JP2010506568A - リンホトキシン−αに対する抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、リンホトキシンαに結合する様々な抗体、該抗体の作製方法、該抗体を含む組成物及び製造品、そして、例えば自己免疫性疾患を治療する際のこれらの使用を提供する。該抗体には、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体が包含される。

Description

（関連出願）
この非仮出願は、２００６年１０月１２日に出願の米国仮特許出願第６０／８２９２５７号、及び２００７年５月１８日に出願の米国仮特許出願第６０／９３８９９９号の優先権の利益を主張するものであり、これら仮特許出願は出典明記によってその全体が援用される。
（技術分野）
本発明は、抗体及び、自己免疫性疾患を治療するためのその使用に関する。より具体的には、本発明は、リンホトキシンαに結合し、また一又は複数のレセプターへのリンホトキシンαリガンドの結合を遮断しうる抗体に関する。
ＴＮＦおよびＬＴ
自己免疫性疾患は、依然としてヒトにおいて臨床的に重要な疾患である。その名の通り、自己免疫性疾患は、身体の自身の免疫系によって破壊が生じる。病理学的メカニズムが個々の種類の自己免疫性疾患の中で異なる一方で、ある一つの一般的なメカニズムには存在する特定の抗体(本明細書において自己反応性抗体又は自己抗体と称される)の結合が伴う。医師および科学者は、関節リウマチ(ＲＡ)、多発性硬化症(ＭＳ)、血管炎、免疫関連糖尿病、及び全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)等の狼瘡を含む７０より多い臨床的に異なる自己免疫性疾患を同定している。多くの自己免疫性疾患は稀で、２０００００足らずの個体が罹患しているに過ぎないが、これらの疾患を合わせると何百万ものアメリカ人（集団の約５パーセント）を苦しめており、ほとんどの疾患は女性に偏っている。これらの疾患の慢性的性質は、非常に大きな社会的・財政的な負荷となる。
腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)-関連タンパク質は、従来技術では、宿主の防御からアポトーシスへの免疫調節まで変動する様々な活性を有するタンパク質の大きなファミリーと認識されている。ＴＮＦは初めに、インビトロでいくつかの形質転換細胞株にとって細胞毒性となり、インビボで特定の腫瘍の壊死を引き起こした血清由来の因子として同定された。スーパーファミリーの類似の因子が同定され、リンホトキシン(「ＬＴ」)と称された。１９８０年代の初期にＴＮＦとＬＴとの間で観察された類似点によって、それぞれ、ＴＮＦおよびＬＴがＴＮＦαおよびＴＮＦβと称することが提案された。したがって科学文献は両名称を使用している。本出願において用いられているように、「ＴＮＦ」なる用語はＴＮＦαを指す。後の研究によって、リンホトキシンの２つの形態が明らかとなりＬＴαおよびＬＴβと称された。米国公開特許２００５−０１２９６１４は、構造的及び生物学的類似点に基づいて、ＴＬ−５と称するＴＮＦリガンドスーパーファミリーの他のポリペプチドメンバーを記載している。
タンパク質のＴＮＦファミリーのメンバーは、細胞-細胞接触によって局所的に作用する膜結合型の形態で存在するか、または分泌されたタンパク質として存在する。ＴＮＦ関連のレセプターのファミリーは、これらのタンパク質と反応して、細胞死ないしアポトーシス、細胞増殖、組織分化および炎症誘発性応答を含むさまざまなシグナル伝達経路を引き起こす。ＴＮＦ-α自体は、炎症性疾患、自己免疫性疾患、ウイルス、細菌及び寄生性感染、悪性腫瘍および／または神経変性疾患に関係しており、ＲＡおよびクローン病等の疾患において特定の生物学的療法のための有用な標的である。
ＴＮＦ及びＬＴαタンパク質のクローニング、これらそれぞれの生物活性の更なる特徴付けにより、タンパク質が多くの態様において異なることが示されている。Aggarwal et al., Cytokines and Lipocortins in Inflammation and Differentiation, Wiley-Liss, Inc. 1990, pp. 375-384。たとえばＬＴαは、およそ２０ｋＤａ(Ｎ−およびＯ−グリコシル化である場合２５ｋＤａ)の分泌された、可溶性タンパク質である。一方、ＴＮＦはグリコシル化のための部位を有しておらず、本来のタンパク質転写が細胞結合型となる明らかな膜貫通ドメインを有して合成される。細胞関連ＴＮＦタンパク質がタンパク質分解されると、およそ１９ｋＤａの分子量を有するタンパク質の可溶形態が放出される。ＴＮＦは活性化されたマクロファージによって主に生産されるのに対して、ＬＴは活性化されたリンパ球によって生産される。Wong et al., Tumor Necrosis Factors: The Molecules and their Emerging Role in Medicine, Beutler, B., ed., Raven Press (1991), pp. 473-484。ＴＮＦおよびＬＴαをコードする配列も異なる。ＴＮＦおよびＬＴαは、およそ３２％のみのアミノ酸配列同一性を有する。ＴＮＦおよびＬＴαの異なる生物活性に関しては、ＴＮＦは内皮細胞インターロイキン１(「ＩＬ-１」)の生産を増加させるのに対して、ＬＴはその作用をほとんど持たない。さらに、マクロファージからのＴＮＦはマクロファージコロニー刺激性因子の生産を誘導するのに対して、ＬＴαはその作用を持たない。これら及びこの他の生物学的活性についてはAggarwal, Tumor Necrosis Factors: Structure, Function and Mechanism of Action, Aggarwal and Vicek, eds. (1992), pp. 61-78において論じられている。
ＴＮＦおよびＬＴαについては、Spriggs, "Tumor Necrosis Factor: Basic Principles and Preclinical Studies," Biologic Therapy of Cancer, DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company (1991) Ch. 16, pp. 354-377；Ruddle, Current Opinion in Immunology, 4:327-332 (1992)；Wong et al., "Tumor Necrosis Factor," Human Monocytes, Academic Press (1989), pp. 195-215；及びPaul et al., Ann. Rev. Immunol., 6:407-438 (1988)による総説においてさらに記述されている。
非腫瘍細胞では、ＴＮＦ及びＴＮＦ関連のサイトカインはさまざまな免疫反応において活性である。ＴＮＦ及びＬＴαのリガンドはＴＮＦレセプターに結合して、そのレセプターを活性化する(ｐ５５又はｐ６０及びｐ７５又はｐ８０；ここでは「ＴＮＦ−Ｒ」と称する)。
細胞表面ＬＴ複合体は、ＬＴを高レベルで発現するＣＤ４＋Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞(ＩＩ-２３.Ｄ７)において特徴が示された(Browning et al., J. Immunol., 147: 1230-1237 (1991)；Androlewicz et al., J. Biol. Chem., 267: 2542-2547 (1992))。ＬＴ-Ｒ、ＬＴサブユニットおよび表面ＬＴ複合体の発現および生物学的役割は、Ware et al., "The ligands and receptors of the lymphotoxin system", in Pathways for Cytolysis, Current Topics Microbiol. Immunol., Springer-Verlag, pp. 175-218 (1995)において概説される。
主に活性化されたＴ及びＢリンパ球及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞によってＬＴα発現が誘導され、ＬＴαが分泌される。Ｔヘルパー細胞サブクラスの中で、ＬＴαはＴｈ２細胞でなくＴｈ１によって生産されるようである。ＬＴαはまた、メラニン細胞においても検出された。ＬＴβ(ｐ３３とも称される)は、Ｔリンパ球、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株およびリンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)細胞の表面上で同定された。研究によって、ＬＴβはＬＴαの非存在下で機能しないことが示された。
ＬＴαは、ホモ三量体(ＬＴα３)又はＬＴβとのヘテロ三量体として存在する。これらのヘテロ三量体は、２つのＬＴαサブユニットと１つのＬＴβサブユニット(ＬＴα２β１)か、又は１つのＬＴαサブユニットと２つのＬＴβ(ＬＴα１β２)のいずれかを含有する。
ＬＴαホモ三量体に対する唯一公知の細胞表面レセプターは２つのＴＮＦレセプター、ｐ５５及びｐ７５である。しかしながら、ＬＴαβヘテロ三量体であるＬＴα1β２は、ＴＮＦレセプターに結合せず、その代わりにＴＮＦレセプタースーパーファミリのメンバーであるリンホトキシンレセプター(本明細書においてＬＴβ-Ｒと称される)に結合する。ヘテロ三量体型のＬＴα２β１はおそらくＴＮＦレセプターを結合する。
ＬＴβ-Ｒは、濾胞性樹状細胞および多くの間質性細胞種を含む、免疫系の発達及び免疫系の多くの細胞の機能的維持において、十分に記載された役割を有する(Matsumoto et al., Immunol. Rev. 156: 137 (1997))。ＬＴβ-Ｒに対する公知のリガンドには、ＬＴα１β２だけでなく、ＬＩＧＨＴと称される第二リガンドも包含される(Mauri et al., Immunity 8:21 (1998))。ＬＴβ-Ｒの活性化によって、インビボで特定の癌細胞株のアポトーシス死が誘導されることが示された(米国特許６３１２６９１)。ＬＴβ-Ｒに対するヒト化抗体及びその使用方法は米国公開特許２００４−００５８３９４に示されており、ヒトの腫瘍形成の発達、重症度又は作用を治療する又は低減するために有用であることが言及されている。さらに、欧州特許第１５８５５４７号(国際公開２００４／０５８１８３) (LePage and Gill)は、一又は複数の他の化学療法剤と組み合わせてＬＴβ−Ｒシグナル伝達を活性化する組成物を包含する併用療法、並びにＬＴβ−Ｒアゴニスト剤と組み合わせて腫瘍抑制に対する付加的効果を有する薬剤を同定するための治療的方法及びスクリーニング方法を開示している。
ノックアウトマウスから明らかなように、ＬＴはリンパネオゲネシス(リンパ新生)にとって重要である。ＬＴβ−Ｒを欠失しているマウスがリンパ節とパイエル板を欠くこと、さらに正常に機能しない抗体親和性成熟を示している、Futterer et al. Immunity, 9 (1): 59-70 (1998)を参照のこと。Rennert et al., Immunity, 9 (1): 71-9 (1998)は、ＬＴβ−Ｒに対するアゴニストモノクローナル抗体がＬＴαノックアウトマウスのリンパ節製造能を修復したことを報告した。また、Wu et al., J. Immunology, 166 (3): 1684-9 (2001)およびEndres et al., J. Exp. Med., 189 (1): 159-68 (1999)；Dohi et al., J. Immunology, 167 (5): 2781-90 (2001)；及びMatsumoto et al., J. Immunology, 163 (3): 1584-91(1999)も参照のこと。Korner et al. Eur. J. Immun., 27 (10): 2600-9 (1997)は、ＴＮＦとＬＴを欠失しているマウスがＢ細胞成熟の遅延と血清イムノグロブリン欠損を示したのに対して、ＴＮＦのみ欠損しているマウスはこのような欠損を示さなかったことを報告した。
さらに、ＬＴは炎症に重要である。ＬＴαは、炎症、ケモカイン発現の増加、及びリンパ様構造を示すＲＩＰ.ＬＴトランスジェニックマウスの膵臓で過剰発現されるが、このトランスジェニックマウスではＬＴβのみを過剰発現しても更なる炎症を示さなかった。さらに、ＬＴα欠失マウスはＴＮＦα産生の機能不全を表し、このようなマウスにＴＮＦ導入遺伝子をかけると欠損した脾臓の構造と機能が修復し(Kollias, J. Exp. Med., 188:745 (1998); Chaplin, Ann Rev Imm 17:399 (1999))、減少したＴＮＦ濃度は病原性抗原投与の後に回復する(Eugster, Eur. J.Immun. 31:1935 (2001))。
ＴＮＦα又はＬＴα３が、ＴＮＦレセプターであるＴＮＦＲＩおよび／またはＴＮＦＲＩＩと相互作用すると、炎症誘発性応答および／またはアポトーシスが起こる。ＬＴα１β２がレセプターＬＴβ-Ｒと相互作用すると、リンパ新生とケモカインおよび接着分子の誘導が起こる。自己免疫性疾患は、リンパ新生および炎症反応と関係しており、ＭＳ、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)及びＲＡを含む自己免疫性疾患患者においてＬＴ発現が増加する(Weyand et al., Curr. Opin. Rheumatol., 15: 259-266 (2003)；Selmaj et al., J. Clin.Invest., 87: 949-954 (1991)；Matusevicius et al., J. Neuroimm., 66: 115-123 (1996)；Powell et al., International Immunology, 2 (6): 539-44 (1990)；Zipp et al., Annals of Neurology, 38/5: 723-730 (1995)；Voskuhl et al., Autoimmunity 15 (2): 137-43 (1993)；Selmaj et al., J. Immunology, 147: 1522-29 (1991)；Agyekum et al., Journal Pathology, 199 (1): 115-21 (2003)；及びTakemura et al., J. Immunol., 167: 1072 (2001))。
ＭＳに関して具体的に言うと、血清ＬＴαは、ＭＳの病変／疾患負荷と相関している(Kraus et al., Acta Neurologica Scandinavica, 105 (4): 300-8 (2002))。ＬＴは、インビボクプリゾンモデルにおいて再ミエリン化でなく脱ミエリン化に関与しているのに対して、ＴＮＦαはこれら両方に必要である(Plant et al., Glia 49:1-14 (2005))。
ＲＡに関して具体的に言うと、ＲＡ患者におけるヒトＬＴα３及びＴＮＦαのレベルは正常なドナーのものよりも高い(Stepien, Eur Cytokine Net 9: 145 (1998))。ＲＡのＬＴαの役割には以下のことが含まれる。血清ＬＴαはいく人かのＲＡ患者に存在し、ＬＴαタンパク質は滑膜で増加しており、ＬＴ経路は滑膜における異所性リンパ新生と関係しており、そして、ＲＡ患者の線維芽細胞様滑膜細胞においてＬＴβ-Ｒ発現が増加している。さらに、症例報告では、ＬＴα３の効力を消すと、インフリキシマブ耐性ＲＡ患者に有益であることを開示している(Buch et al., Ann. Rheum.Dis., 63: 1344-46 (2004))。また、Han et al., Arthrit. Rheumat., 52: 3202-3209 (2005)は、ＬＴ経路を遮断するとＴｈ１応答が上昇し自己免疫性関節炎が悪化することを記載している。
コラーゲン誘導性の関節炎(ＣＩＡ)におけるＬＴβＲ-Ｉｇによる予防および治療のための臨床前有効性は、Fava et al., J. Immunology, 171 (1): 115-26 (2003)に示されている。さらに、ＬＴ欠損マウスは実験的自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ)に抵抗力がある(Suen et al., J. Exp. Med, 186: 1233-40 (1997)；Sean Riminton et al., J. Exp. Med, 187 (9): 1517-28 (1998))。ＥＡＥにおけるＬＴβＲ-Ｉｇの有効性も公開されている(Gommerman et al., J. Clin.Invest ,112 (5): 755-67 (2003))。また、ＬＴβＲ-Ｉｇはマウスのリンパ球新生を崩壊する。Mackay et al., Europ. J. Immunol. 27 (8): 2033-42 (1997))。さらに、LTβR.Igを投与すると、非肥満性糖尿病マウスにおけるインスリン依存性糖尿病(ＩＤＤＭ)が低減する(Wu et al., J. Exp. Med , 193 (11): 1327-32 (2001))。非ヒト霊長類におけるリンパ形成でのＬＴの役割は、ＬＴβＲ-Ｉｇを用いてGommerman et al., J. Clin. Invest.110 (9): 1359-69 (2002)によって研究された。さらに、ＬＴα欠損マウスは、ＴＮＦα欠損マウスよりもＭ. ｂｏｖｉｓ ＢＣＧに対する感受性が低い。Eugster et al., Europ. J. Immunol., 31: 1935 (2001)。
ＬＴもまた癌を治療するために用いられている。米国特許第５７４７０２３号を参照のこと。
抗体
抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すタンパク質である。天然抗体は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の作用領域を形成すると考えられている。
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合特異性に寄与するという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照)。
定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、抗体または免疫グロブリンは異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、更にそれらは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域はそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。ヒトイムノグロブリンのクラスの中のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＭのみが補体を活性化することが知られており、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４より効率よく抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を媒介する。
２つの主な手法を用いて、ＴＮＦαを阻害する治療的化合物を開発した。第一に、ＴＮＦαに対するキメラモノクローナル抗体であり、ＲＥＭＩＣＡＤＥ(登録商標)としても知られるインフリキシマブに例証されるように、親和性と有効性が高い特定のモノクローナル抗体を用いることによってＴＮＦα作用を中和し、ＴＮＦαのそのレセプターへの結合を妨げることである。第二に、ＥＮＢＲＥＬ(登録商標)としても知られるエタネルセプトに例証されるように、「おとり」として機能するＴＮＦレセプターベースの分子を用いることによってＴＮＦαを阻害して、ＴＮＦαのその天然のレセプターへの結合を低減することである。両方のタイプの分子がＴＮＦαのそのレセプターへの結合を妨げうるが、エタネルセプトのようなレセプターベースのインヒビターもまた、ＬＴαのレセプター結合を予防するであろう。
特許文献において、欧州特許第２１２４８９号によって開示されるカケクチン(ＴＮＦ)に対する抗体が、診断用イムノアッセイにおいて、そして、細菌性感染時のショックの療法において有用であることが報告されている。欧州特許第２１８８６８号は、ヒトＴＮＦに対するモノクローナル抗体とそれらの使用を開示している。欧州特許第２８８０８８号は、抗ＴＮＦ抗体、および病理、特に川崎の病理および細菌性感染のイムノアッセイ診断における該抗体の有用性を開示している。抗ＴＮＦ抗体もまた、例えば、欧州特許第１５８５４７７号(Giles-Komar et al.)；米国公開特許２００６−０１４７４５２；米国公開特許２００６−０２２２６４６；及び米国公開特許２００６−０１２１０３７において記載されている。ヒトＴＮＦαのそのレセプターへの結合をアンタゴナイズする単一ドメイン抗体ポリペプチドコンストラクトを用いたＲＡの治療方法は、米国公開特許２００５−０２７１６６３において記述されている。抗ＴＮＦレセプター融合タンパク質を用いたＲＡの治療方法は、米国公開特許２００５−０２６０２０１において記述されている。メトトレキセートと抗ＴＮＦ抗体とを含む組成物を用いた、ＲＡ、クローン病および移植と関連する急性及び慢性の免疫病を含む、ＴＮＦ媒介性疾患の治療方法は、欧州特許第１５９３３９３号において記述されている。ＴＮＦ-Ｒに結合する抗体は、米国特許第７０５７０２２号に記述されるものを包含する。ＴＮＦαアンタゴニスト活性を有する新規のタンパク質は米国特許第７０５６６９５号に記載されている。米国公開特許２００６−０１４７４４８は、ＬＴ経路インヒビターによる免疫学的腎臓疾患の治療を開示している。
ＬＴβおよびＬＴβ／ＬＴα複合体およびＬＴβ-Ｒおよびこの抗体、並びにＬＴβ遮断剤は、例えば、国際公開１９９２／００３２９；国際公開１９９４／１３８０８；米国特許第５６６１００４号；米国特許第５７９５９６４号；欧州特許第０９５４３３３号；米国特許第５６７０１４９号；米国特許第５９２５３５１号；米国公開特許２００５−００３７００３；米国特許第６４０３０８７号；米国特許第６６６９９４１号；米国特許第６３１２６９１号；米国特許第７００１５９８号；米国特許第７０３００８０号；米国公開２００６−０２２２６４４；及び米国公開特許２００５−０１６３７４７に記載されている。米国公開特許出願２００６−０１３４１０２は、化学療法剤と組み合わせたＬＴβ−Ｒ薬剤を開示している。ＬＴβ−Ｒに対する抗体は、米国公開特許２００５−０２８１８１１に記述されている。また、肥満及び肥満関連の疾患を予防及び／または治療するためのＬＴβ−Ｒ抗体の使用に関しては、国際公開２００６／１１４２８４も参照のこと。治療法においてＬＴβ−Ｒに特異的なヒト化抗体単独、または化学療法剤(一又は複数)と組み合わせた該抗体は、欧州特許第１５３９７９３号に開示されている。ＬＴαおよびこれに対する抗体は、例えば、米国特許第４９５９４５７号；米国特許第５８２４５０９号；米国特許第４９２０１９６号；及び米国特許第５６８３６８８号；米国公開特許２００５−０２６６００４(国際公開２００５／０６７４７７)および米国特許第５１８８９６９号(欧州特許第３４７７２８号Ｂ１)に記載されている。また、ＬＴβ又はＬＴβ−Ｒ技術に関しては、米国公開特許２００２-００３９５８０；国際公開２００４／０３９３２９；及び米国公開特許２００２-０１９７２５４も参照のこと。多価抗体(ＴＮＦレセプタースーパーファミリーを結合する)は、例えば、米国公開特許２００２−０００４５８７および米国公開特許２００６−００２５５７６に記述されている。
当分野では、ＬＴαがＴＮＦα又はＬＴβ単独よりも様々なレセプターとより多く相互作用するので、抗体、特に、ＬＴαをブロックする抗ＬＴα抗体ないしその断片等の、向上した機能を有する治療用抗体を製造することが引き続き必要とされている。
本発明は、重要な治療用標的として提示する生物学的／細胞性プロセスであるＬＴ生物学的経路の多様なアンタゴニストの同定に一部基づく。本発明は、限定するものではないが、様々なレセプターへのＬＴα結合を干渉することを含む、ＬＴα活性化の干渉に基づく組成物及び方法を提供する。
したがって、本発明は特許請求の範囲の通りである。一態様では、本発明は、
(a) KASQAVSSAVA(配列番号：１)又はRASQAVSSAVA(配列番号：２)であるアミノ酸Ａ１−Ａ１１を含むＣＤＲ-Ｌ１配列、又は、KSSQSLLYSTNQKNFLA(配列番号：３)又はKSSQSLLYSANQKNFLA(配列番号：４)又はKSSQSLLYSTNQKNALA(配列番号：６)であるアミノ酸Ａ１−Ａ１７を含むＣＤＲ-Ｌ１配列であって、このときＮが任意のアミノ酸であり(それぞれキメラ２Ｃ８又はヒト化２Ｃ８.ｖ２／２Ｃ８.ｖＸ又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５／ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４、又は３Ｆ１２クローン１４又は１７)、
(b) SASHRYT(配列番号：７)又はWASTRDS(配列番号：８)であるアミノ酸Ｂ１−Ｂ７を含むＣＤＲ-Ｌ２配列(それぞれキメラ２Ｃ８／ヒト化２Ｃ８.ｖ２／ヒト化２Ｃ８.ｖＸ又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５／ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４)、
(c) QQHYSTPWT(配列番号：９)又はQENYSTPWT(配列番号：１１)又はQQYYSYPRT(配列番号：１３)又はQQYASYPRT(配列番号：１４)又はQQYYAYPRT(配列番号：１５)であるアミノ酸Ｃ１−Ｃ９を含むＣＤＲ-Ｌ３配列であり、このときＮが任意のアミノ酸であり(それぞれキメラ２Ｃ８／ヒト化２Ｃ８.ｖ２又は２Ｃ８クローンＧ７又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５／ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４又は３Ｆ１２クローン２０又は３Ｆ１２クローン２１)、
(d) GYTFTSYVIH(配列番号：１６)又はGYTFSSYWIE(配列番号：１７)であるアミノ酸Ｄ１−Ｄ１０を含むＣＤＲ-Ｈ１配列(それぞれキメラ２Ｃ８／ヒト化２Ｃ８.ｖ２／ヒト化２Ｃ８.ｖＸ又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５／ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４)、
(e) YNNPYNDGTNYNEKFKG(配列番号：１８)又はEISPGSGSTNYNEEFKG(配列番号：１９)又はYNNPYNAGTNYNEKFKG(配列番号：１０１)又はEINPGSGSTIYNEKFKG(配列番号：１１０)であるアミノ酸Ｅ１−Ｅ１７を含むＣＤＲ-Ｈ２配列であり、このときＮが任意のアミノ酸であり(それぞれキメラ２Ｃ８／ヒト化２Ｃ８.ｖ２又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５、又はヒト化２Ｃ８.ｖＸ、又はヒト化３Ｆ１２.ｖ１４)、及び、
(f) PTMLPWFAY(配列番号：２０)であるアミノ酸Ｆ１-Ｆ９を含むＣＤＲ-Ｈ３配列、又は、GYHGY(配列番号：２１)又はGYHGA(配列番号：２２)であるアミノ酸Ｆ１−Ｆ５を含むＣＤＲ-Ｈ３配列(それぞれキメラ２Ｃ８／ヒト化２Ｃ８.ｖ２／ヒト化２Ｃ８.ｖＸ又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５／ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４又は３Ｆ１２クローン１２)
からなる群から選択される少なくとも一の相補性決定領域(ＣＤＲ)配列を含んでなる単離された抗リンホトキシンα(ＬＴα)抗体を提供する。
配列番号：３はKSSQSLLYSTAQKNFLA(配列番号：５)(３Ｆ１２クローン１５)であることが好ましい。他の好適な態様では、配列番号：１１は、QESYSTPWT(配列番号：１０)(２Ｃ８クローンＡ８／ヒト化２Ｃ８.ｖＸ)又はQEVYSTPWT(配列番号：１２)(２Ｃ８クローンＨ６)である。
他の好適な実施態様では、ＣＤＲ-Ｌ１配列は、配列番号：２又は３又は４又は６である。
他の好適な実施態様では、抗体は、(i) 配列番号：１又は２および７および９、又は配列番号：１又は２及び７又は８及び１１、又は配列番号：３、８および１３、又は配列番号：４、５又は６、８および１３、又は配列番号：３、８及び１４又は１５、又は配列番号：４、５又は６、８および１４又は１５のＣＤＲ-Ｌ１からＣＤＲ-Ｌ３アミノ酸配列のすべて、又は(ii) 配列番号：１６、１８および２０、又は配列番号：１６、１０１および２０、又は配列番号：１７、１９および２１又は２２、又は配列番号：１７、１１０および２１のＣＤＲ-Ｈ１からＣＤＲ-Ｈ３アミノ酸配列のすべて、のいずれかを含んでなる。
なお更なる好適な態様では、抗体は、配列番号：１又は２および７および９のすべて、又は配列番号：１６、１８および２０のすべて、又は配列番号：１６、１０１および２０のすべて、のいずれかを含んでなる。代替的な実施態様では、抗体は、配列番号：３、８および１３のすべて、又は配列番号：１７、１９及び２１又は２２のすべて、のいずれかを含んでなる。代替的な実施態様では、抗体は、配列番号：４、８および１４のすべて、又は配列番号：１７、１１０および２１のすべて、のいずれかを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、(i) 配列番号：１又は２、７および９、又は配列番号：１又は２及び７又は８及び１１、又は配列番号：３、８および１３、又は配列番号：４、５又は６、８および１３、又は配列番号：３、８及び１４又は１５、又は配列番号：４、５又は６、８および１４又は１５のＣＤＲ-Ｌ１からＣＤＲ-Ｌ３アミノ酸配列のすべてと、(ii) 配列番号：１６、１８および２０、又は配列番号：１６、１０１および２０、又は配列番号：１７、１９および２１又は２２、又は配列番号：１７、１１０および２１のＣＤＲ-Ｈ１からＣＤＲ-Ｈ３アミノ酸配列のすべてとを含む。
さらに、本明細書中の抗体は、好ましくはキメラ又はヒト化であり、最も好ましくはヒト化である。本発明のヒト化抗体は、抗体が所望の生物学的特性(例えば所望の結合親和性)を表すのであれば、その重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインに一又は複数の好適なヒト及び／又はヒトコンセンサス非ＣＤＲ(例えばフレームワーク)配列を含みうる。好ましくは、このようなヒト化抗体フレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトのコンセンサスフレームワーク配列である。
いくつかの実施態様では、ヒト及び／又はヒトコンセンサス非ＣＤＲ配列内に一又は複数の更なる修飾が存在する。一実施態様では、本発明の抗体の重鎖可変ドメインは、ヒトのコンセンサスフレームワーク配列の少なくとも一部(好ましくはすべて)、一実施態様では、サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、少なくとも一つのアミノ酸位が修飾された変異体サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む。例えば、一実施態様では、変異体サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列は、位置７１、７３および／または７８の一又は複数に置換を含みうる。一実施態様では、前記置換は、Ｒ７１Ａ、Ｎ７３Ｔおよび／またはＮ７８Ａ、これらいずれかの組み合わせ、好ましくは３つすべてである。他の実施態様では、これらの抗体は、ヒト軽鎖コンセンサスフレームワーク配列の少なくとも一部(好ましくはすべて)を含むか又はさらに含む。好ましい実施態様では、本発明の抗体は、ヒトサブグループＩフレームワークコンセンサス配列の少なくとも一部(好ましくはすべて)を含む。
文脈および当分野で公知の(後述するように)様々な定義に従い、抗体のＣＤＲを正確に説明するアミノ酸位／境界は異なってもよい。可変ドメイン内のいくつかの位置は、ある判断基準の下ではＣＤＲ内であるとみなされる一方で、異なる判断基準の下ではＣＤＲの外であるとみなされる点で、ハイブリッド高頻度可変位と考えられうる。また、一又は複数のこれらの位置は伸展した(extended)ＣＤＲにみられうる。本発明は、これらのハイブリッド高頻度可変位置に修飾を含む抗体を提供する。一実施態様では、これらのハイブリッド高頻度可変位置は、重鎖可変ドメインの位置２６−３０、３３−３５Ｂ、４７−４９、５７−６５、９３、９４および１０２の一又は複数を含む。一実施態様では、これらのハイブリッド高頻度可変位置は、軽鎖可変ドメインの位置２４−２９、３５−３６、４６−４９、５６および９７の一又は複数を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、一又は複数のハイブリッド高頻度可変位置で修飾された変異体ヒトサブグループコンセンサスフレームワーク配列を含む。
他の好適な態様では、抗体は、ＬＴα３に結合し、腫瘍壊死因子レセプター−１(ＴＮＦＲＩ)および腫瘍壊死因子レセプター-２(ＴＮＦＲＩＩ)とのＬＴα３の相互作用を遮断する。特に細胞表面上の一又は複数のＬＴαβ複合体にも結合することが好ましい。また、一又は複数のＬＴαβ複合体の機能を遮断することが好ましい。また、インビトロコラーゲン誘導性関節炎アッセイ又はインビトロ抗体誘導性関節炎アッセイ等の、インビトロ関節炎アッセイにおいて、関節リウマチと関係している炎症性サイトカインのレベルを低減させることが好ましい。
いくつかの態様では、マウスＳ５Ｈ３抗体等の抗体は、ＬＴβ-ＲとＬＴαβとの相互作用を遮断しない。他の態様では、抗体は、ＬＴβ-ＲとＬＴαβとの相互作用を遮断する。抗体は、ＬＴαβ発現細胞を調整することが好ましい。他の実施態様では、抗ＬＴα抗体は、少なくとも一のＬＴαタンパク質の少なくとも一の活性を実質的に中和する。本明細書中の抗体は、好ましくはＬＴαを発現する任意の細胞を標的とし、より好ましくはＬＴαポジティブ又は分泌細胞を枯渇する。
好適な抗体は、少なくともおよそ１０−１２Ｍ(ピコモルレベル)、より好ましくは少なくともおよそ１０−１３Ｍの親和性でＬＴαを結合する。また、ＩｇＧ抗体が好ましく、より好ましくはヒトＩｇＧである。ヒトＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のヒトＩｇＧアイソタイプのいずれかが包含される。マウスＩｇＧには、ＩｇＧ１、２ａ、２ｂおよび３のアイソタイプが包含される。マウスＩｇＧはＩｇＧ２ａであり、ヒトＩｇＧはＩｇＧ１であることがより好ましい。ヒトＩｇＧの他の好適な実施態様では、示されるＶＨおよびＶＬ配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域に結合される。
他の実施態様では、本発明は、配列番号：２３又は２４を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：２５又は２６を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：２３及び２５の両方、又は配列番号：２４及び２６の両方を含む軽鎖および重鎖の可変ドメインを有する抗ＬＴα抗体を提供する。
なお更なる実施態様では、本発明は、配列番号：２７又は２８を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：２９又は３０又は３１を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：２７および２９の両方、又は配列番号：２７および３０の両方、又は配列番号：２７および３１の両方、又は配列番号：２８および３０の両方、又は配列番号：２８および３１の両方を含む軽鎖及び重鎖の可変ドメインを有する、抗ＬＴα抗体を提供する。
なお更なる態様では、本発明は、配列番号：１０２を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：１０３を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：１０２及び１０３の両方を含む軽鎖および重鎖の可変ドメインを有する、抗ＬＴα抗体を提供する。
なお更なる態様では、本発明は、配列番号：１０８を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：１０９を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：１０８と１０９の両方を含む軽鎖及び重鎖の可変ドメインを有する、抗ＬＴα抗体を提供する。
他の好適な実施態様では、抗体はＦｃ領域を有する。一態様では、このようなＦｃ領域は、野生型(または、天然の配列)のＦｃ領域である。他の実施態様では、抗体は、一又は複数のアミノ酸置換をそのＦｃ領域に更に含み、その結果、以下の性質のうちの少なくとも一を表しているポリペプチドとなる。天然配列のＦｃ領域を有する抗体と比較して、増大したＦｃγＲ結合、増大した抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ＡＤＣＣ)、増大した補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)、低減したＣＤＣ、増大したＡＤＣＣおよびＣＤＣ、ＡＤＣＣは増大しているがＣＤＣ機能は低減している、増大したＦｃＲｎ結合および増大した血清半減期。より好ましくは、抗体はさらに、一又は複数のアミノ酸置換をそのＦｃ領域に含み、その結果、天然配列Ｆｃ領域を有する同じ抗体と比較して、増大したＡＤＣＣ機能を有するものとなる。
特に好適な実施態様では、抗体は、２６８Ｄ、又は２９８Ａ、又は３２６Ｄ、又は３３３Ａ、又は３３４Ａ、又は２９８Ａと３３３Ａ、又は２９８Ａと３３４Ａ、又は２３９Ｄと３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ａ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと３３０Ｌ及び３３２Ｅ及び２７２Ｙ及び２５４Ｔ及び２５６Ｅ、又は２５０Ｑと４２８Ｌ、又は２６５Ａ、又は２９７Ａである一又は何れかを組み合わせた位置にアミノ酸置換を有し、このとき２６５Ａ置換は２９７Ａの存在下になく、２９７Ａ置換は２６５Ａの存在下にない。ある特定の実施態様では、Ｆｃ領域は、１から３の前記アミノ酸置換、例えば位置２９８、３３３および３３４の置換、より好ましくは、２９８Ａ、３３３Ａおよび３３４Ａの組み合わせを有する。これら名称のそれぞれの番号の後の文字はその位置で変化したアミノ酸を表す。
このような抗ＬＴα抗体は、ＬＴα／ＬＴβシグナル伝達経路の破壊の様々な程度を生じる。例えば、一実施態様では、本発明は、ヒトＬＴαに対する抗体の一価性親和性(例えばヒトＬＴαに対するＦａｂ断片としての抗体の親和性)が、アメリカ培養細胞系統保存機関番号ＰＴＡ−７５３８(ハイブリドーママウスリンホトキシンα２β１ ｓ５Ｈ３.２.２)の下に寄託されるハイブリドーマ細胞株によって生産されるマウス抗体のヒトＬＴαに対する一価性親和性(例えばヒトＬＴαに対するＦａｂ断片としてのマウス抗体の親和性)とおよそ同じか又はそれより大きい、抗ＬＴα抗体(好ましくはヒト化)を提供する。一価性親和性は、Ｋｄ値として表されるか、及び／又は表面プラスモン共鳴(ＳＰＲ)(ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)技術)又はラジオイムノアッセイを用いる光学バイオセンサーによって測定されるのが好ましい。
さらに、本明細書中の抗体は、野生型のチャイニーズハムスター卵巣細胞において生産される同じ抗体上のフコースの量と比較してフコースが減少している、上記特性のいずれかを有する抗体を包含する。フコースを有さない抗体がより好ましい。
他の実施態様では、本発明は、Ｆｃ領域を有する本明細書中に記載の抗体を含有する抗体組成物であって、該組成物中の抗体のおよそ２０〜１００％がフコースを欠いているＦｃ領域に成熟コア炭水化物構造を含む、抗体組成物を提供する。好ましくは、このような組成物は、２３８、２３９、２４６、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１４、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８および４３９からなる群から選択されるＦｃ領域のいずれか一又はいずれか組み合わせた位置に、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、ＴおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸を用いる(substitute)ことによって、野生型のＩｇＧ Ｆｃ配列と比較して、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ又は抗体の薬物動態学的性質の一又は複数が変化するように改変されているＦｃ領域を含む抗体を含む。
上記抗体組成物は、抗体が、２６８Ｄ又は３２６Ｄ又は３３３Ａと３３４Ａ、又は２９８Ａと３３３Ａ、又は２９８Ａと３３４Ａ、又は２３９Ｄと３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ａ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと３３０Ｌ及び３３２ＥであるＦｃ置換を含むものであることがより好ましく、このときこれら名称のそれぞれの番号の後の文字はその位置で変化したアミノ酸を表す。
上記の抗体組成物は、抗体がＦｃγＲＩＩＩを結合するものであることがさらに好ましい。組成物は、抗体が、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣ活性を有するか、又はヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃを含む他の同じ抗体と比較して、ヒトエフェクター細胞の存在下で増大したＡＤＣＣ活性を有するものであることが好ましい。また、組成物は、抗体が、糖タンパク質のＦｃ領域に付着したフコースを包含する成熟コア炭水化物構造を有する糖タンパク質よりも、良好な親和性でＦｃγＲＩＩＩを結合するか、又はＡＤＣＣをより効率よく媒介するものであることが好ましい。さらに、組成物は、抗体がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、好ましくはＬｅｃ１３細胞によって生産されたものであることが好ましい。また、組成物は、抗体がフコシル基転移酵素遺伝子、より好ましくはＦＵＴ８遺伝子を欠いている哺乳類の細胞によって生産されたものであることが好ましい。
一実施態様では、上記の組成物は、抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した分岐するＮ‐アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を持たないものである。代替的な実施態様では、組成物は、抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した分岐するＧｌｃＮＡｃを持つものである。
他の態様では、上記の組成物は、抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した一又は複数のガラクトース残基を持つものである。代替的な実施態様では、組成物は、抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した一又は複数のガラクトース残基を持たないものである。
更なる態様では、上記の組成物は、抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した一又は複数のシアル酸残基を持つものである。代替的な態様では、組成物は、抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した一又は複数のシアル酸残基を持たないものである。
上記の組成物は、少なくともおよそ２％のアフコシル化抗体、より好ましくは少なくともおよそ４％のアフコシル化抗体、さらにより好ましくは少なくともおよそ１０％のアフコシル化抗体、さらにより好ましくは少なくともおよそ１９％のアフコシル化抗体、最も好ましくはおよそ１００％のアフコシル化抗体を含むことが好ましい。
また、本明細書中の抗体のいずれかを特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も本明細書中に包含される。
宿主被検体での使用のための治療用薬剤は、該被検体において該薬剤への免疫原性反応をほとんどないしはまったく引き起こさないことが好ましい。一実施態様では、本発明は、宿主被検体においてマウス抗体と比較して実質的に低減したレベルでヒト抗マウス抗体反応(ＨＡＭＡ)を誘発するか、及び／又は誘発すると予測されるキメラ又はヒト化抗体を提供する。他の実施例では、本発明は、ヒト抗マウス抗体反応(ＨＡＭＡ)を最小限引き起こすか、又はまったく引き起こさないか、相であると予測されるキメラ又はヒト化抗体を提供する。ある実施例では、本発明の抗体は、臨床的に許容範囲内の最大レベルであるか、又はそれ以下である抗マウス抗体反応を誘発する。
本発明の抗体は、限定するものではないが、ＬＴαレセプター活性化、下流の分子シグナル伝達、細胞増殖、細胞移動、細胞生存、細胞形態形成および血管新生を含む、ＬＴα関連の作用の一又は複数の態様を調節するために用いられうる。これらの作用は、リガンド(例えばＬＴα)の破壊、ＬＴα３レセプター又はヘテロ二量体レセプターの一又は両方に結合してブロックすること、並びにレセプターリン酸化、及び／又はレセプター多量体化を含む、任意の生物学的に関連するメカニズムによって調節されうる。
他の態様では、本発明は、ＬＴα活性化細胞増殖を阻害する方法であって、本発明の一又は複数の抗体の有効量を細胞又は組織と接触させることを含む方法を提供する。
好適な実施態様では、このようなＬＴα活性化細胞増殖は、自己免疫性疾患、より好ましくはＲＡ、ＭＳ、シェーグレン症候群、狼瘡、重症筋無力症、又はＩＢＤ、または癌、特に乳癌、肺癌、前立腺癌、リンパ腫又は白血病によるものである。他の好適な実施態様では、方法は、第一医薬が本明細書中に記載の一又は複数の抗体である場合に、細胞又は組織に第二医薬を接触させることを更に含む。なお更なる好適な実施態様では、細胞又は組織は、哺乳類の細胞又は組織、より好ましくはヒトであり、さらにより好ましくは、方法はインビボ方法である。このような好適なインビボ方法では、好ましくは、細胞又は組織を有する被検体、最も好ましくはヒト被験者は、例えば静脈内又は皮下投与によって、本明細書中に記載の抗体の有効量が投与される。
他の実施態様では、本発明は、本発明の抗体の有効量を被検体に投与することを含む、被検体の自己免疫性疾患を治療する方法を提供する。好ましくは、自己免疫性疾患は、関節リウマチ(ＲＡ)、狼瘡、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少、多発性硬化症(ＭＳ)、乾癬、ＩｇＡネフロパシー、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ヘリコバクターピロリ胃炎および慢性Ｃ型肝炎からなる基から選択される。
好ましくは、自己免疫性疾患は、ＲＡ、ＭＳ、シェーグレン症候群、狼瘡、重症筋無力症又はＩＢＤであることが好ましく、より好ましくは自己免疫性疾患はＲＡ、ＩＢＤ、狼瘡又はＭＳである。より好ましくは、狼瘡は全身性エリテマトーデス又はループス腎炎であり、ＩＢＤはクローン病又は潰瘍性大腸炎である。
他の実施態様として、抗体はネイキッド抗体である。更なる態様では、抗体は細胞障害性剤等の他の分子とコンジュゲートしている。
他の態様では、方法は、抗体が静脈内に投与されるものである。代替的な態様では、抗体は皮下に投与される。
他の実施態様では、被検体はＲＡを有し、抗体は被検体において主要な臨床反応を誘導する。
更なる態様では、被検体は、一又は複数の調節性サイトカイン、抗核抗体(ＡＮＡ)、抗リウマチ因子(ＲＦ)抗体、クレアチニン、血中尿素窒素、抗内皮性抗体、抗好中球細胞質抗体(ＡＮＣＡ)、浸潤性ＣＤ２０細胞、抗二本鎖ＤＮＡ(ｄｓＤＮＡ)抗体、抗Ｓｍ抗体、抗核リボ核タンパク質抗体、抗リン脂質抗体、抗リボソームＰ抗体、抗Ｒｏ／ＳＳ−Ａ抗体、抗Ｒｏ抗体、抗Ｌａ抗体、シェーグレン関連抗原Ａ又はＢに対する抗体(ＳＳ−Ａ又はＳＳ−Ｂ)、セントロメアプロテインＢ(ＣＥＮＰ Ｂ)又はセントロメアプロテインＣ(ＣＥＮＰ Ｃ)に対する抗体、ＩＣＡ６９に対する自己抗体、抗スミス抗原(Ｓｍ)抗体、抗核リボ核タンパク質抗体、抗リボソームＰ抗体、好中球の核又は核周囲領域を染色する自己抗体(ｐＡＮＣＡ)、抗酵母抗体、ＧＭ１ガングリオシド又はＧＱ１ｂガングリオシドに対する交差反応性抗体、抗アセチルコリンレセプター(ＡｃｈＲ)抗体、抗ＡｃｈＲサブタイプ抗体ないし抗筋特異的チロシンキナーゼ(ＭｕＳＫ)抗体、血清抗内皮細胞抗体、ＩｇＧ又は抗デスモグレイン(Ｄｓｇ)抗体、抗セントロメア抗体、抗トポイソメラーゼ−１(Ｓｃｌ−７０)抗体、抗ＲＮＡポリメラーゼ抗体ないし抗Ｕ３-リボヌクレオタンパク質(Ｕ３-ＲＮＰ)抗体、抗糸球体基底膜(ＧＢＭ)抗体、抗糸球体基底膜(ＧＢＭ)抗体、抗ミトコンドリア(ＡＭＡ)ないし抗ミトコンドリアＭ２抗体、抗甲状腺ペルオキシダーゼ(ＴＰＯ)抗体、抗チログロビン(ＴＧ)抗体又は抗甲状腺刺激性ホルモンレセプター(ＴＳＨＲ)抗体、抗核(ＡＮ)抗体、抗アクチン(ＡＡ)抗体ないし抗平滑筋抗原(ＡＳＭ)抗体、ＩｇＡ抗筋内膜抗体、ＩｇＡ抗組織トランスグルタミナーゼ抗体、ＩｇＡ抗グリアジン抗体ないしＩｇＧ抗グリアジン抗体、抗ＣＹＰ２１Ａ２抗体、抗ＣＹＰ１１Ａ１ないし抗ＣＹＰ１７抗体、抗リボヌクレオタンパク質(ＲＮＰ)抗体ないしｍｙｏｓｙｔｉｓ-特異的抗体、抗ミエリン関連糖タンパク質(ＭＡＧ)抗体、抗Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)抗体、抗ＧＭ１ガングリオシド、抗硫酸塩-３-グリクロニル パラグロボシド(ＳＧＰＧ)抗体ないしＩｇＭ抗グリココンジュゲート抗体、ＩｇＭ抗ガングリオシド抗体、抗甲状腺ペルオキシダーゼ(ＴＰＯ)抗体、抗チログロビン(ＴＧ)抗体ないし抗甲状腺刺激性ホルモンレセプター(ＴＳＨＲ)抗体、抗ミエリン塩基性タンパク質抗体ないし抗ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体、ＩｇＧのＦｃ部分に対するＩｇＭリウマチ因子抗体、抗第ＶＩＩＩ因子抗体、又はこれらの組み合わせを異常なレベルで有する
本方法の他の好適な態様では、抗体は隔週でおよそ１回だけ、より好ましくは月におよそ１回被検体に投与される。
他の実施態様では、抗体が第一医薬である場合に、第二医薬は、上記の方法において被検体を治療するために有効な量で被検体に投与される。このような第二医薬は、免疫抑制剤、Ｂ細胞表面マーカーを結合するアンタゴニスト、ＢＡＦＦアンタゴニスト、疾患修飾性抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)、インテグリンアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症性剤(ＮＳＡＩＤ)、サイトカインアンタゴニスト、又はこれらの組み合わせであることが好ましい。さらに、活性な運搬媒介物としてヒアルロニダーゼ糖タンパク質であってもよい。ＤＭＡＲＤ又はメトトレキセートであることが最も好ましい。
他の実施態様では、被検体は、疾患のための医薬によって以前に治療されたことがない。更なる態様では、被検体は、ＴＮＦアンタゴニストによって以前に治療されたことがない。
代替的な実施態様では、被検体は、疾患のための医薬、好ましくはＴＮＦアンタゴニスト(例えば抗ＴＮＦ抗体又はＴＮＦレセプター-Ｉｇ、例えばエタネルセプト)又はＤＭＡＲＤによって以前に治療されたことがある。
他の実施態様では、本発明は、本発明の抗体の有効量を被検体に投与することを含む被検体のＲＡの治療方法を提供する。この方法では、抗体は、被検体において主要な臨床反応を誘導することが好ましい。より好ましくは、被検体は、疾患のための医薬、好ましくはＴＮＦアンタゴニスト(例えば抗ＴＮＦ抗体又はＴＮＦレセプター-Ｉｇ、例えばエタネルセプト)又はＤＭＡＲＤによって以前に治療されたことがある。本方法の他の好適な態様では、抗体は隔週でおよそ１回だけ、より好ましくは月におよそ１回被検体に投与される。
このＲＡ治療方法の他の実施態様では、抗体が第一医薬である場合に、第二医薬は、被検体を治療するために有効な量でＲＡ治療を受けている被検体に投与される。このような第二医薬は、免疫抑制剤、Ｂ細胞表面マーカーを結合するアンタゴニスト、ＢＡＦＦアンタゴニスト、疾患修飾性抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)、インテグリンアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症性剤(ＮＳＡＩＤ)、サイトカインアンタゴニスト、又はこれらの組み合わせであることが好ましい。さらに、活性な運搬媒介物としてヒアルロニダーゼ糖タンパク質であってもよい。ＤＭＡＲＤ又はメトトレキセートであることが最も好ましい。好ましくは、ＲＡを治療するために使用する抗体は、皮下又は静脈内に投与される。さらに、ネイキッド抗体であってもよいし、又は例えば細胞障害性剤にコンジュゲートされていてもよい。本方法の他の好適な態様では、抗体は隔週でおよそ１回だけ、より好ましくは月におよそ１回被検体に投与される。
また、本発明は、前述の実施態様のいずれかに記載の抗体と、薬学的に許容可能な担体などの担体とを含む組成物を提供する。
本発明の他の態様は、前述の実施態様のいずれかに記載の抗体をコードする単離された核酸である。このような核酸を含む発現ベクター、及び本発明の抗体をコードするものも提供する。また、本発明の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。任意の様々な宿主細胞が使われてもよい。一実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。他の実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えば酵母菌又は哺乳類の細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である。
他の態様では、本発明は、本発明の抗体の製造方法を提供する。例えば、本発明は、抗体を生産するための条件下で、本発明の抗体をコードする核酸を含む(好ましくは該抗体(又はその断片)をコードする本発明の組み換えベクターを含む)好適な宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む、抗ＬＴα抗体(本明細書における定義では、Ｆｃ領域を含有する限りにおいて抗体の完全長及びその断片も包含される)の作製又は製造方法を提供する。抗体は、宿主細胞又は宿主細胞培養物から回収されてもよい。好ましい実施態様では、抗体はネイキッド抗体である。他の好適な実施態様では、抗体は他の分子とコンジュゲートしており、他の分子は細胞障害性剤であることが好ましい。
本発明の更に別の態様は、容器と、該容器に内包される組成物と、該組成物が自己免疫性疾患等の抗体が意図する症状を治療するために用いられうることを示すパッケージ挿入物とを具備し、このとき該組成物が前述の実施態様のいずれか一に記載の抗体を含むものである、製造品である。上述のように、第二医薬は、抗体が第一医薬である場合に抗体に加えて、例えば異なる容器内で前記製造品に付加されてもよい。
更なる態様では、本発明は、２００９年４月１９日に寄託番号ＰＴＡ−７５３８としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマを包含する。このようなハイブリドーマによって分泌される抗体がさらに提供される。
自己免疫性疾患が特にＲＡである場合に、ある態様は、患者がＲＡのための医薬を以前に投与されたことがない場合の方法である。代替的な態様は、患者はＲＡのための少なくとも一の医薬を以前に投与されたことがあり、より好ましくは患者は以前に投与された少なくとも一の医薬に反応しなかった場合の方法である。患者が反応しないかもしれない以前に投与した一又は複数の医薬には、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、副腎皮質ステロイド、鎮痛剤、ＤＭＡＲＤ、ＮＳＡＩＤ、又はＣＤ２０アンタゴニスト、より好ましくは免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、副腎皮質ステロイド、ＤＭＡＲＤ、ＮＳＡＩＤ、又はＣＤ２０アンタゴニスト、例としてＣＤ２０抗体、好ましくはリツキシマブ又はヒト化２Ｈ７でないものが含まれる。最も好ましくは、このような前もって投与された医薬(一又は複数)は、ＤＭＡＲＤ又はＴＮＦ阻害薬（例えば抗ＴＮＦ−α抗体又はＴＮＦ−Ｉｇ）である。
ＲＡ等の自己免疫性疾患を治療するための本明細書中に記載の抗体の使用についての本発明の他の好適な態様では、患者は、一又は複数のＴＮＦインヒビターに、または、一又は複数のＤＭＡＲＤに不十分な反応を表した。ＲＡは、早期のＲＡ又は初期のＲＡであることがより好ましい。
他の実施態様では、ＲＡ又は関節損傷の患者に本明細書中に記載の抗体の投与の少なくともおよそ３か月後に、投与前の基準値と比較して骨又は軟組織関節損傷の減少を測定する画像試験を行い、投与される抗体の量が関節損傷の低減を達成するために有効である方法が提供される。好適な態様では、試験は全体の変更したシャープスコアを測定する。好適な態様では、方法はさらに、抗体の以前の投与時の効果と比較して、関節損傷の低減の継続又は維持を達成するために有効な量の本明細書中に記載の抗体を、患者にさらに投与することを含む。更なる態様では、本明細書中に記載の抗体は、たとえ以前の投与の後に試験した時に患者に臨床的な改善がない場合であっても、患者に付加的に投与される。臨床的な改善は、圧痛があるか又は肥大した関節の数を評価する、患者の全体的な臨床評価を行う、赤血球沈降速度を評価する、Ｃ反応性タンパク質レベルの量を評価する、又は疾患活動性の複合的測定値を用いることによって決定することが好ましい。
ＲＡ及び関節損傷の治療のために好適な第二医薬には、免疫抑制剤、ＤＭＡＲＤ、疼痛制御剤、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホネート、Ｂ細胞表面マーカーに対するアンタゴニスト、例えば、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＲ３抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２３抗体、又はこれらの組み合わせが含まれる。第二医薬がＤＭＡＲＤである場合に、オーラノフィン、クロロキン、Ｄ-ペニシラミン、注射用ゴールド、経口用ゴールド、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、ミオクリシンおよびメトトレキセートからなる群から選択されるのが好ましい。第二医薬がＮＳＡＩＤである場合に、フェンブフェン、ナプロジン(naprosyn)、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、アスピリンおよびイブプロフェンからなる群から選択されるのが好ましい。第二医薬が免疫抑制剤である場合に、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、レフルノミド、アナキンラ、アザチオプリンおよびシクロホスファミドからなる群から選択されるのが好ましい。好適な第二医薬の他の群には、抗α４、エタネルセプト、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、キナレト(kinaret)、エファリズマブ、破骨細胞形成抑制因子(ＯＰＧ)、ＮＦκＢリガンドの抗レセプター活性化因子(抗ＲＡＮＫＬ)、ＮＦκＢ−Ｆｃの抗レセプター活性化因子(ＲＡＮＫＬ−Ｆｃ)、パミドロン酸、アレンドロネート、アクトネル、ゾレドロネート(zolendronate)、クロドロネート、メトトレキセート、アザルフィジン、ヒドロキシクロロキン、ドキシサイクリン、レフルノミド、スルファサラジン(ＳＳＺ)、プレドニソロン、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト、プレドニゾン又はメチルプレドニゾロンが含まれる。第二医薬の他の好適な群には、インフリキシマブ、インフリキシマブ／メトトレキセート(ＭＴＸ)の組合せ、ＭＴＸ、エタネルセプト、副腎皮質ステロイド、サイクロスポリンＡ、アザチオプリン、オーラノフィン、ヒドロキシクロロキン(ＨＣＱ)、プレドニソロン、ＭＴＸおよびＳＳＺの組合せ、ＭＴＸ、ＳＳＺおよびＨＣＱの組合せ、シクロホスファミド、アザチオプリンおよびＨＣＱの組合せ、そしてアダリムマブとＭＴＸの組み合わせが含まれる。副腎皮質ステロイドはプレドニゾン、プレドニソロン、メチルプレドニゾロン、ハイドロコーチゾン又はデキサメサゾンであることがより好ましい。他の好適な実施態様では、第二医薬はＭＴＸであり、経口的に、または、非経口的に投与されることがより好ましい。
他の態様では、本明細書中に記載の治療方法はさらに、本明細書中に記載の抗体の有効量を患者に再投与することによって患者を再治療することを含む。再治療は、抗体の第一投与の少なくともおよそ２４週間後に開始されることが好ましい。他の実施態様では、２回目の再治療は開始されている、より好ましくは、２回目の再治療は抗体の第二投与の少なくともおよそ２４週間後に開始される。他の実施態様では、自己免疫性疾患がＲＡである場合に、関節損傷は再治療の後に低減されている。代替的な実施態様では、再治療の後の試験の時に患者に臨床的改善が観察されない。特にこのときの臨床的改善は、圧痛があるか又は肥大した関節の数を評価する、患者の全体的な臨床評価を行う、赤血球沈降速度を評価する、Ｃ反応性タンパク質レベルの量を評価する、又は疾患活動性の複合的測定値を用いることによって測定されるものである。
他の態様では、本明細書中の本発明は、標的視聴者に、ＲＡ、ＭＳ、狼瘡又はＩＢＤ等の自己免疫性疾患を表している患者ないし患者集団を治療するために本明細書中に記載の抗体又はその薬学的に許容される組成物の使用を促すことを含む、本明細書中に記載の抗体又はその薬学的に許容される組成物を公示する方法を提供する。
他の態様では、本発明は、本明細書中に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物と、該抗体ないし薬学的組成物がＲＡ、ＭＳ、狼瘡又はＩＢＤ等の自己免疫性疾患を持つ患者の治療に適応されることを記載しているラベルとを共に包装されて具備する製造品を提供する。好適な実施態様では、製造品はさらに、本明細書中に記載の抗体が第一医薬である場合に、第二医薬を内包する容器を具備し、さらに、有効量の第二医薬によって患者を治療することについてのパッケージ挿入物への指示を具備する。このときの第二医薬はメトトレキセートであることが好ましい。
なお更なる態様では、本発明は、本明細書中に記載の抗体又は該抗体の薬学的組成物と、該抗体ないし薬学的組成物がＲＡ、ＭＳ、狼瘡又はＩＢＤ等の自己免疫性疾患を示す患者の治療に適応されることを記載しているラベルとを一つのパッケージに入れる(combining)ことを含む、本明細書中に記載の抗体又は該抗体の薬学的組成物のパッケージ方法を提供する
２Ｃ８キメラ軽鎖および重鎖(それぞれ配列番号：３２および３３)の完全長配列を表す。 ３Ｆ１２キメラ軽鎖および重鎖(それぞれ配列番号：３４および３５)、並びに３Ｆ１２キメラ重鎖可変領域(配列番号：３１)の完全長配列を表す。 改善した３Ｆ１２キメラ(下記の実施例ではキメラ２と称する)(３Ｆ１２.２Ｄ３)の軽鎖可変領域の配列(配列番号：３６)および３Ｆ１２.２Ｄ３の軽鎖定常領域の配列(配列番号：３７)を表す。残基の太文字は、様々な化学的／酵素的切断から同定されたものを示す。 改善した３Ｆ１２キメラ(３Ｆ１２.２Ｄ３)の重鎖可変領域の配列(配列番号：３８)および３Ｆ１２.２Ｄ３の重鎖定常領域の配列(配列番号：３９)を表す。残基の太文字は、様々な化学的／酵素的切断から同定されたものを示し、アスタリスクはグリコシル化部位を示す。 キメラ２Ｃ８抗体の可変軽鎖の配列(配列番号：２３)、ヒト化２Ｃ８.ｖ２の可変軽鎖の配列(配列番号：２４)、そして、ヒトκサブグループIコンセンサス配列の可変軽鎖の配列(配列番号：４０)のアラインメントを示す。各々のＣＤＲ配列を括弧で示し、アスタリスクは整列した配列アミノ酸残基の中の相違を示すために用いる。 キメラ２Ｃ８抗体の可変重鎖の配列(配列番号：２５)、ヒト化２Ｃ８.ｖ２の可変重鎖の配列(配列番号：２６)およびヒトサブグループＩＩＩコンセンサス配列の可変重鎖の配列(配列番号：４１)のアラインメントを示す。各々のＣＤＲ配列を括弧で示し、アスタリスクは整列した配列アミノ酸残基の中の相違を示すために用いる。 バージョン２Ｃ８.ｖ７及び２Ｃ８.ｖ１２(配列番号：４２−４５)の軽鎖および重鎖配列を表す。 キメラ３Ｆ１２抗体の可変軽鎖の配列(配列番号：２７)、ヒト化３Ｆ１２.ｖ５の可変軽鎖の配列(配列番号：２８)、そして、ヒトκサブグループIコンセンサス配列の可変軽鎖の配列(配列番号：４０)のアラインメントを示す。各々のＣＤＲ配列を括弧で示し、アスタリスクは整列した配列アミノ酸残基の中の相違を示すために用いる。 元のキメラ３Ｆ１２抗体(３Ｆ１２.２Ｄ３でない)の可変重鎖の配列(配列番号：２９)、ヒト化３Ｆ１２.ｖ５の可変重鎖の配列(配列番号：３０)およびヒトサブグループＩＩＩコンセンサス配列の可変重鎖の配列(配列番号：４１)のアラインメントを示す。各々のＣＤＲ配列を括弧で示し、アスタリスクは整列した配列アミノ酸残基の中の相違を示すために用いる。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３が抗体誘導性の関節炎(ＡＩＡ)を阻害することを示す。抗ＬＴα抗体と、Ｆｃ ＤＡＮＡ突然変異体(抗ＬＴ.Ｆｃｍｕｔａｎｔ)およびＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃ変異体(ＴＮＦＲ.Ｉｇイムノアドヘシン)並びにコントロールアイソタイプ(抗ブタクサＩｇＧ２ａモノクローナル抗体)との予防的使用の結果を示す。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３が抗体誘導性の関節炎(ＡＩＡ)を阻害することを示す。コントロールアイソタイプおよびＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃ変異体と比べて、抗ＬＴα抗体が治療的に投与された場合に、ＡＩＡモデルの関節炎の発達を阻害したことを示す。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３がコラーゲン誘導性の関節炎(ＣＩＡ)を阻害することを示す。Ｆｃ ＤＡＮＡ突然変異体(抗ＬＴ.Ｆｃｍｕｔａｎｔ)並びにコントロールアイソタイプ(抗ブタクサＩｇＧ２ａモノクローナル抗体)と比べて、Ｓ５Ｈ３がＣＩＡ予防モデルにおいて関節炎を抑制し、その効果はＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃ変異体と同程度であったことを示す。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３がコラーゲン誘導性の関節炎(ＣＩＡ)を阻害することを示す。コントロールアイソタイプと比べて、Ｓ５Ｈ３抗ＬＴα抗体が治療的に投与された場合に、ＣＩＡモデルの関節炎の発達を阻害し、その効果はＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃ変異体と同程度であったことを示す。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３が、コントロールアイソタイプ(抗ｇｐ１２０ ＩｇＧ１モノクローナル抗体)と比べて、ＭＢＰ-ＴＣＲトランスジェニックマウスにおいてＥＡＥ疾患の発症及び重症度を遅延させることを示す。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３による処置が、アイソタイプコントロール(抗ブタクサ)、抗ＬＴ.Ｆｃ変異体およびＣＴＬＡ４.Ｆｃ(ポジティブコントロール)と比較して、Ｔ細胞依存性の抗ＴＮＰ ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答に、それぞれ作用しないことを示す。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３による処置が、アイソタイプコントロール(抗ブタクサ)およびＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃ変異体と比較して、Ｔ細胞非依存性の抗体(ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３)応答に作用しないことを示す。 抗ＬＴαキメラモノクローナル抗体２Ｃ８がＤＡＮＡ抗ＬＴα ２Ｃ８ Ｆｃ変異体およびアイソタイプコントロール(トラスツズマブ、ヒトＩｇＧ１)と比較して、ヒトＳＣＩＤマウスのＧＶＨＤを予防することを示す。また、ＣＴＬＡ４.Ｆｃ変異体をポジティブコントロールとして用いた。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８および３Ｆ１２がヒトＬＴα３に結合することを示す。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３並びに抗ＬＴ.Ｆｃ変異体がマウスのＬＴα3に結合することを示す。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα Ｓ５Ｈ３抗体が抗ＬＴ.Ｆｃ変異体と同様に、マウスＬＴα１β２複合体に結合するという酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)結果を示す。 ＬＴβと複合体化したヒト細胞の表面上のＬＴαに対するキメラ抗ＬＴα抗体３Ｆ１２及び２Ｃ８の結合についてのＦＡＣＳアッセイ結果を示す。これらは、ＬＴβ-レセプター.ｈｕＩｇＧ１およびアイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ１(トラスツズマブ)と比較する。 ＬＴβと複合体化したマウス細胞の表面上のＬＴαに対するハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３の結合についてのＦＡＣＳアッセイ結果を示す。ＬＴβ-レセプターマウスＩｇＧ２ａ、抗ＬＴ Ｓ５Ｈ３ Ｆｃ変異体およびアイソタイプコントロール(抗ＩＬ１２２ ｍｕＩｇＧ２ａ)と比較する。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８及び３Ｆ１２が、ヒトのＴｈ１およびＴｈ２細胞にそれぞれ結合することを示し、ＬＴｂＲ.Ｆｃ、ＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃおよび比較のためのアイソタイプコントロールの結合結果を示す。 アイソタイプコントロールの結合と比較して、抗ＬＴαヒト化抗体２Ｃ８.ｖＸが休止細胞に結合しないが(図１２Ｃ)、ヒトのＴｈ１およびＴｈ１７細胞とは結合する(それぞれ図１２Ｄ及びＥ)ことを示す。 ＬＴｂＲ.Ｆｃ(実線)、キメラ抗ＬＴα ３Ｆ１２抗体(点線)およびアイソタイプコントロール(太い実線)にて処置した非活性Ｔ細胞を示す。 図１３Ａの試薬にて処置した抗ＣＤ３-および抗ＣＤ２８-活性化ＣＤ４ Ｔ細胞を示す。 図１３Ａの試薬にて処置した抗ＣＤ３-および抗ＣＤ２８-活性化ＣＤ８ Ｔ細胞を示す。 図１３Ａの試薬にて処置したＩＬ１５-活性化ＣＤ５６ ＮＫ細胞を示す。 図１３Aの試薬にて処置したＩｇＭ-およびＣＤ４０Ｌ-活性化ＣＤ１９ Ｂ細胞を示す。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８及び３Ｆ１２が、アイソタイプコントロール(トラスツズマブ)と比べてヒトＬＴα３を機能的にブロックすることを示す。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３と抗ＬＴ.Ｆｃ変異体が、アイソタイプコントロール(トラスツズマブ)と比べてマウスＬＴα３を機能的にブロックすることを示す。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８及び３Ｆ１２が、アイソタイプコントロール(トラスツズマブ)と比べて、Ａ５４９細胞のＬＴα３誘導性ＩＬ-８をブロックすることを示す。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８及び３Ｆ１２、並びにＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃ変異体が、アイソタイプコントロール(トラスツズマブ)と比べて、ＨＵＶＥＣ上のＬＴα３誘導性ＩＣＡＭ発現をブロックすることを示す。刺激されていない細胞の反応も示す。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８がアイソタイプコントロールと比べてＬＴα３誘導性ＮＦκＢ活性化をブロックすることを示す。刺激されていない細胞の反応も示す。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８がアイソタイプコントロールと比べてＬＴα１β２誘導性ＮＦκＢ活性化を機能的にブロックすることを示す。刺激されていない細胞の反応も示す。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８がそれぞれ、ＬＴα３-、ＬＴα２β１-、そして、ＬＴα１β２-誘導性の細胞障害性をブロックすることを示す。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８及び３Ｆ１２が、アイソタイプコントロールと比べて、ＨＵＶＥＣ上のＬＴα１β２誘導性ＩＣＡＭ発現をブロックすることを示す。刺激されていない細胞の反応も示す。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８が、抗ＬＴα ２Ｃ８ Ｆｃ変異体と比較して、ＬＴαβ発現細胞を殺傷しうることを示す。 キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８が、ＨＵＶＥＣ細胞のサイトカインおよびケモカインの分泌をブロックすることを示す。図１７Ａ−１７ＤのそれぞれはＬＴα１β２によるＫＣ／ＩＬ-８、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ１０およびＩＬ-６を示し、図１７Ｅ−１７Ｈのそれぞれはコントロールと比べた時のＬＴα３によるＫＣ／ＩＬ-８、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ１０およびＩＬ-６を示す。 ハムスター−マウスのキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３が、３Ｔ３細胞のサイトカインおよびケモカインの分泌をブロックすることを示す。図１７Ｉ−１７ＬのそれぞれはＬＴα１β２によるＫＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ１０およびＩＬ-６を示し、図１７Ｍ−１７Ｐのそれぞれはコントロールと比べた時のＬＴα３によるＫＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ１０およびＩＬ-６を示す。 キメラ２Ｃ８抗体の可変軽鎖の配列(配列番号：２３)、ヒト化２Ｃ８.ｖＸの可変軽鎖の配列(配列番号：１０２)、そして、ヒトκサブグループＩコンセンサス配列の可変軽鎖の配列(配列番号：４０)のアラインメントを示す。各々のＣＤＲ配列を括弧で示し、アスタリスクは整列した配列アミノ酸残基の中の相違を示すために用いる。 キメラ２Ｃ８抗体の可変重鎖の配列(配列番号：２５)、ヒト化２Ｃ８.ｖＸの可変重鎖の配列(配列番号：１０３)およびヒトサブグループＩＩＩコンセンサス配列の可変重鎖の配列(配列番号：４１)のアラインメントを示す。各々のＣＤＲ配列を括弧で示し、アスタリスクは整列した配列アミノ酸残基の中の相違を示すために用いる。 それぞれ、ＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃ／アイソタイプコントロールと比較したときの、２Ｃ８.ｖＸ抗体のＬＴα３及びＬＴα１β２の結合のＥＬＩＳＡを示す。 それぞれ、ヒトＬＴ誘導性細胞障害性のブロックを試験するためのアッセイを用いた、アイソタイプコントロール／ＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃと比較したときの、２Ｃ８ｖＸ抗体によるヒトＬＴα３およびＬＴα１β２のブロックを示す。 ＨＵＶＥＣ細胞上のＬＴα３によるＩＣＡＭ１上方制御の阻害を示す機能的アッセイにおいて、様々な分子がどの程度ＬＴα３をブロックするのかを比較する。具体的には、アイソタイプ、２Ｃ８.ｖＸおよびＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃを比較した。 ２９３-ＬＴβＲ細胞を用いたＬＴα１β２ブロックを示す機能的アッセイにおいて、様々な分子がどの程度ＬＴα１β２をブロックするのかを比較する。具体的には、刺激していない細胞と合わせてアイソタイプ及び２Ｃ８.ｖＸを比較した。 ２９３-ＬＴα１β２細胞を用いたプロトコールを使用した２Ｃ８.ｖＸのＡＤＣＣ活性を示す。２Ｃ８.ｖＸは、２Ｃ８.ｖＸ ＤＡＮＡ変異体(Ｆｃ変異体)およびアイソタイプコントロールと比較した。 コントロール(２Ｃ８.ｖＸ ＤＡＮＡ Ｆｃ変異体およびアイソタイプコントロール)と比較したときの、ヒトＳＣＩＤモデルにおける２Ｃ８.ｖＸとＣＴＬＡ４-ＦｃによるＧＶＨＤ生存結果を示す。 ２Ｃ８.ｖＸ抗体がヒトＳＣＩＤ ＧＶＨＤモデルにおいてＬＴα１β２発現のＴおよびＢ細胞を減少させることを示す。図２５Ａの結果は、アイソタイプコントロール、２Ｃ８.ｖＸおよび２Ｃ８.ｖＸ.ＤＡＮＡ変異体についての、２日目の総ポジティブヒト細胞を示す。図２５Ｂ−Ｄはそれぞれ、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９抗体を用いたゲーティング(gating)の結果を示す。 キメラ３Ｆ１２抗体の可変軽鎖の配列(配列番号：２７)、ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４の可変軽鎖の配列(配列番号：１０８)、そして、ヒトκサブグループＩコンセンサス配列の可変軽鎖の配列(配列番号：４０)のアラインメントを示す。各々のＣＤＲ配列を括弧で示し、アスタリスクは整列した配列アミノ酸残基の中の相違を示すために用いる。 キメラ３Ｆ１２抗体の可変重鎖の配列(配列番号：２９)、ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４の可変重鎖の配列(配列番号：１０９)およびヒトサブグループＩＩＩコンセンサス配列の可変重鎖の配列(配列番号：４１)のアラインメントを示す。各々のＣＤＲ配列を括弧で示し、アスタリスクは整列した配列アミノ酸残基の中の相違を示すために用いる。 ２Ｃ８.ｖＸおよびそのアフコシル化相対物のＡＤＣＣ活性を示し、このときＡＦはアフコシル化抗体であり、ＷＴは正規のＣＨＯ細胞株産生抗体である。
（好適な実施態様の詳細な説明）
一般的な技術
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用して行う。このような技術は、例えば以下のような文献に完全に明記されている。「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第２版(Sambrookら, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait, 編, 1984)；「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney, 編, 1987)；「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら, 編, 1987、定期的更新)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullisら, 編, 1994)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V., 1988)；「Phage Display: A Laboratory Manual」(Barbas 等, 2001)。
定義
「リンホトキシンα」又は「ＬＴα」は、本明細書中で、米国特許第5824509号の図２Ａに示すアミノ酸配列を有する生物学的に活性なポリペプチドとして定義される。ＬＴαは特にヒトＴＮＦα又はその天然の動物アナログを除外するために定められる(Pennica et al., Nature 312:20/27 : 724-729 (1984)、及びAggarwal et al., J. Biol. Chem. 260: 2345-2354 (1985))。例えば米国特許第５６６１００４号において定められるように、ＬＴαは特にヒトＬＴβを除外するために定められる。
「リンホトキシンα３三量体」又は「ＬＴα３」はＬＴα一量体のホモ三量体を指す。このホモ三量体は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインであるＬＴβによって、細胞表面に固定される。
「リンホトキシンαβ」又は「ＬＴαβ」又は「ＬＴαβ複合体」はＬＴαとＬＴβのヘテロ三量体を指す。これらヘテロ三量体は２つのサブユニットのＬＴαと１つのサブユニットのＬＴβ(ＬＴα２β１)、又は１つのサブユニットのＬＴαと２つのサブユニットのＬＴβ(ＬＴα１β２)のいずれかを含む。
「腫瘍壊死因子レセプター-Ｉ」又は「ＴＮＦＲＩ」および「腫瘍壊死因子レセプター-ＩＩ」又は「ＴＮＦＲＩＩ」は、ＬＴα３ホモホモ三量体の細胞-表面ＴＮＦレセプターを指し、それぞれｐ５５およびｐ７５としても知られる。
「リンホトキシンβレセプター」又は「ＬＴβ-Ｒ」は、ＬＴαβヘテロ三量体が結合するレセプターを指す。
「調節サイトカイン」は、患者の自己免疫性疾患の存在を示す異常なレベルのサイトカインである。このようなサイトカインには、例えば、インターロイキン-１(ＩＬ-１)、ＩＬ- ２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-１０、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１４、ＩＬ-１５、ＩＬ- １８、ＩＬ-２３、ＩＬ-２４、ＩＬ-２５、ＩＬ-２６、ＢＬｙＳ/Ａｐｒｉｌ、ＴＧＦ-α、ＴＧＦ-β、インターフェロン-α(ＩＦＮ-α)、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＭＩＰ-１、ＭＩＦ、ＭＣＰ-１、Ｍ-ＣＳＦ又はＧ-ＣＳＦ、リンホトキシン、ＬＩＧＨＴ、４-１ＢＢリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＧＩＴＲリガンド、ＯＸ４０リガンド、ＲＮＡＫリガンド、ＴＨＡＮＫ、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ及びＶＥＧが含まれる。このグループには、限定するものではないがＴＮＦ-α、ＬＴ、例としてＬＴα、ＬＴβ、及びＬＩＧＨＴを含む、ＴＮＦファミリーメンバーが含まれる。ＴＮＦスーパーファミリーの概要については、MacEwan, Br. J. Pharmacology 135: 855-875 (2002)を参照のこと。調節サイトカインはＩＬ、例えばＩＬ-１ｂ又はＩＬ-６および／またはＴＮＦファミリーメンバーであることが望ましい。
「関節リウマチと関係している炎症性サイトカイン」は、ＲＡ病理と関係している、ＩＬ-６、ＩＬ-１ｂおよびＴＮＦαを指し、このサイトカインはインビトロコラーゲン誘導関節炎アッセイにおいて全身的及び／又は関節内で阻害されうる。
「ＬＴαβ発現細胞」は、ＬＴαβヘテロ三量体を発現するかまたは分泌する細胞である。
「ＬＴαβ発現細胞を調整する」なる表現は、サイトカイン、ケモカイン又は増殖因子のような細胞によって作製されるタンパク質を、例えば単球、樹状細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む細胞によって減少させるか又は変更することを指す。
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は、広義の意味で交換可能に用いられ、モノクローナル抗体(例として完全長又はインタクトモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、多価抗体、及び多特異性抗体(例として所望の生物学的活性を示すかぎりの二重特異性抗体)が含まれ、特定の抗体断片(本明細書中においてより詳細に記載するもの)も含まれうる。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化、及び／又は親和性成熟したものでもよい。
「抗体断片」は、インタクト抗体の部分のみを含有するものであり、該部分はインタクト抗体中に存在する場合、その部分に通常伴う機能の少なくとも一、好ましくはほとんど又はすべてを保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全抗体の抗原結合部位を含有するため、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含有するものは、完全抗体に存在するＦｃ領域が通常関連する少なくとも一の生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全抗体と実質的に同じインビボ半減期を有する一価抗体である。例えばそのような抗体断片は、該断片にインビボ安定性を供与しうるＦｃ配列に結合した抗原結合アーム上に含みうる。一実施態様では、本発明の抗体は、国際公開公報２００５／０６３８１６に記載の一アーム形抗体、例えば、「ノブ(knob)」及び「孔(hole)」を構成するFc突然変異を含む抗体である。例えば、孔(hole)突然変異は、Ｆｃポリペプチド内のＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖの一又は複数であり、腔(cavity)突然変異はＴ３６６Ｗでありうる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
本明細書中の「インタクト抗体」とは、重鎖及び軽鎖の可変ドメイン、並びにＦｃ領域を含むものである。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原性部位に対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体と混ざらないで合成されうる点で有利である。「モノクローナル」なる修飾は、ある特定の方法によって抗体が作製されることを必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256;495 (1975)によって初めて記載されるハイブリドーマ方法論によって調製されてもよいし、例えば細菌、非動物真核生物、動物又は植物の細胞における組み換えＤＮＡ法を用いて作製されてもよい(例として米国特許第４８１６５６７号を参照)。また、「モノクローナル抗体」は、例としてClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されうる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体の作製方法は当分野で公知である。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例としてＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２又は抗体の他の抗原結合配列)である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖ ＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入したＣＤＲやフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練し最大限にするために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。しかしながらＦＲ領域には結合親和性を改善する一又は複数のアミノ酸置換が含まれる。ＦＲ内のこれらアミノ酸置換の数は典型的には、Ｈ鎖では６以下、Ｌ鎖では３以下である。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)を参照のこと。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域が、例えばマカクザルを対象の抗原にて免疫化することによって製造した抗体から得た、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体が含まれる。ヒト化抗体の製造方法は当分野で公知である。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当分野で公知の様々な技術を用いて製造することができる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)に記載の方法もヒトモノクローナル抗体の調整のために有用である。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
「抗原」は、抗体が選択的に結合しうる予め決められた抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に生じる化合物又は合成化合物であってもよい。標的抗原はポリペプチドであることが望ましい。本願明細書において、目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含有するか、又は既存のアミノ酸配列変化を含有してもよい。既存のアミノ酸変化が存在する場合、好ましくは５つのみ、好ましくは４つ以下、又は３つ以下の既存のアミノ酸変化が存在する。既存のアミノ酸変化がＶＨ中に存在する場合、好ましくは、それらの変化は位置７１、７３および７８の３つ、２つ又は１つのみであり、例えば、それらの位置のヒスチジン残基はアラニン残基であってもよい。一実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。通常、上掲のKabat等によると、配列のサブグループがサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループIIIである。
「ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変重鎖サブグループIIIのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含有する。一実施態様では、ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列の各々の少なくとも一部又は配列の全てを含んでなる：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (配列番号:46)-H1-WVRQAPGKGLEWVG (配列番号:47)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (配列番号:48)-H3-WGQGTLVTVSS (配列番号:49)。ここで、Ｎは任意のアミノ酸残基である。
他の実施態様では、ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は以下のそれぞれの配列の少なくとも一部又はすべてを含む：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (配列番号:46)-H1-WVRQAPGKGLEWVG (配列番号:47)-H2-RATFSADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAD (配列番号:50)-H3-WGQGTLVTVSS (配列番号:49)。ここで、Ｎは任意のアミノ酸残基である。
「ＶＬサブグループIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽鎖κサブグループIのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含んでなる。一実施態様では、ＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列の各々の少なくとも一部又は配列の全てを含んでなる：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (配列番号:51)-L1-WYQQKPGKAPKLQIY (配列番号:52)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (配列番号: 53)-L3-FGQGTKVEIKR (配列番号:54)。
他の実施態様では、ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は以下のそれぞれの配列の少なくとも一部又はすべてを含む：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (配列番号:51)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (配列番号:55)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (配列番号:53)-L3-FGQGTKVEIKR (配列番号:54)。
本願明細書において用いられる「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」なる用語は、配列中の高頻度に可変しているおよび／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。通常、抗体は、ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)の３つと、ＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)の３つの計６つの高頻度可変領域を含んでなる。多くの高頻度可変領域が描写されており、本願明細書において包含される。Kabat ＣＤＲは、配列多様性に基づいており、最も一般的に用いられるものである(上掲のKabat 等)。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置を指す(Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、Kabat ＣＤＲとChothia構造ループとが組み合わさったものであり、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複雑な結晶構造の分析に基づくものである。各々のこれらの高頻度可変領域の残基を以下に示す。
ループ Kabat ＡｂＭ Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Kabat番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
ＣＤＲは、以下の「伸展したＣＤＲ」を含有してもよい：ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)および８９−９７(Ｌ３)およびＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)および９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２(Ｈ３)。可変ドメイン残基は、各々のこれらの定義にあるように上掲のKabat 等に従って番号を付けた。本明細書及び特許請求の範囲を通して、免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、上掲のKabat 等のようにＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
「修飾されていないヒトフレームワーク」は、アクセプターヒトフレームワークと同じアミノ酸配列を有するヒトフレームワーク、例えばアクセプターヒトフレームワーク内にヒトから非ヒトへのアミノ酸置換を欠いているものである。
本明細書中における「変更したＣＤＲ」は、一又は複数(例えば１〜およそ１６)のアミノ酸置換を含むＣＤＲである。
本明細書中における「修飾していないＣＤＲ」は、元の非ヒト抗体と同じアミノ酸配列を有するＣＤＲ、すなわち、一又は複数のアミノ酸置換を欠いているＣＤＲである。
「フレームワーク」又はＦＲ」残基は本明細書中で定義するＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「ブロッキング(ブロック)抗体」又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか、減弱するものである。好適なブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にないしは完全に阻害する。
本明細書中で用いられる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも一を擬態する抗体である。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語およびその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
「親ポリペプチド」は、ここに開示した一又は複数のＦｃ領域修飾を欠くき、及び、ここに開示したポリペプチド変異体と比較してエフェクター機能が異なるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドである。親ポリペプチドは天然のアミノ酸配列であるＦｃ領域又は(例えば付加、欠失及び／又は置換のような)アミノ酸配列の修飾を持つＦｃ領域を含みうる。
「Ｆｃ領域」という用語は、イムノグロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然アミノ酸配列であるＦｃ領域、又は修飾を持つアミノ酸配列であるＦｃ領域含みうる。イムノグロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸展すると定義される。イムノグロブリンのＦｃ領域は、２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＩｇＧ１の重鎖の最後の残基であるリジンは、成熟タンパク質のＦｃ内の末端残基として存在するべきではない。
ヒトＩｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２」ドメイン(「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる)は通常アミノ酸２３１からアミノ酸３４０まで伸展する。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接には対をなさないという点で独特である。むしろ、二つのＮ-結合分岐炭水化物鎖が未変性の天然ＩｇＧ分子の二つのＣＨ２ドメインの間に介在されている。炭水化物はドメイン−ドメイン対形成に対する代替物を提供し、ＣＨ２ドメインを安定化させるのに役立つと推測されてきた。Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)。
「ＣＨ３」ドメインは、Ｆｃ領域におけるカルボキシル末端からＣＨ２領域まで伸展する。(すなわち、ＩｇＧのアミノ酸３４１からおおよそアミノ酸４４７まで伸展する。
「機能的なＦｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域が有するエフェクター機能を保持する。典型的なエフェクター機能は、Ｃ１ｑ結合；補体媒介障害活性(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)；貪食作用、細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）の低減下などである。このようなエフェクターの機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合領域（例えば、抗体の可変領域）に結合するのに必要とされており、ここで実施例として開示する様々はアッセイを用いることで評価することが可能である。
「天然配列のＦｃ領域」又は「野生型Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域と同一のアミノ酸配列を包含する。天然のアミノ酸配列を有するヒトＦｃ領域は、当分野で公知であるが、この配列には、天然のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非Ａ-およびＡ-アロタイプ）が含まれる；天然のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；天然のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、同様に、そこから自然に生じる対立変異の変異体等も含まれる。
「変異体Ｆｃ領域」は、ここで定義するような少なくとも一つの「アミノ酸修飾」により、天然のアミノ酸配列を持つＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。特に、変異体Ｆｃ領域には、天然配列のＦｃ領域もしくは親ペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換が存在する。例えば、天然配列のＦｃ領域又は親鎖のＦｃ領域において、おおよそ１から１０、多くの場合、おおよそ１から５ののアミノ酸の置換が存在する。ここで言う変異体Ｆｃ領域は、好ましくは少なくともおよそ８０％以上の相同性を天然配列のＦｃ領域および/又は親ペプチドのＦｃ領域との間に有するか、より好ましくはおよそ９０％以上の相同性を、最も好ましくは少なくともおよそ９５％の相同性を有するものであろう
「Ｆｃ領域を含んだポリペプチド」という言葉は、Ｆｃ領域を含むような抗体もしくはイムノアドヘンシン（本明細書中の定義を参照）のようなポリペプチドのことを指す。
「Ｆｃレセプター」もしくは「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。好適なヒトＦｃＲは、天然の配列の事である。さらに、好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスを含み、それらの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされたものも含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型受容体」）、ＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型受容体」）が含まれ、主として細胞質領域は異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質領域にチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ；ITAM）を含んでいる。阻害型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質領域にチロシン依存性免疫受容体阻害性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ；ITIM）を含んでいる（Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)）。該用語には、FcγRIIIAアロタイプ：FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131、及び／又はFcγRIIA-H131などのアロタイプが含まれる。ＦｃＲに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)；Capel 等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；de Haas 等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に総説されている。他のＦｃＲ、ここでは、将来的に同定されるものも含めて、「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、また、該用語には、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性受容体「ＦｃＲｎ」も含まれる（Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)および Kim 等, J. Immunol.24:249 (1994)）。
「抗体依存性細胞障害活性」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)に結合した分泌型Ｉｇが細胞障害性エフェクター細胞を抗原保持標的細胞に特異的に結合させ、続いて標的細胞を細胞障害性によって標的細胞を殺傷する細胞障害性の形態を指す。抗体は細胞障害性細胞「に対するものであり」、必ず細胞の殺傷に必要である。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又はそれ以上のＦｃＲｓを発現し、エフェクターとしての機能を発揮する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介する細胞の例として、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、好中球、が含まれるが、ＰＢＭＣｓとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然の材料（例えば、ここで述べるように、血液やＰＭＢＣｓ）から単離してもよい。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。古典的な補体経路の活性化は、補体活性化経路は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(好適なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
「改変された」ＦｃＲ結合親和性またはＡＤＣＣ活性を有するポリペプチド変異体を含むポリペプチドとは、親ポリペプチドもしくは天然の配列を有するポリペプチドと比較して強化または減弱化されたＦｃＲ結合活性(ＦｃγＲまたはＦｃＲ)及び／又はＡＤＣＣ活性を持つ変異体である。ＦｃＲに対して「亢進した結合能を示す」変異形Ｆｃとは、少なくとも親ポリペプチドよりはより強く結合するＦｃＲのことである。親ポリペプチドと比較したときの結合の改善はおよそ３倍、好ましくはおよそ５、１０、２５、５０、６０、１００、１５０、２００、５００倍まで、またはおよそ２５％から１０００％の結合の改善である。ＦｃＲに対して「減弱した結合能を示す」ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりは弱い親和性で少なくとも一のＦｃＲに結合する。親ポリペプチドと比較したときの結合の減弱は、およそ４０％またはそれ以上の結合の減弱であってもよい。このようなＦｃＲに対して減弱化した結合能を示す変異体は、ほとんどあるいは全く感知できないくらいの弱いＦｃＲへの結合能（例えば、天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較しておよそ０−２０％のＦｃＲへの結合能）しか有していない可能性がある
野生型又は天然配列のＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチド又は親ポリペプチドよりも「高い親和性」の「より良好な親和性」でＦｃＲと結合する変異形Ｆｃを有するポリペプチドは、変異形Ｆｃおよび親ポリペプチドの量を本質的に同じくしてアッセイを行った時、天然配列のＦｃを有する親ポリペプチドよりも本質的により強い結合親和性で、前述したＦｃＲｓの一又はそれ以上のものと結合するものである。例えば、改善されたＦｃＲ結合能を有する変異形Ｆｃポリペプチドは、例えば、ここで開示される例としてＦｃＲ結合親和性が測定された際、親ペプチドと比較してＦｃＲ結合能が約２倍から約３００倍、好ましくは約３倍から約１７０倍の改善を示す可能性がある。
ヒトエフェクター細胞存在下において、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドよりも効果的に「抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)を媒介する」または「亢進したＡＤＣＣを示す」変異形Ｆｃ領域を含有するポリペプチドは、アッセイに用いる野生型Ｆｃ領域を有するポリペプチドと変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドの量を実質的に同じにした場合、インビトロもしくはインビボにおいて実質的により効果的にＡＤＣＣを媒介する変異体のことである。一般にそのような変異体は、ここで開示するインビトロでのＡＤＣＣアッセイを用いる事で同定する事ができるであろう。しかし、ＡＤＣＣを測定するその他のアッセイもしくは方法（例えば、動物モデルによるアッセイ）なども考慮すべき方法である。好適な変異体は、野生型ＦｃよりもＡＤＣＣの媒介において約５倍から約１００倍、より好ましくは約２５倍から約５０倍の有効性である。
「アミノ酸修飾」とは、すでに決定されているアミノ酸の配列における変異のことを指す。典型的な修飾には、アミノ酸の置換、挿入および/もしくは欠失が含まれる。ここでの好適なアミノ酸修飾は、置換である。
特定位置、例えば、Ｆｃ領域「におけるアミノ酸修飾」とは、特定されたアミノ酸残基の置換もしくは欠失、または特定されたアミノ酸残基の隣接位置に少なくとも一つのアミノ酸を挿入することを指す。特定されたアミノ酸残基の「隣接位置」への挿入とは、１または２残基以内の挿入を意味する。その挿入は、特定された残基のN末端側、もしくはC末端側の場合があり得る。
「アミノ酸置換」とは、すでに決定されているアミノ酸配列に存在する少なくとも１アミノ酸残基を他の異なる「置換」アミノ酸残基で置き換えることを指す。置換残基もしくは残基群は「天然に生じるアミノ酸残基」（即ち、遺伝コードでコードされるもの）で良く、アラニン（Ala）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）。好適には、置換アミノ酸はシステインではない。ここでのアミノ酸置換の定義には、一又はそれ以上の非天然型アミノ酸残基の置換も含める。「非天然のアミノ酸残基」とは、上述した天然アミノ酸以外のアミノ酸で、ポリペプチド鎖においてアミノ酸残基(一又は複数)に隣接して共有結合し得るものを指す。非天然のアミノ酸の例には、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびその他Ellman 等 Meth,Enzym. 202:301-336 (1991)に記載されているようなアミノ酸類似体が含まれる。非天然のアミノ酸残基を産生するためには、Noren 等 Science 244:182 (1989)および上掲のEllman 等の方法を利用することができる。要するに、これらの方法はインビトロにおけるＲＮＡの転写及び翻訳に先立って非天然型アミノ酸残基にてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することを伴う。
本発明で使用される「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に等価なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味する。保存的アミノ酸変化は、結果的なポリペプチドのアミノ酸配列に変化を生じない。例えば、類似の極性の一又は複数のアミノ酸は等価に作用し、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさない。一般に、グループ内での置換は、構造及び機能に関して保存的であるとみなす。しかしながら、特定の残基の役割はそれが存在している分子の３次元構造を背景に決定されることを当業者は認識しているであろう。例えば、Ｃｙｓ残基は、還元された（チオール）形態よりも極性の低い酸化された（ジスルフィド）形態に存在する。Arg側鎖の長い脂肪性部位は、その構造的又は機能的役割の重大な特徴を構成し、これは他の塩基性残基よりも非極性の置換によって最も保存されうる。また、芳香族のグループ（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅ）を含む側鎖は、イオン性-芳香族又は「カチオン-π」相互作用に関与しうることが認識されるであろう。これらの場合、酸性又は荷電していない極性のグループのメンバーを有するこれら側鎖の１つの置換は、構造又は機能に関して保存的でありうる。Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓ（ジスルフィド形態）のような残基は、主鎖の高次構造に直接的な影響力を有し、構造上の変形なしに置換されないことがある。
「アミノ酸挿入」とは、すでに決定されているアミノ酸配列の中に少なくとも１つアミノ酸を取り込ませることである。挿入は通常１または２のアミノ酸残基の挿入により構成されるが、本出願においては、より長い「ペプチド挿入」（例えば、約３から５、さらには約１０アミノ酸残基の挿入）を考慮する。挿入された残基(一又は複数)は、上述した天然に生じるもしくは非天然のアミノ酸である。
「アミノ酸欠失」とは既に決定されているアミノ酸配列から少なくとも１アミノ酸を除去することを意味する。
アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される( Biochemistry, 第２版., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中のA. L. Lehninger)：
(１) 非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(２) 荷電のない極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(３) 酸性：Asp (D), Glu (E)
(４) 塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる：
(１) 疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(２) 中性親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；
(３) 酸性：Asp, Glu；
(４) 塩基性：His, Lys, Arg；
(５) 鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；
(６) 芳香族：Trp, Tyr, Phe。
「ヒンジ領域」はヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０の伸展として一般に定義されている(Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985))。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ-Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１と整合させられうる。
Ｆｃ領域の「低ヒンジ領域」は、通常、カルボキシル末端からヒンジ領域（すなわち、233番目のアミノ酸残基から２３９番目のアミノ酸残基）までの伸展として定義されている。
「Ｃ１ｑ」は免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは二つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓと共に、補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)経路の最初の成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは例えばQuidel, San Diego, CAから市販されている。
「結合ドメイン」なる用語は、他の分子に結合するポリペプチドの領域を意味する。ＦｃＲの場合には、結合ドメインはＦｃ領域の結合の原因であるそのポリペプチド鎖の一部(例えばそのα鎖)を含みうる。一つの有用な結合ドメインはＦｃＲα鎖の細胞外ドメインである。
本発明の抗体の「機能的断片」は、一般に、ＦｃＲ結合能を保持する抗体のＦｃ領域又は抗体の抗原結合領域ないし可変領域を含む、インタクト抗体の一部を含む。抗体断片の例には、線形抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
ここで用いられているように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。例えば、本明細書中の第二医薬として有用なイムノアドヘシンには、Ｂリンパ球刺激因子(ＢＬｙＳ)レセプターの膜貫通配列または細胞質配列のないＢＬｙＳレセプターのＢＬｙＳ結合部位を含有するポリペプチドである。一実施態様では、ＢＲ３(ＢＬｙＳレセプター３)、ＴＡＣＩ(膜貫通アクチベーター及びカルシウム調節因子及びシクロフィリンリガンド相互作用因子)またはＢＣＭＡ(Ｂ細胞成熟抗原)の細胞外ドメインはイムノグロブリン配列の定常ドメインに融合している。
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、共有結合で互いに結合した２つの部分を持つポリペプチドを指し、各部分は異なる特性を有するポリペプチドである。この特性は、例えばインビトロまたはインビボ活性などの生物学的性質でよい。この特性はまた、単一の化学的または物理的性質、例えば対象抗原との結合、反応の触媒などかもしれない。この２つの部分は単一のペプチド結合によって直接、または１つまたは複数のアミノ酸残基を含んでいるペプチドリンカーを通して結合していてもよい。通常、この２つの部分とリンカーは同じ読み枠に存在する。
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施態様を記載する。
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcore(登録商標)-2000又はBIAcore(登録商標)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した後、動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ＴｗｅｅｎＴＭ２０を含むＰＢＳ(ＰＢＳＴ)に注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore(登録商標) Evaluationソフトウェアバージョン3.2ＴＭ)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかしながら、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、結合速度は、好ましくは分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-AmincoＴＭ分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定される。
本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原分子を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって測定する(Chen,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881)。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート(Dynex)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに長時間(例えば６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをTopcountγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下の濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
ここで用いる「実質的に類似」又は「実質的に同じ」という句は、当業者が２つの数値(一般に、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が有意に類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較抗体の値の好ましくは約５０％以下、より好ましくは約４０％以下、さらにより好ましくは約３０％以下、さらにより好ましくは約２０％以下、及び最も好ましくは約１０％以下である。
ここで用いる「実質的に減少」又は「実質的に異なる」という句は、当業者が２つの数値(一般に、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値、ＨＡＭＡ応答)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、２つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較抗体の値の、好ましくは約１０％より大きく、より好ましくは約２０％より大きく、さらにより好ましくは約３０％より大きく、より好ましくは約４０％より大きく、最も好ましくは約５０％より大きい。
ペプチド又はポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」及び「相同性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のペプチド又はポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２はジェネンテック社によって作製され、ＡＬＩＧＮ-２のソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、本明細書中に示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
「疾患」は、メカニズムにかかわらず、ＬＴα３又はＬＴαβの作用を阻害するか又はブロックする、及び／又はＬＴαポジティブ細胞を枯渇させることによることを含む、本発明の抗体又は方法による治療から利益を得うる任意の症状である。この症状には、限定するものではないが、任意の細胞によるＬＴα３及び／又はＬＴαβによって媒介される医学的症状ないしは病気、又はＬＴα３及び／又はＬＴαβの発現ないしは活性の亢進、又は異常な活性化に関連する医学的症状ないしは病気が含まれる。これには、問題の疾患に哺乳動物をかかりやすくさせる病理学的症状などの慢性及び急性の疾患が含まれる。
本明細書中の「自己免疫性疾患」は、個体の自己組織ないしは臓器又は同時分離したものに対する及びそれらから生じる疾患又は症状、又はその徴候又は結果として生じるその症状である。これら多くの自己免疫性及び炎症性疾患において、多くの臨床用及び研究用のマーカーが存在してもよく、限定するものではないが、高ガンマグロブリン血症、高レベルの自己抗体、組織中の抗原抗体複合体蓄積、副腎皮質ステロイド又は免疫抑制性治療の利点、及び、影響を受けた組織中のリンパ系細胞の凝集塊が含まれうる。Ｂ細胞が媒介する自己免疫性疾患に関して何か一つの理論に限定されるものではないが、Ｂ細胞は、自己抗体産生、免疫複合体形成、樹状及びＴ細胞活性化、サイトカイン合成、ケモカインの直接放出、及び病巣への異所性新リンパ形成を含む、多くの機構的な経路によりヒト自己免疫性疾患において病原性効果を示すことが考えられる。各々のこれらの経路は、自己免疫性疾患の病状の程度の違いに寄与しうる。
「自己免疫性疾患」は、臓器特異的疾患(すなわち、免疫応答が、内分泌系、造血系、皮膚、循環器系、胃腸及び肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系などといった臓器系に対して特異的である)又は、複数の臓器系に影響しうる全身性疾患(例えば全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、関節リウマチ、多発性筋炎など)でありうる。好ましい前記疾患には、自己免疫性リウマチ学疾患(例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、ＳＬＥ及びループス腎炎などの狼瘡、多発性筋炎／皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬の関節炎など)、自己免疫性胃腸及び肝臓疾患(例えば、炎症性腸疾患(例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病)、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆管萎縮症、原発性硬化性胆管炎、及び小児脂肪便病など)、血管炎(例えば、チャング-シュトラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症及び顕微鏡的多発動脈炎を含むＡＮＣＡネガティブ血管炎及びＡＮＣＡ-関連血管炎)、自己免疫性神経学的疾患(例えば、多発性硬化症(ＭＳ)、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び自己免疫性多発性神経炎など)、腎臓疾患(例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びベルガー病など)、自己免疫性皮膚科疾患(例えば、乾癬、蕁麻疹、蕁麻疹、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、及び皮膚紅班性狼瘡など)、血液系疾患(例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後の紫斑病、及び自己免疫溶血性貧血など)、アテローム性動脈硬化、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患(例えば、内耳疾患及び聴力障害など)、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植及び自己免疫性内分泌系疾患(例えば、インスリン依存型糖尿病(ＩＤＤＭ)などの糖尿病関連の自己免疫性疾患、アジソン病及び自己免疫性甲状腺疾患(例えばグレーブス病及び甲状腺炎)など)が含まれる。より好ましい前記疾患には、例えば、関節リウマチ、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むＩＢＤ、ＡＮＣＡ関連血管炎、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎及び糸球体腎炎が含まれる。さらにより好ましくは、ＲＡ、ＩＢＤ、ループス及びＭＳであり、より好ましくはＲＡ及びＩＢＤであり、最も好ましくはＲＡである。
場合によって上記のものを包含する、本明細書中で定義されるような他の自己免疫性疾患の具体的な例には、限定されるものではないが、関節炎(急性及び慢性の関節リウマチ、例として、若年発症関節リウマチ及び段階、例として、関節リウマチ関節滑膜炎、痛風又は痛風性関節炎、急性の免疫学的な関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、II型コラーゲン誘導性の関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、スティル病、椎骨関節炎、骨関節炎、慢性関節炎プログレディエンテ、変形性関節炎、慢性多発性関節炎プリマリア、反応性関節炎、閉経期の関節炎、エストロゲン-枯渇関節炎、及び強直性脊椎炎／リウマチ様脊椎炎)、自己免疫性リンパ系増殖性疾患、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例としてプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬、アトピー、例としてアトピー性疾患、例えば花粉症及びジョブ症候群、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、原発性刺激物接触皮膚炎、及びアトピー性皮膚炎、Ｘ連鎖過剰ＩｇＭ症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、蕁麻疹、例として慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫性蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、全身性硬化症などの硬化症、多発性硬化症(ＭＳ)、例として脊髄-視神経ＭＳ、原発性進行性ＭＳ(ＰＰＭＳ)、及び再発性寛解型ＭＳ(ＲＲＭＳ)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、皮膚硬化症、失調性硬化症、視神経脊髄炎(ＮＭＯ)、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(例えば、クローン病、自己免疫媒介性胃腸疾患、胃腸炎症、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸炎潰瘍、顕微鏡的大腸炎、膠原性大腸炎、多発性大腸炎、壊死性全腸炎、及び経壁性大腸炎、及び自己免疫性炎症性腸疾患)、腸炎症、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、呼吸窮迫症候群、例として、成人又は急性の呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液疾患、移植片対宿主病、遺伝性血管性浮腫などの血管性浮腫、髄膜炎の脳神経損傷、妊娠ヘルペス、妊娠性類天疱瘡、陰嚢掻痒、自己免疫性早期卵巣機能不全、自己免疫性症状による急性聴力損失、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎（ＧＮ）、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性ネフロパシ）、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）（タイプＩ及びタイプＩＩを含む）、急速進行性ＧＮ（ＲＰＧＮ）、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌不全、亀頭炎、例として形質細胞限局性亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、薄板状魚鱗癬、表皮剥離性角質増殖症、妊娠前角化症、膿皮症壊疽、アレルギー性状態および応答、食物アレルギー、薬剤アレルギー、昆虫アレルギー、まれなアレルギー性疾患、例として肥満細胞症、アレルギー性応答、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、乾皮性湿疹、異常発汗剤湿疹および小胞の掌蹠湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、妊娠中の胎児のＡＢＯ式血液型など外来性抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、ループス、例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、ジスコイドループス、円板状エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、脱毛症ループス、ＳＬＥ、例えば皮膚ＳＬＥ又は亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群（ＮＬＥ）及び紅班性狼瘡汎発、若年性開始型（Ｉ型）真正糖尿病、例として小児ＩＤＤＭ、成人発症型真正糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、糖尿病性網膜症、糖尿病性ネフロパシ、糖尿病性大腸炎、糖尿病性大動脈疾患、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎(例として大脈管脈管炎、リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中脈管脈管炎（川崎病及び結節性多発動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む）、免疫血管炎、ＣＮＳ血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、類線維素全身性壊死性血管炎及び全身性壊死性血管炎のような壊死性血管炎、ＡＮＣＡネガティブ血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例として、チャーグ-ストラウス症候群（ＣＳＳ）、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多血管炎、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血（貧血症悪性熱）、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全（ＰＲＣＡ）、第VIII因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、例として汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、単神経炎、アレルギー性神経炎、ベーチェット病／症候群、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡又は天疱瘡、例えば水疱性類天疱瘡、瘢痕性(粘膜)類天疱瘡、類天疱瘡皮膚、天疱瘡、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデス、後天性表皮性水疱症、眼性炎症、好ましくはアレルギー性結膜炎などのアレルギー性眼性炎症、線状ＩｇＡ水疱症、自己免疫誘発性結膜炎症、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、自己免疫性状態による熱性損傷、子癇前症、免疫複合体疾患、例として、免疫複合体腎炎、抗体が媒介する腎炎、神経炎症性疾患、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少（例えば心筋梗塞患者によるもの）、例えば血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）、ヘパリン誘発性血小板減少及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、強膜炎、例えば特発性のセラト強膜炎、上強膜炎、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、グレーブス眼病(眼障害又は甲状腺関連眼障害)、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群、例えばタイプI（又は、多腺性内分泌障害症候群）、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群（ＯＭＳ）及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、間質性肺炎、例えばリンパ系間隙間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡネフロパシ）、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、急性発熱性好中性皮膚病、角層下膿疱症、一過性棘融解皮膚病、肝硬変、例として原発性胆管萎縮症及び肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアックないしはコエリアック病、脂肪便症（グルテン腸疾患）、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、例として混合性クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症（ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig's disease)）、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫聴力障害、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性ないしは再発する多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、角膜炎、例としてコーガン症候群／非梅毒性間質性角膜炎、ベル麻痺、スウィート病／症候群、自己免疫性酒さ、帯状ヘルペス関連疼痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症（例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナルガーモパチィ(monoclonal garnmopathy of undetermined significance)、ＭＧＵＳ）が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性又は分節性又は限局性分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として、自己免疫脱髄性病及び慢性炎症性脱髄性多発性神経炎、ドレスラー症候群、円形脱毛症、完全脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症）、雌雄自己免疫性不妊性、例えば、抗精子抗体によるもの、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、寄生虫病、例としてリーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間隙肺線維形成、間質性肺線維形成、繊維化縦隔炎、肺線維形成、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎（急性又は慢性）又はＦｕｃｈの毛様体炎）、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＳＣＩＤ、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、エコーウィルス感染、敗血症(全身性炎症反応症候群(ＳＩＲＳ))、内毒血症、膵炎、thyroxicosis、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、慢性過敏性肺炎、結膜炎、例として、春季カタル、乾性角結膜炎及び流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血-再灌流障害、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道／肺性疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、(大脳血管性不足)、例として動脈硬化脳症及び動脈硬化症網膜症、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自
己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、leprosum、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎symphatica(交感性眼炎)、新生児眼炎、視神経炎、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、リンパ濾胞性胸腺炎、白斑、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球-粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、自己免疫多腺性症候群、例えば多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、拡張型心筋症、例えば後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、アレルギー性副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、脊椎関節症、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張症、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、例えば慢性関節リウマチ、リンパ節炎、血圧応答の減退、血管機能不全、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、腎虚血、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、虚血性再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、リンパ腫気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性成分を有する皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、ナルコレプシ、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
本明細書中で用いる「関節リウマチ」又は「ＲＡ」は、ＲＡの分類のために２０００年に改訂された米国リウマチ協会判定基準又は任意の類似の判定基準に従って診断されうる認識された疾患状態を指し、以下に定義するように活性、早期及び初期のＲＡが含まれる。ＲＡの生理学的指標は対称性の関節腫脹を含み、この腫脹は関節リウマチに不変ではないが特徴的である。手の近位指節間(ＰＩＰ)関節だけでなく中手指節間関節(ＭＣＰ)の紡錘形腫脹、手首、肘、膝、足首および中足指節間(ＭＴＰ)関節が共通して罹患し、腫脹は容易に検出される。受動運動に対する痛みは、関節炎症について最も感度が高い検査であり、炎症および構造的な奇形により罹患した関節の関節可動域が制限されることが多い。代表的な視覚的変化には、ＭＣＰおよびＰＩＰ関節のＭＣＰ関節、過伸展又は過屈曲にある指の尺骨の偏差、肘の屈曲拘縮、および手根骨および足指の亜脱臼が含まれる。ＲＡを有する被検体は、症状の治療に際してＤＭＡＲＤが有効でないか十分に有効でないという点で、ＤＭＡＲＤに耐性があるかもしれない。さらに、本発明の療法の候補には、毒性ないしは不十分な有効性のために、ＴＮＦインヒビター、例えばエタネルセプト、インフリキシマブ及び／又はアダリムマブによる以前ないしは現在の治療(例えば、週２回２５ｍｇ、３か月間のエタネルセプト、又は３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブの少なくとも４回の注入)に対して不十分な反応を示している者が含まれる。
「活動性の関節リウマチ」患者は、ＲＡの活動的であり、潜在的でない症状を有する患者を意味する。「早期活動性の関節リウマチ」を有する被検体は、１９８７年に改訂されたＲＡの分類のためのＡＣＲ判定基準に従って、少なくとも８週間、４年以下の間診断された活動性ＲＡ被検体である。「早期関節リウマチ」を有する被検体は、１９８７年に改訂されたＲＡの分類のためのＡＣＲ判定基準に従って、少なくとも８週間、４年以下の間診断されたＲＡ被検体である。早期ＲＡには、例えば、若年性発症ＲＡ、若年性突発性の関節炎(ＪＩＡ)又は若年性ＲＡ(ＪＲＡ)が含まれる。
「初期ＲＡ」患者は、ＲＡの診断のためのＡＣＲ判定基準を十分に満たしてはいないが、ＲＡ特異的兆候バイオマーカー、例えば抗ＣＣＰおよび共有エピトープの存在と関係している、早期多発性関節炎を有する。初期ＲＡ患者には、多発性関節炎が存在するが、ＲＡと診断されてはおらず、公式のＡＣＲ判定基準ＲＡを進行させ続ける高いリスクにある(９５％の確率)、抗ＣＣＰ抗体がポジティブである患者が含まれる。
「関節損傷」は広義の意味で用いられ、結合組織および軟骨を含む一又は複数の関節のいずれか一部への損傷又は部分的ないしは完全な破壊を指し、この損傷には、何らかの原因による構造的および／または機能的損傷が含まれ、そして、関節痛／arthalgiaが生じる場合もあるし生じない場合もある。限定するものではないが、関節損傷には、炎症関節疾患並びに非炎症性関節疾患に伴う関節損傷、又は炎症関節疾患並びに非炎症性関節疾患から生じる関節損傷が含まれる。この損傷は、何か状態も、例えば自己免疫性疾患、特に関節炎および最も特にＲＡによって生じてもよい。例示的な前記症状には、急性及び慢性の関節炎、若年性発症ＲＡ、若年性特発性関節炎(ＪＩＡ)又は若年性ＲＡ(ＪＲＡ)を含むＲＡ、および関節リウマチ滑膜炎などの段階、痛風又は痛風の関節炎、急性の免疫学的な関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、タイプＩＩコラーゲン誘導性関節炎、感染性関節炎、化膿性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、椎骨関節炎、骨関節炎、慢性関節炎progrediente、変形性関節炎、慢性多発性関節炎primaria、反応性関節炎、更年期性関節炎、エストロゲン-枯渇関節炎、及び強直性脊椎炎／リウマチ様脊椎炎、ＲＡ以外のリウマチ性自己免疫性疾患、およびＲＡに伴う有意な全身併発(血管炎、肺線維形成又はフェルティー症候群を含む)が含まれる。本明細書中において、関節は、関節を囲み支持する部位を有する(動物などの脊椎動物の)骨格の構成成分間の接点であって、限定するものではないが、例えば、腰部、脊椎の脊柱間の関節、脊椎と骨盤(仙腸関節)間の関節、腱および靭帯が骨に付着する関節、肋骨と脊椎間の関節、肩、膝、足、肘、手、指、足首および足指が含まれるが、特に手および足の関節を含む。
本明細書中で用いる「治療」は、治療される個体又は細胞の自然な経過を変更するための臨床的介入を指し、予防のため又は臨床病理の経過の間のいずれかの時期に実施されうる。治療の所望の効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的ないしは間接的な病理的影響の低減、転移の予防、疾患進行の割合の低減、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解ないしは予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患又は障害の発達を遅延させるために用いる。本発明の方法による治療的な量の本発明の抗体を服用した後に、被検体が特定の疾患の一又は複数の兆候及び症状の観察可能な及び／又は測定可能な程度の低減ないし欠如を示す場合には、例えば自己免疫性疾患について被検体は成功裏に「治療され」ている。
成功した治療のある好適な実施態様では、抗体は、ＲＡを有する被検体において主要な臨床効果を誘導する。本明細書において、「主要な臨床効果」は連続した６か月間の米国リウマチ学会７０応答(ＡＣＲ７０)を達成するものと定義される。ＡＣＲ７０応答スコアは、ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０及びＡＣＲ７０に分類され、ＡＣＲ７０はこの評価システムにおいて最も高いレベルの兆候及び症状コントロールである。ＡＣＲ応答スコアは、ＲＡ疾患活動性における改善を測定するものであり、関節腫脹及び圧痛、疼痛、障害のレベル、及び全身的な患者及び医師評価を含む。ＦＤＡに公認された、そして本明細書で定義した主要な臨床効果を誘導する異なるタイプの抗体の例は、エタネルセプト(ＥＮＢＲＥＬ(登録商標))である。
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
本明細書中の医薬の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する医薬、例えば抗体の能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は対象の薬剤、例えば抗体の任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
ここで使用する「細胞障害性剤」なる用語は、細胞の機能阻害又は阻止、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を表す。この用語は、放射性同位体(例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ-９-テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標))；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標))、ＣＰＴ-１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９-アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドュオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；ＣＤＰ３２３；経口α４インテグリンインヒビター；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばNicolaou et al., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン(aclacinomycin)などの他の抗生物質、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣＩリポソーム注射剤(DOXIL(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、及びゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ)、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び5-FU及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
またこの定義に含まれるものには、癌の増殖を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(ＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD)；エストロゲンレセプターアンタゴニスト、例えばフルベストラント(fulvestrant) (FASLODEX(登録商標))；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ARIMIDEX(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、ＮＥ-５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害薬(例えばLURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばABARELIX(登録商標))；ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(ＧＷ５７２０１６としても知られるＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害薬)；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、及びＩＬ-１５等のインターロイキン(ＩＬ)、例えば、PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２、ＴＮＦ、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β、及び白血球阻害因子(ＬＩＦ)及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養物由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物、例えば合成して産生された小分子構成要素及び製薬的に受容可能な誘導体及びその塩類を含む。「サイトカインアンタゴニスト」は、例えばサイトカインに対する抗体、サイトカインレセプターに対する抗体、及びイムノアドヘシンを含む、任意のメカニズムによってサイトカインを阻害するか又は拮抗する分子である。
本明細書中の「腫瘍壊死因子α」又は「ＴＮＦα」又は「ＴＮＦアルファ」は、Pennica et al., Nature, 312:721 (1984)又はAggarwal et al., J. Biol. Chem., 260:2345 (1985)に記載のアミノ酸配列を含むヒトＴＮＦα分子を指す。
「ＴＮＦアンタゴニスト」又は「ＴＮＦインヒビター」は、本明細書中では、インビトロ、インサイツ、及び／又は好ましくはインビボでのＴＮＦα活性を低減する、ブロックする、阻害する、無効にする、又は干渉する分子として定義される。このような薬剤は、一般にＴＮＦαに結合してその活性を中和することによってＴＮＦαの生物学的な機能をある程度阻害する。また、好適なＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦのＲＮＡ、ＤＮＡないしはタンパク質合成、ＴＮＦα放出、ＴＮＦαレセプターシグナル伝達、膜ＴＮＦα切断、ＴＮＦα活性、及びＴＮＦα産生及び／又は合成を低減、ブロック、無効、干渉、阻止、及び／又は阻害することができる。このようなＴＮＦアンタゴニストには、限定するものではないが、抗ＴＮＦα抗体、その抗原結合断片、ＴＮＦαへの結合時に、哺乳動物のＴＮＦαを発現する細胞を破壊するか枯渇する、及び／又はこれら細胞の一又は複数の機能を干渉する、ＴＮＦαに特異的に結合する特定の変異体ないしドメイン、可溶性ＴＮＦレセプター(例えばｐ５５、ｐ７０又はｐ８５)ないしは断片、その融合ポリペプチド、小分子ＴＮＦアンタゴニスト、例えばＴＮＦ結合プロテインＩ又はＩＩ(TBP-I又はTBP-II)、nerelimonmab、CDP-571、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、アダリムマブ(HUMIRATM)、CDP-571、CDP-870、アフェリモマブ、レネルセプトなど)、その抗原結合断片、及びＴＮＦαに特異的に結合するレセプター分子、ＴＮＦα合成、ＴＮＦα放出又は標的細胞に対する作用を阻止及び／又は阻害する化合物、例えばサリドマイド、テニダップ、ホスホジエステラーゼインヒビター(例えば、ペントキシフィリンおよびロリプラム)、A2bアデノシンレセプターアゴニスト、およびA2bアデノシンレセプターエンハンサー、ＴＮＦαレセプターシグナル伝達を阻止及び／又は阻害する化合物、例としてマイトジェン活性化タンパク質(ＭＡＰ)キナーゼインヒビター、膜ＴＮＦα切断をブロック及び／又は阻害する化合物、例えばメタロプロテイナーゼインヒビター、ＴＮＦα活性をブロック及び／又は阻害する化合物、例えばアンジオテンシン転換酵素(ＡＣＥ)インヒビター(例えばカプトプリル)、及びＴＮＦα産生及び／又は合成をブロック及び／又は阻害する化合物、例えばＭＡＰキナーゼインヒビターが含まれる。好適なアンタゴニストには抗体又はイムノアドヘシンが含まれる。本明細書中に具体的に包含されるＴＮＦアンタゴニストの例は、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、及びアダリムマブ(HUMIRATM)である。
「ホルモン」なる用語は通常管を有する腺性器官によって分泌されるポリペプチドホルモンを表す。そのようなホルモンには、例えば、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；エストラジオール；ホルモン補充療法；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン又はテストラクトン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；プロラクチン、胎盤ラクトゲン、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド性腺刺激ホルモン放出ホルモン；インヒビン；アクチビン；ミュラー阻害物質；及びトロンボポエチンなどがある。本明細中で用いるように、ホルモンなる用語は、天然源由来又は組み換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列ホルモンの生物学的活性な相当物、例えば合成して産生した小分子成分及び製薬的に許容可能な誘導体及びその塩類が含まれる。
「増殖因子」なる用語は増殖を促進するタンパク質を表し、例えば、肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；血管内皮増殖因子；神経成長因子、例えばＮＧＦ-β；血小板由来増殖因子；トランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)、例えばＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β；インスリン様成長因子-I及び-II；エリトロポエチン(ＥＰＯ)；骨誘導因子；インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-β、及び-γ；及び、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)、顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)などがある。本明細書中で用いられる、増殖因子なる用語には、天然源由来あるいは組換え細胞培養物由来のタンパク質及び天然配列増殖因子の生物学的に活性な等価物、例えば合成して産生された小分子構成要素及び製薬的に受容可能な誘導体及びその塩類を含む。
「インテグリン」なる用語は、細胞の細胞外基質への結合と応答の両方をさせるレセプタータンパク質であり、創傷治癒、細胞分化、腫瘍細胞のホーミング及びアポトーシスなどの様々な細胞性機能に関与するものを表す。これらは細胞-細胞外基質及び細胞間相互作用に関与する細胞接着レセプターの大きなファミリーの一部である。機能的なインテグリンは、α及びβと称する２つの膜貫通性グリコプロテインサブユニットから成り、非共有的に結合している。βサブユニットのように、αサブユニットはすべて互いにいくらかの相同性がある。レセプターは常に１のα鎖及び１のβ鎖を含有する。例えば、α６β１、α３β１、α７β１、ＬＦＡ-１などがある。本明細書中で用いられる、インテグリンなる用語には、天然源由来あるいは組換え細胞培養物由来のタンパク質及び天然配列インテグリンの生物学的に活性な等価物、例えば合成して産生された小分子構成要素及び製薬的に受容可能な誘導体及びその塩類を含む。
「インテグリンアンタゴニスト」は、例えばインテグリンに対する抗体を含む、任意のメカニズムによってインテグリンを阻害するか又は拮抗する分子である。本明細書中の「インテグリンアンタゴニスト又は抗体」の例として、ＬＦＡ-１抗体、例としてGenentechから市販のエファリズマブ(RAPTIVA(登録商標))、又は他のＣＤ１１／１１ａ及びＣＤ１８抗体、又はα４インテグリン抗体、例としてBiogenから入手可能なナタリズマブ(ANTEGREN(登録商標))、又は、ジアザサイクリックフェニルアラニン誘導体(国際公開第２００３／８９４１０号)、フェニルアラニン誘導体(国際公開第２００３／７０７０９号、国際公開第２００２／２８８３０号、国際公開第２００２／１６３２９号及び国際公開第２００３／５３９２６号)、フェニルプロピオン酸誘導体(国際公開第２００３／１０１３５号)、エナミン誘導体(国際公開第２００１／７９１７３号)、プロパン酸誘導体(国際公開第２０００／３７４４４号)、アルカノン酸誘導体(国際公開第２０００／３２５７５号)、置換型フェニール誘導体(米国特許第６６７７３３９号及び同第６３４８４６３号)、芳香族アミン誘導体(米国特許第６３６９２２９号)、ＡＤＡＭディスインテグリンドメインポリペプチド(米国公開公報２００２／００４２３６８号)、αｖβ３インテグリンに対する抗体(欧州特許第６３３９４５号)、アザ架橋された二環式アミノ酸誘導体(国際公開第２００２／０２５５６号)などが含まれる。
「副腎皮質ステロイド」は、天然に生じる副腎皮質ステロイドの効果を模倣するかあるいは増大するステロイドの一般的な化学構造を有するいくつかの合成又は天然に生じる物質の何か一つを指す。合成副腎皮質ステロイドの例として、プレドニゾン、プレドニゾロン(メチルプレドニゾロン、例としてSOLU-MEDROL(登録商標) メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウムを含む)、デキサメサゾン又はデキサメサゾントリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、及びベタメサゾンが含まれる。本明細書中の好適な副腎皮質ステロイドは、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン又はデキサメサゾンである。
ここで補助治療として用いる「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書中で治療される哺乳動物の免疫系を抑制する又は遮断するように働く物質を表す。これは、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原の発現を下方制御又は抑制する、あるいはＭＨＣ抗原を遮断する物質を含む。そのような薬剤の例として、２-アミノ-６-アリル-５-代替ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号参照)；非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)；ガンシクロビル；タクロリムス、糖質ステロイド、例としてコルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例としてシクロオキシゲナーゼインヒビター、５-リポキシゲナーゼインヒビター又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例えばアザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(ＭＭＦ)；trocade(Ｒｏ３２−３５５)；末梢シグマレセプターアンタゴニスト、例えばＩＳＲ−３１７４７；アルキル化剤、例えばシクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド (米国特許第４１２０６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原を遮断する)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣフラグメントに対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質ステロイド類似体などのステロイド、例としてプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、例えばSOLU-MEDROL(登録商標) メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、リメキソロン及びデキサメタゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例としてメトトレキサート(経口又は皮下)；クロロキン及びヒドロキシクロロキンなどの抗マラリア剤；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン放出インヒビター、例えばＳＢ−２１０３９６及びＳＢ−２１７９６９モノクローナル抗体及びＭＨＣ ＩＩアンタゴニスト、例えばＺＤ２３１５；ＰＧ１レセプターアンタゴニスト、例えばＺＤ４９５３；ＶＬＡ４接着ブロッカー、例えばＺＤ７３４９；抗サイトカイン又は抗サイトカインレセプター抗体、例として抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体(インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子β抗体、インターロイキン−１(ＩＬ−１)ブロッカー、例えば組み換えＨｕＩＬ−１Ｒａ及びＩＬ−１Ｂインヒビター、抗インターロイキン２(ＩＬ-２)抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；ＩＬ−２融合毒素；抗Ｌ３Ｔ４抗体；レフルノミド；異種性抗リンパ球グロブリン；ＯＰＣ−１４５９７；ＮＩＳＶ(免疫応答モディファイヤー)；必須脂肪酸、例えばγリノレン酸又はエイコサペンタイン酸；ＣＤ−４ブロッカー及びパンＴ抗体、好ましくは抗ＣＤ３ないしは抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；同時刺激モディファイヤー(例えばＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合、ABATACEPTTMとしても知られる)；抗インターロイキン６(ＩＬ-６)レセプター抗体及びアンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(国際公開第９０／０８１８７号)；ストレプトキナーゼ；ＩＬ−１０；トランスフォーミング成長因子-β(ＴＧＦ-β)；ストレプトドルナーゼ(streptodornase)；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；enlimomab；CDP-855；PNPインヒビター；CH-3298；GW353430；4162W94、クロランブシル；デオキシスペルグアニン(deoxyspergualin)；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター (Cohen等, 米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプターフラグメント(Offner等, Science 251:430-432 (1991)；国際公開第９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第９１／０１１３３号)；ＢＡＦＦ抗体及びＢＲ３抗体などのＢＡＦＦアンタゴニスト；ｚＴＮＦ４アンタゴニスト(Mackay及びMackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002))；Ｔ細胞ヘルパーシグナルを阻害する生物学的な薬剤、例として抗ＣＤ４０レセプター又は抗ＣＤ４０リガンド(ＣＤ１５４)、例えばＣＤ４０-ＣＤ４０リガンドに対する阻止抗体(例えば、Durie等, Science, 261: 1328-30 (1993)；Mohan等, J. Immunol., 154: 1470-80 (1995))及びＣＴＬＡ４-Ｉｇ(Finck等, Science, 265: 1225-7 (1994))；及びＴ１０Ｂ９などのＴ細胞レセプター抗体 (欧州特許第３４０１０９号)を含む。本明細書中に記載のいくつかの好適な免疫抑制剤には、シクロホスファミド、クロランブシル、アザチオプリン、レフルノミド、ＭＭＦ又はメトトレキサートが含まれる。
「疾患変更性抗リウマチ剤」又は「ＤＭＡＲＤ」の例には、クロロキン、ヒドロキシクロロキノン、ｍｙｏｃｒｉｓｉｎ、オーラノフィン、スルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ(プラス経口及び皮下用メトトレキセート)、アザチオプリン、Ｄ-ペニシラミン、ゴールド塩類(経口)、ゴールド塩類(筋肉内)、ミノサイクリン、シクロスポリンＡ及び局所性シクロスポリンを含むシクロスポリン、ブドウ球菌プロテインＡ(Goodyear 及びSilverman, J. Exp. Med., 197, (9), p1125-39 (2003))、これらの塩類及び誘導体を含むものなどがある。
「非ステロイド系抗炎症薬」又は「ＮＳＡＩＤ」の例として、アスピリン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン及びイブプロフェン遅延剤、フェノプロフェン、ピロキシカム、フルルビプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、ナプロキセン、tenoxicam、benorylate、ジクロフェナク、ナプロキセン、nabumetone、インドメタシン、ケトプロフェン、メフェナム酸、ジクロフェナク、フェンブフェン、アザプロパゾン、アセメタシン、チアプロフェン酸、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、フェニルブタゾン、ジクロフェナクおよびジクロフェナク遅延剤、GR253035などのシクロオキシゲナーゼ(COX)-2インヒビター、MK966、セレコキシブ(celecoxib) (CELEBREX(登録商標)；4-(5-(4-メチルフェニル)-3-(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾロ-1-イル) ベンゼンスルホンアミド及びバルデコキシブ(valdecoxib) (BEXTRA(登録商標))、及びメロキシカム(MOBIC(登録商標))、これらの塩類及び誘導体などがある。好ましくは、これらはアスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、インドメタシン、またはトルメチンである。このようなＮＳＡＩＤは場合によって、コデイン(codenine)、トラマドール、及び/又はジヒドロコデイン(dihydrocodinine)またはモルヒネなどの麻酔剤などの鎮痛剤と用いられる。
「Ｂ細胞」は骨髄内で成熟するリンパ球であり、ナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞、又はエフェクターＢ細胞(プラズマ細胞)などがある。本明細書中のＢ細胞は正常又は非悪性のＢ細胞でもよい。
「ＣＤ２０」抗原又は「ＣＤ２０」は、末梢血又はリンパ系器官に由来するＢ細胞の９０％以上の表面にみられるおよそ３５ｋＤａの非グルコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は正常Ｂ細胞だけでなく悪性のＢ細胞上にも存在し、幹細胞には発現しない。ＣＤ２０を意味する文献中での他の名称には、「Ｂリンパ球限定抗原(B-lymphocyte-restricted antigen)」及び「Ｂｐ３５」などがある。ＣＤ２０抗原は、例としてClark等 PNAS (USA) 82:1766 (1985)に記載されている。好適なＣＤ２０は非ヒト霊長類又はヒトのＣＤ２０であり、最も好ましくはヒトＣＤ２０である。
ＢＬ-ＣＡＭ又はＬｙｂ８としても知られる「ＣＤ２２」抗原又は「ＣＤ２２」は、およそ１３０ｋＤ(還元型)から１４０ｋＤ(非還元型)の分子量を有するタイプ１完全膜糖タンパク質である。それはＢリンパ球の細胞質及び細胞膜に発現される。ＣＤ２２抗原は、Ｂ細胞リンパ球分化の初めにＣＤ１９抗原とおよそ同じ段階で現れる。他のＢ細胞マーカーと異なり、ＣＤ２２膜発現は成熟Ｂ細胞(ＣＤ２２＋)とプラズマ細胞(ＣＤ２２−)の間の後期分化段階に限定される。ＣＤ２２抗原は、例えば、Wilson 等 J. Exp. Med. 173: 137 (1991)及びWilson 等 J. Immunol. 150:5013 (1993)において記述されている。
「Ｂ細胞表面マーカーに対するアンタゴニスト」とは、Ｂ細胞表面マーカーに結合し、例えば、Ｂ細胞に誘導される体液性反応を低減又は阻害することによって、哺乳動物のＢ細胞を破壊又は枯渇させる、及び／又は一以上のＢ細胞機能を妨げる抗体である。好ましくは、アンタゴニストは、それによって治療される哺乳動物のＢ細胞を枯渇する(すなわち、循環中のＢ細胞レベルを下げる)ことができる。そのような枯渇は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)、Ｂ細胞増殖の阻害及び／又はＢ細胞死の誘導(例えば、アポトーシスを介する)等の多様な機能を介して達成されるであろう。本発明の権利範囲に包含されるアンタゴニストには、抗体、合成ないし天然の配列のペプチド、イムノアドヘシン、及びＢ細胞表面マーカーに結合する、場合によって他の分子とコンジュゲートするか又は融合される小分子アンタゴニストが含まれる。好適なアンタゴニストには抗体又はイムノアドヘシンが含まれる。それには、イムノアドヘシンなどのＢＬｙＳアンタゴニストが含まれ、好ましくはルミリキシマブ(抗ＣＤ２３)、ＣＤ２０、ＣＤ２２又はＢＲ３抗体又はＢＬｙＳイムノアドヘシンである。ＢＬｙＳイムノアドヘシンは、ＢＲ３の細胞外ドメインを含むＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含むＴＡＣＩイムノアドヘシン、及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含むＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択されるのが好ましい。最も好適なＢＲ３イムノアドヘシンは、国際公開2005/00351及び米国公開2005/0095243の配列番号：２のｈＢＲ３−Ｆｃである。また、米国公開2005/0163775及び国際公開2006/068867も参照のこと。他の好適なＢＬｙＳアンタゴニストは抗ＢＬｙＳ抗体(より好ましくはこの抗ＢＬｙＳ抗体は残基１６２−２７５を含むＢＬｙＳの領域内でＢＬｙＳを結合する)又は、抗ＢＲ３抗体(より好ましくはこの抗ＢＲ３抗体はヒトＢＲ３の残基２３−３８を含む領域内でＢＲ３を結合する)である。
ＣＤ２０抗体の例には以下のものが含まれる：現在では「リツキシマブ」(「リツキサン(登録商標)」)と呼称される「Ｃ２Ｂ８」(米国特許第５，７３６，１３７号)及びＣＤ２０への結合能を保持するその断片；「Ｙ２Ｂ８」又は「Ibritumomab Tiuxetan」ゼバリン(登録商標)と命名されるイットリウム-[90]-標識２Ｂ８マウス抗体、IDEC Pharmaceuticals, Inc.から市販(米国特許第５，７３６，１３７号；１９９３年６月２２日に受託番号ＨＢ１１３８８としてＡＴＣＣに寄託された２Ｂ８)；場合によっては「１３１Ｉ-Ｂ１」またはCorixaから市販の「ヨードＩ131 Tositumomab」抗体(BEXXARＴＭ)を生成するために１３１Ｉで標識した「Tositumomab」とも呼称されるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」(米国特許第５，５９５，７２１号も参照のこと)；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Press等 Blood 69(2):584-591 (1987)及びそれらの変異体、例として「フレームワークパッチ」又はヒト化１Ｆ５(国際公報０３／００２６０７, Leung, S；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-９６４５０)；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体(米国特許第５，６７７，１８０号)；ヒト化２Ｈ７(国際公報2004/056312 (Lowman 等)及び以下に挙げるもの)；Ｂ細胞の細胞膜のＣＤ２０分子を標的としたｈｕＭａｘ-ＣＤ２０ＴＭ完全ヒト、高親和性抗体(Genmab, Denmark；例としてGlennie及びvan de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003)とCragg 等, Blood 101: 1045-1052 (2003)を参照)；国際公報２００４／０３５６０７(Teeling 等)に記載のヒトモノクローナル抗体；ＡＭＥ-１３３ＴＭ抗体(Applied Molecular Evolution)；ＧＡ１０１(GlycArt；米国公開2005/0123546)；キメラ又はヒト化Ａ２０抗体(それぞれｃＡ２０、ｈＡ２０)などのＡ２０抗体又はその変異形(米国公開番号２００３／０２１９４３３、免疫医学)；及びInternational Leukocyte Typing Workshopより入手のモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-Ｃ１又はＮＵ-Ｂ２(Valentine等, Leukocyte Typing III (McMichael, 編集, 440頁, Oxford University Press (1987))。本明細書中の好適なＣＤ２０抗体は、キメラＣＤ２０抗体、ヒト化ＣＤ２０抗体またはヒトＣＤ２０抗体、より好ましくはリツキシマブ、ヒト化２Ｈ７、キメラないしはヒト化Ａ２０抗体(Immunomedics)、及びＨＵＭＡＸ−ＣＤ２０ＴＭ ヒトＣＤ２０抗体(Genmab)である。
単に本願明細書中の目的のために、特別に明記しなければ、「ヒト化２Ｈ７」は、ヒト化ＣＤ２０抗体又はその抗原結合断片を意味し、該抗体がインビボで霊長類のＢ細胞を枯渇させる効果を有する。抗体には、米国公開2006/0062787及びその図に記載のものが含まれ、米国公開2006/0188495に示される配列を有する抗体が含まれる。また、米国公開2006/0034835及び米国公開2006/0024300も参照のこと。
本発明の様々な好適な実施態様をまとめると、米国公開2006/0062787に開示される２Ｈ７バージョン１６に基づく変異体のＶ領域は、以下の表に示すアミノ酸置換の位置以外はｖ１６のアミノ酸配列であるだろう。特に明記しない限りは、２Ｈ７変異形はｖ１６のＬ鎖と同じである。
Figure 2010506568
好適なヒト化２Ｈ７はバージョン１６、又は上記のいずれかのバージョンの配列を有するインタクト抗体又は抗体断片である。
本明細書中の「ＢＡＦＦアンタゴニスト」はＢＡＦＦ又はＢＲ３の活性をブロックする任意の分子である。これらには、ＢＡＦＦを結合するＢＲ３、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの一部を含むイムノアドヘシン、又はＢＡＦＦを結合するその変異体が含まれる。他の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストはＢＡＦＦ抗体である。「ＢＡＦＦ抗体」は、ＢＡＦＦを結合する抗体であり、好ましくは該抗体はヒトＢＡＦＦの残基１６２−２７５を含むヒトＢＡＦＦの領域内でＢＡＦＦを結合する。他の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストはＢＲ３抗体である。「ＢＲ３抗体」はＢＲ３を結合する抗体であり、好ましくはヒトＢＲ３の残基２３−３８を含むヒトＢＲ３の領域内でＢＲ３を結合するものである。ヒトＢＡＦＦ及びヒトＢＲ３の配列は、例えば米国公開2006/0062787に見られる。ＢＡＦＦ結合ポリペプチド又はＢＡＦＦ抗体の他の例は、例えば国際公開2002/092620、国際公開2003/014294、Gordon et al., Biochemistry 42(20):5977-5983 (2003)、Kelley et al., J. Biol. Chem.,279(16):16727-16735 (2004) 、国際公開1998/18921、国際公開2001/12812、国際公開2000/68378、及び国際公開2000/40716に見られうる。
「慢性」投与は、長期間初期治療効果(活性)を維持するために、急性の状態とは対照的に連続的状態での薬剤投与を表す。「間欠的」投与は中断せずに継続して行わずむしろ自然的周期で行う治療である。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭを含む。
「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物として分類される任意の動物、例としてヒト、家畜及び酪農動物、及び動物園、スポーツ用、又は愛玩用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを指す。本明細書中の哺乳動物はヒトであることが好ましい。
「パッケージ挿入物」は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌、パッケージされている製品と併用される他の医薬、及び／又はその医薬などの用途に関する警告についての情報を含む、医薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指す。
「キット」は、少なくとも一の試薬、例えばＲＡ、ループス、ＭＳ又はＩＢＤなどの自己免疫性疾患の治療のための医薬を含む任意の製造品(例えば、パッケージ又は容器)である。製造品は、本発明の方法を行うためのユニットとして宣伝され、流通され、又は市販されることが好ましい。
「標的視聴者」は、特に特定の使用、治療又は症状について、マーケティングする又は宣伝することによって、特定の医薬が販売促進される、ないしは販売促進されることを意図する対象となる集団又は施設であり、例えば、個々の患者、患者集団、新聞、医学文献及び雑誌の読者、テレビ又はインターネットの視聴者、ラジオ又はインターネット視聴者、医師、製薬会社などである。
「医薬」とは対象の疾患ないしはその症状または副作用を治療するために活性な薬剤である。
本明細書中で用いる「およそ」なる用語は、当分野の技術者が容易にわかる個々の値の通常の誤差の範囲を指す。
（本発明を実施するための方法）
一実施態様では、本発明は、
(a) KASQAVSSAVA(配列番号：１)又はRASQAVSSAVA(配列番号：２)であるアミノ酸Ａ１−Ａ１１を含むＣＤＲ-Ｌ１配列、又は、KSSQSLLYSTNQKNFLA(配列番号：３)又はKSSQSLLYSANQKNFLA(配列番号：４)又はKSSQSLLYSTNQKNALA(配列番号：６)であるアミノ酸Ａ１−Ａ１７を含むＣＤＲ-Ｌ１配列であって、このときＮが任意のアミノ酸であり(それぞれキメラ２Ｃ８又はヒト化２Ｃ８.ｖ２／２Ｃ８.ｖＸ又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５／ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４、又は３Ｆ１２クローン１４又は１７)、
(b) SASHRYT(配列番号：７)又はWASTRDS(配列番号：８)であるアミノ酸Ｂ１−Ｂ７を含むＣＤＲ-Ｌ２配列(それぞれキメラ２Ｃ８／ヒト化２Ｃ８.ｖ２／ヒト化２Ｃ８.ｖＸ又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５／ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４)、
(c) QQHYSTPWT(配列番号：９)又はQENYSTPWT(配列番号：１１)又はQQYYSYPRT(配列番号：１３)又はQQYASYPRT(配列番号：１４)又はQQYYAYPRT(配列番号：１５)であるアミノ酸Ｃ１−Ｃ９を含むＣＤＲ-Ｌ３配列であり、このときＮが任意のアミノ酸であり(それぞれキメラ２Ｃ８／ヒト化２Ｃ８.ｖ２又は２Ｃ８クローンＧ７又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５／ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４又は３Ｆ１２クローン２０又は３Ｆ１２クローン２１)、
(d) GYTFTSYVIH(配列番号：１６)又はGYTFSSYWIE(配列番号：１７)であるアミノ酸Ｄ１−Ｄ１０を含むＣＤＲ-Ｈ１配列(それぞれキメラ２Ｃ８／ヒト化２Ｃ８.ｖ２／ヒト化２Ｃ８.ｖＸ又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５／ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４)、
(e) YNNPYNDGTNYNEKFKG(配列番号：１８)又はEISPGSGSTNYNEEFKG(配列番号：１９)又はYNNPYNAGTNYNEKFKG(配列番号：１０１)又はEINPGSGSTIYNEKFKG(配列番号：１１０)であるアミノ酸Ｅ１−Ｅ１７を含むＣＤＲ-Ｈ２配列であり、このときＮが任意のアミノ酸であり(それぞれキメラ２Ｃ８／ヒト化２Ｃ８.ｖ２又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５、又はヒト化２Ｃ８.ｖＸ、又はヒト化３Ｆ１２.ｖ１４)、及び、
(f) PTMLPWFAY(配列番号：２０)であるアミノ酸Ｆ１-Ｆ９を含むＣＤＲ-Ｈ３配列、又は、GYHGY(配列番号：２１)又はGYHGA(配列番号：２２)であるアミノ酸Ｆ１−Ｆ５を含むＣＤＲ-Ｈ３配列(それぞれキメラ２Ｃ８／ヒト化２Ｃ８.ｖ２／ヒト化２Ｃ８.ｖＸ又はキメラ３Ｆ１２／ヒト化３Ｆ１２.ｖ５／ヒト化３Ｆ１２.ｖ１４又は３Ｆ１２クローン１２)
からなる群から選択される少なくとも一の相補性決定領域(ＣＤＲ)配列を含んでなる単離された抗リンホトキシンα(ＬＴα)抗体を考慮する。
ある好適な実施態様では、配列番号：３はKSSQSLLYSTAQKNFLA(配列番号：５)(３Ｆ１２クローン１５)である。さらに好適な実施態様では、配列番号：１１は、QESYSTPWT(配列番号：１０)(２Ｃ８クローンＡ８／ヒト化２Ｃ８.ｖＸ)又はQEVYSTPWT(配列番号：１２)(２Ｃ８クローンＨ６)である。
他の好適な実施態様では、ＣＤＲ-Ｌ１配列は、配列番号：２又は３又は４又は６である。
他の好適な態様では、抗体は、(i) 配列番号：１又は２および７および９、又は配列番号：１又は２及び７又は８及び１１、又は配列番号：３、８および１３、又は配列番号：４、５又は６、８および１３、又は配列番号：３、８及び１４又は１５、又は配列番号：４、５又は６、８および１４又は１５のＣＤＲ-Ｌ１からＣＤＲ-Ｌ３アミノ酸配列のすべて、又は(ii) 配列番号：１６、１８および２０、又は配列番号：１６、１０１および２０、又は配列番号：１７、１９および２１又は２２、又は配列番号：１７、１１０および２１のＣＤＲ-Ｈ１からＣＤＲ-Ｈ３アミノ酸配列のすべて、のいずれかを含んでなる。
他の態様では、抗体は、配列番号：１又は２および７および９のすべて、又は配列番号：１６、１８および２０のすべて、又は配列番号：１６、１０１および２０のすべて、のいずれかを含んでなる。代替的な実施態様では、抗体は、配列番号：３、８および１３のすべて、又は配列番号：１７、１９及び２１又は２２のすべて、のいずれかを含んでなる。代替的な実施態様では、抗体は、配列番号：４、８および１４のすべて、又は配列番号：１７、１１０および２１のすべて、のいずれかを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、(i) 配列番号：１又は２、７および９、又は配列番号：１又は２及び７又は８及び１１、又は配列番号：３、８および１３、又は配列番号：４、５又は６、８および１３、又は配列番号：３、８及び１４又は１５、又は配列番号：４、５又は６、８および１４又は１５のＣＤＲ-Ｌ１からＣＤＲ-Ｌ３アミノ酸配列のすべてと、(ii) 配列番号：１６、１８および２０、又は配列番号：１６、１０１および２０、又は配列番号：１７、１９および２１又は２２、又は配列番号：１７、１１０および２１のＣＤＲ-Ｈ１からＣＤＲ-Ｈ３アミノ酸配列のすべてとを含む。
他の好適な態様は、配列番号：２３又は２４を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：２５又は２６を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：２３及び２５の両方、又は配列番号：２４及び２６の両方を含む軽鎖および重鎖の可変ドメインを有する抗ＬＴα抗体である。配列番号：２７又は２８を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：２９又は３０又は３１を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：２７および２９の両方、又は配列番号：２７および３０の両方、又は配列番号：２７および３１の両方、又は配列番号：２８および３０の両方、又は配列番号：２８および３１の両方を含む軽鎖及び重鎖の可変ドメインを有する、抗ＬＴα抗体がさらに好適である。さらに好適な態様では、本発明は、配列番号：１０２を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：１０３を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：１０２及び１０３の両方を含む軽鎖および重鎖の可変ドメインを有する、抗ＬＴα抗体を提供する。なお更なる態様では、本発明は、配列番号：１０８を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：１０９を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：１０８と１０９の両方を含む軽鎖及び重鎖の可変ドメインを有する、抗ＬＴα抗体を提供する。
他の実施態様の抗体はヒトκサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列を含むか、及び／又は重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含み、このときフレームワーク配列は、位置７１、７３および／または７８の一又は複数に置換を含むことが好ましい。この置換は、Ｒ７１Ａ、Ｎ７３ＴまたはＮ７８Ａ、又はこれらいずれかの組み合わせ、最も好ましくは３つすべてである。
本発明の抗体は、ＬＴα３に結合し、腫瘍壊死因子レセプター−１(ＴＮＦＲＩ)および腫瘍壊死因子レセプター-２(ＴＮＦＲＩＩ)とのＬＴα３の相互作用を遮断することが好ましい。特に細胞表面上のＬＴαβ複合体にも結合することが好ましい。また、ＬＴαβの機能を遮断することが好ましく、及び／又はＦｃ領域を含むことが好ましく、及び／又は、インビトロコラーゲン誘導性関節炎アッセイ又はインビトロ抗体誘導性関節炎アッセイにおいて、関節リウマチと関係している炎症性サイトカインのレベルを低減させる。
更なる好適な抗体は、ＬＴβ-ＲとＬＴαβとの相互作用を遮断する、及び／又はＬＴαβ発現細胞を調節する。他の好適な実施態様では、本明細書中の抗ＬＴα抗体は、少なくとも一のＬＴαタンパク質の少なくとも一の活性を実質的に中和する。本明細書中の抗体は、好ましくはＬＴαを発現する任意の細胞を標的とし、より好ましくはＬＴαポジティブ又は分泌細胞を枯渇する。
本明細書中の好適な抗体は、少なくともおよそ１０−１２Ｍ、より好ましくは少なくともおよそ１０−１３Ｍの親和性でＬＴαを結合する。また、抗体はＩｇＧ抗体が好ましく、例としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ３、より好ましくはヒトＩｇＧであり、最も好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａである。
他の好適な抗体は、ヒトＬＴαに対する抗体の一価性親和性が、アメリカ培養細胞系統保存機関番号ＰＴＡ−７５３８(ハイブリドーママウスリンホトキシンα２β１ ｓ５Ｈ３.２.２)の下に寄託されるハイブリドーマ細胞株によって生産されるマウス抗体のヒトＬＴαに対する一価性親和性とおよそ同じか又はそれより大きい、ヒトＬＴαに対する一価性親和性を有する。
当分野で十分確立されているので、レセプターに対するリガンドの結合親和性は、様々なアッセイのいずれかを用いて決定され、様々な量的値で表されうる。したがって、一実施態様では、結合親和性はＫｄ値として表され、(例えば最小の結合活性作用を有する)内在性結合親和性を表す。一般に好ましくは、結合親和性は、細胞フリー又は細胞を伴うセットのいずれかでインビトロで測定される。結合親和性の倍数差は、(例えばＦａｂ型の)ヒト化抗体の一価性結合親和性値及び(例えばＦａｂ型の)参照／比較抗体(例えばドナーＣＤＲ配列を有するマウス抗体)の一価性結合親和性値の比率で定量化されうる。このときの結合親和性値は類似のアッセイ条件で測定される。
したがって、ある実施態様では、結合親和性の倍数差は、Ｆａｂ型のヒト化抗体と前記参照／比較Ｆａｂ抗体のＫｄ値の比率として決定される。例えば、ある実施態様では、本発明の抗体(Ａ)が参照抗体(Ｍ)の親和性の「３分の１未満」である親和性を有する場合、そしてＡのＫｄ値が３倍である場合、ＭのＫｄ値が１倍であり、ＭのＫｄに対するＡのＫｄの比率は３：１となる。逆に、ある実施態様では、本発明の抗体(Ｃ)が参照抗体(Ｒ)の親和性の「３倍より大きい」親和性を有する場合、そしてＣのＫｄ値が１倍である場合、ＲのＫｄ値が３倍であり、ＲのＫｄに対するＣのＫｄの比率は１：３となる。本明細書中に記載のものを含む当分野で公知のいずれかのアッセイ、例えばＳＰＲ(ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)技術)、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡを使用する光学バイオセンサーを含むアッセイを用いて、結合親和性測定値を得ることができる。好ましくは、測定値は光学バイオセンサー又はラジオイムノアッセイによるものである。
本明細書中の抗体は、キメラ又はヒト化であるのが好ましく、より好ましくはヒト化であり、さらにより好ましくはフレームワーク配列の少なくとも一部がヒトコンセンサスフレームワーク配列である抗体である。
本明細書中の他の実施態様は、本明細書中の抗体を特異的に結合する抗イデオタイプ抗体である。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、次いでポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles及びPractice, 59-103頁(Academic Press, 1986)）。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合パートナーとも称される）の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための選択的培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう（ＨＡＴ培地）。
好適な融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、非融合親細胞に対する選択的培地に対して感受性である細胞である。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカ培養細胞系統保存機関、Rockville, Maryland USAから入手し得るＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞といったＳＰ-２又は誘導体から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；及びBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques及びApplications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばＲＩＡ又はＥＬＩＳＡによって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles及びPractice, 59-103頁(Academic Press, 1986)）。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、例えば細胞のマウスへの腹腔内注射により、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティクロマトグラフィ（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースＴＭ培地を用いた）、またはイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析のような常套的な抗体精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好適な供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次いでこれを、そうしないと抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)がある。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、例えばMcCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したそれぞれマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生産（Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992)）、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え（Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266 (1993)）を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に代わる実行可能な別法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、相同的マウス配列をヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）に置換することにより(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851 (1984))、又は免疫グロブリンコード配列を非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部と融合させることにより、キメラまたは融合抗体ポリペプチドを生産するために修飾できる。非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置換されるか又は、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するまた別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法が当技術分野で周知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、ヒト抗体の相当する配列をＣＤＲ配列に置換することにより、Winter及び共同研究者等の方法に従って基本的に実行可能である（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988)）。よって、こういった「ヒト化」抗体は、実質的に一以下のインタクトなヒト可変ドメインが非ヒト種由来の相当する配列で置換されたキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７）。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987)）。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを複数の異なるヒト化抗体に使用できる（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623 (1993)）。
抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することがさらに重要である。この目標を達成するべく、一方法では、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的には、ＣＤＲ残基が、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗体は、抗体断片、例えばイムノコンジュゲートを生産するために一又は複数の細胞障害性剤にコンジュゲートされていてもよいＦａｂであってよい。あるいは、ヒト化抗体は全長抗体、例えば全長ＩｇＧ１抗体であってよい。
ヒト抗体及びファージディスプレイ法
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくとも免疫化することでヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子の同型接合除去が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、５５９１６６９号（全てGenharm）；及び同５５４５８０７号；及び国際公開公報第１９９７／１７８５２号を参照されたい。
あるいは、ファージディスプレイ技術（例えばMcCafferty等, Nature 348：552-553 (1990)）を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。当該技術では、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄのメジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子の何れかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として示される。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＬＴα細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson及びChiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築し、抗原（自己抗原を含む）の異なった配列に対する抗体を、Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12:725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
上述したように、ヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい（米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号を参照）。
抗体断片
特定の状況において、完全な抗体ではなく抗体断片の使用が有利である。より小さいサイズの断片により迅速除去が可能となり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解性消化を介して誘導されていた（例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical及びBiophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい）。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は全て大腸菌で発現され、そこから分泌されるため、大量のこれらの断片を容易に生産することができる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ’-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter等, Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。他のアプローチ法では、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。エピトープ残基に結合するサルベージレセプターを含むインビボでの半減期が延長したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片が米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦＶ）である。例えば国際公開公報第１９９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び同第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠いたインタクトな結合部位を有する唯一の種であり；よってそれらはインビボでの使用中の低減された非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質が、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端の何れかでエフェクタータンパク質の融合を産出するために構築されてよい。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってよい。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＬＴαタンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体は、ＬＴα結合部位を、別のタンパク質の結合部位と連結しうる。あるいは、抗ＬＴαアームは、ＬＴα発現細胞に細胞防御メカニズムを集中及び局在化させるように、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ３）、又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプター、又はＮＫＧ２Ｄ又は他のＮＫ細胞活性化リガンド等の、白血球上のトリガー分子に結合するアームと連結されうる。また、二重特異性抗体はＬＴαを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＬＴα結合アーム及び細胞障害剤（例えば、サポリン（saporin）、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン）と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
国際公開公報第１９９６／１６６７３号は、二重特異性抗ＥｒｂＧ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を開示し、米国特許第５８３７２３４号は、二重特異性抗ＥｒｂＧ２／抗ＦｃγＲＩ抗体を開示している。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、国際公開公報第１９９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示している。
二重特異性抗体の作成方法は、当技術分野で周知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づき、ここで２つの鎖は異なる特異性を持っている（Millstein等, Nature, 305:537-539(1983)）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ（四部雑種）は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティクロマトグラフィ工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開公報第１９９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原-抗体連結部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好適には、該融合は、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインとの融合でありうる。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合の少なくとも一つに存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、及び望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が、所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節により大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の組み合わせの収率に有意な影響を及ぼさないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖／軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開公報第１９９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
別のアプローチ法（米国特許第５７３１１６８号）によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含みうる。この方法では、第一抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより、大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を第二の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロコンジュゲート（ヘテロ抱合体）」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体がアビジンとカップリングし、他方はビオチンとカップリングしていてもよい。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること（米国特許第４６７６９８０号）及びＨＩＶ感染の治療（国際公開公報第１９９１／００３６０号、国際公開公報第１９９２／２０３７３号及び欧州特許第０３０８９号）等の用途が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は適当な架橋方法によって生成できる。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号などに記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクト抗体をタンパク質分解的に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片は次いでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’-ＴＮＢ誘導体の一つを次いでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’-チオールに再転換し、等モル量の他のＦａｂ’-ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ’-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別々に分泌され、インビトロで定方向化学的カップリングを受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能であるだけでなく、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となりうる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な方法もまた記述されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が生産されている。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合により２つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させられた。抗体ホモダイマーがヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用する別の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60(1991)。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション（及び／又は異化）されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外のもの）であってよく（例えば四価抗体）、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によりすぐに生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有しうる。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する（又はそれらからなる）。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する（又はそれらからなる）。多価抗体は少なくとも一つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を有し、ポリペプチド鎖（一又は複数）は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖（一又は複数）はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は第二の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖（一又は複数）は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有しうる。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有しうる。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、あるいはＣＬドメインをさらに有する。
ベクター、宿主細胞、及び組換え法
宿主細胞の選択及び形質転換
組換えモノクローナル抗体、イムノアドヘシン及び本明細書中に記載の他のポリペプチドアンタゴニストをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核細胞である。この目的にとって適切な原核生物としては、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア（Erwinia）、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス（licheniformis）（例えば、１９８９年４月１２日に公開された旧東ドイツ特許第２６６７１０号に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属が挙げられる。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のような株も適切である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
例えば治療的抗体が細胞障害性剤（例として、毒素）にコンジュゲートし、そのイムノコンジュゲートそれ自体が腫瘍細胞破壊に効果的である場合など、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でないときは特に、完全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は細菌内で生成することができる。全長抗体は循環中で半減期が長い。大腸菌での生成がより早くよりコスト効率がよい。細菌内における抗体断片及びポリペプチドの発現方法については、発現及び分泌を最適化する転写開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載している米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、同第５７８９１９９号（Joly等）、及び同第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。発現後、可溶性分画の大腸菌細胞ペーストから抗体を単離し、例としてアイソタイプによるプロテインＡまたはＧカラムにより精製しうる。例えばＣＨＯ細胞で発現した抗体の精製工程と同様にして最終的精製を行う。一般的なモノクローナル抗体の生産については、米国特許第７０１１９７４号も参照のこと。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＬＴα抗体などの抗体コードベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ．ラクティス、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリカス（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウィッケラミイ（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア（欧州特許第４０２２２６号）；ピチアパストリス（欧州特許第１８３０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（欧州特許第２４４２３４）；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
例えばグリコシル化ＬＴα結合抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蚊）、アエデス・アルボピクトゥス（蚊）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、及びボンビクス・モリといった宿主からのものが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションに使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養も宿主として利用することができる。
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ-７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（例えば２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ（ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）、限定するものではないが例としてＣＨＯ Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ３−、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ ＤＵＸＢ１１、Ｌｅｃ１３、Ｂ-Ｌｙ１、及びＣＨＯ ＤＲ１２細胞、好適にはＣＨＯ ＤＵＸ（ＤＨＦＲ-）又はそのサブクローン（いわゆる「ＣＨＯ ＤＵＸ」）；Ｃ１２７細胞、マウスＬ細胞；Ｌｔｋ−細胞；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サルの腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ-７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス骨髄腫細胞；ＮＳ０；ハイブリドーマ細胞、例えばマウスハイブリドーマ細胞；ＣＯＳ細胞；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、本明細書中のＬＴα結合抗体の生産のために発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。ハム（Ｈａｍ）のＦ１０（シグマ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（シグマ））、ＲＰＭＩ-１６４０（シグマ）及びダルベッコの改良イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、シグマ）といった市販の培地が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４９２７７６２号；同第４５６０６５５号；又は同第５１２２４６９号；国際公開公報第１９９０／０３４３０号；同第１９８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞のための培地として使用できる。これらの培地には何れも、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン又は表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者であればわかる適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
一つの特定の態様において、適切な培地は基礎培地成分を含み、該成分は例えば、必要であれば適切に変更された濃度の何らかの成分、例えばアミノ酸、塩類、砂糖、及びビタミン類、及び任意でグリシン、ヒポキサンチン及びチミジンを含む；組換えヒトインスリン、加水分解ペプトン、例えばＰＲＯＴＥＡＳＥ ＰＥＰＴＯＮＥ２及び３ＴＭ、ＰＲＩＭＡＴＯＮＥ ＨＳＴＭ又はＰＲＩＭＡＴＯＮＥ ＲＬＴＭ（Difco, USA；Sheffield, England）、又はその等価物；細胞保護剤、例えばＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８ＴＭ又は等価なＰＬＵＲＯＮＩＣＴＭポリオール；ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ抗生物質；及び微量元素を有する、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ-１２ベースの製剤（ＤＭＥＭ及びＨＡＭ Ｆ１２倍地、及び特に無血清培地の組成のためのもの、American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines及びHybridomas, 第６版, 1998, 346-349ページの培地製剤を参照）（米国特許第５１２２４６９号に記載の培地の設計が適当であろう）を含む。
本発明の一態様では、発酵法によって多量の抗体産生が行われる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも約１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる容積の発酵槽での発酵を意味する。
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始され、このステージで細胞は初期定常期にある。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
本発明のポリペプチドの生産収率と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てと折り畳みを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ）のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等, J Bio Chem 274:19601-19605 (1999)；米国特許第６０８３７１５号及び同第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun, J. Biol. Chem. 275:17100-17105 (2000)；Ramm及びPluckthun, J. Biol. Chem. 275:17106-17113 (2000)；及びArie等, Mol. Microbiol. 39:199-210 (2001)。
発現された異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性のもの）のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。いくつかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、これらは例えば上掲の米国特許第５２６４３６５号；同第５５０８１９２号；及びHara等, Microbial Drug Resistance 2:63-72 (1996)に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質分解性酵素を欠損し、且つ一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株を、本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合、第一工程として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は限外濾過により取り除く。抗体が培地へ分泌される場合、一般的には、そのような発現系からの上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰｅｌｌｉｃｏｎＴＭの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の増殖を防止してもよい。
一実施態様において、本明細書に記載の生産した抗体タンパク質をさらに精製して、さらなるアッセイ及び使用のために実質的に均一な調製物を得る。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭによるクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、免疫親和性カラムによる分画化、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィ、アニオン-又はカチオン-交換樹脂（ＤＥＡＥ又はポリアスパラギン酸カラム等）によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降、及び、例えばＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ Ｇ-７５を用いたゲル濾過。アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。分析規模の精製の場合、より少量がカラムを通過及び使用され；治療用途で有用な量の抗体を生産するための実験及び商業用規模の精製の場合、より大量が使用される。当業者であれば、どの用途にどの規模が使用されるべきかわかるであろう。好適には、本発明には実験規模が使用される。
親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する何らかの免疫グロブリンＦｃドメインのアイソタイプ及び種に依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 15671575 (1986)）。アフィニティリガンドが結合されるマトリックスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも使用可能である。孔制御ガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。
プロテインＡクロマトグラフィの場合、プロテインＡが固定される固形相は、好適にはガラス又はシリカ表面を含むカラム、より好ましくは孔制御ガラスカラム又はケイ酸カラムである。いくつかの用途においては、カラムは、汚染物の非特異的な接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。次いで、固形相を洗浄し、該固形相に非特異的に接着した汚染物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形相から回収する。
任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物とを含む混合物に、約２．５−４．５のｐＨでの溶出バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィを施してもよく、これは好ましくは低い塩濃度（例えば約０−０．２５Ｍ塩）で実施される。
ＨＡＭＡ応答の減弱又は欠損を示す変異体抗体の生成
ＨＡＭＡ応答の減弱又は欠損は、適切な治療薬の臨床開発の重要な態様である。例として、Khaxzaeli 等, J. Natl. Cancer Inst., 80:937 (1988)、Jaffers 等, Transplantation, 41:572 (1986)、Shawler 等, J. Immunol., 135:1530 (1985)、Sears 等, J. Biol. Response Mod., 3:138 (1984)、Miller 等, Blood, 62:988 (1983)、Hakimi 等, J. Immunol., 147:1352 (1991)、Reichmann 等, Nature, 332:323 (1988)、Junghans 等, Cancer Res., 50:1495 (1990)を参照。本明細書に記載のいくつかの実施態様において、本発明は、ＨＡＭＡ応答が減弱されるかまたは欠損されるようにヒト化された抗体を提供する。これらの抗体の変異体がさらに、当分野で公知の慣例的な方法を使用して得られてもよい。その方法のいくつかを後述する。
例えば、本明細書において記述されるように、抗体のアミノ酸配列はフレームワーク及び／又はＣＤＲ配列（一又は複数）を多様化させるために開始（親）配列として働きうる。開始ＣＤＲ配列が連結される選択されたフレームワーク配列は、本明細書において、アクセプターヒトフレームワークと称する。アクセプターヒトフレームワークは、ヒト免疫グロブリン（そのＶＬ及び／又はＶＨ領域）のものかあるいはそれに由来するものであってよいが、好ましくはヒトコンセンサスフレームワーク配列のものかあるいはそれに由来するものであり、これはそのようなフレームワークがヒト患者においてごく小さい免疫原性あるいは全く免疫原性を示さないことが証明されているためである。
アクセプターがヒト免疫グロブリンから得られる場合、場合によっては、ドナーフレームワーク配列を一まとまりのヒトフレームワーク配列の様々なヒトフレームワーク配列に合わせること、及びアクセプターとして最も相同性のあるフレームワーク配列を選択することによって、ドナーフレームワーク配列に対するその相同性に基づくヒトフレームワーク配列を選択してもよい。
一実施態様では、本明細書中のヒトコンセンサスフレームワークは、ＶＨサブグループＩＩＩ及び／又はＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク配列のものかあるいはそれに由来するものである。
故に、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは、１、２、３又は以下のすべてのフレームワーク配列を含有してなってもよい：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS（配列番号：４６）を含有してなるＦＲ１、
WVRQAPGKGLEWVG（配列番号：４７）を含有してなるＦＲ２、
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR（配列番号：４８）又はRATFSADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAD（配列番号：５０）を含有してなるＦＲ３、及び
WGQGTLVTVSS（配列番号：４５）を含有してなるＦＲ４。
ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、１、２、３又は以下のすべてのフレームワーク配列を含有してなってもよい：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC（配列番号：５１）を含有してなるＦＲ１、
WYQQKPGKAPKLQIY（配列番号：５２）又はWYQQKPGKAPKLLIY（配列番号：５５）を含有してなるＦＲ２、
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC（配列番号：５３）を含有してなるＦＲ３、及び
FGQGTKVEIKR（配列番号：５４）を含有してなるＦＲ４。
アクセプターが、ヒト免疫グロブリン又はヒトコンセンサスフレームワークからのものか否かにかかわらず、配列において、選択されたヒトフレームワーク配列と同一でもよい一方で、本発明では、アクセプター配列はヒト免疫グロブリン配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に関して既存のアミノ酸置換を含有しうると考えられる。これらの既存の置換は、ヒト免疫グロブリン配列又はコンセンサスに関して、最小限、通常、４つ、３つ、２つ又は一つだけのアミノ酸の相違であることが好ましい。
非ヒト抗体のＣＤＲ領域残基は、ＶＬ及び／又はＶＨアクセプターヒトフレームワークに組込まれる。例えば、ＫａｂａｔＣＤＲ残基、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ残基、ＡｂＭ残基、及び／又は接触残基に対応する残基を組込んでもよい。場合によって、以下のような伸展したＣＤＲ領域残基が組み込まれる：２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）。
ＣＤＲ残基の「組込み」は様々な方法で達成可能であり、例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸は、そのフレームワーク残基がアクセプターヒトフレームワーク残基に変化するようにマウス可変ドメイン配列をコードする核酸を変異させることによって、又は、ＣＤＲ残基が非ヒト残基に変化するようにヒト可変ドメイン配列をコードする核酸を変異させることによって、又は、所望の配列をコードする核酸を合成することによってなどして生成できる。
ＣＤＲグラフト変異体は、各ＣＤＲについて別個のオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトアクセプター配列をコードする核酸のＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発法により生成されうる。Kunkel 等, Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)。慣例的な技術を用いてフレームワーク及び／又はＣＤＲの中に適当な変異を導入して、適正なＣＤＲ-抗原相互作用を修正及び再確立できる。
ファージ（ファジミド）ディスプレイ（また本明細書中ではファージディスプレイとも称する）は、配列のランダム化により生成されたライブラリ中の、多くの異なる潜在的な変異体抗体の生成及びスクリーニングのための簡便で迅速な方法として用いることができる。しかしながら、変更された抗体の作製及びスクリーニングのための他の方法も当業者に有用である。
ファージ（ファジミド）ディスプレイ技術は、抗原などのリガンドに結合する新規のタンパク質を生成して選別するための強力な手段を提供している。ファージ（ファジミド）ディスプレイ技術を用いると、高い親和性で標的分子と結合する配列について迅速に選別できるタンパク質変異体の大きなライブラリを生成できる。変異体ポリペプチドをコードする核酸は、通常、遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質などのウィルスコートタンパク質をコードする核酸配列に融合する。タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列が遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合されている一価性ファジミドディスプレイシステムが開発されている。（Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)、Lowman及びWells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)）。一価性ファジミドディスプレイシステムにおいて、遺伝子融合は低レベルで発現され、粒子の感染力が保持されるように野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現される。ペプチドライブラリを生成する方法及びそれらのライブラリのスクリーニング方法は、多くの特許に開示されている（例えば米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、及び同第５４９８５３０号）。
抗体のライブラリは、ランダムなＤＮＡ配列を挿入することによって、単一遺伝子を変更すること、又は、関連した遺伝子のファミリをクローニングすることなどを含む、多くの方法により調製されている。ファージ（ファジミド）ディスプレイを用いた抗体又は抗原結合断片のディスプレイ方法は、米国特許第５７５０３７３号、同第５７３３７４３号、同第５８３７２４２号、同第５９６９１０８号、同第６１７２１９７号、同第５５８０７１７号、及び同第５６５８７２７号に記述されている。次いでライブラリは、所望の特徴を有する抗原結合タンパク質又は抗体の発現についてスクリーニングされる。
オリゴヌクレオチド配列は、変更するＣＤＲ残基の一又は複数の設計されたコドンセットを含む。コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。コドンセットは、ＩＵＢコードによって以下に示すように、特定のヌクレオチド又はヌクレオチドの等モル混合物を示す符号を使って表される。
ＩＵＢコード
Ｇ グアニン
Ａ アデニン
Ｔ チミン
Ｃ シトシン
Ｒ（Ａ又はＧ）
Ｙ（Ｃ又はＴ）
Ｍ（Ａ又はＣ）
Ｋ（Ｇ又はＴ）
Ｓ（Ｃ又はＧ）
Ｗ（Ａ又はＴ）
Ｈ（Ａ又はＣ又はＴ）
Ｂ（Ｃ又はＧ又はＴ）
Ｖ（Ａ又はＣ又はＧ）
Ｄ（Ａ又はＧ又はＴ）Ｈ
Ｎ（Ａ又はＣ又はＧ又はＴ）
例えば、コドンセットＤＶＫでは、ＤはヌクレオチドＡ又はＧ又はＴであり；ＶはＡ又はＧ又はＣであり；ＫはＧ又はＴであってよい。このコドンセットは１８の異なるコドンを示し、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ及びＣｙｓをコードする。
オリゴヌクレオチド又はプライマーのセットは、標準の方法を使って合成できる。一組のオリゴヌクレオチドは、例えば、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの全ての可能な組合せを表し且つ所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、固相法によって合成することができる。ある位置での選ばれたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能）を使って合成することができ、又は市販品を入手することができる（例えば、Life Technologies, Rockville, MDから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本明細書中で使用されるように、オリゴヌクレオチドは、可変ドメインの核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
一つの方法では、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は、オリゴヌクレオチドを媒介した突然変異生成によって作製することができる。この手法はZoller等, Nucleic Acids Res.10:6487-6504 (1987)が記載しているように、当技術分野で公知である。つまり、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は、所望の制限コドンセットをコードしているオリゴヌクレオチドセットをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズすることによって作製され、前記鋳型は可変領域核酸鋳型配列を含むプラスミドの一本鎖型である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の完全二次相補鎖を合成し、この相補鎖はオリゴヌクレオチドプライマーを組込み、前記オリゴヌクレオチドセットによって提供される制限コドンセットを含むようになる。
通常、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使われる。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異体をコードするヌクレオチド（一又は複数）の片側が鋳型と完全に相補性である少なくとも１２から１５個のヌクレオチドを持つ。これにより、オリゴヌクレオチドが正しく一本鎖ＤＮＡ鋳型分子にハイブリダイズするようになる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の手法、例えばCrea等, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA, 75:5765 (1978)に記載の手法を使って容易に合成される。
ＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクター（市販のＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９ベクターが適当）に由来するベクター、又はViera等, Meth.Enzymol., 153:3 (1987)に記載の一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの一つに挿入することができる。一本鎖鋳型の生産は、Sambrook等, 上掲のセクション４．２１〜４．４１に記載されている。
天然のＤＮＡ配列を変えるために、オリゴヌクレオチドが適当なハイブリダイゼーション条件の下で一本鎖鋳型にハイブリダイズされる。ＤＮＡ重合酵素、例えば、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を次に加え、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使って鋳型の相補鎖を合成する。こうしてＤＮＡの一つの鎖が遺伝子１の突然変異した形態をコードし、他の鎖（元の鋳型）が遺伝子１の未変性、未変更の配列をコードするようにヘテロ二本鎖分子が形成される。このヘテロ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞、通常大腸菌ＪＭ１０１のような原核生物に形質転換される。細胞を増殖させた後にアガロースプレートの上へプレートし、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを同定するために３２Ｐリン酸塩で放射性標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使ってスクリーニングする。
直前で記載されている方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異を含むホモ二本鎖分子が作製されるように修正することができる。この修正は以下の通りである。一本鎖オリゴヌクレオチドを先に述べたように一本鎖鋳型にアニールする。３つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）及びデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手できる）と合わせる。この混合物を鋳型-オリゴヌクレオチド複合体に加える。ＤＮＡポリメラーゼをこの混合物へ追加すると、突然変異した塩基以外は鋳型と同一のＤＮＡ鎖が生成される。さらに、この新しいＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ-（ａＳ）を含み、これはＤＮＡ鎖を制限酵素による消化作用から保護するのに役立つ。二本鎖ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素でニックを入れた後、突然変異を起こさせる部位を含む領域の後方で鋳型鎖はＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ又は別の適当なヌクレアーゼで消化することができる。反応を終了すると、部分的にだけ一本鎖の分子が残る。次に、完全な二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖が、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸のすべて、ＡＴＰ及びＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを使って形成される。このホモ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞に形質転換することができる。
前に示したように、オリゴヌクレオチドセットの配列の長さは、鋳型核酸にハイブリダイズするために十分な長さであり、また、必須ではないが制限部位を含むこともできる。ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクターに由来するベクター、又はViera等（Meth.Enzymol., 153:3 (1987)）に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成できる。このように、突然変異させるべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの一つに挿入する必要がある。一本鎖鋳型の生産は、Sambrook等, 上掲のセクション４．２１〜４．４１に記載されている。
別の方法によると、ライブラリは上流及び下流のオリゴヌクレオチドセットを提供することによって生成することができ、各セットは、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを持つ。これらの配列は、オリゴヌクレオチドの配列内で提供されたコドンセットによって確立される。上流及び下流のオリゴヌクレオチドセットは、可変ドメイン鋳型核酸配列と共に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いてＰＣＲ産物の「ライブラリ」を作製することができる。ＰＣＲ産物は確立された分子生物学的手法を使って他の関連した、又は無関係な核酸配列、例えばウィルスのコートタンパク質及び二量体化ドメインと融合することができるので、「核酸カセット」と呼ぶこともある。
ＰＣＲプライマー配列は、ＣＤＲの溶媒に露出し非常に多様な位置のために設計された一又は複数のコドンセットを含む。前記したように、コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。
標準的な組み換え技術を用いて、好適なスクリーニング／選別工程を介して選択された、所望の基準を満たす抗体選択物を単離してクローニングすることができる。
活性のアッセイ
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的特性及び生物学的機能について特徴付けることができる。
精製された免疫グロブリンは、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィ、及びパパイン消化を含む一連のアッセイによってさらに特徴付けることができる。
本発明の特定の実施態様では、ここで生産された抗体は、その生物学的活性について分析される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、その抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を用いた任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。
一実施態様では、本発明は全てではなくいくつかのエフェクター機能を有する変更した抗体について考察し、このことによって、該抗体は、抗体のインビボ半減期が重要であるがある種のエフェクター機能（補体又はＡＤＣＣなど）が不要又は有害な多くの用途の望ましい候補となる。特定の実施態様では、生成した免疫グロブリンのＦｃ活性を測定して、所望の特性のみが維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している（つまり、おそらくＡＤＣＣ活性を欠損している）が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣをもたらす第一細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、その一方で単核細胞はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等, PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法を用いて行うことができる。
抗体変異体
いくつかの実施態様では、本明細書に開示の抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、又は残基への挿入、あるいは残基の置換を含む。最終コンストラクトが所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWellsによりScience, 244:1081-1085 (1989)に開示されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の群が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電した残基）、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与えるように中性の、又は負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置換される。次いで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において又は置換の部位のために、さらなる又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要はない。例えば、任意の部位における突然変異の機能を分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャニング又はランダム突然変異誘発を実行し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入には、１から１００以上までの長さに亘る残基を有するポリペプチドへのアミノ-末端融合及び／又はカルボキシ-末端融合、並びに、単一又は多重アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ-末端メチオニル残基を持つ抗体、又は細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は（例えばＡＤＥＰＴのための）酵素の抗体のＮ-末端又はＣ-末端への融合が含まれる。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異について最も関心ある部位はＣＤＲを含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表Ａに示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表Ａに「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入して、生成物をスクリーニングしてよい。
表Ａ
Figure 2010506568
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩、の維持に対するそれらの効果が実質的に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸を、それらの側鎖の特性における類似性にしたがってグループ分けできる（例えばA. L. Lehninger, Biochemistry, 第二版, 73-75ページ, Worth Publishers, New York (1975)に記載のとおり）：
（１）非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
（２）非荷電極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
（３）酸性：Asp (D), Glu (E)
（４）塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基を共通の側鎖特性に基づいてグループ分けできる：
（１）疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile
（２）中性の親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln
（３）酸性：Asp, Glu
（４）塩基性：His, Lys, Arg
（５）鎖配向に影響する残基：Gly, Pro
（６）芳香族：Trp, Tyr, Phe
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このような置換された残基はまた、保存的置換部位、又は好ましくは残留（非保存的）部位に導入されうる。
ある型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一又は複数のＣＤＲ残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性突然変異を伴う。簡潔に言えば、いくつかのＣＤＲ部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位において全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、次いで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となるＣＤＲ部位を位置づけるために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与するＣＤＲ残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基が、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択できる。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）、又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
本発明の抗体は、好適には天然配列Ｆｃ領域を有する。しかしながら、Ｆｃ領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異体を生成することが望ましい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、置換）を有するヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含みうる。にもかかわらず、これらの抗体はその野生型対応物と実質的に同じ治療用途に必要な特徴を維持している。こういったアミノ酸置換は、例えば他のＦｃ機能を改善又は減少させるか又はさらに同一のＦｃ機能を改善するか、抗原結合親和性を増加するか、安定性を増加するか、グリコシル化を変更するか、又はアロタイプ変異体を含みうる。抗体はさらに、野生型Ｆｃ領域を有する同じ抗体と比べて増加したＦｃγＲ結合、増加したＡＤＣＣ、増加したＣＤＣ、減少したＣＤＣ、増加したＡＤＣＣ及びＣＤＣ機能、増加したＡＤＣＣしかし減少したＣＤＣ機能（例えば融合反応を最小化するための）、増加したＦｃＲｎ結合、及び増加した血清半減期から選択される一又は複数の特性を有しうる。これらの活性は、ここに記載の方法によって測定可能である。例えば、国際公開公報第１９９９／５１６４２号を参照。また、他のＦｃ領域変異体の例に関してはDuncan及びWinter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及び国際公開公報第１９９４／２９３５１号を参照のこと。
Ｆｃ機能を改善するさらなるアミノ酸変化については、例えば米国特許第６７３７０５６号を参照のこと。本発明の抗体はいずれもさらに、ＣＤＣ活性を低下させるＦｃ領域での少なくとも一以上のアミノ酸置換、例えば少なくとも置換Ｋ３２２Ａを含むもの、を含みうる。米国特許第６５２８６２４号（Idusogie等）を参照。
また別の好適な実施態様において、抗体は、２６８Ｄ、又は２９８Ａ、又は３２６Ｄ、又は３３３Ａ、又は３３４Ａ、又は２９８Ａと３３３Ａ、又は２９８Ａと３３４Ａ、又は２３９Ｄと３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ａ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと３３０Ｌ及び３３２Ｅ及び２７２Ｙ及び２５４Ｔ及び２５６Ｅ、又は２５０Ｑと４２８Ｌ、又は２６５Ａ、又は２９７Ａである一又は何れかを組み合わせた位置にアミノ酸置換を有し、ここで２６５Ａ置換は２９７Ａがないときに起こり、２９７Ａ置換は２６５Ａがないときに起こる。これらの各記号表示の数字の後の文字は、その位置で変化したアミノ酸を示す。
ＡＤＣＣ及びＣＤＣを改善する突然変異は、本明細書において三重Ａｌａ突然変異とも称される、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４（残基のＥＵ番号付け）、特にＳ２９８ＡとＥ３３３Ａ及びＫ３３４Ａ（Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、又は同義的に２９８Ａ、３３３Ａ及び３３４Ａの組み合わせ）を含む、Ｆｃ領域の一つから３つの位置での置換を含む。Ｋ３３４Ｌは、ＣＤ１６への結合を増加させる。Ｋ３２２ＡはＣＤＣ活性を減少させ；Ｋ３２６Ａ又はＫ３２６ＷはＣＤＣ活性を増進する。Ｄ２６５ＡはＡＤＣＣ活性を減少させる。
安定性変異体は、例えば酸化及びアミド分解に関して改善された安定性を示す変異体である。
さらなる種類の抗体のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。このような変更は、抗体に見られる一又は複数の炭水化物部分の欠損、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を含む。ＡＤＣＣ機能を増加させるグリコシル化変異体は、国際公開公報第２００３／０３５８３５号に記載されている。また米国特許公開公報第２００６／００６７９３０号も参照のこと。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の接着(attachment)を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン（ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的接着(attachment)のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが接着することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列（Ｎ結合グリコシル化部位のもの）を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる（Ｏ-結合グリコシル化部位の場合）。
抗体がＦｃ領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国特許公開公報第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）に記載されている。米国特許公開公報第２００４／００９３６２１号（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.）も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を二分する抗体は、国際公開公報第２００３／０１１８７８号, Jean-Mairet等、及び米国特許第６６０２６８４号, Umana等で参照されている。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、例えば国際公開公報第１９９７／３００８７号, Patel等に報告されている。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公開公報第１９９８／５８９６４号（Raju）及び国際公開公報第１９９９／２２７６４号（Raju）も参照のこと。また、Ｎ結合オリゴサッカリドを含むＦｃ領域を有する抗体を含む、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国特許公開公報第２００５／０１２３５４６号（Umana等）；同第２００４／００７２２９０号（Umana等）；同第２００３／０１７５８８４号（Umana等）；国際公開公報第２００５／０４４８５９号（Umana等）；及び米国特許公開公報第２００７／０１１１２８１号（Sondermann等）；及び同第２００７／００１０００９（Kanda等）を参照。
本明細書中の好適なグリコシル化抗体変異体はＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域に接着される炭水化物構造はフコースが減少又はフコースを欠いており、これによりＡＤＣＣ機能が改善されうる。特に、ここでは、野生型ＣＨＯ細胞で産生された同じ抗体のフコースの量と比べてフコースが減少した抗体を考察する。つまり、それらは、天然ＣＨＯ細胞で産生された場合のフコースの量より少量のフコースを有することを特徴とする。好適には、抗体は、そのＮ結合グリカンの約１０％以下がフコースを含む抗体であり、より好適にはそのＮ結合グリカンの約５％以下がフコースを含む抗体であり、最も好適にはそのＮ結合グリカンがフコースを含まない抗体である、つまり抗体が完全にフコースがないか含まない。
このような「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体は、例えば米国特許公開公報第２００３／０１５７１０８号；国際公開公報第２０００／６１７３９号；同第２００１／２９２４６号；米国特許公開公報第２００３／０１１５６１４号；同第２００２／０１６４３２８；同第２００４／００９３６２１；同第２００４／０１３２１４０；同第２００４／０１１０７０４；同第２００４／０１１０２８２；同第２００４／０１０９８６５；国際公開公報第２００３／０８５１１９；同第２００３／０８４５７０；同第２００５／０３５５８６；同第２００５／０３５７７８；同第２００５／０５３７４２；米国特許公開公報第２００６／００６３２５４号；同第２００６／００６４７８１号；同第２００６／００７８９９０号；同第２００６／００７８９９１；Okazaki等, J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；及びYamane-Ohnuki等, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)に開示されているような、細胞株での抗体の培養によって産生されうる。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコース化欠損Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka等, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許公開公報第２００３／０１５７１０８号（Presta）；及び国際公開公報第２００４／０５６３１２号（Adams等, 特に実施例１１））、及びノックアウト細胞株、例としてα-１，６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８-ノックアウトＣＨＯ細胞（Yamane-Ohnuki等, Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)）などがある。Kanda等, Biotechnol. Bioeng., 94:680-8 (2006)も参照のこと。米国特許公開公報第２００７／００４８３００号（Ｂｉｏｇｅｎ-ＩＤＥＣ）は、所望のエフェクター機能を備えるアグリコシル化Ｆｃ含有ポリペプチド、例えば抗体の製造方法、並びに該方法にしたがって産生されるアグリコシル化抗体、及びそういった抗体の薬剤としての使用方法を開示しており、これらは全て本明細書において適用できる。加えて、米国特許第７２６２０３９号は、α-１，３-フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、及び該ポリペプチドを用いたフコース含有糖鎖の産生方法に関する。
また、ここで適用可能な組換え糖タンパク質及びグリコシル化変異体については、米国特許公開公報第２００６／０２４３０４号（Gerngross等）；米国特許第７０２９８７２号（Gerngross）；米国特許公開公報第２００４／０１８５９０号（Gerngross等）；米国特許公開公報第２００６／０３４８２８号（Gerngross等）；米国特許公開公報第２００６／０３４８３０号（Gerngross等）；米国特許公開公報第２００６／０２９６０４号（Gerngross等）；国際公開公報第２００６／０１４６７９号（Gerngross等）；国際公開公報第２００６／０１４６８３号（Gerngross等）；国際公開公報第２００６／０１４６８５号（Gerngross等）；国際公開公報第２００６／０１４７２５号（Gerngross等）；及び国際公開公報第２００６／０１４７２６号（Gerngross等）を参照のこと。
別の実施態様において、本発明は、Ｆｃ領域を有する本明細書に記載の抗体を含む抗体組成物を提供し、ここで該組成物の抗体の約２０〜１００％が、フコースを欠失するＦｃ領域に成熟コア糖鎖構造を有する。好ましくはこういった組成物は、２３８、２３９、２４６、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１４、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８及び４３９からなる群から選択されるＦｃ領域の位置の何れか一つまたは何れかの組み合わせにおいて、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｔ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸を置換することによって、抗体の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、又は薬物動態特性の一又は複数が、野生型ＩｇＧＦｃ配列と異なるように変更されたＦｃ領域を有する抗体を含む。
組成物は、より好ましくは、抗体がさらに２６８Ｄ又は３２６Ｄ又は３３３Ａと３３４Ａ、又は２９８Ａと３３３Ａ、又は２９８Ａと３３４Ａ、又は２３９Ｄと３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ａ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと３３０Ｌ及び３３２ＥのＦｃ置換をさらに有するものであり、ここでこれらの各記号表示の数字の後の文字は、その位置で変化したアミノ酸を示す。
組成物は、さらに好ましくは、抗体がＦｃγＩＩＩと結合しているものである。組成物はさらに、抗体が、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣ活性を有するか、又はヒトエフェクター細胞の存在下でヒト野生型ＩｇＧ１Ｆｃ領域を備える同じ抗体と比べてＡＤＣＣ活性が増強しているようなものであるのが好ましい。
組成物は、また好ましくは、抗体が、糖タンパク質のＦｃ領域に接着したフコースを含む成熟コア糖鎖構造を有する糖タンパク質よりも、より高い親和性でＦｃγＲＩＩＩと結合しているか、又はより効果的にＡＤＣＣを媒介するものである。また、組成物は、抗体がＣＨＯ細胞、好適にはＬｅｃ１３細胞により産生されたものであることが好ましい。組成物はまた、抗体がフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、より好適にはＦＵＴ８遺伝子を欠いた哺乳類細胞により産生されたものであることが好ましい。
一態様において、組成物は、抗体が、成熟コア糖鎖構造に接着した二分岐Ｎ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有さないものである。あるいは、組成物は、抗体が、成熟コア糖鎖構造に接着した二分岐ＧｌｃＮＡｃを有するものである。
また別の態様において、組成物は、抗体が、成熟コア糖鎖構造に接着した一又は複数のガラクトース残基を有するものである。あるいは、組成物は、抗体が、成熟コア糖鎖構造に接着した一又は複数のガラクトース残基を有さないものである。
さらなる態様において、組成物は、抗体が、成熟コア糖鎖構造に接着した一又は複数のシアル酸残基を有するものである。あるいは、組成物は、抗体が、成熟コア糖鎖構造に接着した一又は複数のシアル酸残基を有さないものである。
組成物は、好ましくは、少なくとも約２％のアフコシル化抗体を含む。組成物は、より好ましくは、少なくとも約４％のアフコシル化抗体を含む。組成物は、さらに好ましくは、少なくとも約１０％のアフコシル化抗体を含む。組成物は、さらにより好ましくは、少なくとも約１９％のアフコシル化抗体を含む。組成物は、最も好ましくは、少なくとも約１９％のアフコシル化抗体を含む。
イムノコンジュゲート（免疫抱合体）
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む、イムノコンジュゲート、又は抗体-薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、例えば癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体-薬剤コンジュゲートを用いると（Syrigos及びEpenetos, Anticancer Research 19:605-614 (1999)；Niculescu-Duvaz及びSpringer, Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172 (1997)；米国特許第４９７５２７８号）、腫瘍への薬剤部分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる（Baldwin等, Lancet, 603-05 (1986)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等（編）, pp. 475-506 (1985)）。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている（Rowland等, Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87 (1986)）。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる。抗体-毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒、ゲルダナマイシン（Mandler等, J. Nat. Cancer Inst. 92 (19):1573-1581 (2000)；Mandler等, Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000)；及びMandler等, Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)）、メイタンシノイド（欧州特許第１３９１２１３号；Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8618-8623 (1996)）、及びカリケアマイシン（Lode等, Cancer Res., 58:2928 (1998)；Hinman等, Cancer Res., 53:3336-3342 (1993)）などの小分子毒素などのが含まれる。いかなる理論にも制限されることなく、該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含むメカニズムにより、その細胞障害性及び細胞分裂停止性効果を発揮しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
こういったイムノコンジュゲートの生成に有用な化学治療薬を上記に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（momordica charantia）インヒビター、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）インヒビター、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）及びトリコテセン（tricothecene）が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-（２-ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス（ｐ-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-（ｐ-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098 (1987)に記載されているように調製することができる。炭素-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合（コンジュゲート）のためのキレート剤の例である。例えば国際公開公報第１９９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテセン、及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体もまた、ここで考察される。
本発明のＡＤＣにおいて、リンカー（Ｌ）を介して、抗体（Ａｂ）を、一つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：（１）共有結合を介してＡｂ-Ｌを形成し、その後に薬剤部分Ｄと反応させるための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び（２）共有結合を介してＤ-Ｌを形成し、その後に抗体の求核基と反応させるための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ 式Ｉ
抗体上の求核基は、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。
また、本発明の抗体-薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入することによって生成してよく、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤（Domen等, J. Chromatog., 510:293-302 (1990)）上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基が生じうる。別の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する（Geoghegan & Stroh, Bioconjugate Chem., 3:138-146 (1992)；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基は、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸、及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル、及びアリールヒドラジド基。
別法として、抗体及び細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする各領域を含有する。
さらに別の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用して循環から非結合コンジュゲートを除去し、次いで細胞障害性剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートする「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
本明細書に記載のＡＤＣは、あるいは、架橋剤、例えば市販（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより）のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＫＭＵＳ、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、スルホ-ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル-（４-ビニルスルホン）安息香酸塩）を用いて調製される。Applications Handbook and Catalog, 467-498ページ, 2003-2004を参照。
抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ用意に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１，３-ジオキソラン、ポリ-１，３，６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーかランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ（ｎ-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが接着(attach)する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうかなど、改善される抗体の特定の特性又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
薬剤的製剤
本発明にしたがって使用される抗体の治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書におけるさらなる製剤及び送達方法は、例えば国際公開公報第２００４／０７８１４０号に記載のものを含み、ＥＮＨＡＮＺＥＴＭ薬剤送達技術（Halozyme Inc.）を含む。当該技術は、組換えヒトヒアルロニダーゼ（ｒＨｕＰＨ２０）に基づく。ｒＨｕＰＨ２０は、皮膚などの組織のマトリックスのスペースを一時的に空ける（除去する）、ＦＤＡに認可された天然発生ヒト酵素の組換え形態である。つまり、該酵素は、ヒアルロン酸（ＨＡ）、体全体の組織の主な構成要素である空間充填「ゲル」様物質、を分解する能力を有する。この除去活動により、ｒＨｕＰＨ２０は、皮下スペースへの治療的分子の進入を向上させ薬剤送達を改善できると予想される。よって、特定の注射薬剤と組み合わせまたは共形成されたとき、該技術は、皮下で一時的に流路を開けることによりこれら薬剤の浸透及び分散を容易にする「分子マチェーテ（刀）」として作用する。２００ナノメートルもの大きさの分子が穿孔された細胞外マトリックス（およそ２４時間以内に通常の密度に回復する）を自由に通過でき、皮膚の構成を永久的に変えることはしない薬剤送達プラットフォームができる。
したがって、本発明は、過剰量のグリコサミノグリカンを含有する組織に、本明細書に記載の抗体を送達する方法を含み、当該方法は、直径約５００ナノメートル以下のチャネルを開けるのに十分なグリコサミノグリカンを分解するのに十分な量のヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）（当該タンパク質は中立活性可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチド及び少なくとも一のＮ結合糖成分を含み、ここでＮ結合糖成分はポリペプチドのアスパラギン残基に共有結合している）を組織に投与すること；及び分解されたグルコサミノグリカンを含む組織に当該抗体を投与することを含んでなる。
別の実施態様において、本発明は、被検体に投与される本明細書に記載の抗体の拡散を増大する方法を含み、当該方法は、抗体の直径より小さいチャネルを開ける又は形成するのに十分な量のｓＨＡＳＥＧＰポリペプチドを被検体に投与すること、及び抗体を投与することによって治療的物質の拡散を増大させることを含んでなる。ｓＨＡＳＥＧＰ及び抗体は、別々にか又は一つの製剤中で同時に、及び何れかの順序で連続的にか又は同時に、投与されうる。
抗ＬＴα抗体製剤の例は、国際公開公報第１９９８／５６４１８号に記載されており、２−８℃で保存寿命が最低２年の、４０ｍｇ／ｍＬの抗ＬＴα抗体、２５ｍＭの酢酸塩、１５０ｍＭのトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、０．０２％ポリソルベートを含むｐＨ５．０の液体複数用量（multidose）製剤を含む。対象となる別の抗ＬＴα製剤は、９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム中１０ｍｇ／ｍＬの抗体、７．３５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬのＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ ８０ＴＭ界面活性剤、及び注射用蒸留水、ｐＨ６．５を含んでなる。また別の水性薬剤的製剤は、約ｐＨ４．８から約ｐＨ５．５、好ましくはｐＨ５．５の１０−３０ｍＭの酢酸ナトリウム、界面活性剤として約０．０１−０．１％ｖ／ｖの量のＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥＴＭ、約２−１０％ｗ／ｖの量のトレハロース、及び保存料としてベンジルアルコールを含んでなる（米国特許第６１７１５８６号）。皮下投与用の凍結乾燥製剤は、例えば国際公開公報第１９９７／０４８０１号及び米国特許第６２６７９５８号（Andya等）に記載されている。このような凍結乾燥製剤は、適切な希釈剤を用いて高タンパク質濃度にもどすことができ、もどされた製剤は、ここで治療すべき哺乳類に皮下投与できる。
抗体の結晶化形態もまた考えられる。例えば米国特許公開公報第２００２／０１３６７１９号（Shenoy等）を参照。
本明細書に記載の製剤はまた、治療すべき特定の適応症の必要に応じて、一以上の活性化合物（上述したような第二の医薬）、好適には互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含みうる。例えば、細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、又は免疫抑制剤（例えばＴ細胞に作用するもの、例えばシクロスポリン又はＴ細胞に結合する抗体、例えばＬＦＡ-１に結合するもの）をさらに提供することが望ましい。こういった第二の医薬のタイプ及び有効量は、例えば製剤中に存在する抗体の量、疾病又は疾患又は治療のタイプ、被検体の臨床的指標、及び上述した他の要素に依存する。これらは通常、同一用量、及び本明細書に記載の投与経路で、又は従来から採用されてきた用量の約１から９９％で使用される。このような医薬の好適なものは上述したとおりである。
活性成分もまた、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド薬剤送達システム又はマクロエマルジョンで、ヒドリキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル、及びポリ-（メチルメタアシレート）マイクロカプセルに封入されうる。このような技術は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
持続放出製剤が調製されてもよい。適切な持続放出製剤の例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透明マトリックスを含み、該マトリックスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２-ヒドロキシエチル-メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニル酢酸塩、非分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-（−）-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなくてはならない。これは、除菌ろ過膜を介したろ過によって容易に達成される。
使用
本発明の抗体は、例えばインビトロ、エクスビボ、及びインビボの治療方法で使用されうる。本発明の抗体は、インビボ、エクスビボ、及び／又はインビボで特定のＬＴα活性を部分的又は完全に遮断するためのアンタゴニストとして使用できる。さらに、本発明の少なくともいくつかの抗体は、他の種からの抗原活性を不活性化することができる。したがって、本発明の抗体は、例えば抗原を含む細胞培地における、ヒト被検体における、又は本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類被検体（例えばチンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル、アカゲザル、ブタ、又はマウス）における、特定の抗原活性を阻害するために使用できる。一実施態様で、本発明の抗体は、抗体を、抗原活性が阻害されるように抗原と接触させることによって、抗原活性を阻害するために使用することができる。好ましくは、抗原はヒトタンパク分子である。
一実施態様において、本発明の抗体は、抗原活性が有害である疾患を患っている被検体において抗原を阻害するための方法で使用することができ、当該方法は、本発明の抗体を、被検体の抗原活性が阻害されるように被検体に投与することを含んでなる。好適には抗原は、ヒトタンパク分子であり、被検体はヒト被検体である。あるいは被検体は、本発明の抗体が結合する抗原を発現している哺乳類であってもよい。さらに被検体は、（例えば抗原の投与、又は抗原トランス遺伝子の発現によって）抗体が導入されている哺乳類であってもよい。本発明の抗体は、治療目的でヒト被検体に投与できる。さらに本発明の抗体は、イムノグロブリンが獣医用又はヒト疾病の動物モデルとして交差反応する抗原を発現している非ヒト哺乳類（例えば霊長類、ブタ、又はマウス）に投与することができる。後者の動物モデルは、本発明の抗体の治療有用性を評価（例えば投与の用量及び時間経過を試験）するのに役立ちうる。本発明の抗体は、自己免疫疾病、疾患、又は本明細書で定義した状態を治療する、抑制する、その進行を遅らせる、その再発を防止／遅らせる、改善する、又は防ぐために使用できる。
一態様において、本発明の遮断抗体は、リガンド抗原に特異的であり、リガンド抗原に関与するリガンド-レセプター相互作用を遮断又は阻害することで対応するシグナル経路及び他の分子又は細胞的事象を妨げることによって、抗原活性を阻害する。本発明はまた、必ずしもリガンド結合を妨げないがレセプター活性化を阻害することで、通常であればリガンド結合により引き起こされる何らかの反応を妨げるレセプター特異的抗体を特徴とする。本発明はまた、好適には又は単独でリガンド-レセプター複合体に結合する抗体を網羅する。本発明の抗体はまた、特定の抗原レセプターのアゴニストとして作用可能で、よってリガンド媒介レセプター活性化の全ての又は部分的な活性を強化、増進、又は活性化する。
抗体は、ネイキッド（naked）抗体であってよい、又は別の分子、例えば細胞障害性剤にコンジュゲートされている。抗体は好適には、静脈内又は皮下投与され、より好適には皮下投与される。
一実施態様において、被検体は、疾患の治療のために薬剤、例えば免疫抑制剤によって以前に治療されたことがなく、特定の実施態様では、被検体はＴＮＦアンタゴニストによって以前に治療されたことがない。代替的実施態様において、被検体は、疾患の治療のために、ＴＮＦアンタゴニストを含み薬剤によって以前に治療されたことがある。
またさらなる態様で、患者は疾患が再発している。代替的実施態様において、患者は疾患が再発していない。
別の態様において、本明細書に記載の抗体は、疾患を治療するために被検体に投与される唯一の医薬である。代替的実施態様において、本明細書に記載の抗体は、疾患の治療に使用される複数の医薬の一つである。
さらなる態様において、被検体は、自己免疫疾患としてＲＡのみを患う。あるいは、被検体は、自己免疫疾患としてＭＳのみを患う。さらにあるいは、被検体は、自己免疫疾患として狼瘡、又はＡＮＣＡ関連血管炎、又はシェーグレン症候群のみを患う。全ての場合において、自己免疫疾患は上記で定義したとおりである。
さらなる実施態様において、被検体は、一又は複数の調節性サイトカイン、抗核抗体（ＡＮＡ）、抗リウマチ因子（ＲＦ）抗体、クレアチニン、血中尿素窒素、抗内皮性抗体、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）、浸潤性ＣＤ２０細胞、抗二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体、抗Ｓｍ抗体、抗核リボ核タンパク質抗体、抗リン脂質抗体、抗リボソームＰ抗体、抗Ｒｏ／ＳＳ−Ａ抗体、抗Ｒｏ抗体、抗Ｌａ抗体、シェーグレン関連抗原Ａ又はＢに対する抗体（ＳＳ−Ａ又はＳＳ−Ｂ）、セントロメアプロテインＢ（ＣＥＮＰ Ｂ）又はセントロメアプロテインＣ（ＣＥＮＰ Ｃ）に対する抗体、ＩＣＡ６９に対する自己抗体、抗スミス抗原（Ｓｍ）抗体、抗核リボ核タンパク質抗体、抗リボソームＰ抗体、好中球の核又は核周囲領域を染色する自己抗体（ｐＡＮＣＡ）、抗酵母抗体、ＧＭ１ガングリオシド又はＧＱ１ｂガングリオシドに対する交差反応性抗体、抗アセチルコリンレセプター（ＡｃｈＲ）抗体、抗ＡｃｈＲサブタイプ抗体ないし抗筋特異的チロシンキナーゼ（ＭｕＳＫ）抗体、血清抗内皮細胞抗体、ＩｇＧ又は抗デスモグレイン（Ｄｓｇ）抗体、抗セントロメア抗体、抗トポイソメラーゼ−１（Ｓｃｌ−７０）抗体、抗ＲＮＡポリメラーゼ抗体ないし抗Ｕ３-リボヌクレオタンパク質（Ｕ３-ＲＮＰ）抗体、抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体、抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体、抗ミトコンドリア（ＡＭＡ）ないし抗ミトコンドリアＭ２抗体、抗甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）抗体、抗チログロビン（ＴＧ）抗体又は抗甲状腺刺激性ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）抗体、抗核（ＡＮ）抗体、抗アクチン（ＡＡ）抗体ないし抗平滑筋抗原（ＡＳＭ）抗体、ＩｇＡ抗筋内膜抗体、ＩｇＡ抗組織トランスグルタミナーゼ抗体、ＩｇＡ抗グリアジン抗体ないしＩｇＧ抗グリアジン抗体、抗ＣＹＰ２１Ａ２抗体、抗ＣＹＰ１１Ａ１ないし抗ＣＹＰ１７抗体、抗リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）抗体ないしｍｙｏｓｙｔｉｓ-特異的抗体、抗ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）抗体、抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体、抗ＧＭ１ガングリオシド、抗硫酸塩-３-グリクロニル パラグロボシド（ＳＧＰＧ）抗体ないしＩｇＭ抗グリココンジュゲート抗体、ＩｇＭ抗ガングリオシド抗体、抗甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）抗体、抗チログロビン（ＴＧ）抗体ないし抗甲状腺刺激性ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）抗体、抗ミエリン塩基性タンパク質抗体ないし抗ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体、ＩｇＧのＦｃ部分に対するＩｇＭリウマチ因子抗体、抗第ＶＩＩＩ因子抗体、又はこれらの組み合わせを異常なレベルで有する。
自己免疫疾患（自己免疫関連疾病を含む）の治療の効果又は成果を評価するためのパラメータは、適当な疾病の熟練した医師には周知である。通常、熟練した医師は、特定の疾病の兆候及び症状の軽減を探る。以下は例示的なものである。
一実施態様において、本発明の方法及び組成物は、ＲＡの治療に有用である。ＲＡは、多関節の炎症、軟骨の損失、及び関節破壊と最終的には関節機能の低下を引き起こす骨侵食を特徴とする。また、ＲＡは全身性疾病であるので、肺、眼及び骨髄のような他の組織に影響を持ちうる。
被検体が、ここで好適な適応症であるＲＡを患っている場合、好ましくは、本明細書に記載の抗体は被検体において主要な臨床反応を誘発する。
抗体は、初期ＲＡ（つまり、メトトレキセート（ＭＴＸ）を受けたことがない）の患者において第一選択治療薬として、又は例えばＭＴＸ又はシクロホスファミドとの併用で、使用することができる。あるいは、抗体は、例えばＤＭＡＲＤ及び／又はＴＮＦインヒビター、及び／又はＭＴＸに不応性の患者に対する二次療法として、例えばＭＴＸとの併用で、使用することができる。ＬＴα結合抗体はまた、Ｂ細胞を動員するインテグリン抗体といったＢ細胞動員剤と併用して、より効果的な殺傷のために血流内に投与できる。ＬＴα結合抗体は、関節損傷の予防及び管理、構造損傷の遅延化、ＲＡの炎症に伴う疼痛の軽減、及び中程度から重篤なＲＡの症状及び徴候の低減一般に有用である。ＲＡ患者は、ＲＡの治療に使用される他の薬剤（以下の併用療法を参照）での治療に先立って、その治療後に、又はその治療と併せて、ＬＴα抗体で治療することができる。一実施態様では、ＤＭＡＲＤが過去に失敗したか、及び／又はＭＴＸ単独に対しては不十分な応答であった患者が、本発明のＬＴα結合抗体で治療される。別の実施態様では、このような患者は、ヒト化ＬＴα結合抗体と、シクロホスファミド又はＬＴα結合抗体と、ＭＴＸが投与される。最も好ましくは、本明細書に記載の抗体は、ＲＡの治療のためにＭＴＸとともに投与されるが、高用量のステロイドとともには投与されない。
ＲＡの治療効果を評価する一方法は、American College of Rheumatology（ＡＣＲ）基準に基づくものであり、これはとりわけ圧痛及び腫大した関節の改善の割合の測定に使用される。ＲＡ患者は、無抗体治療（例えば、治療前のベースライン）又はプラセボ治療と比較して例えばＡＣＲ２０（２０パーセントの改善）でスコア付けをすることができる。抗体治療の効果を評価する他の方法は、Ｘ線スコア付け、例えば骨の侵食及び関節腔狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられるＳｈａｒｐ Ｘ線スコアを含む。また、患者は、治療期間中又は治療後の時間期間においてHealth Assessment Questionnaire（ＨＡＱ）スコア、ＡＩＭＳスコア、又はＳＦ-３６に基づいて能力障害の予防又は改善について評価をすることができる。ＡＣＲ２０基準は、圧痛（痛み）関節数と腫大関節数の両方に２０％の改善があり、且つ５つの追加測定のうち少なくとも３つに２０％の改善があることを含みうる。
１．視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）による患者の疼痛評価
２．疾患活動性の患者の全体評価（ＶＡＳ）
３．疾患活動性の医師の全体評価（ＶＡＳ）
４．Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、及び
５．急性反応物質、ＣＲＰ又はＥＳＲ
ＡＣＲ５０及び７０も同様に定義される。好ましくは少なくともＡＣＲ２０のスコア、好ましくは少なくともＡＣＲ３０、より好ましくは少なくともＡＣＲ５０、さらにより好ましくは少なくともＡＣＲ７０、最も好ましくは少なくともＡＣＲ７５より高いスコアに達する用量の本発明のＬＴα結合抗体を患者に投与する。
乾癬性関節炎は独特で明瞭なＸ線像の特徴を有する。乾癬性関節炎の場合、関節侵食及び関節腔狭小化も同様にシャープ（Sharp）スコアにより評価できる。本明細書に開示した抗体は、関節損傷の予防、並びに疾病の兆候及び疾患の症状の軽減に用いることができる。
本発明のさらに別の態様は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びループス腎炎を含むループスの、そのような疾病に罹患している被検体に本発明の治療的有効量の抗体を投与することによる治療方法である。ＳＬＥＤＡＩスコアは疾患活動性の数値的定量化を付与する。ＳＬＥＤＡＩは疾患活動性に相関することが知られている２４の臨床及び治験パラメータの荷重指数であり、０−１０３の数的範囲である。Gescuk及びDavis, Current Opinion in Rheumatology, 14:515-521 (2002)を参照のこと。二本鎖ＤＮＡに対する抗体は、腎性発赤及び他のループスの症状を引き起こすと考えられている。抗体治療を受けている患者を、尿中の血液、尿タンパク、又は血清クレアチニンの有意で再現可能な増加として定義される腎性発赤までの時間についてモニターすることができる。あるいは又は加えて、抗核抗体及び二本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルについて患者をモニターできる。ＳＬＥの治療は高用量のコルチコステロイド及び／又はシクロホスファミド（ＨＤＣＣ）を含む。
脊椎関節症は一群の関節疾患であり、硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎、及びクローン病を含む。治療成果は、確認された患者及び医師の全体的評価測定ツールによって決定しうる。
乾癬の治療には様々な医薬が使用され；治療は疾病の重症度に直接関連して異なる。より軽症型の乾癬に罹患している患者は、典型的には、疾病を処置するために局所ステロイド類、アントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾール、及びタザロテンといった局所治療を行い、中程度及び重度の乾癬に罹患している患者は、全身（メトトレキセート、レチノイド類、シクロスポリン、ＰＵＶＡ及びＵＶＢ）療法を採用することが多い。タールもまた使用される。これらの療法は、安全性の心配、時間のかかる治療計画、及び／又は治療の不便な手順のため、不利である。さらに、いくつかは、高価な設備、及び診療場所に専門のスペースを設ける必要がある。このような全身投薬は、高血圧、脂質異常症、骨髄抑制、肝疾患、腎疾患、及び胃腸障害を含む重篤な副作用を引き起こすことがある。また、光線療法の使用は、皮膚癌の発生率を高めうる。局所療法の使用に伴う不都合及び不快症状に加えて、光線療法及びそういった全身治療はまた、それらの副作用のため、患者への治療を周期的に行ったり止めたりする必要があり、一生涯の被ばく量をモニターする必要がある。
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価（ＰＧＡ）変化、及び乾癬領域及び重症度指数（ＰＡＳＩ）スコア、乾癬症状評価（ＰＳＡ）を含む臨床兆候及び疾患の症状の変化をモニターし、ベースライン症状と比較することによって評価する。患者は、治療の間中定期的に、特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）で測定されうる。
アッセイ
リガンド／レセプター結合の試験を、競合的結合アッセイ、直接的及び間接的サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイのような、いずれかの既知の方法で実行することができる。細胞に基づくアッセイ及び動物モデルを使用することにより、ここで同定されるリガンドとレセプターの相互作用、及びここで言及される病態及び疾病の進行及び病理を理解することができる。
一の方式では、哺乳動物の細胞にここで開示されるリガンド又はレセプターを形質移入し、本発明の抗体の、結合又は活性化を阻害する能力を分析する。適切な細胞に所望の遺伝子を形質移入して、活性をモニタリングすることができる。次いで、このように形質移入した細胞株を使用して、抗体が、細胞のＬＴαβ複合体の発現を変調する能力を試験することができる。
加えて、トランスジェニック動物由来の初代培養物を、細胞に基づくアッセイに使用することができる。トランスジェニック動物から連続的な細胞株を取得する技術は従来技術に周知である。例えば、Smallら、Mol. Cell. Biol., 5:642-648 (1985)を参照されたい。
一の適切な細胞に基づくアッセイでは、対応するレセプターを有するか又は発現する細胞にエピトープリガンド（例えば、ＬＴα）を添加し、（期待の抗体の存在下又は不在下において）抗タグ抗体を用いたＦＡＣＳ染色により結合を分析する。別のアッセイでは、本発明の抗体の、ＬＴαβ複合体を発現する細胞上において同複合体の発現を阻害する能力をアッセイする。例えば、適切な発現細胞株を期待の抗体の存在下又は不在下で培養し、３Ｈ−チミジンの取り込み又は細胞数によってＬＴαβ複合体の発現の調節を測定することができる。
更に、インビトロにおける細胞に基づくアッセイの結果は、インビボ動物モデルを使用して証明することができる。例えば免疫関連疾患に関連してここに同定される抗体の有効性を試験するために、多くの動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作成することができる。
移植片対宿主疾患は、そのために動物モデルが設計された疾病の一例である。移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制された患者又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は宿主抗原を認識してそれに反応する。反応は生命に危険のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度のケースまで多様である。移植片対宿主疾患モデルはＭＨＣ抗原及び少量の移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は、Current Protocols in Immunology, Cologanら編、（John Wiley & Sons, Inc., 1994）, unit4.3.に詳細に記載されている。
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、インビボで組織の破壊を媒介するＴ細胞の能力を試験する手段であり、抗ウイルス免疫におけるそれらの役割を測定するもので、例えば上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.4.に記載されている。本発明の抗体の試験に使用可能な他の移植拒絶モデルは、Tanabe, M.等, Transplantation 58:23 (1994)及びTinubu, S.A.等、J. Immunol. 4330-4338 (1994)により記載されている同種心臓移植片モデルである。
遅発型過敏症の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイを提供する。遅発型過敏反応は、抗原投与後一定の時間が経過するまでピークに達しない炎症により特徴付けられるＴ細胞媒介インビボ免疫反応である。これらの反応はまた組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(ＭＳ)及び実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ、ＭＳ用のモデル)で生じる。適切な例示的モデルは上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.5.に詳細に記載されている。
コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）モデルは、ヒトＲＡに対する多くの免疫学的及び病理学的類似性、局所的に大きな組織適合性への関与、クラスＩＩ限定ヘルパーＴリンパ球活性、及び組織学的病巣により、ヒト関節炎に作用する創薬又は生物製剤の研究に適したモデルと考えられる。ＲＡ患者に見られる特性に類似のこのＣＩＡモデルの特性には、関節辺縁部の軟骨及び骨の侵食（レントゲン写真で見ることができる）、増殖性滑膜炎、並びに、小さな及び中位の大きさの末梢関節の対称な合併症が四肢の骨格に生じるが体幹部の骨格には生じないことが含まれる。Jamiesonら、Invest. Radiol. 20:324-9 (1985)。更に、ＩＬ−１及びＴＮＦ−αは、ＣＩＡ及びＲＡに関与しているように思われる。Joostenら、J. Immunol. 163:5049-5055 (1999)。ＴＮＦ中和抗体、及びこれとは別々にＴＮＦＲ．Ｆｃは、このモデルにおいてＲＡの症状を低減した（Williamsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9784-9788 (1992): Wooleyら、J. Immunol., 151:6602-6607 (1993)）。
ＲＡのこのモデルでは、ウシ関節軟骨からＩＩ型コラーゲンを精製し、マウスの免疫化に使用した（Williamsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2762 (1994)）。組織学により決定される、関節炎の症状には、軟骨及び骨の侵食又は異常だけでなく、紅斑及び／又は四肢の腫れが含まれる。広く使用されるこのモデルは、例えば、Holmdahlら、APMIS, 97:575 (1989), Current Protocols in Immunology、上掲、units 15.5、及びIssekutzら、Immunology, 88:569 (1996)にも記載されている。
喘息モデルについては、抗原誘発性気道反応亢進、肺好酸球増加症及び炎症が卵白アルブミンで動物を感作させ、エアゾールにより送達される同様のタンパク質に動物を暴露することで誘発されることが開示されている。げっ歯類及び非ヒト霊長類等の動物モデルでは、エアゾール抗原への暴露時にヒトのアトピー性喘息に類似した徴候が示された。喘息治療への適性について本発明の抗体を試験するのに適した手順は、Wolyniec等、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 18:777 (1998)に記載されている。
更に、本発明の抗体は、免疫疾患のＳＣＩＤ／ＳＣＩＤマウスモデルにおいて試験することができる。例えば、Schon等、Nat. Med. 3:183 (1997)により記載されているように、当該マウスは乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示す。他の適切なモデルはNickoloff等、Am. J. Path. 146:580 (1995)に記載されているようにして調製されたヒトskin／ＳＣＩＤマウスキメラである。
用量
疾病の予防又は治療のため、本発明の抗体の適切な用量（単独で、又は後述する第２の薬物と組み合わせて使用するときの）は、例えば、治療する疾病の種類、抗体の種類、疾病の重症度及び経過、抗体の投与目的が予防であるか又は治療であるか、治療歴、患者の臨床歴と抗体への応答、並びに主治医の判断に応じて決まる。用量は、毒性と副作用とを最小限に抑えながら、治療に効果を示すものであることが好ましい。
抗体は、一度に、又は一連の治療期間に亘って患者に適切に投与される。疾病の種類及び重症度により、例えば一又は複数回の投与で、或いは連続注入で、患者に投与される最初の抗体の用量の候補は、約１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ）である。一般的に、一日当たりの用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ以上である。複数日に亘って繰り返し投与を行う場合、状態に応じて、疾病の徴候に所望の抑制が見られるまで、治療が維持される。一実施例として、抗体の用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇである。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ又は４００ｍｇ／ｋｇ（或いはこれらのいずれかの組み合わせ）を患者に投与できる。このような用量は、間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に投与してもよい（例えば患者が約２〜２０回、例えば約６回に亘り抗体を投与されるように）。最初の用量を大きくし、その後一又は複数回に亘ってそれよりも小さい用量を投与してもよい。抗体の投与計画の一実施例では、最初の用量を約４〜５００ｍｇ／ｋｇとし、続いて毎週約２〜４００ｍｇ／ｋｇの用量を維持する。しかしながら、他の投与計画も有効でありうる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
自己免疫疾患の治療では、治療的に有効な用量は一般に約５０ｍｇ／ｍ２〜約５０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約５０〜１５００ｍｇ／ｍ２、更に好ましくは約５０〜１０００ｍｇ／ｍ２であろう。一実施態様では、用量は約１２５〜７００ｍｇ／ｍ２である。ＲＡの治療の一実施態様では、ヒト化抗体の用量は、約５０ｍｇ／ｍ２又は１２５ｍｇ／ｍ２（約２００ｍｇ／回に相当）〜約１０００ｍｇ／ｍ２であり、二回に分けて、例えば約２００ｍｇの初回用量を1日目に投与し、２回目に約２００ｍｇの用量を１５日目に投与する。異なる実施態様では、用量は、５０ｍｇ／回、８０ｍｇ／回、１００ｍｇ／回、１２５ｍｇ／回、１５０ｍｇ／回、２００ｍｇ／回、２５０ｍｇ／回、２７５ｍｇ／回、３００ｍｇ／回、３２５ｍｇ／回、３５０ｍｇ／回、３７５ｍｇ／回、４００ｍｇ／回、４２５ｍｇ／回、４５０ｍｇ／回、４７５ｍｇ／回、５００ｍｇ／回、５２５ｍｇ／回、５５０ｍｇ／回、５７５ｍｇ／回、６００ｍｇ／回、７００ｍｇ／回、８００ｍｇ／回、９００ｍｇ／回、１０００ｍｇ／回、又は１５００ｍｇ／回である。
疾病の治療において、本発明のＬＴα結合抗体を、当該疾病の技術を有する医師の決定により慢性的に又は間欠的に患者に投与することができる。
静脈内注入により又は皮下に薬剤を投与された患者は、熱、悪寒、灼熱感、無力症、及び頭痛等の副作用を経験することがある。このような副作用を緩和又は最小化するため、患者にはまず前処置用量で抗体を投与し、次いで治療用量を投与することができる。前処置用量は治療的用量より小さく、より大きな用量に耐えられるように患者の調子を整える。
本発明の抗体は、上述した用量等の様々な要因に応じて、主治医の技術及び判断による頻度で投与することができる。この頻度は、週２回、週３回、週１回、２週間に１回、又は月１回を含む。この方法の好ましい態様では、抗体の投与は多くても隔週約１回とし、更に好ましくは月に約１回とする。
投与経路
本発明の方法に使用される抗体（及び第２の薬物）は、ヒトの患者を含む対象又は患者に対し、医師に知られている方法等の適切な方法に従い、投与が急性であるか又は慢性であるかを含めた多くの要因に応じて投与される。これらの経路には、例えば、非経口投与、例えばボーラス投与又は一定の期間に亘る連続注入としての静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、肺内投与、脳脊髄内投与、関節内注射、滑膜内投与、くも膜下腔内投与、吸入（例えば鼻腔内）が含まれる。加えて、抗体は、パルス注入により、特に抗体の用量を減らしながら、適切に投与される。本発明において好ましい経路は、静脈内投与又は皮下投与であり、最も好ましくは皮下投与である。
一実施態様では、本発明の抗体は、静脈内注入によって投与され、更に好ましくは、注入媒体としての約０．９〜２０％の塩化ナトリウムと共に投与される。
併用療法
本発明のいずれの方法においても、対象又は患者に対し、本発明の抗体と共に、治療が必要な対象の病態を治療することができる別の活性薬剤である第２の薬物（本発明の抗体を第１の薬物とする場合）の有効量を投与することができる。例えば、病態が自己免疫性疾患である場合、第２の薬物は、単独で、又は別の活性な薬剤と共に、自己免疫疾患を治療することができる薬剤である。自己免疫疾患の治療の場合、第２の薬物には、例えば、化学療法剤、免疫抑制剤、リツキシマブやヒト化２Ｈ７のようなＢ細胞表面マーカーに結合するアンタゴニスト（例えば抗体）、ＢＡＦＦアンタゴニスト、ＤＭＡＲＤ、細胞障害性剤、ＣＤ１１ａ又はＣＤ１８抗体を含むＣＤ１１又はＣＤ１８アンタゴニスト等のインテグリンアンタゴニスト、例えばエファリズマブ（ラプティバ（登録商標））、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、例えばＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋ブロッカー、抗菌薬、抗乾癬薬、副腎皮質ステロイド薬、タンパク質同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫化薬、免疫グロブリン、放射性医薬品、抗うつ薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリン、サイトカイン、国際公開第２００５／０２７８４１号に記載のＢ細胞自動抗体分泌を阻止する細胞、例えば国際公開第２００４／０７８１４０号に記載の活性な送達媒体としてのヒアルロニダーゼ糖タンパク質、及びこれらの組み合わせが含まれる。
癌のような増殖性疾病の治療の場合、第２の薬物には、例えば、化学療法剤、ホルモン、細胞障害性剤、及びＨＥＲ−２に対する抗体、ＶＥＧＦに対する抗体、ＴＡＨＯ抗原（例えば米国特許出願公開第２００６／０２５１６６２号）、ＣＤ２０、及びＣＤ２２のようなＢ細胞表面抗原に対する抗体、並びにＥＧＦ／ＥＧＦ−Ｒに対する抗体のようなその他の生物製剤が含まれる。
好ましくは、自己免疫疾患用のそのような第２の薬物は、免疫抑制剤、Ｂ細胞表面マーカーに結合するアンタゴニスト（例えば、ＣＤ２０抗体又はＣＤ２２抗体のような抗体）、ＢＡＦＦアンタゴニスト、ＤＭＡＲＤ、インテグリンアンタゴニスト、ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（活性な送達媒体として）、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、更に好ましくはＴＮＦ（例えばＴＮＦ−α）、ＣＤ１１、又はＣＤ１８アンタゴニスト、或いはこれらの組み合わせである。更に好ましくは、それは、メトトレキサート、ＴＮＦアンタゴニスト、Ｂ細胞表面マーカーに対するアンタゴニスト、或いはＤＭＡＲＤである。
このような第２の薬物の種類は、自己免疫疾患の種類、疾病の重症度、病態、及び患者の年齢、使用される第１薬物の種類と用量等を含む様々な要因に応じて決まる。
本発明の抗体は、第２の薬物と同時に、連続して、又は交互に、或いは他の療法に応答がない場合に、投与することができる。つまり、第２の薬物を組み合わせた投与には、別々の製剤又は単一の製薬的製剤を使用した同時投与（併用）、及びいずれかの順番での連続投与が含まれ、連続投与の場合、両方（又は全て）の薬物が同時にその生物活性を発揮する期間があることが好ましい。これらの第２薬物は全て、互いに又は第１薬物と組み合わせて使用されるので、本明細書で使用する「第２の薬物」という表現は、それぞれ第１の薬物の他に使用される唯一の薬物であることを意味しない。つまり、第２の薬物は１つの薬物である必要はなく、複数のそのような薬剤を含みうる。
本明細書に定めるこれら第２の薬物は、通常、第１の薬物と同じ用量及び同じ投与経路で使用されるか、又は第１薬物の用量の約１〜９９％で使用される。このような第２薬物が多少なりとも使用される場合、それらによって引き起こされる副作用を排除又は低減するために、特に第１の薬物との初回投与に続く後続の投与で、好ましくは第１薬物が存在しない場合より少ない量で使用される。
関節リウマチの治療では、例えば、本発明の抗体と、次の薬剤のいずれか一又は複数とを組み合わせて、患者を治療することができる：インテグリンアンタゴニスト、ＤＭＡＲＤＳ(例えばＭＴＸ)、ＮＳＡＩＤ、ＨＵＭＲＩＡＴＭのようなサイトカイン阻害薬（アダリムマブ；Abbott Laboratories)、ＡＲＡＶＡ(登録商標)(レフルノミド)、ＲＥＭＩＣＡＤＥ(登録商標)(インフリキシマブ；Centocor Inc., Malvern, Pa)、ＥＮＢＲＥＬ(エタネルセプト；Immunex, WA)、副腎皮質ステロイド、又はＣＯＸ-２インヒビター。ＲＡに一般的に使用されるＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロキン、サルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ、アザチオプリン、Ｄ−ペニシルアミン、ゴールド(経口)、ゴールド(筋肉内)、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌性プロテインＡ免疫吸着である。アダリムマブは、ＴＮＦαと結合するヒトモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、ＴＮＦαと結合するキメラモノクローナル抗体である。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に結合されるヒトの７５ｋＤ(ｐ７５)腫瘍壊死因子レセプター(ＴＮＦＲ)の細胞外リガンド結合部分からなる「イムノアドヘシン」融合タンパク質である。ＲＡの一般的な治療については、例えば“Guidelines, Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。特定の実施態様では、ＲＡの患者はメトトレキセート(ＭＴＸ)と併用して本発明のＬＴα抗体で治療される。ＭＴＸの投薬量の例は、約７．５−２５ｍｇ／ｋｇ／週である。ＭＴＸは経口及び皮下的に投与することができる。
強直性脊椎炎、乾癬性関節炎及びクローン病の治療では、患者を、例えばレミケード(Remicade)(登録商標)(インフリキシマブ；Centocor Inc., Malvern, Pa.)、エンブレル(ENBREL)(登録商標)(エタネルセプト；Amgen, CA)と併用して本発明の抗体で治療することができる。
ＳＬＥの治療は、本発明の抗体と高用量コルチコステロイド及び／又はシクロホスファミド(ＨＤＣＣ)との併用を含む。
乾癬の治療では、患者には、局所治療剤、例えば局所ステロイド類、アントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾール、及びタザロテンと併用して、あるいはメトトレキセート、レチノイド類、シクロスポリン、ＰＵＶＡ及びＵＶＢ療法、並びに、エファリズマブ（ラプティバ（登録商標））等を含む抗ＣＤ１１ａ又は抗ＣＤ１８抗体のようなインテグリンアンタゴニストと共に、ＬＴα結合抗体を投与することができる。一実施態様では、乾癬患者はシクロスポリン又はエファリズマブと連続して又は同時に、ＬＴα結合抗体で治療される。
特定の実施態様では、細胞障害性剤とコンジュゲートした本発明の抗体を含むイムノコンジュゲートが患者に投与される。一部の実施態様では、イムノコンジュゲート及び／又はそれが結合する抗原は、細胞によって内部移行し、その結果、結合した標的細胞を死滅させるイムノコンジュゲートの治療効果が増大する。一実施態様では、細胞障害性剤は標的細胞中の核酸を標的とするか、同核酸と相互作用する。このような細胞障害性剤の例には、ここに記載の化学療法剤（例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシン）、放射性同位元素、リボヌクレアーゼ、又はＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の治療に有用な物質を含む製造品が提供される。一態様では、該製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む容器（好ましくは、容器は中に、抗体と薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む）と、（ｂ）患者の疾患の治療に関する指示が書かれたパッケージ挿入物を具備する。
好ましい一実施態様では、本発明の製造品は更に、第２の薬物を収容する容器を備え、この場合抗体が第１の薬物である。この製造品は更に、有効な量の第２の薬物で患者を治療することに関する指示をパッケージ挿入物上に含んでいる。第２の薬物は上述で列挙したもののうちのいずれでもよく、例示的な第２の薬物は、Ｂ細胞表面マーカー（例えばＣＤ２０抗体）に結合するアンタゴニスト、ＢＡＦＦアンタゴニスト、ＭＴＸ及び副腎皮質ステロイドを含む免疫抑制剤、インテグリンアンタゴニスト、ＴＮＦ、ＣＤ１１、又はＣＤ１８アンタゴニスト等のサイトカインアンタゴニスト、又はそれらの組み合わせである。好ましい第２の薬物は、ステロイド、サイトカインアンタゴニスト、及び／又は免疫抑制剤である。
この態様では、容器の上に又は容器に付属品してパッケージ挿入物が存在する。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器はガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成される。容器は、問題の疾患の治療に有効な組成物を保持又は収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈注射用溶液のバッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパを有するバイアルでよい。）組成物中少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が、治療を受けることが望ましい患者又は対象の特定の疾病を治療するために使用されること示すもので、抗体及び提供される他のあらゆる薬物の投与量及び投与間隔を含め、患者に対する組成物の投与に関する特定のガイドを含んでいる。パッケージ挿入物は、そのような治療用製品の使用に関する表示、使用法、用量、投与法、禁忌、及び／又は警告を含む。製造品は更に、薬学的に許容可能な希釈バッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、及び／又はブドウ糖溶液を含む別の容器を備えることができる。製造品は更に、商業的な観点及びユーザーの視点から望ましいその他の物品、例えば他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含むことができる。
本発明の特定の実施態様では、一緒に包装された、本発明の抗体を含む製薬的組成物と、薬学的に許容可能な担体と、当該抗体又は製薬的組成物がＲＡ、ＭＳ、ループス、又はＩＢＤ等の自己免疫疾患を持つ患者の治療用であることを示すラベルとを備える製造品が提供される。
好ましい一実施態様では、本発明の製造品は第２の薬物を収容する容器を更に備える。この場合抗体が第１の薬物であり、本製造品は更に、有効な量の第２の薬物で患者を治療することに関する指示をパッケージ挿入物上に含んでいる。第２の薬物は、上述で列挙したもののうちのいずれでもよく、例示的な第２の薬物は上述に記載のものであり、特にＲＡの治療用として、免疫抑制剤、副腎皮質ステロイド、ＤＭＡＲＤ、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホネート、又はこれらの組み合わせを含み、更に好ましくは、ＤＭＡＲＤ、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、又は免疫抑制剤である。疾病がＲＡである場合、最も好ましくは、第２の薬物は、メトトレキサート又はＤＭＡＲＤである。
別の態様では、本発明は、本発明の抗体を包装するか又は製造する方法であって、抗体又は製薬的組成物と、当該抗体又は製薬的組成物が、ＲＡ、ＭＳ、ループス、又はＩＢＤ等の自己免疫疾患を有する患者の治療用であることを示すラベルとを一つのパッケージに組み合わせることを含む方法を提供する。
宣伝方法
本発明には、本発明の抗体、又はその薬学的に許容可能な組成物の宣伝方法であって、標的とする相手に対し、ＲＡ、ＭＳ、ループス、又はＩＢＤを有する患者又は患者の集団の治療に、本抗体又は本抗体の薬学的組成物の使用を促すことを含む方法も含まれる。
宣伝は、通常、スポンサーが特定されてメッセージがコントロールされる非個人的媒体を通した有料の通信である。本発明の目的のために行われる宣伝には、公報、広告、製品の提供、後援、査定、及び販売促進が含まれる。この用語はまた、多くの対象者に訴えて、本発明の購入、後援、又は承認の好ましいパターンに向かって、説得、通知、促進、動機付け又はそれ以外の方法で行動させるようにつくられた、いずれかの活字媒体に登場するスポンサーによる情報の公示を含む。
本発明の治療方法の宣伝及び促進は、いずれの手段で行ってもよい。これらのメッセージを伝えるために使用される宣伝媒体の例には、テレビ、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネット及び看板が含まれ、電波媒体に登場するメッセージであるコマーシャルも含まれる。宣伝には、食品カートの座部、空港の通路の壁、及びバスの側面上の広告、電話の保留中に流れるメッセージで流れる広告、店舗のＰＡシステムや、目に見えるか耳に聞こえる通信が行われるあらゆる場所、通常は公の場所に現れる広告も含まれる。促進又は宣伝の具体的な手段の例は、テレビ、ラジオ、映画、ウェブキャスト及びウェビナー等のインターネット、同時に複数のユーザーと通信することを意図した双方向性のコンピューターネットワーク、固定の又は電子看板及びその他公の表示、ポスター、雑誌及び新聞のような伝統的又は電子的文献、例えばｅメール、電話、インスタントメッセージ、郵便、宅配便、一括送信メール、キャリアメール（carrier mail）、個人的訪問等によるその他のメディア出口、提示又は個人的接触を含む。
使用される宣伝の種類は、多くの要因、例えば、病院、保険会社、診療所、医師、看護師、及び患者等の標的とする相手の性質、経費検討、並びに薬物の宣伝を規定する関連の法律及び規則に応じて決定される。サービスのやりとり、及び／又はユーザーの人口統計及び所在地のようなその他のデータによって規定されるユーザーの特徴に基づいて、宣伝を個別化又はカスタマイズしてもよい。
後述では、本発明の方法及び組成物の非限定的な実施例について説明する。上述では概要を説明しており、他に様々な実施態様の実行が可能である。本明細書に引用する全ての文献の開示内容は、出典を明記したことにより本明細書に包含される。
実施例１：抗ヒト及び抗マウスのＬＴαモノクローナル抗体とハムスター−マウスキメラの調整
抗ヒトＬＴαモノクローナル抗体である２Ｃ８および３Ｆ１２は、以下の通りに生成した。ＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River Laboratories, Wilmington, DE)を、大腸菌において発現される精製した組み換えヒトＬＴα ５μｇ／用量(Genentech, Inc., South San Francisco, CA; Genentech Lot# 8360-2B；また、Spriggs, "Tumor Necrosis Factor: Basic Principles and Preclinical Studies," Biologic Therapy of Cancer, DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company (1991) Ch. 16, pp. 354-377；Ruddle, Current Opinion in Immunology, 4:327-332 (1992)；Wong et al., "Tumor Necrosis Factor," Human Monocytes, Academic Press (1989), pp. 195-215；Aggarwal et al., Cytokines and Lipocortins in Inflammation and Differentiation, Wiley-Liss, Inc. 1990, pp. 375-384；及びPaul et al., Ann. Rev. Immunol., 6:407-438 (1988)も参照のこと)を含むＤＥＴＯＸＴＭアジュバント(RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MO)を注射することによって、過剰免疫化した。具体的には、１０μｇのＬＴα３を５０μｌのアジュバントと混合して、第１、４、１５、２９、４１、５６及び７１日目にマウス(ＢＡＬＢ／ｃ系統)の後足蹠に皮下注射した。結合ＥＬＩＳＡによって抗ＬＴα3-特異的抗体を検出するために第１５及び５６日目に血清を採取した。
７５日目に動物を屠殺し、脾臓を採取し、確立された手順(Oi and Herzenberg, in Selected Methods in Cellular Immunology, B. Mishel and S. Schiigi, eds., (W.J.Freeman Co., San Francisco, CA, 1980))により、５０％ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)４０００を用いて、３×１０Ｅ７個の細胞を５×１０Ｅ７個のマウスメラノーマ細胞株Ｘ６３−Ａｇ８.６５３と融合させた。融合細胞は、選別のために、ＨＡＴ培地を含む１ウェル当たり２×１０Ｅ５細胞の密度で９６ウェルマイクロタイタープレートに播いた(Littlefield, Science, 145:709 (1964))。１２日後に、上清を回収して、直接ＥＬＩＳＡによって抗体産生を検査した。各々のハイブリドーマ系統から回収される上清を、親和性クロマトグラフィによって精製した(ファルマシア高速タンパク質液体クロマトグラフィ(ＦＰＬＣ)；Pharmacia, Uppsala, Sweden)。次いで、精製された抗体調製物をフィルター滅菌して(０．２-μｍ細孔径；Nalgene, Rochester NY)、リン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)にて４℃で保存した。
抗マウスＬＴαモノクローナル抗体Ｓ５Ｈ３は、以下の通りに生成した。アルメニアハムスターを、組み換えマウスＬＴα２β１(R&D Systems Inc. (1008-LY))にて免疫化した。ハムスターの足蹠に２μｇの抗原を１２回注射することによって免疫化し、さらに２μｇの抗原をＩＰ追加免疫した。ＰＥＧ処置によってリンパ節と脾臓を溶融させた。一次スクリーニングは、ジェネンテックが製造したマウスのＬＴα-６Ｈｉｓ(６つのヒスチジンがＣ末端に付着しているマウスＬＴα)に対する免疫原についてのＥＬＩＳＡによって行った。検出は、ペルオキシダーゼがコンジュゲートしたＡＦＦＩＮＩＰＵＲＥＴＭヤギ抗アルメニアハムスターＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ) (Jackson ImmunoResearch 127-035-160)を用いて行った。二次スクリーニングは、(Ｇ４１８選別の下で)安定してマウスＬＴαβを形質移入したＨＥＫ２９３細胞に対する無関係に(irrelevant)形質移入したＨＥＫ２９３細胞についてのＦＡＣＳによって行った。検出は、Ｒ-フィコエリトリンがコンジュゲートしたＡＦＦＩＮＩＰＵＲＥＴＭ Ｆ(ａｂ')２ヤギ抗アルメニアハムスターＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ) (Jackson ImmunoResearch 127-116-160)を使用して行った。抗体を得たハイブリドーマを、寄託番号ＰＴＡ-７５３８(ハイブリドーママウスリンホトキシンα２β１ ｓ５Ｈ３.２.２)としてＡＴＣＣに寄託した。
これらの実験において生成されるすべての抗マウスＬＴα抗体及び抗ヒトＬＴα抗体は、ＬＴα３の認識について選択した。次いで、(a) ＥＬＩＳＡによってＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ１１に対するＬＴα３の結合のブロックについて、(b) ＬＴα及びＬＴβを安定して形質移入した細胞のＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによってＬＴαβの結合について、そして(c) ＥＬＩＳＡによってＬＴβレセプターとのＬＴαβ相互作用のブロックについてスクリーニングを行った。すべてがＬＴα３およびＬＴαβを結合して、中和したので、抗体３Ｆ１２、２Ｃ８およびＳ５Ｈ３を選択した。
以下に記載のインビボ試験のマウスに使用するために、ハムスター抗マウスＬＴαハイブリドーマをハムスター／マウスキメラとしてクローニングした。ＲＮＥＡＳＹ ＭＩＮＩＴＭキット(Qiagen)と製造業者が示すプロトコールを用いてＳ５Ｈ３ハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを抽出した。Ｑｉａｇｅｎ ＯＮＥ-ＳＴＥＰＴＭキットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインを増幅し、クローニングのための制限酵素部位を付加するように設定した。
このキメラ抗体Ｓ５Ｈ３の軽鎖の構築のために、２つの連続的なクローニング工程を用いた。第一のＲＴ−ＰＣＲの工程では、ｐＲＫベースのベクター内へのクローニングを可能にするプライマーセット１を用いてＣｌａＩ及びＡｓｃＩ部位を付加して、単に配列決定のためにＤＮＡを増幅した。軽鎖可変ドメインのＤＮＡ配列を得た後に、このプラスミドを鋳型としてＰＣＲラウンドを行い、発現ベクターに適するＥｃｏＲＶとＫｐｎＩ部位を付加した。
Ｓ５Ｈ３の重鎖の構築のために、同様に、２つのクローニング工程を用いた。具体的には、ＲＴ-ＰＣＲを用いてｃＤＮＡを増幅し、配列決定のためにベクター内へクローニングするためのＣｌａＩおよびＡｓｃＩ部位を加えた。その後、このプラスミドをＰＣＲの鋳型として用いて、発現ベクターに適するＢｓｉＷＩとＡｐａＩ部位を付加した。
ＲＴ-ＰＣＲのために使用したプライマーは、以下の通りである。
Ｓ５Ｈ３軽鎖セット１：
５'プライマー：GGA TCA TCG ATA CAR CTN GTV YTN CAN CAR TCN CC(配列番号：５６)
３'プライマー：GGT AAC GGC GCG CCG YTC AGA AGA TGG TGG RAA(配列番号：５７)
Ｓ５Ｈ３軽鎖セット２：
５'プライマー：GGA TCC GAT ATC CAG CTG GTA TTG ACC CAA TCT(配列番号：５８)
３'プライマー：GGA TCA GGT ACC GCT GCC AAA AAC ACA CGA CCC(配列番号：５９)
Ｓ５Ｈ３重鎖セット１：
５'プライマー：TGA TAA TCG ATG ARG TNC CAT TTR GTN GAR(配列番号：６０)
３'プライマー：TAG TAA GGC GCG CCT GGT CAG GGA NCC NGA RTT CCA(配列番号：６１)
Ｓ５Ｈ３重鎖セット２：
５'プライマー：TGA TCG CGT ACG CTG AGG TTC AAT TGG TTG AG(配列番号：６２)
３'プライマー：TGA TCG TGG GCC CTT TGT TGT GGC TGA GGA GAC GG(配列番号：６３)
ここで、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、そしてＮ＝Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴの４つすべての核酸。軽鎖可変ドメインの精製したＰＣＲ産物は、マウスκ定常ドメインを含むｐＲＫ哺乳類細胞発現ベクター(ｐＲＫ. ＬＰＧ２.ｍｕκ)内にクローニングした。重鎖のＰＣＲ産物は、マウスのアイソタイプＩｇＧ２ａのマウスＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードするｐＲＫ哺乳類細胞発現ベクター(ｐＲＫ.ＬＰＧ１０.ｍｕＩｇＧ２ａ)内にクローニングした。これらのベクターは２９３細胞におけるＩｇＧの発現のための先に述べたベクターの誘導体である(Shields et al., J. Biol. Chem., 276:6591-6604 (2000)、及びGorman et al., DNA Prot Eng Tech, 2:3-10 (1990))。Ｓ５Ｈ３キメラ抗体発現のために、軽鎖および重鎖のためのプラスミドを、２９３細胞(アデノウイルス形質転換ヒト胚腎臓細胞株(Graham et al., J.Gen. Virol., 36:59-74 (1977))又はＣＨＯ細胞内に過渡的に同時形質移入した。抗体タンパク質は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィによって細胞-培養物上清から精製した。
ＬＴα３結合ＥＬＩＳＡは、以下の通りに行った。マイクロタイターウェルは、１μｇ／ｍｌのＬＴα３を含む５０ｍＭの炭酸塩緩衝液(５０μｌ／ウェル)にて終夜をかけてコートした。非吸着溶液をウェルから吸引した。５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む２００μｌのＰＢＳ(ＰＢＳ-ＢＳＡ)にてウェルの反応を止めた。ＰＢＳ-ＢＳＡにて適切に希釈した５０μｌの試験試料を各ウェルに加え、１時間インキュベートし、０．０５％のＴＷＥＥＮ-２０ＴＭ界面活性剤を含むＰＢＳにて洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼにて標識したヤギ抗マウスＩｇＧを含むＰＢＳ-ＢＳＡバッファ １００μｌを、各ウェルに加え、１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０.０５%ＴＷＥＥＮ-２０ＴＭ界面活性剤にて各ウェルを洗浄し、次いで、０．１ｍｇのｏ-フェニレンジアミン／ｍｌを含むクエン酸-リン酸緩衝液ｐＨ５(基質溶液)と、水溶性３０％Ｈ２Ｏ２を各ウェルに添加した。ウェルを３０分間インキュベートし、次いで、５０μｌの２．５Ｍ 硫酸 Ｈ２ＳＯ４にて反応を止め、４９０ｎｍにて吸光度を読んだ。
ＬＴα３-ブロッキングＥＬＩＳＡ、ＬＴαβ-結合ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳアッセイ、およびＬＴαβ-ブロッキングＥＬＩＳＡを、以下に記述する手順によって行った。
実施例２：抗ＬＴα抗体３Ｆ１２の配列決定、ヒト化および親和性成熟
１．ＬＴＱ−ＦＴＭＳ−ＭＳ／ＭＳ分析及びエドマン分析を用いた抗ＬＴα ３Ｆ１２のデノボ配列決定
ハイブリドーマ細胞株３Ｆ１２.２Ｄ３は凍結細胞株バンクから失われたので、ＰＢＳ中およそ３．０ｍｇ／ｍｌの濃度で配列決定するために、腹水から精製した抗ＬＴαモノクローナル抗体タンパク質である３Ｆ１２.２Ｄ３を提出した。還元条件下で４−２０％のＴＲＩＳＴＭ ＨＣｌ ＳＤＳ-ＰＡＧＥにて抗体(Ａｂ)を分離し、各々分解した重鎖(ＨＣ)及び軽鎖(ＬＣ)をＮ末端配列決定(２５〜３０の残基が配列決定される)に用い、単クローン性を確認した。ＨＣは、Ｎ末端アミノ酸をエドマン配列決定によって決定できなくするピログルタミル基によって反応が止められることがわかった。その後ブロック基(blocking group)をピログルタミン酸アミノペプチダーゼ酵素(ＰＧＡＰ)を用いて除去し、ＨＣを再び配列決定した。ＨＣおよびＬＣは、モノクローナルであることを確認した。次いで、Ａｂを、Analytical Biochemistry, 35:77-86 (2006)において記述される方策に従って、様々な酵素および化学的切断にて処理した。簡単に言えば、これらは、酵素トリプシン、エンドＬｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、およびＣＮＢｒおよび希酸による化学処理(Ａｓｐ／Ｐｒｏ切断)からなる。
化学的切断によって、モデル４９４ＰＲＯＣＩＳＥＴＭシーケンサーにて配列決定して、ジェネンテックのＳＥＱＳＯＲＴプログラムを用いて同定したペプチドの混合物が生成された(ＳＥＱＳＯＲＴは、ピッツバーグスーパーコンピューティングセンターの配列分析セットのプログラムによって出力される結果をより扱いやすくかつ読み込み可能にするように設計されたユーティリティプログラムである)。これらの化学的切断によって、タンパク質配列データベースの抗体との同一性から、ＨＣおよびＬＣの定常領域を同定した。酵素消化から生成されるペプチドは、キャピラリーＲＰ−ＨＰＬＣ分離から回収し、ペプチド質量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を用いて測定した。定常領域と一致しなかった質量を有するペプチドを用いて、ＬＴＱ−ＦＴ質量分析計による液体クロマトグラフィ−エレクトロスプレイイオン化タンデム質量分析(ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ)又はエドマン分解を用いて更なる分析を行った。ＨＣおよびＬＣの可変領域の配列は、様々なタンパク質分解性切断によって得られたオーバーラッピング配列を有するペプチドから入手した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるペプチドの分析のために、マイクロ−キャピラリーＣ１８逆相クロマトグラフィカラム(０．１５×１５０ｍｍ、ｉ.ｄ.、５μｍ、３００Å)を、ＡＧＩＬＥＮＴＴＭ１１００シリーズキャピラリーＬＣシステムにて１μｌ／分の流速を使用して行った。溶剤Ａを用い、２から８０％の溶剤Ｂの勾配を適用した。溶剤Ａは水中０．１％ｖ／ｖ蟻酸からなり、溶剤Ｂはアセトニトリル中０．１％ｖ／ｖ蟻酸からなる。ＬＣはＬＴＱ-ＦＴ質量分析計にてインラインでカップリングし、３５０と１８００の間のｍ／ｚを有するペプチドを、衡突解離(ＣＩＤ)のために選択される各々完全な質量範囲調査スキャンにおいて５つの最も質量の大きい種を有するデータ依存モードで分析した。結果として生じたＣＩＤスペクトルをサーチプログラムＭＡＳＣＯＴにてスクリーニングし、データベース配列と正確に一致することを確認し、新規の可能性がある配列を手動のデノボインタープレテーションにて決定した。完全に配列決定することができなかったペプチド、又は等圧性のアミノ酸対であるロイシン／イソロイシン及びグルタミン／リジンを含むペプチドを、エドマン分解を用いてさらに分析した。
抗ＬＴαのＦａｂ部分は、インタクト抗体のパパイン消化の後にサイズ排除クロマトグラフィを行った得た。鎖間ジスルフィドを還元した後、Ｆａｂの重鎖および軽鎖の構成成分の質量を４重−ＴＯＦ質量分析によって得た。実測質量は、各々０．５Ｄａ内に重鎖および軽鎖の得られた配列に基づいて算出される質量に相当した。
キメラ３Ｆ１２.２Ｄ３の抗ＬＴα軽鎖の配列：
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSTNQKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(配列番号：６４)
キメラ３Ｆ１２.２Ｄ３の定常領域にわたる抗ＬＴα重鎖可変領域の配列：
QGQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEISPGSGSTNYNEEFKGKATFTADKSSNTAYIQLSSLSTSEDSAVYYCADGYHGYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPIST(配列番号：６５)、ここでＮは任意のアミノ酸である。
図１Ｃは、このクローンの軽鎖可変領域、並びに自身の配列決定ではなく、他の抗体との相同性によって埋められた軽鎖定常領域を示す。図１Ｄは、このクローンの重鎖可変領域、並びに他の抗体との相同性によって埋められた重鎖定常領域を示す。
２．キメラ３Ｆ１２の得られたアミノ酸配列をコードするＤＮＡの合成
鋳型として抗ＴＧＦβモノクローナル抗体２Ｇ７の軽鎖の遺伝子(国際公開２００５／９７８３２)を含むｐＲＫベースのプラスミドと、上記のように得たアミノ酸配列とを用いて、数ラウンドのオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を行って、キメラ抗体３Ｆ１２の軽鎖の遺伝子を得た。同様に、モノクローナル抗体２Ｇ７の重鎖を、３Ｆ１２の重鎖の構築のための鋳型とした。軽鎖および重鎖の鋳型は、ヒト定常ドメイン、軽鎖のためのＣκ、および重鎖のためのＩｇＧ１アイソタイプのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。軽鎖及び重鎖のための合成に用いたオリゴヌクレオチドを以下に示す。
３Ｆ１２のキメラ軽鎖の合成のためのオリゴヌクレオチド：
ＣＡ１８４５
GCT CAT AGT GAC CTT TTC TCC AAC AGA CAC AGC CAG AGA TGA TGG CGA CTG TGA CAT CAC GAT ATC TGA ATG TAC TCC(配列番号：６６)
ＣＡ１８４６
GCT GTA AGT CCA GTC AAA GTC TTT TAT ACA GTA CCA ATC AGA AGA ACT TCT TGG CCT GGT ACC AGC(配列番号：６７)
ＣＡ１８４７
GCG ATC AGG GAC ACC AGA TTC CCT AGT GGA TGC CC(配列番号：６８)
ＣＡ１８４８
GCC ACG TCT TCA GCT TTT ACA CTG CTG ATG G(配列番号：６９)
ＣＡ１８４９
GGT CCC CCC TCC GAA CGT GCG CGG GTA GGA GTA GTA TTG CTG ACA GTA ATA AAC TGC CAG GTC(配列番号：７０)
３Ｆ１２のキメラ重鎖の合成のためのオリゴヌクレオチド：
ＣＡ１８５０
GCT GCA GCT GAC CTT CTG AAT GTA CTC C(配列番号：７１)
ＣＡ１８５１
GCC TTG CAG GAG ATC TTC ACT GAA GCC CCA GGC TTC ATC AGC TCA GCT CC(配列番号：７２)
ＣＡ１８５２
CCC ACT CTA TCC AGT AAC TAG AGA AGG TGT ATC CAG TAG CCT TGC AGG
（配列番号：７３）
ＣＡ１８５３
CCA CTT CCA GGA CTA ATC TCT CCA ATC CAC TCA AGG CCA TGT CCA GGC C
（配列番号：７４）
ＣＡ１８５４
GCC CTT GAA CTC CTC ATT GTA ATT AGT ACT ACC ACT TCC AGG(配列番号：７５)
ＣＡ１８５５
CCG CAG AGT CCT CAG ATG TGA TCA GGC TGC TGA GCT GGA TGT AGG CAG TGT TGG AGG ATT TGT CTG CAG TGA ATG TTG CCT TGC C(配列番号：７６)
ＣＡ１８５６
GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA GCC ATG GTA CCC GTC TGC ACA GTA ATA GAC CTC(配列番号：７７)
ＣＡ１８７１
CCA GAC TGC TGC AGC TGA CCT TGT GAA TGT ACT CCA GTT GC(配列番号：７８)
元の３Ｆ１２マウスモノクローナル抗体がＩｇＧ２ｂのアイソタイプを有するので、このアイソタイプの軽鎖及び重鎖のマウス定常ドメインをキメラのヒト定常ドメインに換え、完全なマウス抗体とした。比較のために、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプも構築した。各々の変異体の軽鎖および重鎖のＤＮＡを、一過性発現のためにアデノウイルス形質転換ヒト胚腎臓細胞株である２９３に同時形質移入し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィを用いてタンパク質を調整した培地から精製した。ＥＬＩＳＡ形式のＬＴαへの結合を、腹水から得た元の３Ｆ１２モノクローナル抗体と合成ｍｕＩｇＧ２ａおよびｍｕＩｇＧ２ｂ変異体との間で比較した。
簡単に言うと、ＮＵＮＣ ＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭプレートを、１ｍｌ当たり２μｇのＬＴαを含む５０ｍＭ 炭酸バッファｐＨ９．６にて４℃で終夜をかけてコートし、次いで、０.５% ＢＳＡ、１０ ＰＰＭ ＰＲＯＣＬＩＮＴＭを含むＰＢＳにて室温で１時間かけてブロックした。０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮＴＭ、１０ＰＰＭのＰＲＯＣＬＩＮＴＭを含むＰＢＳにて段階的に希釈した試料を２時間、プレート上でインキュベートした。洗浄後、３,３',５,５'テトラメチルベンジジン(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を基質として用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＦｃ(Jackson ImmunoResearch)にて結合した抗体を検出した。４５０ｎｍの吸光度を読み取った。ＩｇＧ２ａ−およびＩｇＧ２ｂ−クローン化変異体はいずれも、腹水から精製した３Ｆ１２抗体と同様に結合した。これは正しい配列が合成されたことを示す。
３．３Ｆ１２のヒト化
キメラクローンのアミノ酸配列を使用して、軽鎖および重鎖のＣＤＲ残基を同定した(カバット)。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いて、ヒト化抗ＴＧＦβ ２Ｇ７バージョン５(国際公開２００５／９７８３２)の軽鎖及び重鎖のコード配列を含むベクターにこれらのＣＤＲを換えて、３Ｆ１２のＣＤＲｓｗａｐバージョンを得た。このようにして得たフレームワーク配列はそれぞれ、ＶＬκサブグループIおよびＶＨサブグループＩＩＩコンセンサス配列のものである。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号：５１)−Ｌ１−WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号：５５)−Ｌ２−GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号：５３)−Ｌ３−FGQGTKVEIKR(配列番号：５４)、及び、
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号：４６)−Ｈ１−WVRQAPGKGLEWVG(配列番号：４５)−Ｈ２−RATFSADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAD(配列番号：５０)−Ｈ３−WGQGTLVTVSS(配列番号：４９)。
上記のように発現および精製をした後、ＬＴαに対するＣＤＲｓｗａｐの結合を、キメラのものと比較した。ＣＤＲｓｗａｐの結合はほぼ完全に失われた。
ヒト化抗体の結合を元に戻すために、ＣＤＲｓｗａｐのＤＮＡを鋳型として用いて突然変異を行った。コンピュータ生成モデルを使用して、抗体−抗原表面のＣＤＲ高次構造に作用しうる位置にあるヒトフレームワーク残基をマウス相対残基に変わるように、突然変異を設定した。変異体と上記のＥＬＩＳＡによるこれらの相対的な結合を、以下の表１に示す。イソロイシン６９のフェニルアラニンへの変化により得たｖ２は、Ｌｅｕ７８Ａｌａの変化と同様に、結合が有意に増加したのに対して、Ａｓｎ７３Ｌｙｓの変化はＣＤＲｓｗａｐに対して改善がなかった。Ｉｌｅ６９ＰｈｅおよびＬｅｕ７８Ａｌａを組み合わせたバージョン５は、このＥＬＩＳＡアッセイフォーマットにおいて、キメラのおよそ５分の１未満のＬＴαを結合した。
２つの変異体は、ヒトコンセンサスにより近いフレームワーク配列を移動するように作製した。バージョン６は、Ｌｙｓ２４ＡｒｇおよびＳｅｒ２５Ａｌａの変異を有しており、バージョン５と結合が同程度であった。しかしながら、９４位の通常アスパラギン酸をコンセンサスアルギニンに変えてみると(バージョン７)、結合がほぼ完全に消失した。
表１
Figure 2010506568
＊これらの値は元のキメラ(重鎖配列番号：３５と図１Ｂに示す重鎖可変領域を有する)との相対値であって、後に、重鎖のＦＲ３に「余分な」セリン(図３Ｂの配列番号：２９の位置ｃのＬの後のセリン)を有することが発見された。このセリンはキメラ２(図１Ｄの配列番号：３８の重鎖可変領域を有する)を作るために取り出し、ＥＬＩＳＡ結合を上記と同様に行った。
３Ｆ１２キメラを用いた後述のすべての動物実験は、表の脚注に記載のキメラ２ではなく、元のキメラを指す。
４．抗体３Ｆ１２の親和性成熟
ＣＤＲの残基と領域がＬＴαを結合するために最も重要であろうと同定するため、そして親和性成熟のためにファージディスプレイライブラリに加えるための候補剤を同定するために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発のための単鎖鋳型としてｖ５を用いて、部分的なアラニンスキャニングを行った。
表２に示すように、いくつかの残基は、アラニンに変異した場合に、ＬＴαに対する結合が消失又は増加したことが明らかとなった。
表２
Figure 2010506568
＊ＬＴαに対するプレートベースのＥＬＩＳＡにおける、バージョン５のＥＣ５０によって割った変異体のＥＣ５０の比率。数が大きいほど弱い結合を示し、１より大きい数は結合がバージョン５の結合より小さいことを意味する。
したがって、バージョン１４、１５、１７、２０、２１及び１２は、変異によって結合親和性が改善した位置を有し、それぞれの位置での保存的置換(又は、常法の試験によって当業者が測定した場合によっては非保存的置換)によって結合が増加することが期待される。
実施例３：キメラ抗体２Ｃ８およびヒト化の調製
１．キメラ抗体の調製
ＬＴα３とＬＴαβを結合して中和したマウス抗ＬＴα抗体２Ｃ８の重鎖及び軽鎖の可変領域をクローニングして、Ｓ５Ｈ３のクローニングのために、基本的には実施例１に記載のようにマウス／ヒトキメラ抗体として形式を整えた。
ＲＴ-ＰＣＲのために使用したプライマーは、以下の通りである。
２Ｃ８軽鎖：
５'プライマー：GCC ATA GAT ATC GTR ATG CAN CAG TCT C(配列番号：７９)
３'プライマー：TTT KAT YTC CAG CTT GGT ACC(配列番号：８０)
２Ｃ８重鎖：
５'プライマー：GAT CGA CGT ACG CTG AGG TYC AGC TSC AGC TSC AGC AGT CTG G(配列番号：８１)
３'プライマー：ACA GAT GGG CCC TTG GTG GAG GCT GMR GAG ACD GTG ASH RDR GT(配列番号：８２)。
ここで、Ｋ＝Ｇ又はＴ、Ｓ＝Ｃ又はＧ、Ｄ＝Ａ又はＧ又はＴ、Ｍ＝Ａ又はＣ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ、Ｎ＝Ｔ、Ｇ、Ａ又はＣ(４つのいずれかの核酸)、Ｒ＝Ａ又はＧ、及びＹ＝Ｃ又はＴ。
軽鎖の可変ドメインをヒトκ定常ドメインを含むベクターｐＲＫ.ＬＰＧ３.ヒトκににクローニングしたのに対して、重鎖可変ドメインを完全長ヒトＩｇＧ１定常ドメインをコードする発現ベクターｐＲＫ.ＬＰＧ４.ヒトＨＣにクローニングした。これらのベクターは２９３細胞においてＩｇＧを発現するための前述のベクターの誘導体である(Shields et al., J Biol Chem, 276:6591-6604 (2000)、及びGorman et al., DNA Prot Eng Tech, 2:3-10 (1990))。抗体の一過性発現のために、これらのプラスミドを２９３細胞又はＣＨＯ哺乳類細胞株に同時形質移入し、タンパク質を実施例１に記載のように精製した。
このキメラ抗体2Ｃ8を後述する動物実験に用いた。
２．２Ｃ８のヒト化
抗ＬＴα抗体２Ｃ８のヒト化は、一連の部位特異的突然変異誘発工程にて行った。キメラの可変ドメインの配列を使用して、これらドメインのアミノ酸配列を公知の抗体の配列(上掲のKabat等)と比較することによって、軽鎖および重鎖のＣＤＲ残基を同定した。ＣＤＲは、配列超可変性(上掲のKabat等)に基づいて定め、図２に示す。
オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いて２Ｃ８のＣＤＲｓｗａｐを作製した。このＣＤＲ領域は、軽鎖及び重鎖それぞれについて別々のｐＲＫ５ベースのベクターに繋いだ。これらのベクターは、軽鎖ヒトκＩ定常ドメイン、又は重鎖ベクターのための、ヒトＩｇＧ１定常ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含む(Gorman, Current Opinion in Biotechnology, 1, (1), p36-47 (1990))。
他のヒト化抗体との比較によって、２Ｃ８の軽鎖がヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５の軽鎖と非常に類似しているのに対して(米国特許第５８２１３３７号)、２Ｃ８の重鎖が抗ＴＧＦ-β２Ｇ７(国際公開２００５／９７８３２)に配列が類似していることが示された。したがって、ｒｈｕＭＡｂ ４Ｄ５の軽鎖を含むベクターを、２Ｃ８の軽鎖の構築のための鋳型として用いた。表３に示される軽鎖配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、このベクターから得られるデオキシウリジン含有の鋳型に対して部位特異的突然変異を行った。さらに、オリゴヌクレオチドＣＡ１７３０を用いてフレームワーク３配列をヒトκＩコンセンサスの配列に戻した。
表３ ２Ｃ８(軽鎖)のためのオリゴヌクレオチド
Figure 2010506568
(すべてのオリゴヌクレオチドはコード鎖に対して逆相補鎖として並べた。したがって、ｐＲＫベクターのｆ１ｏｒｉはｐＢＲベースのベクターのものから逆定位である)
重鎖については、デオキシウリジン含有鋳型を、表４に示すオリゴヌクレオチドを用いて、ヒト化抗体２Ｇ７(国際公開２００５／９７８３２)の重鎖を含むベクターから得た。フレームワークは、オリゴヌクレオチドＫＭ５５、ＫＭ５６およびＫＭ６１を用いてコンセンサスに変換した。
表４ ２Ｃ８のオリゴヌクレオチド(重鎖)
Figure 2010506568
ＣＤＲｓｗａｐを含む軽鎖および重鎖である、上記のように生成したｖ１０を、アデノウイルス形質転換ヒト胚腎臓細胞株である２９３に同時形質移入した(上掲のGraham et al.)。抗体は、プロテインＡ-ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ-４ＢＴＭ樹脂を用いて培養物上清から精製し、その後バッファを１０ｍＭの琥珀酸ナトリウム、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に交換し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ-１０ＴＭ濃縮器(Amicon)を使用して濃縮した。
ヒトＬＴαに対するＣＤＲｓｗａｐ及びその後の２Ｃ８変異体の相対的な結合親和性を測定するために、上記のようにプレートベースのＥＬＩＳＡを用いた。
表５に示すように、ＣＤＲｓｗａｐであるｖ１０はＬＴα ＥＬＩＳＡにおいて結合を示さない。バージョン２および続くバージョンは、この結合を回復するように構築した。バージョン２はキメラと同程度の結合を回復したが、７つの非コンセンサス残基を含む。更なる変異体を試験して、キメラと比較して結合を維持しているか又は結合が改善していながら、できるだけコンセンサスに近いフレームワークを得た。バージョン１２は(ＥＬＩＳＡによると)キメラと同程度の結合を有するか、又は(ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ分析によると)キメラよりもわずかに良好な結合を有し、非コンセンサス残基を５つのみ保持する。バージョン７および１２の軽鎖および重鎖の配列を図２Ｃに示す。
表５
Figure 2010506568
３．２Ｃ８の親和性成熟
ＬＴαに対して改善した親和性を有するヒト化２Ｃ８モノクローナル抗体を、ファージにディスプレイされた一価性Ｆａｂのライブラリから選択した。ヒト化２Ｃ８.ｖ２ Ｆａｂをディスプレイし、ＣＤＲ-Ｌ３に停止コドンを含む鋳型を生成した。オリゴヌクレオチド(表６に列挙する)は、特定のＣＤＲ-Ｌ３及びＣＤＲ-Ｈ３残基をソフトランダム化するように設定した。
表６ ２Ｃ８ ＣＤＲ-Ｌ３およびＣＤＲ-Ｈ３の親和性成熟のためのソフトランダム化オリゴヌクレオチド
Figure 2010506568
１ソフトランダム化コード(Ａ＝５、Ｇ＝６、Ｃ＝７およびＴ＝８)：それぞれの変性塩基は、７０％が野生型で、残りの３つのヌクレオチドが１０％の等モル量で加わる。
ＬＴαについて３ラウンドの分類を行い、抗原に対して２ｎＭ未満の結合を有する高親和性Ｆａｂ分子を選択的に捕獲した。第１ラウンドでは、２μｇ／ｍｌのプレートコートＬＴαに対して室温で２時間かけてファージを捕獲した。第２及びだ３ラウンドの選別は、室温で、２ｎＭ ビオチン化ＬＴαを含む溶液相にて３０分間、その後ニュートラビジンコートプレート上でファージを捕獲することによって行った。最も高い親和性クローンは、競合的ＥＬＩＳＡを使用して同定した。一定濃度のファージクローン(固相ＬＴα結合ＯＤによって規準化されたもの)を、漸増濃度のＬＴα(０−５０ｎＭ)を含む溶液中でインキュベートし、２μｇ／ｍｌのＬＴαにてコートしたプレート上で捕獲した。１クローンは、ＬＴαとの競合において野生型2C8.v2よりも１０倍の改善を示した。このファジミドクローンのＤＮＡ塩基配列決定により、ＣＤＲ-Ｌ３の野生型２Ｃ８配列から、２つのアミノ酸が変化していることが明らかとなった。８９位のグルタミンがグルタミン酸に変化し、９０位のヒスチジンがセリンに変化していた。野生型２Ｃ８.ｖ７軽鎖上の部位特異的突然変異によってこれら２つのＣＤＲ-Ｌ３の変異が起こった。ｖ７軽鎖が２Ｃ８.ｖ１２重鎖を有する２９３細胞に形質移入されて２Ｃ８.ｖ１６となると、結果として生じた抗体は、２Ｃ８.ｖ２と比較するとＬＴαに対するＩｇＧ結合が２倍改善したことが、ＥＬＩＳＡによって示された(表５)。
安定性を上げるために、アスパラギン酸異性化部位となりうる部位を取り除いて、重鎖ＣＤＲ２のａｓｐ５３をアラニンに変えた。結果として生じた２Ｃ８変異体であるｖＸは、ＥＬＩＳＡによるＬＴαへの結合において、２Ｃ８.ｖ２および２Ｃ８.キメラと比較して、それぞれ３．５倍および３倍の改善があった(表５)。
下記の表７は、ＣＤＲ-Ｌ３領域の残基変化がＬＴαを結合する能力に関してどのように分類されるかをＥＬＩＳＡ分析によって示す。
表７ ファージディスプレイによる２Ｃ８の親和性成熟：ファジミドＣＤＲ-Ｌ３領域の配列変化はｒｈＬＴαに競争する能力によって分類した
Figure 2010506568
１ランダム化された残基を太字及びイタリック体で示す。
２すべてのファジミドは野生型ＣＤＲ-Ｈ３配列を有した。
３クローンＥ２は、競合ＥＬＩＳＡにおけるファジミド規準化に必要なｒｈＬＴα直接ＥＬＩＳＡ結合閾値(ＯＤ＝１)に合わなかった。
この表から、最も良好なクローンはＡ８、Ｇ７およびＨ６であり、これらすべてが野生型クローンより高い親和性でｒｈＬＴαを結合したことが読み取れる。
実施例４：抗ＬＴα抗体は抗体誘導性関節炎(ＡＩＡ)を阻害する
ＡＩＡは、抗原(ウシコラーゲンタイプＩＩ)を注入する代わりに、タイプＩＩコラーゲンを認識する抗体が注入されるという点において、後述のコラーゲン誘導性関節炎(ＣＩＡ)と異なる。このような方法で、適応性ＢおよびＴ細胞応答を回避して、Ｆｃレセプターおよび補体媒介性の活性化によりマクロファージおよび好中球にエフェクター機能を直接誘導する。
ＡＲＴＨＲＯＧＥＮ-ＣＩＡＴＭマウスＢ−ハイブリドーマ細胞株によって生成される４つの異なるモノクローナル抗体の組合せをｉ.ｖ.注射することによって、ＡＩＡをマウスに誘導した。３つのモノクローナル抗体は、ＣＢ１１のＬｙＣ２(タイプＩＩコラーゲンの最も小さい関節炎誘発性の断片)である、８４アミノ酸残基断片内にクラスター化される自己抗原エピトープを認識し、４つ目のモノクローナル抗体はＬｙＣ１と反応する。４つすべての抗体は、様々な種のタイプＩＩコラーゲンに共通である保存されたエピトープを認識し、相同な及び異種性のタイプＩＩコラーゲンと交差反応する。
すべての群(ｎ＝５／群)に、０日目に２ｍｇのモノクローナル抗体混合物を含む１００μｌのＰＢＳを静注し、その後３日目に２５μｇのＬＰＳを含む５０μｌのＰＢＳを腹腔内投与した。動物は、１日目(予防的)又は４日目(治療的)に、１０ｍｇ／ｋｇのコントロールアイソタイプ(抗ブタクサ)、ハムスターマウスキメラＬＴα抗体Ｓ5Ｈ3(抗ヒトＬＴα抗体の代わりに)、抗ＬＴ.Ｆｃ変異体(後述するようにＦｃ領域にＤＡＮＡ突然変異を有する抗ＬＴα抗体)、又はＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃ(ＴＮＦＲ.Ｉｇイムノアドヘシン)を腹膜内又は皮下に投与することによって処置した。足の腫脹は１４日間モニターした。各足に０−４のスコアをつけた。１動物につき最大で合計１６となる。
この実施例及び以降の実施例において用いる抗ＬＴ.Ｆｃ変異体のＤＡＮＡ突然変異は、マウス又はヒトのＩｇＧのＦｃ領域にある２つの単一位置変異を指す。これらの変異は、２６５位のＤ(アスパラギン酸)がＡ(アラニン)に、２９７位のＮ(アスパラギン)がＡ(アラニン)になる。ＤＡＮＡ変異体は、ＰＣＲベースの部位特異的突然変異方法(ＧＥＮＥ ＴＡＩＬＯＲＴＭ, Invitrogen Corp.)によって、マウス又はヒトのＩｇＧの２６５位と２９７位にアラニン残基を導入して構築した。
図４Ａは、導入後の日数に対する、上記の各々の群の予防的処置についての平均的臨床スコアを示す。ＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃおよび抗ＬＴ.Ｆｃ変異体分子を含むすべての治療群のこのモデルにおいて、Ｓ５Ｈ３抗体が最も有効であったことが読み取れる。ゆえに、抗体Ｓ５Ｈ３は、この抗体誘導性のモデルにおいて関節炎の発達を有意に阻害した。Ｆｃ ＤＡＮＡ変異を有する抗ＬＴα(抗ＬＴ.Ｆｃ変異体)は有効でなかったことから、ＬＴα発現細胞のＦｃ媒介性殺傷は有効性に必要であったことが示される(図４Ａ)。
図４Ｂは、導入後の日数に対する、上記の各々の群の治療的処置についての平均的臨床スコアを示す。結果から、Ｓ５Ｈ３抗体は、試験した他の分子に対して、治療的に投与した場合、この抗体誘導性モデルにおいて関節炎の発達を有意に阻害したことが示唆される。
結論として、ハムスター−マウスキメラＳ５Ｈ３で治療した動物は、Ｓ５Ｈ３.ＤＡＮＡ又はコントロールによって治療した動物と比較して、臨床スコアを有意に下げた。Ｓ５Ｈ３は、この動物モデルにおいて予防的及び治療的な有効性を示した。
実施例５：抗ＬＴαはコラーゲン誘導性関節炎(ＣＩＡ)を阻害する
ＲＡにおいて、複数の関節の滑膜は炎症を起こし得、骨および軟骨を含む関節組織の破壊が生じうる。ＲＡの関節滑膜は本来非常に炎症性が高く、一般的にリンパ球および単核細胞の浸潤、Ｔ細胞および抗原提示性細胞(ＡＰＣ)活性化、Ｂ細胞免疫グロブリン(Ｉｇ)分泌、及び炎症誘発性サイトカイン産生に特徴がある(Potocnik et al., Scand. J. Immunol., 31:213 (1990)；Wernick et al., Arthritis Rheum., 28:742 (1985)；Ridley et al., Br. J. Rheumatology, 29:84 (1990)；Thomas et al., J. Immunol., 152:2613 (1994)；及びThomas et al., J. Immunol., 156:3074 (1996))。慢性的に炎症を起こした関節滑膜は通常広範囲に及ぶＣＤ４ Ｔ-細胞浸潤が伴う(Pitzalis et al., Eur. J. Immunol., 18:1397 (1988)、及びMorimoto et al., Am. J. Med., 84:817 (1988))。
コラーゲン誘導性関節炎(ＣＩＡ)は、ヒトの疾患に似ているヒトＲＡの動物モデルであって、異種性のタイプＩＩコラーゲン(ＣＩＩ)による免疫化によってマウスの感受性系統において誘導されうる(Courtenay et al., Nature, 283:665 (1980)、及びCathcart et al., Lab. Invest., 54:26 (1986))。ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＩＩに対する抗体は、ＣＩＡを発達させるために必要である。ナイーブな動物に抗ＣＩＩを移入するだけで、ＣＩＡとは非常に異なる部分的な組織病理が生じ、ＣＩＡの完全な症状は発症しない(Holmdahl et al., Agents Action, 19:295 (1986))。対照的に、ＣＩＩ-免疫マウスからナイーブなレシピエントへＣＤ４ Ｔ細胞および抗ＣＩＩ抗体を養子移入すると、典型的なＣＩＡの症状が完全に再構成される(Seki et al., J. Immunol., 148:3093 (1992))。また、ＣＩＡのＴ細胞および抗体の併発は、ＣＩＡの炎症を起こした関節の組織病理調査結果と一致している。ゆえに、Ｂ細胞又はＴ細胞の機能をブロックする薬剤、又はＴ細胞によって誘導される炎症誘発性サイトカインを阻害する薬剤は、関節炎を予防又は治療するために効果的であるかもしれない。実際、ＣＤ４ Ｔ細胞の枯渇、ＣＤ４０-ＣＤ４０Ｌ相互作用の遮断、ＴＮＦαの無効化、又はＩＬ-１レセプターの遮断がマウスのＣＩＡの防止につながりうる(Maini et al., Immunol. Rev., 144:195 (1995)；Joosten et al., Arthritis Rheum., 39:797 (1996)；及びDurie et al., Science, 261:1328 (1993))。
本明細書において用いられるＣＩＡモデルにおいて、ＤＢＡ−１Ｊマウスを、０日目及び２１日目に、１００μｇのウシコラーゲンタイプＩＩを含む１００μｌの完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ)を皮内に投与することによって免疫化した。免疫後２４日目に、マウスを治療群にランダムに分けた。６ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサＩｇＧ２ａモノクローナル抗体(コントロール抗体) １００μｌ、又は４ｍｇ／ｋｇのハムスター−マウスキメラ抗ＬＴα抗体(Ｓ５Ｈ３)、抗ＬＴα.Ｆｃ変異体又はマウスＴＮＦＲＩＩ-Ｉｇを含む１００ ＰＢＳのいずれかを動物に皮下投与した。動物は、試験の間に週３回治療した。動物の四肢は、各関節について最大１６スコアとなる１〜４の評価システムを用いて関節浸潤の徴候について毎日調べた。
ＣＩＡ予防モデルでは、ハムスター−マウス抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３およびＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃの使用により、７０日間にわたって、抗Ｓ５Ｈ３.ＤＡＮＡ Ｆｃ変異体およびアイソタイプコントロール(抗ブタクサＩｇＧ２ａモノクローナル抗体)に対比して、平均臨床スコアが低減した。ＴＮＦＲ.Ｉｇを有する抗体Ｓ５Ｈ３のＣＩＡ予防マウスモデルにおける比較有効性を示す、図５Aを参照のこと。
図５Ｂは、この治療ＣＩＡマウスモデルにおける、９０日間にわたる、ＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃを有するハムスター−マウスキメラ抗ＬＴα抗体(Ｓ５Ｈ３)の比較有効性を示す。この図から、平均臨床スコアを低減するにあたり、アイソタイプコントロールよりはるかに良好な有効性があることが示される。図５Ａの結果とこれらの結果を併せると、本明細書中の抗体は予防に有用であり、ＲＡなどの自己免疫性疾患において効果的であると思われることが示唆される。本明細書中の抗ＬＴα抗体は、ＴＮＦＲ.Ｉｇ及び抗ＴＮＦα抗体を含め、一般にＴＮＦ治療に反応しない個体のＲＡを予防及び治療する際に有効であり、このような反応しない個体がこれらの抗体によって予防的かつ効果的に治療されることが期待される。
実施例６：抗ＬＴαはＭＢＰ−ＴＣＲトランスジェニックマウスにおける脳脊髄炎(ＥＡＥ)疾患の発症及び重症度を遅らせる
実験的自己免疫性／アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)は、ＭＳに類似する中枢神経系の炎症性症状である。両疾患において、循環白血球が血液−脳関門および損傷ミエリンを透過し、障害性の神経伝達および麻痺が生じる。ＥＡＥマウスモデル(トランスジェニックマウス予防モデル)は、ヒトのＭＳモデルとして記述されている(Grewal et al., Science, 273:1864-1867 (1996))。
ＭＢＰＡｃ１-１１Ｔ細胞レセプタートランスジェニックマウス(Dr. Richard Flavell, Howard Hughes Medical Institute, Yale Universityから入手したつがいの個体から繁殖させた、１０〜１５週齢の雄及び雌の成体ＭＢＰ-ＴＣＲトランスジェニックマウス)に、１０μｇのＭＢＰＡｃ１-１１を含む１００μｌのＣＦＡを皮下投与して免疫化した。１日目及び２日目に、すべてのマウスにさらに、２００ｎｇ／１００μｌ／マウスの百日咳菌毒素を腹腔内投与した。０日目に、マウス(ｎ＝１０／群)に、６ｍｇ／ｋｇの抗ｇｐ１２０ ＩｇＧ１モノクローナル抗体(コントロール抗体)又はハムスター−マウスキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３のいずれかを含む１００μｌを腹腔内投与した後、６ｍｇ／ｋｇを含む１００μｌのＰＢＳを週に３回皮下投与した。
動物は、以下の評価システムを用いて臨床徴候について毎日評価した。０−正常マウス：疾患の明確な徴候なし。１−肢−尾部又は後肢部の脆弱、両方ではない。２−肢-尾部および後肢部の脆弱。３−部分的な後肢麻痺；４−完全な後肢麻痺；５−瀕死。
結果を図６に示す。疾患スコアは、コントロール群よりも抗ＬＴα処置マウス群で低く、試験の間、臨床スコアは３に達した(コントロールでは４以上の臨床スコア)。結果から、抗体Ｓ５Ｈ３は、これらトランスジェニックマウスにおけるＥＡＥ疾患の発症と重症度を遅延させたことを示したことから、抗体処置により明確なＥＡＥの発達からマウスを予防したことが示唆された。
実施例７：抗ＬＴα抗体治療はＴ細胞依存性抗体アイソタイプ応答に影響せず、安全性を示す
トリニトロフェノール(ＴＮＰ)−ＦＩＣＯＬＬＴＭ静注に対する免疫応答は、ほとんどのマウス系統において非常に高く、マウスにおいて様々なアイソタイプレベルを測定することによって、マウスに投与した抗体の相対的な安全性をアッセイすることが可能となる。
０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス(ｎ＝１２／群)に、６ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサアイソタイプコントロール、ハムスター−マウス抗ＬＴα抗体(Ｓ５Ｈ３)、抗ＬＴ.Ｆｃ変異体、又はＣＴＬＡ４-Ｆｃ(ポジティブコントロール)のいずれかを含む１００μｌのＰＢＳを腹腔内投与した。治療は週３回、５週間続けた。１日目に、１マウス当たりＴＮＰ−ＯＶＡ(１００μｇ)を含む２ｍｇのミョウバンを腹腔内投与し、２９日目に１マウス当たりＴＮＰ−ＯＶＡ(５０μｇ)を腹腔内投与してマウスを免疫化した。０、１４及び３５日目に、標準ＥＬＩＳＡによって抗ＴＮＰ ＩｇアイソタイプＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの測定のために血清を採取した。
データを抗ＴＮＰ ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａそれぞれをＬｏｇ１０力価として表した図７Ａ−７Ｃに示す結果から、アイソタイプコントロール、Ｓ５Ｈ３抗体、およびＤＡＮＡ Ｆｃ変異体抗体が各アイソタイプレベルについて類似のパターンを表したのに対して、ＣＴＬＡ４.Ｆｃイムノアドヘシンは異なる作用を示したことがわかる。これは、本明細書中のＳ５Ｈ３抗体の投与に対する患者の免疫応答が、あるとしても極わずかであることを示唆する。
実施例８：抗ＬＴα抗体治療はＴ細胞非依存性抗体アイソタイプ応答に影響せず、安全性を示す
０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス(ｎ＝１０／群)に、６ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサ(ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール)、ハムスター−マウス抗ＬＴα抗体(Ｓ5Ｈ3)、又はTNFRII.Fcのいずれかを含む１００μｌのＰＢＳを腹腔内投与した。治療は週３回、１０日間続けた。ＴＮＰ-ＦＩＣＯＬＬＴＭ(１００μｇ)を含む１００μｌのＰＢＳをマウスの腹腔内似投与して免疫化した。０及び１０日目に、標準ＥＬＩＳＡによって抗ＴＮＰ ＩｇアイソタイプＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３の測定のために血清を採取した。
データをＬｏｇ１０力価として表した図８から、アイソタイプコントロール、Ｓ２Ｃ８抗体、およびＴＮＦＲＩＩ.ＦｃイムノアドヘシンのすべてがＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３アイソタイプについて同様に作用したことがわかる。これにより、生体内投与のための本明細書に記載の抗体の安全性がさらに示される。
実施例９：抗ＬＴα抗体はヒトＳＣＩＤ移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)を予防する
免疫適格性細胞を免疫を抑制した患者又は認容性患者に移植した場合、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)が生じる。ドナーＴ細胞は、宿主抗原を認識して、活性化され、サイトカインを分泌して、増殖し、エフェクター細胞に分化する。この応答は移植片対宿主反応(ＧＶＨＲ)として知られている。ＧＶＨＲ応答は多臓器症候群であり、生命を脅かすほどの重症な炎症から下痢や体重損失の軽度な症例までこの影響は様々となりうる。マウスのＧＶＨＤモデルは、骨髄移植及び自己免疫性疾患後に生じる急性及び慢性のＧＶＨＲの臨床疾患モデルとして用いられている。一般的な手順は、上掲のImmunology, unit 4.3のCurrent Protocolsに記載されている。
ＳＣＩＤマウスは、ＦＩＣＯＬＬＴＭ多糖勾配によって正常なドナーのＬＥＵＫＯＰＡＣＫＴＭ(Interstate Blood Bank, Memphis, TNなどの血液バンクより入手可能)から精製したヒトＰＢＭＣにより再構成した。すべてのマウス(ｎ＝１０／群)に、セシウム１３７源を使用して３５０ラドによって致死未満の照射を与えた。照射の２時間後に、１マウス当たり５０００００００個のヒトＰＢＭＣを含む２００μｌのＰＢＳをマウスに静注した。細胞注入の直後に、３００μｇのトラスツズマブ(ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体)、抗ＬＴαキメラ抗体２Ｃ８、又はＣＴＬＡ４-Ｆｃのいずれかを含む１００μｌの生理食塩水を、週に２回、３週間、マウスの腹腔内に投与した。ＰＯＬＹＭＹＸＩＮＴＭ Ｂ(１１０ｍｇ／リットル)およびＮＥＯＭＹＣＩＮＴＭ(１．１ｇ／リットル)の抗生物質を、照射後５日間、飲料水に加えた。ＧＶＨＤについてマウスをモニターし、生存によって示した。
結果を図９に示す。この結果から、アイソタイプコントロールと比較すると、２Ｃ８抗体は、抗ＬＴα ２Ｃ８ Ｆｃ変異体及びアイソタイプコントロールと比較して、ヒトＳＣＩＤマウス(ＧＶＨＤを予防する)の生存を有意に増やし、結果としてＣＴＬＡ４.Ｆｃイムノアドヘシンが試験した分子の中でこのモデルにおいて最も良好であったことが示された。ゆえに、本明細書中の抗ＬＴα抗体は、移植片対宿主病の予防および／または治療において有用であると思われる。さらに、この結果から、２Ｃ８ Ｆｃ変異体(ＤＡＮＡ)は有効性を示さなかったので、ＬＴα-ポジティブ細胞の枯渇はこのモデルにおける有効性に必要であることが示唆される。
実施例１０：抗ＬＴαモノクローナル抗体はＬＴα３に結合する
マイクロタイターウェルを、１μｇ／ｍｌのヒトＬＴα３を含む５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液(１００μｌ／ウェル)にて終夜をかけてコートした。吸着されていない溶液をウェルから別の容器に移した。５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する１５０μｌのＰＢＳ(ＰＢＳ−ＢＳＡ)にて１〜２時間かけてウェルをブロックした。ＰＢＳ−ＢＳＡに希釈した適切に希釈された試験試料(抗ＬＴαキメラ抗体２Ｃ８又は３Ｆ１２)の１００μｌを各ウェルに加え、１時間インキュベートして、０．０５％ＴＷＥＥＮＴＭ-２０界面活性剤を含むＰＢＳにて洗浄した。次いで、ビオチン標識ラット抗マウスＩｇＧを含むＰＢＳ−ＢＳＡバッファの１００μｌを各ウェルに加え、１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ／０.０５％ＴＷＥＥＮＴＭ-２０界面活性剤にてプレートを洗浄し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＳＡ−ＨＲＰ)を各ウェルに加えて３０分間置いた。ＰＢＳ／０.０５％ＴＷＥＥＮＴＭ-２０界面活性剤にて各ウェルを洗浄し、結合したＨＲＰを、テトラメチルベンジジンの溶液(ＴＭＢ)／Ｈ２０２にて測定した。１５分後に、１００μｌの１Ｍ リン酸を加えて反応を止めた。６５０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
図１０Ａは、ヒトＬＴα３に結合したキメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８および３Ｆ１２を示す。
ヒトＬＴα３の代わりにマウスＬＴα３を、そしてハムスター−マウスキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３および抗ＬＴ.Ｆｃ変異体を、結合能について試験する抗体として使用して、上記手順を繰り返した。図１０Ｂは、Ｓ５Ｈ３および抗ＬＴα.Ｆｃ変異体がマウスＬＴα３に結合したことを示す。
実施例１１：抗ＬＴα抗体はＬＴα１β２に結合する
ＬＴαβ ＥＬＩＳＡのために、マイクロタイターウェルを、１μｇ／ｍｌのマウスＬＴα１β２を含む５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液(１００μｌ／ウェル)にて終夜をかけてコートした。吸着されていない溶液をウェルから別の容器に移した。５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する１５０μｌのＰＢＳ(ＰＢＳ−ＢＳＡ)にて１〜２時間かけてウェルをブロックした。適切に希釈された試験試料(ＰＢＳ−ＢＳＡに希釈した抗ＬＴαキメラ抗体Ｓ５Ｈ３又は抗ＬＴα.Ｆｃ変異体)の１００μｌを各ウェルに加え、１時間インキュベートして、０．０５％ＴＷＥＥＮＴＭ-２０界面活性剤を含むＰＢＳにて洗浄した。次いで、ビオチン標識ラット抗マウスＩｇＧを含むＰＢＳ−ＢＳＡバッファの１００μｌを各ウェルに加え、１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ／０.０５％ＴＷＥＥＮＴＭ-２０界面活性剤にてプレートを洗浄し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＳＡ−ＨＲＰ)を各ウェルに加えて３０分間置いた。ＰＢＳ／０.０５％ＴＷＥＥＮＴＭ-２０界面活性剤にて各ウェルを洗浄し、結合したＨＲＰを、テトラメチルベンジジンの溶液(ＴＭＢ)／Ｈ２０２にて測定した。１５分後に、１００μｌの１Ｍ リン酸を加えて反応を止めた。６５０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
図１１Ａは、抗ＬＴαキメラ抗体Ｓ５Ｈ３が、抗ＬＴ．Ｆｃ変異体と同様に、マウスＬＴα１β２複合体に結合したことを示す。
ＦＡＣＳアッセイを用いて、ＬＴβと複合体化した細胞表面上のＬＴαに対する抗ＬＴα抗体の結合を測定した。ヒトＬＴαβについて、２９３細胞に完全長ヒトＬＴαとヒトＬＴαβ(ヒトＬＴα配列 GenBank Ref ＮＭ＿０００５９５；ヒトＬＴβ配列 GenBank Ref ＮＭ＿００２３４１)とを形質移入し、ヒトＬＴαβ安定発現細胞株を生成した。細胞は、１〜５μｇ／ｍｌの抗ＬＴαキメラ抗体３Ｆ１２又は２Ｃ８、ヒトＬＴβＲ.ｈｕＩｇＧ１、又はｈｕＩｇＧ１アイソタイプコントロール(トラスツズマブ)と共に、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄して、検出のために抗ヒトＩｇ-ＰＥ二次抗体と共にインキュベートした。
マウスＬＴαβについて、ＳＶＴ２細胞に完全長マウスＬＴαとマウスＬＴαβ(マウスＬＴα配列 GenBank Ref ＮＭ＿０１０７３５；マウスＬＴβ配列 GenBank Ref ＮＭ＿００８５１８)とを形質移入し、マウスＬＴαβ安定発現細胞株を生成した。表面ＬＴは、ハムスター−マウスキメラＳ５Ｈ３、抗ＬＴ.Ｓ５Ｈ３.Ｆｃ変異体、ｍｕＬＴβＲ.ＩｇＧ２ａ、又はアイソタイプコントロール(抗ＩＬ１２２ ｍｕＩｇＧ２ａ)(ＡＬＥＸＡ−６４７ＴＭ蛍光体に直接コンジュゲートしたもの)によって、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で２０分間おいて検出した。細胞を洗浄し、吸引し、２％ＦＢＳを有するＰＢＳに再懸濁した。細胞は、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴＴＭソフトウェアを用いたＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲＴＭ(dual laser)にて分析し、結果はＦＬＯＷＪＯＴＭアナライザー(Treestar)にて分析した。
図１１Ｂは、キメラ抗ＬＴα抗体３Ｆ１２と２Ｃ８がどれほど良好にＬＴβと複合体化したヒト細胞表面上のＬＴαに結合したかを示す。これらは、ＬＴβ-レセプター.ｈｕＩｇＧ１およびアイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ１(トラスツズマブ)と比較する。すべてのヒト抗体は表面ＬＴαを結合した。
図１１Ｃは、ハムスター−マウス抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３がどれほど良好にＬＴβと複合体化したマウス細胞表面上のＬＴαに結合したかを示す。これは、ＬＴβ-レセプターマウスＩｇＧ２ａ、抗ＬＴ Ｓ５Ｈ３ Ｆｃ変異体、およびアイソタイプコントロール(抗ＩＬ１２２ ｍｕＩｇＧ２ａ)と比較する。すべてのマウス抗体は表面ＬＴαを結合した。
実施例１２：抗ＬＴα抗体はヒトＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞に結合する
ＣＤ４＋Ｔ細胞が胸腺から成熟し、末梢リンパ系に入る場合、通常、このＴ細胞レセプターに特異的な抗原に遭遇する前はナイーブな表現型を維持している(Sprent et al., Annu Rev Immunol. 20:551-79 (2002))。ＡＰＣにより提示される特異的な抗原結合することによりＴ細胞が活性化される。環境およびサイトカイン刺激に応じて、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｈ１又はＴｈ２の表現型に分化し、エフェクター細胞又はメモリー細胞となる(上掲のSprent et al.、およびMurphy et al., Nat Rev Immunol. 2(12): 933-44 (2000))。この過程は一次活性化として知られている。一次活性化を経て、ＣＤ４＋Ｔ細胞はエフェクター細胞又はメモリー細胞となり、Ｔｈ１又はＴｈ２として表現型を維持する。これら細胞が再び抗原に遭遇すると、二次活性化が起こるが、抗原に対する応答の時期は、一次活性化より早く、一次活性化によって見られるエフェクターサイトカインが産生される(上掲のSprent et al.、及び上掲のMurphy et al.)。
一次活性化状態について、ナイーブＴ細胞は、Ｔｈ１及びＴｈ２のどちらが試験されていたかに応じて、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および特定のサイトカインによって活性化された。特に、ヒトのＴｈ１およびＴｈ２細胞株は、プレートに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８(それぞれ１０μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ；BD PharMingen)によりヒトＰＢＭＣを刺激して生成した。１日目に、Ｔｈ２分化を誘導するために、インターロイキン(ＩＬ)−４(５ｎｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)、抗-ＩＬ−１２(５μｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)、及び抗インターフェロン(ＩＦＮ)-γ(５μｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)を添加した。Ｔｈ１の分化のために、１日目に、ＩＬ−１２(１ｎｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)、ＩＦＮ−γ(１０ｎｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)、及び抗ＩＬ−４(１μｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)を添加した。７及び１４日目に再度２回細胞を刺激した。
Ｔｈ１及びＴｈ２に対する抗体の結合を決定するためのＦＡＣＳ分析細胞-表面染色のために、最終刺激の２日後に、活性化されたヒトＴ細胞(Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞株)を、抗ＬＴα抗体２Ｃ８(１μｇ／ｍｌ)、３Ｆ１２(１μｇ／ｍｌ)、ＬＴβＲ.Ｆｃ(１μｇ／ｍｌ)、ＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃ(１μｇ／ｍｌ)、又はｈｕＩｇＧ１アイソタイプコントロール(１μｇ／ｍｌ)(これらすべてはＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ(登録商標)６４７蛍光体(Invitrogen Corp.)に直接コンジュゲートしている)と共に、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄して、吸引し、２％ＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁した。細胞は、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴＴＭソフトウェアを用いたＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲＴＭ(dual laser)にて分析し、結果はＦＬＯＷＪＯＴＭアナライザー(Treestar)にて分析した。
図１２Ａおよび１２Ｂは、キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８および３Ｆ１２がヒトのＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞にそれぞれ結合したことを示す。グラフも、ＬＴβＲ.Ｆｃ、ＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃおよびアイソタイプコントロールについての結合結果を示す。
ＬＴ-α３およびＬＴ-α１β２が、ヒトＴｈ１７細胞並びにヒトＴｈ１細胞に発現されることがＦＡＣＳ分析によって明らかとなったので、キメラ２Ｃ８、２Ｃ８.ｖ２および２Ｃ８.ｖＸ(実施例３および１８に記載のもの)を含む、本明細書中に記載の抗ＬＴα抗体は、(Ｔｈ１及びＴｈ２と同様に)ヒトＴｈ１７細胞と結合するので、ＭＳ(マウスモデルにおいてＥＡＥを誘導する)および狼瘡、並びにＲＡおよびＩＢＤ、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎を含む多くの自己免疫性疾患を治療する際に有用であると思われる。
したがって、ＬＴαとして抗ＬＴαヒト化抗体２Ｃ８.ｖＸを用い、また、Ｔｈ１７細胞株、並びにＴｈ２細胞株ではなくＴｈ１細胞株を用いて、上記と同じ実験を行った。ヒトＴｈ１７細胞株は、上記のように抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８により、そしてＩＬ−２３(１０ｎｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)、抗ＩＦＮ−γ(１０μｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)、及び抗-IＬ−１２(１０μｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)によりヒトＰＢＭＣを刺激して、生成した。この実験から、実際に抗体２Ｃ８.ｖＸが、休止細胞ではなくヒトＴｈ１７細胞並びにヒトＴｈ１細胞に結合したことが示された。図１２Ｃ−Ｅを参照のこと。
実施例１３：抗ＬＴα抗体はヒトＴ、Ｂ及びＮＫ Ａ細胞に結合する
ＦＡＣＳアッセイを用いて、一次ヒト細胞の表面上のＬＴαに対する抗ＬＴαの結合を決定した。ヒトＰＢＭＣを単離して、活性化されたＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞のために抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８(それぞれ１０μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ；BD PharMingen)にて２日間、又はＢ細胞のために抗ＩｇＭ(１０μｇ／ｍｌ、R&D Systems Inc.)及びＩＬ−４(２０ｎｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)にて２日間かけて活性化した。ＮＫ ＣＤ５６＋細胞は、ネガティブ選別(Miltenyi Biotec)によって単離し、ＩＬ−１５(２０ｎｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)と共に１５時間インキュベートした。
ＦＡＣＳ分析のために、細胞は、キメラ抗ＬＴα抗体３Ｆ１２(１μｇ／ｍｌ)、ヒトＬＴβＲ.ｈｕＩｇＧ１(１μｇ／ｍｌ)、又はｈｕＩｇＧ１アイソタイプコントロール(トラスツズマブ、１μｇ／ｍｌ)(これらすべてはＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ(登録商標)６４７蛍光体(Invitrogen Corp.)に直接コンジュゲートしている)と共に、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、吸引して、２％ＦＢＳを有するＰＢＳに再懸濁した。細胞は、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴＴＭソフトウェアを用いたＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲＴＭ(dual laser)にて分析し、結果はＦＬＯＷＪＯＴＭアナライザー(Treestar)にて分析した。
図１３Ａ−１３Ｅは、アイソタイプコントロールと比較して、抗体が細胞に結合したことを示す。図１３Ａは活性化されていない細胞を表し、図１３Ｂは抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８-活性化ＣＤ４ Ｔ細胞を示し、図１３ＣはＣＤ８ Ｔ細胞を示し、図１３ＤはＩＬ１５-活性化ＣＤ５６ ＮＫ細胞を示し、図１３ＥはＩｇＭ及びＣＤ４０Ｌ-活性化ＣＤ１９ Ｂ細胞を示す。
実施例１４：抗ＬＴαモノクローナル抗体はＬＴα３を機能的にブロックする
１．ヒト及びマウスのＬＴα３のブロック(遮断)
マイクロタイターウェルは、０．７μｇ／ｍｌのヒトＴＮＦＲＩＩ.ｈｕＩｇＧ１(ＥＮＢＲＥＬ(登録商標))を含む５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液(１００μｌ／ウェル)にて終夜をかけてコートした。非吸着溶液をウェルから吸引した。ビオチン化ＬＴα３(マウス又はヒト)を捕獲し、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)にて検出した。ヒトＬＴα３の中和のために、漸増用量のキメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８又は３Ｆ１２又はコントロールアイソタイプ(トラスツズマブ)を、一定の濃度のＬＴα３と１時間予めインキュベートし、コートしたマイクロプレートに添加した。ハムスター−マウスキメラ抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３又は抗ＬＴ.Ｆｃ変異体又はコントロールアイソタイプ(トラスツズマブ)を用いて、マウスＬＴα３の中和のために同じ手順を行った。各ウェルを、ＰＢＳ／０.０５％ＴＷＥＥＮＴＭ ２０界面活性剤にて洗浄し、結合したＨＲＰを、テトラメチルベンジジンの溶液(ＴＭＢ)／Ｈ２０２によって測定した。１５分後に、各ウェルに１Ｍ リン酸を１００μｌ添加して反応を止めた。６５０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
図１４Ａは、抗ＬＴα抗体２Ｃ８および３Ｆ１２が、アイソタイプコントロールと比較してヒトＬＴα３を機能的にブロックしたことを示す。図１４Ｂは、抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３および抗ＬＴ.Ｆｃ変異体が、アイソタイプコントロールと比較してマウスＬＴα３を機能的にブロックしたことを示す。
２．Ａ５４９細胞におけるＬＴα３誘導性のＩＬ−８のブロック
上皮細胞株(Ａ５４９)をＬＴα３の存在下で２４時間培養した。キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８および３Ｆ１２によるＬＴα３の作用の中和を、適切なウェルに添加した抗ＬＴα抗体の階段希釈液(１０〜０μｇ／ｍｌ)によって測定した。上清を用いて、標準ＥＬＩＳＡにおいてＩＬ−８を検出した。
図１４Ｃは、キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８および３Ｆ１２が、アイソタイプコントロール(トラスツズマブＩｇＧ１)と比較して、Ａ５４９細胞におけるＬＴα３誘導性ＩＬ−８をブロックしたことを示す。
３．ＨＵＶＥＣ上のＬＴα３誘導性のＩＣＡＭ発現のブロック
ＨＵＶＥＣ細胞を、ＬＴα３の存在下で２４時間培養した。キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８および３Ｆ１２によるＬＴα３の作用の中和を、適切なウェルに添加した抗ＬＴα抗体の階段希釈液(１０〜０μｇ／ｍｌ)によって測定した。ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現をＦＡＣＳによって測定し、平均蛍光強度として示した。コントロールとしてＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃを用いた。
図１４Ｄは、抗ＬＴα抗体２Ｃ８および３Ｆ１２が、ＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃ変異体と同様に、アイソタイプコントロール(トラスツズマブＩｇＧ１)と比較して、ＨＵＶＥＣ上のＬＴα３誘導性のＩＣＡＭ発現をブロックしたことを示す。刺激していない細胞に対する効果も示す。
４．ＬＴα３誘導性のＮＦκＢ活性化のブロック
抗ＬＴα抗体がＴＮＦレセプターによるＬＴα３のシグナル伝達をブロックするか否かを決定するために、２９３細胞株を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２ ５０:５０(＋１０％ＦＢＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ)中で７５％の集密度まで培養した。標準的な形質移入技術(Fugene)を用いて、標準的なＮＦｋＢ−ＲＥルシフェラーゼレポーターコンストラクトを細胞に形質移入した。２４時間後、細胞を洗浄した後、ＬＴα３(１００ｎｇ／ｍｌ)にて、又はＬＴα３と３０分間予めインキュベートしたキメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８(１０〜０μｇ／ｍｌ)の段階希釈液にて刺激した。６時間後に、細胞をＰＢＳにて洗浄し、ルシフェラーゼ活性を以下の通りに測定した。ＬＹＳＩＳ ＢＵＦＦＥＲＴＭ(Promega、１２５μｌ／ウェル)を加えて１５分間置いた。溶解物を回収し、９６ウェルアッセイプレート(高結合、白いポリスチレン、ＣＯＳＴＡＲＴＭ)に２０μｌ／ウェルで３通り移し、ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ ＡＳＳＡＹ ＲＥＡＧＥＮＴＴＭおよびＳＴＯＰ ＡＮＤ ＧＬＯ ＢＵＦＦＥＲＳＴＭ(Promega)の注入の後に、ＬＭＡＸＩＩＴＭプレート読み取り機(Molecular Devices)にて読み取った。用いたアイソタイプコントロールはトラスツズマブＩｇＧ１であった。
図１４Ｅは、抗ＬＴα抗体２Ｃ８が、アイソタイプコントロールと比較して、ＬＴα３誘導性のＮＦκＢ活性化をブロックしたことを示す。刺激していない細胞に対する効果も示す。
実施例１５：抗ＬＴα抗体はＬＴα1β2を機能的にブロックする
１．ＬＴα誘導性ＮＦκＢ活性化のブロック
抗ＬＴα抗体がＬＴβＲによるＬＴα１β２のシグナル伝達をブロックするか否かを決定するために、２９３細胞株を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２ ５０:５０(＋１０％ＦＢＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ)中で７５％の集密度まで培養した。標準的な形質移入技術(Fugene)を用いて、標準的なＮＦｋＢ−ＲＥルシフェラーゼレポーターコンストラクトを細胞に形質移入した。２４時間後、細胞を洗浄した後、ＬＴα１β２(R&D Systems Inc.；１００ｎｇ／ｍｌ)にて、又はＬＴαβと３０分間予めインキュベートしたキメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８(１０〜０μｇ／ｍｌ)の段階希釈液にて刺激した。６時間後に、細胞をＰＢＳにて洗浄し、ルシフェラーゼ活性を以下の通りに測定した。ＬＹＳＩＳ ＢＵＦＦＥＲＴＭ(Promega、１２５μｌ／ウェル)を加えて１５分間置いた。溶解物を回収し、９６ウェルアッセイプレート(高結合、白いポリスチレン、ＣＯＳＴＡＲＴＭ)に２０μｌ／ウェルで３通り移し、ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ ＡＳＳＡＹ ＲＥＡＧＥＮＴＴＭおよびＳＴＯＰ ＡＮＤ ＧＬＯ ＢＵＦＦＥＲＳＴＭ(Promega)の注入の後に、ＬＭＡＸＩＩＴＭプレート読み取り機(Molecular Devices)にて読み取った。用いたアイソタイプコントロールはトラスツズマブＩｇＧ１であった。
図１５Ａは、抗ＬＴα抗体２Ｃ８が、アイソタイプコントロールと比較して、ＬＴα１β２誘導性のＮＦκＢ活性化を機能的にブロックしたことを示す。刺激していない細胞の反応も示す。
２．ＬＴα３−、ＬＴα２β１−およびＬＴα１β２−誘導性の細胞障害性のブロック
試験試料を、マウスＬ９２９細胞障害能アッセイにおいて、ＬＴα３、ＬＴα２β１およびＬＴα１β２(R&D Systems Inc.)の細胞溶解活性を中和する能力についてアッセイした。Ｌ９２９細胞は、３つうちの１つのＬＴα試薬(図１５Ｂ−Ｄに示す用量で)とＤＮＡ阻害剤アクチノマイシンＤの存在下でマイクロタイタープレート中で培養した。中和キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８を１０μｇ／ｍｌで培養物に加えた。細胞溶解は生きている細胞を標準的にＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥＴＭにて染色して、相対的な蛍光単位(ＲＦＵ)として表した。
図１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｄは、キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８が、ＬＴα３−、ＬＴα２β１−およびＬＴα１β２−誘導性の細胞障害性をそれぞれブロックしたことを示す。
３．ＨＵＶＥＣ上のＬＴα１β２誘導性のＩＣＡＭ発現のブロック
ＨＵＶＥＣ細胞を、ＬＴα１β２(R&D Systems Inc.)の存在下で２４時間培養した。抗ＬＴα抗体によるＬＴα１β２の作用の中和を、適切なウェルに添加したキメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８および３Ｆ１２の階段希釈液(１０〜０μｇ／ｍｌ)によって測定した。ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現をＦＡＣＳによって測定した。
図１５Ｅは、キメラ抗ＬＴα抗体２Ｃ８および３Ｆ１２が、アイソタイプコントロール(トラスツズマブＩｇＧ１)と比較して、ＨＵＶＥＣ上のＬＴα１β２誘導性のＩＣＡＭ発現をブロックしたことを示す。刺激していない細胞に対する効果も示す。
実施例１６：抗ＬＴαモノクローナル抗体はＬＴαβ発現細胞を殺傷しうる
以下の通りにマイクロタイタープレートにおいてＡＤＣＣアッセイを二通り実施した。ネガティブ選別(ＲＯＳＥＴＴＥＳＥＰＴＭ, #15065, StemCell Technologies)を用いて１００ｍｌの正常ヒトドナー全血からＮＫ細胞を単離した。アッセイ希釈液は、ＲＰＭＩＴＭ１６４０および０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡであった。キメラ抗体２Ｃ８とそのＦｃ変異体を含む５０μｌ中１００ｎＭで開始した段階希釈物を、５０μｌのヒトＬＴαβを安定に発現する２９３細胞(２００００)(詳細は実施例１１を参照)と共に、室温で３０分間インキュベートした。５０μｌのＮＫ細胞(１２００００)を添加して、３７℃でさらに４時間インキュベートした。１５００ｒｐｍにて１０分間プレートを遠心分離し、１００μｌの上清を９６平底マイクロウェルプレートに移した。細胞溶解のレベルは、溶解した細胞から放出される乳酸デヒドロゲナーゼの量を測定することによって決定した(ＬＤＨキット、#1-644-793, Roche)。１００μｌのＬＤＨキット反応混合物を１００μｌの上清に加え、３０分未満インキュベートした。４９０ｎｍでプレートを読み取った。コントロールは、(抗体非依存性細胞溶解のためには)抗体がない条件下での標的：エフェクター細胞、(総溶解のためには)１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ-１００ＴＭ界面活性剤と標的細胞単独、そして抗体ＡＤＣＣネガティブ及びポジティブコントロールを含む。
図１６は、ＡＤＣＣアッセイにおいて、抗ＬＴα抗体２Ｃ８が２９３ヒトＬＴαβ発現細胞株を溶解したが、対応するＦｃ変異体モノクローナル抗体は溶解しなかったことを示す。
実施例１７：抗ＬＴαモノクローナル抗体は３Ｔ３細胞およびＨＵＶＥＣ細胞のサイトカインおよびケモカイン分泌をブロックする
ＨＵＶＥＣ細胞及び３Ｔ３細胞を、ヒトＬＴα３(１００ｎｇ／ｍｌ；R&D Systems Inc.)又はヒトＬＴα１β２(２００ｎｇ／ｍｌ； R&D Systems Inc.)の存在下で、ヒト又はマウスの試薬をそれぞれ用いて２４時間培養した。キメラ２Ｃ８又はＳ５Ｈ３抗ＬＴα抗体(ＨＵＶＥＣの時キメラ２Ｃ８、およびマウス３Ｔ３細胞の時ハムスター−マウスキメラＳ５Ｈ３)によるＬＴα三量体の作用の中和を、１０〜０μｇ／ｍｌの静的用量(static dose)を用いて決定した。ＨＵＶＥＣ評価のためにヒトＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＰ−１０およびＩＬ−８について、または３Ｔ３評価のためにマウスＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＰ−１０およびＫＣについて、標準的なＬＩＮＣＯＰＬＥＸＴＭキットを用いて上清をアッセイし、ＬＵＭＩＮＥＸＴＭプレート読み取り機にて読み取った。
図１７Ａ−Ｈは、アイソタイプコントロールに対して、刺激していない細胞と比較して、抗ＬＴα抗体が、ＨＵＶＥＣ細胞のサイトカインとケモカインの分泌をブロックしたことを示す。図１７Ａ−１７Ｄのそれぞれは、ＬＴα１β２によるＫＣ／ＩＬ-８、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ１０およびＩＬ-６を示し、図１７Ｅ−１７Ｈのそれぞれは、ＬＴα３によるＫＣ／ＩＬ-８、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ１０およびＩＬ-６を示す。
図１７Ｉ−Ｐは、アイソタイプコントロールに対して、刺激していない細胞と比較して、抗ＬＴα抗体が、３Ｔ３細胞のサイトカインとケモカインの分泌をブロックすることを示す。図１７Ｉ−１７Ｌのそれぞれは、ＬＴα１β２によるＫＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ１０およびＩＬ-６を示し、図１７Ｍ−１７Ｐのそれぞれは、ＬＴα３によるＫＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ１０およびＩＬ-６を示す。
要約すると、ＬＴαに対して本明細書中に記載の好適な抗体は、
１) ＬＴα３をブロックする。
２) 細胞表面上のＬＴβと複合体化されるＬＴαを標的として結合することによって、ＬＴαポジティブ細胞を枯渇する。枯渇が重要であるというデータは、野生型をＦｃ(ＤＡＮＡ)変異体と比較しているインビボデータである。マウスでは：ＣＩＡ、ＡＩＡ(図４および５)、ヒトでは：２Ｃ８によるヒトＳＣＩＤマウス(図９)およびＡＤＣＣアッセイ(図１６)。
３) ＬＴαβ機能をブロックする。
４) 何かの理論に縛られるものではないが、Ｔ、Ｂ及び可能性として又は任意のＴｈ１−又はＴｈ１７−又はＴｈ２−作動性の疾患(及びＮＫ細胞)を含む、ＬＴαを発現する任意の細胞を標的とする。
本明細書中に記載の抗体による治療から利益を得ると思われる疾患には、ＲＡ、ＩＢＤ、乾癬、ＭＳ、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、および狼瘡、特に、ＲＡ、ＭＳ、狼瘡(例えばＳＬＥおよびＬＮ)、クローン病およびＵＣを含むＩＢＤが含まれる。
実施例１８：親和性成熟された抗ＬＴα抗体２Ｃ８.ｖＸ
実施例３に示す抗体２Ｃ８を親和性成熟することによってヒト化抗体２Ｃ８.ｖＸを生成した。この抗体の軽鎖および重鎖の可変領域およびＣＤＲは、それぞれ図１８Ａおよび１８Ｂに、ＣＤＲと共に示す。
以下は、抗ＬＴα２Ｃ８.ｖＸの完全長重鎖をコードするＤＮＡ配列である。
GAAGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTACACATTCACCAGCTATGTGATCCATTGGGTCCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGGTTGGTTATAACAATCCTTATAACGCCGGCACCAACTATAACGAGAAGTTCAAGGGGCGCTTCACTATCAGTTCTGACAAGTCGAAAAACACAGCATACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTCGACCCACAATGCTCCCATGGTTCGCCTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(配列番号：１０４ )
以下は、抗ＬＴα２Ｃ８.ｖＸの完全長軽鎖をコードするＤＮＡ配列である。
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCTGTGTCTTCCGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCTGCATCCCACCGTTACACTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCGGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGGAATCTTATTCTACTCCTTGGACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(配列番号：１０５)
以下は、２Ｃ８.ｖＸの完全長重鎖アミノ酸配列である。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYVIHWVRQAPGKGLEWVGYNNPYNAGTNYNEKFKGRFTISSDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRPTMLPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号：１０６)
以下は、２Ｃ８.ｖＸの完全長軽鎖アミノ酸配列である。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASHRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号：１０７)
エピトープマッピングから、この分子がレセプター結合部位と部分的な重なりを有することが示された。活性化されたアカゲザルＴおよびＢ細胞は表面ＬＴαβを発現する。抗体２Ｃ８.ｖＸは、アカゲザル表面ＬＴαβ(ＦＡＣＳにより測定される)及びアカゲザル可溶性ＬＴα３(ＦＯＲＴＥＢＩＯＴＭ ｏｃｔｅｔにより測定される)を結合した(交差反応した)。
図１９Ａおよび１９Ｂは、それぞれ、アイソタイプコントロール／ＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃと比較したときの、２Ｃ８.ｖＸ抗体のＬＴα３およびＬＴα１β２結合のＥＬＩＳＡを示す。
これらＥＬＩＳＡは、ヒトＬＴα３を用いて上記の実施例１０に、そして、ＬＴα１β２を用いて実施例１１に記載したのと同様に行った。ＬＴα３及びＬＴα１β２に対するこれら同じ抗体のＥＣ５０値は、ＬＴα３に対してＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃでは１.０３ｎＭ、２Ｃ８.ｖＸでは０.０５ｎＭ、ＬＴα１β２に対してＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃでは結合はなく、２Ｃ８.ｖＸでは０.３４ｎＭである。結果は、いずれの場合においても２Ｃ８.ｖＸはＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃよりもはるかに良好に結合したことを示す。
図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれ、上記実施例１５に記載の、ヒトＬＴ誘導性細胞障害性のブロックを試験するためのアッセイを用いた、アイソタイプコントロール／ＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃと比較したときの、２Ｃ８ｖＸ抗体によるヒトＬＴα３およびＬＴα１β２のブロックを示す。ＬＴα３及びＬＴα１β２に対するこれら同じ抗体のＩＣ５０値は、ＬＴα３に対してＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃでは０．８３ｎＭ、２Ｃ８.ｖＸでは０.２９ｎＭであり、アイソタイプではブロックを示さず、ＬＴα１β２に対して２Ｃ８.ｖＸでは０.３１ｎＭであり、アイソタイプではブロックを示さない。結果は、２Ｃ８.ｖＸがＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃよりも良好にＬＴα３をブロックしたことを示す。
図２１は、上記の実施例１４に記載のプロトコールを用いた、ＨＵＶＥＣ細胞上のＬＴα３によるＩＣＡＭ１上方制御の阻害を示す機能的アッセイに関する。図２１は、機能的なアッセイにおいて様々な分子がどの程度ＬＴα３をブロックするかの比較を示す。具体的には、アイソタイプコントロール、２Ｃ８.ｖＸおよびＴＮＦＲＩＩ.Ｆｃを比較した。結果は、このアッセイにおいて両抗体がＬＴα３をブロックすることができることを示す。
図２２は、上記の実施例１５に記載のプロトコールを用いた、２９３−ＬＴβＲ細胞を用いたＬＴα１β２ブロックを示す機能的アッセイに関する。図２２は、この機能的なアッセイにおいて様々な分子がどの程度ＬＴα１β２をブロックするかの比較を示す。具体的には、刺激していない細胞と合わせてアイソタイプコントロール及び２Ｃ８.ｖＸを比較した。結果は、このアッセイにおいて２Ｃ８.ｖＸがＬＴα１β２をブロックすることができることを示す。
図２３は、２９３−ＬＴα１β２細胞を伴う実施例１６に記載のプロトコールを用いた２Ｃ８.ｖＸのＡＤＣＣ活性を示す。２Ｃ８.ｖＸは、２Ｃ８.ｖＸ ＤＡＮＡ変異体およびアイソタイプコントロールと比較した。この結果は、２Ｃ８.ｖＸはＡＤＣＣ活性を有するのに対して、ＤＡＮＡ変異体は有さないことを示す。
図２４は、３〜４週間で終了する、実施例９の記載と同じプロトコールを用いた、コントロール(Ｆｃ変異体およびアイソタイプコントロール)と比較したときの、ヒトＳＣＩＤモデルにおける２Ｃ８.ｖＸとＣＴＬＡ４−ＦｃによるＧＶＨＤ生存結果を示す。この結果は、このモデルにおいてＣＴＬＡ４−Ｆｃ及び２Ｃ８.ｖＸは生存を延長したので、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ及び２Ｃ８.ｖＸはＬＴα細胞を枯渇するために有効であるが、コントロール２Ｃ８.ｖＸ-ＤＡＮＡ変異体とヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体はそうでないことを示す。
図２５Ａ−Ｄは、２Ｃ８.ｖＸ抗体がヒトＳＣＩＤ ＧＶＨＤモデルにおいてＬＴα１β２発現のＴおよびＢ細胞を枯渇させたことを示す。このプロトコールにおいて、ＳＣＩＤマウスは、ＦＩＣＯＬＬＴＭ多糖勾配によって正常なドナーのＬＥＵＫＯＰＡＣＫＴＭ(Interstate Blood Bank, Memphis, TNなどの血液バンクより入手可能)から精製したＰＢＭＣにより再構成した。すべてのマウス(ｎ＝１０／群)に、セシウム１３７源を使用して３５０ラドによって致死未満の照射を与えた。照射の２時間後に、１マウス当たり５０００００００個のヒトＰＢＭＣを含む２００μｌのＰＢＳをマウスに注入した。細胞注入後１日目に、３００μｇのヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体、２Ｃ８.ｖＸ、又は２Ｃ８.ｖＸ ＤＡＮＡ変異体のいずれかを含む１００μｌの生理食塩水を、１日間、マウスの腹腔内に投与した。照射後の２日目に、マウスの脾細胞を、５-(及び６-) カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル(ＣＦＳＥ)にて標識し、絶対細胞数(総ＣＦＳＥポジティブ細胞)を測定し、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ１９＋細胞に電気的にゲーティング(gating)させた後に、ＣＦＳＥピークでの細胞の割合を測定した。この三色染色のために、以下のモノクローナル抗体を用いた。ＰＥ標識抗ＣＤ４、ＰＥ標識抗ＣＤ８、およびＰＥ標識ＣＤ１９。染色された細胞は、ＦＡＣＳＣＡＮＴＭ又はＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲＴＭ計測器にて分析した。
図２５Ａの結果は、アイソタイプコントロール、２Ｃ８.ｖＸおよび２Ｃ８.ｖＸ.ＤＡＮＡ変異体についての、２日目の総ＣＦＳＥポジティブヒト細胞を示す。この結果から、ｖＸ抗体による枯渇が最も良かったことが示唆される。図２５Ｂ−Ｄはそれぞれ、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９抗体を用いたゲーティング(gating)の結果を示す。 この結果から、ｖＸ抗体が、アイソタイプコントロールおよびＤＡＮＡ変異体と比較して、ＬＴαβポジティブＴおよびＢ細胞を枯渇するにあたって最も良かったことが示唆される。
要約すると、抗体２Ｃ８.ｖＸは、インビトロＡＤＣＣアッセイ及びインビボの２つのヒトＳＣＩＤ ＧＶＨＤモデルにおいてＬＴ発現細胞を枯渇させる。また、ＨＵＶＥＣ細胞及び２９３−ＬＴβＲ細胞をそれぞれ用いた機能的細胞アッセイにおいて、ＬＴα３およびＬＴα１β２をブロックする。さらに、非ヒト霊長類(ＮＨＰ)リンホトキシンと交差反応する。これは、活性化されたアカゲザル一次細胞及びＬＴα３アカゲザルタンパク質によって測定される。
実施例１９：親和性成熟した抗ＬＴα抗体３Ｆ１２.ｖ１４
上記の抗体３Ｆ１２を親和性成熟することによってヒト化抗体３Ｆ１２.ｖ１４を生成した。この抗体の軽鎖および重鎖の可変領域およびＣＤＲは、それぞれ図２６Ａおよび２６Ｂに、ＣＤＲと共に示す。
上記のアッセイを用いて、ＬＴα３及びＬＴαβの結合及びブロックについて試験すると、３Ｆ１２.ｖ１４は、抗体２ｃ８.ｖＸと同様に、これら分子を結合し、ブロックした。
実施例２０：アフコシル化２Ｃ８.ｖＸ
米国公開２００３／０１５７１０８；国際公開２０００／６１７３９；国際公開２００１／２９２４６；米国公開２００３／０１１５６１４；米国公開２００２／０１６４３２８；米国公開２００４／００９３６２１；米国公開２００４／０１３２１４０；米国公開２００４／０１１０７０４；米国公開２００４／０１１０２８２；米国公開２００４／０１０９８６５；国際公開２００３／０８５１１９；国際公開２００３／０８４５７０；国際公開２００５／０３５５８６；国際公開２００５／０３５７７８；国際公開２００５／０５３７４２；米国公開２００６／００６３２５４；米国公開２００６／００６４７８１；米国公開２００６／００７８９９０；米国公開２００６／００７８９９１；Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；又はYamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004)に開示される技術や細胞株を用いて抗体を培養することによって、本明細書中に記載の抗体をフコースを欠損するように変更してもよい。脱フコシル化抗体を生産する細胞株の例には、タンパク質フコシル化に欠陥のあるＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞(Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys., 249:533-545 (1986)；米国公開２００３／０１５７１０８Ａ１(Presta)および国際公開２００４／０５６３１２Ａ１(Adams et al.、特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例えばα-１,６-フコシル基転移酵素遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞(上掲のYamane-Ohnuki et al.)が含まれる。
実際に、抗体２Ｃ８.ｖＸをアフコシル化して、抗ＬＴａ ２Ｃ８.ｖＸ ＡＦと称される抗体を生産させた。上掲のYamane-Ohnuki et al.の方法によって記載されるように、ＦＵＴ8ノックアウト遺伝子を有する安定ＣＨＯ細胞株を用いてこの分子を生成した。１００アフコシル化される。
２Ｃ８.ｖＸの生物物理学の特性(ブロック及び結合データを含む)は、ＡＤＣＣを除き、アフコシル化によって実質的に変化しなかった。野生型分子およびアフコシル化分子のＡＤＣＣ特性は、２９３−ＬＴα１β２細胞を用いた実施例１６に記載されるプロトコールを用いて実験を行うことによって決定した。結果を図２７に示す。図から、アフコシル化抗体抗ＬＴａ ２Ｃ８.ｖＸ ＡＦが、野生型(ＷＴ)抗体(上記の正常ＣＨＯ細胞株において産生される抗体)よりもおよそ１０倍増加していることが示される。
実施例２１：アンダーフコシル化２Ｃ８.ｖＸ
哺乳類細胞において非フコシル化抗体の高収率を達成するための選択的な方法として、ＲＮＡｉ方策を用いてＦＵＴ８遺伝子の発現をノックダウンしてもよい。プラスミドを用いて、ＦＵＴ８遺伝子に特異的な１９ｎｔ(ヌクレオチド)センスｓｉＲＮＡ配列からなる短いヘアピンｓｉＲＮＡを、該ｓｉＲＮＡのリバース相補鎖アンチセンスｓｉＲＮＡ配列に、短いスペーサー(９ｎｔヘアピンループ)によって連結し、３'末端に５−６Ｕ'ｓをつなげて作製した。
４つの異なるＲＮＡｉプローブは、入手可能なＣＨＯ ＦＵＴ８ ＤＮＡ配列を元に異なる領域を標的とするように設定した。
これらＲＮＡｉプローブの有効性を試験するために、ＦＬＡＧタグ化ＦＵＴ８融合タンパク質を、入手可能なＣＨＯ ＦＵＴ８ ＤＮＡ配列(Genbank寄託番号 Ｐ＿ＡＡＣ６３８９１)を用いて構築した。ＦＵＴ８プライマーを用いてＲＴ-ＰＣＲを行い、結果として生じたＰＣＲ断片を５'ＦＬＡＧタグ配列と融合した。タグ化ＦＵＴ８断片を発現ベクターにクローン化する。ＲＮＡｉプローブプラスミドおよびｆｌａｇタグ化ＦＵＴ８プラスミドをＣＨＯ細胞に同時形質移入する。形質移入の２４時間後に細胞溶解物を抽出し、ＦＵＴ8融合タンパク質レベルをイムノブロッティング法によって抗ｆｌａｇＭ２抗体を用いて分析した。ＲＮＡｉプローブの存在下で、融合タンパク質発現は、ほとんどの場合においてかなり阻害されると思われる。
２Ｃ８.ｖＸなど、本明細書において記述するように、最高の阻害作用を示す２つのプローブを抗体を発現するＣＨＯ細胞株に形質移入する。発現した抗ＬＴα抗体はプロテインＡカラムによって精製し、アスパラギン-結合オリゴ糖(フコース含有を含む)のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ)質量分析と以下に記載のＦｃγＲ結合アッセイにかけた。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるオリゴ糖の分析方法は一般的に以下のように行う。Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998)のペプチド-Ｎ-グリコシダーゼ-Ｆ(ＰＮＧａｓｅ Ｆ)手順を用いて、Ｎ連結オリゴ糖を、組み換えグリコタンパク質から放出する。簡単に言うと、９６ウェルのポリビニリデン二フッ化物(ＰＶＤＦ)舗装のマイクロタイタープレート(Millipore, Bedford, MA)であって、ＰＶＤＦメンブレンを引いたものを、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＴＭマルチスクリーン真空マニホールドを真空にすることによって、１００μｌのメタノールにて調整する。調整したＰＶＤＦメンブレンを２５０μｌの水にて３回洗浄する。すべての洗浄工程の間で、マニホールドを緩やかに真空にすることによって完全に廃液する。６Ｍ グアニジン塩酸塩、３６０ｍＭ ＴＲＩＳバッファ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．６からなるカルボキシメチル化バッファ(ＲＣＭ)及び還元によりメンブランを洗浄する。糖タンパク質試料(５０μｇ)を各ウェルに置き、再び緩やかに真空にしてＰＶＤＦメンブレンを引き、５０μｌのＲＣＭバッファにて２回ウェルを洗浄する。固定した試料を、各ウェルに５０μｌの０．１Ｍ ジチオトレイトール(ＤＴＴ)溶液を加えて、３７℃で１時間マイクロタイタープレートをインキュベートすることによって還元する。真空にしてＤＴＴを除去し、２５０μｌの水にて４回ウェルを洗浄する。１Ｍ ＮａＯＨにて新たに調整して、ＲＣＭバッファにて０．１Ｍに希釈した５０μｌの０．１Ｍ ヨード酢酸(ＩＡＡ)溶液を添加して、システイン残基をカルボキシメチル化する。
カルボキシメチル化は、暗所にて室温で３０分間インキュベートすることによって行った。プレートを真空にして、ＩＡＡ溶液を除去し、２５０μｌの精製水にて４回ウェルを洗浄する。１００μｌの１％ＰＶＰ３６０ＴＭ(ポリビニルピロリジン３６００００ＭＷ)(Sigma)溶液を添加して、室温で３０分間インキュベートすることによって、ＰＶＤＦメンブレンをブロックする。穏やかに真空にすることによってＰＶＰ-３６０ＴＭ溶液を除去し、２５０μｌの水にて４回ウェルを洗浄する。ペプチド：Ｎ-グリコシダーゼＦ(ＰＮＧａｓｅ ＦＴＭ)アミダーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を、２５単位／ｍｌ１０ｍＭトリスアセテート溶液、ｐＨ８．３の濃度で２５μｌを各ウェルに添加し、３７℃で３時間消化を行う。消化後、試料を５００μｌのＥＰＰＥＮＤＯＲＦＴＭチューブへ移し、２．５μｌの１．５Ｍ 酢酸溶液を各試料に添加する。酸性化した試料を、室温にて２時間インキュベートし、グリコシルアミンからヒドロキシ形態にオリゴ糖を転換する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の前に、コンパクト反応チューブ(US Biochemical, Cleveland, OH)に充填された０．７ｍｌベッドのカチオン交換樹脂(水素型のＡＧ５０Ｗ−Ｘ８樹脂)(Bio-Rad, Hercules, CA)スラリーを用いて、放出されたオリゴ糖を脱塩する。
ポジティブ様式で試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析するために、２ｍｇの２,５ジヒドロキシ安息香酸を０．１ｍｇの５-メトキシサリチル酸と共に１ｍｌの１ｍＭ ＮａＣｌ／２５％水溶性エタノールに溶解させることによって調整する０．５μｌの２,５ジヒドロキシ安息香酸基質(ｓＤＨＢ)によってステンレスターゲットに、脱塩したオリゴ糖(０．５μｌ等量)を用いる。試料／基質混合物真空乾燥し、大気の水分を吸収させて、分析する。放出されたオリゴ糖をＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ ＶＯＹＡＧＥＲ−ＥＬＩＴＥＴＭ質量分析計によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析する。質量分析計は、線形構造かつ遅延抽出を利用して、２０ｋＶのポジティブモードで操作する。データは、およそ１１００のレーザー検出力を用いて、データ総和モード(２４０スキャン)で行い、シグナル／ノイズ比を改善する必要がある。計器は標準オリゴ糖の混合物にて標準化し、データを１９ポイントＳａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムを用いて平滑化して、質量を割り当てる。質量スペクトルデータの統合は、ＣＡＥＳＡＲ７．２ＴＭデータ分析ソフトウェアパッケージ(ＳｃｉＢｒｉｄｇｅソフトウェア)を用いて行う。
ヒトＦｃγレセプターに対するコントロール試料および試験材料の結合は、基本的にShields et al., J Biol Chem, 276:6591-604 (2001)に記載の手順の変法を用いて評価してもよい。
ＲＮＡｉ形質移入細胞でのＦＵＴ８ ＲＮＡ発現が低いことを確認するために、形質移入の２４時間後の形質移入細胞から抽出したＲＮＡ試料を用いてノーザンブロットを行ってもよい。コントロールプラスミド(ランダムマウスＤＮＡ配列、いずれか公知のマウスタンパク質に相同性がない)を含む細胞からの総ＲＮＡと２つのＲＮＡｉプラスミドを精製して、３００ｂｐプローブとハイブリダイズさせてもよい。内在性１,６-フコシル基転移酵素ＲＮＡのノックダウンにより、定量的ＰＣＲによってさらに確認してもよい。
材料の寄託
以下の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209, USA(ATCC)に寄託した：
材料
ハイブリドーママウスリンホトキシンα２β１ｓ５Ｈ３.２.２
ＡＴＣＣ寄託番号
ＰＴＡ−７５３８
寄託日
２００６年４月１９日
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願のいずれか早いものの公開時に、寄託培養物の後代が永久かつ非制限的に一般に入手可能となることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１.１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許商標庁長官が決定した者が後代を入手できることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されているときに死亡もしくは損失又は破壊された場合、通知時に材料を同一の他のものに即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。本発明の権利範囲は本明細書中に示す実施例によって限定されるものではない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の特許請求の範囲内に入るものである。

Claims (102)

  1. (a) KASQAVSSAVA(配列番号：１)又はRASQAVSSAVA(配列番号：２)であるアミノ酸Ａ１−Ａ１１を含むＣＤＲ-Ｌ１配列、又は、KSSQSLLYSTNQKNFLA(配列番号：３)又はKSSQSLLYSANQKNFLA(配列番号：４)又はKSSQSLLYSTNQKNALA(配列番号：６)であるアミノ酸Ａ１−Ａ１７を含むＣＤＲ-Ｌ１配列であって、このときＮが任意のアミノ酸であり、
    (b) SASHRYT(配列番号：７)又はWASTRDS(配列番号：８)であるアミノ酸Ｂ１−Ｂ７を含むＣＤＲ-Ｌ２配列、
    (c) QQHYSTPWT(配列番号：９)又はQENYSTPWT(配列番号：１１)又はQQYYSYPRT(配列番号：１３)又はQQYASYPRT(配列番号：１４)又はQQYYAYPRT(配列番号：１５)であるアミノ酸Ｃ１−Ｃ９を含むＣＤＲ-Ｌ３配列であり、このときＮが任意のアミノ酸であり、
    (d) GYTFTSYVIH(配列番号：１６)又はGYTFSSYWIE(配列番号：１７)であるアミノ酸Ｄ１−Ｄ１０を含むＣＤＲ-Ｈ1配列、
    (e) YNNPYNDGTNYNEKFKG(配列番号：１８)又はEISPGSGSTNYNEEFKG(配列番号：１９)又はYNNPYNAGTNYNEKFKG(配列番号：１０１)又はEINPGSGSTIYNEKFKG(配列番号：１１０)であるアミノ酸Ｅ１−Ｅ１７を含むＣＤＲ-Ｈ２配列であり、このときＮが任意のアミノ酸であり、及び、
    (f) PTMLPWFAY(配列番号：２０)であるアミノ酸Ｆ１-Ｆ９を含むＣＤＲ-Ｈ３配列、又は、GYHGY(配列番号：２１)又はGYHGA(配列番号：２２)であるアミノ酸Ｆ１−Ｆ５を含むＣＤＲ-Ｈ３配列
    からなる群から選択される少なくとも一の相補性決定領域(ＣＤＲ)配列を含んでなる単離された抗リンホトキシンα(ＬＴα)抗体。
  2. 配列番号：３がKSSQSLLYSTAQKNFLA(配列番号：５)である、請求項１に記載の抗体。
  3. 配列番号：１１がQESYSTPWT(配列番号：１０)又はQEVYSTPWT(配列番号：１２)である、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. ＣＤＲ-Ｌ１配列が配列番号：２又は３又は４又は６である、請求項１から３の何れか一に記載の抗体。
  5. 配列番号：１又は２および７および９のすべて、又は配列番号：１又は２及び７又は８及び１１のすべて、又は配列番号：１６、１８および２０のすべて、又は配列番号：１６、１０１および２０のすべて、の何れかを含んでなる、請求項１から３の何れか一に記載の抗体。
  6. 配列番号：３、８および１３のすべて、又は配列番号：４、５又は６、８および１３のすべて、又は配列番号：３、８および１４又は１５のすべて、又は配列番号：４、５又は６、８および１４又は１５のすべて、又は配列番号：１７、１９および２１又は２２のすべて、又は配列番号：１７、１１０および２１のすべて、のいずれかを含んでなる、請求項１から３の何れか一に記載の抗体。
  7. (i) 配列番号：１又は２および７および９、又は配列番号：１又は２及び７又は８及び１１、又は配列番号：３、８および１３、又は配列番号：４、５又は６、８および１３、又は配列番号：３、８及び１４又は１５、又は配列番号：４、５又は６、８および１４又は１５のＣＤＲ-Ｌ１からＣＤＲ-Ｌ３アミノ酸配列のすべてと、(ii) 配列番号：１６、１８および２０、又は配列番号：１６、１０１および２０、又は配列番号：１７、１９および２１又は２２、又は配列番号：１７、１１０および２１のＣＤＲ-Ｈ１からＣＤＲ-Ｈ３アミノ酸配列のすべてとを含む、請求項１から６の何れか一に記載の抗体。
  8. ヒトのサブグループ１コンセンサスフレームワーク配列を含む、請求項１から７の何れか一に記載の抗体。
  9. 重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む、請求項１から８の何れか一に記載の抗体。
  10. フレームワーク配列が位置７１、７３又は７８に置換を含む、請求項９に記載の抗体。
  11. 前記置換がＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ又はＮ７８Ａ、又はこれらの組み合わせである、請求項１０に記載の抗体。
  12. リンホトキシンα３三量体(ＬＴα３)に結合し、腫瘍壊死因子レセプター−Ｉ(ＴＮＦＲＩ)および腫瘍壊死因子レセプター-ＩＩ(ＴＮＦＲＩＩ)とのＬＴα３の相互作用を遮断する、請求項１から１１の何れか一に記載の抗体。
  13. リンホトキシンαβヘテロ二量体(ＬＴαβ)に結合する、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体。
  14. ＬＴαβ機能を遮断する、請求項１から１３の何れか一に記載の抗体。
  15. Ｆｃ領域を有し、インビトロ関節炎アッセイにおいて関節リウマチと関係している炎症性サイトカインのレベルを低減する、請求項１から１４の何れか一に記載の抗体。
  16. リンホトキシンβレセプター(ＬＴβ-Ｒ)とのＬＴαβの相互作用を遮断する、請求項１から１５の何れか一に記載の抗体。
  17. ＬＴαポジティブ細胞を低減させる、請求項１から１６の何れか一に記載の抗体。
  18. ＬＴαβ発現細胞を調節する、請求項１から１７の何れか一に記載の抗体。
  19. キメラまたはヒト化した、請求項１から１８の何れか一に記載の抗体。
  20. ヒト化されている、請求項１９に記載の抗体。
  21. フレームワーク配列の少なくとも一部が、ヒトのコンセンサスフレームワーク配列である、請求項２０に記載の抗体。
  22. 前記抗体が少なくともおよそ１０−１２Ｍの親和性でＬＴαを結合する、請求項１から２１の何れか一に記載の抗体。
  23. ＩｇＧアイソタイプのものである、請求項１から２２の何れか一に記載の抗体。
  24. ＩｇＧがＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａである、請求項２３に記載の抗体。
  25. Ｆｃ領域が野生型Ｆｃ領域である、請求項１５から２４の何れか一に記載の抗体。
  26. さらに、Ｆｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換を含み、その結果、天然配列のＦｃ領域を有する同じ抗体と比較して、増大した抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ＡＤＣＣ)機能を有するものとなる、請求項１５から２４の何れか一に記載の抗体。
  27. さらに、１〜３のアミノ酸置換をＦｃ領域に含む、請求項２６に記載の抗体。
  28. Ｆｃ領域が、２６８Ｄ、又は２９８Ａ、又は３２６Ｄ、又は３３３Ａ、又は３３４Ａ、又は２９８Ａと３３３Ａ、又は２９８Ａと３３４Ａ、又は２３９Ｄと３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ａ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと３３０Ｌ及び３３２Ｅ及び２７２Ｙ及び２５４Ｔ及び２５６Ｅ、又は２５０Ｑと４２８Ｌ、又は２６５Ａ、又は２９７Ａである一又は何れかを組み合わせた位置にアミノ酸置換を有し、このとき２６５Ａ置換は２９７Ａの存在下になく、２９７Ａ置換は２６５Ａの存在下にない、請求項２６に記載の抗体。
  29. アメリカ培養細胞系統保存機関番号ＰＴＡ−７５３８(ハイブリドーママウスリンホトキシンα２β１ ｓ５Ｈ３.２.２)の下に寄託されるハイブリドーマ細胞株によって生産されるマウス抗体のヒトＬＴαに対する一価性親和性とおよそ同じか又はより大きいヒトＬＴαに対する一価性親和性を有する、請求項２０から２８の何れか一に記載の抗体。
  30. 一価性親和性がＫｄ値として表される、請求項２９に記載のヒト化抗体。
  31. 一価性親和性が光学バイオセンサー又はラジオイムノアッセイで測定される、請求項３０に記載のヒト化抗体。
  32. 配列番号：２３又は２４を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：２５又は２６を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：２３及び２５の両方又は配列番号：２４及び２６の両方を含む軽鎖および重鎖の可変ドメインを有する抗リンホトキシンα(ＬＴα)抗体。
  33. 配列番号：２７又は２８を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：２９又は３０又は３１を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：２７および２９の両方、又は配列番号：２７および３０の両方、又は配列番号：２７および３１の両方、又は配列番号：２８および３０の両方、又は配列番号：２８および３１の両方を含む軽鎖及び重鎖の可変ドメインを有する、抗リンホトキシンα(ＬＴα)抗体。
  34. 配列番号：１０２を含む軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：１０３を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：１０２及び１０３の両方を含む軽鎖および重鎖の可変ドメインを有する、抗リンホトキシンα(ＬＴα)抗体。
  35. 配列番号：１０８を含む軽鎖可変ドメイン又は配列番号：１０９を含む重鎖可変ドメインを有するか、又は配列番号：１０８と１０９の両方を含む軽鎖及び重鎖の可変ドメインを有する、抗リンホトキシンα(ＬＴα)抗体。
  36. 野生型のチャイニーズハムスター卵巣細胞において生産される同じ抗体上のフコースの量と比較してフコースが減少している、請求項１から３５の何れか一に記載の抗体。
  37. フコースをもたない、請求項３５に記載の抗体。
  38. Ｆｃ領域を有する請求項１から３７の何れか一に記載の抗体を含有する抗体組成物であって、該組成物中の抗体のおよそ２０〜１００％がフコースを欠いているＦｃ領域に成熟したコア炭水化物構造を含む、抗体組成物。
  39. ２３８、２３９、２４６、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１４、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８および４３９からなる群から選択されるＦｃ領域の何れか一又はいずれか組み合わせた位置に、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、ＴおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸を用いることによって、抗体が、野生型のＩｇＧ Ｆｃ配列と比較して、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ＡＤＣＣ)、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)又は抗体の薬物動態学的性質の一又は複数が変化するように改変されているＦｃ領域を含む、請求項３８に記載の組成物。
  40. 抗体が、ヒトエフェクター細胞の存在下で抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を有するか、又はヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃを含む他の同じ抗体と比較して、ヒトエフェクター細胞の存在下で増大した抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を有する、請求項３８又は３９の何れかに記載の組成物。
  41. さらに、抗体が、２６８Ｄ又は３２６Ｄ又は３３３Ａと３３４Ａ、又は２９８Ａと３３３Ａ、又は２９８Ａと３３４Ａ、又は２３９Ｄと３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ａ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと２６８Ｄ及び２８３Ｌ及び２９８Ａ及び３２６Ａ及び３３２Ｅ、又は２３９Ｄと３３０Ｌ及び３３２ＥであるＦｃ置換を含む、請求項３８に記載の組成物。
  42. 抗体がＦｃγＲＩＩＩを結合する、請求項３８に記載の組成物。
  43. 抗体が、糖タンパク質のＦｃ領域に付着したフコースを包含する成熟コア炭水化物構造を有する糖タンパク質よりも、良好な親和性でＦｃγＲＩＩＩを結合するか、又は抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ＡＤＣＣ)をより効率よく媒介する、請求項３８に記載の組成物。
  44. 抗体が、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞によって生産されている、請求項３８から４３の何れか一に記載の組成物。
  45. ＣＨＯ細胞がＬｅｃ１３細胞である、請求項４４に記載の組成物。
  46. 抗体がフコシル基転移酵素遺伝子を欠いている哺乳動物細胞によって生産されている、請求項３８から４５の何れか一に記載の組成物。
  47. フコシル基転移酵素遺伝子がＦＵＴ８遺伝子である、請求項４６に記載の組成物。
  48. 抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した分岐するＮ‐アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を持たない、請求項３８に記載の組成物。
  49. 抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した分岐するＮ‐アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を持つ、請求項３８に記載の組成物。
  50. 抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した一又は複数のガラクトース残基を持つ、請求項３８に記載の組成物。
  51. 抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した一又は複数のガラクトース残基を持たない、請求項３８に記載の組成物。
  52. 抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した一又は複数のシアル酸残基を持つ、請求項３８に記載の組成物。
  53. 抗体が、成熟コア炭水化物構造に付着した一又は複数のシアル酸残基を持たない、請求項３８に記載の組成物。
  54. 少なくともおよそ２％のアフコシル化抗体を含む、請求項３８に記載の組成物。
  55. 少なくともおよそ４％のアフコシル化抗体を含む、請求項３８に記載の組成物。
  56. 少なくともおよそ１０％のアフコシル化抗体を含む、請求項３８に記載の組成物。
  57. 少なくともおよそ１９％のアフコシル化抗体を含む、請求項３８に記載の組成物。
  58. 少なくともおよそ１００％のアフコシル化抗体を含む、請求項３８に記載の組成物。
  59. 請求項１から３７の何れか一に記載の抗体を特異的に結合する抗イディオタイプ抗体。
  60. 請求項１から３７の何れか一に記載の抗体と担体を含む組成物。
  61. 抗ＬＴα抗体が第一医薬である場合に、第二医薬をさらに含む、請求項６０に記載の組成物。
  62. 第二医薬が、免疫抑制剤、Ｂ細胞表面マーカーを結合するアンタゴニスト、ＢＡＦＦアンタゴニスト、疾患修飾性抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)、インテグリンアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症性剤(ＮＳＡＩＤ)、サイトカインアンタゴニスト、又はこれらの組み合わせである、請求項６１に記載の組成物。
  63. ２００６年４月１９日に寄託番号ＰＴＡ−７５３８でアメリカ培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマ。
  64. 請求項６３に記載のハイブリドーマによって分泌される抗体。
  65. 請求項１から３７の何れか一に記載の抗体をコードする単離された核酸。
  66. 請求項６５に記載の核酸を含む発現ベクター。
  67. 請求項６５に記載の核酸を含む宿主細胞。
  68. 抗体を生産するための条件下で請求項６７に記載の宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む、抗体の製造方法。
  69. リンホトキシンα活性化細胞増殖を阻害する方法であって、請求項１から３７の何れか一に記載の抗体の有効量を細胞又は組織と接触させることを含む方法。
  70. 請求項１から３７の何れか一に記載の抗体の有効量を被検体に投与することを含む、被検体の自己免疫性疾患の治療方法。
  71. 自己免疫性疾患が、関節リウマチ、狼瘡、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少、多発性硬化症(ＭＳ)、乾癬、ＩｇＡネフロパシー、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ヘリコバクターピロリ胃炎および慢性Ｃ型肝炎からなる基から選択される、請求項７０に記載の方法。
  72. 自己免疫性疾患が、関節リウマチ、ＭＳ、シェーグレン症候群、狼瘡、重症筋無力症又はＩＢＤである、請求項７１に記載の方法。
  73. 自己免疫性疾患が、関節リウマチ、ＩＢＤ、狼瘡又はＭＳである、請求項７２に記載の方法。
  74. 狼瘡が全身性エリテマトーデス又はループス腎炎であり、ＩＢＤがクローン病又は潰瘍性大腸炎である、請求項７３に記載の方法。
  75. 抗ＬＴα抗体が第一医薬である場合に、第二医薬が有効量で投与される、請求項７０から７４の何れか一に記載の方法。
  76. 第二医薬が複数の医薬である、請求項７５に記載の方法。
  77. 第二医薬が、免疫抑制剤、Ｂ細胞表面マーカーを結合するアンタゴニスト、ＢＡＦＦアンタゴニスト、疾患修飾性抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)、インテグリンアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症性剤(ＮＳＡＩＤ)、サイトカインアンタゴニスト、又はこれらの組み合わせである、請求項７５又は７６に記載の方法。
  78. 第二医薬がＤＭＡＲＤ又はメトトレキセートである、請求項７７に記載の方法。
  79. 被検体が疾患のための医薬によって以前に治療されたことがない、請求項７０から７８の何れか一に記載の方法。
  80. 被検体がＴＮＦアンタゴニストによって以前に治療されたことがない、請求項７９に記載の方法。
  81. 被検体が疾患のための医薬によって以前に治療されたことがある、請求項７０から７８の何れか一に記載の方法。
  82. 被検体がＴＮＦアンタゴニスト又はＤＭＡＲＤによって以前に治療されたことがある、請求項８１に記載の方法。
  83. 抗体がネイキッド抗体である、請求項７０から８２の何れか一に記載の方法。
  84. 抗体が他の分子とコンジュゲートしている、請求項７０から８２の何れか一に記載の方法。
  85. 他の分子が細胞障害性剤である、請求項８４に記載の方法。
  86. 抗体が静脈内投与される、請求項７０から８５の何れか一に記載の方法。
  87. 抗体が皮下投与される、請求項７０から８５の何れか一に記載の方法。
  88. 被検体が関節リウマチを有しており、抗体が被検体において主要な臨床効果を引き起こすものである、請求項７０から８７の何れか一に記載の方法。
  89. 被検体が、一又は複数の調節性サイトカイン、抗核抗体(ＡＮＡ)、抗リウマチ因子(ＲＦ)抗体、クレアチニン、血中尿素窒素、抗内皮性抗体、抗好中球細胞質抗体(ＡＮＣＡ)、浸潤性ＣＤ２０細胞、抗二本鎖ＤＮＡ(ｄｓＤＮＡ)抗体、抗Ｓｍ抗体、抗核リボ核タンパク質抗体、抗リン脂質抗体、抗リボソームＰ抗体、抗Ｒｏ／ＳＳ−Ａ抗体、抗Ｒｏ抗体、抗Ｌａ抗体、シェーグレン関連抗原Ａ又はＢに対する抗体(ＳＳ−Ａ又はＳＳ−Ｂ)、セントロメアプロテインＢ(ＣＥＮＰ Ｂ)又はセントロメアプロテインＣ(ＣＥＮＰ Ｃ)に対する抗体、ＩＣＡ６９に対する自己抗体、抗スミス抗原(Ｓｍ)抗体、抗核リボ核タンパク質抗体、抗リボソームＰ抗体、好中球の核又は核周囲領域を染色する自己抗体(ｐＡＮＣＡ)、抗酵母抗体、ＧＭ１ガングリオシド又はＧＱ１ｂガングリオシドに対する交差反応性抗体、抗アセチルコリンレセプター(ＡｃｈＲ)抗体、抗ＡｃｈＲサブタイプ抗体ないし抗筋特異的チロシンキナーゼ(ＭｕＳＫ)抗体、血清抗内皮細胞抗体、ＩｇＧ又は抗デスモグレイン(Ｄｓｇ)抗体、抗セントロメア抗体、抗トポイソメラーゼ−１(Ｓｃｌ−７０)抗体、抗ＲＮＡポリメラーゼ抗体ないし抗Ｕ３-リボヌクレオタンパク質(Ｕ３-ＲＮＰ)抗体、抗糸球体基底膜(ＧＢＭ)抗体、抗糸球体基底膜(ＧＢＭ)抗体、抗ミトコンドリア(ＡＭＡ)ないし抗ミトコンドリアＭ２抗体、抗甲状腺ペルオキシダーゼ(ＴＰＯ)抗体、抗チログロビン(ＴＧ)抗体又は抗甲状腺刺激性ホルモンレセプター(ＴＳＨＲ)抗体、抗核(ＡＮ)抗体、抗アクチン(ＡＡ)抗体ないし抗平滑筋抗原(ＡＳＭ)抗体、ＩｇＡ抗筋内膜抗体、ＩｇＡ抗組織トランスグルタミナーゼ抗体、ＩｇＡ抗グリアジン抗体ないしＩｇＧ抗グリアジン抗体、抗ＣＹＰ２１Ａ２抗体、抗ＣＹＰ１１Ａ１ないし抗ＣＹＰ１７抗体、抗リボヌクレオタンパク質(ＲＮＰ)抗体ないしｍｙｏｓｙｔｉｓ-特異的抗体、抗ミエリン関連糖タンパク質(ＭＡＧ)抗体、抗Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)抗体、抗ＧＭ１ガングリオシド、抗硫酸塩-３-グリクロニル パラグロボシド(ＳＧＰＧ)抗体ないしＩｇＭ抗グリココンジュゲート抗体、ＩｇＭ抗ガングリオシド抗体、抗甲状腺ペルオキシダーゼ(ＴＰＯ)抗体、抗チログロビン(ＴＧ)抗体ないし抗甲状腺刺激性ホルモンレセプター(ＴＳＨＲ)抗体、抗ミエリン塩基性タンパク質抗体ないし抗ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体、ＩｇＧのＦｃ部分に対するＩｇＭリウマチ因子抗体、抗第ＶＩＩＩ因子抗体、又はこれらの組み合わせを異常なレベルで有する、請求項７０から８８の何れか一に記載の方法。
  90. 抗体が隔週でおよそ１回だけ投与される、請求項７０から８９の何れか一に記載の方法。
  91. 抗体が１か月におよそ１回投与される、請求項９０に記載の方法。
  92. 容器と、該容器に内包される組成物と、該組成物が自己免疫性疾患を治療するために用いられ得ることを示すパッケージ挿入物とを具備し、このとき該組成物が請求項１から３７の何れか一に記載の抗体を含むものである、製造品。
  93. さらに、抗体が第一医薬である場合に、第二医薬を内包する容器を具備し、さらに、第二医薬によって被検体を治療することについてのパッケージ挿入物への指示を具備する、請求項９２に記載の製造品。
  94. 第二医薬が、免疫抑制剤、Ｂ細胞表面マーカーを結合するアンタゴニスト、ＢＡＦＦアンタゴニスト、疾患修飾性抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)、インテグリンアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症性剤(ＮＳＡＩＤ)、サイトカインアンタゴニスト、又はこれらの組み合わせである、請求項９３に記載の製造品。
  95. 標的視聴者に、自己免疫性疾患を表している患者ないし患者集団を治療するために請求項１から３７の何れか一に記載の抗体又はその薬学的に許容される組成物の使用を促すことを含む、請求項１から３７の何れか一に記載の抗体又はその薬学的に許容される組成物を公示する方法。
  96. 自己免疫性疾患が、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症又は炎症性腸疾患である、請求項９５に記載の方法。
  97. 請求項１から３７の何れか一に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物と、該抗体ないし薬学的組成物が自己免疫性疾患を持つ患者の治療に適応されることを記載しているラベルとを共に包装されて具備する製造品。
  98. 自己免疫性疾患が、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症又は炎症性腸疾患である、請求項９７に記載の製造品。
  99. さらに、抗体が第一医薬である場合に、第二医薬を内包する容器を具備し、さらに、有効量の第二医薬によって患者を治療することについてのパッケージ挿入物への指示を具備する、請求項９７又は９８に記載の製造品。
  100. 第二医薬がＤＭＡＲＤ又はメトトレキセートである、請求項９９に記載の製造品。
  101. 請求項１から３７の何れか一に記載の抗体又は該抗体の薬学的組成物と、該抗体ないし薬学的組成物が自己免疫性疾患を示す患者の治療に適応されることを記載しているラベルとを一つのパッケージに入れることを含む、請求項１から３７の何れか一に記載の抗体又は該抗体の薬学的組成物のパッケージ方法。
  102. 自己免疫性疾患が、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症又は炎症性腸疾患である、請求項１０１に記載の方法。
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