JP2523423B2 - 分子プロ―ブとしての４，７―ジクロロフルオレセイン色素 - Google Patents
分子プロ―ブとしての４，７―ジクロロフルオレセイン色素Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、一般に螢光標識技術に関するものであり、
さらに詳しくは、同一の試料から多数の標的物質を検出
するための、4,7−ジクロロフルオレセインの利用に関
するものである。
さらに詳しくは、同一の試料から多数の標的物質を検出
するための、4,7−ジクロロフルオレセインの利用に関
するものである。
発明の背景 多くの、診断的な、あるいは分析的は技術は、同一試
料中の多数の標的物質を、識別することのできる蛍光性
の標識で標識付けすることを必要とする、例えばラニエ
ルらによるジャーナル・オブ・イムノロジー、第132
巻、151〜156頁（1984）によって例示されるようなフロ
ーサイトメトリー；およびグレイらによるクロモソー
マ、第73巻、９〜27頁（1979）によって例示されるよう
な染色体分析。この要求を満たすことは、最も自動化さ
れた手順において、スペクトルで分解できる染料が少な
くとも四種必要とされる。DNAの配列分析において特に
難しい。
料中の多数の標的物質を、識別することのできる蛍光性
の標識で標識付けすることを必要とする、例えばラニエ
ルらによるジャーナル・オブ・イムノロジー、第132
巻、151〜156頁（1984）によって例示されるようなフロ
ーサイトメトリー；およびグレイらによるクロモソー
マ、第73巻、９〜27頁（1979）によって例示されるよう
な染色体分析。この要求を満たすことは、最も自動化さ
れた手順において、スペクトルで分解できる染料が少な
くとも四種必要とされる。DNAの配列分析において特に
難しい。
現在では、DNAの配列決定について、二つの基本的ア
プローチがある：ジデオキシチェインターミネーター
法、例えばサンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンシーズ、第
74巻、5463〜5467頁（1977）および化学的分解法、例え
ばマキサムら、プロシーディンクズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、56
0〜564頁（1977）。チェインターミネーター法は、いく
つかの方法によって改良されてきており、最近の全ての
入手できる自動化DNA配列分析装置の基礎として役に立
っている。例えば、サンガーら、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジィ、第143巻、161〜178頁（198
0）；シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジィ、第129巻、169〜172頁（1979）；ス
ミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第13巻、
2399〜2412頁（1985）；スミスら、ネイチュア、第321
巻、674〜679頁（1987）；プロバーら、サイエンス、第
238巻、336〜341頁（1987）、セクション11、メソッズ
・イン・エンザイモロジィ、第155巻、51〜334頁（198
7）；チャーチら、サイエンス、第240巻、185〜188頁
（1988）；およびコンネルら、バイオテクニクス、第５
巻、342〜348頁（1987）。
プローチがある：ジデオキシチェインターミネーター
法、例えばサンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンシーズ、第
74巻、5463〜5467頁（1977）および化学的分解法、例え
ばマキサムら、プロシーディンクズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、56
0〜564頁（1977）。チェインターミネーター法は、いく
つかの方法によって改良されてきており、最近の全ての
入手できる自動化DNA配列分析装置の基礎として役に立
っている。例えば、サンガーら、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジィ、第143巻、161〜178頁（198
0）；シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジィ、第129巻、169〜172頁（1979）；ス
ミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第13巻、
2399〜2412頁（1985）；スミスら、ネイチュア、第321
巻、674〜679頁（1987）；プロバーら、サイエンス、第
238巻、336〜341頁（1987）、セクション11、メソッズ
・イン・エンザイモロジィ、第155巻、51〜334頁（198
7）；チャーチら、サイエンス、第240巻、185〜188頁
（1988）；およびコンネルら、バイオテクニクス、第５
巻、342〜348頁（1987）。
チェインターミネーター法と化学的分解法はともに、
一つあるいはそれ以上のセットの標識付けされたDNAの
フラグメントの世代を必要とし、それぞれのDNAは共通
の起原を持ち、また、既知の塩基を末端に持つ。そして
一つあるいはそれ以上のセットのフラグメントは、配列
情報を得るための大きさに分離されねばならない。両方
の方法ともに、DNAフラグメントは、高度のゲル電気泳
動分離によって分離される。最も自動化されたDNA配列
分析装置では、異なる末端塩基を持つフラグメントは、
異なる蛍光色素によって標識付けされ、それらはプライ
マー、例えばスミスら（1987、上記参照）、または末端
ジデオキシヌクレオチドの塩基、例えばプロバーら（上
記参照）、のいずれかに結合している。標識付けされた
フラグメントは、一緒に合わされて同一のゲルカラムに
電気泳動分離するために装填される。塩基配列は、分離
工程の間に据え付けの検出器をフラグメントが通過する
時に、フラグメントによって放射される蛍光性の信号を
分析することによって決定される。
一つあるいはそれ以上のセットの標識付けされたDNAの
フラグメントの世代を必要とし、それぞれのDNAは共通
の起原を持ち、また、既知の塩基を末端に持つ。そして
一つあるいはそれ以上のセットのフラグメントは、配列
情報を得るための大きさに分離されねばならない。両方
の方法ともに、DNAフラグメントは、高度のゲル電気泳
動分離によって分離される。最も自動化されたDNA配列
分析装置では、異なる末端塩基を持つフラグメントは、
異なる蛍光色素によって標識付けされ、それらはプライ
マー、例えばスミスら（1987、上記参照）、または末端
ジデオキシヌクレオチドの塩基、例えばプロバーら（上
記参照）、のいずれかに結合している。標識付けされた
フラグメントは、一緒に合わされて同一のゲルカラムに
電気泳動分離するために装填される。塩基配列は、分離
工程の間に据え付けの検出器をフラグメントが通過する
時に、フラグメントによって放射される蛍光性の信号を
分析することによって決定される。
異なるフラグメントを標識付けするための１組の色素
を得るのは、このようなDNA配列システムにおいては大
変難しい。第一に、有機蛍光色素に対する代表的な放出
バンド半幅が約40〜80ナノメーター（nm）であり、可視
スペクトルの幅が約350〜400nmに過ぎないので、かなり
の部分がオーバーラップする放射バンドを持たないよう
な、３種あるいはそれ以上の色素を見つけることが難し
い。第二に、部分的にオーバーラップしない放射バンド
を持つ色素が見いだされた時でも、もしそれぞれの蛍光
効率が余りに低ければ、そのセットは、そえでもDNA配
列に適さない。例えば、プリングルら、DNAコア・ファ
シリティス・ニュースレター、第１巻、15〜21頁（198
8）には、装填するゲルを増やしても、低い蛍光効率を
埋め合わせることが出来ないことを示すデータがある。
第三に、数種の蛍光色素が同時に使われた時、色素の吸
収バンドがしばしば広く分離するので、励起が困難にな
る。最も効率的な励起が起こすのは、それぞれの色素
が、吸収バンドの最大に一致する波長で照射される時で
ある。複数の色素が使われる時、検出システムの感度と
各色素に対する別々の励起源を供給するためのコストの
増大との間で、妥協を強いられる場合が多い。第四に、
単一のゲルのカラム中の異なる大きさのフラグメントの
数が数百よりも多い時、色素の物理化学的性質と、色素
をフラグメントに結合するための方法が非常に重要とな
る。大きいバンドの広がりが起きるか、またはゲルのバ
ンドの位置が逆になり、これによって、配列を決定する
核酸中のバンドの順番と塩基の順番との間の一致が壊さ
れるように、荷電、分子量、および色素とリンカーの形
態が、大きさの接近しているフラグメントの電気泳動の
流動性に逆に影響してはいけない。最後に、蛍光色素
は、フラグメントを作り上げるかまたは操作するために
使われる化学物質と混合しても、化学反応を起こさない
ことが必要である。例えば、チェインターミネーター法
においては、プライマーに標識付けするために使われる
色素および／またはジデオキシチェインターミネーター
は、用いられるポリメラーゼまたは逆転写酵素の活性を
妨げてはいけない。
を得るのは、このようなDNA配列システムにおいては大
変難しい。第一に、有機蛍光色素に対する代表的な放出
バンド半幅が約40〜80ナノメーター（nm）であり、可視
スペクトルの幅が約350〜400nmに過ぎないので、かなり
の部分がオーバーラップする放射バンドを持たないよう
な、３種あるいはそれ以上の色素を見つけることが難し
い。第二に、部分的にオーバーラップしない放射バンド
を持つ色素が見いだされた時でも、もしそれぞれの蛍光
効率が余りに低ければ、そのセットは、そえでもDNA配
列に適さない。例えば、プリングルら、DNAコア・ファ
シリティス・ニュースレター、第１巻、15〜21頁（198
8）には、装填するゲルを増やしても、低い蛍光効率を
埋め合わせることが出来ないことを示すデータがある。
第三に、数種の蛍光色素が同時に使われた時、色素の吸
収バンドがしばしば広く分離するので、励起が困難にな
る。最も効率的な励起が起こすのは、それぞれの色素
が、吸収バンドの最大に一致する波長で照射される時で
ある。複数の色素が使われる時、検出システムの感度と
各色素に対する別々の励起源を供給するためのコストの
増大との間で、妥協を強いられる場合が多い。第四に、
単一のゲルのカラム中の異なる大きさのフラグメントの
数が数百よりも多い時、色素の物理化学的性質と、色素
をフラグメントに結合するための方法が非常に重要とな
る。大きいバンドの広がりが起きるか、またはゲルのバ
ンドの位置が逆になり、これによって、配列を決定する
核酸中のバンドの順番と塩基の順番との間の一致が壊さ
れるように、荷電、分子量、および色素とリンカーの形
態が、大きさの接近しているフラグメントの電気泳動の
流動性に逆に影響してはいけない。最後に、蛍光色素
は、フラグメントを作り上げるかまたは操作するために
使われる化学物質と混合しても、化学反応を起こさない
ことが必要である。例えば、チェインターミネーター法
においては、プライマーに標識付けするために使われる
色素および／またはジデオキシチェインターミネーター
は、用いられるポリメラーゼまたは逆転写酵素の活性を
妨げてはいけない。
これらの厳しい制約のために、自動化DNA配列分析や
他の診断的で分析的な技術に使い得る蛍光色素のセット
は、ほんの数セットしか見つかってしない、例えばスミ
スら（1985、上記参照）：プロバーら（上記参照）、フ
ードら、英国特許第2,155,176号；およびコンネルら
（上記参照）。
他の診断的で分析的な技術に使い得る蛍光色素のセット
は、ほんの数セットしか見つかってしない、例えばスミ
スら（1985、上記参照）：プロバーら（上記参照）、フ
ードら、英国特許第2,155,176号；およびコンネルら
（上記参照）。
上のことを考慮して、多くの分析的で診断的な技術、
例えばDNA配列分析は、新しい蛍光色素のセットが利用
できることによって大きく進歩するであろう。それは
（１）物理化学的に類似であり、（２）空間的にオーバ
ーラップする標的物質、例えば位置の接近しているゲル
上のDNAバンドの検出が可能であり、（３）自動DNA配列
分析の最近の方法によって単一のゲルカラムで決定でき
る塩基の数を広げ、（４）広い範囲の分離および操作上
の技術を使用することができ、（５）その他に上記の多
くの要求を満足することである。
例えばDNA配列分析は、新しい蛍光色素のセットが利用
できることによって大きく進歩するであろう。それは
（１）物理化学的に類似であり、（２）空間的にオーバ
ーラップする標的物質、例えば位置の接近しているゲル
上のDNAバンドの検出が可能であり、（３）自動DNA配列
分析の最近の方法によって単一のゲルカラムで決定でき
る塩基の数を広げ、（４）広い範囲の分離および操作上
の技術を使用することができ、（５）その他に上記の多
くの要求を満足することである。
発明の概要 本発明は、空間的にオーバーラップする標的物質を、
4,7−ジクロロフルオレセイン色素を用いて、同時に検
出する方法に関するものである。本発明はまた、4,7−
ジクロロフルオレセイン色素を用いるDNA配列決定の方
法、および式Ｉによって示される１′,2′,7′,8′−ジ
ベンゾ−５（および６−）カルボキシ−4,7,−ジクロロ
フルオレセインから成る化合物を含む。
4,7−ジクロロフルオレセイン色素を用いて、同時に検
出する方法に関するものである。本発明はまた、4,7−
ジクロロフルオレセイン色素を用いるDNA配列決定の方
法、および式Ｉによって示される１′,2′,7′,8′−ジ
ベンゾ−５（および６−）カルボキシ−4,7,−ジクロロ
フルオレセインから成る化合物を含む。
式中： Ａ′は水素、フッ素、塩素あるいは、例えばカルボキ
シル基、スルホニル基、またはアミノ基のような基であ
り、これらは、結合する官能基に転化することができ；
好ましくは、Ａは結合する官能基に転化されうる基であ
る； Ｘ′は水素、フッ素あるいは塩素であり、そしてＡ′
が６炭素原子の置換基であるときはいつでもＸ′は５炭
素原子の置換基であり、Ａ′が５炭素原子の置換基であ
るときはいつでもＸ′は６炭素原子の置換基であり；好
ましくは、Ｘ′は水素である； Z3は水素、フッ素、塩素あるいは、例えばカルボキシ
ル基、スルホニル基やメチルアミノ基のような基であ
り、これらは、結合する官能基に転化することができ、
好ましくは、Z3は水素が塩素である； Z4は水素、フッ素、塩素あるいは、例えばカルボキシ
ル基、スルホニル基やメチルアミノ基のような基であ
り、これらは、結合する官能基に転化することができ、
好ましくは、Z4は水素が塩素である； Ｂ′はフッ素、塩素あるいは、酸性アニオン基であ
り、好ましくは、Ｂ′はカルボキシル基、あるいはスル
ホニル基であり、そして最も好ましくは、Ｂ′はカルボ
キシル基である； そして、Ａ′、Z3、Z4、のうちの少なくとも一つは、
結合する官能基に転化されうる基である。好ましくは、
Ａ′、Z3、およびZ4のうちのただ一つの基だけが、結合
する官能基に転化することができる。
シル基、スルホニル基、またはアミノ基のような基であ
り、これらは、結合する官能基に転化することができ；
好ましくは、Ａは結合する官能基に転化されうる基であ
る； Ｘ′は水素、フッ素あるいは塩素であり、そしてＡ′
が６炭素原子の置換基であるときはいつでもＸ′は５炭
素原子の置換基であり、Ａ′が５炭素原子の置換基であ
るときはいつでもＸ′は６炭素原子の置換基であり；好
ましくは、Ｘ′は水素である； Z3は水素、フッ素、塩素あるいは、例えばカルボキシ
ル基、スルホニル基やメチルアミノ基のような基であ
り、これらは、結合する官能基に転化することができ、
好ましくは、Z3は水素が塩素である； Z4は水素、フッ素、塩素あるいは、例えばカルボキシ
ル基、スルホニル基やメチルアミノ基のような基であ
り、これらは、結合する官能基に転化することができ、
好ましくは、Z4は水素が塩素である； Ｂ′はフッ素、塩素あるいは、酸性アニオン基であ
り、好ましくは、Ｂ′はカルボキシル基、あるいはスル
ホニル基であり、そして最も好ましくは、Ｂ′はカルボ
キシル基である； そして、Ａ′、Z3、Z4、のうちの少なくとも一つは、
結合する官能基に転化されうる基である。好ましくは、
Ａ′、Z3、およびZ4のうちのただ一つの基だけが、結合
する官能基に転化することができる。
全体を通じて、カラー・インデックス（アソシエイシ
ョン・オブ・テキスタイル・ケミスツ、第２版、1971）
カーボン・ナンバーリング図を使用する、即ち、プライ
ムを付けた数はキサンテン構造の炭素に関係し、プライ
ムを付けていない数は９′−フェニルの炭素に関係す
る。
ョン・オブ・テキスタイル・ケミスツ、第２版、1971）
カーボン・ナンバーリング図を使用する、即ち、プライ
ムを付けた数はキサンテン構造の炭素に関係し、プライ
ムを付けていない数は９′−フェニルの炭素に関係す
る。
本発明は、一部分、4,7−クロロ−５−（および６
−）カルボキシルフルオレセインの蛍光性の性質およ
び、関連している色素が分子プローブとして使用するた
めに非常に好都合であるという発見に基づくものであ
る。これらの放射バンドの幅は一般に、4,7−ジクロロ
誘導体が欠けている類似化合物に比べて、20〜30％狭
く、これらの放射および吸収の上限は、一般に、4,7−
ジクロロ誘導体が欠けている類似化合物に比べて、約10
〜30mm波長が長く、さらに、これらの蛍光効率は高く、
いくつかの場合においては、4,7−ジクロロ誘導体が欠
けている類似化合物のそれの三倍近くにもなる。
−）カルボキシルフルオレセインの蛍光性の性質およ
び、関連している色素が分子プローブとして使用するた
めに非常に好都合であるという発見に基づくものであ
る。これらの放射バンドの幅は一般に、4,7−ジクロロ
誘導体が欠けている類似化合物に比べて、20〜30％狭
く、これらの放射および吸収の上限は、一般に、4,7−
ジクロロ誘導体が欠けている類似化合物に比べて、約10
〜30mm波長が長く、さらに、これらの蛍光効率は高く、
いくつかの場合においては、4,7−ジクロロ誘導体が欠
けている類似化合物のそれの三倍近くにもなる。
発明の詳細な説明 上に述べたように、本発明は、一部は、著しく長い波
長で吸収および放射の上限を持ち、狭い放射バンドの幅
と他の都合のよい蛍光性質をもつ蛍光色素の種類の発見
に基づくものである。さらに、本発明は、この種類の色
素の一員として、式Ｉによって定義される新しい蛍光色
素類自体を含む。これらの色素は、スペクトルにより分
解でき、物理化学的に類似した色素、特に自動化された
DNA配列分析に有用な色素の新しいセットのアセンブリ
イを可能にする。
長で吸収および放射の上限を持ち、狭い放射バンドの幅
と他の都合のよい蛍光性質をもつ蛍光色素の種類の発見
に基づくものである。さらに、本発明は、この種類の色
素の一員として、式Ｉによって定義される新しい蛍光色
素類自体を含む。これらの色素は、スペクトルにより分
解でき、物理化学的に類似した色素、特に自動化された
DNA配列分析に有用な色素の新しいセットのアセンブリ
イを可能にする。
色素のセットに関してここで使われる“スペクトルに
より分解できる”という言葉は、色素の蛍光性の放射バ
ンドが十分にはっきりと識別できる、すなわち十分にオ
ーバーラップしていないことを意味し、それぞれの色素
を結合した標的物質、例えばポリヌクレオチドはそれぞ
れの色素から生じる蛍光信号を基礎として、標準光検出
装置によって、例えば、バンドパスフィルタと光電増倍
管等を用いて識別することができる。このようなシステ
ムとしては、例えば米国特許4,230,558、4,811、218
等、あるいはホイーレスら、21〜76頁、フロウ・シトメ
トリー：インストルメンテイション・アンド・データ・
アナリシス（アカデミックプレス、ニューヨーク、198
5）に記載されているものが例示される。
より分解できる”という言葉は、色素の蛍光性の放射バ
ンドが十分にはっきりと識別できる、すなわち十分にオ
ーバーラップしていないことを意味し、それぞれの色素
を結合した標的物質、例えばポリヌクレオチドはそれぞ
れの色素から生じる蛍光信号を基礎として、標準光検出
装置によって、例えば、バンドパスフィルタと光電増倍
管等を用いて識別することができる。このようなシステ
ムとしては、例えば米国特許4,230,558、4,811、218
等、あるいはホイーレスら、21〜76頁、フロウ・シトメ
トリー：インストルメンテイション・アンド・データ・
アナリシス（アカデミックプレス、ニューヨーク、198
5）に記載されているものが例示される。
直接的にあるいはエーテルに関連して、ここで使われ
る“低級アルキル”という言葉は、１〜６の炭素原子を
含む直鎖および／または分枝鎖のアルキル基を示し、例
えば、この言葉は、メチル基、エチル基、プロピル基、
イソプロピル基、第三ブチル基、イソブチル基等を含
む。
る“低級アルキル”という言葉は、１〜６の炭素原子を
含む直鎖および／または分枝鎖のアルキル基を示し、例
えば、この言葉は、メチル基、エチル基、プロピル基、
イソプロピル基、第三ブチル基、イソブチル基等を含
む。
ここで使われている“ハロゲン”という言葉は、ハロ
ゲン原子フッ素、塩素、臭素とヨウ素を示し、さらに好
ましくは、この言葉はフッ素または塩素を示し、そして
最も好ましくは、この言葉は塩素を示す。
ゲン原子フッ素、塩素、臭素とヨウ素を示し、さらに好
ましくは、この言葉はフッ素または塩素を示し、そして
最も好ましくは、この言葉は塩素を示す。
好ましくは、本発明の4,7−クロロ−５−（および６
−）カルボキシフルオレセイン色素は、式IIによって定
義されるものを含む。
−）カルボキシフルオレセイン色素は、式IIによって定
義されるものを含む。
式中： Ａ′、Ｂ′とＸ′は上によって定義され； Z1は水素か、Z2と共にとるときはベンゾ基である； Z1は単独でとるとき、水素、ハロゲン、低級アルキル
基、低級アルコキシ基あるいは例えばカルボキシル基、
スルホニル基、メチルアミノ基のような基であり、これ
らは活性の結合する官能基に転化することができ、ある
いはZ1と共にとるときはZ2はベンゾ基である；好ましく
は、単独でとるとき、Z2は水素、メチル基、エチル基、
フッ素、塩素、メトキシ基あるいはエトキシ基である； Z3とZ3は水素、ハロゲン、低級アルキル基、低級アル
キルオキシ基、あるいは例えばカルボキシル基、スルホ
ニル基、メチルアミノ基のような基であり、これらは結
合する官能基に転化することができ；さらに好ましく
は、Z3とZ4は水素、フッ素、塩素、メチル基、エチル
基、メトキシ基あるいはエトキシ基であり； Z5は水素あるいは、Z6と共にとるときは、ベンゾ基で
あり、そして、 Z6は、単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アル
キル基、低級アルコキシ基、あるいは、例えばカルボキ
シル基、スルホニル基、メチルアミノ基のような基であ
り、これらは活性な結合する官能基に転化することがで
き、あるいはZ5と共にとるときは、Z6はベンゾ基であ
り；好ましくは、単独でとるときは、Z6は水素、メチル
基、エチル基、フッ素、塩素、メトキシ基あるいエトキ
シ基であり； そして式中、Ａ、Z2、Z3、Z4、およびZ5のうちの少な
くとも一つは、結合する官能基に転化することのできる
基である。好ましくは、Ａ、Z2、Z3、Z4、およびZ5のう
ちただ一つだけが、活性な結合する官能基に転化するこ
とのできる基である。
基、低級アルコキシ基あるいは例えばカルボキシル基、
スルホニル基、メチルアミノ基のような基であり、これ
らは活性の結合する官能基に転化することができ、ある
いはZ1と共にとるときはZ2はベンゾ基である；好ましく
は、単独でとるとき、Z2は水素、メチル基、エチル基、
フッ素、塩素、メトキシ基あるいはエトキシ基である； Z3とZ3は水素、ハロゲン、低級アルキル基、低級アル
キルオキシ基、あるいは例えばカルボキシル基、スルホ
ニル基、メチルアミノ基のような基であり、これらは結
合する官能基に転化することができ；さらに好ましく
は、Z3とZ4は水素、フッ素、塩素、メチル基、エチル
基、メトキシ基あるいはエトキシ基であり； Z5は水素あるいは、Z6と共にとるときは、ベンゾ基で
あり、そして、 Z6は、単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アル
キル基、低級アルコキシ基、あるいは、例えばカルボキ
シル基、スルホニル基、メチルアミノ基のような基であ
り、これらは活性な結合する官能基に転化することがで
き、あるいはZ5と共にとるときは、Z6はベンゾ基であ
り；好ましくは、単独でとるときは、Z6は水素、メチル
基、エチル基、フッ素、塩素、メトキシ基あるいエトキ
シ基であり； そして式中、Ａ、Z2、Z3、Z4、およびZ5のうちの少な
くとも一つは、結合する官能基に転化することのできる
基である。好ましくは、Ａ、Z2、Z3、Z4、およびZ5のう
ちただ一つだけが、活性な結合する官能基に転化するこ
とのできる基である。
本発明の多くの色素は市販されており、あるいはこの
分野で知られた技術によって合成することができる。例
えばガタクら、ジャーナル・オブ・ザ・インディアン・
ケミカル・ソサイアテイ、第６巻、465〜471頁（192
9）；およびカンナら、米国特許第4,439,356。代わりに
なるべきものとして、実施例に示したように、フルオレ
セイン類似化合物、すなわちＡ＝Ｂ＝カルボキシルの化
合物は、置換されたレゾシノールを、置換されたベンゾ
フェノンあるいは置換されたトリメリット酸と、プロピ
オン酸の存在下で反応させることによって、合成するこ
とが出来る。ＡまたはＢがスルホニルであるスルホニル
フルオレセインは、リーら、サイトメトリー、第10巻、
151〜164頁（1989）によって開示された方法に従って合
成され、適当な反応物で置換することにより改良され、
５−あるいは６−カルボキシルあるいはスルホニルフル
オレセイン生成物を与える。好ましくは、DNA配列分析
においてポリヌクレオチドを標識付けするとき、色素の
５−および６−異性体は別々に使用される。何故なら、
それらはもしも異性体の混合物が使用されるとバンドの
広がりにつながるようなわずかに異なる電気泳動の移動
性を持つからである。色素の５−と６−の異性体は逆相
HPLCによって容易に分離できる、例えばエドマドソン
ら、モレキュラー・イムノロジー、第21巻、561頁（198
4）。一般には、最初に溶離するピークは６−異性体
で、次に溶離するピークは５−異性体であると考えられ
ている。
分野で知られた技術によって合成することができる。例
えばガタクら、ジャーナル・オブ・ザ・インディアン・
ケミカル・ソサイアテイ、第６巻、465〜471頁（192
9）；およびカンナら、米国特許第4,439,356。代わりに
なるべきものとして、実施例に示したように、フルオレ
セイン類似化合物、すなわちＡ＝Ｂ＝カルボキシルの化
合物は、置換されたレゾシノールを、置換されたベンゾ
フェノンあるいは置換されたトリメリット酸と、プロピ
オン酸の存在下で反応させることによって、合成するこ
とが出来る。ＡまたはＢがスルホニルであるスルホニル
フルオレセインは、リーら、サイトメトリー、第10巻、
151〜164頁（1989）によって開示された方法に従って合
成され、適当な反応物で置換することにより改良され、
５−あるいは６−カルボキシルあるいはスルホニルフル
オレセイン生成物を与える。好ましくは、DNA配列分析
においてポリヌクレオチドを標識付けするとき、色素の
５−および６−異性体は別々に使用される。何故なら、
それらはもしも異性体の混合物が使用されるとバンドの
広がりにつながるようなわずかに異なる電気泳動の移動
性を持つからである。色素の５−と６−の異性体は逆相
HPLCによって容易に分離できる、例えばエドマドソン
ら、モレキュラー・イムノロジー、第21巻、561頁（198
4）。一般には、最初に溶離するピークは６−異性体
で、次に溶離するピークは５−異性体であると考えられ
ている。
本発明の色素は、この分野でよく知られている様々な
方法によって、標的物質に結合することができる。例え
ば、ホウグランド・ハンドブック・オブ・フルオレセン
ト・プローブス・アンド・リサーチ・ケミカルス（モレ
キュラープローブス社、ユージーン、1989）は、色素を
標的物質に結合するための方法の手引と実例を示してい
る。置換基Ａは、結合基を形成するように標的物質に相
補的官能基によって反応することができる結合する官能
基に変換される。次の表は、Ａがカルボキシル基、スル
ホニル基あるいはアミン基であってもいつでも形成され
ることのできる実例となる結合する官能基、適当な相補
的官能基、および本発明の使用に適する得られた結合基
をまとめて示したものである。
方法によって、標的物質に結合することができる。例え
ば、ホウグランド・ハンドブック・オブ・フルオレセン
ト・プローブス・アンド・リサーチ・ケミカルス（モレ
キュラープローブス社、ユージーン、1989）は、色素を
標的物質に結合するための方法の手引と実例を示してい
る。置換基Ａは、結合基を形成するように標的物質に相
補的官能基によって反応することができる結合する官能
基に変換される。次の表は、Ａがカルボキシル基、スル
ホニル基あるいはアミン基であってもいつでも形成され
ることのできる実例となる結合する官能基、適当な相補
的官能基、および本発明の使用に適する得られた結合基
をまとめて示したものである。
好ましくは、結合する官能基は相補的官能基がアミン
であるときはいつでも、イソチオシアナート、スルホニ
ルクロクド、4,6−ジクロロトリアジニルアミン、ある
いはスクシニミジルカルボキシレートである。そして、
好ましくは、相補的官能基がスルフヒドリルであるとき
はいつでも、結合する官能基はマレイミド、またはヨー
ドアセタミドである。スクシニミジルカルボキシレート
は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）に用いる
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと上記色素の５−および
／または６−カルボキシルを縮合することによって生成
することができる。例えば、カンナら、米国特許4,318,
846の実施例６および８、およびカサイら、アナリチカ
ル・ケミストリイ、第47巻、34〜37頁（1975）に示され
ている。従って、これらの引用文献を参考として加え
る。
であるときはいつでも、イソチオシアナート、スルホニ
ルクロクド、4,6−ジクロロトリアジニルアミン、ある
いはスクシニミジルカルボキシレートである。そして、
好ましくは、相補的官能基がスルフヒドリルであるとき
はいつでも、結合する官能基はマレイミド、またはヨー
ドアセタミドである。スクシニミジルカルボキシレート
は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）に用いる
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと上記色素の５−および
／または６−カルボキシルを縮合することによって生成
することができる。例えば、カンナら、米国特許4,318,
846の実施例６および８、およびカサイら、アナリチカ
ル・ケミストリイ、第47巻、34〜37頁（1975）に示され
ている。従って、これらの引用文献を参考として加え
る。
本発明の色素が、DNA配列分析のためにジデオキシヌ
クレオチドに標識付けするために使用される時、好まし
くは、色素はピリミジン塩基の５炭素と７−デアザプリ
ン塩基の７炭素に結合される。例えば、本発明とともに
用いられ得る適当な塩基の標識付けの手順がいくつか報
告されている。例えばギブソンら、ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、第15巻、6455〜6467（1987）；ゲベイ
ェフら、ヌクレイック・ジテッズ、リサーチ、第15巻、
4513〜4535頁（1987;ハラルアンビジスら、ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ、第15巻、4856〜4876（1987）
等がある。好ましくは、色素と塩基との間の結合基は、
本発明の色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）
エステルとジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ
誘導塩基を反応させることによって形成される。好まし
くは、結合基は、３−カルボキシアミノ−１−プロピニ
ルである。このようなアルキニルアミノ誘導ジデオキシ
ヌクレオチドの合成は、ホッブスらのヨーロッパ特許出
願第87305844.0号によって教示され、これを参考文献と
してここに加える。手短に言えば、アルキニルアミノ誘
導ジデオキシヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌ
クレオシド（普通、５−ヨードピリミジンと７−ヨード
−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシドといった、
ホッブスら（上記に引用）によって教示されたもの）と
銅（Ｉ）をフラスコに入れ、空気を取り除くためにArを
流し込み、乾燥DMFを加え、続いてアルキニルアミン、
トリエチルアミン及びPd（０）を添加することによって
生成される。反応混合物は数時間にわたって、あるいは
薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオシド
の消費を示すまで、攪拌される。保護されていないアル
キルアミンが用いられるとき、アルキニルアミノヌクレ
オシドは、反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生
成したハイドロハライドを中和するため水酸化アルミニ
ウムを含む溶離溶媒を使用するシリカゲルクロマトグラ
フィーによって単離することができる。保護されている
アルキルアミンが用いられるとき、メタノール／塩化メ
チレンを反応混合物に加えることができ、続いて強塩基
アニオン交換樹脂の重炭酸塩形態とする。次いでスラレ
ーを約45分間攪拌して、濾過し、樹脂を追加のメタノー
ル／塩化メチレンを用いて洗浄する。一緒に合わせた濾
液を濃縮し、メタノール−塩化メチレングラジエントを
用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによ
って精製する。トリホスフェートが標準技法によって得
られる。
クレオチドに標識付けするために使用される時、好まし
くは、色素はピリミジン塩基の５炭素と７−デアザプリ
ン塩基の７炭素に結合される。例えば、本発明とともに
用いられ得る適当な塩基の標識付けの手順がいくつか報
告されている。例えばギブソンら、ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、第15巻、6455〜6467（1987）；ゲベイ
ェフら、ヌクレイック・ジテッズ、リサーチ、第15巻、
4513〜4535頁（1987;ハラルアンビジスら、ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ、第15巻、4856〜4876（1987）
等がある。好ましくは、色素と塩基との間の結合基は、
本発明の色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）
エステルとジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ
誘導塩基を反応させることによって形成される。好まし
くは、結合基は、３−カルボキシアミノ−１−プロピニ
ルである。このようなアルキニルアミノ誘導ジデオキシ
ヌクレオチドの合成は、ホッブスらのヨーロッパ特許出
願第87305844.0号によって教示され、これを参考文献と
してここに加える。手短に言えば、アルキニルアミノ誘
導ジデオキシヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌ
クレオシド（普通、５−ヨードピリミジンと７−ヨード
−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシドといった、
ホッブスら（上記に引用）によって教示されたもの）と
銅（Ｉ）をフラスコに入れ、空気を取り除くためにArを
流し込み、乾燥DMFを加え、続いてアルキニルアミン、
トリエチルアミン及びPd（０）を添加することによって
生成される。反応混合物は数時間にわたって、あるいは
薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオシド
の消費を示すまで、攪拌される。保護されていないアル
キルアミンが用いられるとき、アルキニルアミノヌクレ
オシドは、反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生
成したハイドロハライドを中和するため水酸化アルミニ
ウムを含む溶離溶媒を使用するシリカゲルクロマトグラ
フィーによって単離することができる。保護されている
アルキルアミンが用いられるとき、メタノール／塩化メ
チレンを反応混合物に加えることができ、続いて強塩基
アニオン交換樹脂の重炭酸塩形態とする。次いでスラレ
ーを約45分間攪拌して、濾過し、樹脂を追加のメタノー
ル／塩化メチレンを用いて洗浄する。一緒に合わせた濾
液を濃縮し、メタノール−塩化メチレングラジエントを
用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによ
って精製する。トリホスフェートが標準技法によって得
られる。
本発明の標的物質は、本発明の色素を結合できるもの
であれば実質的にいずれのものでもよい。好ましくは、
色素は標的物質に共有結合により結合される。標的物質
は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカライ
ド、ポリヌクレオチド、脂質、およびこれらの組合せた
ものおよび集合したもの、例えば染色体、細胞核、生き
ている細胞、例えばバクテリア、他の微生物、および哺
乳類の細胞、組織等を含む。ここで使用される語“ポリ
ヌクレオチド”はDNAまたはRNAの一重鎖または二重鎖を
意味し、その長さは約10〜1000塩基の寸法の範囲（一重
鎖の場合）にあり、またはその長さは約10〜1000塩基対
の寸法の範囲（二重鎖の場合）にある。
であれば実質的にいずれのものでもよい。好ましくは、
色素は標的物質に共有結合により結合される。標的物質
は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカライ
ド、ポリヌクレオチド、脂質、およびこれらの組合せた
ものおよび集合したもの、例えば染色体、細胞核、生き
ている細胞、例えばバクテリア、他の微生物、および哺
乳類の細胞、組織等を含む。ここで使用される語“ポリ
ヌクレオチド”はDNAまたはRNAの一重鎖または二重鎖を
意味し、その長さは約10〜1000塩基の寸法の範囲（一重
鎖の場合）にあり、またはその長さは約10〜1000塩基対
の寸法の範囲（二重鎖の場合）にある。
若干の相補的官能基は合成オリゴヌクレオチドおよび
ポリヌクレオチドの５′または３′末端に結合すること
ができ、例えばアミノ基はフングら、米国特許第4,757,
141号およびミヨシら、米国特許第4,605,735号；または
スルフヒドリル基は、コンノリイ・ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、第13巻、4485〜4502頁（1985）、およ
びスポートら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第
15巻、4837〜4848頁（1987）を参照することができる。
ポリヌクレオチドの５′または３′末端に結合すること
ができ、例えばアミノ基はフングら、米国特許第4,757,
141号およびミヨシら、米国特許第4,605,735号；または
スルフヒドリル基は、コンノリイ・ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、第13巻、4485〜4502頁（1985）、およ
びスポートら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第
15巻、4837〜4848頁（1987）を参照することができる。
本発明の色素は特に、ゲル電気泳動のような生物化学
的分離方法を行うポリヌクレオチドの種類を同定するた
めに良く適しており、そこでは類似した物理化学的性
質、例えば、寸法、コンフォメーション、荷電、疎水性
等をもつ標的物質の一連のバンドまたはスポットが直線
または平面的な配列で存在する。ここに使用される語
“バンド”は類似したまたは同一の物理化学的性質を基
礎として標的物質の空間的グループ化または集合のいず
れをも含む。通常、バンドはゲル電気泳動によって色素
−ポリヌクレオチド共役体の分離で生じる。
的分離方法を行うポリヌクレオチドの種類を同定するた
めに良く適しており、そこでは類似した物理化学的性
質、例えば、寸法、コンフォメーション、荷電、疎水性
等をもつ標的物質の一連のバンドまたはスポットが直線
または平面的な配列で存在する。ここに使用される語
“バンド”は類似したまたは同一の物理化学的性質を基
礎として標的物質の空間的グループ化または集合のいず
れをも含む。通常、バンドはゲル電気泳動によって色素
−ポリヌクレオチド共役体の分離で生じる。
ポリヌクレオチドの分類は種々の情況を生むことがで
きる。例えば、これらは制限酵素消化物の生成物として
生じることができる。好ましくは、本発明に従って同定
される分類は、４つの可能な末端塩基と一組のスペクト
ルにより分解できる色素の数との間で一致するように、
末端ヌクレオチドによって明らかにされる。このような
セットは市販されている分光光度計を用いて放射および
吸収のバンド幅を測定することによって本発明の色素か
ら容易に組立てられる。さらに好ましくは、分類はDNA
配列分析の化学的または鎖末端方法に関連して現われ、
そして最も好ましくは分類は鎖末端方法に関連して現わ
れる。いずれの方法でも、色素−ポリヌクレオチド共役
体は標準ゲル電気泳動法によって分離される。例えばゴ
ウルドおよびマシュース、上記参照；リックウッドおよ
びハメス著、核酸のゲル電気泳動：実際的アプローチ、
（IRLプレス・リミテッド、ロンドン、1981）；または
オスターマン、メソッズ・オブ・プロテイン・アンド・
ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第１巻（スプリン
ガー・ベルラーク、ベルリン、1984）。好ましくは、ゲ
ルのタイプは約２〜20パーセントの濃度（重量対容量）
をもつポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、
ポリアクリルミアミドゲル濃度が約４〜８パーセントで
ある。好ましくは、ゲルはストランド分離または変性剤
を含む。このようなゲルを構築するための詳細な方法
は、マニアチスら、“98％ホルムアミドまたは7Mの尿素
を含有するポリアクリルアミドゲル中の低分子量DNAお
よびRNAの分別”、メソッズ・イン・エンザイモロジ
イ：第65巻、299〜305頁（1980）；マニアチスら、“ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動による小さい二重および
一重鎖DNA分子の鎖長決定、バイオケミストリィ、第14
巻、3787〜3794頁（1975）；およびマニアチスら、モレ
キュラー・クローニング；実験室手法（コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリィ、ニューヨーク、198
2）、179〜185頁。従ってこれらの参考文献は参照用に
加えられる。特定の分離に用いられる最適のゲル濃度、
pH、温度、変性剤の濃度等は、核酸が一重鎖または二重
鎖のいずれであっても、分離すべき核酸の大きさの範囲
を含めて、それからの塩基の組成；および情報を電気泳
動によって調べるための種類の性質など、多くの因子に
依存する。従って本発明の応用は特定の分離のため条件
を最適にするための標準の予備試験を必要とするかも知
れない。一例として、約20〜300塩基の大きさをもつオ
リゴヌクレオチドは次に示すゲルで本発明に従って分離
され検出された；このゲルは19部対１部のアクリルアミ
ドとビスアクリルアミドから得られた６パーセントのポ
リアクリルアミドで、48パーセント（重量／容量）尿素
を用いてpH8.3（25℃で測定）にてトリス・ボレートEDT
A緩衝液中で生成させた。このゲルを50℃で実験に供し
た。
きる。例えば、これらは制限酵素消化物の生成物として
生じることができる。好ましくは、本発明に従って同定
される分類は、４つの可能な末端塩基と一組のスペクト
ルにより分解できる色素の数との間で一致するように、
末端ヌクレオチドによって明らかにされる。このような
セットは市販されている分光光度計を用いて放射および
吸収のバンド幅を測定することによって本発明の色素か
ら容易に組立てられる。さらに好ましくは、分類はDNA
配列分析の化学的または鎖末端方法に関連して現われ、
そして最も好ましくは分類は鎖末端方法に関連して現わ
れる。いずれの方法でも、色素−ポリヌクレオチド共役
体は標準ゲル電気泳動法によって分離される。例えばゴ
ウルドおよびマシュース、上記参照；リックウッドおよ
びハメス著、核酸のゲル電気泳動：実際的アプローチ、
（IRLプレス・リミテッド、ロンドン、1981）；または
オスターマン、メソッズ・オブ・プロテイン・アンド・
ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第１巻（スプリン
ガー・ベルラーク、ベルリン、1984）。好ましくは、ゲ
ルのタイプは約２〜20パーセントの濃度（重量対容量）
をもつポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、
ポリアクリルミアミドゲル濃度が約４〜８パーセントで
ある。好ましくは、ゲルはストランド分離または変性剤
を含む。このようなゲルを構築するための詳細な方法
は、マニアチスら、“98％ホルムアミドまたは7Mの尿素
を含有するポリアクリルアミドゲル中の低分子量DNAお
よびRNAの分別”、メソッズ・イン・エンザイモロジ
イ：第65巻、299〜305頁（1980）；マニアチスら、“ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動による小さい二重および
一重鎖DNA分子の鎖長決定、バイオケミストリィ、第14
巻、3787〜3794頁（1975）；およびマニアチスら、モレ
キュラー・クローニング；実験室手法（コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリィ、ニューヨーク、198
2）、179〜185頁。従ってこれらの参考文献は参照用に
加えられる。特定の分離に用いられる最適のゲル濃度、
pH、温度、変性剤の濃度等は、核酸が一重鎖または二重
鎖のいずれであっても、分離すべき核酸の大きさの範囲
を含めて、それからの塩基の組成；および情報を電気泳
動によって調べるための種類の性質など、多くの因子に
依存する。従って本発明の応用は特定の分離のため条件
を最適にするための標準の予備試験を必要とするかも知
れない。一例として、約20〜300塩基の大きさをもつオ
リゴヌクレオチドは次に示すゲルで本発明に従って分離
され検出された；このゲルは19部対１部のアクリルアミ
ドとビスアクリルアミドから得られた６パーセントのポ
リアクリルアミドで、48パーセント（重量／容量）尿素
を用いてpH8.3（25℃で測定）にてトリス・ボレートEDT
A緩衝液中で生成させた。このゲルを50℃で実験に供し
た。
ゲル上の色素−ポリヌクレオチド共役体は標準手法、
例えば高強度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって、照
射される。好ましくは、ゲル上の色素−ポリヌクレオチ
ドはアルゴンイオンレーザーによって発生するレーザー
光、特にアルゴニオンレーザーの488および514nm発光ラ
インによって照射される。それらのラインで同時にレー
ザー光を発する複数のアルゴンイオンレーザーが市販さ
れており、シノニクス社（サニイベル、CA）のモデル20
01等が例示される。
例えば高強度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって、照
射される。好ましくは、ゲル上の色素−ポリヌクレオチ
ドはアルゴンイオンレーザーによって発生するレーザー
光、特にアルゴニオンレーザーの488および514nm発光ラ
インによって照射される。それらのラインで同時にレー
ザー光を発する複数のアルゴンイオンレーザーが市販さ
れており、シノニクス社（サニイベル、CA）のモデル20
01等が例示される。
チェインターミネーター法においては、本発明の色素
をプライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれか
に結合することができる。色素を例えば、ここに参考文
献として加えられるフングらの米国特許第4,757,141の
教示に従ってプライマーの５′末端；プライマーの塩
基；または例えば、ここに参考文献として加えられるヨ
ーロッパ特許出願番号87305844.0にホップスらによって
開示されたアルキルアミノ結合基を介するジデオキシヌ
クレオチドの塩基の相補的官能基に結合することができ
る。
をプライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれか
に結合することができる。色素を例えば、ここに参考文
献として加えられるフングらの米国特許第4,757,141の
教示に従ってプライマーの５′末端；プライマーの塩
基；または例えば、ここに参考文献として加えられるヨ
ーロッパ特許出願番号87305844.0にホップスらによって
開示されたアルキルアミノ結合基を介するジデオキシヌ
クレオチドの塩基の相補的官能基に結合することができ
る。
実施例 実施例I.4,7−ジクロロ−５−（および６−）カルボキ
シフルオレセイン（“ALF"） 0.58gの3,6−ジクロロトリメリット酸、0.72gのレゾ
ルシレノール、0.5mlの膿硫酸、および3mlのプロピオン
酸をアルゴン下に12時間還流させた。反応混合物を150m
lの水に注入し；沈降物を乾燥し、3mlのピリジンに入れ
て2mlの無水酢酸で１時間アセチル化した。アセチル化
した混合物を100mlの酢酸エチルに入れ、INの塩酸、水
で洗浄し、蒸発乾燥させた。残渣を15gのシリカゲルに
入れて50mlの酢酸エチル、次いで4:1の酢酸エチルとメ
タノールで溶離させた。約0.2のRf（4:1の酢酸エチルと
メタノール／シリカゲル）でUV活性物質を含む画分を蒸
発乾燥させた。この残渣を10mlのメタノールに溶解し次
いで1mlの4N水酸化ナトリウムを添加した。10分後、反
応混合物を水で200mlまで稀釈し、次いで0.5mlの膿塩酸
を添加した。混合物すべてを200mlの酢酸エチルで抽出
し、その後に酢酸エチルを硫酸ナトリウムで乾燥っせ
て、蒸発乾固し、102mgの黄緑色の固体を得た。
シフルオレセイン（“ALF"） 0.58gの3,6−ジクロロトリメリット酸、0.72gのレゾ
ルシレノール、0.5mlの膿硫酸、および3mlのプロピオン
酸をアルゴン下に12時間還流させた。反応混合物を150m
lの水に注入し；沈降物を乾燥し、3mlのピリジンに入れ
て2mlの無水酢酸で１時間アセチル化した。アセチル化
した混合物を100mlの酢酸エチルに入れ、INの塩酸、水
で洗浄し、蒸発乾燥させた。残渣を15gのシリカゲルに
入れて50mlの酢酸エチル、次いで4:1の酢酸エチルとメ
タノールで溶離させた。約0.2のRf（4:1の酢酸エチルと
メタノール／シリカゲル）でUV活性物質を含む画分を蒸
発乾燥させた。この残渣を10mlのメタノールに溶解し次
いで1mlの4N水酸化ナトリウムを添加した。10分後、反
応混合物を水で200mlまで稀釈し、次いで0.5mlの膿塩酸
を添加した。混合物すべてを200mlの酢酸エチルで抽出
し、その後に酢酸エチルを硫酸ナトリウムで乾燥っせ
て、蒸発乾固し、102mgの黄緑色の固体を得た。
実施例II.4,7−ジクロロ−５−（および６−）カルボキ
シフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NH
S）エステル 実施例Ｉからの13.7mgのフルオレセイン、3.3mgのNH
S、6.4mgのDCC、および1mlの酢酸エチルを0.5時間かき
まぜた。固体を濾過し、上澄を３回、1:1のブラインと
水を用いて洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固
して15mgのNHSエステルを得た。
シフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NH
S）エステル 実施例Ｉからの13.7mgのフルオレセイン、3.3mgのNH
S、6.4mgのDCC、および1mlの酢酸エチルを0.5時間かき
まぜた。固体を濾過し、上澄を３回、1:1のブラインと
水を用いて洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固
して15mgのNHSエステルを得た。
実施例III.アミノアルキルオリゴヌクレオチドを用いた
4,7−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオ
レセインの結合 実施例IIからの5mgのNHSエステルを20μｌのDMSOに溶
解した；この溶液の３μｌを1.0mMの５′−アミノヘキ
シルホスフェートオリゴヌクレオチド（18量体）の水溶
液20μｌおよび1Mの重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム
緩衝液、pH9.0、10μｌから成る溶液に添加した。暗所
で１時間後、溶液を、0.1Mトリメチルアルミニウムアセ
テート緩衝液pH7.0を用いて10mlのセファデックスＧ−2
5（媒体）カラムに通した。限定容量で溶離した着色物
質のバンドを収集した。逆相HPLCは、DNAに共役結合し
た色素の５−および６−異性体に相当する２本の蛍光性
の主ピークを示した。これらのピークを収集し、その蛍
光スペクトルはpH8.0の50％尿素中でハーフマックス34n
mと放射最大値529nmで全幅を示した。
4,7−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオ
レセインの結合 実施例IIからの5mgのNHSエステルを20μｌのDMSOに溶
解した；この溶液の３μｌを1.0mMの５′−アミノヘキ
シルホスフェートオリゴヌクレオチド（18量体）の水溶
液20μｌおよび1Mの重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム
緩衝液、pH9.0、10μｌから成る溶液に添加した。暗所
で１時間後、溶液を、0.1Mトリメチルアルミニウムアセ
テート緩衝液pH7.0を用いて10mlのセファデックスＧ−2
5（媒体）カラムに通した。限定容量で溶離した着色物
質のバンドを収集した。逆相HPLCは、DNAに共役結合し
た色素の５−および６−異性体に相当する２本の蛍光性
の主ピークを示した。これらのピークを収集し、その蛍
光スペクトルはpH8.0の50％尿素中でハーフマックス34n
mと放射最大値529nmで全幅を示した。
実施例IV.2′,7′−ジメトキシ−５−（および６−）カ
ルボキシ4,7−ジクロロフルオレセレン（“BUB"） 次に示す物質と分量に置き換えた以外は、実施例Ｉの
方法に従った:1.47gの４−メトキシレゾルシノール、0.
60gの3,6−ジクロロトリメリット酸、０。2mlの膿硫
酸、および4mlのプロピオン酸。この方法で0.180gの4,7
−ジクロロ−２′,7′−ジメトキシ−５−（および６
−）カルボキシフルオレセインを生成した。
ルボキシ4,7−ジクロロフルオレセレン（“BUB"） 次に示す物質と分量に置き換えた以外は、実施例Ｉの
方法に従った:1.47gの４−メトキシレゾルシノール、0.
60gの3,6−ジクロロトリメリット酸、０。2mlの膿硫
酸、および4mlのプロピオン酸。この方法で0.180gの4,7
−ジクロロ−２′,7′−ジメトキシ−５−（および６
−）カルボキシフルオレセインを生成した。
実施例V.2′,7′−ジメトキシ−５−（および６−）カ
ルボキシ4,7−ジクロロフルオレセインNHSエステル 18mgの実施例IVからの色素、3.5mgのNHS、6.4mgのDC
C、および2mlの酢酸エチルを用いて実施例IIと同様にし
て、1.8mgの色素NHSエステルを調製した。
ルボキシ4,7−ジクロロフルオレセインNHSエステル 18mgの実施例IVからの色素、3.5mgのNHS、6.4mgのDC
C、および2mlの酢酸エチルを用いて実施例IIと同様にし
て、1.8mgの色素NHSエステルを調製した。
実施例VI.アミノアルキルオリゴヌクレオチドを用いた
4,7−ジクロロ−２′,7′−ジメトキシ−５−（および
６−）カルボキシフルオレセインの結合 実施例Ｖの色素NHSエステルを用いて実施例IIIの方法
に従った。逆相HPLCの間に集められた２本のピークの蛍
光スペクトルはpH8.2の50％尿素中でハーフマックス37n
mと放射最大値544nmで全幅を示した。
4,7−ジクロロ−２′,7′−ジメトキシ−５−（および
６−）カルボキシフルオレセインの結合 実施例Ｖの色素NHSエステルを用いて実施例IIIの方法
に従った。逆相HPLCの間に集められた２本のピークの蛍
光スペクトルはpH8.2の50％尿素中でハーフマックス37n
mと放射最大値544nmで全幅を示した。
実施例VII.2′,7′−ジメトキシ−４′,5′−ジクロロ
−５−（および６−）カルボキシ4,7−ジクロロフルオ
レセイン（“LOU"） この色素は実施例IVの色素および水酸化ナトリウムの
水溶液に溶かした次亜塩素酸ナトリウムから調製した。
−５−（および６−）カルボキシ4,7−ジクロロフルオ
レセイン（“LOU"） この色素は実施例IVの色素および水酸化ナトリウムの
水溶液に溶かした次亜塩素酸ナトリウムから調製した。
実施例VIII.4,7−ジクロロ−２′,7′−ジメトキシ−
４′,5′−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフ
ルオレセインNHSエステル この色素NHSエステル1.1mgを、実施例VIIからの0.7mg
の色素、0.45mgのNHS、0.7mgのDCC、および0.2mlの酢酸
エチルから実施例IIのようにして調製した。
４′,5′−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフ
ルオレセインNHSエステル この色素NHSエステル1.1mgを、実施例VIIからの0.7mg
の色素、0.45mgのNHS、0.7mgのDCC、および0.2mlの酢酸
エチルから実施例IIのようにして調製した。
実施例IX.アミノアルキルオリゴヌクレオチドを用いた
4,7−ジクロロ−２′,7′−ジメトキシ−４′,5′−ジ
クロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセイン
の結合 この実施例の色素オリゴヌクレオチド結合体は実施例
VIIIからの色素NHSエステルを用い実施例IIIと同様にし
て調製した。逆相HPLCの間に集められた２本のピークの
蛍光スペクトルはpH8.2の50％尿素中でハーフマックス3
8nmと放射最大値558nmで全幅を示した。
4,7−ジクロロ−２′,7′−ジメトキシ−４′,5′−ジ
クロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセイン
の結合 この実施例の色素オリゴヌクレオチド結合体は実施例
VIIIからの色素NHSエステルを用い実施例IIIと同様にし
て調製した。逆相HPLCの間に集められた２本のピークの
蛍光スペクトルはpH8.2の50％尿素中でハーフマックス3
8nmと放射最大値558nmで全幅を示した。
実施例X.1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−５−（および６
−）カルホキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン（“NA
N"） まず、3,6−ジクロロトリメリット酸トリクロライド
を調製した:0.5gの3,6−ジクロロトリメリット酸と1.3g
の五塩化トリンの混合物を130℃にて40分間加熱した。
混合物を室温まで冷却し氷中に注いだ。次いで混合物を
40mlのエーテルで抽出し、有機画分を15mlの水で２回洗
浄し、MgSO4で乾燥させ、澄明なオイルに濃縮した（0.7
g）。さらに精製することなく酸トリクロライドを使用
した。NANを次のようにして調製した。2.7gの1,3−ジヒ
ドロキシナフタリン、2.84gの3,6−ジクロロドリメリッ
ト酸トリクロライド、および8mlのプロピオン酸の混合
物を２時間還流させた。水（50ml）と酢酸エチル（50m
l）を添加した。層を分離し、有機層を３回、50mlの1M
NaHCO3を用いて抽出した。水溶液を沸点まで加熱し、膿
HClを用いて酸性にした。得られた赤色固体（0.2g）を
濾過し乾燥した。
−）カルホキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン（“NA
N"） まず、3,6−ジクロロトリメリット酸トリクロライド
を調製した:0.5gの3,6−ジクロロトリメリット酸と1.3g
の五塩化トリンの混合物を130℃にて40分間加熱した。
混合物を室温まで冷却し氷中に注いだ。次いで混合物を
40mlのエーテルで抽出し、有機画分を15mlの水で２回洗
浄し、MgSO4で乾燥させ、澄明なオイルに濃縮した（0.7
g）。さらに精製することなく酸トリクロライドを使用
した。NANを次のようにして調製した。2.7gの1,3−ジヒ
ドロキシナフタリン、2.84gの3,6−ジクロロドリメリッ
ト酸トリクロライド、および8mlのプロピオン酸の混合
物を２時間還流させた。水（50ml）と酢酸エチル（50m
l）を添加した。層を分離し、有機層を３回、50mlの1M
NaHCO3を用いて抽出した。水溶液を沸点まで加熱し、膿
HClを用いて酸性にした。得られた赤色固体（0.2g）を
濾過し乾燥した。
実施例XI.1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−４′,5′−ジク
ロロ−５−（および６−）カルホキシ−4,7−ジクロロ
フルオレセイン（“DEB"） 20mgのNAN、水酸化ナトリウム（34μｌ、15％溶
液）、水（1ml）、および次亜塩素酸ナトリウム（170μ
ｌ、５％溶液）を一緒に合わせた。逆相HPLCは92％の反
応を示した。溶液を塩酸で酸性として、20mlの酢酸エチ
ルで抽出し、乾燥（Na2SO4）し、20mgまで濃縮した。固
体をシリカゲルカラム（１インチ（2.54cm）の直径×２
インチ（5.08cm）の高さ）のクロマトグラフィーによっ
て、600:60:16の塩化メチレンとメタノールと酢酸を用
いて溶離した精製した。色素溶液を濃縮し、稀HClと酢
酸エチルを添加した。有機層を乾燥（MgSO4）し、20mg
のDEBまで濃縮した。
ロロ−５−（および６−）カルホキシ−4,7−ジクロロ
フルオレセイン（“DEB"） 20mgのNAN、水酸化ナトリウム（34μｌ、15％溶
液）、水（1ml）、および次亜塩素酸ナトリウム（170μ
ｌ、５％溶液）を一緒に合わせた。逆相HPLCは92％の反
応を示した。溶液を塩酸で酸性として、20mlの酢酸エチ
ルで抽出し、乾燥（Na2SO4）し、20mgまで濃縮した。固
体をシリカゲルカラム（１インチ（2.54cm）の直径×２
インチ（5.08cm）の高さ）のクロマトグラフィーによっ
て、600:60:16の塩化メチレンとメタノールと酢酸を用
いて溶離した精製した。色素溶液を濃縮し、稀HClと酢
酸エチルを添加した。有機層を乾燥（MgSO4）し、20mg
のDEBまで濃縮した。
実施例XII.1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−５−（および
６−）カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセインNHSエ
ステルの生成 NAN（10mg）を2mlの酢酸エチルに溶解し、NHS（10m
g）とDCC（5mg）を添加した。20分後、溶液は暗赤色と
なり結晶性の固体が現われた。600:60:16の塩化メチレ
ンとメタノールと酢酸を用いたシリカゲルの薄層クロマ
トグラフィーでは完全にNHSエステルに変換したことを
示した。酢酸エチル溶液を稀HClで洗浄し、乾燥（MgS
O4）させて赤色固体（15mg）まで濃縮した。
６−）カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセインNHSエ
ステルの生成 NAN（10mg）を2mlの酢酸エチルに溶解し、NHS（10m
g）とDCC（5mg）を添加した。20分後、溶液は暗赤色と
なり結晶性の固体が現われた。600:60:16の塩化メチレ
ンとメタノールと酢酸を用いたシリカゲルの薄層クロマ
トグラフィーでは完全にNHSエステルに変換したことを
示した。酢酸エチル溶液を稀HClで洗浄し、乾燥（MgS
O4）させて赤色固体（15mg）まで濃縮した。
実施例XIII.DNA配列分析において色素標識プライマーと
してALF−、BUB−、LOU、およびNAN−オリゴヌレクオチ
ド共役体を使用 アプライド・バイオシステムズ（フォスター市、CA）
のモデル370A自動DNAシーケンサーを用いる鎖末端アプ
ローチにおいて色素の全フルオレセインセットを用いて
標識を付けた。この製造業者のプロトコル（ここに参考
文献として加えるユーザーブレタンDNAシーケンサーモ
デル370、第２号、1987年８月12日発行）に従って、M13
中の未知のDNAを増幅し、ゲル電気泳動分離のための別
々に標識を付けたDNAフラグメントを調製した。色素標
識プライマーを上記の実施例に記載したように調製し
た。即ち、各色素のNHSエステルを調製し、５′−アミ
ノヘキシル誘導M13ユニバーサルプライマー（５′−TCC
CAGTCACGACGTTGT−３′）と反応させて、４つの異なる
ジデオキシ反応混合物に対して色素標識プライマーを生
成した。次の変更例は標準プロトコルに作り変えた：ジ
デオキシシチジン反応においてプライマーを標識付けし
た５−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、ジ
デオキシアデノシン反応においてプライマーを標識付け
した２′,7′−ジメトキシ−５−カルボキシ−4,7−ジ
クロロフルオレセイン、ジデオキシグアノシン反応にお
いてプライマーを標識付けした２′,7′−ジメトキシ−
4,5−ジクロロ−６−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオ
レセイン、ジデオキシチミジン反応においてプライマー
を標識付けした１′,2′,7′,8′−ジベンゾ−５−カル
ボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、各反応からの
標識付けしたDNAフラメンドを次のモル比:1:1:4:2のddC
反応:ddA反応:ddG反応:ddT反応で、ゲルに装填するため
に一緒に合わせ、535、550、565、および580nmに中心を
置いた10nmバンドパスフィルターを使用する改良フィル
ターホイールを用いて検出を行った。
してALF−、BUB−、LOU、およびNAN−オリゴヌレクオチ
ド共役体を使用 アプライド・バイオシステムズ（フォスター市、CA）
のモデル370A自動DNAシーケンサーを用いる鎖末端アプ
ローチにおいて色素の全フルオレセインセットを用いて
標識を付けた。この製造業者のプロトコル（ここに参考
文献として加えるユーザーブレタンDNAシーケンサーモ
デル370、第２号、1987年８月12日発行）に従って、M13
中の未知のDNAを増幅し、ゲル電気泳動分離のための別
々に標識を付けたDNAフラグメントを調製した。色素標
識プライマーを上記の実施例に記載したように調製し
た。即ち、各色素のNHSエステルを調製し、５′−アミ
ノヘキシル誘導M13ユニバーサルプライマー（５′−TCC
CAGTCACGACGTTGT−３′）と反応させて、４つの異なる
ジデオキシ反応混合物に対して色素標識プライマーを生
成した。次の変更例は標準プロトコルに作り変えた：ジ
デオキシシチジン反応においてプライマーを標識付けし
た５−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、ジ
デオキシアデノシン反応においてプライマーを標識付け
した２′,7′−ジメトキシ−５−カルボキシ−4,7−ジ
クロロフルオレセイン、ジデオキシグアノシン反応にお
いてプライマーを標識付けした２′,7′−ジメトキシ−
4,5−ジクロロ−６−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオ
レセイン、ジデオキシチミジン反応においてプライマー
を標識付けした１′,2′,7′,8′−ジベンゾ−５−カル
ボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、各反応からの
標識付けしたDNAフラメンドを次のモル比:1:1:4:2のddC
反応:ddA反応:ddG反応:ddT反応で、ゲルに装填するため
に一緒に合わせ、535、550、565、および580nmに中心を
置いた10nmバンドパスフィルターを使用する改良フィル
ターホイールを用いて検出を行った。
実施例XIV.DNA配列分析において色素標識プライマーと
してALF−、BUB−、DEB−、およびNAN−オリゴヌクレオ
チド共役体を使用 次のことを除いては、実施例XIIIに述べたと同じ方法
に従った：（ｉ）ジデオキシグアノシン反応においてプ
ライマーを標識付けした１′,2′,7′,8′−ジベンゾ−
４′,5′−ジクロロ−５−カルボキシ−4,7−ジクロロ
フルオレセイン、（ii）各反応からの標識付けしたDNA
フラグメントを次のモル比:1:1:2:15のddC反応:ddA反
応:ddG反応:ddT反応で、ゲルに装填するために一緒に合
わせ、そして（iii）5nmバンドパスフィルターは540、5
60、580、および610nmに中心を置いた。
してALF−、BUB−、DEB−、およびNAN−オリゴヌクレオ
チド共役体を使用 次のことを除いては、実施例XIIIに述べたと同じ方法
に従った：（ｉ）ジデオキシグアノシン反応においてプ
ライマーを標識付けした１′,2′,7′,8′−ジベンゾ−
４′,5′−ジクロロ−５−カルボキシ−4,7−ジクロロ
フルオレセイン、（ii）各反応からの標識付けしたDNA
フラグメントを次のモル比:1:1:2:15のddC反応:ddA反
応:ddG反応:ddT反応で、ゲルに装填するために一緒に合
わせ、そして（iii）5nmバンドパスフィルターは540、5
60、580、および610nmに中心を置いた。
本発明の好適例の前記開示は例証し説明することを目
的にして示されたものである。この開示されたその形態
に本発明を網羅するものでもなくこれに限定するつもり
もなく、明らかに上記教示において多くの改良および変
更が可能である。これらの好適例は本発明の基本および
その実際の反応を良く説明するために選択され記載され
たものであり、これによってこの分野の当業者には種々
の変更および予期される特定の用途に適合するような種
々の改良が可能である。本発明の範囲はさらに請求の範
囲によって画定するつもりである。
的にして示されたものである。この開示されたその形態
に本発明を網羅するものでもなくこれに限定するつもり
もなく、明らかに上記教示において多くの改良および変
更が可能である。これらの好適例は本発明の基本および
その実際の反応を良く説明するために選択され記載され
たものであり、これによってこの分野の当業者には種々
の変更および予期される特定の用途に適合するような種
々の改良が可能である。本発明の範囲はさらに請求の範
囲によって画定するつもりである。
フロントページの続き (72)発明者 コンネル，チャールス アール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94062 レッドウッド シティ，キング ストリート 167 (72)発明者 ハーシイ，エヌ デイビス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94070 サン カルロス、エルム スト リート 800 ナンバー 208 (72)発明者 チャケリアン，バージン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94403 サン マテオ、アイビイ スト リート 1940 アパート ビー (72)発明者 ウー，サム リー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94061 レッドウッド シテイ，カルロ ス アベニュ 450 (72)発明者 フング，スチーブン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94306 パロ アルト，アドベ プレイ ス 420 (56)参考文献 特開 昭62−249049（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−109370（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−242368（ＪＰ，Ａ) 米国特許4811218（ＵＳ，Ａ)
Claims (21)
- 【請求項１】電気泳動により分離される試料中の多数の
蛍光により標識付けされた標的核酸を検出する方法が次
の工程から成り： 第１の蛍光信号を発生することができる4,7−ジクロロ
フルオレセイン化合物を用いて少なくとも１つの標的核
酸に標識付けし； 第２の蛍光信号を発生することができる第２の蛍光化合
物を用いて少なくとも１つの他の標的核酸に標識付け
し、各第１と第２の蛍光信号が各他の第１と第２の蛍光
信号からスペクトルにより分解でき； 互いに異なる標的核酸を分離するために有効な条件下に
標的核酸を電気泳動により分離し； 各標的核酸の電気泳動移動度と蛍光信号に基づいて異な
る標的核酸を同定し； 前記4,7−ジクロロフルオレセイン化合物が次式によっ
て示される化合物群から選択されて成る方法。 式中、 Ａ′は水素、フッ素、塩素、カルボキシル基、スルホニ
ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり； Ｂ′はフッ素、塩素、カルボキシル、またはスルホニル
基であり； Ｘ′は水素、フッ素、または塩素であり； Z1は水素または、Z2と共にとるときは、ベンゾ基であ
り； Z2は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはZ1
と共にとるときは、ベンゾ基であり； Z3およびZ4は別々に水素、ハロゲン、低級アルキル基、
低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニル
基、メチルアミノ基またはアミノ基であり； Z5は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはZ6
と共にとるときは、ベンゾ基であり；そして Z6は水素であり、またはZ5と共にとるときは、ベンゾ基
であり； Ａ′、Z2、Z3、Z4、およびZ5の少なくとも１つは標的核
酸に結合するためカルボキシル基、スルホニル基、メチ
ルアミノ基またはアミノ基である。 - 【請求項２】前記第２の蛍光化合物が次式で表されるフ
ルオレセイン色素である請求項１記載の方法。 式中、 Ａは水素、フッ素、塩素、カルボキシル基、スルホニル
基、メチルアミノ基またはアミノ基であり； Ｂはフッ素、塩素、カルボキシル、またはスルホニル基
であり； Ｘは水素、フッ素、または塩素であり； R1は水素または、R2と共にとるときは、ベンゾ基であ
り； R2は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはR1
と共にとるときは、R2はベンゾ基であり； R3とR4は別々に水素、ハロゲン、低級アルキル基、低級
アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニル基、メ
チルアミノ基またはアミノ基であり、 R5は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはR6
と共にとるときは、ベンゾ基であり； そして R6は水素、またはR5と共にとるときは、ベンゾ基であ
り、 Ａ、R2、R3、R4およびR5の少なくとも１つは標的核酸に
結合するためカルボキシル基、スルホニル基、メチルア
ミノ基またはアミノ基である。 - 【請求項３】ＡおよびＡ′が別々にカルボキシル基、ス
ルホニル基、またはアミノ基であり； ＢおよびＢ′が別々にカルボキシル基またはスルホニル
基であり； ＸおよびＸ′が水素であり； R2は単独でとるとき、水素、メチル基、エチル基、メト
キシ基、エトキシ基、または塩素であり； Z2は単独でとるとき、水素、メチル基、エチル基、メト
キシ基、エトキシ基、または塩素であり； R3，R4、Z3、およびZ4は別々に水素、メチル基、エチル
基、メトキシ基、エトキシ基、塩素、カルボキシル基、
スルホニル基、アミノ基、またはメチルアミノ基であ
り； R5は単独でとるとき、水素、メチル基、エチル基、メト
キシ基、エトキシ基、または塩素であり； Z5が、単独でとるとき、水素、メチル基、エチル基、メ
トキシ基、エトキシ基、または塩素であり；そして Ａ、R2、R3、R4、およびR5の１つのみがカルボキシル
基、スルホニル基、メチルアミノ基、またはアミノ基で
あり、そして、Ａ′、Z2、Z3、Z4、およびZ5の１つのみ
がカルボキシル基、スルホニル基、メチルアミノ基、ま
たはアミノ基である請求項２記載の方法。 - 【請求項４】DNA配列分析のチェインターミネーター法
において、同じ種類のDNAフラグメントが同じ末端塩基
を有し同じ蛍光染料で標識付けされるように、４種類の
DNAフラグメントが形成されているタイプの該方法の改
良が： 少なくとも１種類のDNAフラグメントを、次式によって
示される群から選択される4,7−ジクロロフルオレセイ
ン化合物で標識を付けて成る方法。 式中、 Ａ′は水素、フッ素、塩素、カルボキシル基、スルホニ
ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり； Ｂ′はフッ素、塩素、カルボキシル、またはスルホニル
基であり； Ｘ′は水素、フッ素、または塩素であり； Z1は水素または、Z2と共にとるときは、ベンゾ基であ
り； Z2は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはZ1
と共にとるときは、ベンゾ基であり； Z3およびZ4は別々に水素、ハロゲン、低級アルキル基、
低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニル
基、メチルアミノ基またはアミノ基であり； Z5は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはZ6
と共にとるときは、ベンゾ基であり；そして Z6は水素であり、またはZ5と共にとるときは、ベンゾ基
であり； Ａ′、Z2、Z3、Z4、およびZ5の少なくとも１つは標的核
酸に結合するためカルボキシル基、スルホニル基、メチ
ルアミノ基またはアミノ基である。 - 【請求項５】Ａ′およびＢ′はカルボキシルであり;X′
は水素であり；Z2は単独でとるときは、水素、塩素、メ
チル、エチル、エトキシ、またはメトキシ基であり、Z3
およびZ4は別々に水素、塩素、メチル、エチル、メトキ
シ、またはエトキシ基であり；そしてZ5は単独でとると
きは、水素、塩素、メチル、エチル、エトキシ、または
メトキシ基である請求項４記載の方法。 - 【請求項６】Z1、Z3、Z4、およびZ6は水素であり、そし
てZ2およびZ5はメトキシ基である請求項５記載の方法。 - 【請求項７】Z1およびZ6は水素であり、Z3およびZ4は塩
素であり、そしてZ2およびZ5はメトキシ基であり、また
はZ1およびZ2は共にとるときはベンゾ基であり；Z5とZ6
は共にとるときはベンゾ基であり、そしてZ3およびZ4は
塩素である請求項５記載の方法。 - 【請求項８】Z1およびZ2は共にとるときはベンゾ基であ
り；Z5とZ6は共にとるときはベンゾ基であり、そしてZ3
およびZ4は水素である請求項５記載の方法。 - 【請求項９】Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、およびZ6は水素であ
る請求項５記載の方法。 - 【請求項１０】DNA配列分析のチェインターミネーター
法において異なる末端ジデオキシヌクレオチドをもつポ
リヌクレオチドを識別する方法が、次の工程： 第１、第２、第３、および第４の種類のポリヌクレオチ
ドの混合物を形成し、 第１の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジデオキ
シアデノシンをもち、５−および６−カルボキシルフル
オレセイン、５−および６−カルボキシ−4,7−ジクロ
ロフルオレセイン、２′,7′−ジメトキシ−５−および
６−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、２′,
7′−ジメトキシ−４′,5′−ジクロロ−５−および６
−カルボキシフルオレセレン、２′,7′−ジメトキシ−
４′,5′−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−4,7
−ジクロロフルオレセイン、１′,2′,7′,8′−ジベン
ゾ−５−および６−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオ
レセイン、および１′,2′,7′,8′−ジベンゾ−４′,
5′−ジクロロ−５−および６−カルボキシ、4,7−ジク
ロロフルオレセインから成る群から選ばれた第１の色素
を用いて標識付けされ、 第２の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジデオキ
シチミジンをもち、５−および６−カルボキシルフルオ
レセイン、５−および６−カルボキシ−4,7−ジクロロ
フルオレセイン、２′,7′−ジメトキシ−５−および６
−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、２′,
7′−ジメトキシ−４′,5′−ジクロロ−５−および６
−カルボキシフルオレセレン、２′,7′−ジメトキシ−
４′,5′−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−4,7
−ジクロロフルオレセイン、１′,2′,7′,8′−ジベン
ゾ−５−および６−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオ
レセイン、および１′,2′,7′,8′−ジベンゾ−４′,
5′−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−4,7−ジク
ロロフルオレセインから成る群から選ばれた第２の色素
を用いて標識付けされ、 第３の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジデオキ
シグアノシンをもち、５−および６−カルボキシルフル
オレセイン、５−および６−カルボキシ−4,7−ジクロ
ロフルオレセイン、２′,7′−ジメトキシ−５−および
６−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、２′,
7′−ジメトキシ−４′,5′−ジクロロ−５−および６
−カルボキシルフルオレセレン、２′,7′−ジメトキシ
−４′,5′−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−4,
7−ジクロロフルオレセイン、１′,2′,7′,8′−ジベ
ンゾ−５−および６−カルボキシ−4,7−ジクロロフル
オレセイン、および１′,2′,7′,8′−ジベンゾ−
４′,5′−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−4,7
−ジクロロフルオレセインから成る群から選ばれた第３
の色素を用いて標識付けされ、 第４の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジデオキ
シシトシンをもち、５−および６−カルボキシルフルオ
レセイン、５および６−カルボキシ−4,7−ジクロロフ
ルオレセイン、２′,7′−ジメトキシ−５−および６−
カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、２′,7′
−ジメトキシ−４′,5′−ジクロロ−５−および６−カ
ルボキシルフルオレセイン、２′,7′−ジメトキシ−
４′,5′−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−4,7
−ジクロロフルオレセイン、１′,2′,7′,8′−ジベン
ゾ−５−および６−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオ
レセイン、および１′,2′,7′,8′−ジベンゾ−４′,
5′−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−4,7−ジク
ロロフルオレセインから成る群から選ばれた第４の色素
を用いて標識付けされ、 第１、第２、第３、および第４の色素がお互いからスペ
クトルにより分離することができ； 類似した大きさのポリヌクレオチドのバンドが形成され
るように、混合物中のポリヌクレオチドをゲル上の電気
泳動により分離し； ゲル上のバンドを照射ビームを用いて照射し、この照射
ビームは色素に蛍光を生じさせることができ；そして バンド中のポリヌクレオチドの種類を色素の蛍光または
吸収スペクトルによって同定する、 各工程から成る識別方法。 - 【請求項１１】前記第１の種類の各ポリヌクレオチド
を、前記第１の色素を前記３′−末端ジデオキシアデノ
シンに結合させて標識付けし、前記第２の種類の各ポリ
ヌクレオチドを、前記第２の色素を前記３′末端ジデオ
キシチミジンに結合させて標識付けし、前記第３の種類
の各ポリヌクレオチドを、前記第３の色素を前記３′−
末端ジデオキシグアノシンに結合基に結合させて標識付
けし、そして前記第４の種類の各ポリヌクレオチドを、
前記第４の色素を前記３′−末端ジデオキシシトシンに
結合させて標識付けする、請求項10記載の方法。 - 【請求項１２】前記ジデオキシアデノシンが２′,3′−
ジデオキシ−７−デアザアデノシンであり、前記ジデオ
キシシチジンが、２′,3′−ジデオキシシチジンであ
り、前記ジデオキシグアノシンが２′,3′−ジデオキシ
−７−デアザグアノシン、または２′,3′−ジデオキシ
−７−デアザイノシンであり、前記ジデオキシチミジン
が２′,3′−ジデオキシウリジンである、請求項11記載
の方法。 - 【請求項１３】前記２′,3′−ジデオキシシチジンまた
は２′,3′−ジデオキシウリジンの５位の炭素を前記第
２の色素または前記第４の色素の５または６位の炭素
に、それぞれ結合し、そして前記２′,3′−ジデオキシ
−７−デアザアデノシンまたは２′,3′−ジデオキシ−
７−グアノシンまたは２′,3′−ジデオキシ−７−デア
ザイノシンの７位の炭素を前記第１の色素または前記第
３の色素の５または６位の炭素に、それぞれ結合してい
る、請求項12記載の方法。 - 【請求項１４】前記２′,3′−ジデオキシシチジンまた
は２′,3′−ジデオキシウリジンの５位の炭素を前記第
２の色素または前記第４の色素の５または６位の炭素に
カルボキシアミノアルキニル基によって、それぞれ結合
し、そして前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデ
ノシンまたは２′,3′−ジデオキシ−７−グアノシンま
たは２′,3′−ジデオキシ−７−デアザイノシンの７位
の炭素を前記第１の色素または前記第３の色素の５また
は６位の炭素にカルボキシアミノアルキニル基によっ
て、それぞれ結合している、請求項13記載の方法。 - 【請求項１５】前記カルボキシアミノアルキニル基が３
−カルボキシアミノ−１−プロピニル基である、請求項
14記載の方法。 - 【請求項１６】前記ジデオキシアデノシンが２′,3′−
ジデオキシ−７−デアザアデノシンであり、前記ジデオ
キシシチジンが、２′,3′−ジデオキシシチジンであ
り、前記ジデオキシグアノシンが２′,3′−ジデオキシ
−７−デアザグアノシン、または２′,3′−ジデオキシ
−７−デアザイノシンであり、そして前記ジデオキシチ
ミジンが２′,3′−ジデオキシウリジンである、請求項
10記載の方法。 - 【請求項１７】前記第１の色素が２′,7′−ジメトキシ
−５−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセインであ
り、前記第４の色素が５−カルボキシ−4,7−ジクロロ
フルオレセインであり、前記第３の色素が２′,7′−ジ
メトキシ−４′,5′−ジクロロ−６−カルボキシ−4,7
−ジクロロフルオレセインまたは１′,2′,7′,8′−ジ
ベンゾ−４′,5′−ジクロロ−５−カルボキシ−4,7−
ジクロロフルオレセインであり、そして前記第２の色素
が１′,2′,7′,8′−ジベンゾ−５−カルボキシ−4,7
−ジクロロフルオレセインである、請求項16記載の方
法。 - 【請求項１８】次式で示される化合物。 式中、 Ａ′は水素、フッ素、塩素、カルボキシル基、スルホニ
ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり； Ｂ′はフッ素、塩素、カルボキシル基、またはスルホニ
ル基であり； Ｘ′は水素、フッ素、または塩素であり； Z3およびZ4は別々に水素、ハロゲン、低級アルキル基、
低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニル
基、メチルアミノ基またはアミノ基であり；そして Ａ′、Z3、およびZ4の少なくとも１つはカルボキシル
基、スルホニル基、メチルアミノ基またはアミノ基であ
る。 - 【請求項１９】Ａ′がカルボキシル基、スルホニル基、
またはアミノ基であり;B′がカルボキシル基またはスル
ホニル基であり;X′が水素であり；Z3およびZ4が別々に
水素、ハロゲン、メチル基、メトキシ基、エチル基、エ
トキシ基、カルボキシル基、スルホニル基、またはメチ
ルアミノ基である請求項18記載の化合物。 - 【請求項２０】Ａ′、Z3およびZ4の１つのみがカルボキ
シル基、スルホニル基、メチルアミノ基、またはアミノ
基である請求項18記載の化合物。 - 【請求項２１】Ａ′、およびＢ′がカルボキシル基であ
り、Z3が水素または塩素であり、そしてZ4が水素または
塩素である請求項18記載の化合物。
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