JP2020114818A - 糖鎖工学的に操作された抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらの調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書及び特許請求の範囲において使用する動詞「含むこと(to comprise)」、並びにその語形変化は、非限定的な意味で使用され、その単語に続く項目が含まれるが、具体的に明記されていない項目が除外されるわけではないことを意味する。
本発明は、修飾抗体を調製する方法であって、好適な触媒の存在下で、モノサッカライド誘導体Su(A)xを近位N−結合型GlcNAc残基に結合させるステップを含み、好適な触媒が、Su(A)xが基質である触媒として定義され、Su(A)xがx個の官能基Aを含むモノサッカライド誘導体Suとして定義され、xが1、2、3又は4であり、Aが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択され、前記近位N−結合型GlcNAc残基が、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に1つのN−結合型グリコシル化部位を含むIgG抗体のN−結合型グリコシル化部位に結合しており、前記N−結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異N−結合型グリコシル化部位であり、前記近位N−結合型GlcNAc残基が、任意選択でフコシル化されている、方法に関する。
によるものである。
(1) 単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に1つのN−結合型グリコシル化部位を含むIgG抗体を用意するステップであって、N−結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異N−結合型グリコシル化部位であり、近位N−結合型GlcNAc残基が、前記グリコシル化部位において抗体に結合している、ステップ、及び
(2) 好適な触媒の存在下で、モノサッカライド誘導体Su(A)xを近位N−結合型GlcNAc残基に結合させるステップであって、好適な触媒が、Su(A)xが基質である触媒として定義され、Su(A)xがx個の官能基Aを含むモノサッカライド誘導体Suとして定義され、xが1、2、3又は4であり、Aが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択され、前記近位N−結合型GlcNAc残基が、任意選択でフコシル化されている、ステップ
を含む。
(1) 単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に1つのN−結合型グリコシル化部位を含むIgG抗体を用意するステップであって、N−結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異N−結合型グリコシル化部位である、ステップ、及び
(2) エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼの作用により、前記グリコシル化部位に結合しているオリゴサッカライドをトリミングして、前記グリコシル化部位における近位N−結合型GlcNAc残基を得るステップ、及び
(3) 好適な触媒の存在下で、モノサッカライド誘導体Su(A)xを近位N−結合型GlcNAc残基に結合させるステップであって、好適な触媒が、Su(A)xが基質である触媒として定義され、Su(A)xがx個の官能基Aを含むモノサッカライド誘導体Suとして定義され、xが1、2、3又は4であり、Aが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される、ステップ、
を含み、
ステップ(2)及び(3)における前記近位N−結合型GlcNAc残基が、任意選択でフコシル化されている。
(i) 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、297位のN−グリコシル化部位が除去されており、重鎖の改変されたアミノ酸鎖が、その野生型対応物と比べると、1つの改変されたN−グリコシル化部位を含み、
(ii) 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、297位のN−グリコシル化部位が除去されており、軽鎖が、その野生型対応物と比べると、1つの改変されたN−グリコシル化部位を含む。
(i) 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、297位のN−グリコシル化部位が除去されており、重鎖の改変されたアミノ酸鎖が、その野生型対応物と比べると、1つの改変されたN−グリコシル化部位を含む;又は、
(ii) 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、297位のN−グリコシル化部位が除去されており、軽鎖が、その野生型対応物と比べると、1つの改変されたN−グリコシル化部位を含む。
(i) 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、297位のN−グリコシル化部位が除去され、重鎖の改変されたアミノ酸鎖が、コンセンサス配列Asn−X−Ser/Thrを含み、Xは、Proを除く任意のアミノ酸である;又は
(ii) 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、297位のN−グリコシル化部位が除去され、軽鎖のアミノ酸が、コンセンサス配列Asn−X−Ser/Thrを含み、Xは、Proを除く任意のアミノ酸である。
本発明はさらに、本発明による修飾抗体を調製する方法により得ることができる、修飾抗体に関する。前記方法、及びその好ましい実施形態は、上で詳細に記載されている。抗体を修飾する方法の好ましい実施形態はまた、その方法により得ることができる修飾抗体にも該当する。
(式中、
Abは、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に1つの(かつ、1を超えない)N−結合型グリコシル化部位を含むIgG抗体を表し、N−結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異N−結合型グリコシル化部位であり、Su(A)及びxは、上記の通りであり、bは0(フコシル化されていない)又は1(フコシル化されている)である)
である。
本発明はさらに、抗体コンジュゲートの調製における、本発明による修飾抗体の使用であって、抗体コンジュゲートが、リンカーLを介して対象の分子Dにコンジュゲートされている抗体として定義される、使用に関する。
である。
(a) 修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、(ヘテロ)シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び1つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
(b) 修飾抗体がケト修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、一級アミン基、アミノオキシ基若しくはヒドラジニル基、及び1つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
(c) 修飾抗体がアルキン修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、アジド基、ニトロン若しくはニトリルオキシド、及び1つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
(d) 修飾抗体がチオール修飾抗体若しくはメルカプトアセトアミド修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、N−マレイミド基若しくはハロゲン化アセトアミド基若しくは末端アルケン、及び1つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
(e) 修飾抗体がハロゲン修飾抗体、ハロゲン化アセトアミド修飾抗体、スルホニルオキシ修飾抗体若しくはスルホニル化ヒドロキシアセトアミド修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、チオール基及び1つ若しくは複数の対象の分子を含む。
(式中、
Lは、リンカーであり、
Dは、対象の分子であり、
rは、1〜20であり、
R1は、水素、ハロゲン、−OR5、−NO2、−CN、−S(O)2R5、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、(ヘテロ)アリール基、アルキル(ヘテロ)アリール基及び(ヘテロ)アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、2つの置換基R1は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している(ヘテロ)アレーン置換基を形成していてもよく、R5は、水素、ハロゲン、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Zは、C(R1)2、O、S又はNR2であり、R2は、R1又はL(D)rであり、L、D及びrは上で定義されている通りであり、
qは、0又は1であるが、但し、qが0である場合、ZはN−L(D)rであることを条件とし、
aは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、
a’は、0、1、2、3、4、5、6、7又は8であり、
a’’は、0、1、2、3、4、5、6、7又は8であり、
a’+a’’<10であり、
Xは、F、Cl、Br又はIであり、
R8は、R1又は−L(D)rであり、好ましくは水素、−L(D)r又はC1〜C24アルキル基であり、より好ましくは、水素、−L(D)r又はC1〜C6アルキル基である)
からなる群から選択される。
(式中、
Lは、リンカーであり、
Dは、対象の分子であり、
rは、1〜20であり、
R1は、水素、ハロゲン、−OR5、−NO2、−CN、−S(O)2R5、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、(ヘテロ)アリール基、アルキル(ヘテロ)アリール基及び(ヘテロ)アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、2つの置換基R1は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している(ヘテロ)アレーン置換基を形成していてもよく、R5は、水素、ハロゲン、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Zは、C(R1)2、O、S又はNR2であり、R2は、R1又はL(D)rであり、L、D及びrは上で定義されている通りであり、
qは、0又は1であるが、但し、qが0である場合、ZはN−L(D)rであることを条件とし、
aは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)
であるのが好ましい。
(式中、
Lは、リンカーであり、
Dは、対象の分子であり、
rは、1〜20であり、
R1は、水素、ハロゲン、−OR5、−NO2、−CN、−S(O)2R5、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、(ヘテロ)アリール基、アルキル(ヘテロ)アリール基及び(ヘテロ)アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、2つの置換基R1は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している(ヘテロ)アレーン置換基を形成していてもよく、R5は、水素、ハロゲン、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Zは、C(R1)2、O、S又はNR2であり、R2は、R1又はL(D)rであり、L、D及びrは上で定義されている通りであり、
qは、0又は1であるが、但し、qが0である場合、ZはN−L(D)rであることを条件とし、
a’は、0、1、2、3、4、5、6、7又は8であり、
a’’は、0、1、2、3、4、5、6、7又は8であり、
a’+a’’<10である)
である。
(式中、
R1、L、D及びrは上で定義した通りであり、
Yは、O、S又はNR2であり、R2は上で定義されている通りであり、
R3は、水素、ハロゲン、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
R4は、水素、Y−L(D)r、−(CH2)n−Y−L(D)r、ハロゲン、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基は、任意選択で、O、N及びSからなる群から選択される複数のヘテロ原子の1個により分断されており、アルキル基、(ヘテロ)アリール基、アルキル(ヘテロ)アリール基及び(ヘテロ)アリールアルキル基は、任意選択で独立して置換されており、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)
を有する。
(式中、Y、L、D、n及びrは、上で定義されている通りである)を有する。rが1又は2であるのが好ましく、rが1であるのがより好ましい。
(1) 単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に1つのN−結合型グリコシル化部位を含むIgG抗体を用意するステップであって、N−結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異N−結合型グリコシル化部位である、ステップ、
(2) エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼの作用により、前記グリコシル化部位に結合しているオリゴサッカライドをトリミングして、前記グリコシル化部位における近位N−結合型GlcNAc残基を得るステップ、及び
(3) 好適な触媒の存在下で、モノサッカライド誘導体Su(A)xを前記近位N−結合型GlcNAc残基に結合させるステップであって、好適な触媒が、Su(A)xが基質である触媒として定義され、Su(A)xがx個の官能基Aを含むモノサッカライド誘導体Suとして定義され、xが1、2、3又は4であり、Aが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される、ステップ、
(4) 近位N−結合型GlcNAc−Su(A)x置換基をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって、前記リンカーコンジュゲートが官能基(B)及び対象の分子(D)を含み、前記官能基(B)が、前記GlcNAc−Su(A)x置換基の官能基(A)と反応する能力のある官能基であり、Su(A)xが、上で定義されている通りであるが、但し、Aはチオール基前駆体ではないことを条件とする、ステップ、
を含み、
ステップ(2)、(3)及び(4)における近位N−結合型GlcNAc残基は、任意選択でフコシル化されている。
本発明はさらに、本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法により得ることができる、抗体コンジュゲートに関する。
によるものである。
(式中、
Abは、抗体であり、
Suは、糖誘導体であり、
Lは、リンカーであり、
Dは、対象の分子であり、
bは、0又は1であり、
rは、1〜20であり、
xは、1、2、3又は4であり、
pは、0又は1であり、
Qは、−N(H)C(O)CH2−又はCH2であり、
R9は、L(D)r、水素、C1〜C24アルキル基、C6〜C24アリール基、C7〜C24アルキルアリール基及びC7〜C24アリールアルキル基からなる群から選択され、C1〜C24アルキル基、C6〜C24アリール基、C7〜C24アルキルアリール基及びC7〜C24アリールアルキル基は、任意選択で置換されている)によるものである。好ましくはR9が、L(D)r、水素、C1〜C12アルキル基、C6〜C12アリール基、C7〜C12アルキルアリール基及びC7〜C12アリールアルキル基からなる群から選択され、C1〜C12アルキル基、C6〜C12アリール基、C7〜C12アルキルアリール基及びC7〜C12アリールアルキル基は、任意選択で置換されている。より好ましくはR9が、L(D)r、水素、C1〜C6アルキル基、C6〜C12アリール基、C7〜C12アルキルアリール基及びC7〜C12アリールアルキル基からなる群から選択され、C1〜C6アルキル基、C6〜C12アリール基、C7〜C12アルキルアリール基及びC7〜C12アリールアルキル基は、任意選択で置換されている。さらにより好ましくはR9が、H、C1、C2、C4又はC4アルキル又はC6〜C12アリールである。最も好ましくはR9が、H又はメチルである。
(式中、
Abは、抗体であり、
Suは、糖誘導体であり、
Lは、リンカーであり、
Dは、対象の分子であり、
bは、0又は1であり、
rは、1〜20であり、
xは、1、2、3又は4であり、
yは、1〜20であり、
R1は、水素、ハロゲン、−OR5、−NO2、−CN、−S(O)2R5、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、(ヘテロ)アリール基、アルキル(ヘテロ)アリール基及び(ヘテロ)アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、2つの置換基R1は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している(ヘテロ)アレーン置換基を形成していてもよく、R5は、水素、ハロゲン、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Zは、C(R1)2、O、S又はNR2であり、R2は、R1又はL(D)rであり、L、D及びrは上で定義されている通りであり、
pは、0又は1であり、
Qは、−N(H)C(O)CH2−又は−CH2−であり、
qは、0又は1であるが、但し、qが0である場合、ZはN−L(D)rであることを条件とし、
aは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)
によるものである。
(式中、
Abは、抗体であり、
Suは、糖誘導体であり、
Lは、リンカーであり、
Dは、対象の分子であり、
bは、0又は1であり、
rは、1〜20であり、
xは、1、2、3又は4であり、
yは、1〜20であり、
R1は、水素、ハロゲン、−OR5、−NO2、−CN、−S(O)2R5、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、(ヘテロ)アリール基、アルキル(ヘテロ)アリール基及び(ヘテロ)アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、2つの置換基R1は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している(ヘテロ)アレーン置換基を形成していてもよく、R5は、水素、ハロゲン、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Zは、C(R1)2、O、S又はNR2であり、R2は、R1又はL(D)rであり、L、D及びrは上で定義されている通りであり、
pは、0又は1であり、
Qは、−N(H)C(O)CH2−又は−CH2−であり、
qは、0又は1であるが、但し、qが0である場合、ZはN−L(D)rであることを条件とし、
a’は、0、1、2、3、4、5、6、7又は8であり、
a’’は、0、1、2、3、4、5、6、7又は8であり、
a’+a’’<10である)
によるものである。
本発明による抗体コンジュゲートの特に好ましい実施形態では、対象の分子は、薬学的に活性な物質からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、活性物質は、薬物及びプロドラッグからなる群から選択される。対象の分子は、低から中程度の分子量化合物からなる群から選択されるのがさらにより好ましい。対象の分子は、細胞毒、抗ウイルス剤、抗菌剤、ペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるのがより好ましく、対象の分子は、細胞毒であるのが最も好ましい。さらなる好ましい実施形態では、対象の分子は、コルヒチン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアマイシン、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン、デボーガニン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン又はピロロベンゾジアゼピン(PBD)からなる群から選択される。好ましい実施形態では、細胞毒は、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン及びピロロベンゾジアゼピン(PBD)からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、細胞毒は、コルヒチン、ビンカアルカロイド、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン及びデボーガニンからなる群から選択される。
実施例1.BCN−PEG2−OSuカーボネート(33)の合成
N,N’−ジスクシンイミジルカーボネート(1.82g、7.11mmol)のMeCN(50mL)溶液をアルゴン下で調製した。BCN−PEG2−OH(1.0g、3.55mmol)のMeCN(50mL)溶液を3時間かけて滴下して加えた。さらなる撹拌を1時間行った後、この反応混合物を、EtOAc/H2O(150mL/150mL)の混合物に注いだ。層を分離し、水層をEtOAc(150mL)により抽出した。合わせた有機層を乾燥(Na2SO4)して濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物が無色油状物(0.79g、2.81mmol、79%)として得られた。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)5.19(bs,1H)、4.50−4.42(m,2H)、4.16(d,J=8.0Hz,2H)、3.77−3.71(m,2H)、3.57(t,J=5.1Hz,2H)、3.39(dd,J=10.5,5.4Hz、2H)、2.85(s,4H)、2.35−2.16(m,6H)、1.65−1.51(m,2H)、1.41−1.34(m,1H)。
Val−Cit−PAB−MMAF.TFA(17.9mg、14.3μmol)のDMF(2mL)溶液に、BCN−PEG2−C(O)OSu(17.9mg、14.3μmol)(33)をDMF(0.78mL)溶液として、及びトリエチルアミン(6.0μL)を加えた。逆相HPLC(C18、グラジエントH2O/MeCN1%AcOH)による精製後、生成物(7mg、5μmol、35%)が得られた。LRMS(HPLC、ESI+)C74H114N11O18(M+H+)計算値1444.83、実測値1445.44。
MeCN(2mL)中のVal−Cit−PABA−β−アラニノイル−マイタンシノイド(Concortisから市販)(27mg、0.022mmol)の懸濁液に、トリエチルアミン(9.2μL、6.7mg、0.066mmol)及びBCN−PEG2−OSuカーボネート33(9.2mg、0.022mmol)のMeCN(1mL)溶液を加えた。23時間後、この混合物を、EtOAc(20mL)と水(20mL)との混合物に注いだ。分離後、有機相を乾燥(Na2SO4)し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー(EtOAc→MeOH/EtOAc 1/4)による精製後、22mg(0.015mmol、70%)の所望の生成物35が得られた。LRMS(ESI+)C70H97ClN10O20(M+H+)計算値1432.66、実測値1434.64。
天然のトラスツズマブと変異体抗体の両方を、Evitria(Zurich、スイス)により、CHO K1細胞において一過的に発現させ、プロテインAセファロースを使用して精製し、質量分析により分析した。
全容積約70μLでの、50μg(修飾されている)IgG、1M Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTA及び30mM DTTの溶液を、37℃で20分間、インキュベートし、ジスルフィド架橋を還元して、軽鎖と重鎖の両方を分析できるようにした。存在する場合、アジド官能基をこれらの条件下で、アミンに還元する。還元済み試料をAmicon Ultra−0.5、Ultracel−10 Membrane(Millipore)を使用するmilliQにより3回、洗浄し、10μMの(修飾されている)IgGまで濃縮した。JEOL AccuTOFで、還元済みIgGをエレクトロスプレーイオン化飛行時間法(ESI−TOF)により分析した。Magtranソフトウェアを使用してデコンボリューション(deconvoluted)したスペクトルを得た。
IgGグリカンのトリミングは、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Genovis(スウェーデン)から市販)由来のエンドSを使用して行った。このIgG(10mg/mL)を、25mM Tris(pH8.0)中、エンドS(最終濃度40U/mL)と共に37℃で16時間、インキュベートした。
エルザベトキンギア・ミリコラ(Elizabethkingia miricola)(QA Bioから市販)に由来するエンドF2、又はエルザベトキンギア・メニンゴセプチクム(Elizabethkingia meningosepticum)(QA Bioから市販)に由来するエンドF3を使用して、IgGグリカンのトリミングを行った。100mMクエン酸ナトリウム(pH4.5)中、このIgG(10mg/mL)を、37℃で16時間、エンドF2(100mU/mL IgG)又はエンドF3(25mU/mg IgG)と共にインキュベートした。脱グリコシル化したIgGを濃縮し、Amicon Ultra−0.5、Ultracel−10Membrane(Millipore)を使用して、25mM Tris−HCl(pH8.0)により洗浄した。
グリコシル化物のG0、G0F、G1F及びG2Fアイソフォームに相当する50444、50591及び50753及び50914Daの基準MSピークを有するトラスツズマブに、上記のエンドSを用いるトリミングプロトコルを施した。ピークをデコンボリューションした後、質量スペクトルにより、軽鎖のピーク1つ、及び重鎖のピークが2つ示された。重鎖の2つのピークは、コアGlcNAc(Fuc)置換トラスツズマブに起因する1つの主要生成物(49496Da、総重鎖の90%)、及びコアGlcNAc置換トラスツズマブに起因する少量の生成物(49351Da、総重鎖の±10%)に属した。
グリコシル化アイソフォームG2F、G2FS及びG2FS2に相当する50934、51225及び51516Daの主要な基準MSピークを有するトラスツズマブ−(N297Q、L196N)変異体に、上記のエンドF3を用いるトリミングプロトコルを施した。ピークをデコンボリューション(deconvolution)した後の質量スペクトルにより、コアGlcNAc(Fuc)置換トラスツズマブ(N297Q、L196N)変異体に由来する、軽鎖のピークが1つ、及び重鎖(49514Da、重鎖全体の90%)の主要ピークが1つ、示された。上記のエンドF3の代わりにエンドF2を用いてインキュベートすると、同一のコアGlcNAc(Fuc)置換重鎖生成物が得られた。一方、トラスツズマブ(N297Q、L196N)変異体は、エンドSの作用による加水分解に完全に不活性であった。
グリコシル化アイソフォームG2F、G2FS及びG2FS2に相当する50961、51251及び51542Daの主要な基準MSピークを有するトラスツズマブ−(N297Q、G164S)変異体に、上記のエンドF3を用いるトリミングプロトコルを施した。ピークをデコンボリューションした後の質量スペクトルにより、コアGlcNAc(Fuc)置換トラスツズマブ(N297Q、G164S)に由来する、軽鎖のピークが1つ、及び重鎖(49537Da、重鎖全体の90%)の主要ピークが1つ、示された。
グリコシル化アイソフォームG2F、G2FS及びG2FS2に相当する50934、51227及び51517Daの主要な基準MSピークを有するトラスツズマブ−(N297Q、V363T)変異体に、上記のエンドF3を用いるトリミングプロトコルを施した。ピークをデコンボリューションした後の質量スペクトルにより、コアGlcNAc(Fuc)置換トラスツズマブ−(N297Q、V363T)変異体に由来する、軽鎖のピークが1つ及び軽鎖のピークが1つ及び重鎖(49515Da、重鎖全体の90%)の主要ピークが1つ示された。同様に、上記のエンドF2を用いてインキュベートすると、コアGlcNAc(Fuc)置換重鎖生成物が得られた。
IgGへの修飾糖の酵素による導入は、ウシβ(1,4)−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異体であるβ(1,4)−Gal−T1(Y289L)を用いて行った。10mM MnCl2及び25mM Tris−HCl(pH8.0)中で、脱グリコシル化されたIgG(上記の通り調製、10mg/mL)を、UDP−糖28〜31の1つに由来する修飾UDP−糖誘導体(0.4mM)及びβ(1,4)−Gal−T1(Y289L)(1mg/mL)と共に、30℃で15時間、インキュベートした。
脱グリコシル化トラスツズマブに、UDP−GalNAz28を用いて、上記のグリコシル転移プロトコルを施した。プロテインAの親和力による精製後、質量スペクトル分析により、GalNAzからコアGlcNAc(Fuc)置換トラスツズマブへの転移に由来する主要生成物(49713Da、重鎖全体の90%)が1つ、及びGalNAzからコアGlcNAc置換トラスツズマブへの転移に由来する少量生成物(49566Da、重鎖全体の±10%)の形成が示された。
トラスツズマブ−(N297Q、L196N)、トラスツズマブ−(N297Q、G164S)及びトラスツズマブ−(N297Q、V363T)に、UDP−GalNAz28を用いて、上記のグリコシル転移プロトコルを施した。トラスツズマブ−(N297Q、L196N)(49733Da、重鎖全体の90%)、トラスツズマブ−(N297Q、G164S)(49757、重鎖全体の90%)及びトラスツズマブ−(N297Q、V363T)(49734Da、重鎖全体の90%)について、重鎖の主要ピークが1つ、観察された。3つの変異体すべての場合で、これは、コアGlcNAc(Fuc)GalNaz置換されている重鎖に相当する。
10mM MnCl2及び25mM Tris−HCl(pH6.0)中で、トリミングしたタラスツズマブ(250μL、10mg/mL、16.5nmol)をUDP−GalNAcSAc(29)(18.5μL、10mM)及びβ(1,4)−Gal−T1(Y289L)(12.5μL、2mg/mL)と共に、30℃で16時間、インキュベートした。この粗製混合物をProtAにより精製し、低いpHを維持するためにカラムを25mM Tris−HCl(pH6.0)により洗浄して、グリシン.HCl緩衝液(pH2.7、0.1M)による溶出後、溶出した緩衝液をTris−HCl(pH7.2、1M)により中和した。
10mM MnCl2及び25mM Tris−HCl(pH6.0)中で、トリミングしたトラスツズマブ(N297Q、V363T)(100μL、10mg/mL、6.6nmol)をUDP−GalNAcSAc(29)(14μL、10mM)及びβ(1,4)−Gal−T1(Y289L)(10μL、2mg/mL)と共に、30℃で16時間、インキュベートした。この粗製混合物をProtAにより精製し、低いpHを維持するためにカラムを25mM Tris−HCl(pH6.0)により洗浄して、グリシン.HCl緩衝液(pH2.7、0.1M)による溶出後、溶出した緩衝液をTris−HCl(pH7.2、1M)により中和した。このプロトコルにより、0.25mgのIgGを得て、IgGのAccuTOF分析により、trast(N297Q、V363T)−(GalNAcSH)2が単一の所望の生成物(恐らく、DDTによるインサイチュ脱保護による、GalNAcSAcマイナスアセテート基)(質量49744、予期される質量49748)として存在していることが示された。
10mM MnCl2及び25mM Tris−HCl(pH6.0)中で、トリミングしたトラスツズマブ(100μL、10mg/mL、6.6nmol)をUDP−GalNAcCl(30)(5μL、10mM)及びβ(1,4)−Gal−T1(Y289L)(5μL、2mg/mL)と共に、30℃で16時間、インキュベートした。GalNAcSAcの場合のプロトコルに従い、この粗製混合物をProtAにより精製すると、trast−(GalNAcCl)2(0.36mg)が得られた。AccuTOF分析により、所望の生成物(質量49731、予期される質量49732)に完全に変換されていることが示された。
10mM MnCl2及び25mM Tris−HCl(pH6.0)中で、トリミングしたトラスツズマブN297Q、V363T変異体(100μL、10mg/mL、6.6nmol)をUDP−GalNAcCl(30)(5μL、10mM)及びβ(1,4)−Gal−T1(Y289L)(5μL、2mg/mL)と共に、30℃で16時間、インキュベートした。GalNAcSAcの場合のプロトコルに従い、この粗製混合物をProtAにより精製すると、trast−(GalNAcCl)2(0.35mg)が得られた。AccuTOF分析により、所望の生成物(質量49750、予期される質量49750)に完全に変換されていることが示された。
プロテインAによる精製後、BCN−vc−PABA−マイタンシノイド35に、トラスツズマブ−(N297Q、L196N)、トラスツズマブ−(N297Q、G164S)及びトラスツズマブ−(N297Q、V363T)をコンジュゲートした。3つのトラスツズマブ変異体すべてをPBS中、100μMになるまで濃縮し、BCN−vc−PABA−マイタンシノイド(DMF中4、当量)に加え、室温で一晩、インキュベートした。少なくとも90%の変換率を得るため、この工程を5回、繰り返し、トラスツズマブ(L196N、N297Q)−(vc−PABA−マイタンシノイド)2(BCN−vc−PABA−マイタンシノイドにコンジュゲートされている重鎖に相当する51187Daの主要ピークを含む、51100〜51500Daの間の重鎖生成物、重鎖全体の±95%)、トラスツズマブ(N297Q、V363T)−(vc−PABA−マイタンシノイド)2(BCN−vc−PABA−マイタンシノイドにコンジュゲートされている重鎖に相当する51189Daの主要ピークを含む、51100〜51500Daの間の重鎖生成物、重鎖全体の±80%)及びトラスツズマブ(G164S、N297Q)−(vc−PABA−マイタンシノイド)2(BCN−vc−PABA−マイタンシノイドにコンジュゲートされている重鎖に相当する51218Daの主要ピークを含む、51100〜51500Daの間の重鎖生成物、重鎖全体の±90%)を得た。
10%ウシ胎仔血清(FCS)(Invitrogen、200μL/ウェル)を補給した、RPMI1640 GlutaMAX(Invitrogen)中で、96ウェルプレート(5000個細胞/ウェル)において、SK−Br−3(Her2+)、SK−OV−3(Her2+)及びMDA−MB−231(Her2−)細胞をプレート培養し、37℃及び5%CO2で一晩、インキュベートした。10%FCSを補給したRPMI1640 GlutaMAX中、滅菌ろ過した化合物の3倍の希釈シリーズ(±0.002〜100nMの範囲)を調製した。培養培地を除去した後、これらの濃度のシリーズを四連で加え、37℃及び5%CO2で3日間、インキュベートした。この培養培地を、10%FCSを補給したRPMI1640 GlutaMAX中のレサズリン(Sigm Aldrich)0.01mg/mLにより交換した。37℃及び5%CO2で4〜6時間後、蛍光プレートリーダー(Tecan Infinite200)を用いて、540nmの励起及び590nmの発光で、蛍光を検出した。細胞を含まないウェルを0%生存率、及び最低用量の化合物を含むウェルを100%生存率に設定することにより、相対蛍光単位(RFU)を細胞生存率に規格化した。各条件について、平均細胞生存率±標準誤差を示す。
GalT変異体の遺伝子は、オーバーラップエクステンションPCR法により、130−402aa残基からなるGalTの触媒ドメインをコードする配列を含有する構築物から増幅した。野生型酵素は、配列番号17により表される。Y289N変異体(配列番号18により表される)の場合、第1のDNA断片は、一対のプライマー:
を用いて増幅した。NdeI制限部位には下線を引いた一方、変異部位は、太字で強調している。第2の断片は、一対のプライマー:
により増幅した。BamHI制限部位には下線を引いた一方、変異部位は、太字で強調している。PCRの最初のラウンドにおいて生じた2つの断片は、Oligo38_GalT_External_Fw及びOligo29_GalT_External_Rwプライマーを使用して、第2のラウンドに融合した。NdeI及びBamHIによる消化後、この断片は、同じ制限酵素を用いて切断したpET16bベクターにライゲーションした。新しく構築した発現ベクターは、Y289N変異体をコードする遺伝子、及びpET16bベクターに由来するHisタグをコードする配列を含有しており、このことは、DNAシークエンシング結果により確認した。Y289F(配列番号19により表される)、Y289M(配列番号20により表される)、Y289I(配列番号21により表される)、Y289V(配列番号22により表される)、Y289A(配列番号23により表される)及びY289G(配列番号24により表される)変異体の構築の場合、それぞれ、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン又はグリシンをコードするTTT、ATG、ATT、GTG、GCG又はGGCトリプレットに変化する変異部位によって、同じ手順を使用した。より詳細には、Y289Fの構築の場合、第1のDNA断片は、本明細書において、配列番号1及び配列番号5として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第2の断片は、本明細書において、配列番号3及び配列番号6(関連配列に関しては、表1が参照される)として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。さらに、Y289Mの構築の場合、第1のDNA断片は、本明細書において、配列番号1及び配列番号7として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第2の断片は、本明細書において、配列番号3及び配列番号8として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Y289Iの構築の場合、第1のDNA断片は、本明細書において、配列番号1及び配列番号9として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第2の断片は、本明細書において、配列番号3及び配列番号10として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Y289Vの構築の場合、第1のDNA断片は、本明細書において、配列番号1及び配列番号11として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第2の断片は、本明細書において、配列番号3及び配列番号12として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Y289Aの構築の場合、第1のDNA断片は、本明細書において、配列番号1及び配列番号13として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第2の断片は、本明細書において、配列番号3及び配列番号14として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Y289Gの構築の場合、第1のDNA断片は、本明細書において、配列番号1及び配列番号15として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第2の断片は、本明細書において、配列番号3及び配列番号16(関連配列に関しては、表1が参照される)として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。
対応するADCの凝集に及ぼす、マイタンシノイドのコンジュゲートしている部位の影響を、様々なトラスツズマブ変種に由来する5種のADCを使用して検討した。これらのADCは、天然のトラスツズマブ及び4種のトラスツズマブ変異体を使用して調製し、これらの各々は、重鎖(トラスツズマブ(G164S、N300Q)、トラスツズマブ(L196N、N300Q)、トラスツズマブ(K291T、N300Q)及びトラスツズマブ(N300Q、V366T))に単一グリコシル化部位を含有した。ADCは、GalNAzの導入を伴う、酵素によるグリカンのリモデリング、続くBCN−マイタンシン35へのコンジュゲートによって調製した。Superdex200 10/300GLカラム(GE Healthcare)のサイズ排除イオンクロマトグラフィーによりすべてのADCを精製し、単量体の画分を得た。精製後、1mg/mlの濃度のリン酸緩衝生理食塩水中、37℃でADCをインキュベートした。Superdex200 PC3.2/30カラム(GE Healthcare)を使用して、0、1及び2週間後に凝集のレベルを分析した。T0と比べた、1及び2週間後の凝集の増加量を表2に示している。トラスツズマブ(G164S、N300Q)及びトラスツズマブ(L196N、N300Q)に由来するADCは、天然のトラスツズマブに由来するADCに比べると、それほどの凝集を示さない。
雌のSHOマウス(Crl:SHO−Prkdcscid Hrhr、実験段階の開始時に6〜9週齢、Charles River Laboratories、L‘Arbresles(フランス)から入手)をケタミン/キシラジンを用いて麻酔にかけ、皮膚をクロルヘキシジン溶液により滅菌処理し、肩甲骨領域のレベルに切り込みを入れて、20mm3の腫瘍断片(HBCx−13B乳がん患者に由来する異種移植片モデル)を皮下組織に置き、皮膚をクリップで閉じた。腫瘍体積が、60〜200mm3の範囲になると、10匹のマウスの群に、ビヒクル、トラスツズマブ−(GalNAz−vc−PABA−マイタンシン)2、又はグリコシル化変異体であるトラスツズマブ(G164S、N300Q)、トラスツズマブ(L196N、N300Q)、トラスツズマブ(K291T、N300Q)、トラスツズマブ(N300Q、V366T)、トラスツズマブ(L177N、N300Q)若しくはトラスツズマブ(LC−R18N、HC−N300Q)のいずれかを、すべて6mg/kgの用量で、i.v.注射した。0、4、7、11、14、18、21、25及び28日目に腫瘍を測定した。
Claims (15)
- 修飾抗体を調製する方法であって、
β(1,4)−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β(1,3)−N−ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ(1,4)−ガラクトシルトランスフェラーゼ及び変異触媒ドメインを含むβ(1,3)−N−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択される触媒の存在下で、モノサッカライド誘導体Su(A)xを近位N−結合型GlcNAc残基に結合させるステップを含み、
Su(A)xがx個の官能基Aを含むモノサッカライド誘導体Suとして定義され、xが1、2、3又は4であり、Aが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択され、前記近位N−結合型GlcNAc残基が、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に1つのN−結合型グリコシル化部位を含むIgG抗体のN−結合型グリコシル化部位に結合しており、前記N−結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異N−結合型グリコシル化部位であり、前記近位N−結合型GlcNAc残基が、任意選択でフコシル化されている、方法。 - 前記触媒が、変異触媒ドメインを含むβ(1,4)−ガラクトシルトランスフェラーゼ及び変異触媒ドメインを含むβ(1,3)−N−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記触媒が、ウシβ(1,4)−Gal−T1 GalT Y289L、GalT Y289N、GalT Y289I、GalT Y289F、GalT Y289M、GalT Y289V、GalT Y289G及びGalT Y289Aからなる群から選択される、β(1,4)−ガラクトシルトランスフェラーゼに由来する変異触媒ドメインを含む触媒である、請求項1又は2に記載の方法。
- Su(A)xが、GalNAz−UDP、6−AzGalNAc−UDP、6−GalNAcCl−UDP、6−GalNAcSH−UDP、2−GalNAcCl−UDP、2−GalNAcSH−UDP、6−ClGal−UDP、2−ClGal−UDP、2−HSGal−UDP及び6−HSGal−UDPからなる群から、又は2−GalNProSH−UDP及び2−GalNBuSH−UDPからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に1つのN−結合型グリコシル化部位を含むIgG抗体であって、前記N−結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異N−結合型グリコシル化部位であり、近位N−結合型GlcNAc−Su(A)x置換基が前記抗体に結合しており、前記N−結合型GlcNAc−Su(A)x置換基におけるGlcNAcが、任意選択でフコシル化されており、Su(A)xがx個の官能基Aを含むモノサッカライド誘導体Suとして定義され、xが1、2、3又は4であり、Aが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される、IgG抗体。
- Aが、アジド基、チオール基又はハロゲンである、請求項5又は6に記載の抗体。
- 抗体コンジュゲートの調製における請求項5〜7のいずれか一項に記載の抗体の使用であって、抗体コンジュゲートが、リンカーLを介して対象の分子Dにコンジュゲートされている抗体として定義される、使用。
- 抗体コンジュゲートを調製する方法であって、請求項5〜7のいずれか一項に記載の修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含み、前記リンカーコンジュゲートが官能基B及び1つ又は複数の対象の分子を含み、前記官能基Bが、前記修飾糖タンパク質のグリカン上の官能基Aと反応する能力がある官能基であり、官能基Aが、請求項1に定義されている通りである、方法。
- (a) 前記修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、(ヘテロ)シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び1つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
(b) 前記修飾抗体がケト修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、一級アミン基、アミノオキシ基若しくはヒドラジニル基、及び1つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
(c) 前記修飾抗体がアルキン修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、アジド基及び1つ若しくは複数の対象の分子を含む、
(d) 前記修飾抗体がチオール修飾抗体若しくはメルカプトアセトアミド修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、N−マレイミド基若しくはハロゲン化アセトアミド基若しくはアルケン、及び1つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
(e) 前記修飾抗体がハロゲン修飾抗体、ハロゲン化アセトアミド修飾抗体、スルホニルオキシ修飾抗体若しくはスルホニル化ヒドロキシアセトアミド修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、チオール基及び1つ若しくは複数の対象の分子を含む、
請求項9に記載の方法。 - 請求項9又は10に記載の方法により得ることができる、抗体コンジュゲート。
- 前記抗体が、式(154)、(155)、(156)又は(157):
(式中、
Abは、請求項6において定義されている通りであり、
Suは、糖誘導体であり、
Lは、リンカーであり、
Dは、対象の分子であり、
bは、0又は1であり、
rは、1〜20であり、
xは、1、2、3又は4であり、
pは、0又は1であり、
Qは、−N(H)C(O)CH2−又は−CH2−であり、
R9は、L(D)r、水素、C1〜C24アルキル基、C6〜C24アリール基、C7〜C24アルキルアリール基及びC7〜C24アリールアルキル基からなる群から選択され、前記C1〜C24アルキル基、前記C6〜C24アリール基、前記C7〜C24アルキルアリール基及び前記C7〜C24アリールアルキル基は、任意選択で置換されている。好ましくはR9は、L(D)r、水素、C1〜C12アルキル基、C6〜C12アリール基、C7〜C12アルキルアリール基及びC7〜C12アリールアルキル基からなる群から選択され、前記C1〜C12アルキル基、前記C6〜C12アリール基、前記C7〜C12アルキルアリール基及び前記C7〜C12アリールアルキル基は、任意選択で置換されている。より好ましくはR9は、L(D)r、水素、C1〜C6アルキル基、C6〜C12アリール基、C7〜C12アルキルアリール基及びC7〜C12アリールアルキル基からなる群から選択され、前記C1〜C6アルキル基、前記C6〜C12アリール基、前記C7〜C12アルキルアリール基及び前記C7〜C12アリールアルキル基は、任意選択で置換されている。さらにより好ましくはR9は、H、C1、C2、C4又はC4アルキル又はC6〜C12アリールである。最も好ましくはR9は、H又はメチルである)、
(式中、
Abは、請求項6において定義されている通りであり、
Suは、糖誘導体であり、
Lは、リンカーであり、
Dは、対象の分子であり、
bは、0又は1であり、
rは、1〜20であり、
xは、1、2、3又は4であり、
yは、1〜20であり、
R1は、水素、ハロゲン、−OR5、−NO2、−CN、−S(O)2R5、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、前記アルキル基、前記(ヘテロ)アリール基、前記アルキル(ヘテロ)アリール基及び前記(ヘテロ)アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、2つの置換基R1は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している(ヘテロ)アレーン置換基を形成していてもよく、R5は、水素、ハロゲン、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Zは、C(R1)2、O、S又はNR2であり、R2は、R1又はL(D)rであり、L、D及びrは上で定義されている通りであり、
pは、0又は1であり、
Qは、−N(H)C(O)CH2−又は−CH2−であり、
qは、0又は1であるが、但し、qが0である場合、ZはN−L(D)rであることを条件とし、
aは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)、
(式中、
Abは、請求項6において定義されている通りであり、
Suは、糖誘導体であり、
Lは、リンカーであり、
Dは、対象の分子であり、
bは、0又は1であり、
rは、1〜20であり、
xは、1、2、3又は4であり、
yは、1〜20であり、
R1は、水素、ハロゲン、−OR5、−NO2、−CN、−S(O)2R5、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、前記アルキル基、前記(ヘテロ)アリール基、前記アルキル(ヘテロ)アリール基及び前記(ヘテロ)アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、2つの置換基R1は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化しているアレーン置換基を形成していてもよく、R5は、水素、ハロゲン、C1〜C24アルキル基、C6〜C24(ヘテロ)アリール基、C7〜C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7〜C24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Zは、C(R1)2、O、S又はNR2であり、R2は、R1又はL(D)rであり、L、D及びrは上で定義されている通りであり、
pは、0又は1であり、
Qは、−N(H)C(O)CH2−又は−CH2−であり、
qは、0又は1であるが、但し、qが0である場合、ZはN−L(D)rであることを条件とし、
a’は、0、1、2、3、4、5、6、7又は8であり、
a’’は、0、1、2、3、4、5、6、7又は8であり、
a’+a’’<10である)
による、請求項11に記載の抗体コンジュゲート。 - xが1若しくは2であり、及び/又はrが1若しくは2である、請求項11又は12に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記対象の分子が、薬学的に活性な物質の群から選択される、請求項11〜13のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 医薬として使用するための、請求項11〜14のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
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