KR20220024829A - 이중 약물 항체-약물 접합체 - Google Patents

이중 약물 항체-약물 접합체 Download PDF

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제르트-얀 분스
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Abstract

각각의 약물의 정의된 화학량론적 비를 갖는 이중 약물 항체 약물 접합체가 본원에 개시된다. 본원에 개시된 접합체는 암, 특히 약물 내성 및 다제내성 암의 치료에 유용하다.

Description

이중 약물 항체-약물 접합체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 6월 24일에 제출된 미합중국 가출원 62/865,692의 이익을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에 원용된다.
정부 지원 진술서
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)의 R01CA88986에 따른 정부 지원 하에 실시되었다. 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 갖는다.
본 발명은 동일한 항체에 접합된 다중 제제를 갖는 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 본원에 개시된 방법은 소정의 화학량론적 비율로 제제의 선택적 설치를 가능하게 한다.
항체-약물 접합체(ADC)는 종양 관련 항원을 과발현하는 세포에 세포독성 약물을 선택적으로 전달할 수 있는 능력으로 인해 암 치료를 위한 매력적인 치료제로 부상하고 있다. 4개의 ADC가 재발성 호지킨 림프종, 역형성 대세포 림프종, 전이성 유방암, 및 재발성 또는 불응성 B 세포 전구체 급성 림프모구성 백혈병의 치료를 위해 미국 식품의약국에서 승인되었다. 또한, 200개 초과의 ADC가 다른 많은 유형의 암 치료를 위한 임상 평가를 진행 중이다.
암의 약물 내성은 성공적인 암 치료의 주요 장애물이다. 암 세포에서 다제내성(MDR)은 세포가 특히 약물 유출의 증가를 포함한 여러 기전을 기반으로 하는 화학요법 화합물에 대해 감소된 민감성을 나타내는 표현형이다. 상기 다제내성은 기존에 존재하는 내성일 수 있고, 따라서 치료 개시 시에 명백하거나(내재적), 또는 대안적으로 치료 개시 후에 획득될 수도 있다. 다제내성의 가장 잘 규명된 기전 중 하나는 ATP 결합 카세트(ABC) 수송체, 특히 P 당단백질(P-gp, MDR1, ABCB1)에 의해 매개되는 약물 유출의 증가이다. 원핵생물에서 포유류에 이르기까지 모든 살아있는 유기체에 존재하는 ABC 단백질은 막 장벽을 가로질러 기질의 통과를 제어하는 막관통 단백질이다. ABC 수송체는 세포 또는 유기체에 진입하는 환경 독성 물질의 인식 및 에너지 의존적 제거를 담당하는 복잡한 세포 방어 체계를 구성한다. 암에서, P 당단백질은 세포 내 화학요법 약물 수준을 세포 사멸 임계값 미만으로 유지하는 1차 보호막 역할을 한다. P 당단백질을 과발현하는 암세포는 P 당단백질(P-gp)의 복잡한 결합으로 인해 임상적으로 사용되는 대부분의 항암제의 유출이 발생하기 때문에 다제내성이 된다. 불량한 화학요법 반응에 대한 P-gp의 기여는 혈액암, 육종, 유방암, 및 기타 고형암에서 입증되었다. 최근에 획득한 독소루비신 내성은 BRCA1 관련 유방암에 대한 유전자 조작 마우스 모델에서 마우스 Mdr1 유전자의 발현 증가와 관련이 있다. 중요하게도, 심지어 Mdr1 발현의 적당한 증가도 독소루비신 내성을 유발하기에 충분한 것으로 밝혀졌으며, 이는 3세대 P-gp 억제제 타리퀴다르에 의해 역전될 수 있다. 상기 결과는 P-gp가 실제로 암의 실제 모델에서 약물 내성을 유발하는 데 주요한 역할을 한다는 것을 확인시켜준다. 특히, 다제내성을 극복할 수 있는 이중 약물 ADC를 개발하는 것이 매력적으로 보인다. 많은 P-gp 억제제 또는 조절제는 높은 전신 독성, 정상 조직에 의한 MDR1 발현으로 인한 표적 외 독성, 및 열악한 약동학적 특성으로 인해 임상 시험에서 실패하였다. 칼리키아미신, 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 파클리탁셀 및 메이탄시노이드와 같은 ADC의 개발을 위해 일반적으로 사용되는 세포독성 화합물은 P 당단백질(P-gp)의 기질로서 다제내성 암에 대한 활성이 좋지 않다.
겹치지 않는 독성 프로필 및 차등 작용 방식을 가진 약물 조합이 암 치료에서 일반적이며, 이러한 관행을 기반으로 여러 ADC가 비접합의 임상적으로 승인된 약물과 조합되고 있다. 잠재적으로, 다중약물 전달을 위한 보다 매력적인 접근 방식은 여러 상이한 약물로 항체를 기능화하는 것이다. 개념 증명 연구에서, Senter와 동료들은 2개의 직교 보호된 시스테인 잔기를 함유하는 약물 담체가 항체에 결찰된 후 시스테인 잔기의 선택적 탈보호 및 상보적 특성을 지닌 2개의 상이한 티오 반응성 모노메틸 아우리스타틴 유도체의 순차적 부착으로 이어지는 이중 약물 ADC를 설명하였다. 개념적으로는 훌륭하지만, 약물 운반체의 부착을 위한 사슬간 이황화 결합을 감소시킬 필요성, 아세트아미도메틸(Acm) 보호기의 탈보호를 위한 독성 금속의 사용 및 매우 높은 약물 로딩은 상기 접근법의 잠재적인 단점을 나타낸다. 2개의 탄두를 부착하기 위한 다른 이형기능성 링커가 보고되었지만, 기능화를 위해서는 독성 시약이 또한 필요하다. 항체에 여러 약물을 부착하기 위한 순하고 비유전적이며 부위 특이적 접합 기술의 개발이 시급하다.
상기 항체에 접합된 치료제의 수준이 제어가능한 ADC가 여전히 필요하다. 독성 또는 그렇지 않으면 다른 문제가 있는 시약에 의존하지 않고 원하는 수의 약물 카고를 항체 상에 선택적으로 설치하는 방법이 여전히 필요하다. 이중 약물 ADC를 제조하기 위한 개선된 방법이 여전히 필요하다. P-gp 과발현을 특징으로 하는 암을 포함한 다제내성 암을 치료하는 방법이 여전히 필요하다. 허용 가능한 독성 수준 내에서 P-gp 억제제 또는 조절제를 암 조직에 선택적으로 전달하는 방법이 여전히 필요하다.
본원에서는 2개 이상의 접합된 카고 모이어티, 예를 들어 치료제 및 진단제 등을 특징으로 하는 항체-약물 접합체를 개시한다. 본원에 개시된 ADC는 상기 접합된 모이어티에 대해 제어된 화학량론적 비율을 갖는다. 일부 구현예들에서, 이중 약물 ADC는 적어도 하나의 화학요법제, 및 상기 화학요법제의 유효성을 향상시키는 적어도 하나의 작용제를 포함한다.
하나 이상의 구현예의 세부 사항은 하기의 설명에 제시되어 있다. 다른 특징, 목적 및 장점은 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 나말와(Namalwa) A) 야생형 및 B) MDR+ve 세포에서 다양한 구성체의 시험관내 세포독성 프로파일을 도시한다. 세포 생존율은 MTT 분석으로 평가하였다. 데이터는 프리즘(Prism) 비선형 회귀 소프트웨어를 사용하여 맞춤을 실시하였다.
도 2는 항체의 트립신 분해로부터 당펩티드의 HILIC-LC/MS 스펙트럼을 도시한다. A) 항체 12; B) 항체 항체 13; C) 항체 14; 및 D) 항체 13, 화합물 1 대 항체 13의 몰비 25:1에서 1의 존재하에 ST6Gal I에 의해 변형됨.
도 3은 화합물 1 대 항체 13의 상이한 몰비: A) 2:1; B) 3:1; C); 3.5:1 및 D) 4:1에서 화합물 1의 존재하에 ST6Gal I에 의해 변형된 13의 트립신 분해로부터 당펩티드에 대한 HILIC-LC/MS 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 탁소이드 및 조수퀴다르 기반 카고 모이어티 둘 다를 설치하기 위한 리모델링 및 접합 과정을 도시한다. 시약 및 조건: a) UDP-Gal, 갈락토실트랜스퍼라제, MOPS 완충액, pH 7.2; b) 아지드 기능화된 시알로사이드, ST6Gal1, CIAP; c) (D1); d) 아지드 기능화된 시알로사이드, ST6Gal1, CIAP; e) (D2). a-e에 대한 반응은 카코딜레이트 완충액, pH 7.6에서 실시하였다.
도 5a는 글리칸 내에 아지드 및 테트라진 변형 시알로사이드를 설치하기 위한 순차적 글리코실화 과정을 도시한다. 도 5b는 특정 시알로사이드 공여자를 도시한다. 도 5c는 직교 접합 반응을 도시한다.
본 방법과 시스템을 개시하고 설명하기 전에, 상기 방법과 시스템은 특정 합성 방법, 특정 구성 요소, 또는 특정 조성에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해된다.
명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 “한(a)”, “하나(an)”, 및 “그것(the)”은 문맥에서 달리 명시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값부터, 및/또는 "약" 다른 하나의 특정 값까지로 표시될 수 있다. 이러한 범위를 표시하는 경우, 다른 구현예는 상기 하나의 특정 값부터 및/또는 상기 다른 하나의 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 선행사 “약”을 사용하여 근사치로서 표현될 때, 특정 값은 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 범위 각각의 종결점은 다른 종결점과 관련하여, 그리고 다른 종결점과 독립적으로 유의미한 것으로 더욱 이해될 것이다.
“선택적” 또는 “선택적으로”는 차후에 설명된 사건 또는 상황이 발생하거나 또는 발생하지 않을 수 있고, 그리고 상기 설명이 상기 사건 또는 상황이 발생하는 사례 및 발생하지 않는 사례를 포함한다는 것을 의미한다.
본 명세서의 설명 및 청구범위에 걸쳐, 단어 "포함한다" 및 상기 단어의 변형, 예컨대 "포함하는" 및 "포함하다"는"포함하지만 이에 제한되지는 않는"을 의미하며, 예를 들어 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않는다. "예시적인"은 "~의 예"를 의미하며, 선호되거나 이상적인 구현예의 표시를 전달하는 것으로 의도되지 않는다. "~와 같은"은 제한적 의미가 아니라 설명의 목적으로 사용된다.
개시된 방법 및 시스템을 실시하기 위해 사용될 수 있는 구성 요소를 개시한다. 상기 및 다른 구성 요소는 본원에 개시되며, 상기 구성 요소들의 조합, 부분 집합, 상호 작용, 군 등이 개시되는 경우, 각각의 다양한 개별적 및 집단적 조합에 대한 구체적인 참조 및 이들 조합의 순열은 명시적으로 개시되지 않을 수 있지만, 각 구성 요소는 모든 방법 및 시스템에 대해 본원에 구체적으로 고려되고 설명되는 것으로 이해한다. 이는 개시된 방법의 단계를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 본 출원의 모든 양태에 적용된다. 따라서, 만약 실시될 수 있는 다양한 추가 단계가 있으면, 이들 추가 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 특정한 구현예 또는 구현예들의 조합으로 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 용어 "알킬"은 분지쇄 또는 비분지쇄 탄화수소 기, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 및 도데실 등이다. 알킬기는 또한 치환 또는 비치환될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "알킬"은 치환 및 비치환된 알킬기 둘 모두를 고려한다. 상기 알킬기는 알콕시, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알데히드, 아미노, 카르복실산, 에스테르, 에테르, 할로겐화물, 히드록시, 케톤, 니트로, 실릴, 설포-옥소 또는 티올을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다. 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합을 함유하지 않는 알킬기는 포화 알킬기로 표시되는 반면, 상기 결합을 하나 이상 갖는 알킬기는 불포화 알킬기로 표시된다. 이중 결합을 갖는 불포화 알킬기는 알케닐기로 표시될 수 있고, 삼중 결합을 갖는 불포화 알킬기는 알키닐기로 표시될 수 있다. 이와 반대로 명시되지 않는 한, 용어 알킬은 포화 및 불포화 기 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "시클로알킬"은 3개 이상의 탄소 원자로 구성된 비방향족 탄소계 고리이다. 시클로알킬기의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 용어 "헤테로시클로알킬"은 상기 고리의 탄소 원자 중 하나 이상이 헤테로원자, 예컨대 제한없이 질소, 산소, 황, 셀레늄 또는 인으로 대체되는 상기 정의된 바와 같은 시클로알킬기이다. 상기 시클로알킬기 및 헤테로시클로알킬기는 치환 또는 비치환될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 치환 및 비치환된 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬기 둘 모두를 고려한다. 상기 시클로알킬기 및 헤테로시클로알킬기는 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알데히드, 아미노, 카르복실산, 에스테르, 에테르, 할로겐화물, 히드록시, 케톤, 니트로, 실릴, 설포-옥소 또는 티올을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다. 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합을 함유하지 않는 시클로알킬기는 포화 시클로알킬기로 표시되는 반면, 상기 결합을 하나 이상 갖는(하지만, 여전히 방향족은 아님) 시클로알킬기는 불포화 시클로알킬기로 표시된다. 이와 반대로 명시되지 않는 한, 용어 시클로알킬은 포화 및 불포화, 비방향족 고리 시스템을 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "아릴"은 탄소 원자로 구성된 방향족 고리이다. 아릴기의 예는 페닐 및 나프틸 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 용어 "헤테로아릴"은 상기 고리의 탄소 원자 중 하나 이상이 헤테로원자, 예컨대 제한없이 질소, 산소, 황, 셀레늄 또는 인으로 대체되는 상기 정의된 바와 같은 아릴기이다. 상기 아릴기 및 헤테로아릴기는 치환 또는 비치환될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "아릴" 및 "헤테로아릴"은 치환 및 비치환된 아릴 및 헤테로아릴기 둘 모두를 고려한다. 상기 아릴기 및 헤테로아릴기는 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알데히드, 아미노, 카르복실산, 에스테르, 에테르, 할로겐화물, 히드록시, 케톤, 니트로, 실릴, 설포-옥소 또는 티올을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
예시적인 헤테로아릴 및 헤테로시클릴 고리는: 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조티오푸라닐, 벤조티오페닐, 벤족사졸릴, 벤족사졸리닐, 벤즈티아졸릴, 벤즈트리아졸릴, 벤즈테트라졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이미다졸리닐, 카바졸릴, 4AH 카바졸릴, 카볼리닐, 크로마닐, 크로메닐 시르놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 2H, 6H~ 1,5,2-디티아지닐, 디히드로푸로[2,3b]테트라히드로푸란, 푸라닐, 푸라자닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸릴, 1H-인다졸릴, 인돌레닐, 인돌리닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 3H-인돌릴, 이사티노일, 이소벤조푸라닐, 이소크로마닐, 이소인다졸릴, 이소인돌리닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 메틸렌디옥시페닐, 모르폴리닐, 나프티리디닐, 옥타히드로이소퀴놀리닐, 옥사디아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥신돌릴, 피리미디닐, 페난트리디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사티닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피페리도닐, 4-피페리도닐, 피페로닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도옥사졸, 피리도이미다졸, 피리도티아졸, 피리디닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴녹살리닐, 퀴누클리디닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라졸릴, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 티안트레닐, 티아졸릴, 티에닐 티에노티아졸릴, 티에노옥사졸릴, 티에노이미다졸릴, 티오페닐, 및 크산테닐을 포함한다.
용어 "알콕시", "시클로알콕시", "헤테로시클로알콕시", "시클로알콕시", "아릴옥시" 및 "헤테로아릴옥시"는 알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴에 대해 전술한 의미를 가지며, 추가로 상기 기는 산소 원자를 통해 연결된다.
본원에서 사용된 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용 가능한 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 넓은 측면에서, 허용되는 치환기는 유기 화합물의 비고리형 및 고리형, 분지쇄 및 비분지쇄, 탄소고리 및 헤테로고리, 방향족 및 비방향족 치환기를 포함한다. 예시적인 치환기에는, 예를 들어 하기에 기재된 것들이 포함된다. 허용되는 치환기는 적절한 유기 화합물에 대해 하나 이상이고 동일하거나 상이할 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환기 및/또는 헤테로원자의 원자가를 충족시키는 본원에 기재된 유기 화합물의 임의의 허용가능한 치환기를 가질 수 있다. 본 개시는 유기 화합물의 허용가능한 치환기에 의해 어떠한 방식으로든 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 또한, 용어 "치환" 또는 "~로 치환된"은 상기 치환이 치환된 원자 및 치환기의 허용된 원자가에 따르고, 상기 치환이 안정적인 화합물, 예컨대 재배열, 고리화, 제거 등과 같은 변형을 자발적으로 거치지 않는 화합물을 초래한다는 암묵적인 조건을 포함한다. 구체적으로 언급되지 않는 한, "치환된"이라고 하는 치환기는 상기 치환기가 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알데히드, 아미노, 카르복실산, 에스테르, 에테르, 할로겐화물, 히드록시, 케톤, 니트로, 실릴, 설포-옥소, 또는 티올 중 하나 이상으로 치환될 수 있음을 의미한다. 특정 예에서, 치환된다고 하는 기는 pH에 따라 양성자화되거나 탈양성자화될 수 있는 기인 양성자성 기로 치환된다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "환자"는 인간을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 포유류 동물을 지칭한다.
제1 및 제2 카고 모이어티에 접합된 N 연결 올리고당을 갖는 기능화된 항체가 본원에 개시된다. 바람직한 구현예들에서, 상기 제1 및 제2 카고 모이어티는 실질적으로 1:1 비율로 존재할 것이다. 다른 구현예들에서, 상기 카고 모이어티 중 하나는 다른 것보다 더 많은(몰) 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 카고 모이어티가 더 많은 양으로 존재할 수 있거나, 또는 상기 제2 카고 모이어티가 더 많은 양으로 존재할 수 있다. 일부 구현예들에서, (a) 제1 카고 모이어티 대 (b) 제2 카고 모이어티의 몰 비는 대략 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1;3, 또는 1:4일 수 있다.
항체
본 발명의 기능화된 항체는 단일클론 또는 다클론 항체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 기능화된 항체는 단일클론 항체이다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 기능화된 항체는 표적 항원을 인식한다. 바람직한 구현예에서, 상기 표적 항원은 종양 항원이고 종양 세포의 표면에 국소화된다. 추가의 구현예에서, 상기 표적 항원에 결합된 기능화된 항체는 상기 종양 세포에 결합한 후 내재화될 수 있다. 상기 기능화된 항체가 하나 이상의 카고 분자에 접합되는 경우, 상기 카고 분자는 내재화 후에 상기 세포 내로 방출될 수 있다. 예를 들어, 상기 기능화된 항체가 세포독성 약물에 연결되는 경우, 내재화 후 상기 세포독성 약물이 상기 세포 내로 방출되어 세포 사멸을 초래할 수 있다. 바람직하게는, 상기 표적 항원은 정상 세포 및 종양 세포 사이에 차등 발현을 나타내어 종양 세포 상에서 증가된 발현을 나타낸다. 상기 표적 항원은 B 세포 항원, 예를 들어 CD19, CD20, CD21, CD22, CD79, 또는 CD180, 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 표적 항원은 특정 유형의 암에서 상승된 단백질 또는 종양 표지자, 예를 들어 Her2, Muc16, M1S1, 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 또는 CD30, 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 표적 항원은 대안적으로 당단백질 NMB, CD33, CD56, CD66e/CEACAM5, CD74, CD79b, CD138, CA-IX, SLC44A4, 메조텔린, 또는 넥틴-4, 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 표적 항원은 조직 특이적 표지자 또는 글리칸, 또는 이의 단편일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 기능화된 항체는 높은 친화도로 상기 표적 항원에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 상기 기능화된 항체의 친화도는 비표적 분자에 대한 친화도보다 표적 분자에 대하여 약 5배 이상, 바람직하게는 -10배, 더 바람직하게는 25배, 보다 더 바람직하게는 50배, 가장 바람직하게는 100배 이상 클 것이다.
상기 기능화된 항체 또는 기능화된 항체 단편은 IgM, IgA, IgD, IgE 또는 IgG 부류와 같인 임의의 부류, 또는 면역글로불린 분자의 하위부류일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 기능화된 항체 또는 기능화된 항체 단편은 IgG 부류의 것이다. 상기 기능화된 항체 또는 기능화된 항체 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4 하위부류로부터 유래할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 기능화된 항체 또는 기능화된 항체 단편은 IgG1 부류로부터 유래한다. 바람직한 구현예에서, 상기 기능화된 항체 또는 기능화된 항체 단편은 카바타(Kabat) 넘버링 시스템Kabat 넘버링에 의해 정의된 바와 같이 중쇄의 위치 297에 보존된 아스파라긴을 갖는다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol. 1, 5th Ed. U.S. Public Health Service, National Institutes of Health. NIH Publication No. 91-3242; Copyright 1991).
상기 기능화된 항체 또는 기능화된 항체 단편은 인간, 마우스, 래트, 또는 다른 포유동물로부터 유래될 수 있다. 기능화된 항체 또는 기능화된 항체 단편은 또한 인간, 마우스, 래트 및/또는 다른 포유동물로부터의 항체의 혼성화일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 기능화된 항체 또는 기능화된 항체 단편은 인간으로부터 유래한다. 상기 기능화된 항체 또는 기능화된 항체 단편은 하이브리도마 세포 또는 세포주에 의해 생성될 수 있다. 상기 기능화된 항체 또는 기능화된 항체 단편은 인간화될 수 있다.
상기 기능화된 항체는 단일클론 항체일 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 아바고보맙, 압식시맙, 아비투주맙, 아브레제키맙, 아브릴루맙, 악톡수맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아두카누맙, 아파세비쿠맙, 아펠리모맙, 알라시주맙 페골, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 안데칼릭시맙, 아네투맙 라브탄신, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아프루투맙 익사도틴, 아르시투모맙, 아스린바쿠맙, 아셀리주맙, 아테졸리주맙, 아티도르톡수맙, 아티누맙, 아토롤리무맙, 아벨루맙, 아진툭시주맙 베도틴, 바피네우주맙, 바실릭시맙, 바비툭시맙, BCD-100, 벡투모맙, 베겔로맙, 벨란타맙 마포도틴, 벨리무맙, 베마리투주맙, 벤랄리주마, 파센라맙, 베를리마톡수맙, 베르메키맙, 베르산리맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비메키주맙, 비르타미맙, 비바투주맙 메르탄신, 블레셀루맙, 블리나투모맙, 블론투벳맙, 블로소주맙, 보코시주맙, 브라지쿠맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리아키누맙, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 브론틱투주맙, 부로수맙, 크리스비타맙, 카비랄리주맙, 카미단루맙 테시린, 캠렐리주맙, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데타이드, 카루맙, 카로툭시맙, 카투막소맙, CBR96-독소루비신 면역접합체, 세델리주맙, 세미플리맙, 세르구투주맙 아뮤날류킨, 세르톨리주맙 페골, 세트렐리맙, 세툭시맙, 시비사타맙, 시름투주맙, 시타투주맙 보가톡스, 시수투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 코드리투주맙, 코페투주맙 펠리도틴, 콜툭시맙 라브탄신, 코나투무맙, 콘시주맙, 코스프로빅시맙, CR6261, 크레네주맙, 크리잔리주맙, 크로테두맙, 쿠사투주맙, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다피롤리주맙 페골, 다라투무맙, 덱트레쿠맙, 뎀시주맙, 데닌투주맙 마포도틴, 데노수맙, 데파툭시주맙 마포도틴, 데를로툭시맙 비오틴, 데투모맙, 데자미주맙, 디누툭시맙, 디리다부맙, 도마그로주맙, 돌리모맙 아리톡스, 도스타리맙, 드로지주맙, ds-8201, 둘리고투주맙, 두필루맙, 더발루맙, 두시기투맙, 두보르툭시주맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에푼구맙, 엘델루맙, 엘레자누맙, 엘젬투맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에막투주맙, 에마팔루맙, 에미베투주맙, 에미시주맙, 헴리브라, 에나포타맙 베도틴, 에나바투주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엔리모맙 페골, 에노블리투주맙, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에프라투주맙, 엡티네주맙, 에레누맙, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에티길리맙, 에트롤리주맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파라리모맙, 파리시맙, 팔레투주맙, 파시누맙, fbta05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피바투주맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 피리주맙, 플란보투맙, 플레티쿠맙, 플로테투주맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레마네주맙, 프레솔리무맙, 프로보시맙, 프루네벳맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈카네주맙, 갈릭시맙, 간코타맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가티포투주맙, 가빌리모맙, 게디부맙, 젬투주맙 오조가미신, 게보키주맙, 길베트맙, 김실루맙, 지렌툭시맙, 글렘바투무맙 베도틴, 골리무맙, 고밀릭시맙, 고수라네맙, 구셀쿠맙, 이아날루맙, 이발리주맙, IBI308, 이브리투모맙 티욱세탄, 이크루쿠맙, 이다루시주맙, 이파보투주맙, 이고보맙, 일라다투주맙 베도틴, IMAB362, 이말루맙, 이마프렐리맙, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인두사투맙 베도틴, 이네빌리주맙, 인플릭시맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가미신, 인테투무맙, IOMAB-B, 이필리무맙, 이라투무맙, 이사툭시맙, 이스칼리맙, 이스티라투맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, 켈릭시맙, 라베투주맙, 락노투주맙, 라디라투주맙 베도틴, 람팔리주맙, 라나델루맙, 란도그로주맙, 라프리툭시맙 엠탄신, 라르카빅시맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 렌달리주맙, 렌베르비맙, 렌질루맙, 레르델리무맙, 레론리맙, 레소파무맙, 레톨리주맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리파투주맙 베도틴, 리겔리주맙, 릴로토맙 사테트라크세탄, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로키벳맙, 론카스툭시맙 테시린, 로르보투주맙 메르탄신, 로사투시주맙 베도틴, 루카투무맙, 룰리주맙 페골, 루미릭시맙, 루레투주맙, 루파르투맙 아마도틴, 루티키주맙, 마파투무맙, 마르게툭시맙, 마르스타시맙, 마실리모맙, 마투주맙, 마브릴리무맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미리키주맙, 미르베툭시맙 소라브탄신, 미투모맙, 모도툭시맙, 모가물리주맙, 모날리주맙, 모로리무맙, 모수네투주맙, 모타비주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 납투모맙 에스타페나톡스, 나라툭시맙 엠탄신, 나르나투맙, 나탈리주맙, 나비식시주맙, 나비부맙, 낙시타맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네몰리주맙, NEOD001, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 네타키맙, 니모투주맙, 니르세비맙, 니볼루맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오빌톡사시맙, 오비누투주맙, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올레클루맙, 올렌달리주맙, 올로키주맙, 오말리주맙, 옴부르타맙, OMS721, 오나르투주맙, 온툭시주맙, 온바틸리맙, 오피시누맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오틸리맙, 오틀레투주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 팜레브루맙, 파니투무맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파사투주맙, 파스콜리주맙, 파소툭시주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, PDR001, 펨브롤리주맙, 펨투모맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 플로잘리주맙, 포갈리주맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 포르가빅시맙, 프라시네주맙, 프레잘리주맙, 프릴릭시맙, 프리톡악시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 랄판시주맙, 라무시루맙, 라네벳맙, 라니비주맙 루센티스, 라바갈리맙, 라불리주맙, 락시바쿠맙, 레파네주맙, 레가비루맙, 렐라틀리맙, 렘톨루맙, 레슬리주맙, 리로투무맙, 리누쿠맙, 리산키주맙, 리툭시맙, 리바바주맙 페골, RMAb 라비실드, 로바투무맙, 롤레두맙, 로밀키맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로즈만투주맙, 로발피투주맙 테시린, 로벨리주맙, 로자놀릭시주맙, 루플리주맙, SA237, 사시투주맙 고비테칸, 사말리주맙, 삼로타맙 베도틴, 사릴루맙, 사트랄리주맙, 사투모맙 펜데티드, 세쿠키누맙, 셀리크렐루맙, 세리반투맙, 세톡악시맙, 세트루수맙, 세비루맙, SGN-CD19a, SHP647, 시브로투주맙, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙 시르트라투맙 베도틴, 시루쿠맙, 소피투주맙 베도틴, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소네프시주맙, 손투주맙, 스파르탈리주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수프타부맙, 수팀리맙, 수비주맙, 수브라톡주맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트라세탄, 타도시주맙, 탈라코투주맙, 탈리주맙, 탐투베트맙, 타네주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 타렉스주맙, 타볼리맙, 테피바주맙, 텔리모마브 아리톡스, 텔리소투주맙 베도틴, 테나투모맙, 테네릭시맙, 테플리주맙, 테포디타맙, 테프로투무맙, 테시돌루맙, 테툴로맙, 테제펠루맙, TGN1412, 티불리주맙, 티가투주맙, 틸드라키주맙, 티미구투주맙, 티몰루맙, 티라고투맙, 티슬레리주맙, 티소투맙 베도틴, TNX-650, 토실리주맙, 토무조툭시맙, 토랄리주맙, 토사톡수맙, 토시투모맙, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, TRBS07, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 트레보그루맙, 투코투주맙 셀몰류킨, 투비루맙, 유블리툭시맙, 울로쿠플루맙, 우레루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 우토밀루맙, 바다툭시맙 탈리린, 바날리맙맙, 반도르투주맙 베도틴, 반틱투맙, 바누시주맙, 바팔릭시맙, 바리사쿠맙, 바릴루맙, 바텔리주맙, 베돌리주맙, 엔티비오, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 보바리리주맙, 볼로식시맙, 본레롤리주맙, 보프라텔리맙, 보세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 부나키주맙, 크센투주맙, XMAB-5574, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 제노쿠투주맙, 지랄리무맙, 졸베툭시맙, 졸리모맙 아리톡스 또는 포네주맙일 수 있다.
본 발명에 따른 번역후 기능화에 적합한 항체는 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는, 예를 들어 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함한 폭넓게 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 배양에서 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 원래 Kohler와 Milstein(256 Nature 495-497(1975))이 개발한 하이브리도마 기술을 사용할 수 있다. 또한, Asubel et al., Antibodies: a Laboratory Manual (Harlow & Lane eds., Cold Spring Harbor Lab. 1988); Current Protocols in Immunology (Colligan et al., eds., Greene Pub. Assoc. & Wiley Interscience 30 N.Y., 1992-1996)을 참조한다.
항체는 표적 항원으로 면역화함으로써 동물 숙주에서 유도될 수 있거나, 또는 면역 세포의 시험관내 면역화에 의해 형성될 수 있다. 상기 항체는 또한 적절한 세포주가 적절한 항체 부호화 DNA로 형질전환, 형질감염, 감염 또는 형질도입되는 재조합 시스템에서 생성할 수 있다. 대안적으로, 상기 항체는 정제된 중쇄 및 경쇄의 생화학적 재구성에 의해 작제될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는, 예를 들어 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용한 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 상업적 항체를 사용하여 본 발명의 항체를 생성할 수 있다. 상기 항체는 종래의 수단을 사용하여 인간, 마우스, 또는 기타 포유동물 또는 포유동물 시스템에서 생성할 수 있다.
일단 항체 또는 항체 단편이 동물에 의해 생성되어, 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 발현되면, 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화성 및 크기 분류 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 기타 표준 기술에 의해 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 정제를 용이하게 하기 위해 당업계에 공지된 이종 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
카고 모이어티
항체와 유리하게 접합될 수 있는 적합한 카고 모이어티는 치료제 및 진단제, 예컨대 방사성핵종, 형광단, 염료 등을 포함한다. 적합한 치료제는 세포독성제, 항생제, 면역억제제, 및 다양한 생체고분자, 예컨대 치료 단백질, 백신 및 핵산 등을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 제1 카고 모이어티는 하나 이상의 항암제를 포함한다. 항암제의 예시적인 부류는 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 항엽산제와 같은 항대사물질, 피리미딘 길항제, 퓨린 유사체, 퓨린 길항제, 리보뉴클레오티드 환원효소 억제제, 프로테아좀 억제제, 티로신 키나제 억제제, 및 피롤로옥사다이아제핀, 옥사자포스포린, 질소, 히드라진 및 백금 기반 제제와 같은 알킬화제를 포함한다. 특정 구현예들에서, 화학요법제는 P-gp 강화된 MDR 선택적 화합물이며, 이는 P-gp 또는 다른 경로의 과발현을 통한 약물에 대한 내성이 공지되어 있음을 의미한다.
일부 경우들에, 상기 제2 카고 모이어티는 상기 정의된 바와 같은 항암제일 수 있다. 다른 구현예들에서, 상기 제2 카고 모이어티는 상기 제1 카고 모이어티의 치료 효과를 증가시키는 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 카고 모이어티는 ABC 수송 조절제, DNA 메틸화 억제제, P 당단백질 억제제, 또는 면역 조절제일 수 있다.
N 연결 올리고당
N 연결된 올리고당은 아미노산 측쇄, 예를 들어 아스파라긴, 아르기닌, 글루타민, 또는 라이신 내에 존재하는 펜던트 질소를 통해 항체에 연결될 수 있다. 바람직하게는, N 연결 올리고당은 아스파라긴, 예를 들어 Fc 도메인의 Asp297 위치를 통해 연결된다. 상기 N 연결된 올리고당은 적어도 하나의 분지를 포함할 수 있으며, 상기 분지의 제1 팔은 상기 제1 카고 모이어티에 접합되고, 상기 분지의 제2 팔은 상기 제2 카고 모이어티에 접합된다.
특정 구현예들에서, 상기 N 연결 올리고당의 분지는 카고 모이어티에 접합된 기능화된 시알로사이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 N 연결 올리고당의 분지는 말단 시알로사이드를 포함할 수 있으며, 이는 기능화된 시알로사이드가 당류 사슬의 말단에 있음을 의미한다. 상기 말단 시알로사이드는 하기의 화학식:
Figure pct00001
을 갖고,
R은 H, OH, 또는 *-L-A에서 독립적으로 선택되고, L은 무효), 절단성 링커 또는 비절단성 링커이고, A는 카고 모이어티이며, *는 상기 시알로사이드에 대한 부착 부위를 나타낸다. 특정 구현예들에서, 상기 말단 시알로사이드는 하기의 화학식:
Figure pct00002
을 갖고,
RC9는 히드록실 또는 *-L-A이고, RAC는 수소 또는 *-L-A이고, 단 적어도 하나의 *-L-A 기가 존재한다.
적합한 분지쇄 N 연결 올리고당은 GlnNAc를 이등분하거나 하지 않는 G2 당형을 갖는 것을 포함한다. 상기 경우들에서, 상기 G2 당형의 C-3 팔은 상기 제1 카고 모이어티에 접합되고, 상기 G2 당형의 C-6 팔은 상기 제2 카고 모이어티에 접합된다. 특정 구현예들에서, 상기 N 연결 올리고당은 하기의 화학식:
Figure pct00003
을 갖고
P는 단백질을 나타내고, Rf는 수소 또는 푸코오스로에서 독립적으로 선택되고, n은 0 또는 1이고, Rg는 수소 또는 GlcNAc에서 선택되고, R3은 C-3 팔을 나타내며, R6은 C-6 팔을 나타낸다. 일부 경우들에서, Rg는 하기의 화학식을 갖는다:
Figure pct00004
상기 N 연결 올리고당의 C-3 팔은 하나 이상의 제1 카고 모이어티에 접합된 말단 시알로사이드(상기 정의된 바와 같음)를 포함할 수 있다. 상기 말단 시알로사이드는 하기의 화학식:
Figure pct00005
을 갖고,
Ra1, Ra2, Ra3, 및 Ra4는 -OH 또는 *-L1-(A1)a에서 독립적으로 선택되고, Rb는 -H 또는 *-L1-(A1)a에서 독립적으로 선택되고, L1은 제1 링커를 나타내고, A1은 제1 카고 화합물을 나타내며, a는 1 또는 2이고, 단 적어도 하나의 *-L1-(A1)a 기가 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 말단 시알로사이드는 하기의 화학식:
Figure pct00006
을 갖고,
Ra는 -OH 또는 *-L1-(A1)a에서 독립적으로 선택되고, Rb는 -H 또는 *-L1-(A1)a에서 독립적으로 선택되고, L1은 제1 링커를 나타내고, A1은 제1 카고 화합물을 나타내며, a는 1 또는 2이고, 단 적어도 하나의 *-L1-(A1)a 기가 존재한다.
일부 구현예들에서, R3은 하기의 화학식:
Figure pct00007
을 갖는 올리고당일 수 있고,
Ra 및 Rb는 상기 정의된 바와 같다.
상기 N 연결 올리고당의 올리고당의 C-6 팔은 하나 이상의 제2 카고 모이어티에 접합된 말단 시알로사이드(상기 정의된 바와 같음)를 포함할 수 있다. 상기 말단 시알로사이드는 하기의 화학식:
Figure pct00008
을 갖고,
Rc1, Rc2, Rc3, 및 Rc4는 -OH 또는 *-L2-(A2)a에서 독립적으로 선택되고, Rd는 -H 또는 *-L2-(A2)b에서 독립적으로 선택되고, L2는 제2 링커를 나타내고, A2는 제2 카고 화합물을 나타내며, b는 1 또는 2이고, 단 적어도 하나의 *-L2-(A2)b 기가 존재한다. 일부 경우들에서, 상기 C-6 팔은 하기의 화학식:
Figure pct00009
을 갖는 말단 시알산 모이어티를 포함할 수 있고,
Rc는 -OH 또는 *-L2-(A2)b에서 독립적으로 선택되고, Rd는 -H 또는 *-L2-(A2)b에서 독립적으로 선택되고, L2는 제2 링커를 나타내고, A2는 제2 카고 화합물을 나타내며, b는 1 또는 2이고, 단 적어도 하나의 *-L2-(A2)b 기가 존재한다.
일부 구현예들에서, R6은 하기의 화학식:
Figure pct00010
을 갖는 올리고당일 수 있고,
Rc 및 Rd는 상기 정의된 바와 같다.
특정 구현예들에서, L1은 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진:
Figure pct00011
또는
Figure pct00012
을 포함하고,
Z1 및 Y1 중 하나는 A1을 나타내고 다른 하나는 말단 시알로사이드를 나타내고, Z1이 A1일 때, z는 1 또는 2이고 y는 1이며, Y1이 A1일 때, z는 1이고 y는 1 또는 2이고;
Rt1은 수소, C1-8알킬, C1-8알콕시, 아릴, C1-8헤테로아릴, C3-8시클로알킬, C1-8헤테로시클릴, 또는 Z1이 A1일 때, 다른 *-LH1-(Z1)z 기를 나타내며; 그리고
LH1 및 LC1은 각각 독립적으로 무효, 절단성, 및 비절단성 링커에서 선택된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 특정 탄소에서 종결되지 않고 대신 고리 시스템으로의 결합은 원자가가 충족되는 한 상기 결합이 상기 고리 상의 임의의 원자에 위치할 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 상기 트리아졸은 1,2 트리아졸:
Figure pct00013
, 또는
1,4 트리아졸:
Figure pct00014
일 수 있다.
특정 구현예들에서, L1은 7, 8, 9 또는 10원, 선택적으로 치환된 고리에 선택적으로 융합된 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진을 포함할 수 있다. 예시적인 선택적 치환기는 할로겐, 카르보닐, 및 융합된 아릴을 포함한다. 일부 경우들에서, L1은 8원 고리에 융합된 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진:
Figure pct00015
또는
Figure pct00016
을 포함할 수 있고,
Z1 Y1 z, y, LC1, LH1, 및 Rt1은 상기 정의된 바와 같다. 상기 고리를 정의하는 원자들 중 임의의 것은 탄소 또는 헤테로원자일 수 있다. 상기에 명시적으로 도시되지는 않았지만, 상기 고리 내의 임의의 원자는 1회 이상 치환될 수 있다.
특정 구현예들에서, Ra 및 Rb는 독립적으로 하기의 화학식:
Figure pct00017
,
Figure pct00018
,
Figure pct00019
,
Figure pct00020
Figure pct00021
또는
Figure pct00022
을 갖는 *-L1-(A1)a 기일 수 있고,
여기서,
Rco는 수소 또는 할로겐, 예컨대 F, Cl, Br, 또는 I이고;
X는 무효 또는 O이고;
R0은 각각의 경우에 독립적으로 수소, 할로겐, C1-8알킬, C1-8알콕시, 아릴, C1-8헤테로아릴, C3-8시클로알킬, 또는 C1-8헤테로시클릴에서 선택되고; 임의의 2개 이상의 R0 기가 함께 고리를 형성하고;
E1는:
Figure pct00023
,
Figure pct00024
,
Figure pct00025
, 또는
Figure pct00026
에서 선택되고,
Z1, Y1, z, y, Rt1, LH1, 및 LC1은 상기 정의된 바와 같다.
추가의 구현예들에서, Ra는 *-L1-(A1)2 기일 수 있고 Rb는 *-L1-A1 기일 수 있는 반면, 다른 구현예들에서는, Ra는 *-L1-A1 기일 수 있고 Rb는 *-L1-(A1)2 기일 수 있다.
특정 바람직한 구현예들에서, LH1은 무효이고 Z1은 말단 시알로사이드이다. 추가의 구현예들은 LC1이 링커이고 Y1이 A1인 것을 포함한다.
LH1 및 LC1 기에 대한 절단성 링커는 하나 이상의 히드라존 또는 기타 산 민감성 기, 캡테신 B 반응성 기, β 글루쿠로니다제 반응성 기, 이황화 기, 또는 피로포스페이트 디에스테르 기를 포함할 수 있다.
일부 경우들에서, 상기 *-L1-A1 기는 하기의 화학식:
Figure pct00027
또는
Figure pct00028
을 가질 수 있고,
LH1, Z1, z 및 E1은 상기 정의된 바와 같고, Re는 수소, 또는 *-OSO3X1 또는 *-OPO3X1 중 하나에서 선택되고, X1은 H, C1-8알킬, 또는 약학적으로 허용가능한 양이온에서 선택된다. 다른 구현예들에서, 각각의 R0은 수소이고 E1은:
Figure pct00029
이다.
특정 구현예들에서, L2는 1,2,3-트리아졸(1,2 또는 1,4 이성질체) 또는 1,2-디아진:
Figure pct00030
또는
Figure pct00031
을 포함하고,
Z2 및 Y2 중 하나는 A2를 나타내고 다른 하나는 말단 시알로사이드를 나타내고, Z2가 A2일 때, z는 1 또는 2이고 y는 1이며, Y2가 A2일 때, z는 1이고 y는 1 또는 2이고;
Rt2는 수소, C1-8알킬, C1-8알콕시, 아릴, C1-8헤테로아릴, C3-8시클로알킬, C1-8헤테로시클릴, 또는 Z2가 A2일 때, 다른 *-LH2-(Z2)z 기를 나타내며; 그리고
LH2 및 LC2는 각각 독립적으로 무효, 절단성, 및 비절단성 링커에서 선택된다. 특정 구현예들에서, L2은 7, 8, 9 또는 10원, 선택적으로 치환된 고리에 선택적으로 융합된 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진을 포함할 수 있다. 예시적인 선택적 치환기는 할로겐 및 융합된 아릴을 포함한다. 일부 경우들에서, L2는 8원 고리에 융합된 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진:
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
을 포함할 수 있고,
Z2, Y2, z, y, Rt2, LH2, 및 LC2는 상기 정의된 바와 같다. 상기 도시된 8원 고리 또는 다른 크기의 고리 중 하나에서의 탄소환식 고리는 본원에 정의된 바와 같이 1회 이상 추가로 치환될 수 있다.
특정 구현예들에서, Rc 및 Rd는 독립적으로 하기의 화학식:
Figure pct00034
,
Figure pct00035
Figure pct00036
또는
Figure pct00037
을 갖는 *-L2-(A2)a 기일 수 있고,
여기서,
Rco는 수소 또는 할로겐, 예컨대 F, Cl, Br, 또는 I이고;
X는 무효 또는 O이고;
R0은 각각의 경우에 독립적으로 수소, 할로겐, C1-8알킬, C1-8알콕시, 아릴, C1-8헤테로아릴, C3-8시클로알킬, 또는 C1-8헤테로시클릴에서 선택되고; 임의의 2개 이상의 R0 기가 함께 고리를 형성하고;
E2는:
Figure pct00038
,
Figure pct00039
,
Figure pct00040
, 또는
Figure pct00041
에서 선택되며, 그리고
Z2, Y2, z, y, Rt2, LH2, 및 LC2는 상기 정의된 바와 같다.
추가의 구현예들에서, Rc는 *-L2-(A2)2 기일 수 있고 Rd는 *-L2-A2 기일 수 있는 반면, 다른 구현예들에서는, Rc는 *-L2-A2 기일 수 있고 Rd는 *-L2-(A2)2 기일 수 있다.
일부 바람직한 구현예들에서, LH2는 무효이고 Z2는 말단 시알로사이드이다. 추가의 구현예들은 LC2가 링커이고 Y2가 A2인 화합물들을 포함한다.
LH2 및 LC2 기에 대한 절단성 링커는 히드라존 기, 캡테신 B 반응성 기, β 글루쿠로니다제 반응성 기, 이황화 기, 또는 피로포스페이트 디에스테르 기를 포함한다.
일부 경우들에서, 상기 *-L2-A2 기는 하기의 화학식:
Figure pct00042
또는
Figure pct00043
을 가질 수 있고,
LH2, Z2, z 및 E2는 상기 정의된 바와 같고, Re는 수소, 또는 *-OSO3X1 또는 *-OPO3X1에서 선택되고, X1은 H, C1-8알킬, 또는 약학적으로 허용가능한 양이온에서 선택된다. 다른 구현예들에서, 각각의 R0은 수소이고 E2는:
Figure pct00044
일 수 있다.
이중 약물 ADC의 제조 방법
본원에 개시된 이중 약물 ADC는 N 연결 올리고당을 제1 기능화된 시알로사이드 및 이어서 제2 기능화된 시알로사이드로 선택적으로 글리코실화함으로써 수득할 수 있다. 특정 구현예들에서, G2 당형을 갖는 N 연결 올리고당은 제1 기능화된 시알로사이드 및 이어서 제2 기능화된 시알로사이드로 글리코실화될 수 있다. 원하는 경우, 상기 N 연결 올리고당은 송아지 장 알칼리성 인산분해효소(CIAP)의 존재하에 갈락토실 트랜스퍼라제(GalT) 및 UDP-Gal로 처리하여 G2 당형으로 전환될 수 있다. 특정 구현예들에서, 예를 들어 Asn297 위치에서 실질적으로 모든 N 연결 올리고당이 G2 당형 내에 있는 것이 바람직하다. 상기 N 연결 올리고당은 C-3 팔에서 제1 당형 공여자로 클리코실화되고, 상기 제1 글리코실 공여자는 적어도 하나의 클릭가능 기를 포함한다. 바람직한 클릭가능 기는 아지드, 1,2,4,5 테트라진, 시클로옥틴, 및 트랜스 시클로옥텐을 포함한다.
바람직한 제1 글리코실 공여자는 기능화된 시알로사이드 공여자를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 기능화된 시알로사이드는 시알산 분자에 공유 결합된 적어도 하나의 클릭가능 기를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 글리코실 공여자는 하기의 화학식:
Figure pct00045
을 갖는 화합물일 수 있고,
Nuc는 뉴클레오시드(예를 들어, 시토신)를 나타내고, Rz는 -OH 및 *-LH1'-Q에서 선택되고, Ry는 H 및 *-LH1'-Q에서 선택되고, LH1'은 무효, 절단성 링커, 및 비절단성 링커에서 선택되며, Q는 클릭가능 기이며, 단 적어도 하나의 *-LH1'-Q가 존재한다. 적합한 Q 기는 아지드(N3), 및 하기의 화학식:
Figure pct00046
,
Figure pct00047
,
Figure pct00048
,
Figure pct00049
,
Figure pct00050
,
Figure pct00051
또는
Figure pct00052
를 갖는 기들을 포함하고,
X, Rco 및 R0는 상기 정의된 바와 같고 Rtd는 수소, C1-8알킬, C1-8알콕시, 아릴, C1-8헤테로아릴, C3-8시클로알킬, 또는 C1-8헤테로시클릴이다.
일부 예들에서, 상기 제1 글리코실 공여자는 하기의 화학식:
Figure pct00053
또는
Figure pct00054
을 갖는 시알로사이드일 수 있고,
LH2’는 무효, 절단성, 및 비절단성 링커에서 선택된다.
일부 구현예들에서, 상기 N 연결 올리고당 대 제1 글리코실 공여자의 화학량론적 비는 1:1 내지 1:8, 1:1 내지 1:6, 1:1 내지 1:5, 1:2 내지 1:5, 또는 1:3에서 1:5일 수 있다.
특정 구현예들에서, 상기 제1 글리코실 공여자와의 글리코실화 후, 상기 N 연결 올리고당과 제1 카고 공여자 사이의 고리화첨가 반응을 실시함으로써 상기 제1 카고 모이어티가 접합될 수 있다. 상기 제1 카고 공여자는 상기 제1 기능화된 시알로사이드의 Q 기와 반응하는 작용기를 포함한다. 예를 들어, 상기 시알로사이드가 아지드 또는 테트라진 기를 포함하는 경우, 상기 카고 공여자는 사이클로옥틴 또는 트랜스-사이클로옥텐 기를 포함할 수 있다. 유사하게, 상기 시알로사이드가 시클로옥틴 또는 트랜스-시클로옥텐 기를 포함하는 경우, 상기 카고 공여자는 아지드 또는 테트라진을 포함할 수 있다.
상기 제1 고리화 첨가 반응 후, 상기 N 연결 올리고당은 제2 글리코실 공여자로 글리코실화될 수 있다. 바람직한 제2 글리코실 공여자는 기능화된 시알로사이드 공여자를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제2 글리코실 공여자는 하기의 화학식:
Figure pct00055
을 갖는 화합물일 수 있고,
Nuc, Rz, Ry, LH1’ 및 Q는 상기 정의된 바와 같고, 단 적어도 하나의 *-LH2’-Q가 존재한다. 상기 제2 글리코실 공여자는 상기 제1 글리코실 공여자와 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 제2 글리코실 공여자가 설치된 후, 상기 N 연결 올리고당과 제2 카고 공여자 사이에 제2 고리화 첨가 반응을 실시함으로써 상기 제2 카고 모이어티를 접합할 수 있다. 상기 제2 카고 공여자는 상기 제2 기능화된 시알로사이드의 Q 기와 반응하는 작용기를 포함한다. 예를 들어, 상기 제2 시알로사이드가 아지드 또는 테트라진 기를 포함하는 경우, 상기 제2 카고 공여자는 사이클로옥틴 또는 트랜스-사이클로옥텐 기를 포함할 수 있다. 유사하게, 상기 제2 시알로사이드가 시클로옥틴 또는 트랜스-시클로옥텐 기를 포함하는 경우, 상기 제2 카고 공여자는 아지드 또는 테트라진을 포함할 수 있다. 예시적인 공정 개략도는 탁소이드 카고 공여자(D1) 및 조스퀴다르 유래 카고 공여자(D2)를 사용하여 도 4에 도시하였다.
시약 및 조건: a) UDP-Gal, 갈락토실트랜스퍼라제, MOPS 완충액, pH 7.2; b) 아지드 기능화된 시알로사이드, ST6Gal1, CIAP; c) (D1); d) 아지드 기능화된 시알로사이드, ST6Gal1, CIAP; e) (D2). a-e에 대한 반응은 카코딜레이트 완충액, pH 7.6에서 실시하였다.
특정 구현예들에서, 상기 Q 기는 상기 제1 및 제2 고리화첨가 반응이 동시에 실시되도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 글리코실 공여자의 Q 기는 아지드(공여자 1, 도 5a)를 포함할 수 있고, 상기 제2 글리코실 공여자의 Q 기는 테트라진(공여자 2, 도 5a)을 포함할 수 있다. 각각의 기능화된 시알로사이드가 상기 N 연결 올리고당 상에 설치된 후, 화합물은 시클로옥틴을 포함한 제1 카고 공여자 및 트랜스-시클로옥텐을 포함한 제2 카고 공여자 둘 모두와 조합될 수 있다. 상기 글리코실화 공정은 도 5a에 도시되어 있고, 특정 시알로사이드 공여자는 도 5b에 도시되어 있으며, 접합 반응은 도 5c에 도시되어 있다.
본원에 개시된 공정은 독성 금속이 필요하지 않고 모든 단계가 주위 온도에서 매우 효율적으로 진행되기 때문에 균질한 이중 약물 ADC를 생성하는 데 매우 적합하다. 별도의 시약을 사용한 부위 특이적 접합을 위한 다른 접근 방식들과 달리, 새로운 접근 방식은 부위 특이적 아미노산 돌연변이 또는 기타 유전적 변형이 필요하지 않으며 간단한 변형에 의존한다.
본원에 개시된 이중 약물 ADC는 다양한 병태, 특히 암 및 다제내성 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 ADC는 부신피질 암종, 방광암, 골암, 유방암, 중추신경계 비정형 기형/횡문근양 종양, 결장암, 결장직장암, 배아 종양, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 간세포암, 카포시육종, 간암, 폐암(소세포폐암 및 비소세포폐암을 포함), 난소암, 직장암, 횡문근육종, 소장암, 연조직육종, 편평세포암종, 편평 경부암, 위암, 자궁암, 질암, 외음부암, 부신피질암, 방광암, 골암, 유방암, 중추신경계 비정형 기형/횡문근 종양, 결장암, 결장직장암, 배아종양, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 간세포암, 카포시 육종, 간암, 소세포 폐암 및 비소세포 폐암을 포함한 폐암, 난소암, 직장암, 횡문근육종 소장암, 연조직 육종, 편평세포 암종, 편평 경부암, 위암, 자궁암, 질암 또는 외음부암을 치료하는 데 사용될 수 있다.
추가 구현예들에서, 본원에 개시된 이중 약물 ADC는 하나 이상의 이전에 투여된 화학요법제에 불응성인 암을 갖는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한, 상기 이중 약물 ADC는 다제내성을 나타내지 않는 환자에게 투여될 수 있으며, 이러한 경우 상기 이중 약물 ADC는 다제내성의 발병을 방지한다.
본원에 개시된 이중 약물 ADC는 적어도 하나의 약학적으로 적합한 성분을 함유하는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약학적 담체(예를 들어, 멸균 액체)를 함유한다. 본원에서, 액체는, 예를 들어 물 및 오일(석유 및 동물성, 식물성, 합성유)을 포함한다. 상기 오일은 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일 또는 참기름일 수 있다. 물은 상기 약학적 조성물이 정맥내 투여될 때 보다 전형적인 담체이다. 식염수, 덱스트로스 수용액 및 글리세롤 수용액도 특히 주사액의 액체 담체로 사용할 수 있다. 적합한 약학적 비히클은 당업계에 공지되어 있다. 원한다면, 상기 조성물은 또한 미량의 보습제, 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
실시예
하기 실시예들은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
일반 시약 및 재료. 숙신산 무수물, 피리딘, 트리스(에틸렌 글리콜)-1,8-디아민, 트리에틸아민, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU), N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA), 염화트리틸, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(EDC), 디메틸아미노 피리딘(DMAP), N-아지도아세틸-D-만노사민, 피루브산나트륨, L-아스코르브산 나트륨, 트리플루오로아세트산(TFA) 및 트리이소프로필실란(TIPS)은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에서 구입하였다. 파클리탁셀 및 조스퀴다르는 LC 실험실 및 아펙스 바이오테크놀로지 사(Apex Biotechnology Inc.)에서 구입하였다. 만노세아민 염산염은 카보신스(Carbosynth) LLC에서 구입하였다. 디클로로메탄(DCM)은 질소 분위기하에서 새로 증류하였다. 기타 유기 용매는 무수물을 구입하여 추가 정제 없이 사용하였다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 반응은 실온(RT)에서 자기 교반과 함께 오븐 건조된 유리 제품에서 실시하였다. 유기 용액을 40℃ 미만의 수조 온도에서 감압하에 농축시켰다. 플래시 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔 G60(실리사이클(Silicycle), 60-200 μm, 60
Figure pct00056
) 상에서 실시하였다. 박막 크로마토그래피(TLC)는 적용 가능한 경우 UV 흡수(254 nm)로 검출하고 에탄올 중 20% 황산을 분무한 후 ~150℃에서 탄화시키거나, 또는 에탄올 중 10% 황산의 (NH4)6Mo7O24.H2O (25 g L-1) 용액을 분무한 다음 ~150oC에서 탄화시켜 실리카겔 60 F254(EMD 케미칼스 사(Chemicals Inc.)) 상에서 실시하였다.
화합물 특성화를 위한 일반적인 방법. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 태양 워크스테이션이 장착된 베리안 이노바(Varian Inova)-300(300/75MHz), 베리안 이노바-500(500MHz) 및 베리안 이노바(Varian Inova)-600(600/150MHz) 분광계에서 기록하였다. 다중도는 단일항(s), 이중항(d), 이중항들의 이중항(dd), 삼중항(t) 또는 다중항(m)으로 인용된다. NMR 신호는 1H NMR, gCOSY 및 gHSQC 실험을 기반으로 할당하였다. 화학적 이동은 δ 척도에서 백만분율(ppm)로 표시한다. 잔류 용매 신호를 내부 기준으로 사용하였다. 질량 스펙트럼은 어플라이드 바이오 시스템즈(Applied Biosystems) 5800 MALDI-TOF 또는 시마즈(Shimadzu) LCMS-IT-TOF 질량 분석계에서 기록하였다. 사용된 매트릭스는 2,5-디히드록시 벤조산(DHB)이었다.
생화학 시약. CD22 항체(HD239)는 산타 크루즈(Santa Cruz)에서 구입하였다. 바이오테크놀로지 사(Biotechnology, Inc.)의 펩티드 N-글리코시다제 F는 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)에서 구입하였다. 재조합 래트 α-(2,6)-시아릴트랜스퍼라제(ST6Gal I)를 보고된 절차에 따라 제조하였다.[1] 시알산 알돌라아제, CMP-시알산 합성효소, 및 송아지 장 알칼리성 인산분해효소는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 및 케밀리(Chemily)에서 구입하였다.
화합물 1의 합성을 위한 1-포트 2-효소 시스템 접근법
Figure pct00057
(화합물 1)
시알산 알돌라아제(0.2 U/μL, 5 μL) 및 CMP-시알산 합성효소(0.2 U/μL, 5 μL)를 피루브산나트륨(10.5 mg, 0.095 mmol) 및 CTP(10 mg, 0.019 mmol)를 함유한 트리스(Tris)-HCl 완충액(100 mM, pH 8.9, 20 mM MgCl2, 1.9 mL) 중의 N-아지도아세틸-D-만노사민(5 mg, 0.019 mmol) 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 배양하고, TLC(EtOH:NH4HCO3(aq.) (1 M) 7:3, v:v)로 반응 진행을 모니터링하였으며, 이는 5시간 후 반응 완료를 나타내었다. EtOH(3 mL)를 첨가하고, 침전물을 원심분리에 의해 제거한 후, 상층액을 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 증류수(500 μL)에 재용해한 후, 동결건조하여 조 물질을 제공하고 바이오겔(Biogel) 미세 P-2 컬럼(50x1 cm, 4oC의 암실에서 0.1 M NH4HCO3으로 용출)에 적용하였다. TLC는 생성물을 검출하고 적절한 분획을 취합한 후, 동결건조하여 1을 무정형의 백색 고체로서 제공하였다(10.1 mg, 81%).
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 7.86 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-6, cyt), 6.02 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-5, cyt), 5.88 (d, J = 4.5 Hz, 1H, H-1, rib), 4.27 - 4.19 (m, 2H, H-2 + H-3, rib), 4.12 (dd, J = 9.1, 7.6 Hz, 4H), 4.08 - 3.97 (m, 3H, H-4 + N3CH 2CO), 3.92 (t, J = 10.3 Hz, 1H), 3.83 (ddd, J = 9.4, 6.5, 2.6 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 11.8, 2.5 Hz, 1H), 3.52 (dd, J = 11.9, 6.6 Hz, 1H), 3.34 (dd, J = 9.6, 1.2 Hz, 1H), 2.40 (dd, J = 13.2, 4.8 Hz, 1H, H-3eq), 1.55 (ddd, J = 13.3, 11.3, 5.8 Hz, 1H, H-3ax). HRMS (ESI): m/z calcd for C20H30N7O16P [M-H]-: 654.1414; found: 654.2023.
화합물 2의 합성 절차
Figure pct00058
Figure pct00059
4-(((1S,2R)-1-벤즈아미도-3-(((4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-디아세톡시-12-(벤조일옥시)-4,11-디히드록시-4a,8,13,13-테트라메틸-5-옥소-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-도데카히드로-1H-7,11-메타노시클로데카[3,4]벤조[1,2-b]옥세트-9-일)옥시)-3-옥소-1-페닐프로판-2-일)옥시)-4-옥소부탄산(5)
Figure pct00060
1.2 mL 피리딘 중의 4(0.05 g, 0.06 mmol) 및 숙신산 무수물(0.076 g, 0.76 mmol)의 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 3시간 후, 피리딘을 진공에서 증발 건조시켰다. 그런 다음, 잔류물을 2 ml의 물로 처리하고, 20분 동안 교반하고, 여과하였다. 얻어진 침전물을 아세톤 내에서 녹이고 물을 천천히 첨가하여 생성물의 미세한 결정을 수집하였다. 이로써, 5의 0.048 g(86%)을 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 12.25 (br s, 1H), 9.19 (d, 1H), 7.94-8.00 (d, 2H), 7.81-7.85 (d, 2H), 7.70-7.73 (m, 1H), 7.63-7.66 (m, 2H), 7.49-7.56 (m, 1H), 7.45-7.50 (m, 2H), 7.40-7.44 (m, 4H), 7.11-7.21 (m, 1H), 6.27 (s, 1H), 5.76-5.83 (t, 1H), 5.73 (s, 1H), 5.50-5.54 (t, 1H), 5.40 (d, 1H), 5.34 (d, 1H), 4.88-4.90 (d, 2H), 4.61 (s, 1H), 4.08-4.11(m, 1H), 3.97-4.02 (m, 2H), 3.56 (d, 1H), 2.57-2.63 (t, 2H), 2.27-2.37 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 1.76-1.83 (m, 1H), 1.74 (s, 3H), 1.58-1.65 (t, 1H), 1.48 (s, 3H), 1.21 (s, 1H), 0.95-1.00 (d, 6H).
13C NMR 134, 131.9, 130, 129.2, 129.20, 129.09, 128.85, 128.09,127.93, 84.15, 75.76, 75.11, 75, 75.14, 71.41,71,55.34, 54.43,46.51, 40.28, 37.11, 37, 34.86, 34.86, 29.28, 29, 26.74, 23.11, 22.05, 21.16, 14.39, 10.63, 10.33. MALDI HRMS for C51H55NO17 m/z [M+Na+] 976.35; found 976.346.
Figure pct00061
비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸(4-니트로페닐)카보네이트(6)
CH2Cl2(10 mL) 중의 ((1R,8S,9r)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메탄올(100 mg, 0.66 mmol)의 용액에 피리딘(134.70 μL, 1.66 mmol) 및 4-니트로페닐 클로로포르메이트(200 mg, 1 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 포화 염화암모늄 용액(10 mL)으로 중지시키고 CH2Cl2(3x10 mL)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4를 사용하여 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(EtOAc: 헥산, 1:5)로 추가로 정제하여 원하는 생성물 6(162 mg, 77%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.28 (d, 2H), 7.40 (d, 2H), 4.31(d, 2H), 2.15-2.5 (m, 6H), 1.35-1.45 (m, 2H), 0.64-0.75 (m, 3H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3): δ 155.6, 152.5, 145.3, 125.3, 121.7, 98.7, 68.0, 29.0, 21.3, 20.5, 17.2.
((1R,8S,9r)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)카바메이트(7)
Figure pct00062
Et3N(339 μL, 1.945 mmol)을 CH2Cl2(10 mL) 중의 6(150 mg, 0.389 mmol) 및 트리스(에틸렌 글리콜)-1,8-디아민(569 μL, 3.89 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반한 후, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 라트로비드 상에서 플래시 크로마토그래피(MeOH/CH2Cl2, 5 내지 25%, v/v)로 정제하여 화합물 7을 밝은 연노란색 액체(116 mg, 92%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 5.48 (br s, NH), 4.15 (d, 2H), 3.5-3.75 (m, 8H), 3.4 (br s, 2H), 2.9 (br s, 2H), 2.5 (br s, 2NH2), 2.16-2.36 (m, 6H), 1.5-1.65 (m, 2H), 1.2-1.44 (m and s, 3H), 0.79-1.00 (m, 2H) 13C NMR (150 MHz, CDCl3): δ 98.8, 73.4, 70.3, 70.2, 70.1, 62.7, 41.7, 40.8, 29.1, 21.4, 20.1, 17.8. MALDI HRMS for C17H28N2O4 m/z calcd (M + H)+ 325.2124, found: 325.2122.
(4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-9-(((19R)-19-((S)-벤즈아미도(페닐)메틸)-1-(비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일)-3,14,17-트리옥소-2,7,10,18-테트라옥사-4,13-디아자이코산-20-오일)옥시)-12-(벤조일옥시)-4,11-디히드록시-4a,8,13,13-테트라메틸-5-옥소-3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a-데카히드로-1H-7,11-메타노시클로데카[3,4]벤조[1,2-b]옥세트-6,12b(2aH)-디일 디아세테이트 (2)
Figure pct00063
5(5 mg, 0.0052 mmol) 및 7(2.1 mg, 0.0062 mmol)의 혼합물을 무수 DMF(1 mL)에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민(2.73 μL, 0.0157 mmol) 및 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU, 3 mg 및 0.00786 mmol)를 순차적으로 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 실온에서 2시간 동안 반응을 교반한 후 완전한 반응을 나타내었다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 조 생성물을 이동상으로서 EtOAc : 헥산(5 내지 15%, v/v)을 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 2를 백색 고체(6.5 mg, 98%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.15 (d, 1H), 7.83 (d, 1H), 7.63 (t, 1H), 7.52 (dt, 2H), 7.48 - 7.37 (m, 3H), 7.32 (s, 1H), 6.30 (s, 1H), 6.25 - 6.13 (m, 1H), 5.69 (d, 1H), 5.46 (d, 0H), 5.31 (s, 0H), 5.03 - 4.92 (m, 0H), 4.32 (d, 1H), 4.21 (d, 1H), 4.13 (q, 1H), 3.96 (d, 1H), 3.81 (d, 1H), 3.60 (d, 4H), 3.48 (s, 1H), 3.37 (s, 2H), 2.77 (t, 1H), 2.54 (d, 2H), 2.44 (s, 1H), 2.39 (d, 1H), 2.35 - 2.28 (m, 1H), 2.24 (s, 2H), 2.15 (d, 1H), 2.06 (s, 1H), 1.93 (s, 2H), 1.69 (s, 2H), 1.64 (s, 4H), 1.50 (dd, 3H), 1.33 - 1.20 (m, 5H), 1.14 (s, 2H), 0.93 - 0.85 (m, 1H), 0.73 (s, 1H).
13C NMR (150 MHz, CDCl3): δ 130.22, 127.36, 133.70, 128.72, 131.85, 126.78, 129.00, 128.43, 75.61, 71.74, 53.19, 75.08, 74.37, 84.43, 72.10, 76.42, 76.42, 69.23, 45.60, 70.23, 69.77, 39.36, 40.73, 43.72, 29.44, 35.13, 30.76, 22.68, 33.27, 35.47, 21.39, 21.39, 35.48, 14.82, 35.57, 9.62, 23.39, 9.62, 18.63, 17.32, 33.28, 22.68, 31.61, 29.66, 26.80, 22.13, 14.12, 22.87, 23.69. MALDI HRMS for C68H81N3O20 m/z calcd (M + Na)+ 1282.54, found: 1282.534.
화합물 3의 합성 절차
Figure pct00064
3-((2-(트리틸아미노)에틸)디술파닐)프로판산 (9)
Figure pct00065
트리틸기 보호된 아미노-에틸디티오프로판산 링커는 실온에서 24시간 동안 교반된 1 mL 디메틸포름아미드 중의 8(10 mg, 0.055 mmol) 및 트리에틸아민(16.7 mg, 23 μL, 0.165 mmol)의 용액에 트리틸 클로라이드(46 mg, 0.165 mmol)를 첨가하여 제조하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반한 후, 용매를 감압하에 증발시키고, 조 생성물을 MeOH:DCM(2 내지 5%, v/v)을 구배 컬럼 시스템으로 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 화합물 9를 노란색 고체로서 수득하였다(19 mg, 82%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.53 - 7.46 (m, 6H), 7.35 - 7.27 (m, 6H), 7.24 - 7.18 (m, 3H), 4.62 (s, 1H), 2.86 (t, 2H), 2.80 - 2.70 (m, 4H), 2.51 (t, 2H). MALDI HRMS for C24H25NO2S2 m/z calcd (M + H)+ 424.14, found: 424.136.
(2R)-1-(4-((1aR,10bS)-1,1-디플루오로-1,1a,6,10b-테트라히드로디벤조[a,e]시클로프로파[c][7]아눌렌-6-일)피페라진-1-일)-3-(퀴놀린-5-일옥시)프로판-2-일 3-((2-(트리틸아미노)에틸)디술파닐)프로파노에이트 (11)
Figure pct00066
9 (12 mg, 0.0284 mmol), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'에틸카르보디이미드 염산염(7.2 mg, 0.0376 mmol), 촉매량의 디메틸 아미노 피리딘(DMAP), 및 트리에틸아민(4.8 mg, 7 μL, 0.047 mmol)의 반응 혼합물 을 2 ml CH2Cl2에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 화합물 10(5 mg, 0.0094 mmol)을 0℃에서 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 8 ml CH2Cl2로 희석하고 염수 및 포화 중탄산나트륨(각각 5ml)으로 추출하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시키고 조 생성물을 구배 시스템으로서 MeOH : DCM(0 내지 3%, v/v)을 사용한 실리카겔 크로마토그래피 상에서 정제하여 순수한 화합물 11을 베이지색 고체(7 mg, 81%)로서 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.90 (dd, 1H), 8.56 - 8.50 (m, 1H), 7.72 (d, 1H), 7.61 (t, 1H), 7.48 (d, 8H), 7.32 - 7.25 (m, 10H), 7.22-7.12 (m, 6H), 6.87 (d, 1H), 5.52 (dd, 1H), 5.32 (s, 1H), 4.35 (dd, 1H), 4.26 (dd, 2H), 4.15 (q, 1H), 3.92 (s, 1H), 3.20 (d, 2H), 2.92 - 2.67 (m, 8H), 2.64 - 2.23 (m, 10H), 2.09 (d, 1H).
13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 150.80, 130.75, 122.08, 129.23, 128.57, 128.57, 120.39, 127.87, 127.88, 132.70, 132.71, 127.94, 126.34, 129.26, 127.56, 105.18, 70.03, 53.43, 68.43, 68.43, 77.96, 28.96, 40.76, 40.38, 33.18, 33.90, 34.24, 58.07, 58.07, 53.69, 54.19, 41.74, 52.25. MALDI HRMS for C56H54F2N4O3S2 m/z calcd (M + H)+ 933.36, found: 933.354.
(2R)-1-(4-((1aR,10bS)-1,1-디플루오로-1,1a,6,10b 테트라히드로디벤조[a,e]시클로프로파[c][7]아눌렌-6-일)피페라진-1-일)-3-(퀴놀린-5-일옥시)프로판-2-일-3-((2-(((비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시)카르보닐)아미노)에틸)디술파닐)프로파노에이트 (3)
Figure pct00067
화합물 11(5 mg, 0.0053 mmol)을 1 mL 디클로로메탄에 용해시켰다. 2% TFA 및 TIPS v/v를 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 30분 후, 용매를 감압하에 증발시키고 생성된 아미노-TFA 염을 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 다음으로, 아미노-TFA 염을 DMF 중의 6(2.53 mg, 0.008 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(2.1 mg, 3 μL, 0.016 mmol)을 함유하는 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 16시간 동안 교반한 후, 용매를 감압하에 증발시키고 조 생성물을 MeOH : DCM(0 내지 2% v/v)의 이동상을 사용한 실리카 겔 컬럼 상에서 정제하여 화합물 3(4 mg, 89%)을 우수한 수율로 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 8.90 (dd, 1H), 8.56 - 8.45 (m, 1H), 7.71 (d, 1H), 7.59 (t, 1H), 7.38 (dd, 1H), 7.25 - 7.22 (m, 1H), 7.22 - 7.17 (m, 3H), 7.12 (tdd, 5H), 6.86 (d, 1H), 5.55 (s, 2H), 5.10 (s, 1H), 4.38 - 4.22 (m, 2H), 3.95 (t, 3H), 3.49 - 3.37 (m, 2H), 3.34 (s, 2H), 3.16 (d, 2H), 2.90 (t, 2H), 2.82 - 2.69 (m, 4H), 2.46 - 2.00 (m, 9H), 0.90 - 0.77 (m, 4H), 0.76 - 0.61 (m, 3H). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 130.92, 122.03, 129.42, 120.42, 77.11, 132.78, 128.12, 129.65, 127.68, 105.32, 76.87, 68.39, 68.40, 69.25, 70.03, 77.78, 39.58, 39.63, 56.01, 28.94, 33.10, 33.07, 38.31, 34.25, 38.14, 33.37, 33.33, 21.42, 21.41, 21.41, 33.37, 29.35, 31.71, 22.91, 23.69. MALDI HRMS for C48H52F2N4O5S2 m/z calcd (M + Na)+ 889.33, found: 889.32.
이중 약물 ADC의 합성(도 4 참조)
항 CD22 항체의 트립신 소화로부터 당펩티드의 분석
IgG 항체의 분취량을 스피드(Speed) Vac(사반트(Savant) SC 110)으로 건조시키고 중탄산암모늄 완충액(50 mM, pH 8.4)에 재용해하고 100℃에서 5분 동안 가열하여 당단백질을 변성시켰다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 트립신(트립신/IgG = 1/30, w/w)을 첨가하고 용액을 37℃에서 22시간 동안 배양한 후, 트립신을 비활성화하기 위해 5분 동안 100℃로 가열하였다. 용액을 C18 역상 카트리지에 통과시키고, 5% 아세트산 수용액으로 세척하고, 2-프로판올/5% 아세트산(20-100%)의 구배로 용출하여 당펩티드를 수득한 후, 엑스브리지(XBridge)-BEH 아미드-HILIC 컬럼(워터스(Waters), 미국 매사추세츠 주 밀퍼드(Milford) 소재; 2.1×150 mm, 3.5 μm 입자 크기)이 장착된 LCMS-IT-TOF 질량 분석계(시마즈(Shimadzu))로 처리하였다. 상기 분리는 이동상 A를 물(포름산을 사용하여 pH 3.4-3.6으로 조정함) 중 100 mM 포름산 암모늄으로 구성하고 이동상 B는 순수한 ACN으로 구성한 상태에서 20°C에서 0.16 mL/분의 유속으로 실시하였다.
β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 사용한 항 CD22 항체의 글리칸 리모델링
항 CD22 항체 용액에 UDP-갈락토스(10 mM), BSA(80 μg mL-1), 송아지 장 알칼리성 인산분해효소(85 U mL-1) 및 소 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(100 mU mL-1)를 MnCl2(20 mM)를 함유하는 MOPS 완충액(50 mM, pH 7.2) 중에서 30 mg mL-1 IgG의 최종 농도로 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 완전한 갈락토실화를 보장하기 위해, UDP 갈락토오스(4 mg) 및 갈락토실트랜스퍼라제(7 mU)의 추가 분취량을 첨가하고 반응 혼합물을 37°C에서 추가 24시간 동안 배양하였다. 갈락토실화된 IgG는 단백질 A 세파로오스 컬럼(GE 헬스케어(Healthcare))을 사용하여 정제하였다.
항 CD22 항체의 모노시알릴화
카코딜레이트 완충액(50 μL, 50 mM, pH 7.6) 중의 항 CD22 항체에, CMP-Neu5Ac5N3(항체에 대한 1의 다양한 몰비), BSA(1%), 송아지 장 알칼리성 인산분해효소(1.3%) 및 ST6Gal I( 5 μL, 1.0 mg mL-1)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 항체를 단백질 A 세파로오스 컬럼 크로마토그래피로 정제하고 정제된 항체를 트립신으로 분해하였다. 생성된 당펩티드 및 펩티드는 상기에 기재된 바와 같이 HILIC LC-ESI를 사용하여 분리 및 분석하였고 1 대 항체의 4:1의 몰비에서 항체의 완전한 모노시알릴화를 유발하였다(도 2 및 도 3).
모노시알릴화 항체와 화합물 2의 접합
DMF(16 μL, 5 mM, 2.5 당량) 중의 화합물 2를 카코딜레이트 완충액(190 μL, 50 mM, pH 7.6) 중의 항 CD22 항체(1.2 mg)에 첨가하고 혼합물을 실온에서 9시간 동안 배양한 후 회전 여과 컬럼을 통과하여 과량의 2를 제거하여 15를 수득한 후, 정제된 항체 용액에서 비접합 2의 존재를 MALDI-TOF 질량 분석계로 모니터링하고 스핀 여과 칼럼을 통과한 후 항체 용액에서 유리 2가 검출되지 않았다.
항체 15의 추가 시알릴화 및 3과의 접합
230 μL의 50 mM 카코딜레이트 중 15(0.25 mg)의 용액(pH 7.6)에 CMP-Neu5Ac5N3(0.5 mg, 0.76 μmol), ST6GalI(40 μL, 1 mg/mL), BSA(1%) 및 송아지 장 알칼리성 인산분해효소(1.3%)를 첨가하고 혼합물을 37°C에서 24시간 동안 배양한 후 단백질 A 컬럼 정제를 실시하고, 용출된 항체 용액의 완충액을 회전 여과에 의해 카코딜레이트 완충액으로 교환하고 275 μL까지 16을 취하였다. 16의 용액에 DMF 중 화합물 3(8 μL, 5 mM, 10 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 배양한 후 회전 여과 정제를 실시하여 안정적인 트리아졸 연결 이중 약물 변형 ADC 17을 수득하였다.
이중 약물 ADC는 다제내성 암에 효과적이다.
세포주 및 배양
나말와 21 nM VCR(빈크리스틴(21 nM) 노출에 의한 다제내성 세포 및 나말와 야생형(ATCC CRL-1432) 세포를 L-글루타민(2 mM), 중탄산나트륨(1.5 g L-1), 글루코오스(4.5 g L-1), HEPES(10 mM) 및 피루브산나트륨(1.0 mM)이 포함된 ATCC 제형 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 배지에 페니실린(100 U mL-1) 및 스트렙토마이신(100 μg mL-1, 메디아텍(Mediatech)) 및 태아 소 혈청(FBS, 10%, 벤치마크(BenchMark))을 보충하였다. 세포를 37oC의 습한 5% CO2 분위기에서 유지하고 2-3일마다 계대 배양하였다.
세포독성 분석
PCTX 및 화합물 2, 2&10, 15 및 17의 세포독성은 MTT 분석을 사용하여 결정하였다. 노출 당일에, 기하급수적으로 성장하는 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트(눈크(Nunc))에 160 μL에서 25,000개 세포/웰로 분주하였다. 그런 다음, 세포를 표시된 최종 농도(0,1-1000 nM)에서 배지(대조군) 또는 화합물(20 μL, 세포 배양 배지 중 10X)과 함께 배양하였다. 68시간에, MTT 시약(PBS 중 5 mg mL-1, 20 μL/웰)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 추가로 배양하였다. 72시간에, 상기 플레이트를 4°C에서 10분 동안 1400 rpm으로 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거하였다. DMSO(100 μL/웰)를 첨가하여 수불용성 포르마잔 염을 용해시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기(BMG 랩테크(Labtech))를 사용하여 545 nm에서 측정하였다. 데이터 포인트는 삼중으로 수집하였고 처리되지 않은 대조군 세포(100%)에 대한 정규화된 값으로 표현하였다. 데이터는 프리즘(Prism) 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어 사(GraphPad Software, Inc.))를 사용하여 맞춤을 실시하였다.
나말와 세포를 다양한 농도의 PCTX, 화합물 2, 2에 접합된 항 CD22(15) 및 2 및 3에 의해 변형된 동일한 항체(17)와 함께 72시간 동안 배양하였다. 도 3a에 도시된 바와 같이, PCTX(IC50=2 nM)는 2(IC50=26 nM)보다 활성이 더 높은데, 이는 활성 약물을 사용할 수 있게 하기 위해서는 에스테르 결합의 절단에 시간이 필요하기 때문일 가능성이 크다. 또한, 단독이거나 또는 mAb(15)에 접합된 화합물 2는 세포가 두 제제(각각 IC50 = 26 및 61nM)를 쉽게 내재화함을 나타내는 유사한 EC50 값을 가졌다.
대조군 항체에 접합된 화합물 2는 ADC에 의한 세포독성제의 선택적 전달을 나타내는 어떠한 세포독성도 나타내지 않았다(데이터 미도시). 예상한 바와 같이, 화합물 10의 첨가는 mAb(IC50=25 nM)의 세포독성에 눈에 띄는 영향을 미치지 않았는데, 이는 상기 세포주가 P-gp를 과발현하지 않기 때문이다. 다음으로, 다제내성 나말와 세포주(MDR+ve)에서 다양한 화합물 및 접합체의 세포독성을 조사하였다. 단독이거나 또는 항 CD22(15)에 접합된 화합물 2는 아마도 가장 가능성이 높은 이유로서 P-gp에 의한 약물 유출로 인해 상기 세포주에서 감지할 수 있는 활성이 없었다. 만족스럽게도, 세포독성 약물 및 P-gp 억제제(17)로 mAb를 변형한 결과 IC50이 64 nM인 용량 의존적 세포독성이 나타났다.
첨부된 청구범위의 방법 및 조성은 본원에 기재된 특정 조성 및 방법에 의해 그 범위가 제한되지 않으며, 이는 청구범위의 몇몇 양태의 예시로서 의도된 것이고 기능적으로 동등한 임의의 조성 및 방법은 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 본원에 나타내고 기재된 것들 이외의 조성 및 방법의 다양한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에 개시된 특정한 대표 조성 및 방법 단계만이 구체적으로 설명되었지만, 조성 및 방법 단계의 다른 조합은 구체적으로 언급되지는 않더라도, 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 따라서, 단계, 요소, 구성 요소 또는 구성품의 조합이 본원에서 명시적으로 또는 덜 언급될 수 있지만, 명시적으로 언급되지 않더라도 단계, 요소, 구성 요소 및 구성품의 다른 조합이 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)" 및 이의 변형된 형태는 "포함하는(including)" 및 이의 변형 형태와 동의어로 사용되며, 개방적이고 비제한적인 용어다. 다양한 구현예를 설명하기 위해 본원에서 "~을 포함하는"이라는 용어를 사용했지만, 발명의 보다 구체적인 구현예를 제공하기 위해 "~을 포함하는"을 대신하여 "본질적으로 ~로 이루어진" 및 "~로 이루어진"이란 용어가 사용될 수 있으며 또한 개시된다. 실시예 외에 또는 달리 명시된 경우를 제외하고, 명세서 및 청구범위에 사용된 성분 및 반응 조건 등의 양을 나타내는 모든 숫자는 최소한으로 이해되어야 하며, 균등론을 청구범위에 적용하는 것을 제한하려는 시도로서가 아니라, 유효 자릿수 및 일반적인 반올림 방식의 관점에서 해석되어야 한다.

Claims (41)

  1. N 연결 올리고당을 포함하는 기능화된 항체로서, 상기 올리고당은 접합된 제1 카고 모이어티, 및 상기 제1 카고 모이어티와 상이한 접합된 제2 카고 모이어티를 포함하는, 기능화된 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 카고 모이어티가 실질적으로 1:1 비율로 존재하는, 기능화된 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 N 연결 올리고당이 G2 당형을 포함하는, 기능화된 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 G2 당형의 C-3 팔이 상기 제1 카고 모이어티에 접합되고, 상기 G2 당형의 C-6 팔이 상기 제2 카고 모이어티에 접합되는, 기능화된 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 N 연결 올리고당이 하기의 화학식:
    Figure pct00068
    을 갖고,
    P는 단백질을 나타내고, Rf는 수소 또는 푸코오스에서 독립적으로 선택되고, n은 0 또는 1이고, Rg는 수소 또는 GlcNAc에서 선택되고, R3은 C-3 팔을 나타내며, R6은 C-6 팔을 나타내는, 기능화된 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고당의 C-3 팔이 상기 제1 카고 모이어티에 접합된 말단 시알로사이드를 포함하는, 기능화된 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 C-3 팔이 하기의 화학식:
    Figure pct00069
    을 갖는 올리고당을 포함하고,
    Ra는 -OH 또는 -L1-A1에서 독립적으로 선택되고, Rb는 -H 또는 -L1-A1에서 독립적으로 선택되고, L1은 제1 링커를 나타내며 A1은 제1 카고 화합물을 나타내고, 단 적어도 하나의 L1-A1 기가 존재하는, 기능화된 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고당의 C-6 팔이 상기 제2 카고 모이어티에 접합된 말단 시알로사이드를 포함하는, 기능화된 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 C-6 팔이 하기의 화학식:
    Figure pct00070
    을 갖는 올리고당을 포함하고,
    Rc는 -OH 또는 -L2-A2에서 독립적으로 선택되고, Rd는 -H 또는 -L2-A2에서 독립적으로 선택되고, L2은 제2 링커를 나타내며 A2는 제2 카고 화합물을 나타내고, 단 적어도 하나의 L2-A2 기가 존재하는, 기능화된 항체.
  10. 제9항에 있어서,
    Ra는 히드록실이고 Rb는 L1-A1인, 기능화된 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    L1은 7, 8, 9, 또는 10원 고리에 선택적으로 융합된 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진을 포함하는, 기능화된 항체.
  12. 제11항에 있어서,
    L1은 하기의 화학식:
    Figure pct00071
    또는
    Figure pct00072
    을 갖는 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진을 포함하고,
    Z1 및 Y1 중 하나는 A1을 나타내고 다른 하나는 말단 시알로사이드를 나타내고, Z1이 A1일 때, z는 1 또는 2이고 y는 1이며, Y1이 A1일 때, z는 1이고 y는 1 또는 2이고;
    Rt1은 수소, C1-8알킬, C1-8알콕시, 아릴, C1-8헤테로아릴, C3-8시클로알킬, C1-8헤테로시클릴, 또는 Z1이 A1일 때, 다른 *-LH1-(Z1)z 기를 나타내며; 그리고
    LH1 및 LC1은 각각 독립적으로 무효, 절단성, 및 비절단성 링커에서 선택되는, 기능화된 항체.
  13. 제12항에 있어서,
    L1은 하기의 화학식:
    Figure pct00073
    또는
    Figure pct00074
    을 갖는 고리에 융합된 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진을 포함하는, 기능화된 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    L1은 하기의 화학식:
    Figure pct00075
    ,
    Figure pct00076
    ,
    Figure pct00077
    ,
    Figure pct00078
    ,
    Figure pct00079
    또는
    Figure pct00080
    을 갖는 모이어티를 포함하고,
    여기서,
    Rco는 수소 또는 할로겐, 예컨대 F, Cl, Br, 또는 I이고;
    X는 무효 또는 O이고;
    R0은 각각의 경우에 독립적으로 수소, 할로겐, C1-8알킬, C1-8알콕시, 아릴, C1-8헤테로아릴, C3-8시클로알킬, 또는 C1-8헤테로시클릴에서 선택되고; 임의의 2개 이상의 R0 기가 함께 고리를 형성하고
    E1은:
    Figure pct00081
    ,
    Figure pct00082
    ,
    Figure pct00083
    , 또는
    Figure pct00084
    에서 선택되는, 기능화된 항체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 절단성 링커는 하나 이상의 히드라존 기, 캡테신 B 반응성 기, β 글루쿠로니다제 반응성 기, 이황화 기, 또는 피로포스페이트 디에스테르 기를 포함하는, 기능화된 항체.
  16. 제15항에 있어서,
    LH1은 무효이고 Z1은 상기 올리고당의 C-3 팔인, 기능화된 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    LC1은 링커이고 Y1은 A1인, 기능화된 항체.
  18. 제17항에 있어서,
    Rc는 히드록실이고 Rd는 L2-A2인, 기능화된 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    L2는 7, 8, 9, 또는 10원 고리에 선택적으로 융합된 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진을 포함하는, 기능화된 항체.
  20. 제19항에 있어서,
    L21는 하기의 화학식:
    Figure pct00085
    또는
    Figure pct00086
    을 갖는 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진을 포함하고,
    Z2 및 Y2 중 하나는 A2를 나타내고 다른 하나는 말단 시알로사이드를 나타내고, Z2가 A2일 때, z는 1 또는 2이고 y는 1이며, Y2가 A2일 때, z는 1이고 y는 1 또는 2이고;
    Rt2는 수소, C1-8알킬, C1-8알콕시, 아릴, C1-8헤테로아릴, C3-8시클로알킬, C1-8헤테로시클릴, 또는 Z2가 A2일 때, 다른 *-LH2-(Z2)z 기를 나타내며; 그리고
    LH2 및 LC2는 각각 독립적으로 무효, 절단성, 및 비절단성 링커에서 선택되는, 기능화된 항체.
  21. 제20항에 있어서,
    L2는 하기의 화학식:
    Figure pct00087
    또는
    Figure pct00088
    을 갖는 고리에 융합된 1,2,3-트리아졸 또는 1,2-디아진을 포함하는, 기능화된 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    L2는 하기의 화학식:
    Figure pct00089
    ,
    Figure pct00090
    ,
    Figure pct00091
    ,
    Figure pct00092
    ,
    Figure pct00093
    또는
    Figure pct00094
    ,을 갖는 모이어티를 포함하고,
    여기서,
    Rco는 수소 또는 할로겐, 예컨대 F, Cl, Br, 또는 I이고;
    X는 무효 또는 O이고;
    R0은 각각의 경우에 독립적으로 수소, 할로겐, C1-8알킬, C1-8알콕시, 아릴, C1-8헤테로아릴, C3-8시클로알킬, 또는 C1-8헤테로시클릴에서 선택되고; 임의의 2개 이상의 R0 기가 함께 고리를 형성하고
    E2는:
    Figure pct00095
    ,
    Figure pct00096
    ,
    Figure pct00097
    또는
    Figure pct00098
    에서 선택되는,
    기능화된 항체.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 절단성 링커는 하나 이상의 히드라존 기, 캡테신 B 반응성 기, β 글루쿠로니다제 반응성 기, 이황화 기, 또는 피로포스페이트 디에스테르 기를 포함하는, 기능화된 항체.
  24. 제23항에 있어서,
    LH2는 무효이고 Z2는 상기 올리고당의 C-3 팔인, 기능화된 항체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    LC2는 링커이고 Y2는 A2인, 기능화된 항체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 카고 화합물은 세포독성 화합물, 항생제 화합물, 항바이러스 화합물, 또는 리포터 화합물을 포함하는, 기능화된 항체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 카고 화합물은 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 항대사물질, 삽입제, 프로테아좀 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항종양 항생제에서 선택되는 화학요법제를 포함하는, 기능화된 항체화합물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 카고 화합물은 ABC 수송 조절제, DNA 메틸화 억제제, P 당단백질 억제제, 또는 면역 조절제를 포함하는, 기능화된 항체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 기능화된 항체를 제조하는 방법으로서:
    a) G2 당형을 포함하는 N 연결 올리고당을 제1 글리코실 공여자로 선택적으로 글리코실화하는 단계로서, 상기 제1 글리코실 공여자는 적어도 하나의 클릭가능 기를 포함하고;
    상기 N 연결 올리고당 대 제1 글리코실 공여자의 화학량론적 비는 1:1 내지 1:8, 1:1 내지 1:6, 1:1 내지 1:5, 1:2 내지 1:5, 또는 1:3에서 1:5인, 단계;
    b) 상기 제1 글리코실 공여자 내에 존재하는 클릭가능 기 및 제1 카고 상대 사이에 고리화첨가 반응을 실시하는 단계;
    c) 상기 N 연결 올리고당을 제2 글리코실 공여자로 글리코실화하는 단계로서, 상기 제2 글리코실 공여자는 적어도 하나의 클릭가능 기를 포함하는, 단계;
    d) 상기 제2 글리코실 공여자 내의 클릭가능 기 및 제2 카고 상대 사이에 고리화첨가 반응을 실시하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 글리코실 공여자는 동일하고, 단계(b)는 단계(c) 이전에 실시되거나; 또는
    상기 제1 글리코실 공여자 내의 클릭가능 기는 상기 제2 글리코실 공여자 내의 클릭가능 기와 상이하고, 단계(b)는 단계(c) 이전 또는 이후에 실시되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 제1 글리코실 공여자 내의 클릭가능 기는 상기 제2 글리코실 공여자 내의 클릭가능 기와 상이하고, 단계(d)는 단계(b)와 동시에 실시되는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 글리코실 공여자는 하기의 화학식:
    Figure pct00099
    을 갖는 화합물에서 독립적으로 선택되고,
    Nuc는 뉴클레오시드를 나타내고, Rz는 -OH 및 *-LH1'-Q에서 선택되고, Ry는 H 및 *-LH1'-Q에서 선택되고, LH1'은 무효, 절단성 링커, 및 비절단성 링커에서 선택되며, Q는 클릭가능 기이며, 단 적어도 하나의 *-LH1'-Q가 존재하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 글리코실 공여자는 하기:
    Figure pct00100
    에서 선택되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 클릭가능 기는 아지드, 1,2,4,5 테트라진, 시클로옥틴, 또는 트랜스 시클로옥텐을 포함하는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    Q는 알킨, 아지드(N3), 또는 하기의 화학식:
    Figure pct00101
    ,
    Figure pct00102
    ,
    Figure pct00103
    ,
    Figure pct00104
    ,
    Figure pct00105
    ,
    Figure pct00106
    또는
    Figure pct00107
    을 갖는 기를 포함하고,
    X, Rco 및 R0는 상기 정의된 바와 같고 Rtd는 수소, C1-8알킬, C1-8알콕시, 아릴, C1-8헤테로아릴, C3-8시클로알킬, 또는 C1-8헤테로시클릴인, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 글리코실 공여자는 하기의 구조식:
    Figure pct00108
    을 갖는 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 글리코실 공여자는 하기의 구조식:
    Figure pct00109
    을 갖고,
    LH2’는 무효, 절단성, 및 비절단성 링커에서 선택되는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된, 이중 약물 항체 약물 접합체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 이중 약물 항체 약물을 포함하는, 약학적 조성물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 이중 약물 항체 약물 접합체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 상기 환자에서 암을 치료하는 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 암이 내성 암인, 방법.
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