CN104327844A - 10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针及其应用，与现存荧光素二乙酰脂荧光探针相比较，10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针具有更长的激发和发射波长，因此可以避免活细胞自身荧光干扰。在活细胞中脂酶水解10-去氧碳代荧光素二乙酰脂产生具有强烈的红色荧光的10-去氧碳代荧光素而被识别，死细胞或受损细胞则因其脂酶活性损失而不发出红色荧光。本发明进一步公开了10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针在检测细胞活性、细胞毒性中的应用。

Description

10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测细胞活性的荧光探针及其应用。

背景技术

药物、环境污染、温度、离子应激、放射污染或其他生物调节和潜在的不利因素都会对细胞或机体组织产生损害。细胞活性、细胞毒性测定在评价细胞或组织因上述原因导致的细胞改变时非常重要，细胞膜的完整性被广泛的用于细胞活性测定，保护细胞的细胞膜的丢失导致细胞结构、胞浆物质、细胞离子梯度和膜电位等的丧失，细胞膜完整性的丢失将不可避免的导致细胞死亡。

在细胞膜完整性和细胞活性之间没有等价的量化关系，一般情况下把拥有完整细胞膜的细胞归为“活细胞”，而把因有毒的细胞试剂导致的细胞膜不可逆损伤的细胞归为“死细胞”。当然有些细胞在死去的过程中还拥有细胞膜，这些是“将死细胞”，“将死细胞”实际上不是活细胞，它们不能继续被培养和传代，但是按照通常依赖于观测细胞膜的方法经常把“将死细胞”计为活细胞。

细胞膜失去完整性的一个共同特征是其允许极性小分子（分子量小于2000道尔顿）进出细胞质。细胞膜通透性的改变是很多细胞活性、细胞毒性评价方法的基础。最常用的用于检测细胞活性/细胞毒性的方法是放射性的铬⁵¹(⁵¹Cr)释放和非荧光的台盼蓝有色染料排出。荧光染料比普通有色染料有更高的检测灵敏度，也不需要如放射性元素那样要求有复杂的材料处理过程。可是，现存的荧光素二乙酰脂荧光探针激发和发射波长都很短，容易受到细胞背景荧光干扰。例如，由于GFP（绿色荧光蛋白）的发射光谱与荧光素的发射光谱完全重叠，现存的荧光素二乙酰脂荧光探针不可能被用于测定GFP细胞的活性。然而，由于它们长波长发射本发明的10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针则可被用于检测GFP细胞的活性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种简便快速检测细胞活性的荧光探针。10-去氧碳代荧光素二乙酰脂（I）在中性pH水溶液中有非常好的可溶性和稳定性。10-去氧碳代荧光素二乙酰脂相对无色、没有荧光和具有很小的消光系数，然而,活细胞中脂酶可使10-去氧碳代荧光素二乙酰脂的双脂键断裂释放出10-去氧碳代荧光素（II）使溶液荧光和消光系数急速变强，可达10000倍以上。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种具有如下结构式的荧光探针：

（I）

R₁和R₂分别是H、COOH或COOCH₂OAc。

优选R₁是H；R₂是COOCH₂OAc或COOH。

优选R₁是COOH，或COOCH₂OAc；R₂是H。

本发明进一步公开了荧光探针的合成方法，其特征在于按如下的步骤进行：:

（1）合成带有保护基的蒽酮衍生物；

   

（2）蒽酮衍生物与溴代苯衍生物缩合给出10-去氧碳代荧光素；

 

(3)10-去氧碳代荧光素乙酰化给出10-去氧碳代荧光素二乙酰脂；

 

其中的R₁和R₂分别是H或COOH；

(4)10-去氧碳代荧光素二乙酰脂进一步脂化给出10-去氧碳代荧光素二乙酰脂羧酸脂; 

 

其中的R₁和R₂分别是H或COOCH2OAc。

本发明所述的步骤(2)中蒽酮衍生物与溴代苯衍生物的摩尔比为1比1~1.5，优选为1:1.25。

本发明更进一步公开了荧光探针在制备作为检测细胞活性、细胞毒性荧光探针中的应用。实验的结果表明采用本发明的荧光探针可以达到-降低细胞自身荧光干扰，使检测结果更加准确的目的。

结构（I）无色、无荧光；结构（II）红色、强烈红色荧光。这种无色、无荧光的10-去氧碳代荧光素二乙酰脂是一种具有很好的光谱属性的不发荧光的底物。10-去氧碳代荧光素二乙酰脂具有一个高反应性双脂离去基团。另外活细胞中脂酶与10-去氧碳代荧光素二乙酰脂作用形成的10-去氧碳代荧光素产物（II）具有很好的稳定性。合成10-去氧碳代荧光素二乙酰脂需要经过四个步骤（见图1和图2）。

附图说明

图1. 10-去氧碳代荧光素二乙酰脂羧酸脂合成路线；其中step（1）：DDQ/二氯甲烷-水TBSCl/DMF；step (2): nBuLi/THF；step (3): AcOAc；step (4): BrCH₂OAc/iPr₂NEt/DMF；

图2. 10-去氧碳代荧光素二乙酰脂羧酸脂合成路线；其中step（1）：DDQ/二氯甲烷-水，TBSCl/DMF；step (2): nBuLi/THF；step (3): AcOAc；step (4): BrCH₂OAc/iPr₂NEt/DMF；

图3. 在杜氏磷酸缓冲液中10-去氧碳代荧光素二乙酰脂与脂酶作用引导的水解产物的吸收波长和发射波长图谱(pH =7.2)；

图4. 10-去氧碳代荧光素二乙酰脂测定CHO-K1活细胞数目。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供使用10-去氧碳代荧光素二乙酰脂红色荧光检测细胞活性的方法的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。通过参考以下实施例中的合成一个特定的10-去氧碳代荧光素二乙酰脂羧酸脂可以更容易地理解本发明。在这些例子中，简称“TBS”指的是常用的羟基保护基团（TBS-即叔丁基二甲基硅烷基，本发明所用到杜氏磷酸缓冲液有市售。

实施例1

 

化合物1的合成参照Grimm et al， ACS Chemical Biology 2013 8 (6), 1303-1310。化合物2的合成参照WO 2013029650。

将化合物2 （0.977 g）溶解于10 mL 无水四氢呋喃， 用丙酮-干冰浴冷却至-78 ℃，然后 加入正丁基锂的己烷溶液（1 mL， 2.5 M）。40 分钟后， 滴加入化合物1（1.153 g）在8 mL 四氢呋喃的溶液。反应液缓慢升温至0℃， 在0℃反应30分钟后，加入过量氯化铵饱和溶液停止反应。反应混合物用乙酸乙酯萃取， 有机相用无水硫酸钠干燥， 过滤浓缩得一个淡黄色固体。 

淡黄色固体溶解于35 mL二氧六环， 加入45 mL 6N盐酸， 在90℃的油浴中搅拌加热17小时。 加入水稀释，反应混合物用乙酸乙酯萃取。有机相用无水硫酸钠干燥， 过滤浓缩后加入四氢呋喃溶解。往四氢呋喃溶液中加入24g硅胶，浓缩得一白色固体。用硅胶柱分离（正己烷-乙酸乙酯，从10% 逐渐增加至70%，1% 乙酸作为缓冲剂），得到1.15 g 淡红色固体。 

淡红色固体溶解于6mL吡啶和1.5mL醋酸酐，室温下搅拌3小时后浓缩。加入40mL乙腈和10mL水，室温下搅拌1.5小时后加入乙酸乙酯稀释。用0.5N盐酸洗，有机相用无水硫酸钠干燥， 过滤，加入24g硅胶后浓缩得一白色固体。用硅胶柱分离（正己烷-乙酸乙酯，从10% 逐渐增加至60%,1% 乙酸作为缓冲剂），得到化合物3，1.22 g 白色固体。

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 8.35 (dd, J = 8.1,1.5 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.42 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 6.50 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 2.35 (s, 6H), 1.83 (s, 3H), 1.73 (s, 3H). MS (ESI) [M+H]⁺ 522.9。

 

实施例2

 

化合物3 （104mg）溶解于2 mL二甲基甲酰胺，用冰水浴冷却，加入二异丙基乙基胺（208μL）和乙酸溴甲酯（78 μL）。在室温搅拌1.5小时，加入乙酸乙酯稀释。用0.5N盐酸洗，所得有机相用无水硫酸钠干燥， 过滤浓缩得一白色固体。用硅胶柱分离（正己烷-乙酸乙酯， 从0% 逐渐增加至50%），得到化合物4，30 mg 白色固体。

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 8.35 (dd, J = 8.1,1.5 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.42 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 6.50 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 5.96 (s, 2H), 2.35 (s, 6H), 2.11 (s, 3H), 1.85 (s, 3H), 1.73 (s, 3H). MS (ESI) [M+H]⁺ 595.2。

实施例3

 

化合物1的合成参照Grimm et al， ACS Chemical Biology 2013  8 (6), 1303-1310。化合物5的合成参照WO 2013029650。

将化合物5（0.977 g）溶解于10 mL 无水四氢呋喃， 用丙酮-干冰浴冷却至-78 ℃，然后 加入正丁基锂的己烷溶液（1 mL， 2.5 M）。40 分钟后， 滴加入化合物1（1.153 g）在8 mL 四氢呋喃的溶液。反应液缓慢升温至0℃， 在0°C反应30分钟后， 加入过量氯化铵饱和溶液停止反应。反应混合物用乙酸乙酯萃取， 有机相用无水硫酸钠干燥， 过滤浓缩得一个淡黄色固体。 

淡黄色固体溶解于35 mL二氧六环， 加入45 mL 6N盐酸， 在90°C的油浴中搅拌加热17小时。 加入水稀释，反应混合物用乙酸乙酯萃取。 有机相用无水硫酸钠干燥， 过滤浓缩后加入四氢呋喃溶解。往四氢呋喃溶液中加入24g硅胶，浓缩得一白色固体。用硅胶柱分离（正己烷-乙酸乙酯，从10% 逐渐增加至70%，1% 乙酸作为缓冲剂），得到1.15g 淡红色固体。 

淡红色固体溶解于6mL吡啶和1.5mL醋酸酐，室温下搅拌3小时后浓缩。加入40mL乙腈和10mL水，室温下搅拌1.5小时后加入乙酸乙酯稀释。用0.5N盐酸洗，有机相用无水硫酸钠干燥， 过滤，加入24g硅胶后浓缩得一白色固体。用硅胶柱分离（正己烷-乙酸乙酯，从10% 逐渐增加至60%, 1% 乙酸作为缓冲剂），得到化合物6，1.22 g 白色固体。

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 8.35 (dd, J = 8.1,1.5 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.42 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 6.50 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 2.35 (s, 6H), 1.83 (s, 3H), 1.73 (s, 3H). MS (ESI) [M+H]⁺ 522.9。

实施例4

 

化合物6（104mg）溶解于2 mL二甲基甲酰胺，用冰水浴冷却，加入二异丙基乙基胺（208μL）和乙酸溴甲酯（78 μL）。在室温搅拌1.5小时，加入乙酸乙酯稀释。用0.5N盐酸洗，所得有机相用无水硫酸钠干燥， 过滤浓缩得一白色固体。用硅胶柱分离（正己烷-乙酸乙酯， 从0% 逐渐增加至50%），得到化合物7，30 mg 白色固体。

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 8.35 (dd, J = 8.1,1.5 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.42 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 6.50 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 5.96 (s, 2H), 2.35 (s, 6H), 2.11 (s, 3H), 1.85 (s, 3H), 1.73 (s, 3H). MS (ESI) [M+H]⁺ 595.2。

实施例5

荧光探针应用实施例

10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针检测细胞活性的方法，包括如下步骤：

a) 分别将10-去氧碳代荧光素二乙酰脂储存溶液（10mM）加入杜氏磷酸缓冲液（pH=7.2）得到10μM10-去氧碳代荧光素二乙酰脂工作溶液，所述10-去氧碳代荧光素二乙酰脂溶液的溶剂为乙醇；

b)向100uL浓度为30000 个Hela细胞/100uL样品中加入30μL的10-去氧碳代荧光素二乙酰脂工作溶液，在37^oC, 5%CO₂细胞培养箱中培养60 分钟；

c)用杜氏磷酸缓冲液多次洗涤后用荧光显微镜观测步骤b)所获得的细胞的红色荧光。

结果如图4所示：其荧光强度和细胞数量具有较好的线性相关性。与现存荧光素二乙酰脂荧光探针相比较，10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针具有更长的激发和发射波长，如图3所示。因此可以避免活细胞自身荧光干扰。在活细胞中脂酶水解10-去氧碳代荧光素二乙酰脂产生具有强烈的红色荧光的10-去氧碳代荧光素而被识别，死细胞或受损细胞则因其脂酶活性损失而不发出红色荧光。

Claims (7)

1.一种具有如下结构式的荧光探针：

（I）

R₁和R₂分别是H、COOH或COOCH₂OAc。

2.根据权利要求1所述的一种检测细胞活性的化合物，R₁是H，R₂是COOH。

3.根据权利要求1所述的一种检测细胞活性的化合物，R₁是COOH，R₂是H。

4.根据权利要求1所述的一种检测细胞活性的化合物，R₁是COOCH₂OAc，R₂是H。

5.根据权利要求1所述的一种检测细胞活性的化合物，R₁是H，R₂是COOCH₂OAc。

6.权利要求1所述荧光探针的合成方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）合成带有保护基的蒽酮衍生物；

（2）蒽酮衍生物与溴代苯衍生物缩合给出10-去氧碳代荧光素；

其中的R₁和R₂分别是H、COOH或COOCH₂OAc；

(3)10-去氧碳代荧光素乙酰化给出10-去氧碳代荧光素二乙酰脂；

 

其中的R₁和R₂分别是H或COOH；

(4)10-去氧碳代荧光素二乙酰脂进一步脂化给出10-去氧碳代荧光素二乙酰脂羧酸脂; 

 

其中的R₁和R₂分别是H或COOCH₂OAc。

7.权利要求1所述荧光探针在制备作为检测细胞活性、细胞毒性荧光探针中的应用。