JP2009524832A - 検体を定量するためのデバイスおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
関連出願の相互参照
本願は2006年1月25日の米国仮特許出願第60/762,008号および2006年10月20日出願の米国仮特許出願第60/862,422号に対する優先権を主張する。これらの仮特許出願の内容は、それらが完全に本明細書中に示されるように、参照により組み入れられる。
本発明は、例えば蛍光ベースのアッセイ、吸光度ベースのアッセイまたは光散乱アッセイを使用することを特徴とする、試料中の検体(analyte)の量を測定するためのデバイスおよび方法に関する。
検体の読み取りを実施するために使用する従来の蛍光光度計は、通常は、いくつかのタイプの励起フィルターおよび発光フィルターを使用することができる多目的機器として設計され、感度が調整可能になっている場合もあり、その結果、それらは多くの異なるタイプのアッセイ用に構成することができる。Turner BioSystems TBS−380、およびBioRad VersaFluor蛍光光度計は代表的なラボ蛍光光度計の例である。この設計に対する重大な欠点は、使用者が使用すべきフィルターおよび/または光源を選ばなければならないことであり、これでは使用者が、蛍光がどのように作用するかを理解し、それらのアッセイの励起値および発光値を調べ、どのように適切なフィルターセットを選ぶかを理解しなければならず、そして新しいフィルターセットを購入して組み込まなければならない可能性もある。加えて、使用者はしばしば、アッセイを開始する前に反復的なプロセスによって機器の適切な増幅率設定(感度)を決定しなければならない。これらの機器とともに提供される広範な図表から、目的のアッセイを実施するために使用者がその機器を調整することは潜在的に困難であることは明らかである。特に、使用者が1つのタイプのアッセイのみを使用しようとしている場合には、この選択プロセスは、その機器を使用する上での厄介な障害となる。
本発明は、試料中の複数の検体の量を測定するためのデバイスおよび方法に関する。1つの実施形態では、このデバイスは、検体および任意でレポーター分子を有する試料容器を保持するためのレセプタクルと、光検出器と、1つ以上の検体検出部と、機械実行可能な命令を有するコンピュータ・プロセシング・ユニットとを備える。次に、この検体検出部は、所定のピーク波長の光を発光するように構成された、試料を励起するためのエネルギー源、エネルギー源から所定の範囲の波長の光を単離する励起フィルター、および励起された試料から発せられる所定の範囲の波長の光を単離する発光フィルターを備える。このデバイスは、上記検体検出部の各々が、所定の検体の量を測定するように構成されており、上記機械実行可能な命令が、測定すべき検体に対応する適切な検体検出部を選択するように構成されている。
a)所定のピーク波長の光を発するように構成された、試料を励起するためのエネルギー源;
b)上記エネルギー源から所定の範囲の波長の光を単離するように構成された励起フィルター;
c)励起された試料から発せられる所定の範囲の波長の光を単離するように構成された発光フィルター
を備え、上記検体検出部の各々は、所定の検体の量を測定するように構成されており、上記機械実行可能な命令は、測定すべき検体に対応する適切な検体検出部を選択するように構成されている。
a)ブランク試料の蛍光強度(g)を測定することおよび少なくとも1つのハイエンド標品の蛍光強度(v)を測定することを含み、蛍光強度と検体量とを相関させ、かつ所定のシグモイドの次数(n)および曲率(k)を有する蛍光標準曲線を生成するステップ、
b)試料中に検体が存在することを示すことが可能な蛍光部分を含む試料についての蛍光強度(y)を測定するステップ、ならびに
c)上記蛍光標準曲線を使用して、試料における蛍光強度(y)と検体の量とを相関させるステップ
を含む。
(I)y=r(xn/(xn+k))+g
で特徴付けられ、rは式
(II)r=(v−g)((sn+k)/sn)
で決定される補正値であり、(s)はハイエンド標品中の検体の量である。
i)所定のピーク波長の光を発するように構成された、試料を励起するためのエネルギー源、
ii)上記エネルギー源から所定の範囲の波長の光を単離する励起フィルター、
iii)励起された試料から発せられる所定の範囲の波長の光を単離する発光フィルター
を備え、上記検体検出部の各々は、所定の検体の量を測定するように構成されており、上記機械実行可能な命令は、測定すべき検体に対応する適切な検体検出部を選択するようにさらに構成されている。
a)第1のブランク検体試料の蛍光強度(g1)および第2の検体試料の蛍光強度(g2)を測定すること、ならびに第1の検体のための少なくとも1つのハイエンド標品の蛍光強度(v1)および第2の検体のための少なくとも1つのハイエンド標品の蛍光強度(v2)を測定することを含み、蛍光強度と各検体量または相対量とを相関させ、かつ所定のシグモイドの次数(n)および曲率(k)を有する蛍光標準曲線を2つの検体について生成するステップ、
b)試料中に検体が存在することを示すことが可能な蛍光部分を含む試料についての蛍光強度(y1およびy2)を測定するステップ、ならびに
c)上記蛍光標準曲線を使用して、試料における蛍光強度(y1およびy2)と検体の量とを相関させるステップ
を含む。
序論
本発明のデバイスおよび方法は、機器と使用者との間の継ぎ目のない、直観的に認識できる対話を可能にし、そしてその方法が毎日の作業の流れにおいて使用者にとってアクセスのしやすいものにする。本明細書中では、本発明者らは、所定の検体の検出を可能にするように操作可能に接続された検体検出部(ASE)を備える蛍光光度計を開示する。これにより、所定の検体を選択すると、適切なASEが選択される。このようにして、1つの実施形態では、上記デバイスは、特定の検体の検出のために使用しようとするアッセイに対応する適切な検体検出部を、機械実行可能な命令が選択するように構成されている。上記方法は、2つ以上の標品(このうちの1つはゼロまたはブランクの標品である)を測定することによって標準曲線を生成するステップを含む。この標準曲線は、機器が読み取るこのアッセイによって発生したシグナルと試料中の検体の濃度との間の関係を表現する方程式を生成するための特定のアルゴリズムに、標品の値を当てはめることによって生成することができる。このデバイスは、ユーザーインターフェースにより使用者が迅速にアッセイを選択し、標品を挿入し、そして試料を挿入できるように設計することができる。この簡単な入力から、デバイスは自動的に適切な検体検出部およびアルゴリズムを選択し、標準曲線を決定するのに必要な計算を実施し、そして試料に由来するシグナルを標準曲線と比較して、使用者が読み取る値として試料中の検体の量を示すのに必要な計算を実施することができる。加えて、上記デバイスは、標品または試料を保持し、かつ容易に利用できる安価な使い捨てのプラスチックの光学的に透明な微小遠心分離チューブを受けるような構成であってもよい。さらに、上記デバイスは、目的の色素/検体が他の色素/検体の存在下で明瞭にモニタリングできるように、例えば異なる色素で検体を標識化し、次いで特定の波長で励起し、かつ/または特定の波長で発光スペクトルを選別することによって、同一の試料中の複数の検体をモニタリングして定量するために使用することができる。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の組成物またはプロセスステップに限定されないことを理解すべきである。そのようなものは変更し得るものだからである。本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用する場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかにそうではないと指示していない限り、複数の指示対象を包含していることに注意しなければならない。従って、例えば、「1つのレポーター分子」の言及は複数のレポーター分子を含み、「1つの蛍光光度計」の言及は複数の蛍光光度計を含むなどである。
本発明の1つの態様は、検体および任意でレポーター分子を有する試料容器を保持するためのレセプタクル、光検出器、1つ以上の検体検出部、ならびに機械実行可能な命令を有するコンピュータ・プロセシング・ユニットを備えるデバイスを提供する。次いで、この検体検出部は、所定のピーク波長の光を発光するように構成された、試料を励起するためのエネルギー源;上記エネルギー源から所定の範囲の波長の光を単離する励起フィルター;励起された試料から発せられる所定の範囲の波長の光を単離する発光フィルターを備える。上記検体検出部の各々が、所定の検体の量を測定するよう構成され、上記機械実行可能な命令が、測定すべき検体に対応する適切な検体検出部を選択するよう構成されるように、このデバイスは設計されている。
本発明の1つの態様は、レポーター分子を使用して1つ以上の検体の量を測定するためのデバイスを提供する。このデバイスは、検体およびレポーター分子を有する試料容器を保持するためのレセプタクルと、光検出器と、1つ以上の固定された別個の検体検出部(ASE)と、機械実行可能な命令を有するコンピュータ・プロセシング・ユニットとを備えた一体化したユニットである。このASEは、
a)所定のピーク波長の光を発するように構成された、試料を励起するためのエネルギー源、
b)上記エネルギー源から所定の範囲の波長の光を単離するように構成された励起フィルター、
c)励起された試料から発せられる所定の範囲の波長の光を単離するように構成された発光フィルター
を備え、このASEの各々は、所定の検体の量を測定するように構成されており、上記機械実行可能な命令は、測定すべき検体に対応する適切なASEを選択するように構成されている。
a)ブランク試料の蛍光強度(g)を測定することおよび少なくとも1つのハイエンド標品の蛍光強度(v)を測定することを含み、蛍光強度と検体量とを相関させ、かつ所定のシグモイドの次数(n)および曲率(k)を有する蛍光標準曲線を生成するステップ、
b)試料中に検体が存在することを示すことが可能な蛍光部分を含む試料についての蛍光強度(y)を測定するステップ、ならびに
c)上記蛍光標準曲線を使用して、試料における蛍光強度(y)と検体の量とを相関させるステップ
を含む。
(I)y=r(xn/(xn+k))+g
で特徴付けられ、rは式
(II)r=(v−g)((sn+k)/sn)
で決定される補正値であり、(s)はハイエンド標品中の検体の量である。
a)試料をレポーター分子と接触させて、接触した試料を形成するステップ、
b)所定の検体の測定のために、一体化デバイスの試料容器を保持するためのレセプタクル中に光学的に透明な容器を置くことを含む、所定の検体の存在を検出するステップ
を含み、
上記デバイスは、
i)光検出器と、1つ以上の固定された別個の検体検出部(ASE)と、機械実行可能な命令を有するコンピュータ・プロセシング・ユニットとを備え、
このASEは、
所定のピーク波長の光を発するように構成された、試料を励起するためのエネルギー源、
上記エネルギー源から所定の範囲の波長の光を単離するように構成された励起フィルター、
励起された試料から発せられる所定の範囲の波長の光を単離するように構成された発光フィルター
を備え、
上記ASEの各々は、所定の検体の量を測定するように構成されており、かつ
上記機械実行可能な命令は、測定すべき検体に対応する適切なASEを選択するように構成されている。
a)第1のブランク検体試料の蛍光強度(g1)および第2の検体試料の蛍光強度(g2)を測定すること、ならびに第1の検体のための少なくとも1つのハイエンド標品の蛍光強度(v1)および第2の検体のための少なくとも1つのハイエンド標品の蛍光強度(v2)を測定することを含み、蛍光強度と各検体量または相対量とを相関させ、かつ所定のシグモイドの次数(n)および曲率(k)を有する蛍光標準曲線を2つの検体について生成するステップ、
b)試料中に検体が存在することを示すことが可能な蛍光部分を含む試料についての蛍光強度(y1およびy2)を測定するステップ、ならびに
c)上記蛍光標準曲線を使用して、試料における蛍光強度(y1およびy2)と検体の量とを相関させるステップ
を含む。
切断可能なリンカーに結合した標識を含むレセプタクルを備える本明細書中に記載するデバイスを準備するステップであって、この切断可能なリンカーは酵素または切断基質によって切断される、ステップ、
上記酵素または切断基質を含有すると思われる試料をレセプタクルに添加するステップ、
上記切断可能なリンカーに結合したとき、上記標識が占める部位とは別の上記レセプタクルの標的セクションをモニタリングするステップ、ならびに
上記レセプタクルの標的セクション中での標識の存在を検出するステップ
を含む。
CD4診断アッセイにおける最近の進歩によって、全血中の2種の細胞集団を同定し数えることに使用するための2つの簡単な試薬がもたらされた。これは2チャネルを備える蛍光光度計で使用することができる。簡単な分離機構(例えば、手回し式遠心分離機、簡単な細胞濾過器、または電磁ビーズ)を使用すると、その試薬から数えるべき細胞が分離できる。これらの3つの構成要素は、AIDS Diagnostic Platform for Use in Remote Areas(ADPURA)を備える。
a)2つの検出チャネルを有し、その各々がLED、発光フィルター、およびフォトダイオード検出器から構成される蛍光光度計。この蛍光光度計は、ユーザーインターフェースおよびプリント回路基板上のCPU(中央演算処理装置)にデータ解析を有する。この本体は頑丈であり、風、砂、および水に対する耐性を有し、異なるLEDおよび発光フィルター、合理化されたユーザーインターフェースを有し、少ない数のボタンを有していてもよい。加えて、この蛍光光度計は、バッテリー、手回し式、または他の電源で動作させてもよく、必ずしも配電網インフラにプラグを挿入する必要はない。この蛍光光度計は1つの目的についてのみ設計されており、この場合、ユーザーインターフェースは、読み取り値の結果を表現するように簡素化されており、読み取りを実施するために機器を始動させるには1つのボタンだけしか必要としない。あるいは、USB接続を有する「USBメモリ(thumb drive)」を使用して機器にロードすることができる新しいアプリケーションを用いて、複数の診断への応用が実施できる。
b)試薬キット。この試薬キットは、蛍光色素(例えば、Alexa Fluor 488色素)で標識化したCD4抗体およびCD4標識とはスペクトル上異なる蛍光色素(例えば、Alexa Fluor 647色素)で標識されたCD45抗体を含む。これらの抗体は、理想的には、高温条件または低温条件での輸送に対して安定であり、例えば凍結乾燥品、またはアジド化合物の状態である。また、公知の別の抗体安定化技術を用いてもよい。抗体は、適切な濃度で、かつ適切な容器の中に存在するため、技術的な手技を持たない人でも試料中に容易に添加できる。
c)以下の3つの可能な細胞分離プラットフォームのうちの1つ。
a.簡素な磁石を使用して、全細胞集団から、次いで残りのビーズから白血球細胞を分離するための、CD45抗体標識化DynalビーズおよびDetachaBead技術。
b.上清を取り除いて洗浄液を加えるための簡素なプラスチックピペットと組み合わせた、細胞をペレット化するために使用することができる500μLチューブ用の手回し式遠心分離機。この遠心分離機は、市販されている最新の手回し式遠心分離機と原理が類似しているが、500μLプラスチックチューブを使用でき、操作者の安全および試料保全のために密閉でき、最新の卓上型「picofuge」と同様のサイズとなり、そしてフィールド条件に適合するように改変してある。
c.標識化したCD4抗体およびCD45抗体と細胞とを分離するためのフィルター。
d)このプラットフォームへのオプションの付属品としては、安価なプラスチックピペットおよび水精製システム(例えば、キャンプ用品を販売する店舗で見つかるもの)が挙げられる。
e)本発明は、上記細胞標識方法、上記細胞分離方法、および連動して動作する上記蛍光光度計に用いられる、上記構成要素を含むキットをさらに含む。
a.第1に、血液試料を患者から採取し、一般に認められた方法を使用して抗体染色のための準備をする。
b.第2に、この試料を試薬キットの中で抗体と混合する。フルオロフォアで標識したCD4抗体は、CD4+細胞に結合し、フルオロフォアで標識したCD45抗体は、CD45+細胞に結合する。抗体標識化ビーズを分離方法のために使用する場合、これらはこのステップの間に細胞にも結合する。
c.第3に、分離方法を用いて、遊離した標識化抗体を標識化細胞から取り除く。
i.この方法で電磁ビーズを使用する場合、試料からCD4+細胞およびCD45+細胞を取り除くために磁石を使用する。上清は捨てて、ビーズを緩衝液中に再懸濁させる。次いで、例えばDetachaBead技術を使用してこのビーズを取り除く。ビーズを取り出すために磁石を使用し、標識化細胞は上清中に残す。
ii.この方法で遠心分離機を使用する場合、試料を遠心分離機中で回転させて標識化細胞をペレット化する。遊離の標識化抗体を含む上清を捨て、細胞を緩衝液中に再懸濁させる。
iii.この方法でフィルターを使用する場合、試料をそのフィルターに通し、そのフィルターで標識化細胞を捕捉する。濾液を捨て、標識化細胞を緩衝液中に再懸濁させる。
d.第4に、蛍光光度計を使用して試料を読み取る。ステップcからの標識化細胞を500μLの透明なPCRチューブに移し、蛍光光度計中で読み取る。蛍光光度計は両方のチャネルで自動的に読み取り、計算を行って、この試験についての標準的な用語を使用して、LCD上または類似のスクリーン上に値をCD4+カウントとして表現する。
別の実施形態では、この機器は、拡散または能動的混合により、その機器の光路の外側のゾーンから光路内のゾーンへのレポーターの切断を測定してもよい。図4は機器の内部にあるチューブ(306)を示す。切断可能な基質(301)に結合したレポーター要素(302)は、チューブの底に結合されている。いったん基質が切断されると、レポーター要素は自由に(303)チューブの内部を機器(304)の光路(300)内へと移動し、そこでレポーター要素が検出される(305)。
a.別の実施形態では、コンピュータ上で「オフライン」のエンドユーザーが機械実行可能な命令を作成してもよい。この場合、エンドユーザーが、アッセイの名前、適切なASE、関連する較正用試料の値および数、カーブフィッティングアルゴリズム、およびディスプレイ表示された出力のフォーマットを決定して設定し、その後接続ケーブルを介して機器に「アップロード」する。
b.ひとたび機器に「アップロード」すると、この新しいプログラムは機器上で常に選択できるオプションとなる。
全細胞計数のための色素:SYTO9、11−18、20−25、および59−64、BC、TOTO−3、TO−PRO−3、DRAQ−5、DiI、DiO、WGA−546、FM1−43、Calcein AM。
a.液体標品である高濃度較正点の混合試料を模倣することを意図している。例えば、Quant−iT DNA High Sensitivity Assayにおいて、高濃度標品はPicoGreen色素を加えた100ng ラムダDNA(最終濃度0.7μM;最終体積200μL TE)である。
b.機器(例えば、本明細書中に記載する蛍光光度計)上で相対的蛍光値を読み取る。例えば、Quant−iT DNA High Sensitivity Assayでは、460nm励起源を使用して読み取る。
c.濃い安定な蛍光化合物を希釈溶液に段階的に加える。例えば、Quant−iT DNA High Sensitivity Assayでは、濃フルオレセイン(0.1Mホウ酸ナトリウム pH9の緩衝液中、10mM)を、デバイス中の蛍光シグナルがステップbで得られるシグナル(約100nMのフルオレセイン濃度)に等しくなるまで0.1Mホウ酸ナトリウム pH9の緩衝液に加える。
d.これまでに行ったすべての実験について、フルオレセイン溶液を高濃度標品で置き換える。例えば、Quant−iT DNA High Sensitivity Assayでは、100nMフルオレセイン較正用試料を100ng DNAとPicoGreenとを含む較正用試料に置き換える。
(I)y=r(xn/(xn+k))+g
で特徴付けられ、(r)は式
(II)r=(v−g)((sn+k)/sn)
で決定される補正値であり、(s)はハイエンド標品中の検体の量である。
(IV)k=[sntn(d−1)]/[sn−(tnd)]
値dは補正値であって、バックグラウンド補正した2つのブランクでない標品の蛍光値の比に等しく、以下の式Vを使用してdについて解く。
(V)d=(v−g)/(w−g)
a)第1のブランク検体試料の蛍光強度(g1)および第2の検体試料の蛍光強度(g2)を測定すること、ならびに第1の検体のための少なくとも1つのハイエンド標品の蛍光強度(v1)および第2の検体のための少なくとも1つのハイエンド標品の蛍光強度(v2)を測定することを含み、蛍光強度と各検体量または相対量とを相関させ、かつ所定のシグモイドの次数(n)および曲率(k)を有する蛍光標準曲線を2つの検体について生成するステップ、
b)試料中に検体が存在することを示すことが可能な蛍光部分を含む試料についての蛍光強度(y1およびy2)を測定するステップ、ならびに
c)蛍光標準曲線を使用して、試料における蛍光強度(y1およびy2)と検体の量とを相関させるステップ
を含む。
実施例1:RNA濃度の分析
式Iを使用して、試料中のRNAの濃度を定量する:
y=r(xn/(xn+k))+g
式中、(r)は式(II)r=(v−g)((sn+k)/sn)により決定される補正値である。値(y)は、未知濃度の検体を含む試料の蛍光強度である。ハイエンド標品は500ng/mlの濃度を有し、その濃度の値を(s)とする。シグモイドの次数(n)を1.10の値に設定し、曲率(k)を2350に設定する。ブランクの蛍光強度(g)は、22.16相対蛍光単位(RFU)であり、ハイエンド標品の蛍光強度(v)は543.97RFUである。これらの値を式IIで使用して、rについて解くと、rは1839.20である。
(III)x=|(k(y−g))/(r−(y−g)|1/n
上記の式I、II、およびIIを使用して、低レベルのDNAの濃度も評価することができる。この実施例では、(n)を1.00に設定し、(k)を9999999に設定する。ブランクは7.61RFUの蛍光値(g)を有し、ハイエンド標品は3020.30RFUの蛍光値(v)を有する。ハイエンド標品(s)は500ng/mlの濃度を有する。式IIでこれらの値を使用して、補正値(r)を60256806.66と決定する。
上記の式I、II、およびIIを使用して、DNAの濃度も評価することができる。この実施例では、(n)を1.00に設定し、(k)を22.5に設定する。ブランクは25.36RFUの蛍光値(g)を有し、ハイエンド標品は2213.20RFUの蛍光値(v)を有する。ハイエンド標品(s)は5μg/mlの濃度を有する。式IIでこれらの値を使用して、補正値(r)を12033.12と決定する。
上記の式I、II、およびIIIを使用して、タンパク質の濃度も評価することができる。タンパク質濃度を評価する場合、上の場合のような2つの標品よりはむしろ3つの標品を使用することが望ましい場合がある。
(IV)k=[sntn(d−1)]/[sn−(tn*d)]
式中、dは補正値であり、2つのブランクでないバックグラウンド補正した標品の蛍光値の比に等しい。dは式Vによって決定される。
(V)d=(v−g)/(w−g)
PicoGreen色素を特定の緩衝液に希釈し、0.7μMの作業用色素溶液を調製する。180〜199μLの作業用色素溶液を、本明細書中に記載する500μLの透明なプラスチックPCRチューブに加える。このチューブのうちの2つを、このアッセイについて機器を較正するために標品として使用する。10μLのTE溶液(10mM Tris、1mM EDTA)を、「ゼロ」として一方のチューブに加える。10ng/μLのラムダDNAのTE溶液10μLを第2のチューブに加え、ハイエンド標品とする。残りのチューブに、各チューブで最終濃度が200μLになるように1〜20μLの未知試料を加える。これらのチューブの各々を、ボルテックスミキサーを用いるかまたはそれらのチューブを反転させるかして混合し、次いで室温で2分間インキュベーションする。このアッセイチューブ中のDNAの量を決定するために、使用者は蛍光光度計に組み込まれたファームウェアを使用する「Quant−iT DNA HS」アッセイを選択し、そして直ちに蛍光光度計に標品1(上で説明したゼロ標品)、標品2(上で説明したハイエンド標品)を読み取らせ、次いで任意の数の試料を読み取らせる。2つの標品を使用して、この機器は、実施例2で説明した式を使用して試料チューブ中のDNAの濃度を決定する。アッセイチューブの溶液中のDNAの濃度を蛍光光度計の画面に表示する。オプションがファームウェアの中には含まれており、1、2、3、4、5、10、15、または20μLのどの量の試料を試料チューブに加えるかの選択を使用者に問うことによって希釈計算を実施する。そのときは、元の試料チューブのDNAの濃度を蛍光光度計の画面に表示する。これらのデータのすべてを、本明細書中に記載する互換性のあるポートおよびデータロギングソフトウェアを使用してコンピュータに同時に転送することができる。
HiQuant色素を特定の緩衝液に希釈し、2μMの作業用色素溶液を調製する。180〜199μLのこの作業用色素溶液を、本明細書中に記載する500μLの透明なプラスチックPCRチューブに加える。このチューブのうちの2つを、このアッセイについて機器を較正するために標品として使用する。10μLのTE溶液(10mM Tris、1mM EDTA)を、「ゼロ」として一方のチューブに加える。100ng/μLのラムダDNAのTE溶液10μLを第2のチューブに加え、ハイエンド標品として供する。残りのチューブに、各チューブで最終濃度が200μLになるように1〜20μLの未知試料を加える。これらのチューブの各々を、ボルテックスミキサーを用いるかまたはそれらのチューブを反転させるかして混合し、次いで室温で2分間インキュベーションする。このアッセイチューブ中のDNAの量を決定するために、使用者は蛍光光度計に組み込まれたファームウェアを使用する「Quant−iT DNA BR」アッセイを選択し、そして直ちに蛍光光度計に標品1(上で説明したゼロ標品)、標品2(上で説明したハイエンド標品)を読み取らせ、次いで任意の数の試料を読み取らせる。2つの標品を使用して、この機器は、実施例3で説明した式を使用して試料チューブ中のDNAの濃度を決定する。アッセイチューブの溶液中のDNAの濃度を蛍光光度計の画面に表示する。オプションがファームウェアの中には含まれており、1、2、3、4、5、10、15、または20μLのどの量の試料を試料チューブに加えるかの選択を使用者に問うことによって希釈計算を実施する。そのときは、元の試料チューブのDNAの濃度を蛍光光度計の画面に表示する。これらのデータのすべてを、本明細書中に記載する互換性のあるポートおよびデータロギングソフトウェアを使用してコンピュータに同時に転送することができる。
RiboRed色素を特定の緩衝液に希釈し、0.04μMの作業用色素溶液を調製する。180〜199μLのこの作業用色素溶液を、本明細書中に記載する500μLの透明なプラスチックPCRチューブに加える。このチューブのうちの2つを、このアッセイについて機器を較正するために標品として使用する。10μLのTE溶液(10mM Tris、1mM EDTA)を、「ゼロ」として一方のチューブに加える。10ng/μLのリボソームRNAのTE溶液10μLを第2のチューブに加え、ハイエンド標品として供する。残りのチューブに、各チューブで最終濃度が200μLになるように1〜20μLの未知試料を加える。これらのチューブの各々を、ボルテックスミキサーを用いるかまたはそれらのチューブを反転させるかして混合し、次いで室温で2分間インキュベーションする。このアッセイチューブ中のRNAの量を決定するために、使用者は蛍光光度計に組み込まれたファームウェアを使用する「Quant−iT RNA」アッセイを選択し、そして直ちに蛍光光度計に標品1(上で説明したゼロ標品)、標品2(上で説明したハイエンド標品)を読み取らせ、次いで任意の数の試料を読み取らせる。2つの標品を使用して、この機器は、実施例2で説明した式を使用して試料チューブ中のRNAの濃度を決定する。アッセイチューブの溶液中のRNAの濃度を蛍光光度計の画面に表示する。オプションがファームウェアの中には含まれており、1、2、3、4、5、10、15、または20μLのどの量の試料を試料チューブに加えるかの選択を使用者に問うことによって希釈計算を実施する。そのときは、元の試料チューブのRNAの濃度を蛍光光度計の画面に表示する。これらのデータのすべてを、本明細書中に記載する互換性のあるポートおよびデータロギングソフトウェアを使用してコンピュータに同時に転送することができる。
NanoOrange色素を特定の緩衝液に希釈し、4μMの作業用色素溶液を調製する。180〜199μLのこの作業用色素溶液を、本明細書中に記載する500μLの透明なプラスチックPCRチューブに加える。このチューブのうちの3つを、このアッセイについて機器を較正するために標品として使用する。10μLのTE溶液(10mM Tris、1mM EDTA)を、「ゼロ」として一方のチューブに加える。200ng/μLのBSAのTE溶液10μLを第2のチューブに加え、中間域の標品とする。400ng/μLのBSAのTE溶液10μLを第3のチューブに加え、ハイエンド標品として供する。残りのチューブに、各チューブで最終濃度が200μLになるように1〜20μLの未知試料を加える。これらのチューブの各々を、ボルテックスミキサーを用いるかまたはそれらのチューブを反転させるかして混合し、次いで室温で15分間インキュベーションする。このアッセイチューブ中のタンパク質の量を決定するために、使用者は蛍光光度計に組み込まれたファームウェアを使用する「Quant−iT Protein」アッセイを選択し、そして直ちに蛍光光度計に標品1(上で説明したゼロ標品)、標品2(上で説明した中間域の標品)、標品3(上で説明したハイエンド標品)を読み取らせ、次いで任意の数の試料を読み取らせる。3つの標品を使用して、この機器は、実施例4で説明した式を使用して試料チューブ中のタンパク質の濃度を決定する。アッセイチューブの溶液中のタンパク質の濃度を蛍光光度計の画面に表示する。オプションがファームウェアの中には含まれており、1、2、3、4、5、10、15、または20μLのどの量の試料を試料チューブに加えるかの選択を使用者に問うことによって希釈計算を実施する。そのときは、元の試料チューブのタンパク質の濃度を蛍光光度計の画面に表示する。これらのデータのすべてを、本明細書中に記載する互換性のあるポートおよびデータロギングソフトウェアを使用してコンピュータに同時に転送することができる。
SYTO9色素を特定の緩衝液に希釈し、0.02mMの作業用色素溶液を調製する。180〜199μLのこの作業用色素溶液を、本明細書中に記載する500μLの透明なプラスチックPCRチューブに加える。このチューブのうちの2つを、このアッセイについて機器を較正するために標品として使用する。200μLの水の溶液を、「ゼロ」として一方のチューブに加える。0.1Mホウ酸ナトリウム(pH9の緩衝液)中の100nMフルオレセイン溶液200μLを第2のチューブに加え、ハイエンド標品とする。残りのチューブに、各チューブで最終濃度が200μLになるように1〜20μLの未知試料を加える。これらのチューブの各々を、ボルテックスミキサーを用いるかまたはそれらのチューブを反転させるかして混合し、次いで室温で5分間インキュベーションする。このアッセイチューブ中の細胞の量を決定するために、使用者は蛍光光度計に組み込まれたファームウェアを使用する「Quant−iT Cell Count」アッセイを選択し、そして直ちに蛍光光度計に標品1(上で説明したゼロ標品)、標品2(上で説明したハイエンド標品)を読み取らせ、次いで任意の数の試料を読み取らせる。2つの標品を使用して、この機器は、本明細書中で説明した式(式I〜Vを参照のこと)を使用して試料チューブ中のタンパク質の濃度を決定する。アッセイチューブの溶液中の細胞の濃度を蛍光光度計の画面に表示する。オプションがファームウェアの中には含まれており、1、2、3、4、5、10、15、または20μLのどの量の試料を試料チューブに加えるかの選択を使用者に問うことによって希釈計算を実施する。そのときは、元の試料チューブの細胞の濃度を蛍光光度計の画面に表示する。これらのデータのすべてを、本明細書中に記載する互換性のあるポートおよびデータロギングソフトウェアを使用してコンピュータに同時に転送することができる。
SYTO9色素およびSYTOX Red色素を特定の緩衝液に希釈し、各色素の0.02mMの作業用色素溶液を調製する。180〜199μLのこの作業用色素溶液を、本明細書中に記載する500μLの透明なプラスチックPCRチューブに加える。このチューブのうちの2つを、このアッセイについて機器を較正するために標品として使用する。200μLの水の溶液を、「ゼロ」として一方のチューブに加える。0.1Mホウ酸ナトリウム(pH9の緩衝液)中の100nMフルオレセイン色素および100nM Alexa Fluor 647色素の溶液200μLを第2のチューブに加え、ハイエンド標品とする。残りのチューブに、各チューブで最終濃度が200μLになるように1〜20μLの未知試料を加える。これらのチューブの各々を、ボルテックスミキサーを用いるかまたはそれらのチューブを反転させるかして混合し、次いで室温で5分間インキュベーションする。このアッセイチューブ中の生細胞および死細胞の量を決定するために、使用者は蛍光光度計に組み込まれたファームウェアを使用する「Quant−iT Live/Dead」アッセイを選択し、そして本明細書中の段落[0031]に記載したように「青色」チャネル(励起/発光:460nm/520nm)および濃赤色チャネル(励起/発光:630nm/650nm)の両方を使用して、直ちに蛍光光度計に標品1(上で説明したゼロ標品)、標品2(上で説明したハイエンド標品)を読み取らせ、次いで任意の数の試料を読み取らせる。2つの標品を使用して、この機器は、本明細書中で説明した式を使用して、試料チューブ中の全細胞および死細胞の相対濃度を決定する。これら2つの比を蛍光光度計の画面に表示する。これらのデータのすべてを、本明細書中に記載する互換性のあるポートおよびデータロギングソフトウェアを使用してコンピュータに同時に転送することができる。
SYTO61色素を特定の緩衝液に希釈し、0.02mMの作業用色素溶液を調製する。180〜199μLのこの作業用色素溶液を、段落[0016]に記載する500μLの透明なプラスチックPCRチューブに加える。このチューブのうちの2つを、このアッセイについて機器を較正するために標品として使用する。200μLの水の溶液を、「ゼロ」として一方のチューブに加える。0.1Mホウ酸ナトリウム(pH9の緩衝液)中の100nMフルオレセイン色素および100nM Alexa Fluor 647色素の溶液200μLを第2のチューブに加え、ハイエンド標品とする。残りのチューブに、各チューブで最終濃度が200μLになるように1〜20μLの未知試料を加える。これらのチューブの各々を、ボルテックスミキサーを用いるかまたはそれらのチューブを反転させるかして混合し、次いで室温で5分間インキュベーションする。このアッセイチューブ中の細胞の量を決定するために、使用者は蛍光光度計に組み込まれたファームウェアを使用する「Quant−iT GFP」アッセイを選択し、そして本明細書中の段落[0031]に記載したように「青色」チャネル(励起/発光:460nm/520nm)および濃赤色チャネル(励起/発光:630nm/650nm)の両方を使用して、直ちに蛍光光度計に標品1(上で説明したゼロ標品)、標品2(上で説明したハイエンド標品)を読み取らせ、次いで任意の数の試料を読み取らせる。2つの標品およびSYTO61に由来するシグナルを使用して、この機器は、段落[0066]で説明した式を使用して試料チューブ中の細胞の濃度を決定する。2つの標品および「青色」チャネルからのシグナルを使用して、この機器は、段落[0066]で説明した式を使用して試料チューブ中のGFPの濃度を決定する。アッセイチューブの溶液中の細胞濃度に対するGFP濃度の比を蛍光光度計の画面に表示する。これらのデータのすべてを、本明細書中に記載する互換性のあるポートおよびデータロギングソフトウェアを使用してコンピュータに同時に転送することができる。
500μLの透明なプラスチックチューブの底に結合しているペプチドの片方の末端に、GFPを共有結合させる。180〜199μLのこの作業用溶液を、本明細書中に記載する500μLの透明なプラスチックPCRチューブに加える。このチューブのうちの2つを、このアッセイについて機器を較正するために標品として使用する。200μLの水の溶液を、「ゼロ」として一方のチューブに加える。0.1Mホウ酸ナトリウム(pH9の緩衝液)中の100nMフルオレセイン溶液200μLを第2のチューブに加え、ハイエンド標品とする。残りのチューブに、各チューブで最終濃度が200μLになるように1〜20μLの未知試料を加える。これらのチューブの各々をボルテックスミキサーを用いるか、またはそれらのチューブを反転させるかして混合し、次いで室温で5分間インキュベーションする。このアッセイチューブ中のマイコプラズマ汚染の存在を決定するために、使用者は蛍光光度計に組み込まれたファームウェアを使用する「Quant−iT Mycoplasma」アッセイを選択し、そして直ちに蛍光光度計に標品1(上で説明したゼロ標品)、標品2(上で説明したハイエンド標品)を読み取らせ、次いで任意の数の試料を読み取らせる。2つの標品を使用して、この機器は、本明細書中で説明した式を使用して試料チューブ中のマイコプラズマの濃度を決定する。アッセイチューブの溶液中のマイコプラズマの濃度を蛍光光度計の画面に表示する。オプションがファームウェアの中には含まれており、1、2、3、4、5、10、15、または20μLのどの量の試料を試料チューブに加えるかの選択を使用者に問うことによって希釈計算を実施する。そのときは、元の試料のマイコプラズマの濃度を蛍光光度計の画面に表示する。これらのデータのすべてを、本明細書中に記載する互換性のあるポートおよびデータロギングソフトウェアを使用してコンピュータに同時に転送することができる。
2mLの黄色ブドウ球菌(S.aureus)を微小遠心分離チューブに採取し、ペレット化する。1つのチューブを70% IPA(イソプロピルアルコール)を用いて、室温で〜30分間処理して細胞を破壊し、次いで2回洗浄/回転した。ペレットを再懸濁し、0.85% NaCl 10mLに移した。試験液を表1に示した比で調製し、適切な染色剤(0.3μLの3.35mM SYTO9および/または1μLの1mM SYTOX Red)を加える。溶液を室温で15分間インキュベーションし、200μLをPCRチューブに移して分析する。
青色励起 − 生細胞:死細胞の比が小さくなるにつれて、SYTO9はほとんどシグナルの変化を示さない。SYTOX Redは460nmでの励起によっては最適には励起されない(図5Aを参照のこと)。
真核細胞株(Jurkat、MRC5、U2OS、3T3、BPAE、COS、HeLa、CHO−K1)を採取し、細胞濃度を数え、Coulter Counterを使用して等しく(1×106細胞/mL)設定する。1mLの細胞を、室温で15分間SYTO9と混合する(最終濃度1μM)。200μLの溶液をPCRチューブに移して、460nm励起を使用して読み取る。
460nm励起 − SYTO9は試験したすべての真核細胞株について、バックグラウンドを上回る有意な蛍光応答を示す(図6を参照のこと)。
Claims (20)
- 検体(analyte)を有する試料容器を保持するためのレセプタクルと、
光検知器と、
a)所定のピーク波長の光を発するように構成された、試料を励起するためのエネルギー源、
b)前記エネルギー源から所定の範囲の波長の光を単離するように構成された励起フィルター、
c)励起された試料から発せられる所定の範囲の波長の光を単離するように構成された発光フィルター
を備え、操作可能に接続され、所定の検体の量を測定するように各々が構成された1つ以上の別個の検体検出部(ASE)と、
測定すべき検体に対応する適切なASEを選択するように構成された機械実行可能な命令を有するコンピュータ・プロセシング・ユニットとを備える、
1つ以上の所定の検体の量を測定するためのデバイス。 - 前記エネルギー源が発光ダイオード(LED)である、請求項1に記載のデバイス。
- 前記所定の検体が、DNA、RNA、タンパク質、真核細胞または原核細胞、糖質、脂質、ウイルス、pH、および金属イオンからなる群より選択される、請求項1に記載のデバイス。
- 前記機械実行可能な命令が、励起された試料から発せられた光に基づいて特定の検体の濃度を測定するようにさらに構成されている、請求項1に記載のデバイス。
- ユーザーインターフェースをさらに備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記ユーザーインターフェースがディスプレイおよび非数値キーパッドを備える、請求項5に記載のデバイス。
- 前記試料容器のレセプタクルが、光学的に透明な0.5微小遠心分離チューブに適合するように構成されている、請求項1に記載のデバイス。
- 内部電源をさらに備える、請求項1に記載のデバイス。
- 少なくとも1つのCOMポート(communications port)をさらに備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記COMポートが、ユニバーサルシリアルバス(USB)ポート、オーディオ/ビデオシリアルバス(IEEE1394)ポート、赤外(IR)ポート、および無線周波数(RF)ポートからなる群より選択される、請求項9に記載のデバイス。
- 第1および第2のASEを備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記第1のASEが、約470nmのピーク波長を有する光を発するLED、約490nmよりも長波長の光を除く励起フィルター、ならびに約520nmよりも短波長の光および約580nmよりも長波長の光を除く発光フィルターを備える、請求項11に記載のデバイス。
- 前記第2のASEが、約640nmのピーク波長を有する光を発するLED、約570nmよりも短波長の光および約647nmよりも長波長の光を除く励起フィルター、ならびに約652nmよりも短波長の光を除く発光フィルターを備える、請求項11に記載のデバイス。
- 前記ユーザーインターフェースが、ユーザーが測定のための検体を選択することを可能にするように構成されている、請求項5に記載のデバイス。
- 前記機械実行可能な命令が、ユーザーの入力なしで測定のための検体を選択することが可能である、請求項1に記載のデバイス。
- 長軸の寸法が短軸の寸法よりも大きいという条件で、デバイスの寸法が、短軸方向に約30〜300mm、長軸方向に100〜500mm、可変厚み約10〜100mmである、請求項1に記載のデバイス。
- a)ブランク試料の蛍光強度(g)を測定することおよび少なくとも1つのハイエンド標品(high−end standard)の蛍光強度(v)を測定することを含み、蛍光強度と検体量とを相関させ、かつ所定のシグモイドの次数(degree of sigmoidicity)(n)および曲率(k)を有する蛍光標準曲線を生成するステップ、
b)試料中に検体が存在することを示すことが可能な蛍光部分を含む試料についての蛍光強度(y)を測定するステップ、ならびに
c)前記蛍光標準曲線を使用して、試料における蛍光強度(y)と検体の量とを相関させるステップ
を含む、光学的に透明な試料容器中で検体の量を計算する方法。 - 前記曲線が式
(I)y=r(xn/(xn+k))+g
で特徴付けられ、
rが式
(II)r=(v−g)((sn+k)/sn)
で決定される補正値であり、
(s)がハイエンド標品中の検体の量である、
請求項17に記載の方法。 - a)試料をレポーター分子と接触させて、接触した試料を形成するステップ、
b)所定の検体の測定のために、一体化デバイスの試料容器を保持するためのレセプタクル中に光学的に透明な容器を置くことを含む、所定の検体の存在を検出するステップ
を含み、
前記デバイスが、
i)光検知器、操作可能に接続された1つ以上の別個の検体検出部(ASE)、および機械実行可能な命令を有するコンピュータ・プロセシング・ユニット
をさらに備え、
前記ASEが、
所定のピーク波長の光を発光するように構成された、試料を励起するためのエネルギー源、
前記エネルギー源から所定の範囲の波長の光を単離するように構成された励起フィルター、
励起された試料から発せられる所定の範囲の波長の光を単離するように構成された発光フィルター
を備え、
前記ASEの各々が、所定の検体の量を測定するように構成されており、かつ
前記機械実行可能な命令が、測定すべき検体に対応する適切なASEを選択するように構成されている、
光学的に透明な試料容器中にある試料中の所定の検体の存在を検出するための方法。 - a)第1のブランク検体試料の蛍光強度(g1)および第2の検体試料の蛍光強度(g2)を測定すること、ならびに第1の検体のための少なくとも1つのハイエンド標品の蛍光強度(v1)および第2の検体のための少なくとも1つのハイエンド標品の蛍光強度(v2)を測定することを含み、蛍光強度と各検体量または相対量とを相関させ、かつ所定のシグモイドの次数(n)および曲率(k)を有する蛍光標準曲線を2つの検体について生成するステップ、
b)試料中に検体が存在することを示すことが可能な蛍光部分を含む試料についての蛍光強度(y1およびy2)を測定するステップ、ならびに
c)前記蛍光標準曲線を使用して、試料における蛍光強度(y1およびy2)と検体の量とを相関させるステップ
を含む、試料容器中の2つの検体の比を計算する方法。
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