CN110093303A - 一种半固体培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种半固体培养基，特别是一种包含纤维素或甲基纤维素和琼脂糖的半固体培养基，所述半固体培养基的制备方法，及所述半固体培养基在细胞培养中的应用。各种类型的细胞在本发明的半固体培养基中均可以生长、增殖，简便易行、快速有效。

Description

一种半固体培养基及其应用
技术领域
本发明涉及一种半固体培养基及其在细胞培养及筛选中的应用，具体而言，涉及一种包含纤维素/甲基纤维素、琼脂糖的半固体培养基，所述半固体培养基的制备方法及其半固体培养基在细胞培养中的应用，属于细胞生物领域。
背景技术
细胞培养基是细胞赖以体外生长、繁殖、分化的重要因素。根据培养基的物理形态，可将其分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。柔软的浆糊状的半固体培养适合于观察微生物的运动、分类鉴定等用途。
但目前国际市场销售的半固体培养基种类不多，且价格昂贵。其中一些商品化半固体培养基也不利于有些细胞种类的生长，例如STEMCELL Technologies公司的ClonaCell-HY Medium D(03084)，是一种基于甲基纤维素的半固体培养基，可以用于杂交瘤的筛选和克隆，但用这种培养基进行细胞克隆时，细胞会浮在胶上，四处移动，非常难以挑选。又如MOLECULAR DEVICE的CloneMedia Hybridoma Semi-Solid Selection andCloning Medium(P/N K8865)，也是一种包含甲基纤维素的半固体培养基，可用于克隆形成，或者用于脾细胞和骨髓瘤细胞融合后的选择步骤等等，但该培养基不适合杂交瘤的生长，也需要昂贵的仪器设备配套，导致产品推广困难。
因此，市场急需要一种简便易行、快速有效、容易推广、适合各种细胞生长的半固体培养基。
发明内容
为了解决上述问题，本发明创造性劳动筛选出一种半固体培养基。
本发明提供了一种半固体培养基，其中所述半固体培养基包括半固体培养基质，所述半固体培养基质包括(1)纤维素或甲基纤维素和(2)琼脂糖。
优选的，所述纤维素或甲基纤维素和琼脂糖在水溶基质中含量为0.5-2.7％(w/v)，更优选的，所述浓度为0.9-2.0％(w/v)，最优为1.2-1.7％(w/v)。
进一步，所述半固体培养基质还包括下列其他凝胶剂的一种或者多种：软琼脂、胶原蛋白、纤维蛋白、水凝胶、凝胶、基质胶或其他类似胶凝剂。
优选的，上述其他胶凝剂在水溶基质中含量为0.1-3％(w/v)，更优选的，所述浓度为1.5-2.5％(w/v)。
进一步，所述半固体培养基还包括细胞培养液、细胞培养添加物、生长因子、细胞因子、血清和/或荧光检测剂。
更优选的，所述半固体培养基质最初是液体的，当物理状态变化时变为半固体状态。
进一步，所述物理状态变化是指温度变化，所述温度变化为高温降至40℃以下。
优选的，所述高温为60℃以上，最优选的，所述高温为60-80℃。
进一步，所述细胞培养液选自任一本领域的培养液，例如但不仅限于下列培养液中的一种：DMEM、DMEM/F-12、RPMI1640、MEM/opi-MEM、IMDM、CHO培养液、杂交瘤培养液(Hybridoma Medium)，各种表达培养液(Expression Medium)。
进一步，所述细胞培养添加物选自任一本领域的添加物，例如但不仅限于下列组分的一种或多种：MEM-非必须氨基酸溶液(MEM-Non-Essential Amino Acid solution)、葡萄糖、丙酮酸钠盐、L-谷氨酸/2-氨基戊二酸。
进一步，所述生长因子选自任一本领域的生长因子，例如但不仅限于下列组分中的一种或多种：表皮生长因子(Epidermal Growth Factors，EGF))、成纤维生长因子(Fibroblast Growth Factors，FGF))、血小板衍生生长因子(Platelet Derived GrowthFactor，PDGF))、胰岛素样生长因子(Insulin Like Growth Factor，IGF))。
进一步，所述细胞因子选自任一本领域的细胞因子，例如但不仅限于下列组分中的一种或多种：α-TNF、β-TNF、IL-2、IL-6、IL-4。
进一步，所述血清优选为胎牛血清(FBS)。
进一步，所述荧光检测剂选自任一本领域的检测剂，例如但不仅限于下列组分中的一种或多种：特异性抗体标记的RPE或FITC；进一步，所述抗体为抗鼠(mouse)IgG/A/M抗体、抗人IgG/A/M抗体、抗鼠(rat)IgG抗体、抗兔IgG抗体。
本发明还提供一种上述半固体培养基的制备方法，所述方法包括：
(1)将半固体培养基质与水混合，加热至基质完全融化，低温保存；
(2)使用前将半固体培养基质加热，然后冷却至室温，再添加其他组分。
优选的，所述方法中将半固体培养基质中除纤维素/甲基纤维素以外的组分与水混合，加热至60-80℃，然后加入纤维素/甲基纤维素完全融化，低温保存。
本发明也提供一种由上述方法制备得到的半固体培养基。
本发明还提供一种上述半固体培养基在培养细胞中的应用。
进一步，所述细胞可以是包括原核细胞和真核细胞在内的任何细胞类型。优选真核细胞。真核细胞可以包括但不限于哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。在优选实施例中，可以根据本发明使用的合适的细胞系包括任何转化的或永生化的哺乳动物细胞系。这些细胞如干细胞、COS-1，COS-7，HEK293，HK21，CHO，BSC-1，HepG2，653，SP2/0，293，NSO，DG44CHO，CHO K1，HeLa，骨髓瘤或者淋巴瘤细胞或其衍生的、永生或转化细胞，或上述细胞的融合细胞，例如蛋白生产细胞，B细胞，抗体产生细胞等各种杂交瘤细胞，分离或克隆的脾细胞，淋巴结细胞或类似细胞等等。
本领域公知，基质浓度是影响细胞生长的重要因素，高浓度基质将抑制细胞生长，只能在基质中形成极少的克隆，而基质浓度太低又不能阻止细胞沉降到培养板的底部，此时所有细胞都在底部生长，在基质中无法形成克隆，申请人经过无数次的实验，终于筛选出合适浓度的基质，本发明的半固体培养基质，它由经预处理的纤维素、琼脂糖等材料，优选的，含有多种细胞因子和添加物配制而成，采用组合的培养基质，并筛选出最优的含量，使得培养基既利于细胞的生长，又不会流动，沉淀到底部，极有利于各类细胞克隆的生长、增殖，尤其是杂交瘤细胞的生长增殖。进一步的，在高温条件下加入纤维素/甲基纤维素，可使得上述组分充分融化，避免了在常温甚至40℃左右加入时出现的颗粒，从而也有利于各类细胞克隆的生长、增殖。此外，培养基中还含有能与特异分泌蛋白共沉淀的荧光标记物，或识别膜蛋白的荧光标记物，可在6至10天后在荧光显微镜下清楚地辨别特异细胞克隆的位置，无需任何显微镜即可轻松快速地挑选出目标细胞克隆。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：细胞培养流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1半固体培养基质的优化实验
1、制备半固体培养基质：
称取以下各组分：
甲基纤维素 0.2g
琼脂糖 0.1g、0.3g、0.7g、1.0g、1.5g、1.8g、2.0g、2.5g(分别标记为第1-8组)。同时设定仅添加甲基纤维素1.2g或者琼脂糖1.2g为对照1组和对照2组。
注入100ml去离子水，于微波炉中加热二分钟至固体全部融化，于4℃保存。
使用前将半固体培养基置于微波炉加温一分钟，量取12ml至玻璃瓶中，冷却至约37℃，添加12ml室温下2X DEME细胞培养液，25μl鼠IL-6及250μl检测试剂goat anti-mouseIgG-FITC，混合均匀。
2、细胞培养
加入500μl鼠抗人PD-1杂交瘤细胞P1细胞(浓度为1.0*103cell/ml)至上述混合物中。
充分混匀后将混合液置于细胞培养器内，置于冰上15-20分钟至凝胶完全凝固。
将细胞培养器移入37℃，5％二氧化碳培养箱中温育。
细胞培养14天后，将细胞培养器移入超净台中挑选目标克隆。
3、实验结果：
培养基质的组分和浓度是影响细胞生长的重要因素，虽然有些文献认为0.5-5％甲基纤维素等胶凝剂均可作为良好的培养基质，但实验室的结果并非如此，如本实施例结果所示(参见表1)浓度为0.3-2.7％的甲基纤维素+琼脂糖对细胞生长的影响各不相同：
表1不同浓度的基质对细胞生长的影响
组别 细胞克隆数
1 41
2 101
3 123
4 216
5 232
6 112
7 89
8 78
对照1 97
对照2 86
实施例2半固体培养基培养鼠抗黄曲霉毒素B1亲本杂交瘤细胞
如图1所示，利用本发明半固体培养基培养细胞的步骤如下：
1、制备半固体培养基：
称取以下各组分：
注入100ml去离子水，于微波炉中加热二分钟至固体全部融化。冷却至50-60℃，于超净台内加入100mL 2X DMEM和20mL FBS，混匀，分装100mL/瓶后存入-20℃保存。
2、细胞培养
使用前将半固体培养基置于60℃水浴中约为30分钟至胶体完全融化，量取30ml移至50mL消毒离心管中，冷却至约37℃，加入100μl杂交瘤细胞(浓度：5000细胞/毫升)，25μl白介素6(浓度为1-10ug/mL),及250μl荧光标记检测试剂goat anti-mouse IgG-FITC，混合均匀，倒入蜂窝型细胞培养器后移至37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中温育。
细胞培养6-10天后，将细胞培养器移入超净台中挑选目标克隆。
3、实验结果：
孵育6-10天后，形成约320-660杂交瘤克隆。分泌抗体的阳性克隆被绿色荧光环绕，无需任何显微镜即可轻松快速地挑选出目标细胞克隆。挑选阳性克隆，转至96孔板进一步培养筛查其功能。
鼠抗黄曲霉毒素B1亲本杂交瘤细胞经下述方法制备：黄曲霉毒素B1-KLH免疫Balb/c小鼠，免疫的鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，以EELISA检测亲本克隆细胞。这种阳性亲本克隆只有一小部分分泌抗体，而大部分亲本杂交瘤细胞都不分泌抗体。利用一般的培养基很难从不分泌抗体的亲本杂交瘤细胞挑选出单克隆杂交瘤，而利用本发明的半固体培养基却可以很轻松快速的挑选出目标细胞克隆。
实施例3半固体培养基培养新融合的杂交瘤细胞
1、制备半固体培养基：
称取以下各组分：
纤维素 0.12g
胶原蛋白 0.18g
琼脂糖 1.30g
注入100ml去离子水，于微波炉中加热二分钟至固体全部融化，于4℃保存。
使用前将半固体培养基置于微波炉加温一分钟，量取12ml至玻璃瓶中，冷却至约37℃，添加24ml室温下2X DMEM(含2X HAT)细胞培养液，25μl鼠IL-6(4ng/ml)及250μl检测试剂goat anti-mouse IgG-RPE混合均匀。
2、细胞制备
黄曲霉毒素M1-KLH以常规方法免疫Balb/c小鼠，然后滴定免疫小鼠血清，从浓度最高的小鼠中获得脾细胞，以PEG方法将获得的1.0*108脾细胞和3.3*107的SP2/0骨髓瘤细胞融合。所有融合细胞在T150瓶中培养，100ml DMEM+10％FBS+1X HAT培养液，过夜。第二天，旋转下所有融合的杂交瘤细胞，然后在500μl杂交瘤培养液(1X DMEM+10％FBS+1X HAT)重悬培养。
3、细胞培养
加入上述培养的杂交瘤细胞至上述混合物中。
充分混匀后将混合液置于细胞培养器内，置于冰上15-20分钟至凝胶完全凝固。
将细胞培养器移入37℃，5％二氧化碳培养箱中温育。
细胞培养10-14天后，将细胞培养器移入超净台中挑选目标克隆。
4、实验结果：
孵育10-14天后，形成约450-760杂交瘤克隆。分泌抗体的阳性克隆被绿色荧光环绕，无需任何显微镜即可轻松快速地挑选出目标细胞克隆。挑选阳性克隆，转至96孔板进一步培养筛查其功能。
实施例4半固体培养基培养转染CHO-S细胞
1、制备半固体培养基
称取以下各组分：
将除甲基纤维素以外的组分注入100ml去离子水，于微波炉中加热二分钟至70℃左右固体全部融化，然后加入甲基纤维素至全部融化，于4℃保存。
使用前将半固体培养基置于微波炉加温一分钟，量取12ml至玻璃瓶中，冷却至约37℃，添加12ml室温下2X FreeStyleTM CHO Expression Medium细胞培养液(ThermoFisherScientific,12651022)，25μl IGF-1(10ng/ml)，250μl检测试剂rabbit anti human FLT3多克隆抗体-FITC，混合均匀.
2、细胞培养
加入500μl转染CHO-S细胞(Invitrogen,R8007)至上述混合物中。
充分混匀后将混合液置于细胞培养器内，置于冰上15-20分钟至凝胶完全凝固。
将细胞培养器移入37℃，5％二氧化碳培养箱中温育。
细胞培养6-10天后，将细胞培养器移入超净台中挑选目标克隆.
3、实验结果：
培养6-10天后，可见荧光阳性细胞克隆，形成约850-1500杂交瘤克隆。挑选阳性克隆转到96孔板进一步培养。
实施例5半固体培养基培养转染293H细胞
1、制备半固体培养基：
称取以下各组分：
注入100ml去离子水，于微波炉中加热二分钟至固体全部融化，于4℃保存。
使用前将半固体培养基置于微波炉加温一分钟，量取12ml至玻璃瓶中，冷却至约37℃，添加12ml室温下2X FreeStyleTM 293Expression Medium,细胞培养液(ThermoFisherScientific,12338001for 293H cells))，25μl细胞因子α-TNF及25μl IL-2，30μl EGF以及10ml胎牛血清，250μl检测试剂goat anti-Human IgG-FITC，混合均匀。
2、细胞制备
1ml 293H以human anti human FLT3单克隆抗体重链和载体质粒和human antihuman FLT3单克隆抗体轻链进行转染。10×106 293H细胞与10μg线性重链质粒和10μg线性轻链质粒经电穿孔方法((200V，1180uF))1ml转染缓冲液中转染。电穿孔后，置于T-75瓶中72h。复苏后以0.5μg/ml麦考苯酸(mycophenylic acid)选择2-5次。旋转下在抗生素选择培养基中转染的细胞，重悬在0.5ml FreeStyleTM 293Expression.Medium中培养。
3、细胞培养
加入500μl上述转染的293H细胞至上述混合物中。
充分混匀后将混合液置于细胞培养器内，置于冰上15-20分钟至凝胶完全凝固。
将细胞培养器移入37℃，5％二氧化碳培养箱中温育。
细胞培养10-14天后，将细胞培养器移入超净台中挑选目标克隆。
4、实验结果：
培养10-14天后，可见荧光阳性细胞克隆，形成约360-720杂交瘤克隆。挑选阳性克隆转到96孔板进一步培养。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种半固体培养基，其特征在于，所述半固体培养基包括半固体培养基质，所述半固体培养基质包括(1)纤维素或甲基纤维素和(2)琼脂糖。
2.如权利要求1所述的半固体培养基，其特征在于，所述纤维素或甲基纤维素和琼脂糖的含量在水溶基质中含量为0.5-2.7％(w/v)。
3.如权利要求1-2任一所述的半固体培养基，其特征在于，所述半固体培养基质还包括下列其他凝胶剂的一种或者多种：软琼脂、胶原蛋白、纤维蛋白、水凝胶、凝胶、基质胶或其他类似胶凝剂。
4.如权利要求1-3任一所述的半固体培养基，其特征在于，所述半固体培养基还包括细胞培养液、细胞培养添加物、生长因子、细胞因子、血清和/或荧光检测剂。
5.如权利要求1-4任一所述的半固体培养基，其特征在于，所述半固体培养基质最初是液体的，当物理状态变化时变为半固体状态。
6.一种权利要求1-5任一所述的半固体培养基的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将半固体培养基质与水混合，加热至基质完全融化，低温保存；
(2)使用前将半固体培养基质加热，然后冷却至室温，再添加其他组分。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中将半固体培养基质中除纤维素/甲基纤维素以外的组分与水混合，加热至60-80℃，然后加入纤维素/甲基纤维素完全融化，低温保存。
8.一种权利要求1-5任一所述的半固体培养基在细胞培养中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞是包括原核细胞和真核细胞在内的任何细胞类型。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞是真核细胞，优选的，所述真核细胞是哺乳动物细胞。
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