CN102533722A - 一种通过温度突变提高哺乳动物细胞重组蛋白瞬时表达的方法 - Google Patents
一种通过温度突变提高哺乳动物细胞重组蛋白瞬时表达的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102533722A CN102533722A CN2010106036579A CN201010603657A CN102533722A CN 102533722 A CN102533722 A CN 102533722A CN 2010106036579 A CN2010106036579 A CN 2010106036579A CN 201010603657 A CN201010603657 A CN 201010603657A CN 102533722 A CN102533722 A CN 102533722A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- transfection
- temperature
- temperature jump
- hours
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种通过改变转染前后细胞所处环境的温度来提高转染效率进而提高重组蛋白瞬时表达的办法，能使瞬时转染重组蛋白的表达量提高37％～56％。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是提供一种新的提高重组蛋白在哺乳动物细胞中的瞬时转染表达的方法。
背景技术
利用哺乳动物细胞生产重组蛋白的系统已经建立了较长时间。相对与低等真核细胞表达系统或者原核细胞表达系统，哺乳动物细胞系统生产的重组蛋白因为其具有能最佳的表达高分子量的蛋白质产物、使复杂结构的蛋白产生正确的折叠和给糖蛋白提供合适的翻译后修饰的功能而成为生物制药领域的表达重组蛋白的最佳选择【Chen P，Hutter D，Liu P，et al.Protein Expr Purif，2002；24(3)；481-488】。
传统的哺乳动物细胞表达系统是构建细胞稳定表达的将外源基因整合到宿主细胞染色体上的稳定株表达系统。构建稳定株表达系统生产重组蛋白需要在DNA导入细胞后进行长时间的筛选，然后才能确定表达量高并且稳定的细胞株，这个过程通常需要几个月的时间并且花费大量的人力来完成。
随着生命科学和生物制药的飞速发展，大量的蛋白被用于基础研究和药物开发，急需一个能在短时间内就能得到重组蛋白的方法。基因瞬时表达应运而生，与稳定株表达系统不同，瞬时转染的外源DNA不整合到宿主细胞DNA中，其在细胞中的数目通常随着细胞的分裂而减少，因此蛋白表达只能维持几天到十几天的时间，但其优点是能在短短几天之内拿到基因的表达产物，而且其通用性强【Cullen，B.R.(1987).Methods Enzymol.，152，684-704.Blasey，H.D.，Aubry，J.-P.，Mazzei，G.and Bernard，A.(1996).Cytotechnology，18，183-192.Cachianes，G.，Ho，C.，Weber，R.F.，Williams，S.R.，Goeddel，D.V.and Leung，D.W.(1993).Biotechniques，15，255-259.】。随着磷酸钙和PEI等价格低廉的转染试剂的使用，这项技术获得了很大的发展【Boussif，O.，Lezoualc’h，F.，Zanta，M.A.，Mergny，M.D.，Scherman，D.，Demeneix，B.and Behr，J.P.(1995)Proc.Natl Acad.Sci.USA，92，7297-7301】。但是相对于构建稳定株表达的系统来说，瞬时转染生产重组蛋白存在转染效率低、表达量低的缺点，使得此方法的应用受到较大的限制。因此怎样提高瞬时转染的效率、提高表达量成为亟待解决的问题。
之前已经有些提高瞬时转染蛋白表达的研究报道：比如优化构建适合瞬时转染的细胞和载体；选择合适细胞的转染试剂；优化转染试剂和DNA的比例；优化转染时的细胞密度；添加一些生长因子、程序性细胞死亡抑制剂或者与一些生长因子共转染表达；通过控制培养基的pH；转染后的细胞加入不同的蛋白水解物；在转染和表达过程中将细胞暴露于丁酸钠溶液来增加受感染细胞的百分数、诱导蛋白质的合成；使用2-氨基嘌呤来提高重组蛋白的表达量【DUROCHER，Y，et al.，Anal Biochem，2000.284(2)：p.316-26.BALDI，L，et al.，Biotechnol Prog，2005.21(1)：p.148-53.MEISSNER，P，et al.，Biotechnol Bioeng，2001.75(2)：p.197-203.STETTLER，M，et al.，Biotechnol Bioeng，2006.FUSSENEGGER，M，etal.，Nat Biotechnol，1998.16(5)：p.468-72】。通过上面的方法来提高细胞的转染效率和转染后细胞的高密度生长和蛋白表达。美国专利US2008/0145893将这些因素组合起来使用，达到了一个较高的表达量和转染效率，但其工艺复杂，所用试剂昂贵，不适合大规模推广使用。
Clodagh C.O′Shea报道称肿瘤细胞经高温后对病毒治疗更加敏感，其原因是热休克反应的诱导可使抗性肿瘤细胞中的治疗肿瘤的病毒ONYX-015的RNA输出功能得到恢复，使病毒能正常复制，从而杀死肿瘤细胞【Clodagh C.OShea，Conrado Soria，et al，Cancer Cell，Volume 8，Issue 1，61-74，1July 2005】。而且温度调节的方式之前也被广泛应用于各种系统的重组蛋白的表达：专利WO95.33825将温度调节方式用于细菌系统的蛋白表达，取得较好的效果。专利WO2006/026445在稳定株细胞表达重组蛋白过程中，通过温度的调节来改变细胞的代谢，从而达到提高蛋白或者多肽表达的目的。专利US2008/0145893中报道在转染后把培养温度降低到31℃可以增强CHO DG44细胞转染后的蛋白表达。虽然温度的调节应用与蛋白表达的研究很多，但是却没有在瞬时转染过程中利用短暂温度突变来增强细胞瞬时转染效率的报道。
基于此，本发明提供了一种简单易行并有效的方法，通过待转染细胞温度突变来提高重组蛋白瞬时表达的办法，能使重组蛋白的表达量提高37.3％～56.9％。
发明内容
重组蛋白具有很高的商业价值，然而目前使用的最多的是耗费大量人力和时间的稳定株的构建方法。基于外源基因瞬时表达的方法在速度和通用性上面具有很大的优点，而且在表达具有细胞毒性或者影响细胞分裂的蛋白上具有独特的优势。随着脂质体、磷酸钙和PEI等转染试剂的使用，这项技术获得了很大的应用。但是相对于构建稳定株表达系统来说，瞬时转染生产重组蛋白还是存在转染效率低、蛋白表达量低的缺点，使得此方法的应用受到较大的限制。
本发明提供了一种通过改变转染期间细胞所处环境的温度来提高转染效率进而提高重组蛋白瞬时表达的办法，能在原基础上，使重组蛋白的表达量提高37.3％～56.9％。并且简单易行，适合大规模推广。
本发明是在转染期间将细胞突变到较高的温度，使其更易于引入外源DNA，从而提高细胞的转染效率，转染完成后细胞回到正常温度培养，尽量保持细胞的正常的生长和表达环境，减少高温以及引入外源DNA对细胞的毒害，保持细胞的正常生长从而实现重组蛋白的高表达。
本发明的温度突变范围和幅度是随不同的细胞不同的转染方法而变化，本领域的普通技术人员能很容易的确定相应的温度突变的范围和幅度。在本发明的一个优选实施方案中，在进行转染期间将HEK 293细胞所处的培养温度从适宜生长的36.5℃突变到39℃，维持此温度至转染结束，然后在正常的温度下培养细胞进行蛋白表达。能使蛋白表达量显著提高。
本发明中的温度突变可以发生在外源DNA加入细胞培养液之前、外源DNA加入细胞培养液之后或从外源DNA加入细胞培养液之前延续到外源DNA加入细胞培养液之后。本领域的普通技术人员能很容易的确定不同转染方法的温度突变时间。
本发明中的细胞经过转染后，可以选择各种提高蛋白表达的方式来培养，比如进行流加培养、加入丁酸盐、降低表达温度等策略。本发明中的瞬时转染的方法与所有的提高细胞中重组蛋白表达的方法都可以组合使用，不受任何的限制。
本发明中用到的载体可以是任意的商业化载体，本领域的普通技术人员都能选择合适的载体来进行质粒构建。
本发明的方法适用于哺乳动物细胞的瞬时转染。本发明的具体实施例中，用HEK 293细胞和CHO细胞分别做了优化，两者的转染过程都对温度比较敏感，EGFR蛋白表达量分别提高达56.9％和56.2％。
本发明的方法适用于悬浮细胞或者贴壁细胞，在本发明的具体实施例中，分别用贴壁细胞和悬浮细胞来进行温度突变，都取得较好的效果。
本发明的方法适用于各种适合相应转染方法的培养基中。
本发明中的“温度突变”是指在特定的时机改变细胞培养温度，持续特定的时间后再恢复到突变前温度的过程。
本发明中的“瞬时表达”是指将外源DNA引入哺乳动物细胞，但外源DNA不整合在宿主细胞染色体上，而是以游离的形式被转录、翻译、最终表达出外源DNA编码的蛋白。
本发明中的“蛋白”是指被尽可能高量表达和收获的产物蛋白，它可以是任何有意义的蛋白、抗体、抗体片段或多肽。本发明的具体实施例中使用了一个EGFR蛋白和任意一个IgG抗体。产物收集以及用于纯化从培养物中获得蛋白的下游加工技术是本领域普通技术人员熟知的常规方式，包括但不限于：离心、超滤、离子交换层析、亲和纯化等技术。
本发明中的“转染”是指将外源DNA引入细胞的过程，当外源DNA通过细胞膜进入细胞内部则称此细胞被转染。本领域的普通技术人员熟知的多种转染技术，都能将一个或者多个核酸合成物比如质粒载体和其他的核酸分子引入细胞。本发明的方法适用于各种瞬时转染的方法，比如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染、活化的树状聚合物转染、多胺试剂转染。各种转染方法都可以在其各自优化的条件下进行。
本发明中的“单位时间单位细胞的表达率”“细胞表达率”“Qp”是指目标重组蛋白在单个细胞中的24小时的表达量。
本发明中的“表达量”是指目标蛋白的浓度，这个浓度可以是Elisa检测方法得来或者是经过下游蛋白纯化后得出的结果。
本发明作为简单易行并且有效的提高重组蛋白瞬时表达的方法，其具有非常大的商业价值，可以代替传统的构建细胞稳定株表达系统来生产诸如有细胞毒性的蛋白、阻断细胞分裂的蛋白。可以快速得到重组蛋白，对生命科学研究和药物开发有重大支撑作用。
附图说明
图1.三种温度下转染的HEK 293细胞在转染后的生长情况
图2.三种温度下转染的HEK 293细胞，转染后的细胞活率情况
图3.三种温度下转染的HEK 293细胞，转染后蛋白EGFR的表达情况
图4.三种温度下转染的HEK 293细胞，转染后的表达率(Qp)的变化
图5.温度突变开始的不同时间对HEK 293细胞转染后的生长的影响
图6.温度突变开始的不同时间对HEK 293细胞转染后蛋白EGFR的表达情况
图7.温度突变开始的不同时间对HEK 293细胞转染后表达率(Qp)的影响
图8.温度突变持续的不同时间对HEK 293细胞转染后蛋白EGFR的表达情况
图9.温度突变的开始的不同时间对CHO细胞转染后蛋白EGFR的表达情况
图10.温度突变持续的不同时间对CHO细胞转染后蛋白EGFR的表达情况
图11.温度突变对抗体表达量的影响
图12.温度突变对HEK 293贴壁细胞表达EGFR蛋白的影响
具体实施方式
材料和方法
材料
高效转染试剂Sinofection、带Fc标签的EGFR蛋白的质粒、IgG抗体质粒均来自于北京义翘神州生物技术有限公司(中国)
细胞培养
人胚肾细胞HEK 293细胞(ATCC)，用DMEM+10％FBS培养基在T75细胞培养瓶中培养，待丰度为90％左右，用胰酶消化传代细胞。放37℃，8％CO2培养箱中培养。转染前，取丰度为90％左右的细胞，胰酶消化计数。用DMEM+10％FBS的培养基将细胞稀释到0.9×106cells/ml，取0.4ml放24孔板的孔中，将细胞摇匀后放入37℃，8％CO2培养箱中培养3-5小时后转染。转染后将24孔板放37℃，8％CO2培养箱中继续培养，72小时时取样检测蛋白浓度。
人胚肾细胞HEK 293细胞经过悬浮驯化到SBI-293TM无血清培养基(北京义翘神州生物技术有限公司，中国)中，细胞每三天传代，传代起始密度为0.3-0.6×106cells/ml，细胞培养在摇瓶中进行，工作体积为总体积的15～35％，细胞培养瓶放在摇床中，摇床转速：100～130rpm，温度：36.5℃，二氧化碳：5％。转染前一天，取处于对数生长期的细胞，离心传代到细胞密度为0.5×106cells/ml，放摇床中，100～130rpm，36.5℃，5％CO2下培养，100ml的摇瓶中每瓶放30ml的培养物，第二天进行转染。转染后的细胞继续在100～130rpm，36.5℃，5％CO2摇床中培养，并于加入DNA-转染试剂复合物后的24小时开始每隔48小时加入1.2ml的200mM L-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液来进行培养，以提高细胞生长和重组蛋白的表达。转染后72小时和144小时取样检测细胞密度和蛋白浓度。
中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC)已经经过悬浮驯化到SBI-CHOTM无血清培养基中(北京义翘神州生物技术有限公司，中国)，细胞每三天传代，传代起始密度为0.3-0.6×106cells/ml，细胞培养在摇瓶中进行，工作体积为总体积的15～35％，细胞培养瓶放在摇床中，摇床转速：100rpm～130rpm，温度：36.5℃，二氧化碳：5％。转染前一天，取处于对数生长期的细胞，离心传代到细胞密度为0.5×106cells/ml，放摇床中，100～130rpm，36.5℃，5％CO2下培养，100ml的摇瓶中每瓶放30ml的培养物，第二天进行转染。转染后的细胞继续在100～130rpm，36.5℃，5％CO2摇床中培养，并于加入DNA-转染试剂复合物后的24小时开始每隔48小时加入1.2ml的200mM L-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液来进行培养以提高细胞生长和重组蛋白的表达。转染后72小时和144小时取样检测细胞密度和蛋白浓度。
转染
以转染30ml的细胞悬液为例：取30ug DNA稀释到1.5ml的150mM NaCl溶液中，混合均匀，取90ul的高效转染试剂Sinofection稀释到1.5ml的150mMNaCl溶液中，混合均匀，然后将两种溶液混合均匀，配制成DNA-Sinofection的混合液。室温下孵育10～20min，然后逐滴加入要转染的细胞悬浮液中。孔板中的转染，其所用DNA和转染试剂已及NaCl溶液的量按比例减少。
细胞计数
用血细胞计数器来计数细胞密度；用台盼蓝染色法来判断细胞的活率。
蛋白检测
采用双抗夹心酶联免疫(Elisa)检测样品中IgG抗体(Fc标签的蛋白)的含量。将抗人IgG(Fc)的特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加标准品及待测样品，样品及标准品中的人IgG(Fc)与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物；然后，加酶标记的抗人IgG(Fc)抗体，保温反应，固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检样中人IgG(Fc)的量相关。加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中Fc标签的蛋白(或人IgG抗体)的量。
以上方法均为生物技术领域的常规操作方法，为本领域的普通技术人员所熟知。
实施例1：温度突变对HEK 293细胞重组EGFR蛋白表达的影响
为了分析转染时细胞所处环境的温度的突变对细胞瞬时转染过程产生的影响，我们用编码带Fc标签的EGFR蛋白的质粒来进行如下实验。转染前1天，接种HEK 293细胞共9瓶，在36.5℃摇床中培养。转染前3小时分别各取3瓶放在温度为31℃和39℃的摇床中，另外3瓶继续放在36.5℃摇床中。3小时后进行转染。加入外源DNA-转染试剂复合物后，摇瓶分别放回各自31℃、36.5℃以及39℃的摇床中。3小时后，把所有的摇瓶均放在36.5℃的摇床中进行培养。所有细胞DNA-转染试剂复合物加入顺序随机，加入时间相差不超过5分钟。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后24小时开始每隔48小时加入1.2ml的200mML-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液来进行培养以提高细胞生长和重组蛋白的表达。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后72小时和144小时取样检测细胞密度和蛋白浓度。
由图1到图4可以看出：不同温度下转染的细胞，转染后的细胞生长和活率没有显著的差异，但经39℃温度突变的细胞的Qp明显要比其他温度下转染的细胞的Qp要高，增长幅度为43％。蛋白表达量也在39℃温度突变条件下转染的最高，比36.5℃条件下转染的蛋白表达量高32％。
实施例2：HEK 293细胞温度突变起始时间的确定
设计如下实验来确定HEK 293细胞的温度突变起始时间：转染前一天，接种HEK 293细胞共18瓶，分成6组，每组3个平行样，在36.5℃摇床中培养。第二天，在转染前的4小时，3小时，2小时，1小时分别从36.5℃摇床中取出1组3个摇瓶放入39℃的摇床中。这4组细胞在DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后继续放在39℃的摇床中3小时，然后转移到36.5℃的摇床中，继续培养。第5组(即0小时组)细胞在转染前放在36.5℃摇床中，DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后放在39℃摇床中3小时，然后转移到36.5℃摇床中。另外1组3个摇瓶(第6组)一直放在36.5℃摇床中不做温度突变，为对照组。所有细胞DNA-转染试剂复合物加入顺序随机，加入时间相差不超过5分钟。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后24小时开始每隔48小时加入1.2ml的200mML-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液来进行培养以提高细胞生长和重组蛋白的表达。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后72小时和144小时取样检测细胞密度和蛋白浓度。
由图5～7可以看出：细胞生长方面，转染前0-1小时进行温度突变对细胞生长有较大影响，其他时间进行温度突变对转染后细胞的生长没有明显的影响。在转染前0-4小时进行温度突变，单位细胞单位时间的表达率均有提高，提高幅度为17％-63％，而蛋白表达量最高提高44％。
实施例3：HEK 293细胞温度突变持续时间的确定
设计如下实验来确定HEK 293细胞温度突变的持续时间：转染前一天，正常处理细胞共18瓶分成6组，每组3个平行样，36.5℃摇床中正常培养，第二天，在转染前2小时将5组细胞从36.5℃摇床中取出放入39℃的摇床中培养。2小时后转染，在DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后取1组放回36.5℃摇床中继续培养(即0小时组)。另外4组放回39℃的摇床中培养，并在DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后1小时、2小时、3小时和4小时时分别取一组放回36.5℃摇床中继续培养。第6组为对照组，不进行温度突变，在转染前后均放置在36.5℃摇床中培养。所有细胞DNA-转染试剂复合物加入顺序随机，加入时间相差不超过5分钟。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后24小时开始每隔48小时加入1.2ml的200mM L-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液来进行培养以提高细胞生长和重组蛋白的表达。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后72小时和144小时取样检测细胞密度和蛋白浓度。
实验结果如图8所示：进行温度突变的组的蛋白表达量均比不进行温度突变的对照组高，增加幅度为32.3％-56.9％。
实施例4：CHO细胞温度突变起始时间的确定
设计如下实验实验来确定CHO细胞温度突变起始时间：转染前一天，接种CHO细胞共18瓶，分成6组，每组3个平行样，在36.5℃摇床中培养。第二天，在转染前的4小时，3小时，2小时，1小时分别从36.5℃摇床中取出1组细胞放入39℃的摇床中。这4组细胞在DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后继续放在39℃的摇床中培养，3小时后放回36.5℃的摇床中，继续培养。第5组(即0小时组)在转染前培养在36.5℃摇床中，DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后放入39℃的摇床中培养3小时，然后放到36.5℃的摇床中，继续培养。最后1组(第6组)细胞为对照组，不进行温度突变，在转染前后均放置在36.5℃摇床中培养。所有细胞DNA-转染试剂复合物加入顺序随机，加入时间相差不超过5分钟。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后24小时开始每隔48小时加入1.2ml的200mM L-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液来进行培养以提高细胞生长和重组蛋白的表达。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后72小时和144小时取样检测细胞密度和蛋白浓度。
由图9可以看出，转染前0-4小时进行温度突变，转染后蛋白的产量都高于对照，提高量为18.1％-47.8％。
实施例5：CHO细胞温度突变持续时间的确定
设计如下实验来确定细胞温度突变的持续时间：转染前一天，传代细胞共18瓶分成6组在36.5℃摇床中培养，第二天，在转染前2小时将5组细胞从36.5℃摇床中取出放入39℃的摇床中，1组在DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后马上放回36.5℃摇床中继续培养(即0小时组)，其他4组细胞放入39℃的摇床中培养，并分别在DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后1小时，2小时，3小时和4小时时将1组细胞放回36.5℃摇床中继续培养。剩余的一组作为对照组，不进行温度突变，一直在36.5℃摇床中培养。所有细胞DNA-转染试剂复合物加入顺序随机，加入时间相差不超过5分钟。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后24小时开始每隔48小时加入1.2ml的200mM L-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液来进行培养以提高细胞生长和重组蛋白的表达。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后72小时和144小时取样检测细胞密度和蛋白浓度。
实验结果如图10所示：进行温度突变的组的蛋白表达量均比不进行温度突变的组的高，增加幅度为：19.1％-56.2％。
实施例6：温度突变对抗体的表达的影响
设计如下实验来确定温度突变对HEK 293细胞瞬时转染生产抗体的影响：转染前一天，传代HEK 293细胞共6瓶分成2组36.5℃摇床中正常培养，每组3个平行样。第二天，在转染前的2小时将1组细胞从36.5℃摇床中取出放入39℃的摇床中，2小时后，取90ug编码一个IgG抗体轻链的质粒p-LC稀释到9ml的150mM的NaCl溶液中，混合均匀后，加入90ug编码此IgG抗体重链的质粒，重新混合均匀。另取540ul的转染试剂，稀释到9ml的150mM的NaCl溶液中，两者混合均匀配制成DNA-转染试剂复合物，室温下孵育10-20分钟，分别取3ml加入每瓶细胞悬浮液中，轻轻摇匀后，继续放入39℃的摇床中，另三瓶没有经过温度突变的细胞培养，作为对照组仍放在36.5℃的摇床中，所有细胞DNA-转染试剂复合物加入顺序随机，加入时间相差不超过5分钟。1小时后所有的培养瓶都放在36.5℃的摇床中，继续培养。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后24小时开始每隔48小时加入1.2ml的200mM L-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液来进行培养以提高细胞生长和重组蛋白的表达。DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后72小时和144小时取样检测细胞密度和蛋白浓度。
实验结果如图11所示：在HEK 293细胞中表达抗体，经过温度突变同样能导致表达量的增加，增加幅度达到37.3％。
实施例7：温度突变在贴壁细胞中的应用
用人胚肾细胞HEK 293贴壁细胞来考察贴壁情况下温度突变对细胞重组蛋白表达的影响。转染前1天，传代两组共6个摇瓶，每组三个平行样，在转染前的2小时，将其中一组细胞放入39℃的培养箱中，另一组作为对照不进行温度突变，2小时后进行转染，DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后将温度突变组细胞继续放39℃的培养箱中培养，1小时后放回36.5℃的培养箱中，DNA-转染试剂复合物加入细胞培养液后72小时取样检测EGFR的浓度。
结果如图12所示：由结果可以看出，进行温度突变后，EGFR的表达量提高49％。
Claims (7)
1.一种通过温度突变增强重组蛋白在哺乳动物细胞中瞬时表达的方法，其特征在于：
(1)温度突变发生在将外源DNA加入细胞培养液之前，升高细胞培养温度，持续至外源DNA加入细胞培养液后一段时间，再恢复至升高前水平；或
(2)温度突变发生在将外源DNA加入细胞培养液之前，升高细胞培养温度，持续一段时间后，再恢复至升高前水平，然后将外源DNA加入细胞培养液；或
(3)温度突变发生在将外源DNA加入细胞培养液之后，升高细胞培养温度，持续一段时间后，再恢复至升高前水平。
2.权利要求1中所述的方法，其中温度突变是从35.0～38.0℃，升高到38.5～42.0℃，再恢复至35.0～38.0℃。
3.权利要求1中所述的方法，其中温度突变开始时间发生在外源DNA加入细胞培养液之前的0-24小时，或之后的0-24小时。
4.权利要求1中所述的方法，其中温度突变持续时间为0-24小时。
5.权利要求1中所述的方法，其中哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚肾细胞(HEK293)、COS、BHK21、SP2/0或NIH/3T3。
6.权利要求1中所述的哺乳动物细胞为人胚肾细胞(HEK293)或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
7.权利要求1中所述的重组蛋白为蛋白、抗体、抗体片段、或多肽。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010603657.9A CN102533722B (zh) | 2010-12-24 | 2010-12-24 | 一种通过温度突变提高哺乳动物细胞重组蛋白瞬时表达的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010603657.9A CN102533722B (zh) | 2010-12-24 | 2010-12-24 | 一种通过温度突变提高哺乳动物细胞重组蛋白瞬时表达的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102533722A true CN102533722A (zh) | 2012-07-04 |
| CN102533722B CN102533722B (zh) | 2014-03-12 |
Family
ID=46341755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010603657.9A Active CN102533722B (zh) | 2010-12-24 | 2010-12-24 | 一种通过温度突变提高哺乳动物细胞重组蛋白瞬时表达的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102533722B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104611367A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-05-13 | 长沙赢润生物技术有限公司 | 一种变温转染技术 |
| CN105018527A (zh) * | 2015-07-30 | 2015-11-04 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种慢病毒转染鱼类或两栖类细胞系的方法 |
| CN113025648A (zh) * | 2019-12-09 | 2021-06-25 | 广东菲鹏制药股份有限公司 | Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1238807A (zh) * | 1996-11-01 | 1999-12-15 | 基因观测公司 | 稳定的瞬时基因表达 |
| CN1654071A (zh) * | 2004-02-12 | 2005-08-17 | 浙江省医学科学院 | 重组人角质细胞生长因子－2生物流体膜及其制备工艺方法 |
| CN101067137A (zh) * | 2007-05-16 | 2007-11-07 | 湖南省植物保护研究所 | 一种高效表达病毒基因dsRNA的载体及其应用 |
| CN101166827A (zh) * | 2005-04-29 | 2008-04-23 | 开普敦大学 | 在植物中表达蛋白质 |
-
2010
- 2010-12-24 CN CN201010603657.9A patent/CN102533722B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1238807A (zh) * | 1996-11-01 | 1999-12-15 | 基因观测公司 | 稳定的瞬时基因表达 |
| CN1654071A (zh) * | 2004-02-12 | 2005-08-17 | 浙江省医学科学院 | 重组人角质细胞生长因子－2生物流体膜及其制备工艺方法 |
| CN101166827A (zh) * | 2005-04-29 | 2008-04-23 | 开普敦大学 | 在植物中表达蛋白质 |
| CN101067137A (zh) * | 2007-05-16 | 2007-11-07 | 湖南省植物保护研究所 | 一种高效表达病毒基因dsRNA的载体及其应用 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104611367A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-05-13 | 长沙赢润生物技术有限公司 | 一种变温转染技术 |
| CN105018527A (zh) * | 2015-07-30 | 2015-11-04 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种慢病毒转染鱼类或两栖类细胞系的方法 |
| CN105018527B (zh) * | 2015-07-30 | 2018-04-20 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种慢病毒转染鱼类或两栖类细胞系的方法 |
| CN113025648A (zh) * | 2019-12-09 | 2021-06-25 | 广东菲鹏制药股份有限公司 | Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法及其应用 |
| CN113025648B (zh) * | 2019-12-09 | 2023-06-02 | 广东菲鹏制药股份有限公司 | Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102533722B (zh) | 2014-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104024423B (zh) | 用于降低抗体异质性的方法和产生其抗体的方法 | |
| CN105189735B (zh) | 在培养期间减少乳酸累积的方法和生产多肽的方法 | |
| CN107523588B (zh) | 一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用 | |
| CN103320390B (zh) | 一种大规模哺乳动物工程细胞培养方法 | |
| EP2970915B1 (en) | Methods and compositions for generating stable transfected cells | |
| CN114085841B (zh) | 一种cho细胞基因nw_003614092.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用 | |
| JP2022540920A (ja) | 高密度連続接種の細胞培養方法及びその応用 | |
| CN102586190B (zh) | 高效表达重组人神经生长因子的cho细胞株及其构建方法 | |
| CN102533722B (zh) | 一种通过温度突变提高哺乳动物细胞重组蛋白瞬时表达的方法 | |
| CN102369279A (zh) | 新型永久人细胞系 | |
| CN102453716A (zh) | 猪骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的克隆及应用 | |
| CN1869214A (zh) | 一种高效表达目的蛋白的方法 | |
| CN105238816A (zh) | 一种表达载体 | |
| CN107760650A (zh) | 一种改造的cho细胞及其用途 | |
| CN105695494A (zh) | 一种三顺反子表达载体、制备方法及应用 | |
| CN102533721A (zh) | 一种通过渗透压突变提高重组蛋白瞬时表达的方法 | |
| Suarez-Patino et al. | Transient expression of rabies virus glycoprotein (RVGP) in Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2) cells | |
| CN104342454A (zh) | 用于用动物细胞大量生产源自外源基因的蛋白质的表达载体及其应用 | |
| JP6469371B2 (ja) | 人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法 | |
| CN102392047A (zh) | 一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体及其应用 | |
| WO2022243320A1 (en) | Method for producing a biomolecule by a cell | |
| CN112626028B (zh) | 一种激活nk样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用 | |
| CN109402096B (zh) | 一种aid酶突变体及其应用 | |
| CN102559750B (zh) | 一种抗体的高效表达载体及其制备方法 | |
| US20240167006A1 (en) | High production of recombinant protein by making cell hybrids and enriching for a preferred mitochondrial phenotype |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170418 Address after: Section seven economic and Technological Development Zone of Beijing City Hospital No. 31 100176 Street Patentee after: Beijing China Science and Technology Co., Ltd. Address before: 100176 Beijing economic and Technological Development Zone, Zhong Jie, No. 14 B-203 Patentee before: Beijing Yiqiao Shenzhou Biological Technology Co.,Ltd. |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Zhao Shuhuan Document name: Notification of Passing Examination on Formalities |
|
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Room 306, building 9, yard 18, Kechuang 10th Street, Daxing Economic and Technological Development Zone, Beijing 100176 Patentee after: Beijing Yiqiao Shenzhou Polytron Technologies Inc Address before: Section seven economic and Technological Development Zone of Beijing City Hospital No. 31 100176 Street Patentee before: SINO BIOLOGICAL Inc. |