２５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌの混合）を添加した。ＲＴで２．５時間溶液を撹拌した後、Ｈ２Ｏ（０．２ｍＬ）を添加し、溶液を真空濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ、２１．２ｍｍ内径、溶出液２０−３５％のＣＨ３ＣＮ／２５ｍＭのＮＨ４Ａｃ（ｐＨ４．７）、１５ｍＬ／分の流速）により、１５．３ｍｇの生成物（９９％）を得た。ｔＲ＝２４−３０分、ＴＬＣ、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２Ｒｆ＝０．６３（蛍光ピンクスポット）、ＥＳＩ−ネガｍ／ｚ ８１７（Ｍ−２、Ｃ３９Ｈ４１Ｎ６Ｏ１０Ｓ２−、８１７必要）。
実施例４４：トリアリールホスフィン色素
反応式４
Figure 2009528988
５−ＴＡＭＲＡ−トリアリールホスフィン
Ｎ−Ｂｏｃ−トリアリールホスフィン−アミン（１０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、反応式２を参照）のＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を添加した。反応溶液をＲＴで３０分間撹拌し、真空内で濃縮し、トルエンから二回再度蒸発させた。粗製のアミン（０．０１８ｍｍｏｌ、９９％）を、更に精製せずに次の反応に直接用いた。
トリアリールホスフィン−アミン（０．０１８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．２ｍＬ）及びＤＩＥＡ（１２μＬ、０．０８９ｍｍｏｌ）中の溶液に、５−カルボキシテトラメチルローダミン スクシニミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ、９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで２．５時間溶液を撹拌した後、溶液を真空濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１０ｍｍ内径、溶出液４０−５５％ ＣＨ３ＣＮ／２５ｍＭのＮＨ４Ａｃ（ｐＨ＝７）、５．０ｍＬ／分の流速）により、４．１ｍｇの生成物（２７％）を得た。ｔＲ＝３２−３４分、ＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３、１：９）Ｒｆ＝０．６７（蛍光ピンクスポット）、ＥＳＩ ｍ／ｚ ８４８（Ｍ＋Ｈ＋、Ｃ５０Ｈ４８Ｎ４Ｏ７Ｐ、８４８必要）。
実施例で使用される試薬は、市販されているか、又は従来技術において、公知の市販の器具、方法又は試薬を使用して調製できる。本願明細書において、全ての引例は、全体として引用したものとする。上記の実施形態では、本発明の様々な態様及び本発明の方法の実施形態を例示するものである。実施例は、本発明の多くの異なる実施例の徹底的な説明を提供することを目的としない。すなわち、上記した本発明を、理解の便宜上、図及び実施例を挙げて幾つかの具体的な態様として説明するが、当業者であれば、多くの変更及び修飾を、本発明の技術思想又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく実施できることを容易に相当するであろう。
代理人整理番号ＩＶＧＮ ７４５．１及びＩＶＧＮ ７４５．２に係る、２００７年２月１２日に出願された米国特許出願（米国仮特許出願第６０／７７２，２２１号及び第６０／８０４，６４０号の優先権を主張）を本願明細書に援用する。
非天然のアジド糖による代謝的標識を示す。 Ａ）では糖タンパク質サブクラスの代謝的標識及び「クリック」検出を図式的に示し、Ｂ）ではゲル上の分離後の検出を示す。 ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ全タンパク質染色で染色された同じゲルと比較した場合の、二次元ゲルによるＡｃ４ＧｌｃＮＡｚ処理を受けた可溶性のＪｕｒｋａｔ細胞、及び対照のタンパク質分離を示す。 ４０及び５０ｋＤのアジド標識されたモデルタンパク質（最初に蛍光アルキンタグで標識し、更にゲル分離した）のゲル検出を示す。 ４０及び５０ｋｄのアジド標識されたモデルタンパク質の標識効率（複合タンパク質抽出物において不変）を示す。 α−クリスタリン Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの酵素的標識及び検出を示す。 Ｏ−ＧｌｃＮＡｃモノクローナル抗体ＣＴＤ１１０．６を用いた、ＧａｌＴｌによる酵素的標識の比較を示す。 同じ二次元ゲルにおける、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃタンパク質、リンタンパク質及び全タンパク質の複合的検出を示す。 Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ及びコフィリンの複合的ウエスタンブロッティング検出を示す。 対照及び阻害剤処理された細胞抽出液における、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のディファレンシャル検出を示す。 Ａ）では、抗体糖質に存在する末端ＯＧｌｃＮＡｃ分子の反応を介する、抗体標識のための新規な方法としての、ＧａｌＴとの組合せによるＵＤＰＧａｌＮＡｚ（反応式２）を示し、Ｂ）では、ＯＧｌｃＮＡｃ糖が抗体に存在しない場合には、エンド−Ｈ（エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ）酵素を用いて、１つのＮ−アセチルグルコサミン残基を末端に有する切断された鎖を調製することを示す。 本発明の方法を使用している生体分子を標識するために用いることがありえる、４つの現存する（ＡからＤ）及び２つのポテンシャルな（Ｅ、Ｆ）アルキンフルオロフォアの構造式を示す。Ａ）ＴＡＭＲＡ−アルキン、Ｂ）Ａｌｅｘａ ４８８−Ａｌｋｙｎｅ、Ｃ）Ａｌｅｘａ ６３３−Ａｌｋｙｎｅ、Ｄ）Ａｌｅｘａ ５３２−Ａｌｋｙｎｅ、Ｅ）ポテンシャルな蛍光発生アルキン、Ｆ）ポテンシャルな蛍光発生アルキン。 図１２Ａに示されるＴＡＭＲＡ−アルキン化合物を使用したゲル染色の結果を示す。ゲルの左側上のレーン２、３及び４は、アジド修飾された糖で標識された細胞抽出液の結果を表す。レーン１は、対照の、非標識の細胞を表す。右側では、対照のアジド標識タンパク質（オボアルブミン及びミオグロビン）（＋）、又は非標識の対照（−）を、濃度を変化させてアプライした際の結果を示す。その結果、アジド修飾タンパク質の非常に効率的かつ選択的なゲル中標識が可能であることが示された。 異なるキレート剤を用いて、クリック反応により標識されるタンパク質をゲル分離した結果を示す。８０μｇの非標識Ｊｕｒｋａｔ溶解物に取り込ませたアジドオボアルブミン及びアジドミオグロビン各２．５μｇを、ＴＡＭＲＡアルキンで２時間標識した。反応組成：５０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８）、２５％のプロピレングリコール、１ｍＭ ＣｕＳＯ４、５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、２０μＭ ＴＡＭＲＡアルキン。キレート剤の有無で反応を実施した（１０ｍＭのＴＰＥＮ［左上ゲル］、ＥＤＴＡ［右上ゲル］、バソクプロインジスルホン酸（ＢＣＳ）［中央左ゲル］又はネオクプロイン［中央右ゲル］）結果を示す。対照反応を、ＣｕＳＯ４なし［左下ゲル］、又はキレート剤なし［右下ゲル］で実施した。標識後、サンプルを沈殿させ、７ｍＭ 尿素／２ｍＭ チオ尿素／６５ｍＭ ＤＴＴ／２％ ＣＨＡＰＳ／で再度溶解させ、約３０μｇを二次元ゲル電気泳動（ｐＨ４〜７のＩＥＦストリップ、４〜１２％のＢＩＳ−Ｔｒｉｓゲル、ＭＯＰＳバッファー）で分析した。ＴＡＭＲＡシグナルを、５３２ｎｍで励起、Ｆｕｊｉ ＦＬＡ３０００（１４Ａ）で５８０のロングパス放出させてイメージングし、更にゲルをＳｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙを用いて全タンパク質をゲル染色によって、後染色した（１４Ｂ）。 異なるキレート剤を用いた、クリック反応により標識されるタンパク質をゲル分離した結果を示す。サンプル及びクリック標識の条件は図１４と同様である（但し、キレート剤処理を、反応の最初に５ｍＭのＴＰＥＮ、ＢＣＳ又はネオクプロインを添加したことを除く）。標識後、サンプルを沈殿させ、ＬＤＳバッファー＋５ｍＭ ＴＣＥＰ中に再度溶解させ、連続２倍希釈系列を調製した。希釈液を、ＭＯＰＳランニングバッファーを用いて４〜１２％のビストリスゲル上にロードした（レーン１は各々２５０ｎｇのオボアルブミン及びミオグロビン）。図１５Ａは、キレート剤が、感度を低下させることなく、ＴＡＭＲＡシグナルのイメージングの際、バックグラウンドを減少させることを示す。図１５Ｂは、Ｓｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙ全タンパク質ゲル染色による後染色の結果を示し、キレート剤を含有するサンプルではバンド解像度が非常に良好であることを示す。 キレート剤処理において、７ｍＭ、５ｍＭ又は２ｍＭのＢＣＳ又はネオクプロインの添加が含まれることを除き、図１４と同様のサンプル及びクリック標識条件を用いた。（Ａ）の星印のレーンは、アスコルビン酸ナトリウムを添加する前に、ＣｕＳＯ４及びＢＣＳを反応に添加して混合させた反応を示す。他の全ての反応においては、ＢＣＳを添加する前にＣｕＳＯ４及びアスコルビン酸ナトリウムを添加し、ボルテックスした。ゲルを解析した結果、キレート剤を添加する前にアスコルビン酸ナトリウム及びＣｕＳＯ４を反応チューブに添加し、混合することが必要であることが示された。アスコルビン酸ナトリウムを添加する前にキレート剤及びＣｕＳＯ４を添加し、ボルテックスした場合、アジド−アルキン標識が進行せず、キレート剤がＣｕＩＩからＣｕＩへの還元を阻害することが示唆される。 クリックケミストリーを使用した、抗体への酵素的標識：Ａ）レーン１：ヤギ抗体（ＧＡｂ）のみ、レーン２：ＧａｌＴｌ酵素を有するＧＡｂ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ対照なし、レーン３：酵素及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚを有するＧＡｂ、レーン４：アジド標識されたオバルブミン及びミオグロビン対照タンパク質、レーン５：ＭＷマーカー（標識なし）。Ｂ）アジド標識されたヤギ抗体（上記）を、希釈系列として泳動させた。抗体のナノグラム数は、重鎖のみに関して算出した。上記の通りにゲルを泳動し、染色し、イメージングした。 図１８Ａは、ＲＩＩペプチドのみのβ−除去（下のトレース）、及び上のトレースではＲＩＩペプチドにおけるβ−除去とアジドチオ酢酸付加との同時発生を示す。β−除去によりペプチドから９８Ｄａが除去され、アジドチオ酢酸の付加により１５９Ｄａの追加となるため、付加生成物の予想分子質量は２２５３Ｄａ（２１９２−９８＋１５９）となる。１９８０Ｄａピークは、Ｎ末端アラニンが切断された、β除去されたＲＩＩに対応する。１６５５Ｄａピークは、ホスホセリン残基でＲＩＩの加水分解に対応し、追加サンプルにおいては観察されない。図１８Ｂは、ＲＩＩペプチドのみのβ−除去（下のトレース）、及び上のトレースではＲＩＩペプチドにおけるβ−除去とアジドアミン付加との同時発生を示す。β−除去によりペプチドから９８Ｄａが除去され、アジドアミンの付加により１４２Ｄａの追加となるため、付加生成物の予想分子質量は２２３６Ｄａ（２１９２−９８＋１４２）となる。他の付加生成物（＋１３０Ｄａ（予想質量＝２２２４）に対応）が観察された。ＰＤＳ ＭＡＬＤＩ分析により２２３６生成物と同じ断片が観察され、当該生成物が関連していることを示唆する。１９８０Ｄａピークは、Ｎ末端アラニンが切断された、β除去されたＲＩＩに対応する。１６５５Ｄａピークはホスホセリン残基でのＲＩＩの加水分解に対応し、追加サンプルにおいて、β−除去のみのサンプルよりもより小さい分子量で観察される。 生細胞及び固定化細胞の、蛍光クリック標識の結果を示す。 細胞表面対全体の、糖タンパク質サブクラスのゲル分析の結果を示す。レーン１及び４：フィードなしの対照。レーン２：ＧａｌＮＡｚフィードを受け、生細胞を表面標識。レーン３：ＧａｌＮＡｚフィードを受け、全細胞可溶化物を標識。レーン５：ＭａｎＮＡｚフィードを受け、生細胞を表面標識。レーン６：ＭａｎＮＡｚフィードを受け、全細胞可溶化物を標識。 生存する動物中における、標識糖タンパク質のゲル分析の結果を示す。下記の上方パネルは、心筋（Ｈ）、肝臓（Ｌ）、又は腎臓（Ｋ）からの、標識された組織タンパク質の１次元ゲルを示す。下方パネルは、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙにより後染色した同じゲルを示す。

Claims (40)

  1. 糖タンパク質複合体を形成する方法であって、
    （ａ）ＧａｌＴ酵素の存在下で、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚと糖タンパク質とを接触させて、アジド修飾糖タンパク質を形成させる段階；
    （ｂ）前記アジド修飾糖タンパク質を、レポーター分子、担体分子又はアジド反応性部分を含む固体支持体と接触させて、糖タンパク質レポーター分子、担体分子、又は固体支持体との複合体を形成させる段階
    を含む、方法。
  2. アジド反応性部分が、末端アルキン又は末端トリアリールホスフィンである、請求項１記載の方法。
  3. レポーター分子がキサンテン、シアニン、クマリン、ボラポリアザインダセン又はピレン色素である、請求項１記載の方法。
  4. レポーター分子が酵素基質又はハプテンである、請求項１記載の方法。
  5. アジド修飾糖タンパク質が抗体である、請求項１記載の請求項。
  6. 担体分子がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬剤、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー微粒子、生物細胞又はウイルスである、請求項１記載の方法。
  7. 担体分子が抗体又はその断片、アビジン又はストレプトアビジン、ビオチン、血液成分タンパク質、デキストラン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ＩｇＧ結合タンパク質、蛍光タンパク質、成長因子、レクチン、リポ多糖類、微生物、金属結合タンパク質、金属キレート化部分、非生物学的微粒子、ペプチド毒素、ホスファチジルセリン−結合タンパク質、構造タンパク質、小分子薬物又はチラミドを含む、請求項１記載の方法。
  8. 固体支持体がマイクロ流体チップ、シリコンチップ、顕微鏡スライド、マイクロプレートウェル、シリカゲル、重合膜、粒子、誘導体化されたプラスチックフィルム、ガラスビーズ、コットン、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖類、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ又は超常磁性ビーズである、請求項１記載の方法。
  9. 固体支持体がセファロース、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、澱粉、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース又は澱粉である、請求項１記載の方法。
  10. 糖タンパク質複合体を形成する方法であって、
    （ａ）タンパク質とアジド修飾された糖質とを、アジド修飾された糖質をタンパク質へ転移させる酵素の存在下で接触させて、アジド修飾糖タンパク質を形成させる段階；
    （ｂ）前記アジド修飾糖タンパク質を、末端アルキンを含むレポーター分子、担体分子又は固体支持体と接触させて、糖タンパク質とレポーター分子、担体分子又は固体支持体との複合体を形成させる段階
    を含む、方法。
  11. 糖タンパク質複合体を形成する方法であって、
    （ａ）タンパク質と末端アルキン修飾された糖質とを、末端アルキン修飾された糖質をタンパク質へ転移させる酵素の存在下で接触させて、末端アルキン修飾糖タンパク質を形成させる段階；
    （ｂ）前記末端アルキン修飾糖タンパク質を、アジド部分を含むレポーター分子、担体分子又は固体支持体と接触させて、糖タンパク質とレポーター分子、担体分子又は固体支持体との複合体を形成させる段階
    を含む、方法。
  12. リンタンパク質複合体を形成する方法であって、
    （ａ）タンパク質と末端アルキン修飾されたリン酸とを、末端アルキン修飾されたリン酸をタンパク質へ転移させる酵素の存在下で接触させて、末端アルキン修飾リンタンパク質を形成させる段階；
    （ｂ）前記末端アルキン修飾リンタンパク質を、アジド部分を含むレポーター分子、担体分子又は固体支持体と接触させて、リンタンパク質とレポーター分子、担体分子又は固体支持体との複合体を形成させる段階
    を含む、方法。
  13. リンタンパク質複合体を形成する方法であって、
    （ａ）タンパク質とアジド修飾されたリン酸とを、アジド修飾されたリン酸をタンパク質へ転移させる酵素の存在下で接触させて、アジド修飾リンタンパク質を形成させる段階；
    （ｂ）前記アジド修飾リンタンパク質を、末端アルキンを含むレポーター分子、担体分子又は固体支持体と接触させて、リンタンパク質とレポーター分子、担体分子又は固体支持体との複合体を形成させる段階
    を含む、方法。
  14. リンタンパク質複合体を形成する方法であって、
    （ａ）リンタンパク質と、リン酸化されたタンパク質のトレオニン残基及びセリン残基からリン酸を除去する塩基性溶液とを接触させて、デヒドロアラニン又はデヒドロアミノ−２−酪酸を含むタンパク質を形成させる段階；
    （ｂ）デヒドロアラニン又はデヒドロアミノ−２−酪酸と、チオール又はアミン基、及びアジド又は末端アルキンを含む化合物とを接触させて、アジド修飾タンパク質又はアルキン修飾タンパク質を形成させる段階；
    （ｃ）末端アルキン修飾又はアジド修飾されたリンタンパク質と、アジド部分を含むレポーター分子、担体分子又は固体支持体とを接触させて、リンタンパク質とレポーター分子、担体分子又は固体支持体との複合体を形成させる段階
    を含む、方法。
  15. 翻訳後修飾タンパク質複合体を形成する方法であって、
    （ａ）タンパク質とアジド修飾された翻訳後部分とを、アジド修飾された翻訳後部分をタンパク質へ転移させる酵素の存在下で接触させて、アジド修飾タンパク質を形成させる段階；
    （ｂ）前記アジド修飾タンパク質と、末端アルキンを含むレポーター分子、担体分子又は固体支持体と接触させて、リンタンパク質とレポーター分子、担体分子又は固体支持体との複合体を形成させる段階
    を含む、方法。
  16. 翻訳後修飾タンパク質複合体を形成する方法であって、
    （ａ）タンパク質と末端アルキン修飾された翻訳後部分とを、末端アルキン修飾された翻訳後部分をタンパク質へ転移させる酵素の存在下で接触させて、末端アルキン修飾タンパク質を形成させる段階；
    （ｂ）前記末端アルキン修飾タンパク質と、アジド部分を含むレポーター分子、担体分子又は固体支持体と接触させて、リンタンパク質とレポーター分子、担体分子又は固体支持体との複合体を形成させる段階
    を含む、方法。
  17. アジド修飾生体分子を検出する方法であって、
    （ａ）末端アルキン部分を含むレポーター分子、
    アジド修飾生体分子、
    銅イオン、
    少なくとも１つの還元剤、および
    銅キレート剤
    を含むアジド−アルキン環付加反応混合物を形成する段階；
    （ｂ）前記アジド−アルキン環付加反応混合物を充分な時間インキュベートして生体分子−レポーター分子複合体を形成させる段階；
    （ｃ）前記生体分子−レポーター分子複合体を、糖タンパク質−レポーター分子複合体のサイズ及び／又は重量に応じて分離させて、分離された生体分子−レポーター分子複合体を形成させる段階；
    （ｄ）分離された前記生体分子−レポーター分子複合体を適当な波長で照射して、照射された生体分子−レポーター分子複合体を形成させる段階；
    （ｅ）照射された前記生体分子−レポーター分子複合体を観察して、糖タンパク質を検出する段階
    を含む、方法。
  18. 生体分子が糖質、核酸、タンパク質又はペプチドである、請求項１７記載の方法。
  19. 生体分子が糖タンパク質である、請求項１７記載の方法。
  20. レポーター分子がキサンテン、シアニン、クマリン、ボラポリアザインダセン又はピレン色素である、請求項１７記載の方法。
  21. レポーター分子が酵素基質、蛍光タンパク質又はハプテンである、請求項１７記載の方法。
  22. 銅キレート剤が銅（Ｉ）のキレート剤である、請求項１７記載の方法。
  23. 銅キレート剤が、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）、ＥＤＴＡ、ネオクプロイン、Ｎ−（２−アセタミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ピリジン−２，６−ジカルボン酸（ＰＤＡ）、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン（ＳＣＭＣ）、１，１０フェナントロリン又はその誘導体、トリエンチン、グルタチオン、ヒスタジン、ポリヒスタジン又はテトラエチレンポリアミン（ＴＥＰＡ）である、請求項１７記載の方法。
  24. 銅キレート剤が１，１０フェナントロリン、バソフェナントロリンジスルホン酸（４，７ｏジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸）又はバソクプロインジスルホン酸（２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である、請求項１７記載の方法。
  25. 還元剤がアスコルベート、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ＴＣＰ（２，４，６−トリクロロフェノール）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオスルフェート、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、グルタチオン、システイン、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ１、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋及び印加電位である、請求項１７記載の方法。
  26. 還元剤がアスコルベートである、請求項１７記載の方法。
  27. 分離させる段階がクロマトグラフィー又は電気泳動を含む、請求項１７記載の方法。
  28. クロマトグラフィーが、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティクロマトグラフィーの１つまたは複数を含む、請求項２７記載の方法。
  29. 電気泳動がゲル電気泳動、１次元（１Ｄ）ゲル電気泳動、２次元（２Ｄ）ゲル電気泳動、ネイティブゲル電気泳動、変性ゲル電気泳動、等電点電気泳動又はキャピラリー電気泳動を含む、請求項２７記載の方法。
  30. ウエスタンブロッティングを更に含む、請求項２７記載の方法。
  31. アジド修飾生体分子が、アジド修飾された糖質の代謝的取り込みにより修飾される、請求項１７記載の方法。
  32. アジド修飾生体分子が、アジド修飾された糖質の酵素的取り込みにより修飾される、請求項１７記載の方法。
  33. 末端アルキン部分を含むレポーター分子、固体支持体又は担体分子、
    アジド修飾生体分子、
    銅イオン、
    少なくとも１つの還元剤、および
    銅キレート剤
    を含む、アジド−アルキン環付加反応混合物。
  34. 銅キレート剤が銅（Ｉ）キレート剤である、請求項３３記載の反応混合物。
  35. 銅キレート剤が、ＮＮＮＮ−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）、ＥＤＴＡ、ネオクプロイン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ピリジン−２，６−ジカルボン酸（ＰＤＡ）、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン（ＳＣＭＣ）、１，１０フェナントロリン又はその誘導体、トリエンチン又はテトラエチレンポリアミン（ＴＥＰＡ）である、請求項３３記載の方法。
  36. 銅キレート剤が１，１０フェナントロリン、バソフェナントロリンジスルホン酸（４，７ｏジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸）又はバソクプロインジスルホン酸（２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である、請求項３３記載の方法。
  37. アジド部分を含むレポーター分子、固体支持体又は担体分子、
    末端アルキンを有する生体分子、
    銅イオン、
    少なくとも１つの還元剤、および
    銅キレート剤
    を含む、アジド−アルキン環付加反応混合物。
  38. 固定化したアジド修飾生体分子を検出する方法であって、
    ａ．アジド修飾生体分子を固体又は半固体のマトリックス上に固定して、固定化されたアジド修飾生体分子を形成させる段階；
    ｂ．前記固定化されたアジド修飾生体分子を、アジド反応基を含むレポーター分子と接触させて、接触させたアジド修飾生体分子を形成させる段階；
    ｃ．接触させた前記アジド修飾生体分子を、充分な時間インキュベートして、レポーター分子−生体分子複合体を形成させる段階；
    ｄ．前記レポーター分子−生体分子複合体を、適当な波長で照射して、照射されたレポーター分子−生体分子複合体を形成させる段階；
    ｅ．前記照射されたレポーター分子−生体分子複合体を観察して、固定化されたアジド修飾生体分子を検出する段階
    を含む、方法。
  39. 固体又は半固体の支持体が、スライド、アレイ、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、ヒドロゲル、ポリマー粒子又はガラスである、請求項３０記載の方法。
  40. ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ；
    ＧａｌＴ酵素；
    アジド反応性レポーター分子、担体分子、又は固体支持体
    を含む、キット。
JP2008553858A 2006-02-10 2007-02-12 翻訳後修飾されたタンパク質の標識及び検出方法 Pending JP2009528988A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77222106P 2006-02-10 2006-02-10
US80464006P 2006-06-13 2006-06-13
PCT/IB2007/003472 WO2008029281A2 (en) 2006-02-10 2007-02-12 Labeling and detection of post translationally modified proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2009528988A true JP2009528988A (ja) 2009-08-13

Family

ID=38440198

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008553858A Pending JP2009528988A (ja) 2006-02-10 2007-02-12 翻訳後修飾されたタンパク質の標識及び検出方法
JP2014209061A Withdrawn JP2015044828A (ja) 2006-02-10 2014-10-10 オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法
JP2016129992A Active JP6646537B2 (ja) 2006-02-10 2016-06-30 オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法
JP2018122653A Pending JP2018158943A (ja) 2006-02-10 2018-06-28 オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014209061A Withdrawn JP2015044828A (ja) 2006-02-10 2014-10-10 オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法
JP2016129992A Active JP6646537B2 (ja) 2006-02-10 2016-06-30 オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法
JP2018122653A Pending JP2018158943A (ja) 2006-02-10 2018-06-28 オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法

Country Status (5)

Country Link
US (10) US8716033B2 (ja)
EP (7) EP1987068B1 (ja)
JP (4) JP2009528988A (ja)
DK (3) DK1991273T4 (ja)
WO (2) WO2008029281A2 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015534996A (ja) * 2012-10-23 2015-12-07 シンアフィックス ビー．ブイ． 修飾抗体、抗体コンジュゲート及びそれらを調製する方法
JP2016521714A (ja) * 2013-06-04 2016-07-25 トリビオティカ・エルエルシー 核酸に特異的なヘテロ化合物のテンプレート化アセンブリのための方法及び組成物
JP2016538878A (ja) * 2013-10-14 2016-12-15 シンアフィックス ビー．ブイ． 糖鎖工学的に操作された抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらの調製方法
US10704084B2 (en) 2014-12-02 2020-07-07 Tribiotica Llc Methods and kits for theranostic applications
US11186839B2 (en) 2016-11-21 2021-11-30 Tribiotica Llc Methods for preventing titration of bimolecular templated assembly reactions by structurally-determined differential hybridizations
US11253536B2 (en) 2016-11-21 2022-02-22 Tribiotica Llc Methods for directed folding assembly or dimerization of proteins by templated assembly reactions

Families Citing this family (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1991273T4 (da) 2006-02-10 2022-02-07 Life Technologies Corp Mærkning og påvisning af post-translationelt modificerede proteiner
WO2007106886A2 (en) * 2006-03-15 2007-09-20 Trustees Of Tufts College Fluorinated carbohydrates and their use in tumor visualization, tissue engineering, and cancer chemotherapy
US8034396B2 (en) * 2008-04-01 2011-10-11 Tyco Healthcare Group Lp Bioadhesive composition formed using click chemistry
CA2723197C (en) 2008-05-02 2017-09-19 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
JP5569768B2 (ja) * 2008-12-02 2014-08-13 国立大学法人九州大学 ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブおよび標的核酸の検出方法
CN103432566A (zh) * 2008-12-16 2013-12-11 建新公司 寡糖-蛋白缀合物
US8987514B2 (en) 2009-02-04 2015-03-24 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for labeling and imaging phospholipids
US20100189660A1 (en) * 2009-02-14 2010-07-29 Genentech, Inc. Methods for the detection of fatty-acylated protein
EP2398584A2 (en) 2009-02-21 2011-12-28 Sofradim Production Apparatus and method of reaching polymers by exposure to uv radiation to produce injectable medical devices
EP2398523B1 (en) 2009-02-21 2018-04-04 Covidien LP Medical devices having activated surfaces
CA2753171A1 (en) 2009-02-21 2010-08-26 Sofradim Production Crosslinked fibers and method of making same using uv radiation
AU2010215199B2 (en) 2009-02-21 2015-01-15 Sofradim Production Compounds and medical devices activated with solvophobic linkers
US8535477B2 (en) 2009-02-21 2013-09-17 Sofradim Production Medical devices incorporating functional adhesives
US8968818B2 (en) 2009-02-21 2015-03-03 Covidien Lp Medical devices having activated surfaces
US8968733B2 (en) 2009-02-21 2015-03-03 Sofradim Production Functionalized surgical adhesives
US8512728B2 (en) 2009-02-21 2013-08-20 Sofradim Production Method of forming a medical device on biological tissue
US8877170B2 (en) 2009-02-21 2014-11-04 Sofradim Production Medical device with inflammatory response-reducing coating
AU2010215196B2 (en) 2009-02-21 2015-04-16 Covidien Lp Crosslinked fibers and method of making same by extrusion
US8663689B2 (en) 2009-02-21 2014-03-04 Sofradim Production Functionalized adhesive medical gel
US9273191B2 (en) 2009-02-21 2016-03-01 Sofradim Production Medical devices with an activated coating
CA2753162A1 (en) 2009-02-21 2010-08-26 Sofradim Production Amphiphilic compounds and self-assembling compositions made therefrom
EP2398583B1 (en) 2009-02-21 2020-12-23 Sofradim Production Apparatus and method of reacting polymers passing through metal ion matrix to produce injectable medical devices
EP2253635B1 (en) 2009-04-28 2014-03-19 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Novel hydrophilic and lipophilic rhodamines for labelling and imaging
US8735444B2 (en) 2009-06-26 2014-05-27 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Fluorinated rhodamines as photostable fluorescent dyes for labelling and imaging techniques
US8440905B2 (en) * 2009-09-25 2013-05-14 Robert J. LeSuer Copper complex dye sensitized solar cell
WO2011057295A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 University of Washington Center for Commercialization Functionalized chromophoric polymer dots and bioconjugates thereof
US9090542B2 (en) * 2009-11-11 2015-07-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods for labeling a substrate using a hetero-diels-alder reaction
US20110108411A1 (en) * 2009-11-11 2011-05-12 Popik Vladimir V Methods for labeling a substrate using a hetero-diels-alder reaction
US20110129834A1 (en) * 2009-11-24 2011-06-02 Life Technologies Corporation Selective amplification of polynucleotide sequences
US8795331B2 (en) 2010-03-25 2014-08-05 Covidien Lp Medical devices incorporating functional adhesives
EP2550034B1 (en) 2010-03-25 2015-01-07 Sofradim Production Surgical fasteners and methods for sealing wounds
EP2588525A4 (en) 2010-06-29 2015-06-10 Covidien Lp MICROWAVE POWERED REACTOR AND IN SITU IMPLANT TRAINING METHOD
EP2588153A2 (en) 2010-07-01 2013-05-08 Sofradim Production Medical device with predefined activated cellular integration
WO2012014080A2 (en) 2010-07-27 2012-02-02 Sofradim Production Polymeric fibers having tissue reactive members
EP2598128B1 (en) 2010-07-28 2018-03-28 Life Technologies Corporation Anti- viral azide-containing compounds
US20120028335A1 (en) 2010-07-28 2012-02-02 Life Technologies Corporation Anti-viral azide-containing compounds
PT2608796T (pt) 2010-08-05 2019-02-25 Seattle Genetics Inc Inibição de fucosilação de proteínas in vivo utilizando análogos de fucose
AU2011317142B2 (en) 2010-10-18 2015-04-23 University of Washington Center for Commercialization Chromophoric polymer dots
CN103732619A (zh) * 2011-05-31 2014-04-16 普罗拜奥金股份有限公司 用于制备具有毒素、佐剂、检测标签和药代动力学半衰期延长剂的蛋白质的岩藻糖连接位点特异性缀合物的方法
US9164086B2 (en) 2011-10-18 2015-10-20 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Fluorescent dyes with phosphorylated hydroxymethyl groups and their use in light microscopy and imaging techniques
US9797840B2 (en) 2011-11-28 2017-10-24 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Highly fluorescent polymer nanoparticle
US9717803B2 (en) * 2011-12-23 2017-08-01 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
CA2859048C (en) 2011-12-30 2020-08-18 Daniel T. Chiu Chromophoric polymer dots with narrow-band emission
KR20140128966A (ko) * 2012-01-26 2014-11-06 라이프 테크놀로지스 코포레이션 바이러스의 감염성을 증가시키는 방법
EP2809510B1 (en) 2012-02-03 2021-03-31 University of Washington through its Center for Commercialization Polyelectrolyte-coated polymer dots and related methods
WO2013148498A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Ventana Medical Systems, Inc. Signaling conjugates and methods of use
US10350228B2 (en) 2012-08-23 2019-07-16 Seattle Genetics, Inc. Treatment of sickle cell disease and inflammatory conditions
CN104704359A (zh) * 2012-10-25 2015-06-10 生命科技公司 糖蛋白酶介导位点特异性放射性标记的方法和组合物
CN104007091A (zh) * 2013-02-26 2014-08-27 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种基于液滴微流控芯片的微生物高通量检测系统
JP6587605B2 (ja) 2013-03-14 2019-10-09 ユニバーシティ オブ ワシントン スルー イッツ センター フォー コマーシャリゼーション ポリマードット組成物および関連方法
DK2991683T3 (da) 2013-05-02 2019-11-04 Glykos Finland Oy Konjugater af et glykoprotein eller en glykan med en toksisk ladning
US9775928B2 (en) 2013-06-18 2017-10-03 Covidien Lp Adhesive barbed filament
EP3058083B1 (en) 2013-10-14 2018-04-11 SynAffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
US20160235861A1 (en) 2013-10-14 2016-08-18 SynAffix. B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
JP2016538877A (ja) * 2013-10-14 2016-12-15 シンアフィックス ビー．ブイ． 修飾糖タンパク質、タンパク質コンジュゲート及びそれらの調製方法
CN103604791B (zh) * 2013-11-29 2016-01-20 广西师范大学 一种测定叠氮离子的荧光光谱方法
WO2015112013A1 (en) 2014-01-24 2015-07-30 Synaffix B.V. Process for the attachment of a galnac moiety comprising a (hetero)aryl group to a glcnac moiety, and product obtained thereby
EP3097080A1 (en) 2014-01-24 2016-11-30 SynAffix B.V. Process for the cycloaddition of a halogenated 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
EP3925951A1 (en) 2014-01-24 2021-12-22 SynAffix B.V. Process for the cycloaddition of a(hetero)aryl 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
JP5847213B2 (ja) * 2014-02-06 2016-01-20 ホーユー株式会社 ２次元電気泳動方法
AU2015243512B2 (en) * 2014-04-08 2020-06-04 University Of Georgia Research Foundation Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
JP6566348B2 (ja) * 2014-04-08 2019-08-28 国立大学法人弘前大学 新規なグルコース誘導体、および該誘導体を用いた細胞イメージング方法およびイメージング剤
KR20170030648A (ko) 2014-08-04 2017-03-17 시나픽스 비.브이. 베타-(1,4)-n-아세틸갈락토오스아미닐트랜스퍼라아제, 또는 이의 돌연변이체를 이용한 당 단백질의 변형 방법
US20160130324A1 (en) 2014-10-31 2016-05-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. C1 Inhibitor Fusion Proteins and Uses Thereof
CN104761726B (zh) * 2015-01-08 2020-05-22 湖南工业大学 一种基于主链长度调控乙基纤维素接枝聚苯乙烯共聚物材料有序孔孔径的方法
PT3134520T (pt) 2015-04-23 2018-03-26 Synaffix Bv Resumo
CN108368051B (zh) * 2015-11-10 2021-05-25 Eth苏黎世公司 三官能交联试剂
CA3005906A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Recombinant human c1 esterase inhibitor and uses thereof
CN105399639A (zh) * 2015-12-14 2016-03-16 天津科技大学 一种酪胺人工抗原和抗体及其制备方法与应用
WO2017137459A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Enzymes for trimming of glycoproteins
US11951175B2 (en) 2016-02-08 2024-04-09 Synaffix B.V. Bioconjugates containing sulfamide linkers for use in treatment
EP3413915A1 (en) * 2016-02-08 2018-12-19 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting her2 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
WO2017137423A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Improved sulfamide linkers for use in bioconjugates
EP3471703A4 (en) * 2016-06-15 2020-03-18 The General Hospital Corporation METABOLIC MARKING AND MOLECULAR EXTENSION OF BIOLOGICAL MATERIALS USING BIOORTHOGONAL REACTIONS
WO2017218891A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Life Technologies Corporation Site-specific crosslinking of antibodies
US10723760B2 (en) * 2016-09-02 2020-07-28 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Method for preparing site-specifically modified protein based on novel carbon-carbon bond formation
WO2018044130A1 (ko) * 2016-09-02 2018-03-08 한국과학기술원 새로운 탄소-탄소 결합 기반 위치 특이적으로 변형된 단백질의 제조방법
US20180128545A1 (en) 2016-11-08 2018-05-10 Berry Metal Company Modular furnace cooling wall
AU2017388556B2 (en) 2016-12-29 2020-06-25 Development Center For Biotechnology Processes for preparing glycoprotein-drug conjugates
CN108264372B (zh) * 2016-12-30 2021-08-24 四川大学 高强度、低导热的a级不燃气凝胶型泡沫及其制备和应用
CN108728397B (zh) * 2017-04-17 2022-05-20 中国科学院微生物研究所 对昆虫蛋白或昆虫表达系统表达的外源蛋白进行标记的方法
JP2020519261A (ja) 2017-05-11 2020-07-02 ブイアイビー ブイゼットダブリュＶｉｂ Ｖｚｗ 可変免疫グロブリンドメインのグリコシル化
EP3642630A4 (en) * 2017-06-23 2021-03-24 The Scripps Research Institute LYSINE REACTIVE PROBES AND USES OF THEM
CN107486270B (zh) * 2017-08-08 2020-10-23 上海格荣生物科技有限公司 基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法
CN110093303A (zh) * 2018-01-29 2019-08-06 浙江千禾生物科技有限公司 一种半固体培养基及其应用
CN112672764A (zh) 2018-06-19 2021-04-16 格莱科斯生物医药公司 结合物
WO2020002765A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Glykos Biomedical Oy Conjugates
US12097263B2 (en) 2018-08-02 2024-09-24 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
KR20210081324A (ko) 2018-08-02 2021-07-01 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 안면견갑상완 근육 이영양증을 치료하기 위한 그의 용도
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
SG11202100934PA (en) 2018-08-02 2021-02-25 Dyne Therapeutics Inc Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CN109316463B (zh) * 2018-08-03 2021-03-19 暨南大学 一种复合纳米粒及其制备方法和应用
WO2020094670A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing trop-2
GB201901608D0 (en) 2019-02-06 2019-03-27 Vib Vzw Vaccine adjuvant conjugates
EP3928097A1 (en) * 2019-02-20 2021-12-29 Diamidex Methods for labeling eukaryotic cells from a multicellular organism as well as for treating and/or diagnosing a cancer using modified monosaccharide compounds
WO2020228734A1 (en) * 2019-05-13 2020-11-19 Shanghai Polaris Biology Co., Ltd. A tag for labeling biomolecules
GB201918279D0 (en) 2019-12-12 2020-01-29 Vib Vzw Glycosylated single chain immunoglobulin domains
WO2021123506A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Glykos Biomedical Oy Stabile conjugate
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11648318B2 (en) 2021-07-09 2023-05-16 Dyne Therapeutics, Inc. Anti-transferrin receptor (TFR) antibody and uses thereof
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
KR20240035825A (ko) 2021-07-09 2024-03-18 다인 세라퓨틱스, 인크. 디스트로핀병증을 치료하기 위한 근육 표적화 복합체 및 제제
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
TW202334429A (zh) 2021-10-01 2023-09-01 中央研究院 Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途
GB202116442D0 (en) * 2021-11-15 2021-12-29 Actome Gmbh High-efficacy labeling of antibodies with oligonucleotide labels
AU2023237619A1 (en) 2022-03-23 2024-08-29 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing ptk7
AU2023237620A1 (en) 2022-03-23 2024-08-29 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing carcinoembyronic antigen
IL315207A (en) 2022-03-23 2024-10-01 Synaffix Bv Antibody pairs for targeting TROP-2 expressing tumors
WO2023180490A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing nectin-4
AU2023254846A1 (en) 2022-04-15 2024-10-10 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy
EP4285934A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 CER Groupe Modified trimannose-oligosacharides, bisected n-glycans comprising said trimannose core and method for obtaining them
CN115656350A (zh) * 2022-09-05 2023-01-31 华熙生物科技股份有限公司 一种确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式的方法
CN115951070A (zh) * 2023-01-19 2023-04-11 北京青莲百奥生物科技有限公司 一种检测样品中的蛋白的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050130235A1 (en) * 2003-11-18 2005-06-16 Linda Hsieh-Wilson Method and compositions for the detection of protein glycosylation

Family Cites Families (129)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US527027A (en) * 1894-10-02 Method of and apparatus for producing letters or characters in bread
US4196265A (en) * 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
JPS6033479B2 (ja) 1980-07-30 1985-08-02 協和醗酵工業株式会社 過酸化水素の定量方法
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US5055556A (en) 1981-10-06 1991-10-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. Univ. Fluorescent conjugates for analysis of molecules and cells
US4859582A (en) * 1981-10-06 1989-08-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Fluorescent conjugates for analysis of molecules and cells
US4520110A (en) * 1981-10-06 1985-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing a phycobiliprotein labeled ligand or receptor
US4542104A (en) * 1983-04-06 1985-09-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. Univ. Phycobiliprotein fluorescent conjugates
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4603209A (en) 1984-09-07 1986-07-29 The Regents Of The University Of California Fluorescent indicator dyes for calcium ions
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
FR2574415B1 (fr) * 1984-12-11 1987-05-29 Rhone Poulenc Spec Chim Copolyetheramides techniques souples a basse temperature
US4714763A (en) 1985-07-11 1987-12-22 Viomedics Inc. Novel oxazine-ureas and thiazine urea chromophors as fluorescent labels
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4812409A (en) 1986-01-31 1989-03-14 Eastman Kodak Company Hydrolyzable fluorescent substrates and analytical determinations using same
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5627027A (en) * 1986-04-18 1997-05-06 Carnegie Mellon University Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods
US5569587A (en) * 1986-04-18 1996-10-29 Carnegie Mellon University Method for labeling and detecting materials employing luminescent arysulfonate cyanine dyes
US5268486A (en) * 1986-04-18 1993-12-07 Carnegie-Mellon Unversity Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes
US5047519A (en) * 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US4810636A (en) * 1986-12-09 1989-03-07 Miles Inc. Chromogenic acridinone enzyme substrates
US4774339A (en) 1987-08-10 1988-09-27 Molecular Probes, Inc. Chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes
US4945171A (en) 1987-08-10 1990-07-31 Molecular Probes, Inc. Xanthene dyes having a fused (C) benzo ring
US4849362A (en) 1988-05-19 1989-07-18 Smithkline Beckman Corporation Fluorescent intracellular calcium indicators
US5196306A (en) * 1989-03-29 1993-03-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection or quantitation of an analyte using an analyte dependent enzyme activation system
US4981977A (en) 1989-06-09 1991-01-01 Carnegie-Mellon University Intermediate for and fluorescent cyanine dyes containing carboxylic acid groups
US5279954A (en) * 1989-06-30 1994-01-18 Board Of Regents Of The University Of Nebraska And Bionebraska Exopeptidase catalyzed site-specific bonding of supports, labels and bioactive agents to proteins
US5132432A (en) * 1989-09-22 1992-07-21 Molecular Probes, Inc. Chemically reactive pyrenyloxy sulfonic acid dyes
US5202422A (en) * 1989-10-27 1993-04-13 The Scripps Research Institute Compositions containing plant-produced glycopolypeptide multimers, multimeric proteins and method of their use
US5274113A (en) 1991-11-01 1993-12-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes and conjugates
US5459276A (en) 1994-05-20 1995-10-17 Molecular Probes, Inc. Benzazolylcoumarin-based ion indicators for heavy metals
US5501980A (en) 1994-05-20 1996-03-26 Molecular Probes, Inc. Benzazolylcoumarin-based ion indicators
US5227487A (en) 1990-04-16 1993-07-13 Molecular Probes, Inc. Certain tricyclic and pentacyclic-hetero nitrogen rhodol dyes
US5433896A (en) 1994-05-20 1995-07-18 Molecular Probes, Inc. Dibenzopyrrometheneboron difluoride dyes
US5723289A (en) 1990-06-11 1998-03-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel selex
US5625126A (en) * 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2089661C (en) 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) * 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5208148A (en) 1990-12-07 1993-05-04 Molecular Probes, Inc. Lipophilic fluorescent glycosidase substrates
US5248782A (en) 1990-12-18 1993-09-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength heteroaryl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes
WO1993020096A1 (en) 1991-05-08 1993-10-14 Stratagene Oligonucleotide libraries useful for producing primers
US5451343A (en) 1991-05-20 1995-09-19 Spectra Group Limited, Inc. Fluorone and pyronin y derivatives
US5187288A (en) 1991-05-22 1993-02-16 Molecular Probes, Inc. Ethenyl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes and their synthesis
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5316906A (en) * 1991-08-23 1994-05-31 Molecular Probes, Inc. Enzymatic analysis using substrates that yield fluorescent precipitates
US5576424A (en) 1991-08-23 1996-11-19 Molecular Probes, Inc. Haloalkyl derivatives of reporter molecules used to analyze metabolic activity in cells
US5242805A (en) 1991-08-23 1993-09-07 Molecular Probes, Inc. Long wavelength lipophilic fluorogenic glycosidase substrates
EP0603266B1 (en) 1991-08-23 1999-05-12 Molecular Probes, Inc. Use of haloalkyl derivatives of reporter molecules to analyze metabolic activity in cells
CA2141600A1 (en) * 1992-08-03 1994-02-17 Richard U. Margolis Cloning, expression and uses for neurocan as a chondroitin sulfate proteoglycan
AU670108B2 (en) * 1992-09-11 1996-07-04 Becton Dickinson & Company Improved antibodies to plasmodium falciparum
US5274133A (en) * 1993-01-21 1993-12-28 International Flavors & Fragrances Inc. p-Methylenedioxyphenyl propionitrile derivatives, process for producing same, intermediates used in said process and organoleptic uses of said derivatives and intermediates
US5808044A (en) * 1993-01-22 1998-09-15 Pharmacia Biotech Inc. Indocarbocyanine and benzindocarbocyanine phosphoramidites
US6482919B2 (en) * 1993-02-01 2002-11-19 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5767259A (en) 1994-12-27 1998-06-16 Naxcor Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains
JP3240866B2 (ja) * 1995-01-19 2001-12-25 豊田工機株式会社 動力舵取装置
SE9500342D0 (sv) * 1995-01-31 1995-01-31 Marek Kwiatkowski Novel chain terminators, the use thereof for nucleic acid sequencing and synthesis and a method of their preparation
US6127134A (en) * 1995-04-20 2000-10-03 Carnegie Mellon University Difference gel electrophoresis using matched multiple dyes
US5843650A (en) 1995-05-01 1998-12-01 Segev; David Nucleic acid detection and amplification by chemical linkage of oligonucleotides
US5798276A (en) * 1995-06-07 1998-08-25 Molecular Probes, Inc. Reactive derivatives of sulforhodamine 101 with enhanced hydrolytic stability
US6008373A (en) 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
US5874532A (en) * 1997-01-08 1999-02-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for solution phase synthesis of oligonucleotides and peptides
US6004536A (en) 1995-11-14 1999-12-21 Molecular Probes, Inc. Lipophilic cyanine dyes with enchanced aqueous solubilty
US6162931A (en) 1996-04-12 2000-12-19 Molecular Probes, Inc. Fluorinated xanthene derivatives
US6140494A (en) 1996-04-19 2000-10-31 Amersham Pharmacia Biotech Uk Limited Squarate dyes and their use in fluorescent sequencing method
FR2751430B1 (fr) * 1996-07-16 1998-09-11 Aerospatiale Dispositif de suspension et de guidage en translation pour un appareil et appareil equipe d'un tel dispositif
US5846737A (en) * 1996-07-26 1998-12-08 Molecular Probes, Inc. Conjugates of sulforhodamine fluorophores with enhanced fluorescence
US5830912A (en) 1996-11-15 1998-11-03 Molecular Probes, Inc. Derivatives of 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin
US5696157A (en) 1996-11-15 1997-12-09 Molecular Probes, Inc. Sulfonated derivatives of 7-aminocoumarin
AU747242B2 (en) 1997-01-08 2002-05-09 Proligo Llc Bioconjugation of macromolecules
US5948386A (en) * 1997-03-14 1999-09-07 The Curators Of The University Of Missouri Conjugate and method for forming aminomethyl phosphorus conjugates
US5877310A (en) * 1997-04-25 1999-03-02 Carnegie Mellon University Glycoconjugated fluorescent labeling reagents
US5773236A (en) * 1997-04-25 1998-06-30 Molecule Probes, Inc. Assay for glutathiane transferase using polyhaloaryl-substituted reporter molecules
US6075134A (en) * 1997-05-15 2000-06-13 The Regents Of The University Of California Glycoconjugates and methods
DK1009759T3 (da) 1997-09-05 2008-08-04 Altus Pharmaceuticals Inc Carbohydrat-tværbundne glycoproteinkrystaller
US6130101A (en) 1997-09-23 2000-10-10 Molecular Probes, Inc. Sulfonated xanthene derivatives
US6861254B1 (en) * 1997-10-24 2005-03-01 Massachusetts Institute Of Technology Heparan sulfate D-glucosaminyl 3-O-sulfotransferases, and uses therefor
US6133445A (en) 1997-12-17 2000-10-17 Carnegie Mellon University Rigidized trimethine cyanine dyes
US7427678B2 (en) * 1998-01-08 2008-09-23 Sigma-Aldrich Co. Method for immobilizing oligonucleotides employing the cycloaddition bioconjugation method
EP1078023B1 (en) 1998-04-08 2011-01-05 Corporation Luminex Luminescent compounds
US6002003A (en) 1998-04-14 1999-12-14 Beckman Instruments, Inc. Cyanine dye activating group with improved coupling selectivity
JP3983404B2 (ja) * 1999-01-13 2007-09-26 本田技研工業株式会社 レーダ搭載車両用ゲート
US6664047B1 (en) * 1999-04-30 2003-12-16 Molecular Probes, Inc. Aza-benzazolium containing cyanine dyes
EP1065250B1 (en) 1999-07-02 2004-12-08 Visen Medical, Inc. New fluorescent cyanine labels containing a sulfamido linker arm
ATE296828T1 (de) 1999-09-20 2005-06-15 Fuji Photo Film Co Ltd Verbindungen zur floureszenz-kennzeichnung
WO2001068565A2 (en) 2000-03-16 2001-09-20 The Regents Of The University Of California Chemoselective ligation by use of a phosphine
AU7918501A (en) * 2000-08-04 2002-02-18 Molecular Probes Inc Derivatives of 1,2-dihydro-7-hydroxyquinolines containing fused rings
WO2002026891A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 Molecular Probes, Inc. Modified carbocyanine dyes and their conjugates
US6664079B2 (en) 2000-10-06 2003-12-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
CN2445326Y (zh) * 2000-10-09 2001-08-29 刘永详 测定被糖化蛋白的免疫分析装置
RU2321630C2 (ru) 2001-08-03 2008-04-10 Гликарт Биотекнолоджи АГ Гликозилированные антитела (варианты), обладающие повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью
US6406926B1 (en) 2001-08-15 2002-06-18 Motorola, Inc. Method of forming a vacuum micro-electronic device
FI20011671A (fi) 2001-08-20 2003-02-21 Carbion Oy Tuumorispesifiset oligosakkaridisekvenssit ja niiden käyttö
DK1578771T3 (da) 2001-10-10 2013-06-10 Novo Nordisk As Remodellering og glycokonjugering af peptider
US7265085B2 (en) * 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US8323903B2 (en) * 2001-10-12 2012-12-04 Life Technologies Corporation Antibody complexes and methods for immunolabeling
AU2002351199A1 (en) 2001-11-28 2003-06-10 Neose Technologies, Inc. Glycoprotein remodeling using endoglycanases
CA2467509A1 (en) * 2001-12-14 2003-06-26 Eli Lilly And Company Recombinant bovine thrombin
WO2003083066A2 (en) * 2002-03-27 2003-10-09 Immunex Corporation Methods for increasing polypeptide production
CN1671673B (zh) * 2002-05-30 2010-05-26 斯克里普斯研究学院 铜催化的叠氮化物和乙炔的连接
ES2524767T3 (es) * 2002-06-14 2014-12-12 Immunomedics, Inc. Anticuerpo monoclonal humanizado HPAM4
DK3363809T3 (da) 2002-08-23 2020-05-04 Illumina Cambridge Ltd Modificerede nukleotider til polynukleotidsekvensering
US7052843B2 (en) * 2002-10-08 2006-05-30 New York University Transcription-based assay for identification of post-translational modification and its application in proteomics
AU2003297859A1 (en) * 2002-12-13 2004-07-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry
AU2004204463B2 (en) 2003-01-10 2009-02-12 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Catalytic domains of beta(1,4)-galactosyltransferase I having altered donor and acceptor specificities, domains that promote in vitro protein folding, and methods for their use
US7432372B2 (en) 2003-10-31 2008-10-07 Invitrogen Corporation Fluorinated resorufin compounds and their application
SG10202008722QA (en) 2003-11-05 2020-10-29 Roche Glycart Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
US20060263886A1 (en) 2003-11-14 2006-11-23 Eric Peters Fluorous labeling for selective processing of biologically-derived samples
US7070941B2 (en) * 2003-11-17 2006-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for tagging via azido substrates
WO2005051429A2 (en) † 2003-11-19 2005-06-09 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Targeted conjugates with a modified saccharide linker
ATE405831T1 (de) 2004-02-10 2008-09-15 Korea Basic Science Inst Methode zur analyse phosphorylierter stellen und selektives markierungsmittel
US7622279B2 (en) 2004-03-03 2009-11-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Photocleavable fluorescent nucleotides for DNA sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry
JP4601060B2 (ja) 2004-03-30 2010-12-22 ヤマサ醤油株式会社 アジド化アミノ糖ヌクレオチド及びその応用
US20080108557A1 (en) * 2004-09-29 2008-05-08 Novo Nordisk Healthcare A/G Modified Proteins
EP1809339A2 (en) 2004-10-07 2007-07-25 Koninklijke Philips Electronics N.V. Compounds, kits and methods for use in medical imaging
US20060147963A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 Affymetrix, Inc. Detection of polynucleotides on nucleic acid arrays using azido-modified triphosphate nucleotide analogs
SI1877415T1 (sl) * 2005-05-02 2011-01-31 Baseclick Gmbh Nove označevalne strategije za senzitivno detekcijo analitov
WO2007050811A2 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 The President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for labeling nucleic acids
US8114636B2 (en) * 2006-02-10 2012-02-14 Life Technologies Corporation Labeling and detection of nucleic acids
DK1991273T4 (da) 2006-02-10 2022-02-07 Life Technologies Corp Mærkning og påvisning af post-translationelt modificerede proteiner
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione
PT3134520T (pt) 2015-04-23 2018-03-26 Synaffix Bv Resumo
KR20210157943A (ko) 2020-06-22 2021-12-30 현대자동차주식회사 자율주행 차량용 통합조작장치
US11820402B2 (en) 2020-07-02 2023-11-21 Qualcomm Incorporated Motion sickness detection system for autonomous vehicles

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050130235A1 (en) * 2003-11-18 2005-06-16 Linda Hsieh-Wilson Method and compositions for the detection of protein glycosylation

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012035959; Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｖｏｌ．１２６，　Ｎｏ．１, 2004, ｐ．６-７ *
JPN6012035960; Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２７７，　Ｎｏ．２３, 2002, ｐ．２０８３３-２０８３９ *
JPN6012035961; Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１３, 2005, ｐ．５０２１-５０３４ *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015534996A (ja) * 2012-10-23 2015-12-07 シンアフィックス ビー．ブイ． 修飾抗体、抗体コンジュゲート及びそれらを調製する方法
JP2020090526A (ja) * 2012-10-23 2020-06-11 シンアフィックス ビー．ブイ． 修飾抗体、抗体コンジュゲート及びそれらを調製する方法
JP7167071B2 (ja) 2012-10-23 2022-11-08 シンアフィックス ビー．ブイ． 修飾抗体、抗体コンジュゲート及びそれらを調製する方法
JP2023017820A (ja) * 2012-10-23 2023-02-07 シンアフィックス ビー．ブイ． 修飾抗体、抗体コンジュゲート及びそれらを調製する方法
JP2016521714A (ja) * 2013-06-04 2016-07-25 トリビオティカ・エルエルシー 核酸に特異的なヘテロ化合物のテンプレート化アセンブリのための方法及び組成物
US10603385B2 (en) 2013-06-04 2020-03-31 Tribiotica Llc Methods and compositions for templated assembly of nucleic acid specific heterocompounds
JP2016538878A (ja) * 2013-10-14 2016-12-15 シンアフィックス ビー．ブイ． 糖鎖工学的に操作された抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらの調製方法
JP2020114818A (ja) * 2013-10-14 2020-07-30 シンアフィックス ビー．ブイ． 糖鎖工学的に操作された抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらの調製方法
JP7041182B2 (ja) 2013-10-14 2022-03-23 シンアフィックス ビー．ブイ． 糖鎖工学的に操作された抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらの調製方法
US10704084B2 (en) 2014-12-02 2020-07-07 Tribiotica Llc Methods and kits for theranostic applications
US11186839B2 (en) 2016-11-21 2021-11-30 Tribiotica Llc Methods for preventing titration of bimolecular templated assembly reactions by structurally-determined differential hybridizations
US11253536B2 (en) 2016-11-21 2022-02-22 Tribiotica Llc Methods for directed folding assembly or dimerization of proteins by templated assembly reactions

Also Published As

Publication number Publication date
US20070249014A1 (en) 2007-10-25
EP1987068B1 (en) 2018-08-08
EP2623610B1 (en) 2015-04-29
EP3438131A1 (en) 2019-02-06
EP1987068A1 (en) 2008-11-05
DK3438131T3 (da) 2022-04-11
EP2623986A3 (en) 2013-08-28
EP2623609A2 (en) 2013-08-07
WO2008029281A3 (en) 2009-09-11
EP1991273A2 (en) 2008-11-19
EP2623986B1 (en) 2017-06-14
US20140377837A1 (en) 2014-12-25
EP1991273B2 (en) 2022-01-05
US8716033B2 (en) 2014-05-06
US20140206848A1 (en) 2014-07-24
JP6646537B2 (ja) 2020-02-14
WO2008029281A2 (en) 2008-03-13
EP2623609A3 (en) 2013-08-28
US9645140B2 (en) 2017-05-09
DK1991273T4 (da) 2022-02-07
JP2018158943A (ja) 2018-10-11
JP2016190863A (ja) 2016-11-10
DK1987068T3 (en) 2018-09-03
US10676771B2 (en) 2020-06-09
US20150051096A1 (en) 2015-02-19
EP1991273A4 (en) 2010-09-22
US8785212B2 (en) 2014-07-22
EP4092418A1 (en) 2022-11-23
EP2623986A2 (en) 2013-08-07
US20070190597A1 (en) 2007-08-16
DK1991273T3 (da) 2013-09-08
WO2007095506A1 (en) 2007-08-23
EP3438131B1 (en) 2022-03-16
JP2015044828A (ja) 2015-03-12
US20110207171A1 (en) 2011-08-25
EP1987068A4 (en) 2012-12-26
EP1991273B1 (en) 2013-07-03
EP2623610A2 (en) 2013-08-07
US20170362624A1 (en) 2017-12-21
WO2007095506A8 (en) 2007-11-01
US20200216871A1 (en) 2020-07-09
US20120301894A1 (en) 2012-11-29
US20170166943A1 (en) 2017-06-15
EP2623610A3 (en) 2013-09-04
EP2623609B1 (en) 2017-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200216871A1 (en) Labeling and detection of post translationally modified proteins
US8323903B2 (en) Antibody complexes and methods for immunolabeling
US8114636B2 (en) Labeling and detection of nucleic acids
US20200179541A1 (en) Methods and compositions for enzyme-mediated site-specific radiolabeling of glycoproteins
DK3029461T3 (en) Haptenes, hapten conjugates, compositions thereof and processes for their preparation and use
US7595198B2 (en) Photocleavable isotope-coded affinity tags
JP2013056934A6 (ja) オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法
JP2013056934A (ja) オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法
JP2009531289A6 (ja) オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法
EP1627224A1 (en) Differential analysis of cell surface proteins on closed membrane structures by labelling with dyes in the presence of an internal standard
EP2516386B1 (en) Protein modification from the oxidation of clickable polyunsaturated fatty acid analogs
US20190154696A1 (en) Colorimetric Labeling and Detection Methods and Compositions
US11639342B2 (en) 1,3-dipolar cycloadditions, and Staudinger ligations for conjugating biomolecules using click chemistry

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20091207

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101108

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120711

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20121010

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20121017

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130111

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20130911