JPH11508277A - フッ素化キサンテン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の染料のファミリーは、フルオレセインおよびロドールであり、これは１つ以上の芳香族炭素がフッ素で直接置換される。これらのフッ素置換蛍光染料は、非フッ素化染料と比べて、より高い光安定性を有し、そしてpHの生理学的範囲６〜８での変化に対してより低い感度を有し、基質と結びついたときに、より少ない消光を示し、そしてさらなる利点を有する。本発明の染料は検出可能なトレーサーとして有用であり、そして有機および無機基質の結合体の調製のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 フッ素化キサンテン誘導体発明の分野 本発明は、新規なフッ素化キサンテン染料（フルオレセインおよびロドール(r hodol)染料を包含する）、反応性染料誘導体、染料結合体(dye-conjugates)、お よび酵素基質である染料；ならびにそれらの使用に関する。さらに、フッ素化レ ゾルシノールおよびアミノフェノールの容易な合成が提供される。発明の背景 蛍光染料は、高感度検出試薬が所望される生物学的用途に特に適していること が知られている。蛍光染料は、他の物質に可視色および蛍光の両方を与えるため に使用される。本発明の染料は、代表的にはフルオレセインまたはロドールの誘 導体であるキサンテンベースの染料のフッ素置換アナログである。 「フルオレセイン」染料は、９位で2-カルボキシフェニル基で置換された3H- キサンテン-6-オール-3-オンの誘導体を包含し、他方「ロドール染料」は、９位 で2-カルボキシフェニル基で置換された6-アミノ-3H-キサンテン-3-オンの誘導 体を包含する。 ロドールおよびフルオレセインは、代表的には、５員または６員のラクトンま たはラクタム環を形成し得る誘導体で１位が置換される： フルオレセインの、ハロゲン化して波長がシフトするという公知の傾向にもか かわらず、新規なフッ素化フルオレセインは、フルオレセインの好ましい特徴（ 高い吸光度および蛍光、488nm（例えばアルゴンレーザー）での励起、および標 準的な顕微鏡フィルタとの適合性を包含する）を維持し；フルオレセインと比べ た利点（より高い光安定性、および顕著に低いpKa（他の非置換染料に対して＞1 .5pH単位、図３参照）を包含する）を示す。フッ素化染料の改善された特性は、 それらの結合体において保持され、そして結合体上での染料の消光が減少する（ 例えば、図１）。この新規物質は、フルオレセインおよびロドールの公知の用途 （pH７付近でのpH変化に対する感度を必要とする用途を除く）での使用に適する 。さらに、ほとんどのフルオレセインおよびロドール染料中に存在するフェニル 置換基のポリフッ素化は、反応性誘導体および結合体への新規な経路を提供する 。あるフッ素化キサンテンは、予期せぬことに、細胞中で良好に保持される。 フッ素の独特の化学は、塩素、臭素またはヨウ素置換フルオレセイン誘導体の 調製に典型的に使用される方法に適合せず、そしてフルオロレゾルシノールおよ びフルオロアミノフェノール中間体を調製する効率のよい方法は、今まで記載さ れていない。1'-および/または8'-置換キサンテンの新規な調製方法もまた記載 される。 図面の説明 図１：ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ(GAM IgG)の染料結合体についての、置 換度に対する蛍光。蛍光は、染料結合体の量子収率を遊離の染料に対応して測定 し、そして１タンパク質当たりの発蛍光団の数を掛けることによって決定される ：化合物109（▲）、化合物64（■）、化合物61（●）およびフルオレセイン イソチオシアネート（FITC、□）。 図２：GAM IgGの染料結合体の相対光安定性。フッ素化染料の結合体は、非フ ッ素化染料と比べて、増強された光安定性を示す：化合物59（■）、化合物109 （▲）、化合物35（□）および6-カルボキシフルオレセイン（●）。 図３：pH依存性蛍光に対するフッ素化の影響：化合物35（●）、および6-カル ボキシフルオレセイン（○）（490/520nmで励起／発光）。 図４：6-カルボキシメチルチオ-2',4,5,7,7'-ペンタフルオロフルオレセイン （■）および6-カルボキシフルオレセイン（●）のファロイジン結合体の相対光 安定性。 図５：1)化合物25、2)二酢酸フルオレセイン(FDA)、および3)化合物26で処理 した細胞中のフルオレセインの保持。 発明の要旨および好適な実施態様の説明 本発明の染料は、１つ以上の芳香族炭素がフッ素で直接置換されたフルオレセ インおよびロドールである。この染料の説明において、カルボキシは、-COOH、 カルボン酸の生物学的に適合性の塩、またはカルボン酸の生物学的に適合性のエ ステルを意味する；スルホは、-SO₃H、またはスルホン酸の生物学的に適合性の 塩を意味する。生物学的に適合性の塩は、生物学的系に有害な影響を与えない塩 を意味し、K⁺、Na⁺、Cs⁺、Li⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、およびNR⁴⁺塩を包含し、ここでR=H 、C₁-C₄アルキル、またはC₂-C₄アルカノールあるいはそれらの組み合わせである 。生物学的に適合性のエステルは、生物学的系において使用される容易に加水分 解されるエステルを意味し、例えばα-アシロキシアルキルエステル（代表的に は、-CH₂O-(C=O)-R¹⁸（ここでR¹⁸はC₁-C₄アルキル）であり、特にアセトキシメ チル(CH₃CO₂CH₂-)エステルである）である。 １つの実施態様において、染料は次式を有する。 置換基R¹およびR⁶は、独立して、H、F、Cl、Br、I、C₁-C₁₈アルキルまたはC₁- C₁₈アルコキシである。代表的にはR¹およびR⁶はHまたはFである。 置換基R²、R³、R⁴およびR⁵は、独立して、H、F、Cl、Br、IまたはCN、あるい はC₁-C₁₈アルキル、アルコキシ、またはアルキルチオ基である。アルキル、アル コキシ、またはアルキルチオ染料置換基は、任意に、さらにF、Cl、Br、I、カル ボキシ、スルホ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはアルコキシ で置換され、各々のアルキル部分は、独立して１〜６個の炭素を有する。さらに 、染料置換基R³およびR⁴は、任意に、各々-CH₂-N−(CR¹⁹HCOOR¹⁷)₂であり、ここ でR¹⁷はH、生物学的に適合性の対イオン、１〜６個の炭素を有する直鎖または分 岐のアルキル、またはα-アシロキシアルキルエステルであり、そしてR¹⁹はHま たはC₁〜C₆アルキルである。 置換基Aは-NR⁸R⁹または-OR⁷であり、ここでR⁷はH、C₁-C₁₈アルキルまたはC₁-C₁₈ アシルであり、これは任意に、アミノ、ヒドロキシまたはカルボキシで置換さ れ、あるいはR⁷はトリアルキルシリル部分であり、そのアルキル部分は１〜６個 の炭素を有する。置換基R⁸およびＲ⁹は、独立して、H、１〜６個の炭素を有する アルキル、または１〜18個の炭素を有するアシルである。R⁸およびR⁹のうちの１ つまたは両方がアルキルまたはアシルの場合、そのアルキル部分は任意に、カル ボキシまたはスルホでさらに置換される。さらに、R⁸がR²と組み合わされて、あ るいはR⁹がR³と組み合わされて、あるいはその両方で、飽和の５員または６員環 を形成する場合、これは任意に、１つ以上のメチルで置換される。あるいはR⁸お よびR⁹が組み合わされて飽和の５員または６員の複素環を形成する場合、これは ピペリジ ン、モルホリン、ピロリジンまたはピペラジンであり、これは任意にメチルまた はカルボキシで置換される。 置換基R¹⁰は、F、カルボキシ、またはC₁-C₁₈アルキル、アルケニルまたはアル キニル基である。R¹⁰がアルキルである場合、これは任意に、F、Cl、Br、カルボ キシ、スルホ、アミノ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノで置換され、こ こで各置換基のアルキル部分は、１〜６個の炭素を有する。あるいはR¹⁰はアリ ール： （ときに「ボトム環」と呼ばれる）である。置換基R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR^{1 6} は独立してH、F、Cl、Br、I、カルボキシ、スルホ、CN、ニトロ、ヒドロキシ、 アジド、アミノまたはヒドラジノ、あるいはC₁-C₁₈アルキル、アルコキシ、アル キルチオ、アルキルアミノ、アルキルエステル、アルキルアミドまたはアリール アミドであり、これらのアルキルまたはアリール部分は任意にF、Cl、Br、I、ヒ ドロキシ、カルボキシ、スルホ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノま たはアルコキシで置換され、これらのアルキル部分は１〜６個の炭素を有する。 あるいは、R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶の任意の２つの隣接する置換基は、組み合わ された場合、縮合６員芳香族環を形成し（R¹⁰をナフチルにする）、これは任意 にさらにカルボキシで置換される。 １つの実施態様において、R¹⁰は、置換アリール、好ましくはフェニルであり 、R¹²はカルボキシであり、そしてR¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶は独立してH、F、ま たはカルボキシである。他の実態態様において、R¹²はカルボキシまたはスルホ であり、そしてR¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶はいずれもFではない。さらに他の実施 態様において、R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶のうちの３つがFであり、そしてR¹²はカ ルボキシまたはスルホである。 他の実施態様において、染料は次式を有する ここで、置換基R^1-7、R¹⁰、およびAは先に定義の通りであり、そしてR¹¹はH、ヒ ドロキシ、CNまたはC_1-6アルコキシであり、あるいはR¹⁰およびR¹¹は５員のスピ ロラクトン環を形成し、あるいはR¹¹およびR¹²は５員または６員のスピロラクト ン環、または５員または６員のスルトン環を形成する。例えば（さらなる置換基 は図示せず）： スピロラクトン環またはスピロスルトン環のメチレン炭素は、任意に、かつ独立 してH、FまたはCH₃で置換される。 あるいはR¹⁰はR¹¹と一緒になって、カルボニル酸素であり、以下の単純化され た式に従う（さらなる置換基は図示せず）。 スピロラクトン環を含む染料の実施態様は、R¹²がカルボン酸であるか、また はR¹⁰がプロピオン酸または酪酸である異性体と平衡で存在し得る構造異性体の 代表である。スピロスルトン環を含む染料は、R¹²がスルホン酸であるか、また はR¹⁰がスルホン酸置換エチルまたはプロピルである異性体と平衡で存在し得る 。スピロラクトン環またはスピロスルトン環を含む異性体は、開環するまで非蛍 光性である。 AがOR⁷であり、R¹⁰がアリールであり、そしてR¹²がカルボキシである場合、記 載された染料はフルオレセイン（式I）またはジヒドロフルオレセイン（式II） である。AがNR⁸R⁹であり、R¹⁰がアリールであり、そしてR¹²がカルボキシである 場合、記載された染料はロドール（式I）またはジヒドロロドール（式II）であ る。 本発明のすべての実施態様について、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R¹⁰、R¹²、R^{1 3} 、R¹⁴、R¹⁵または_R ¹⁶のうちの少なくとも１つはフッ素(F)である。フッ素化キ サンテンは、任意に反応性基を有し、これは単結合または結合部分で発蛍光団に 結合し、そして染料結合体の調製に使用され得る。染料は任意に、染料を光活性 化可能にするか、またはより細胞透過性とするか、あるいは染料を酵素の基質と するかまたはそのスペクトル特性を改変する、R⁷置換基を含む。 １つの実施態様において、R¹，R²、R³、R⁴、R⁵およびR⁶の１つ以上はFである 。さらなる実施態様において、R²、R³、R⁴およびR⁵の少なくとも１つがFである 場合、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶はいずれもFではない。さらに他の実施態様 において、R²、R³、R⁴およびR⁵の少なくとも１つがFである場合、R¹²、R¹³、R¹⁴ 、R¹⁵およびR¹⁶の少なくとも１つはFである。他の実施態様において、（R³およ びR⁴以外の）少なくとも１つの置換基がFである。あるいは、R¹およびR⁶はHであ り、そしてR²、R³、R⁴、およびR⁵はH、F，Cl、Br、I、またはC₁-C₆アルコキシで あり、ただしこの置換基のうちの少なくとも１つはFである。他の実施態様にお いて、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵お よびR¹⁶のうち少なくとも１つはFである。１つの実施態様において、R¹²、R¹³、 R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶のうちの４つはFである。他の実施態様において、R¹³、R¹⁴、 R¹⁵およびR¹⁶の各々がFである。他の実施態様において、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵お よびR¹⁶の少なくとも１つがFのとき、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵およびR⁶はいずれもF ではない。さらに他の実施態様においてR¹⁰はFである。 代表的には、AがOR⁷のとき、R²およびR⁵がFであるか、あるいはR³およびR⁴がF であるか、あるいはR²、R³、R⁴およびR⁵の全てがFである。Aが=NR⁸R⁹のとき、好 ましくはR⁵がFであり、その結果pKaが低下する；R²がFのとき、pKaは非フッ素化 化合物のpKaに匹敵する。A=NR⁸R⁹およびA=OR⁷の両方について、R¹³からR¹⁶まで の各々がフッ素化される場合、得られる染料は求核試薬と容易に反応し、そして さらにR¹¹およびR¹²が組み合わされてスピロラクトンである場合、得られる染料 は細胞中で良好に保持され、あるいは生物学的分子に容易に付着する。 好適な染料は水溶液(pH=6)中で0.50を超える量子収率を有する。好ましくは、 これらの染料は5.0未満のpKaを有する。好適な染料の吸光係数は、490nmを超え る波長で、pH6.0で測定して、60,000cm^-1M^-1を超える。好ましくは、フッ素化染 料は、非フッ素化アナログに対してl5nm未満のシフトの蛍光発光極大を示す。選 択された染料のスペクトル特性を表１に示す。 反応性染料の結合体 フッ素化発蛍光団の１つの実施態様は少なくとも１つの基-L-R_xを含み、ここ でR_xは反応性基であり、これは共有結合Lで発蛍光団に結合する。ある実施態様 において（表９参照）、R_xは、スペーサーとして働く複数の介在原子によって染 料に結合する。反応性基(R_x)を有する染料は、適切な反応性を有する官能基を含 むかあるいは含むべく修飾された広範囲の有機または無機の基質を蛍光的に標識 し、その結果、結合(conjugated)基質(S_c)が化学的に付着し、これは-L-S_cと表 される。反応性基および官能基は、代表的には、求電子試薬および求核試薬であ り、これは共有結合を生成し得る。あるいは、反応性基は光活性化可能な基であ り、そして適切な波長の光の照射の後にのみ、化学的に活性となる。官能基およ び結合の選択された例を表２に示す。ここで求電子試薬および求核試薬の反応は 共有結合を生じる。 ^＊活性化エステルは当該分野で理解されるように、一般に式-ＣＯΩを有し、こ こでΩは良好な脱離基（例えば、オキシスクシンイミジル（-OC₄H₄O₂）、オキシ スルホスクシンイミジル（-OC₄H₃O₂-SO₃H）、−1-オキシベンゾトリアゾリル(-O C₆H₄N₃)；あるいはアリールオキシ基、または活性化アリールエステルを形成す るために使用される電子吸引性置換基（例えば、ニトロ、フルオロ、クロロ、シ アノ、またはトリフルオロメチル、あるいはそれらの組み合わせ）で１回以上置 換されたアリールオキシ；あるいはカルボジイミドで活性化されて、無水物また は混合無水物-OCOR^aまたは-OCNR^aNHR^b（ここでR^aおよびR^bは同じでも異なってい てもよく、C₁-C₆アルキル、C₁-C₆パーフルオロアルキル、またはC₁-C₆アルコキ シである）を形成するカルボン酸；またはシクロヘキシル、3-ジメチルアミノプ ロピル、またはN-モルホリノエチル）である。^＊＊ アシルアジドはまた、転位してイソシアネートとなり得る。 共有結合Lは、反応性基R_xまたは結合基質R_cを発蛍光団に、直接（Lは単結合） または安定な化学結合（任意に、単結合、二重結合、三重結合または芳香族の、 炭素-炭素結合、ならびに炭素-窒素結合、窒素-窒素結合、炭素-酸素結合および 炭素-イオウ結合を包含する）との組み合わせのいずれかで結合させる。Lは代表 的には、エーテル、チオエーテル、カルボキシアミド、スルホンアミド、尿素、 ウレタンまたはヒドラジン部分を含む。好適なL部分は、C、N、OおよびSからな る群から選択される１〜20個の非水素原子を有し；そしてエーテル、チオエーテ ル、アミン、エステル、カルボキシアミド、スルホンアミド、ヒドラジド結合お よび芳香族またはヘテロ芳香族結合の任意の組み合わせから構成される。好まし くはLは、単独の炭素-炭素結合およびカルボキシアミドまたはチオエーテル結合 の組み合わせである。結合Lの最長の線状セグメントは好ましくは、１個または ２個のヘテロ原子を含む４〜10個の非水素原子を含む。Lの例は、置換または非 置換の、ポリメチレン、アリーレン、アルキルアリーレンまたはアリーレンアル キルである。１つの実施態様において、Lは１〜６個の炭素原子を含む。他の実 施態様において、Lはチオエーテル結合である。さらに他の実施態様において、L は式-(CH₂)_a(CONH(CH₂)_b)₂-を含み、ここでａは０〜５の任意の値を有し、ｂは １〜５の任意の値を有し、そしてｚは０または１である。 基R_xは、R²-R⁵またはR⁷-R¹⁶の任意の位置で、好ましくはR¹³-R¹⁶のうちの１つ で、より好ましくはR¹⁴またはR¹⁵で発蛍光団に直接結合し、あるいはアルキル、 アルコキシ、アルキルチオまたはアルキルアミノ置換基上に置換基として存在す る。１つの実施態様において、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、 R¹⁴、R¹⁵またはR¹⁶のうちの厳密に１つが-L-S_c部分である。他の実施態様におい て、R¹³、R¹⁴、R¹⁵またはR¹⁶のうちの厳密に１つが-L-S_c部分である。R¹³、R¹⁴ 、R¹⁵またはR¹⁶のうちの厳密に１つが-L-S_c部分である場合、代表的には残りのR¹³ 、R¹⁴、R¹⁵またはR¹⁶の各々はフッ素であるか、あるいは残りのR¹³、R¹⁴、R¹⁵ またはR¹⁶の各々は水素であるかのいずれかである。１つの実施態様において、R¹³ 、R¹⁴、R¹⁵またはR¹⁶の厳密に１つは-L-R_x部分である。他の実施態様において 、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷、R⁸、R⁹またはR¹⁰のうちの厳密に１つが-L-R_x部分である 。他の実施態様において、R¹²がカルボン酸またはスルホン酸である場合、さら なる-L-R_x部分がフッ素化染料上に存在する。 発蛍光団を結合基質に付着させるための共有結合の選択は、典型的には、結合 されるべき基質上の官能基に依存する。有機または無機基質上に典型的に存在す る官能基のタイプは、アミン、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド 、ケトン、ホスフェート、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二 置換アミン、ハライド、エポキシド、スルホン酸エステル、プリン、ピリミジン 、カルボン酸、またはこれらの基の組み合わせを包含するがこれらに限定されな い。単独のタイプの反応性部位が基質上で利用可能である場合もあり（典型的に は多糖の場合）、あるいは、タンパク質の場合に典型的であるように、多種の部 位が存在する場合がある（例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール ）。結合基質は、１以上の発蛍光団（これらは同じかまたは異なり得る）に結合 し得、あるいはハプテンでさらに修飾される基質に結合し得る。いくぶんかの選 択性は反応条件を注意深く制御することによって得られ得るが、標識の選択性は 、適切な反応性染料の選択によって最も良好に得られる。 典型的には、R_xはアミン、チオールまたはアルコールと反応する。１つの実施 態様において、R_xはアクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジ ド、アシルニトリル、アルデヒド、アルキルハライド、アミン、無水物、アニリ ン、アリールハライド、アジド、アジリジン、ボロネート、カルボン酸、ジアゾ アルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、イミドエステル、 イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホルアミダイト、スル ホニルハライド、またはチオール基である。好ましくは、R_xはカルボン酸、スク シンイミジルエステル、アミン、ハロアセトアミド、アルキルハライド、スルホ ニルハライド、イソチオシアネート、マレイミド基、またはアジドパーフルオロ ベンズアミド基である。 以前に記載された方法（米国特許第5,362,628号および同5,576,424号（細胞中 ）；および米国特許第5,459,268号および英国特許第9420661.2（ミトコンドリア 中））によれば、ハロアルキル、ハロアセトアミド、ハロメチルベンズアミドに よる置換は、細胞または細胞小器官中でフッ素化発蛍光団を保持させる。ボトム 環がフッ素化された染料は、グルタチオン（例えば化合物25)とタンパク質との 付加物を与え、これは細胞中に保持される。 有用な染料結合体は、抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝物 、トキシン、環境汚染物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、核酸ポリ マー、炭水化物、脂質、イオン錯形成部分、およびポリマーの結合体を包含する 。あるいは、これらは細胞、細胞系、細胞フラグメント、または準細胞粒子(sub cellular particle)の結合体である。例として、ウイルス粒子、細菌粒予、ウイ ルス成分、生物学的細胞（例えば、動物細胞、植物細胞、細菌、または酵母）、 または細胞成分が挙げられる。フッ素化反応性染料は、細胞表面上、細胞膜、細 胞小器官、または細胞質中の反応性部位を標識する；あるいは低分子量化合物を 、キャピラリゾーン電気泳動、HPLCまたは他の分離技術による分析のために誘導 体化する。好ましくは、結合基質は、アミノ酸、ペプチドタンパク質、多糖、イ オン錯形成部分、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、薬物、 脂質、リン脂質、リポタンパク質、リポ多糖、リポソーム、親油性ポリマー、ポ リマー、ポリマー微粒子、生物学的細胞またはウイルスである。 １つの実施態様において、結合基質(S_c)は、アミノ酸（保護されたアミノ酸、 あるいはホスフェート、炭水化物、またはC₁〜C₂₂カルボン酸で置換されたアミ ノ酸を包含する）、あるいはペプチドまたはタンパク質のようなアミノ酸のポリ マーである。好適なペプチドの結合体は、少なくとも５個のアミノ酸、より好ま しくは５〜36個のアミノ酸を含む。好適なペプチドは、神経ペプチド、サイトカ イン、トキシン、プロテアーゼ基質、およびタンパク質キナーゼ基質を包含する がこれらに限定されない。好適なタンパク質結合体は、酵素、抗体、レクチン、 糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプト アビジン、プロテインA、プロテインG、フィコビリタンパク質および他の蛍光タ ンパク質、ホルモン、トキシンおよび成長因子を包含する。典型的には、結合タ ンパク質は、抗体、抗体フラグメント、アビジン、ストレプトアビジン、トキシ ン、レクチン、または成長因子である。染料-ペプチドおよびタンパク質結合体 は、本発明の染料が第２の蛍光または非蛍光染料と組み合わされてエネルギー移 動対を形成したもので標識されたものを包含する。 他の実施態様において、結合基質(S_c)は核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチ ドまたは核酸ポリマーであり、任意に発蛍光団または他のリガンドの付着のため のさらなるリンカーまたはスペーサー（例えば、アルキニル結合（米国特許第5, 047,519号）、アミノアリル結合（米国特許第4,711,955号）または他の結合）を 含む。好ましくは、結合ヌクレオチドは、ヌクレオシド三リン酸あるいはデオキ シヌクレオシド三リン酸またはジデオキシヌクレオシド三リン酸である。 好適な核酸結合体は、標識された、一本鎖または多重鎖の、天然または合成の 、DNAまたはRNAオリゴヌクレオチド、あるいはDNA/RNAハイブリッドであり、あ るいはモルホリン誘導化ホスフェート(AntiVirals，Inc.，Corvallis OR)のよう な一般的ではないリンカーを取り込み、またはN-(2-アミノエチル)グリシン単位 のようなペプチド核酸であり、ここで核酸は50より少ないヌクレオチド、より典 型的には25より少ないヌクレオチドを含む。典型的には、染料は、１つ以上のプ リンまたはピリミジン塩基を介して、アミド、エステル、エーテルまたはチオエ ーテル結合を通じて付着する；あるいはホスフエートまたは炭水化物に、エステ ル、チオエステル、アミド、エーテルまたはチオエーテルである結合によって付 着する。あるいは、少なくとも１つの本発明の染料がオリゴヌクレオチドに結合 し、これが同時に少なくとも第２の染料で標識されて、蛍光エネルギー移動対を 形成し、あるいはビオチンまたはジゴキシゲニンのようなハプテンに結合し、あ るいはアルカリホスファターゼのような酵素に結合し、あるいは抗体のようなタ ンパク質に結合する。本発明のヌクレオチド結合体は、DNAポリメラーゼに容易 に取り込まれ、そしてインサイチュハイブリダイゼーション（下記参照）および 核酸配列決定（例えば、米国特許5,332,666号；同5,171,534号；および同4,997, 928号；およびWO出願94/05688号）のために使用され得る。 他の実施態様において、結合基質(S_c)は炭水化物であり、これは典型的には多 糖、例えば、デキストラン、FICOL、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン 、マンナン、イヌリン、デンプン、アガロース、およびセルロースである。好適 な多糖結合体は、デキストランまたはFICOL結合体である。 他の実施態様において、結合基質(S_c)は、脂質（典型的には６〜25個の炭素を 有する）であり、これには糖脂質、リン脂質、およびスフィンゴ脂質が包含され る。あるいは、結合基質は、リポソームのような脂質小胞であり、あるいはリポ タンパク質である（下記参照）。米国特許第5,208,148号に記載のように、親油 性部分は化合物を細胞中に保持するために使用され得る。 イオン錯形成部分(ion-complexing moiety)を有する結合体は、カルシウム、 ナトリウム、マグネシウム、カリウム、または他の生物学的に重要な金属イオン の指示薬として働く。好適なイオン錯形成部分はジアリールジアザクラウンエー テル（米国特許5,405,975号）を包含するクラウンエーテル；BAPTA（米国特許第 5,453,517号、米国特許第5,516,911号、および米国特許第5,049,673号）；誘導 体APTRA（AM.J.PHYSIOL.256、C540(1989)）；およびピリジン-およびフェナント ロリン-ベースの金属イオンキレーターであり；好ましくはジアリールジアザク ラウンエーテルまたはBAPTAキレーターである。イオン指示薬は任意に、プラス チックまたはデキストランのような生物学的ポリマーに結合して、それらのセン サーとしての有用性を増大させる。あるいは、染料自体が、個別の染料のpKaか ら1.5pH単位以内のpH値でH⁴の指示薬として作用する。R²およびR⁵にフッ素を有 する染料の実施態様は、pH４〜６の範囲にわたってのpH指示薬として最も有用で ある。 最後に、結合体は、任意に、ポリマー、ポリマー粒子、ポリマー微粒子（磁性 および非磁性のマイクロスフェアを包含する）、ポリマー膜、伝導性および非伝 導性の金属および非金属、ならびにガラスおよびプラスチック表面および粒子の 、染料結合体である。結合体は、任意に、適切な官能性を含むフッ素化染料を、 ポリマーを調製しながら共重合することによって調製され、あるいは適切な化学 反応性を有する官能基を含むポリマーの化学修飾によって調製される。ポリマー の染料結合体を調製するために有用な他のタイプの反応には、アルケンの触媒化 重合または共重合およびジエンとジエノフィルとの反応、エステル交換またはア ミノ交換が挙げられる。他の実施態様において、結合基質はガラスまたはシリカ であり、これは光ファイバーまたは他の構造に形成され得る。 反応性染料を用いた染料結合体の調製は、例えば、R.Haugland、MOLECULAR PR OBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS 1-7巻(1992)； およびBrinkley、BIOCONJUGATE CHEM.,3,2(1992)に詳細に説明される。結合体は 、典型的には、適切なフッ素化反応性染料と結合されるべき基質との両方を溶解 する適切な溶媒中で混合することによって得られる。光活性化される反応性染料 に ついては、結合は反応混合物を照射して反応性染料を活性化することを必要とす る。染料-生物分子結合体は溶液でまたは凍結乾燥されて用いられる。 特異的結合対の標識されたメンバーは、その特異的結合対の相補的メンバーの ための蛍光プローブとして使用され、各特異的結合対メンバーは、その表面上ま たは空隙中に領域を有し、これが他方の特定の空間的または極性の構造に特異的 に結合し、そして相補的である。特異的結合対の代表を表３に示す。このような プローブは任意にブロック(BLOCK)を含み、これは酵素または光で除去され、あ るいはR¹¹はHであり、そしてこの化合物は酸化されると蛍光性となる。 ^＊IgGは免疫グロブリン^† aDNAおよびaRNAは、ハイブリダイゼーションに使用するアンチセンス（相補性 ）鎖ブロックされた染料および他の基質 R⁷、R⁸またはR⁹が、発蛍光団の蛍光を実質的に変化させるブロック部分（これ らは同じかまたは異なり得る）である実施態様において、ブロックの除去により 、 親染料の蛍光が回復する。典型的なブロックは、ホスフェートまたはスルフェー ト、あるいはそれらの生物学的に適合性の塩から；または脂肪族または芳香族カ ルボン酸またはアミノ酸、保護アミノ酸、ペプチド、または保護ペプチドのカル ボキシ基から；あるいはアルコールまたは単糖または多糖から、ヒドロキシル基 を除去することにより誘導される一価部分である。典型的には、R⁷でのブロック -発蛍光団結合は、エーテルまたはエステル結合であり、そしてR⁸またはR⁹では アミド結合である。あるいは、ブロックは、染料または染料結合体上の光不安定 性のケージング基(caging group)である。R⁷で、ケージは典型的には、o-ニトロ アリールメチン(α-カルボキシo-ニトロアリールメチンおよびビス-(5-t-ブトキ シカルボニルメトキシ)-2-ニトロベンジル(化合物101)を包含する）、2-メトキ シ-5-ニトロフェニル、またはデシルの置換または非置換の誘導体である。 -ブロックの切断により酵素活性の存在を示す検出可能な応答を生じるとき、 化合物は酵素基質である。これらの結合部分を切断することが知られている酵素 は、ミクロソームデアルキラーゼ（例えば、シトクロムP450酵素）、グリコシダ ーゼ（例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-フコシダーゼ、 β-グルコサミニダーゼ）、ホスファターゼ、スルファターゼ、エステラーゼ、 リパーゼ、グアニジノベンゾエターゼなどを包含する。アミノ酸またはペプチド アミドであるロドール染料の結合体は、典型的にはペプチダーゼ基質として有用 である。フッ素化二酢酸化フルオレセイン化合物は無傷の細胞中に容易に入り込 み、ここで、アセテート部分は生存細胞中で細胞内エステラーゼによって切断さ れ、固有の蛍光を回復し、そして生存性を示す。同様に、アセトキシメチルエス テルで置換されたフッ素化染料（例えば、カルセイン-AMのフッ素化アナログ（ 例えば化合物99））は、無傷の細胞中に容易に入り込み、そして細胞トレーサー または生存性インジケーターとして作用し得る（特にR¹¹がHの場合）。 染料を細胞中に保持するための上記の任意の置換基は、基質を細胞中に保持す るために使用され得る。好適な酵素基質は、ボトム環がフッ素化されたものであ る。特に好適な基質は、アセテートまたはグリコシドである２つの同一のブロッ ク部分を有し（例えば、β-D-ガラクトピラノシド）、これらは、少なくともボ トム環上で四フッ素化されている。 水溶液中でpKa＜６、より好ましくは約５未満の染料化合物は、酸性環境中（ 例えば、β-D-ガラクトピラノシドのような酸性β-ガラクトシダーゼ）、または 酸性細胞小器官中で好適な基質（例えば、リソソームグリコシダーゼの基質（表 14参照））である。-ブロックがホスファターゼ酵素で切断される基質は、酸性 ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼの両方の検出のために有用であ る。pH７より下で最大代謝回転速度を有する酵素の検出のために好適な基質は、 2'位および7'位がフッ素化されたものである。 他の基質の実施態様において、R¹¹がHである染料は、酸化酵素および他の酸化 剤（例えば、ペルオキシダーゼ酵素）の基質である。それらの非フッ素化アナロ グとは異なり、フッ素化ジヒドロフルオレセインおよびジヒドロロドールは、典 型的には溶解度を低下させるブロッキング基を使用することなく、水性溶液中で 安定である。例えば、化合物84（4,5,6,7-テトラフルオロジヒドロフルオレセイ ン）は、少なくとも2mMまで水中で可溶である。使用方法 新規染料は、一般に、試料を染色して、所望の条件下で検出可能な光学的応答 を与えるために使用される。これは、目的の試料と染料溶液（当該分野で一般に 公知の方法に従って調製される）とを、染料化合物が所望の条件下での検出可能 な光学的応答を生じるに十分な時間、組み合わせることによって、行われる。必 要とされる染料溶液の濃度は（典型的にはナノモルからマイクロモル）は、染料 または染料結合体の濃度を、満足できる染料染色が達成されるまで、系統的に変 化させることによって決定される。 染料化合物は、最も有利には、生物学的成分を有する試料を染色するために使 用される。試料は、成分（無傷の細胞、細胞抽出物、細菌、ウイルス、細胞小器 官、およびそれらの混合物）の不均質混合物、あるいは単独成分または均質の成 分群（例えば、天然または合成のアミノ酸、核酸または炭水化物ポリマー、ある いは脂質膜複合体）を含み得る。BrまたはIでさらに１回以上置換されたフッ素 化染料は効率的な光増感剤であるが、これらの染料は、通常、生細胞および他の 生物学的成分に対して、使用濃度範囲内で非毒性である。 試料は、任意に、公知の方法に従って、染色の間に他の溶液（洗浄溶液、浸透 および／または固定溶液、ならびに追加の検出試薬を含む他の溶液を包含する） と組み合わされる。細胞中で良好に保持される選択された実施態様では、細胞は 、固定の後に、かなりの蛍光染色を保持する。追加の検出試薬が本染料化合物と は異なるスペクトル特性を有する場合、マルチカラー適用が可能である。 染色の後または間に、試料は照射されて、検出可能な光学的応答を与え、そし て、蛍光光度計、顕微鏡、マイクロプレートリーダー、フローサイトメーター、 レーザースキャナー、ハンドランプまたは他の装置を用いて、光学的応答を検出 するための手段で観察される。典型的には、光学的応答は、蛍光の強度あるいは 励起または発光の波長分布における変化、蛍光寿命、蛍光偏光、またはそれらの 組み合わせのような蛍光の変化である。 染色は、公知の方法に従って、試料中の成分または機構の存在、量、あるいは 空間的または時間的分布を決定するために使用される。本発明の染料は、キット の調製に非常に適している。キットは、反応性フッ素化染料、および染料と適切 な官能基を有する任意の基質との結合のための（そして任意にそれらで標識され た物質の回収または精製のための）指示を含み、生物学的ポリマー（例えば、タ ンパク質、オリゴヌクレオチドまたは炭水化物）、ポリマー樹脂およびプラスチ ック（例えば、ポリスチレン）、金属、ガラス、ならびに他の有機または無機基 質を包含するがこれらに限定されない。フッ素化キサンテン染料はまた有用なハ プテンである。なぜなら、フッ素化は、典型的には染料の蛍光消光に至る、抗フ ルオレセイン抗体による発蛍光団の認識を妨害しないからである（表15参照）。染料合成 フッ素化フルオレセインまたはロドール染料の調製の第一の工程は、各々、適 切に置換されたレゾルシノールまたはアミノフェノールを調製することである。 フッ素化レゾルシノールの調製方法は公知であるが（Patrickら、J.ORG.CHEM.51 ,3242(1986);Lermanら、J.ORG.CHEM.49、806(1984)）、フッ素化レゾルシノール およびアミノフェノールはより利便には（市販の）ポリフルオロニトロベンゼン またはアルコキシ置換誘導体から合成される。ニトロに対してオルトおよびパラ 位にあるフッ素原子が、２当量のアルコキシドまたはベンジルオキシドで置換さ れる。次にニトロ基を還元し、次いでジアゾ化および還元的脱ジアゾ化を行う（ 表４参照）。あるいは、ジアゾニウムカチオンを純粋な塩として単離し、次いで 、ホウ水素化ナトリウムで還元する。BBr₃または他のエーテル開裂試薬での脱ア ルキル化、またはベンジルエーテル触媒水素化の場合、純粋なフッ素化レゾルシ ノールが与えられる。この合成方法に耐えられるならば、他の置換基が合成の間 、任意に存在する。例えば、アルキル、カルボキシアルキル、クロロ、ブロモ、 ヨード、アルコキシおよびヒドロキシ部分である。 フッ素化アミノフェノールが同様に調製される：最初にアルキル置換アミン求 核試薬がポリフルオロニトロベンゼン上に置換され、順次、アルコキシドまたは ベンジルオキシドで置換される。還元とそれに続くジアゾ化および水素化脱ジア ゾ化の結果、フッ素化アミノフェノールが生じ、これが次にフッ素化ロドールを 調製するために使用される。あるいは、市販のフッ素化ニトロフェニルケトンお よびアルデヒドを、バイヤー-ビリガー酸化化学を用いて対応するフェノールエ ステルに転化する。還元的アミノ化または直接アルキル化により、所望のN-置換 アミノフェノールが生じる。フェノール性ヒドロキシルの脱アシル化により所望 のフッ素化アミノフェノールが与えられる（表５参照）。 染料のキサンテン部分にフッ素置換基を有するキサンチリウム(xanthylium)染 料は、典型的には、フッ素化レゾルシノールと、フタル酸、フタル酸無水物、ス ルホ安息香酸またはスルホ安息香酸無水物（例えば、フタル酸無水物、トリメリ ト酸無水物、ニトロフタル酸無水物、o-スルホ安息香酸無水物、スルホテレフタ ル酸）との、あるいはベンズアルデヒド（次に酸化される場合）との、あるいは 脂肪族ジカルボン酸または無水物（例えばコハク酸またはグルタル酸の無水物） との縮合によって調製される。縮合は、任意に、触媒され（例えば、ZnCl₂また はメタンスルホン酸により）、そして水性ワークアップの後に所望のフッ素化キ サンチリウム染料が得られる。 フッ素化キサンチリウム染料はまた、２当量のレゾルシノールとフッ素化ベン ゼンカルボニル化合物（例えば、テトラフルオロフタル酸無水物、テトラフルオ ロフタル酸またはフルオロフタル酸誘導体、ペンタフルオロ安息香酸、およびペ ンタフルオロベンズアルデヒドのようなフッ素化ベンズアルデヒド）との縮合に よっても調製されるが、蛍光キサンチリウム染料を与えるためには、フッ素化ベ ンズアルデヒドを用いた後、酸化工程が必要とされる。得られる染料は、キサン テン環系に結合したアリール環上がフッ素化されている。アリール環が４位およ び６位でフッ素化されている場合、還元グルタチオン、メルカプト酢酸、メルカ プトエチルアミンおよびアジドのような求核試薬が、４位または６位のフッ素イ オンを置換し得、引き続く結合化学のための合成経路を提供する（表８参照）。 例えば、メルカプト酢酸付加物は、スクシンイミジルエステルに転化され、ある いはメルカプトエチルアミノはイソチオシアネート、マレイミドまたはハロアセ トアミドに転化される。あるいは、アジド基は還元されてアミンとなり、これは 次にヨード酢酸無水物でアシル化されて、ヨードアセトアミドを与える。 フッ素化キサンチリウム染料はまた、ポリフッ素化ベンゾニトリルから出発し ても得られる。ベンゾニトリルへのアルコキシドまたはベンジルオキシドの付加 は、ニトリル基に対してオルト位およびパラ位のフッ素原子を置換する。ペンタ フルオロフェニルマグネシウムクロライドのようなアリール有機金属試薬の添加 によって、ニトリル基がイミンに転化し、これが次に加水分解されて、２位およ び４位がアルコキシ基で置換されたベンゾフェノンを与える。アルコキシ基が、 例えば臭化水素酸および酢酸で、脱アルキル化される。次にメタノール中のNaOH での処理によって、キサンテノンが得られ、ここで2-ヒドロキシ基が2'-フッ素 原子で置換されている；同時に、アルコキシ基が4'-フッ素原子を置換する。得 られるキサントンの3-ヒドロキシ基は、典型的には、塩基に安定な保護基（例え ば、2-メトキシエチルメチルエーテル(MEMエーテル)で保護され、そして次にペ ンタフルオロフェニルマグネシウムクロライドまたはアルキルリチウム試薬のよ うなアリール有機金属試薬がキサントンカルボニル基に付加される。臭化水素酸 および酢酸による引き続く処理により、得られた三級カルビノールが脱水されて 、所望のキサンチリウム染料となり、同時に6-メトキシ基がヒドロキシル基へと 転化される。 ロドールのような不斉キサンチリウム染料ならびにロドールおよび非対称フル オレセインのような非対称キサンチリウム染料のためには、各々１当量の適切な 置換または非置換レゾルシノールと１当量の異なるレゾルシノール（Khannaら、 米国特許第4,439,359号(1984)に記載のように）、アミノフェノールと、１当量 の適切なフタル酸誘導体またはベンズアルデヒドとを用いて縮合が行われ得る。 合成は、Hauglandらの米国特許第5,227,487号(1993)に記載のように、協奏的な 様式かあるいは段階的に行われ得る（表７参照）。 フッ素化キサンチリウム染料の修飾は、フルオレセインの修飾に関する公知の 方法に従って行われる。例えば、フッ素化フルオレセインは、液体臭素のような 適切なハロゲン化剤でハロゲン化され得る(例えば、化合物31)。フッ素化フルオ レセインの4'位および／または5'位が水素原子で占有されている場合、これらの 位置は、特に置換アミンがイミノ二酢酸またはアミノ酸の場合、マンニッヒ条件 を用いてアミノメチル基で置換され得る（Kirkemoら、米国特許第4,510,251号、 前出、に記載のように）。ボトム環カルボキシレートが存在する場合、これは、 還元と、その次のHClまたはHBrでの処理によって、クロロメチルまたはブロモメ チル置換基へと転化され得る。２つの異性体カルボキシレートが存在する場合、 これらは任意に分離され（一般方法Ｊ）あるいは異性体混合物として使用される 。式２の還元キサンチリウム染料は、有機溶媒中でキサンテノンを亜鉛末または ホウ水素化物で還元することによって調製される（表11参照）。これらのジヒド ロフッ素化染料は、電子を取る(take up)酵素のための基質として作用するか、 あるいは酸化剤、反応性酸素種または酸化窒素の検出に役立つ。ホスフェートに よるフェノール性ヒドロキシルのアシル化を伴う他の酵素基質の調製はホスファ ターゼ基質を与え、カルボン酸によるものはエステラーゼ基質を与え、アルキル 化を伴うものは、デアルキラーゼ基質を与え、そして炭水化物によるものは、グ リコシダーゼ基質を与える。さらに、ロドール窒素に少なくとも１つの水素原子 を有するロドールは、当該分野で周知の方法で任意にアシル化されて、アミド誘 導体を与えるか、あるいはスルホニルハライドで処理されて、スルホンアミドを 与える。 本発明の染料のジヒドロキサンテン型およびキサンチリウム型は、ホウ水素化 物、水素化アルミニウム、水素／触媒、および亜ジチオン酸塩を包含する周知の 酸化または還元試薬によって、自由に相互転換可能である。種々の酸化剤がジヒ ドロキサンテンの酸化を媒介し、これには、触媒存在下または非存在下での分子 酸素、酸化窒素、ペルオキシ硝酸塩、ジクロメート、トリフェニルカルベニウム およびクロラニルが包含される。キサンテンはまた西洋ワサビペルオキシダーゼ と過酸化物との組み合わせを包含する酵素の作用によって、あるいは酸化窒素に よって酸化される。 以下の実施例は、本発明の実施を例示するために示される。これらは本発明の 全体の範囲を限定または定義することを意図しない。 実施例 フッ素化レゾルシノールの調製 一般的方法Ａ ナトリウムメトキシド(1.0M)を、窒素下で０℃にて金属ナトリウムを無水メタ ノール(Aldrich)に滴下することにより調製する。窒素下で室温にてニートなフ ッ素化ニトロベンゼン(1.0当量)に、ナトリウムメトキシド溶液(2.2当量)を５〜 10分かけて添加する。反応混合物を室温で撹拌する。一旦、TLC分析が、反応が 完了(1〜24時間)したことを示したら、1Mのクエン酸数滴を添加する。水を添加 し、続いてエーテルで抽出する。有機層をブラインで洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、 エバポレートし、そしてヘキサン／CH₂Cl₂から再結晶して、所望のジメトキシフ ルオロニトロベンゼンを得る。 一般的方法Ｂ フルオロニトロベンゼンのニトロ基を、エタノール／酢酸エチル中40psiにて1 0%Pd/Cで接触水素化により還元する。TLC分析が、反応が完了したことを示しと き、触媒を濾過により除去し、そして濾液をエバポレートして純粋なアミン置換 フッ素化ベンゼンを得る。 一般的方法Ｃ フルオロニトロベンゼンのニトロ基を、塩化第一スズ２水和物(5当量)を用い て酢酸エチル／エタノール(2:1、0.10M)の還流下で、均一系還元により還元する 。反応過程をTLCでモニターする。反応系を冷却し、水中に注ぎ、そして1M NaOH でpH７まで中和する。混合物を酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗浄し、Na₂SO₄ で乾燥し、そしてエバポレートする。残渣をフラッシュクロマトグラフィーによ り精製する。 一般的方法Ｄ 水/HCl(2:1、0.3M)中の所望のアミノフルオロベンゼンを氷中で冷凍し、そし てNaNO₂(1.05当量)の冷水溶液で処理する。ジアゾニウム塩溶液を15分間撹拌し 、次いで、次亜リン酸(50％水溶液、20当量)を５分間かけて添加する。混合物を 室温で２時間撹拌し、次いで水で希釈する。混合物をNa₂CO₃またはNaOH水溶液で 中和し、そしてエーテルで２回抽出する。有機抽出物を水、次いでブラインで洗 浄し、そしてNa₂SO₄で乾燥する。溶液をエバポレートし、そして残渣をフラッシ ュクロマトグラフィーにより精製する。 一般的方法Ｅ 窒素下室温にて無水CH₂Cl₂(0.3M)中のフッ素化ジメトキシベンゼンの溶液を、 シリンジを介してBBr₃(3.0当量、CH₂Cl₂中で1.0M)で５分間かけて処理する。TLC は反応が完了するまで24〜48時間かかることを示し；0.5当量のさらなるBBr₃溶 液が、時には反応を完了させるために必要である。溶液を注意深く水でクエンチ し、そして撹拌して沈殿物を溶解する。溶液をエーテルで抽出し、抽出物をブラ インで洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、エバポレートし、そして昇華により精製して所 望のフッ素化レゾルシノールを得る。 フッ素化アミノフェノールの調製 一般的方法Ｆ 第２級アミン（３当量）およびフッ素化ニトロベンゼンのエタノール溶液を、 シールされたチューブ中で加熱するか、または加熱還流(1〜24時間)する。溶液 をエバポレートし、そして得られた固体を再結晶するか、またはクロマトグラフ ィーを行い、純粋なフルオロニトロアニリンを得る。次いで、フッ素化アミノフ ェノールを、フッ素化レゾルシノールの一般的方法Ａと同様に調製する。 一般的方法Ｇ フッ素化アミノフェノールを、市販のフッ素化フェニルケトンおよびアルデヒ ドから、フェニルケトンまたはアルデヒドのニトロ化およびバイヤー-ビリガー 酸化化学を用いる対応ニトロフェノールへの変換により生成する。還元後、還元 的アミノ化によりN-置換アミノフェノールを得る。また、アミンを当該分野で公 知の他のアルキル化剤（例えば、ハロゲン化アルキル）で処理し得る。4- フルオロ-3-ニトロフェノール(23)の調製： ０℃にて濃H₂SO₄(15ml)に、6.9g(0.05mmol)の4-フルオロアセトフェノンを添 加する。この溶液にHNO₃(4mL)と濃H₂SO₄(6mL)との混合物を添加する。反応系を ０〜５℃で３時間撹拌する。反応系を氷水中に注ぎ、そしてCHCl₃で抽出する。 有機層を水で洗浄し、Na₂SO₄乾燥し、濾過し、エバポレートする。残渣をカラム クロマトグラフィーにより精製し、6.0gの4-フルオロ-3-ニトロアセトフェノン( 収率60%)を得る。 濃H₂SO₄(200mL)および酢酸(120mL)を０℃で混合する。溶液に15g(0.082mol)の 4-フルオロ-3-ニトロアセトフェノン、続いて36mLの36%過酢酸を添加する。反応 系を室温で４時間撹拌する。水(500mL)を添加し、そして生成物をジエチルエー テル中に抽出する。エーテル画分を水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、そし てエバポレートする。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、3.2gの 化合物23(収率20%)を得る。融点：86〜87℃。分析 実測値：C 45.80;H 2.51;N8 .69。3- アミノ-4-フルオロフェノール(24)の調製： 酢酸エチル(60mL)中の4-フルオロ-3-ニトロフェノール(2.70g、17.2mmol)およ びPd/C(10%、0.31g)の混合物を、50psiのH₂下で水素化する。１時間後、触媒を 濾過により除去する。濾液をエバポレートし、そして残渣を昇華させ、2.18g(10 0%)の化合物24を白色固体として得る。融点：142〜144℃。分析 実測値：C57.2 8;H 4.86;N 10.65。 フッ素化フルオレセインの調製 一般的方法Ｈ フッ素化レゾルシノール（２当量）、フタル酸または無水物（１当量）、およ び無水ZnCl₂(2.5当量)を、約170〜180℃で撹拌しながら30分間縮合させる。冷却 混合物を水中に懸濁させ、そして吸引濾過する。フッ素化フルオレセインを含む 固体を、メタノール/水中に溶解することによりさらに精製し、続いて珪藻土で 濾過し、そしてエバポレートする。 一般的方法Ｈ’ あるいは、方法Ｈの粗フッ素化フルオレセインを、無水酢酸およびピリジン中 でジアセテートに変換し、短時間加熱し、そして混合物を水性後処理(aqueous w orkup)に供し、そして有機可溶性生成物のクロマトグラフィー精製または再結晶 を行う。 一般的方法Ｉ あるいは、所望のフッ素化レゾルシノール（２当量）および無水フタル酸（１ 当量）を、10%w/v溶液としてメタンスルホン酸中にて80〜85℃で48時間加熱する 。冷却溶液を７容積の氷/水混合物中に注ぐ。沈殿物を回収し、冷水で洗浄し、6 0℃にて真空下で乾燥し、そして方法Ｈに記載されるように精製する。 一般的方法Ｉ’ 臭素（６当量）をMeOH中のフッ素化染料（１当量）の溶液に滴下する。混合物 を３時間撹拌し、次いでエバポレートする。残渣を無水酢酸およびピリジンと共 に１時間撹拌し、酢酸エチルで希釈し、1M クエン酸、次いでブラインで洗浄し 、そしてエバポレートする。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、臭 素化染料を得る。 一般的方法Ｊ カルボキシフルオレセイン異性体の単離：フッ素化カルボキシフルオレセイン （１当量）、ピリジン（４当量）、および無水酢酸(100当量)を、80℃で５分間 加熱する。反応系を-4℃まで24時間冷却する。結晶性沈殿物（6-異性体ジアセテ ートのピリジニウム塩）を回収し、無水酢酸、エーテルで洗浄し、そして乾燥し 、オフホワイトの粉末を得る。濾液を等容積の水と共に30分間撹拌し、そして酢 酸 エチルで抽出する。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、乾燥し、エバポレート し、そしてCH₂Cl₂から再結晶させて、5-異性体ジアセテートを遊離酸として得る 。濾液を濃縮し、トルエン中に再溶解し、1.5当量のピリジンを添加し、そして 溶液を20℃で15時間放置する。得られた沈殿物を回収し、トルエン、エーテルで 洗浄し、そして乾燥し、さらなる6-異性体ジアセテートをピリジニウム塩として 得る。濾液を酢酸エチルで希釈し、1M クエン酸、ブラインで２回洗浄し、乾燥 し、濃縮し、そしてCH₂Cl₂から再結晶させて、5-異性体ジアセテートの第２生成 物(crop)を遊離酸として得る。 一般的方法Ｋ フッ素化フルオレセインジアセテートの加水分解：THF/MeOH/水(4:4:2)中のジ アセテートの0.1M溶液を、20℃にてNH₄OH(10当量)で処理する。２時間後、反応 系を７容積の氷水中に注ぎ、そしてHClでpH２まで酸性化する。沈殿物を回収し 、冷水で洗浄し、そして60℃で乾燥し、生成物を得る。 1',8'-置換フッ素化フルオレセインの調製： 1',8'-置換フッ素化フルオレセインを、ポリフッ素化ベンゾニトリルから明細 書中に記載されるように調製する。以下の反応スキームは、1,2,4,5,7,8-ヘキサ フルオロ-6-ヒドロキシ-9-ペンタフルオロフェニルキサンテン-3-オンの調製を 例示する。適切に置換されたベンゾニトリルおよびアリール有機金属基の選択に より、所望のフッ素化染料がもたらされる。 フッ素化ロドールの調製： 一般的方法Ｌ ２つの適切な富電子芳香族成分（すなわち、レゾルシノールおよび3-アミノフ ェノール）の等モル混合物を、１当量のフタル酸、無水フタル酸、またはスルホ テレフタル酸と縮合する。これが１当量の無水塩化亜鉛の存在下で、150〜200℃ での溶融物の場合、水との混合と、その後の濾過とからなる次の後処理を伴い、 または温(80℃)メタンスルホン酸中の溶液の場合、反応溶液を過剰の水中へ注ぐ ことと、その後の濾過とからなる次の後処理を伴う。両方の方法において、所望 の非対称フルオレセインおよびロドール染料生成物を、フラッシュクロマトグラ フィーまたは分取薄層クロマトグラフィーのいずれかにより、所望でない対称染 料生成物から分離する。 フッ素化キサンテンの調製2,7- ジフルオロ-6-ヒドロキシ-9-トリフルオロメチルキサンテン-3-オン(56)の 調製： 4-フルオロレゾルシノール(化合物15、0.10g、0.78mmol)を、80℃にてメタン スルホン酸中でトリフルオロ酢酸(45mg、0.39mmol)と縮合する。所望の生成物を 、過剰の水の添加により反応溶液から沈殿させる。生成物を濾過し、そして乾燥 して化合物56を赤色粉末として得る。2,7- ジフルオロ-6-ヒドロキシ-1-(1-ナフチル)キサンテン-3-オン(57)の調製 ： ２当量の4-フルオロレゾルシノール(化合物15)を、温メタンスルホン酸中でナ フタレン-1-カルボキシアルデヒド（１当量）と縮合する。反応がTLC分析により 完了したと判断されたとき、中間体生成物を反応溶液から水を用いて沈殿させる 。粗固体を濾過し、そして乾燥する。中間体をクロロホルム中に溶解し、そして 過剰のクロラミン-Tで処理する。TLCによる判断で酸化が完了したとき、揮発性 物質を除去し、そして粗生成物をクロマトグラフィーにより精製し、化合物57を 得る。 誘導されたフッ素化発蛍光団の調製： チオエーテル誘導体の一般的調製方法Ｍ： 5%w/v溶液として、所望の「ボトム環」フッ素化フルオレセイン（1当量）およ びメルカプト酢酸(1.2当量)のDMF溶液を、80℃で40分間加熱する。反応系を氷水 中に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗浄し、乾燥し、エバポレートし、 そしてCHCl₃：メタノール：酢酸(85:15:0.3)、次いでTHF：トリフルオロ酢酸(10 0:0.5)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製する。純粋 な生成物を含有する画分を合わせ、そしてエバポレートする。残渣を最小量のTH F中に溶解し、石油エーテル(沸点30〜60℃)中に濾過する。沈殿物を回収し、洗 浄し、そして石油エーテルで洗浄し、そして乾燥する。 スクシンイミジルエステル誘導体の一般的調製方法Ｎ： 適切なフッ素化フルオレセインのピリジン溶液に、1.3当量のスクシンイミジ ルトリフルオロアセテート(STFA、N-ヒドロキシスクシンイミドおよび無水トリ フルオロ酢酸から調製される)を添加する。さらなるSTFA（２×１当量）を添加 し、反応を完了するまで進める。20℃で16時間後、反応混合物をエーテルで希釈 し、1M クエン酸、ブラインで洗浄し、乾燥し、そしてエバポレートする。残渣 を、CHCl₃：メタノール：酢酸(95:5:0.1〜80:20:0.1、段階的グラジエント)で溶 出するカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、所望の生成物を得る。 あるいは、カルボン酸置換フッ素化フルオレセインを、カルボジイミドカップ リング剤（例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒ ドロクロライド（EDAC）またはN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)）を 用いて、当該分野で周知の方法によりN-ヒドロキシスクシンイミドとカップリン グする。 フッ素化フルオレセインの他の誘導体を、表９に示すように当該分野で公知の 方法により調製する。 1)ビス-インドリルマレイミド：2-(1-(3-アミノプロピル)-インドール-3-イル)- 3-(1-メチルインドール-3-イル)マレイミド フッ素化スルホンフルオレセインおよびそれらのアナログの調製： 一般的方法Hの変法において、適切なフッ素化レゾルシノールとスルホテレフ タル酸との縮合は、所望のフッ素化スルホンフルオレセインを与える。 フッ素化ジヒドロフルオレセインの調製： フッ素化フルオレセインは、還元されたジヒドロフルオレセインアナログに容 易に変換される。適切なフッ素化フルオレセインを酢酸または酢酸／メタノール 中に溶解し、そして空気中室温にて亜鉛末で処理する。１〜３日撹拌した後、混 合物を濾過し、そして粗生成物をSEPHADEX LH-20でのクロマトグラフィーにより 精製する。 フッ素化β−ガラクトシダーゼ基質の調製： 一般的方法Ｏ 無水THF(染料で0.02M)中の所望のフッ素化フルオレセイン（１当量）、テトラ -O-アセチルブロモガラクトース(1.5当量)、および酸化銀(I)(1.5当量)の混合物 を、窒素下室温にて撹拌する。反応は完了するまで72〜96時間かかる；必要に応 じてさらに酸化銀を添加する。混合物を濾過し、そしてエバポレートして濃縮す る。残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、純粋なモノアルキル化 生成物を得る。この方法を用いて、2',7'-ジフルオロフルオレセイン、テトラ-O -アセチルガラクトシド(90)を、化合物29から収率92%で調製し、そして4,5,6,7- テトラフルオロフルオレセイン、テトラ-O-アセチルガラクトシド(91)を化合物3 4から収率55%で調製する。 一般的方法Ｐ 乾燥トルエン中の所望のフッ素化フルオレセインモノ（テトラ-O-アセチル） ガラクトシド（１当量）、テトラアセトブロモガラクトース(1.5当量)、および 炭酸カドミウム(1.5当量)の混合物を、４日間加熱還流する。冷却反応混合物を 濾過し、そして濾液を濃縮する。残渣をクロマトグラフィー精製し、非蛍光の保 護ガラクトシダーゼ基質を得る。この方法を用いて、2',7'-ジフルオロフルオレ セイン、ビス-テトラ-O-アセチルガラクトシド(92)を化合物90から収率62%で調 製し、そして4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン、ビス-テトラ-O-アセチル ガラクトシド(93)を、化合物91から収率16%で調製する。 アセチル保護基を、保護されたガラクトシダーゼと１当量未満のナトリウムメ トキシドまたは水酸化リチウムとの反応により除去する。反応をクエン酸水溶液 でクエンチし、そして生成物を分取TLCまたはSEPHADEX LH-20のクロマトグラフ ィーにより精製する。この様式において、2',7'-ジフルオロフルオレセイン、ビ ス-O-ガラクトシド(94)を化合物92から調製し、そして4,5,6,7-テトラフルオロ フルオレセイン、ビス-O-ガラクトシド(95)を化合物93から収率25%で調製する。 アルカリホスファターゼ基質の調製： 一般的方法Ｑ フッ素化フルオレセインまたはロドールホスファターゼ基質の一般的調製スキ ームは、典型的には、最初に、リンオキシクロライドを用いる発蛍光団のホスホ リル化を必要とする。典型的には、フルオレセイン染料を、窒素下０℃にてピリ ジン中に溶解する。フルオレセイン溶液に、POCl₃のピリジン溶液を添加する。T LCにより反応が完了したと判断した後、反応を砕いた氷でクエンチし、NH₄OHでp H7.0まで中和する。ピリジンをクロロホルムで抽出し、そして水相を凍結乾燥す る。粗物質を、水で溶出するSEPHADEX LH20で精製する。純粋な生成物の画分を プールし、凍結し、そして凍結乾燥し、テトラアンモニウム塩としての純粋なフ ッ素化フルオレセインジホスフェートを淡黄色の固体として得る。 方法Ｑを用いて、2',7'-ジフルオロフルオレセイン(29)を2',7'-ジフルオロフ ルオレセインジホスフェートのテトラアンモニウム塩(96)に変換し、そして2',4 , 5,6,7,7'-ヘキサフルオロフルオレセイン(26)を2',4,5,6,7,7'-ヘキサフルオレ セインジホスフェートのテトラアンモニウム塩(97)に変換する。 カルセイン-AMのフッ素化アナログの調製： 一般的方法Ｒ フッ素化染料をエタノール中に溶解し、そして6M KOHを添加して、0.2M溶液を 作る。得られた溶液を３当量のイミノジ酢酸、続いてホルムアルデヒド水溶液（ ４当量）で処理する。溶液を65℃で一晩加熱し、次いで水／エタノールで容積を ２倍にする。pHをHCl水溶液を用いて2.0に下げ、そして沈殿物を濾過により回収 する。中間体をアセトンで粉末化し、続いて濾過し、DMF中に懸濁させ、そして1 0当量のジイソプロピルエチルアミン(DIEA)および無水酢酸（４当量）で処理す ることにより部分的に精製する。30分後、さらにDIEA（７当量）を添加し、続い て均一性が達成されるまで水を滴下する。ブロモメチルアセテート(15当量)を添 加し、そして溶液を一晩撹拌する。混合物を酢酸エチルと水との間に分配する。 有機層をブラインで洗浄し、濃縮し、次いでヘキサン：酢酸エチルを溶出液とし て用いる分取TLCにより精製し、純粋な生成物を無色のオイルとして得る。 ケージドフッ素化発蛍光団の調製： フッ素化発蛍光団を、当該分野で周知のフルオレセインのケージング方法を用 いてケージ化する。例えば、2',4,5,6,7,7'-ヘキサフルオロフルオレセイン(26) を5-(t-ブトキシカルボニルメトキシ)-2-ニトロベンジルヨウ化物およびAg₂Oを 処理し、続いてクロマトグラフィーを用いて精製し、非蛍光性ビス-(5-t-ブトキ シカルボニルメトキシ)-2-ニトロベンジル-ケージド2',4,5,6,7,7'-ヘキサフル オロフルオレセイン(101)を収率46%で得る。生成物は最初に消光するが、照射す ると蛍光性になる。 フッ素化発蛍光団を取り入れたイオン指示薬の調製： フッ素化発蛍光団を取り入れたイオン指示薬は、刊行された方法を利用して容 易に調製される。 ¹Kuhnらの米国特許第5,453,517号(1995)2',7'- ジフルオロフルオレセイン-5-(および-6)-カルボン酸のヌクレオチド結合 体の調製 ： 水(100μL)中の5-(3-アミノアリル)-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェー ト、アンモニウム塩(2mg)に、DMF(100)中の化合物72(3mg)、続いてトリエチルア ミン(5μL)を添加する。室温にて、３時間後、溶液をエバポレートし、そして残 渣を、溶出のために水を用いる親油性のSEPHADEX上で精製する。最初の緑色蛍光 性画分を合わせ、そして凍結乾燥し、蛍光性ヌクレオチド結合体を橙色固体(化 合物107)として得る。 あるいは、デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの蛍光性結合体(化合物108 )を、5-(3-アミノアリル)-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの代わり に5-(3-アミノ-1-プロピニル)-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートを用 いて調製する(Hobbs,Jrらに記載される、前述)。2',4',5',7'- テトラフルオロフルオレセイン-5-(および-6)-カルボン酸のオリゴ ヌクレオチド結合体の調製 ： 5'-アミン修飾24-塩基M13プライマー配列のサンプル(500μg)を、0.1M NaHCO₃ (220μL、pH8.5)中に溶解する。これに、DMF(35μL)中の化合物65(lmg)を添加す る。室温にて、16時間後、5M NaCl(15μL)および３容積の冷100%エタノールを添 加する。混合物を-20℃まで冷却し、遠心分離し、エタノール上清をデカントし 、そしてペレットをすすぎ、そして100μLのH₂O中に溶解する。標識したオリゴ ヌクレオチドを、0.1Mトリエチルアンモニウムアセテート(pH〜7)およびアセト ニトリル(30分間かけて15→60%)の傾斜(ramp)勾配を用いる300A C8逆相カラム上 のHPLCにより精製する。所望のピークを回収し、そしてエバポレートし、蛍光性 オリゴヌクレオチドを得る。2',7'- ジフルオロフルオロレセイン-5-(および-6)-イソチオシアネートの薬物結 合体の調製 蛍光性ドーパミンD₂アンタゴニストを以下のように調製する： DMF(1mL)中のN-(p-アミノフェネチル)スピペロン(Amlaikyら、FEBS LETT、176 、436(1984))(10mg)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(10μL)に、2',7'- ジフルオロフルオレセイン-5−(および-6)-イソチオシアネート(15mg)(化合物76 、実施例77)を添加する。３時間後、反応混合物を5mLのジエチルエーテル中に注 ぐ。沈殿物を遠心分離により回収し、そしてクロロホルム中の10%メタノールを 用いるシリカゲル上のクロマトグラフィーにより精製して、純粋な生成物を橙色 固体として得る。フッ素化染料のタンパク質結合体： ヤギ抗マウスIgGまたはストレプトアビジンの一連の染料結合体を、化合物64 、化合物61、9-(4-カルボキシ-2-スルホフェニル)-2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキ シ-3H-キサンテン-3-オン、スクシンイミジルエステル(化合物109)；およびフル オレセインイソチオシアネートを用いて以下のように別々に調製する： 所望のタンパク質の溶液を、0.1M炭酸水素ナトリウム中10mg/mLで調製する。 標識化剤を10mg/mLでDMF中に溶解する。所定量の標識化剤を、タンパク質溶液に 撹拌しながら徐々に添加する。最適な量は個々の標識化剤および標識されるタン パク質によって変わるが、１当量のタンパク質に対する10当量の染料のモル比が 典型的である。反応混合物を室温で１時間、または氷上で数時間インキュベート する。染料-タンパク質結合体を、PBSで平衡化されたCELLUFINE GH-25上で他の 試薬から分離する。最初の、タンパク質含有着色バンドを回収し、そして標識化 の程度を、フルオレセインについてはpH8における68,000cm^-1M^-1の吸光係数およ び他の３つのフッ素化発蛍光団については吸収極大における70,000cm^-1M^-1の吸 光係数を用いて、各発蛍光団の吸収極大における吸光度により決定する。タンパ ク質濃度を、同じ波長での染料吸収に関して較正された280nmの光学密度から決 定する。置換度の関数としての選択された染料−タンパク質結合体の総蛍光： 一連のヤギ抗マウスIgG結合体を、化合物64、化合物61、化合物109；およびフ ルオレセインイソチオシアネートを用いて上述のように調製し、同じ置換度の誘 導体を得る。フッ素化フルオレセインの結合体の蛍光は、FITCの蛍光より高い。 さらに、化合物59および化合物109の抗体結合体の蛍光は、図１に示すように、 高度に置換されているがそれほど消光されない。フッ素化フルオレセインジアセテートでのβ−ガラクトシダーゼの標識化： リン酸緩衝化生理食塩水(150μL、pH7.5)中のEscherichia coliβ−ガラクト シダーゼ(3mg)を、DMSO中の化合物25のlmg/mLストック溶液(13.6μL)で処理する 。１時間後、pHをNa₂CO₃で10まで２時間で上昇させて、アセテートを除去する。 未反応染料を、スピンカラム上で除去する。置換度は、515nmでε=85,600cm^-1M^{- 1} を用いて8.6と見積もられる。β-ガラクトシダーゼを同じ染料：タンパク質比 で化合物34により直接標識化すると、最小のタンパク質標識が行われる。小麦麦芽アグルチニンの2',7'-ジフルオロフルオレセインでの標識化および使用 ： 小麦麦芽アグルチニン(25mg、EY Laboratories)を、5mM N-アセチルグルコサ ミンを含有する炭酸ナトリウム緩衝液(5mL、pH9.0)中に溶解し、活性部位を保護 する。これに、3.5mgの化合物76を添加する。室温で１時間後、溶液をタンパク 質結合体について上記のように精製する。凍結乾燥後、置換度は、１分子あたり ２〜３個の染料であると、490nmでの吸光度から決定される。Sizemoreら（米国 特許第5,137,810号）に従って使用する場合、結合体はグラム陽性細菌とグラム 陰性細菌とを識別し得る。アクチンフィラメントの化合物73での標識化および光退色： CRE BAG2線維芽細胞をホルムアルデヒドで固定し、アセトンで透過性を上げ、 次いで蛍光性ファロトキシンフルオレセインファロイジンおよび化合物73で染色 する。染色された細胞は緑色の蛍光性F-アクチンフィラメントを示す。各試料を 連続的に照射し、そして蛍光顕微鏡で観測する。図４に示されるように相対光退 色は、フッ素化染料結合体の優れた光安定性を明確に示す。 一旦、F-アクチンフィラメントが染色されたら、さらなる細胞成分を、フッ素 化染料結合体のスペクトル特性から容易に区別されるスペクトル特性を有する他 の染料結合体を用いて必要に応じて染色する。例えば、細胞核を、DAPIを用いて 蛍光性青色に染色し、他方、細胞抗原をローダミンまたはカルボシアニン染料( 例えば、それぞれTEXAS RED染料またはCY-5染料)の蛍光性抗体結合体を用いて赤 色に染色する。染色およびその後の分離した細胞成分の可視化は、同時にまたは 連続して行われ得る。蛍光性α-ブンガロトキシンの調製および使用： 25μLの0.1M NaHCO₃中のα-ブンガロトキシン(1mg)を、室温にて1.5当量の化 合物63で２時間処理する。生成物をCM-SEPHADEX上で精製する。アセチルコリン レセプターの染色および得られた蛍光の検出は、フッ素化染料結合体の蛍光がよ り耐光退色性であることを除いて、フルオレセイン結合α-ブンガロトキシンの それと同等である。化合物76のデキストラン結合体の調製： 化合物76を塩化シアヌルで処理して、ジクロロトリアジン付加物（化合物11 0）を得る。これを、ポリサッカライドの遊離ヒドロキシ基を標識するのに使用 する。 70,000MWデキストラン(50mg)を、0.2M Na₂SO₃(2.5mL、pH9.5)中に溶解する。 化合物110(1mLのDMSO中20mg)を添加する。pHを1M NaOHで9.5〜10.0に維持しなが ら、溶液を50℃まで６時間加熱する。染料-デキストラン結合体を30mＭ酢酸アン モニウムを用いてSEPHADEX G-15上で精製する。最初の着色バンドを回収し、そ して凍結乾燥する。フッ素化フルオレセインのアミノデキストラン結合体の調製： 70,000MWアミノデキストラン（50mg）を、0.1M NaHCO₃中10mg/mLで溶解する。 化合物61を添加し、染料/デキストラン比12を得る。６時間後、結合体を、水で 溶出するSEPHADEX G-50上で精製し、そして生成物を凍結乾燥する。典型的には 、約６モルの染料が70,000gのデキストランと結合する。蛍光性リポソームの調製： 内部に極性誘導体（例えば、化合物36または2',7'-ジフルオロカルセイン（化 合物99の加水分解により調製される））を含有する蛍光性リポソームを調製し、 そしてJ.BIOL.CHEM.257,13892(1982)およびPROC.NATL.ACAD.SCI.USA 75,4194(19 78)に本質的に記載されるように使用する。あるいは、その膜に化合物79のよう な親油性のフッ素化フルオレセインを含有するリポソームを、Szoka,Jrら(ANN.R EV.BIOPHYS.BIOENG.9,467(1980))に本質的に記載されるように、リポソーム分散 体を形成する前にリポソームを作る蛍光性脂質および非標識リン脂質を共溶解す ることにより調製する。蛍光性低密度リポタンパク質の調製： ヒト低密度リポタンパク質(LDL)の共有結合体を、タンパク質結合体の調製に ついて記載した方法を用いて調製し、ゲル濾過により精製する。LDLは、修飾さ れたLDLに特異的な「スカベンジャー」レセプターを有するマクロファージ、内 皮細胞および他の細胞により取り込まれることで知られる。蛍光性結合体の結合 は蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーのいずれかにより検出され得る。ある いは、脂質ドメインにおいて標識されたLDLは、緩衝液中に分散された親油性蛍 光性染料と共にLDLをインキュベーションし、次いでゲル濾過することにより調 製され得る。細菌の蛍光性結合体の調製： 熱死滅Escherichia coliを、pH8〜9の緩衝液中10mg/mLで懸濁させ、次いで0.5 〜1.0mg/mLのアミン反応性フッ素化染料と共にインキュベートする。30〜60分後 、標識された細菌を遠心分離し、そして緩衝液で洗浄して、未結合染料を除去す る。オプソニン化された標識バクテリアは、フローサイトメトリーにより測定さ れるように、マクロファージにより取り込まれる。免疫試薬としてのタンパク質結合体の有用性および耐光退色性： 化合物59；化合物61；化合物109；およびフルオレセインスクシンイミジルエ ステルの抗体結合体を、約４〜６の置換度で調製する。INOVAスライドをリン酸 緩衝化生理食塩水(PBS)中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)中で30分間再水和する。 スライドを完全に水切りする。ヒト自己抗体をアプライし、スライドを30分間イ ンキュベートし、そしてPBSですすぐ。マウス抗ヒト抗体をアプライし、そして スライドを30分間インキュベートし、そしてPBSですすぐ。緑色蛍光性のヤギ抗 マウス抗体結合体の各々を10μg/mL溶液としてアプライし、1%BSA/PBSで希釈す る。30分後、標識されたスライドをPBS、次いで50mM Tris（pH8.0）中ですすぎ 、50mM Tris(pH8.0)中に置き、ロングパスのフルオレセインフィルターを通して 観測する。全ての試料は主として核染色を生じる。スライドの１つの画像を、フ ルオレセインロングパスフィルターを用いて、100秒間の試料の連続的な照射で ５秒ごとに得る。細胞の３つの領域をこの方法を用いて退色させ、そして光退色 値を規格化し、そして平均化する。次いで、各結合体の３回の測定の平均を規格 化し、プロットする。結果を図２に示す。フッ素化染料の抗体結合体は、フルオ レセイン結合体より顕著に優れた光安定性を示す。蛍光性ヌクレオチド結合体を用いて調製されるRNAプローブのインサイチュハイ ブリダイゼーション： 化合物72のUTP結合体を、5-(3-アミノアリル)-ウリジン-5'-トリホスフェート のアンモニウム塩(Sigma Chemical)を用いて調製する。 マウス線維芽細胞を固定し、そして標準的な手順を用いるmRNAインサイチュハ イブリダイゼーションのために調製する。発蛍光団標識RNAプローブを、ファー ジT3 RNAポリメラーゼプロモーターの下流にクローン化されたマウスアクチン構 造遺伝子を含むプラスミドのインビトロ転写により調製する。標識化反応系は、 2μLのDNAテンプレート(1μg DNA)、1μLの10mM 各ATP、CTPおよびGTP、0.75μL の10mM UTP、2.5μLの1mM 蛍光性UTP-化合物72結合体、2μLの10X転写緩衝液(40 0mM Tris、pH8.0、100mM MgCl₂、20mMスペルミジン、100mM NaCl)、1μLのT3 RN Aポリメラーゼ(40ユニット/μL)、1μLの2mg/mL BSA、および8.75μLの水を合わ せたものからなる。反応系を37℃で２時間インキュベートする。 DNAテンプレートを反応系を20ユニットのDNaseIで15分間処理することにより 除去する。RNA転写物を、等容量のフェノール：クロロホルム(1:1)での抽出、次 いでSEPHADEX G50を通すクロマトグラフィーにより精製する。標識化RNAを50℃ で５分間変性し、次いで、標準的手順を用いて細胞性調製物にハイブリダイズす る。調製物を洗浄し、そして蛍光顕微鏡においてフルオレセインフィルターを通 して観測する場合、アクチンmRNAを発現する細胞は、明緑色の蛍光を示す。酸ホスファターゼ活性の検出のための化合物96の使用： 蛍光性生成物の生成速度を、0.1ユニットのプロスタン酸(prostatic acid)ホ スファターゼ(pH5)の存在下で、10μMの化合物96またはフルオレセインジホスフ ェート(FDP)の溶液を490nmで励起し、一方で蛍光光度計にて515nmの発光をモニ ターすることにより、測定する。こららの条件下において、酸ホスファターゼは 、シグナルの変化において化合物96を用いるとFDPより約6.5倍大きい変化をもた らす。酸β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための化合物94の使用： フルオレセインジガラクトシド(FDG)および化合物94で試験したウシ由来の酸 性β-ガラクトシダーゼの作用から得られる蛍光を比較する。490nmで励起した場 合の512nmにおける蛍光の増加を、50μM基質とアッセイ緩衝液(200mMのリン酸ナ トリウム＋75mMクエン酸、pH4.5)中の4.6nM酵素とに関して時間に対して測定す る。化合物94からの蛍光性生成物の初期速度は、FDGを用いて得られたものの3.0 倍である。無傷な細胞中の内因性（リソソーム）β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための 、4,5,7-トリフルオロ-6-メトキシフルオレセインジガラクトシド(TFMFDG)およ び化合物95の使用： 外因性β-ガラクトシダーゼでトランスフェクトされないNIH 3T3細胞を、10% ウシ胎児血清および2mMのL-グルタミンを補充したダルベッコ改変最小必須培地 中で培養する。PBS中のTFMFDGおよび化合物95のストック溶液を、1μMで細胞培 養培地に添加する。37℃で30分後、細胞を氷上に置き、そしてアルゴンイオンレ ーザー(488nm励起)を備えるFACS-Vantage装置を用いてフローサイトメトリーに より直ちにアッセイする。公知の発蛍光性基質FDGに対して規格化されたFLIにお ける蛍光シグナルは、TFMFDGおよび化合物95が、それぞれFDGの48.1倍および4.1 倍のシグナルを与えることを示す（表１４）。 インビトロでの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)活性の検出のための化合物84 の使用： 化合物84の2mM溶液(0.5mL)を水中で調製する。過酸化水素を含まない等用量の OPD緩衝液(0.5Mリン酸−クエン酸緩衝液)(pH5.5、0.5mL)を添加する。いくらか の混入した酸化染料の存在を示す微量のバックグランド蛍光は、０時間における 蛍光シグナルを提供することに役立つ。化合物84の別の2mM溶液(0.5mL)を、過酸 化水素(0.5mL)を含むOPD緩衝液に添加すると、検出可能な蛍光増加はなくなる。 HRP(1μL、10^-4ユニット)の添加は、明黄色の蛍光の即時の生成をもたらす。フッ素化フルオレセインジアセテートを用いる細胞標識化： RPMI 1640培地中のヒトリンパ球B細胞培養物由来の細胞を、1μMの化合物25、 化合物26、またはフルオレセインジアセテート(FDA)で37℃にて30分間処理する 。遠心分離およびPBS中での洗浄の後、ペレットをRPMI 1640培地中に15分間再懸 濁し、再遠心分離し、PBS中で洗浄し、PBS中の3.7%ホルムアルデヒドで固定し、 そして488nm励起を用いるフローサイトメトリーにより分析する。２時間後、化 合物25および26で染色された細胞は、FDAで染色されたものより顕著に高い蛍光 を示す（図５）。細胞の蛍光は少なくとも24時間検出され得、そして標識された 細胞を未標識細胞と混合した場合、染料は他の細胞に移動しない。2',4',5',7'- テトラフルオロフルオレセインジアセテートで染色した細胞もまた、弱い蛍光で ある。あるいは、染色され、そして洗浄された細胞は、固定せずに観測または分 析される。細胞中のフッ素化染料の生成物の検出： 化合物25で染色されている細胞を、0.1%NP40を有するPBSを用いて穏やかに溶 解する。400xgで５分間の遠心分離により破片を除去後、上清を15,000xgで30分 間の遠心分離によりスピン濾過する。濾液をHPLCを用いて分析する。残った画分 中の蛍光性生成物は、4,5,6,7,-テトラフルオロフルオレセンおよびそのグルタ チオン付加物の両方を含むことを示す（4,5,6,7-TFFDAを用いて別に調製された 参照化合物を用いたHPLCにより確認して、保持時間はそれぞれ14.7分および11.6 分）。SDSゲル電気泳動法を用いると、細胞溶解物は、数種のタンパク質を含む ことを示す。これらのいくつかのみが、蛍光性である。ウサギポリクローナル抗フルオレセインIgG(H+L)画分による2',7'-ジフルオロフ ルオレセインの蛍光の消光： 5×10^-9Mのフルオレセインおよび5×10^-9Mの化合物29の溶液を、リン酸カリウ ム緩衝液(100mM、pH8.0)中で調製する。各溶液の蛍光を、490nm励起で読み取る 。0.5mg/mLのウサギポリクリーナル抗フルオレセインIgG(H+L)画分(Molecular P robes,Ins)を系統的に加え、そして蛍光測定を繰り返す。表15に強度を記録する ： 結果は、２つの染料の実質的に同一の結合および消光を示す。フッ素化発蛍光団のpH滴定の手順 問題の染料を、まず、pHメーターを用いてそれぞれ検定された一連の緩衝液中 に溶解する。典型的には酢酸緩衝液をpH４〜６の範囲において使用し、そしてリ ン酸緩衝液をpH６〜８の範囲において使用する。吸収測定を、濃度約10μMの溶 液を用いて行い、そして蛍光測定は、濃度約1μMの溶液を用いて行う。次いで、 吸収または発光データをpHに対してプロットし、pKa値を決定する。例えば、図 ３は、溶液のpHに対してプロットされた2',7'-ジフルオロフルオレセイン(pKa〜 4.7)およびフルオレセイン(pKa〜6.4)の蛍光発光データを示す。データは発蛍光 団のフッ素化がフルオレセインのpKaを顕著に下げることを示す。フッ素化され たフルオレセインのpKaは、2',7'-ジクロロフルオレセイン(pKa〜5.1)のpKaより もさらに低い。 本発明が例示として詳細に記載されているが、多くの改変、置換および代替が 、以下の請求の範囲において記載される本発明の思想および範囲から逸脱するこ となく可能であることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｃ 217/82 Ｃ０７Ｃ 217/82 Ｃ０７Ｄ 493/10 Ｃ０７Ｄ 493/10 Ｅ Ｃ０７Ｆ 9/6561 Ｃ０７Ｆ 9/6561 Ｚ Ｃ０７Ｋ 1/13 Ｃ０７Ｋ 1/13 Ｃ０９Ｂ 11/28 Ｃ０９Ｂ 11/28 Ｇ０１Ｎ 21/76 Ｇ０１Ｎ 21/76 33/48 33/48 Ｐ // Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 (72)発明者 プート，マーティン アメリカ合衆国 ワシントン 98105，シ アトル，エヌ．イー．58ティーエイチ ス トリート 349 (72)発明者 クローバート，ダイエター エイチ. アメリカ合衆国 オレゴン 97405，ユー ジーン，フォックス ホロウ ロード 29855 (72)発明者 サン，ウェイ−チャン アメリカ合衆国 オレゴン 97405，ユー ジーン，ブラックバーン ストリート 2325 (72)発明者 ホーグランド，リチャード ピー. アメリカ合衆国 オレゴン 97405，ユー ジーン，ラサター 2233 (72)発明者 マオ，フェイ アメリカ合衆国 オレゴン 97405，ユー ジーン，ガーフィールド ストリート 2850

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次式を有するフッ素化レゾルシノールの調製方法であって： ここで R¹、R²およびR⁴は、独立して水素、フッ素、塩素、ヒドロキシ、１〜６個の炭 素を有するアルキルまたは１〜６個の炭素を有するアルコキシであり；ただし、 R¹、R²およびR³の少なくとも１つはフッ素であり； ａ）次式を有する置換ニトロフルオロベンゼン ここで R¹およびR²は独立して、水素、フッ素、塩素、１〜６個の炭素を有するアルキル または１〜６個の炭素を有するアルコキシであり； R⁴は、水素、フッ素、塩素、１〜６個の炭素を有するアルキル、１〜６個の炭素 を有するアルコキシ、またはニトロであり； R³およびR⁵は独立して、１〜６個の炭素を有するアルコキシ、ベンジルオキシま たはFであり；そして R⁶はHまたはニトロであり； ただし、 R⁴およびR⁶のうちの厳密に１つはニトロであり； R³およびR⁵のうち少なくとも１つはFであり；そして R¹、R²およびR⁴のうち少なくとも１つはFである； を、１〜６個の炭素を有するアルコキシドイオンまたはベンジルオキシドイオン である置換イオンで処理してニトロレゾルシノールジエーテルを得る工程； ｂ）該ニトロレゾルシノールジエーテルを還元して、アミノレゾルシノールジエ ーテルを得る工程； ｃ）該アミノレゾルシノールジエーテルをジアゾ化して、レゾルシノールジエー テルジアゾニウム塩を得る工程； ｄ）該レゾルシノールジエーテルジアゾニウム塩を脱ジアゾ化して、レゾルシノ ールジエーテルを得る工程；および ｅ）該レゾルシノールジエーテルを開裂させて、該フッ素化レゾルシノールを得 る工程 を包含する、方法。 ２．前記フッ素化レゾルシノールが、2-フルオロレゾルシノール、4-フルオロレ ゾルシノール、5-フルオロレゾルシノール、2,4-ジフルオロレゾルシノール、4, 5-ジフルオロレゾルシノール、2,5-ジフルオロレゾルシノールまたは2,4,5-トリ フルオロレゾルシノールである、請求項１に記載の方法。 ３．次式 または次式 を有する化合物であって、ここで R¹およびR⁶が、独立して、H、F、Cl、Br、I、C₁-C₁₈アルキルまたはC₁-C₁₈ア ルコキシであり； R²、R³、R⁴およびR⁵が、独立して、H、F、Cl、Br、I、CN；あるいはC₁-C₁₈ア ルキル、C₁-C₁₈アルコキシ、またはC₁-C₁₈アルキルチオであり、ここでアルキル 、アルコキシ、またはアルキルチオの各々は、任意に、さらにF、Cl、Br、I、ス ルホン酸、スルホン酸塩、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆アル コールエステル、カルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸（ここでR¹⁸はC₁-C₆アルキル） エステル、またはアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはアルコキシ で置換され、これらのアルキル部分は、独立して１〜６個の炭素を有する；ある いはR³およびR⁴の各々または両方が-CH₂-N-(CR¹⁹HCOOR¹⁷)₂であり、ここでR¹⁹は HまたはC₁〜C₆アルキルであり、R¹⁷はH、生物学的に適合性の対イオン、１〜６ 個の炭素を有する直鎖または分岐のアルキル、または-CH₂O-(C=O)-R¹⁸である； Aが、-OR⁷または-NR⁸R⁹であり、 ここで各R⁷は、独立して、H、C₁-C₁₈アルキルまたはC₁-C₁₈アシルであり、 これは任意に、アミノ、ヒドロキシ、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸の C₁-C₆アルコールエステル、カルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステルで置換され； あるいはR⁷はトリアルキルシリルであり、ここで各アルキル基は独立して１〜６ 個の炭素を有する； ここでR⁸およびR⁹の各々は、独立して、H、C₁-C₆アルキル、C₁-C₆カルボキ シアルキル、C₁-C₆スルホアルキル、C₁-C₆カルボキシアルキルの塩、C₁-C₆スル ホアルキルの塩、またはC₁-C₁₈アシルであり、ここでアルキル部分は、任意に、 アミノ、ヒドロキシ、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆アルコー ルエステル、カルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステル、スルホン酸、ま たはスルホン酸塩で置換され；あるいはR⁸はR²と組み合わされて、あるいはR⁹は R³と組み合わされて、あるいはその両方で、飽和の５員または６員環を形成し、 これは任意に、１つ以上のメチルで置換される；あるいはR⁸がR⁹と組み合わされ て飽和の５員または６員の複素環を形成する場合、これはピペリジン、モルホリ ン、ピロリジンまたはピペラジンであり、これらの各々は任意にメチルまたはカ ルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆アルコールエステル、カルボン酸 の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステルで置換される； R¹⁰が、F、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆アルコールエステ ル、またはカルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステルであり；あるいはR¹⁰が、C₁-C₁₈ アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、F、Cl、Br、 カルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆アルコールエステル、カルボン 酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステル、スルホン酸、スルホン酸塩、アミノ、アルキル アミノまたはジアルキルアミノで１回以上置換され、これらのアルキル基は、１ 〜６個の炭素を有する；あるいはR¹⁰が次式を有し ここでR¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶は独立してH、F、Cl、Br、I；あるいは スルホン酸、スルホン酸塩、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆ア ルコールエステル、カルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステル、CN、ニトロ、ヒド ロキシ、アジド、アミノ、ヒドラジノ；あるいはC₁-C₁₈アルキル、C₁-C₁₈アルコ キシ、C₁-C₁₈アルキルチオ、C₁-C₁₈アルキルアミノ、C₁-C₁₈アルキルエステル、 C₁-C₁₈アルキルアミドまたはC₁-C₁₈アリールアミドであり、これらのアルキルま たはアリール部分は任意にF、Cl、Br、I、ヒドロキシ、カルボン酸、カルボン酸 塩、カルボン酸のC₁-C₆アルコールエステル、カルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エス テル、スルホン酸、スルホン酸塩、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ またはアルコキシで１回以上置換され、各々のアルキル部分 は１〜６個の炭素を有する；あるいは、隣接する置換基R¹³およびR¹⁴、R¹⁴およ びR¹⁵、またはR¹⁵およびR¹⁶のうちの一対は、組み合わされた場合、縮合６員芳 香族環を形成し、これは任意にさらにカルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸の C₁-C₆アルコールエステル、カルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステルで置換される ；そして R¹¹が、H、ヒドロキシ、CNまたはC_1-6アルコキシであり；あるいはR¹⁰はR¹¹と 組み合わされて５員のスピロラクトン環または５員のスピロスルトン環を形成し ；あるいはR¹¹はR¹²と組み合わされて５員または６員のスピロラクトン環、また は５員または６員のスピロスルトン環を形成し、これは任意に、かつ独立してH 、FまたはCH₃で置換される；あるいはR¹⁰はR¹¹と一緒になって、カルボニル酸素 である、化合物であり； ただし、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R¹⁰、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵またはR¹⁶のうち の少なくとも１つはFであり、そしてR¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R¹⁰、R¹²、R¹³、 R¹⁴、R¹⁵またはR¹⁶のうちのただ１つがFの場合、R¹⁴はFではない、化合物。 ４．R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶のうちの 少なくとも１つが-L-R_xであるか、あるいは修飾されて-L-R_xとなり、ここで各-L -R_xが任意に同じかまたは異なり；そして Lが単共有結合であり、またはLが、C、N、OおよびSからなる群から選択され る１〜24個の非水素原子を含み、かつ単結合、二重結合、三重結合または芳香族 の、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および 炭素−イオウ結合の任意の組み合わせから構成される、共有結合であり；そして R_xが反応性部位である、 請求項３に記載の、化合物。 ５．少なくとも１つの-L-R_xが修飾されて-L-S_cとなり、ここで各-L-S_cが任意に 同じかまたは異なり；そして Lが単共有結合であり、またはLが、C、N、OおよびSからなる群から選択され る１〜24個の非水素原子を含み、かつ単結合、二重結合、三重結合または芳香族 の、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素一酸素結合および 炭素−イオウ結合の任意の組み合わせから構成される、共有結合であり；そして S_cが結合基質である、 請求項３に記載の、化合物。 ６．R⁷、R⁸、またはR⁹の少なくとも１つが修飾されてブロックとなり； ここで、各ブロック部分が、独立して、ホスフェートから、またはスルフェー トから、あるいはそれらの生物学的に適合性の塩からのヒドロキシ基の除去によ って誘導される一価部分；あるいは脂肪族または芳香族のカルボン酸またはアミ ノ酸、保護アミノ酸、ペプチド、または保護ペプチドのカルボキシ基からのヒド ロキシ基の除去によって誘導される一価部分；あるいはアルコールから、または 単糖または多糖からのヒドロキシ基の除去によって誘導される一価部分であり、 ここで該ブロックが、酵素の作用によって該化合物がら除去され得るように選択 され；あるいはブロックが光に不安定なケージング基である、請求項３、４、ま たは５に記載の化合物。 ７．R²、R³、R⁴またはR⁵の少なくとも１つがFである、請求項３、４、または５ に記載の化合物。 ８．R²およびR⁵がFである、請求項３、４、または５に記載の化合物。 ９．R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶の少なくとも３つがFである、請求項３、４、また は５に記載の化合物。 １０．R¹²が、カルボン酸、カルボン酸塩、スルホン酸またはスルホン酸塩であ る、請求項３、４、または５に記載の化合物。 １１．R¹およびR⁶がHであり、そしてR²、R³、R⁴、R⁵が独立して、H、F、Cl、Br 、I、またはC₁-C₆アルコキシである、請求項３、４、または５に記載の化合物。 １２．AがOR⁷である、請求項３、４、または５に記載の化合物。 １３．各R⁷がHである、請求項１２に記載の化合物。 １４．R¹¹がHである、請求項３、４、または５に記載の化合物。 １５．AがNR⁸R⁹である、請求項３、４、または５に記載の化合物。 １６．各置換基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶が、FまたはH のいずれかである、請求項３、４、または５に記載の化合物。 １７．次式を有する、請求項３に記載の化合物であって、 ここで、 R²、R³、R⁴およびR⁵が独立してHまたはFであり； R¹²が、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆アルコールエステル、 スルホン酸またはスルホン酸塩であり； R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶が、独立して,H；F；カルボン酸；カルボン酸塩；カ ルボン酸のC₁-C₆アルコールエステル；カルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステル； スルホン酸；スルホン酸塩；またはC₁-C₆アルキルチオであり、これが任意にカ ルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆アルコールエステル、またはカル ボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステルで置換される、請求項３に記載の化合物。 １８．各Lが、独立して１〜６個の炭素原子を含み、単共有結合であるか、ある いはLの最長の線状セグメントが、１〜２個のヘテロ原子を含む４〜10個の非水 素原子を含む、請求項４または５に記載の化合物。 １９．R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶の厳密に１つが、-L-R_xまたは-L-S_cである 、請求項４または５に記載の化合物。 ２０．R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷、R⁸、R⁹またはR¹⁰の厳密に１つが、-L-R_xまたは-L-S_c である、請求項４または５に記載の化合物。 ２１．R_xが、アクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、ア シルハライド、アシルニトリル、ヒドロキシ、アルデヒド、アルキルハライド、 スルホネート、アミン、無水物、アニリン、アリールハライド、アジド、アジリ ジン、ボロネート、カルボン酸、カルボジイミド、ジアゾアルカン、エポキシド 、グリコール、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、ヒドロキシル アミン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、ケトン、マレ イミド、ホスホルアミダイト、シリルハライド、スルホニルハライド、またはチ オール基である、請求項４に記載の化合物。 ２２．Lが、単共有結合であり、そしてR_xが、カルボン酸、カルボン酸の活性化 エステル、アミン、アジド、ハロアセトアミド、アルキルハライド、スルホニル ハライド、イソチオシアネート、またはマレイミド基である、請求項２１に記載 の化合物。 ２３．S_cが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、イオン錯形成部分、ヌク レオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、薬物、脂質、親油性ポリマー、非生物学 的有機ポリマー、動物細胞、植物細胞、細菌、酵母、またはウィルスである、請 求項５に記載の化合物。 ２４．S_cが、リン脂質、リポタンパク質、リポ多糖、またはリポソームである、 請求項２３に記載の化合物。 ２５．S_cが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオ チド、核酸、イオン錯形成部分、多糖、あるいは非生物学的有機ポリマーまたは ポリマー微粒予である、請求項２３に記載の化合物。 ２６．S_cが、抗体、抗体フラグメント、アビジン、ストレプトアビジン、レクチ ン、プロテインAまたはプロテインGである、請求項２５に記載の化合物。 ２７．AがOR⁷であり、R⁷がブロックである、請求項６に記載の化合物。 ２８．ブロックが、ホスフェート、スルフェートあるいは脂肪族または芳香族カ ルボン酸である、請求項２７に記載の化合物。 ２９．ブロックが、アルコールあるいは単糖または多糖のエーテルである、請求 項６に記載の化合物。 ３０．R⁷およびR⁸がブロックであり、そしてブロックが光に不安定なケージング 基であり、これがo-ニトロアリールメチン、2-メトキシ-5-ニトロフェニルまた はデシル部分である、請求項６に記載の化合物。 ３１．R⁹がHであり；R⁸がブロックであり、ここでブロックが、アミノ酸、ペプ チ ドまたは保護ペプチドであり；あるいはR³がC₁-C₁₈脂肪族カルボン酸、アリール アルカンカルボン酸またはアルキル芳香族カルボン酸であり、これらのアルキル またはアリール部分が、任意に、F、Cl、Br、Ｉ、ヒドロキシ、カルボン酸、カ ルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆アルコールエステル、カルボン酸の-CH₂O-(C=O) -R¹⁸エステルで１回以上置換される、請求項６に記載の化合物。 ３２．生物学的試料の染色方法であって、 ａ）請求項４、５、６または７のいずれかに記載の染料化合物を含む染料溶液を 、所望の条件下で検出可能な光学的応答を与えるに十分な濃度で、調製する工程 ； ｂ）該目的の試料と該染料溶液とを、該染料化合物が、照射すると検出可能な光 学的応答を与えるに十分な時間、組み合わせる工程；および ｃ）該試料を、該光学的応答を誘発するために選択された波長で照射する工程を 包含する、染色方法。 ３３．前記試料を、前記光学的応答と検出可能に異なるスペクトル特性を有する さらなる検出試薬と組み合わせる工程をさらに包含する、請求項３２に記載の染 色方法。 ３４．前記試料の性質を、標準応答パラメータによる光学的応答と比較すること によって、決定する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の染色方法。 ３５．前記決定される試料の性質が、試料中の酸化的酵素の活性であり、そして ここで前記染料化合物についてR¹¹がHである、請求項３４に記載の染色方法。 ３６．前記試料が細胞を含み、そして前記決定される試料の性質が該細胞の保持 効率であり、そしてここで前記染料溶液が次式の染料を、蛍光発光である検出可 能な光学的応答を与える少なくとも最少濃度で含み ここで、 R²、R³、R⁴およびR⁵が、独立して、H、F、Cl，Br、I、CN、C₁-C₁₈アルキル、C₁ -C₁₈アルコキシ、またはC₁-C₁₈アルキルチオであり、ここで各アルキル、アル コキシ、またはアルキルチオは、任意に、さらにF、Cl、Br、I、アミノ、アルキ ルアミノ、ジアルキルアミノ、またはアルコキシで置換され、これらのアルキル 部分は、独立して１〜６個の炭素を有し；あるいはR³およびR⁴のうちの１つまた は両方が-CH₂N(CH₂COOR¹⁷)₂であり、ここでR¹⁷が１〜６個の炭素を有する直鎖ま たは分岐のアルキル、または-CH₂O−(C=O)-R¹⁸であり、ここでR¹⁸はC₁-C₄アルキ ルであり；そしてブロックがアセテートである、請求項３４に記載の染色方法。 ３７．比較が、前記生物学的試料中の前記光学的応答の時間的または空間的位置 をトレースすることを含む、請求項３２に記載の染色方法。 ３８．前記染料化合物に関して、 R²、R³、R⁴およびR⁵が独立してHまたはFであり； R¹²が、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆アルキルエステル、カ ルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステル、スルホン酸またはスルホン酸塩であり； R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶が、独立して,H；F；カルボン酸；カルボン酸塩；カ ルボン酸のC₁-C₆アルキルエステル；カルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステル；ス ルホン酸；スルホン酸塩；またはC₁-C₆アルキルチオであり、これが任意にカル ボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸のC₁-C₆アルキルエステル、カルボン酸の-CH₂ O-(C=O)- R¹⁸エステルで置換される、請求項３７に記載の染色方法。 ３９．前記染料化合物に関して、 R³およびR⁴のうちの１つまたは両方が-CH₂N(CR¹⁹HCOOR¹⁷)₂であり、ここ でR¹⁷はH、生物学的に適合性の対イオン、１〜６個の炭素を有する直鎖または分 岐のアルキル、または-CH₂O-(C=O)-R¹⁸であり、ここでR¹⁸はC₁-C₄アルキルであ り；そしてR¹⁹はHまたはCH₃であり；あるいは R¹³、R¹⁴、R¹⁵またはR¹⁶のうち１つが、カルボン酸、カルボン酸塩、カル ボン酸のC₁-C₆アルコールエステル、カルボン酸の-CH₂O-(C=O)-R¹⁸エステル（こ こでR¹⁸はC₁-C₄アルキル）、スルホン酸、スルホン酸塩、C₁-C₁₈アルキル、C₁-C₁₈ アルコキシ、C₁-C₁₈アルキルチオ、C₁-C₁₈アルキルアミノ、C₁-C₁₈アルキルア ミドまたはC₁-C₁₈アリールアミドである、 請求項３７に記載の染色方法。 ４０．R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶のうち１つが、C₁-C₁₈アルキル、C₁-C₁₈アルコキ シ、C₁-C₁₈アルキルチオ、C₁-C₁₈アルキルアミノ、C₁-C₁₈アルキルアミドまたは C₁-C₁₈アリールアミドである、請求項３９に記載の染色方法。 ４１．前記染料化合物に関して、 R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶のうちの少なくとも１つが-L-R_xであり； ここでR_xが、ハロアセトアミド、アルキルハライド、ハロメチルベンズアミド 、 またはパーフルオロベンズアミドである、 請求項３７に記載の染色方法。 ４２．前記染料化合物に関して、 R¹³、R¹⁴、R¹⁵およびR¹⁶のうちの少なくとも１つがL-S_cであり； ここでS_cが、タンパク質、多糖、イオン錯形成部分、脂質、または非生物学的 有機ポリマーまたはポリマー微粒子であり、これが任意に１つ以上のさらなる発 蛍光団に結合し、これらが同じかまたは異なる、 請求項３７に記載の染色方法。 ４３．前記染料化合物に関して、 少なくとも１つのR⁷がブロックであり、該ブロックがカルボン酸のカルボキシ 基からのヒドロキシ基の除去によって誘導される一価部分であるか、または該ブ ロックが光に不安定なケージング基である、 請求項３７に記載の染色方法。 ４４．前記試料がさらに細胞を含み、そしてここで前記染料化合物に関して、 少なくとも１つのR⁷がブロックまたはHであり； R¹¹がR¹²と組み合わされて、５員または６員のスピロラクトン環あるいは５員 または６員のスピロスルトン環を形成し；そして R¹³〜R¹⁶の各々がFであり； 該試料と該染料化合物とを組み合わせた後、該細胞の外側の残留染料化合物を除 去するために任意に該細胞を洗浄する工程をさらに含む、請求項３２に記載の染 色方法。