JP2523423B2 - 分子プロ―ブとしての4,7―ジクロロフルオレセイン色素 - Google Patents

分子プロ―ブとしての4,7―ジクロロフルオレセイン色素

Info

Publication number
JP2523423B2
JP2523423B2 JP3500838A JP50083890A JP2523423B2 JP 2523423 B2 JP2523423 B2 JP 2523423B2 JP 3500838 A JP3500838 A JP 3500838A JP 50083890 A JP50083890 A JP 50083890A JP 2523423 B2 JP2523423 B2 JP 2523423B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
hydrogen
dichlorofluorescein
dye
carboxyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP3500838A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH05500860A (ja
Inventor
エム メンシェン,スチーブン
ジー リー,リンダ
アール コンネル,チャールス
デイビス ハーシイ,エヌ
チャケリアン,バージン
リー ウー,サム
フング,スチーブン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
APURAIDO BAIOSHISUTEMUZU Inc
Original Assignee
APURAIDO BAIOSHISUTEMUZU Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by APURAIDO BAIOSHISUTEMUZU Inc filed Critical APURAIDO BAIOSHISUTEMUZU Inc
Publication of JPH05500860A publication Critical patent/JPH05500860A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2523423B2 publication Critical patent/JP2523423B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869Methods for sequencing
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82Xanthenes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C09DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09BORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B11/00Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/04Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
    • C09B11/06Hydroxy derivatives of triarylmethanes in which at least one OH group is bound to an aryl nucleus and their ethers or esters
    • C09B11/08Phthaleins; Phenolphthaleins; Fluorescein
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6816Hybridisation assays characterised by the detection means
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/80Fluorescent dyes, e.g. rhodamine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Photoreceptors In Electrophotography (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、一般に螢光標識技術に関するものであり、
さらに詳しくは、同一の試料から多数の標的物質を検出
するための、4,7−ジクロロフルオレセインの利用に関
するものである。
発明の背景 多くの、診断的な、あるいは分析的は技術は、同一試
料中の多数の標的物質を、識別することのできる蛍光性
の標識で標識付けすることを必要とする、例えばラニエ
ルらによるジャーナル・オブ・イムノロジー、第132
巻、151〜156頁(1984)によって例示されるようなフロ
ーサイトメトリー;およびグレイらによるクロモソー
マ、第73巻、9〜27頁(1979)によって例示されるよう
な染色体分析。この要求を満たすことは、最も自動化さ
れた手順において、スペクトルで分解できる染料が少な
くとも四種必要とされる。DNAの配列分析において特に
難しい。
現在では、DNAの配列決定について、二つの基本的ア
プローチがある:ジデオキシチェインターミネーター
法、例えばサンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンシーズ、第
74巻、5463〜5467頁(1977)および化学的分解法、例え
ばマキサムら、プロシーディンクズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、56
0〜564頁(1977)。チェインターミネーター法は、いく
つかの方法によって改良されてきており、最近の全ての
入手できる自動化DNA配列分析装置の基礎として役に立
っている。例えば、サンガーら、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジィ、第143巻、161〜178頁(198
0);シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジィ、第129巻、169〜172頁(1979);ス
ミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第13巻、
2399〜2412頁(1985);スミスら、ネイチュア、第321
巻、674〜679頁(1987);プロバーら、サイエンス、第
238巻、336〜341頁(1987)、セクション11、メソッズ
・イン・エンザイモロジィ、第155巻、51〜334頁(198
7);チャーチら、サイエンス、第240巻、185〜188頁
(1988);およびコンネルら、バイオテクニクス、第5
巻、342〜348頁(1987)。
チェインターミネーター法と化学的分解法はともに、
一つあるいはそれ以上のセットの標識付けされたDNAの
フラグメントの世代を必要とし、それぞれのDNAは共通
の起原を持ち、また、既知の塩基を末端に持つ。そして
一つあるいはそれ以上のセットのフラグメントは、配列
情報を得るための大きさに分離されねばならない。両方
の方法ともに、DNAフラグメントは、高度のゲル電気泳
動分離によって分離される。最も自動化されたDNA配列
分析装置では、異なる末端塩基を持つフラグメントは、
異なる蛍光色素によって標識付けされ、それらはプライ
マー、例えばスミスら(1987、上記参照)、または末端
ジデオキシヌクレオチドの塩基、例えばプロバーら(上
記参照)、のいずれかに結合している。標識付けされた
フラグメントは、一緒に合わされて同一のゲルカラムに
電気泳動分離するために装填される。塩基配列は、分離
工程の間に据え付けの検出器をフラグメントが通過する
時に、フラグメントによって放射される蛍光性の信号を
分析することによって決定される。
異なるフラグメントを標識付けするための1組の色素
を得るのは、このようなDNA配列システムにおいては大
変難しい。第一に、有機蛍光色素に対する代表的な放出
バンド半幅が約40〜80ナノメーター(nm)であり、可視
スペクトルの幅が約350〜400nmに過ぎないので、かなり
の部分がオーバーラップする放射バンドを持たないよう
な、3種あるいはそれ以上の色素を見つけることが難し
い。第二に、部分的にオーバーラップしない放射バンド
を持つ色素が見いだされた時でも、もしそれぞれの蛍光
効率が余りに低ければ、そのセットは、そえでもDNA配
列に適さない。例えば、プリングルら、DNAコア・ファ
シリティス・ニュースレター、第1巻、15〜21頁(198
8)には、装填するゲルを増やしても、低い蛍光効率を
埋め合わせることが出来ないことを示すデータがある。
第三に、数種の蛍光色素が同時に使われた時、色素の吸
収バンドがしばしば広く分離するので、励起が困難にな
る。最も効率的な励起が起こすのは、それぞれの色素
が、吸収バンドの最大に一致する波長で照射される時で
ある。複数の色素が使われる時、検出システムの感度と
各色素に対する別々の励起源を供給するためのコストの
増大との間で、妥協を強いられる場合が多い。第四に、
単一のゲルのカラム中の異なる大きさのフラグメントの
数が数百よりも多い時、色素の物理化学的性質と、色素
をフラグメントに結合するための方法が非常に重要とな
る。大きいバンドの広がりが起きるか、またはゲルのバ
ンドの位置が逆になり、これによって、配列を決定する
核酸中のバンドの順番と塩基の順番との間の一致が壊さ
れるように、荷電、分子量、および色素とリンカーの形
態が、大きさの接近しているフラグメントの電気泳動の
流動性に逆に影響してはいけない。最後に、蛍光色素
は、フラグメントを作り上げるかまたは操作するために
使われる化学物質と混合しても、化学反応を起こさない
ことが必要である。例えば、チェインターミネーター法
においては、プライマーに標識付けするために使われる
色素および/またはジデオキシチェインターミネーター
は、用いられるポリメラーゼまたは逆転写酵素の活性を
妨げてはいけない。
これらの厳しい制約のために、自動化DNA配列分析や
他の診断的で分析的な技術に使い得る蛍光色素のセット
は、ほんの数セットしか見つかってしない、例えばスミ
スら(1985、上記参照):プロバーら(上記参照)、フ
ードら、英国特許第2,155,176号;およびコンネルら
(上記参照)。
上のことを考慮して、多くの分析的で診断的な技術、
例えばDNA配列分析は、新しい蛍光色素のセットが利用
できることによって大きく進歩するであろう。それは
(1)物理化学的に類似であり、(2)空間的にオーバ
ーラップする標的物質、例えば位置の接近しているゲル
上のDNAバンドの検出が可能であり、(3)自動DNA配列
分析の最近の方法によって単一のゲルカラムで決定でき
る塩基の数を広げ、(4)広い範囲の分離および操作上
の技術を使用することができ、(5)その他に上記の多
くの要求を満足することである。
発明の概要 本発明は、空間的にオーバーラップする標的物質を、
4,7−ジクロロフルオレセイン色素を用いて、同時に検
出する方法に関するものである。本発明はまた、4,7−
ジクロロフルオレセイン色素を用いるDNA配列決定の方
法、および式Iによって示される1′,2′,7′,8′−ジ
ベンゾ−5(および6−)カルボキシ−4,7,−ジクロロ
フルオレセインから成る化合物を含む。
式中: A′は水素、フッ素、塩素あるいは、例えばカルボキ
シル基、スルホニル基、またはアミノ基のような基であ
り、これらは、結合する官能基に転化することができ;
好ましくは、Aは結合する官能基に転化されうる基であ
る; X′は水素、フッ素あるいは塩素であり、そしてA′
が6炭素原子の置換基であるときはいつでもX′は5炭
素原子の置換基であり、A′が5炭素原子の置換基であ
るときはいつでもX′は6炭素原子の置換基であり;好
ましくは、X′は水素である; Z3は水素、フッ素、塩素あるいは、例えばカルボキシ
ル基、スルホニル基やメチルアミノ基のような基であ
り、これらは、結合する官能基に転化することができ、
好ましくは、Z3は水素が塩素である; Z4は水素、フッ素、塩素あるいは、例えばカルボキシ
ル基、スルホニル基やメチルアミノ基のような基であ
り、これらは、結合する官能基に転化することができ、
好ましくは、Z4は水素が塩素である; B′はフッ素、塩素あるいは、酸性アニオン基であ
り、好ましくは、B′はカルボキシル基、あるいはスル
ホニル基であり、そして最も好ましくは、B′はカルボ
キシル基である; そして、A′、Z3、Z4、のうちの少なくとも一つは、
結合する官能基に転化されうる基である。好ましくは、
A′、Z3、およびZ4のうちのただ一つの基だけが、結合
する官能基に転化することができる。
全体を通じて、カラー・インデックス(アソシエイシ
ョン・オブ・テキスタイル・ケミスツ、第2版、1971)
カーボン・ナンバーリング図を使用する、即ち、プライ
ムを付けた数はキサンテン構造の炭素に関係し、プライ
ムを付けていない数は9′−フェニルの炭素に関係す
る。
本発明は、一部分、4,7−クロロ−5−(および6
−)カルボキシルフルオレセインの蛍光性の性質およ
び、関連している色素が分子プローブとして使用するた
めに非常に好都合であるという発見に基づくものであ
る。これらの放射バンドの幅は一般に、4,7−ジクロロ
誘導体が欠けている類似化合物に比べて、20〜30%狭
く、これらの放射および吸収の上限は、一般に、4,7−
ジクロロ誘導体が欠けている類似化合物に比べて、約10
〜30mm波長が長く、さらに、これらの蛍光効率は高く、
いくつかの場合においては、4,7−ジクロロ誘導体が欠
けている類似化合物のそれの三倍近くにもなる。
発明の詳細な説明 上に述べたように、本発明は、一部は、著しく長い波
長で吸収および放射の上限を持ち、狭い放射バンドの幅
と他の都合のよい蛍光性質をもつ蛍光色素の種類の発見
に基づくものである。さらに、本発明は、この種類の色
素の一員として、式Iによって定義される新しい蛍光色
素類自体を含む。これらの色素は、スペクトルにより分
解でき、物理化学的に類似した色素、特に自動化された
DNA配列分析に有用な色素の新しいセットのアセンブリ
イを可能にする。
色素のセットに関してここで使われる“スペクトルに
より分解できる”という言葉は、色素の蛍光性の放射バ
ンドが十分にはっきりと識別できる、すなわち十分にオ
ーバーラップしていないことを意味し、それぞれの色素
を結合した標的物質、例えばポリヌクレオチドはそれぞ
れの色素から生じる蛍光信号を基礎として、標準光検出
装置によって、例えば、バンドパスフィルタと光電増倍
管等を用いて識別することができる。このようなシステ
ムとしては、例えば米国特許4,230,558、4,811、218
等、あるいはホイーレスら、21〜76頁、フロウ・シトメ
トリー:インストルメンテイション・アンド・データ・
アナリシス(アカデミックプレス、ニューヨーク、198
5)に記載されているものが例示される。
直接的にあるいはエーテルに関連して、ここで使われ
る“低級アルキル”という言葉は、1〜6の炭素原子を
含む直鎖および/または分枝鎖のアルキル基を示し、例
えば、この言葉は、メチル基、エチル基、プロピル基、
イソプロピル基、第三ブチル基、イソブチル基等を含
む。
ここで使われている“ハロゲン”という言葉は、ハロ
ゲン原子フッ素、塩素、臭素とヨウ素を示し、さらに好
ましくは、この言葉はフッ素または塩素を示し、そして
最も好ましくは、この言葉は塩素を示す。
好ましくは、本発明の4,7−クロロ−5−(および6
−)カルボキシフルオレセイン色素は、式IIによって定
義されるものを含む。
式中: A′、B′とX′は上によって定義され; Z1は水素か、Z2と共にとるときはベンゾ基である; Z1は単独でとるとき、水素、ハロゲン、低級アルキル
基、低級アルコキシ基あるいは例えばカルボキシル基、
スルホニル基、メチルアミノ基のような基であり、これ
らは活性の結合する官能基に転化することができ、ある
いはZ1と共にとるときはZ2はベンゾ基である;好ましく
は、単独でとるとき、Z2は水素、メチル基、エチル基、
フッ素、塩素、メトキシ基あるいはエトキシ基である; Z3とZ3は水素、ハロゲン、低級アルキル基、低級アル
キルオキシ基、あるいは例えばカルボキシル基、スルホ
ニル基、メチルアミノ基のような基であり、これらは結
合する官能基に転化することができ;さらに好ましく
は、Z3とZ4は水素、フッ素、塩素、メチル基、エチル
基、メトキシ基あるいはエトキシ基であり; Z5は水素あるいは、Z6と共にとるときは、ベンゾ基で
あり、そして、 Z6は、単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アル
キル基、低級アルコキシ基、あるいは、例えばカルボキ
シル基、スルホニル基、メチルアミノ基のような基であ
り、これらは活性な結合する官能基に転化することがで
き、あるいはZ5と共にとるときは、Z6はベンゾ基であ
り;好ましくは、単独でとるときは、Z6は水素、メチル
基、エチル基、フッ素、塩素、メトキシ基あるいエトキ
シ基であり; そして式中、A、Z2、Z3、Z4、およびZ5のうちの少な
くとも一つは、結合する官能基に転化することのできる
基である。好ましくは、A、Z2、Z3、Z4、およびZ5のう
ちただ一つだけが、活性な結合する官能基に転化するこ
とのできる基である。
本発明の多くの色素は市販されており、あるいはこの
分野で知られた技術によって合成することができる。例
えばガタクら、ジャーナル・オブ・ザ・インディアン・
ケミカル・ソサイアテイ、第6巻、465〜471頁(192
9);およびカンナら、米国特許第4,439,356。代わりに
なるべきものとして、実施例に示したように、フルオレ
セイン類似化合物、すなわちA=B=カルボキシルの化
合物は、置換されたレゾシノールを、置換されたベンゾ
フェノンあるいは置換されたトリメリット酸と、プロピ
オン酸の存在下で反応させることによって、合成するこ
とが出来る。AまたはBがスルホニルであるスルホニル
フルオレセインは、リーら、サイトメトリー、第10巻、
151〜164頁(1989)によって開示された方法に従って合
成され、適当な反応物で置換することにより改良され、
5−あるいは6−カルボキシルあるいはスルホニルフル
オレセイン生成物を与える。好ましくは、DNA配列分析
においてポリヌクレオチドを標識付けするとき、色素の
5−および6−異性体は別々に使用される。何故なら、
それらはもしも異性体の混合物が使用されるとバンドの
広がりにつながるようなわずかに異なる電気泳動の移動
性を持つからである。色素の5−と6−の異性体は逆相
HPLCによって容易に分離できる、例えばエドマドソン
ら、モレキュラー・イムノロジー、第21巻、561頁(198
4)。一般には、最初に溶離するピークは6−異性体
で、次に溶離するピークは5−異性体であると考えられ
ている。
本発明の色素は、この分野でよく知られている様々な
方法によって、標的物質に結合することができる。例え
ば、ホウグランド・ハンドブック・オブ・フルオレセン
ト・プローブス・アンド・リサーチ・ケミカルス(モレ
キュラープローブス社、ユージーン、1989)は、色素を
標的物質に結合するための方法の手引と実例を示してい
る。置換基Aは、結合基を形成するように標的物質に相
補的官能基によって反応することができる結合する官能
基に変換される。次の表は、Aがカルボキシル基、スル
ホニル基あるいはアミン基であってもいつでも形成され
ることのできる実例となる結合する官能基、適当な相補
的官能基、および本発明の使用に適する得られた結合基
をまとめて示したものである。
好ましくは、結合する官能基は相補的官能基がアミン
であるときはいつでも、イソチオシアナート、スルホニ
ルクロクド、4,6−ジクロロトリアジニルアミン、ある
いはスクシニミジルカルボキシレートである。そして、
好ましくは、相補的官能基がスルフヒドリルであるとき
はいつでも、結合する官能基はマレイミド、またはヨー
ドアセタミドである。スクシニミジルカルボキシレート
は、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)に用いる
N−ヒドロキシスクシンイミドと上記色素の5−および
/または6−カルボキシルを縮合することによって生成
することができる。例えば、カンナら、米国特許4,318,
846の実施例6および8、およびカサイら、アナリチカ
ル・ケミストリイ、第47巻、34〜37頁(1975)に示され
ている。従って、これらの引用文献を参考として加え
る。
本発明の色素が、DNA配列分析のためにジデオキシヌ
クレオチドに標識付けするために使用される時、好まし
くは、色素はピリミジン塩基の5炭素と7−デアザプリ
ン塩基の7炭素に結合される。例えば、本発明とともに
用いられ得る適当な塩基の標識付けの手順がいくつか報
告されている。例えばギブソンら、ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、第15巻、6455〜6467(1987);ゲベイ
ェフら、ヌクレイック・ジテッズ、リサーチ、第15巻、
4513〜4535頁(1987;ハラルアンビジスら、ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ、第15巻、4856〜4876(1987)
等がある。好ましくは、色素と塩基との間の結合基は、
本発明の色素のN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)
エステルとジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ
誘導塩基を反応させることによって形成される。好まし
くは、結合基は、3−カルボキシアミノ−1−プロピニ
ルである。このようなアルキニルアミノ誘導ジデオキシ
ヌクレオチドの合成は、ホッブスらのヨーロッパ特許出
願第87305844.0号によって教示され、これを参考文献と
してここに加える。手短に言えば、アルキニルアミノ誘
導ジデオキシヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌ
クレオシド(普通、5−ヨードピリミジンと7−ヨード
−7−デアザプリンジデオキシヌクレオシドといった、
ホッブスら(上記に引用)によって教示されたもの)と
銅(I)をフラスコに入れ、空気を取り除くためにArを
流し込み、乾燥DMFを加え、続いてアルキニルアミン、
トリエチルアミン及びPd(0)を添加することによって
生成される。反応混合物は数時間にわたって、あるいは
薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオシド
の消費を示すまで、攪拌される。保護されていないアル
キルアミンが用いられるとき、アルキニルアミノヌクレ
オシドは、反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生
成したハイドロハライドを中和するため水酸化アルミニ
ウムを含む溶離溶媒を使用するシリカゲルクロマトグラ
フィーによって単離することができる。保護されている
アルキルアミンが用いられるとき、メタノール/塩化メ
チレンを反応混合物に加えることができ、続いて強塩基
アニオン交換樹脂の重炭酸塩形態とする。次いでスラレ
ーを約45分間攪拌して、濾過し、樹脂を追加のメタノー
ル/塩化メチレンを用いて洗浄する。一緒に合わせた濾
液を濃縮し、メタノール−塩化メチレングラジエントを
用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによ
って精製する。トリホスフェートが標準技法によって得
られる。
本発明の標的物質は、本発明の色素を結合できるもの
であれば実質的にいずれのものでもよい。好ましくは、
色素は標的物質に共有結合により結合される。標的物質
は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカライ
ド、ポリヌクレオチド、脂質、およびこれらの組合せた
ものおよび集合したもの、例えば染色体、細胞核、生き
ている細胞、例えばバクテリア、他の微生物、および哺
乳類の細胞、組織等を含む。ここで使用される語“ポリ
ヌクレオチド”はDNAまたはRNAの一重鎖または二重鎖を
意味し、その長さは約10〜1000塩基の寸法の範囲(一重
鎖の場合)にあり、またはその長さは約10〜1000塩基対
の寸法の範囲(二重鎖の場合)にある。
若干の相補的官能基は合成オリゴヌクレオチドおよび
ポリヌクレオチドの5′または3′末端に結合すること
ができ、例えばアミノ基はフングら、米国特許第4,757,
141号およびミヨシら、米国特許第4,605,735号;または
スルフヒドリル基は、コンノリイ・ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、第13巻、4485〜4502頁(1985)、およ
びスポートら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第
15巻、4837〜4848頁(1987)を参照することができる。
本発明の色素は特に、ゲル電気泳動のような生物化学
的分離方法を行うポリヌクレオチドの種類を同定するた
めに良く適しており、そこでは類似した物理化学的性
質、例えば、寸法、コンフォメーション、荷電、疎水性
等をもつ標的物質の一連のバンドまたはスポットが直線
または平面的な配列で存在する。ここに使用される語
“バンド”は類似したまたは同一の物理化学的性質を基
礎として標的物質の空間的グループ化または集合のいず
れをも含む。通常、バンドはゲル電気泳動によって色素
−ポリヌクレオチド共役体の分離で生じる。
ポリヌクレオチドの分類は種々の情況を生むことがで
きる。例えば、これらは制限酵素消化物の生成物として
生じることができる。好ましくは、本発明に従って同定
される分類は、4つの可能な末端塩基と一組のスペクト
ルにより分解できる色素の数との間で一致するように、
末端ヌクレオチドによって明らかにされる。このような
セットは市販されている分光光度計を用いて放射および
吸収のバンド幅を測定することによって本発明の色素か
ら容易に組立てられる。さらに好ましくは、分類はDNA
配列分析の化学的または鎖末端方法に関連して現われ、
そして最も好ましくは分類は鎖末端方法に関連して現わ
れる。いずれの方法でも、色素−ポリヌクレオチド共役
体は標準ゲル電気泳動法によって分離される。例えばゴ
ウルドおよびマシュース、上記参照;リックウッドおよ
びハメス著、核酸のゲル電気泳動:実際的アプローチ、
(IRLプレス・リミテッド、ロンドン、1981);または
オスターマン、メソッズ・オブ・プロテイン・アンド・
ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第1巻(スプリン
ガー・ベルラーク、ベルリン、1984)。好ましくは、ゲ
ルのタイプは約2〜20パーセントの濃度(重量対容量)
をもつポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、
ポリアクリルミアミドゲル濃度が約4〜8パーセントで
ある。好ましくは、ゲルはストランド分離または変性剤
を含む。このようなゲルを構築するための詳細な方法
は、マニアチスら、“98%ホルムアミドまたは7Mの尿素
を含有するポリアクリルアミドゲル中の低分子量DNAお
よびRNAの分別”、メソッズ・イン・エンザイモロジ
イ:第65巻、299〜305頁(1980);マニアチスら、“ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動による小さい二重および
一重鎖DNA分子の鎖長決定、バイオケミストリィ、第14
巻、3787〜3794頁(1975);およびマニアチスら、モレ
キュラー・クローニング;実験室手法(コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリィ、ニューヨーク、198
2)、179〜185頁。従ってこれらの参考文献は参照用に
加えられる。特定の分離に用いられる最適のゲル濃度、
pH、温度、変性剤の濃度等は、核酸が一重鎖または二重
鎖のいずれであっても、分離すべき核酸の大きさの範囲
を含めて、それからの塩基の組成;および情報を電気泳
動によって調べるための種類の性質など、多くの因子に
依存する。従って本発明の応用は特定の分離のため条件
を最適にするための標準の予備試験を必要とするかも知
れない。一例として、約20〜300塩基の大きさをもつオ
リゴヌクレオチドは次に示すゲルで本発明に従って分離
され検出された;このゲルは19部対1部のアクリルアミ
ドとビスアクリルアミドから得られた6パーセントのポ
リアクリルアミドで、48パーセント(重量/容量)尿素
を用いてpH8.3(25℃で測定)にてトリス・ボレートEDT
A緩衝液中で生成させた。このゲルを50℃で実験に供し
た。
ゲル上の色素−ポリヌクレオチド共役体は標準手法、
例えば高強度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって、照
射される。好ましくは、ゲル上の色素−ポリヌクレオチ
ドはアルゴンイオンレーザーによって発生するレーザー
光、特にアルゴニオンレーザーの488および514nm発光ラ
インによって照射される。それらのラインで同時にレー
ザー光を発する複数のアルゴンイオンレーザーが市販さ
れており、シノニクス社(サニイベル、CA)のモデル20
01等が例示される。
チェインターミネーター法においては、本発明の色素
をプライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれか
に結合することができる。色素を例えば、ここに参考文
献として加えられるフングらの米国特許第4,757,141の
教示に従ってプライマーの5′末端;プライマーの塩
基;または例えば、ここに参考文献として加えられるヨ
ーロッパ特許出願番号87305844.0にホップスらによって
開示されたアルキルアミノ結合基を介するジデオキシヌ
クレオチドの塩基の相補的官能基に結合することができ
る。
実施例 実施例I.4,7−ジクロロ−5−(および6−)カルボキ
シフルオレセイン(“ALF") 0.58gの3,6−ジクロロトリメリット酸、0.72gのレゾ
ルシレノール、0.5mlの膿硫酸、および3mlのプロピオン
酸をアルゴン下に12時間還流させた。反応混合物を150m
lの水に注入し;沈降物を乾燥し、3mlのピリジンに入れ
て2mlの無水酢酸で1時間アセチル化した。アセチル化
した混合物を100mlの酢酸エチルに入れ、INの塩酸、水
で洗浄し、蒸発乾燥させた。残渣を15gのシリカゲルに
入れて50mlの酢酸エチル、次いで4:1の酢酸エチルとメ
タノールで溶離させた。約0.2のRf(4:1の酢酸エチルと
メタノール/シリカゲル)でUV活性物質を含む画分を蒸
発乾燥させた。この残渣を10mlのメタノールに溶解し次
いで1mlの4N水酸化ナトリウムを添加した。10分後、反
応混合物を水で200mlまで稀釈し、次いで0.5mlの膿塩酸
を添加した。混合物すべてを200mlの酢酸エチルで抽出
し、その後に酢酸エチルを硫酸ナトリウムで乾燥っせ
て、蒸発乾固し、102mgの黄緑色の固体を得た。
実施例II.4,7−ジクロロ−5−(および6−)カルボキ
シフルオレセインN−ヒドロキシスクシンイミド(NH
S)エステル 実施例Iからの13.7mgのフルオレセイン、3.3mgのNH
S、6.4mgのDCC、および1mlの酢酸エチルを0.5時間かき
まぜた。固体を濾過し、上澄を3回、1:1のブラインと
水を用いて洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固
して15mgのNHSエステルを得た。
実施例III.アミノアルキルオリゴヌクレオチドを用いた
4,7−ジクロロ−5−(および6−)カルボキシフルオ
レセインの結合 実施例IIからの5mgのNHSエステルを20μlのDMSOに溶
解した;この溶液の3μlを1.0mMの5′−アミノヘキ
シルホスフェートオリゴヌクレオチド(18量体)の水溶
液20μlおよび1Mの重炭酸ナトリウム/炭酸ナトリウム
緩衝液、pH9.0、10μlから成る溶液に添加した。暗所
で1時間後、溶液を、0.1Mトリメチルアルミニウムアセ
テート緩衝液pH7.0を用いて10mlのセファデックスG−2
5(媒体)カラムに通した。限定容量で溶離した着色物
質のバンドを収集した。逆相HPLCは、DNAに共役結合し
た色素の5−および6−異性体に相当する2本の蛍光性
の主ピークを示した。これらのピークを収集し、その蛍
光スペクトルはpH8.0の50%尿素中でハーフマックス34n
mと放射最大値529nmで全幅を示した。
実施例IV.2′,7′−ジメトキシ−5−(および6−)カ
ルボキシ4,7−ジクロロフルオレセレン(“BUB") 次に示す物質と分量に置き換えた以外は、実施例Iの
方法に従った:1.47gの4−メトキシレゾルシノール、0.
60gの3,6−ジクロロトリメリット酸、0。2mlの膿硫
酸、および4mlのプロピオン酸。この方法で0.180gの4,7
−ジクロロ−2′,7′−ジメトキシ−5−(および6
−)カルボキシフルオレセインを生成した。
実施例V.2′,7′−ジメトキシ−5−(および6−)カ
ルボキシ4,7−ジクロロフルオレセインNHSエステル 18mgの実施例IVからの色素、3.5mgのNHS、6.4mgのDC
C、および2mlの酢酸エチルを用いて実施例IIと同様にし
て、1.8mgの色素NHSエステルを調製した。
実施例VI.アミノアルキルオリゴヌクレオチドを用いた
4,7−ジクロロ−2′,7′−ジメトキシ−5−(および
6−)カルボキシフルオレセインの結合 実施例Vの色素NHSエステルを用いて実施例IIIの方法
に従った。逆相HPLCの間に集められた2本のピークの蛍
光スペクトルはpH8.2の50%尿素中でハーフマックス37n
mと放射最大値544nmで全幅を示した。
実施例VII.2′,7′−ジメトキシ−4′,5′−ジクロロ
−5−(および6−)カルボキシ4,7−ジクロロフルオ
レセイン(“LOU") この色素は実施例IVの色素および水酸化ナトリウムの
水溶液に溶かした次亜塩素酸ナトリウムから調製した。
実施例VIII.4,7−ジクロロ−2′,7′−ジメトキシ−
4′,5′−ジクロロ−5−(および6−)カルボキシフ
ルオレセインNHSエステル この色素NHSエステル1.1mgを、実施例VIIからの0.7mg
の色素、0.45mgのNHS、0.7mgのDCC、および0.2mlの酢酸
エチルから実施例IIのようにして調製した。
実施例IX.アミノアルキルオリゴヌクレオチドを用いた
4,7−ジクロロ−2′,7′−ジメトキシ−4′,5′−ジ
クロロ−5−(および6−)カルボキシフルオレセイン
の結合 この実施例の色素オリゴヌクレオチド結合体は実施例
VIIIからの色素NHSエステルを用い実施例IIIと同様にし
て調製した。逆相HPLCの間に集められた2本のピークの
蛍光スペクトルはpH8.2の50%尿素中でハーフマックス3
8nmと放射最大値558nmで全幅を示した。
実施例X.1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−5−(および6
−)カルホキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(“NA
N") まず、3,6−ジクロロトリメリット酸トリクロライド
を調製した:0.5gの3,6−ジクロロトリメリット酸と1.3g
の五塩化トリンの混合物を130℃にて40分間加熱した。
混合物を室温まで冷却し氷中に注いだ。次いで混合物を
40mlのエーテルで抽出し、有機画分を15mlの水で2回洗
浄し、MgSO4で乾燥させ、澄明なオイルに濃縮した(0.7
g)。さらに精製することなく酸トリクロライドを使用
した。NANを次のようにして調製した。2.7gの1,3−ジヒ
ドロキシナフタリン、2.84gの3,6−ジクロロドリメリッ
ト酸トリクロライド、および8mlのプロピオン酸の混合
物を2時間還流させた。水(50ml)と酢酸エチル(50m
l)を添加した。層を分離し、有機層を3回、50mlの1M
NaHCO3を用いて抽出した。水溶液を沸点まで加熱し、膿
HClを用いて酸性にした。得られた赤色固体(0.2g)を
濾過し乾燥した。
実施例XI.1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−4′,5′−ジク
ロロ−5−(および6−)カルホキシ−4,7−ジクロロ
フルオレセイン(“DEB") 20mgのNAN、水酸化ナトリウム(34μl、15%溶
液)、水(1ml)、および次亜塩素酸ナトリウム(170μ
l、5%溶液)を一緒に合わせた。逆相HPLCは92%の反
応を示した。溶液を塩酸で酸性として、20mlの酢酸エチ
ルで抽出し、乾燥(Na2SO4)し、20mgまで濃縮した。固
体をシリカゲルカラム(1インチ(2.54cm)の直径×2
インチ(5.08cm)の高さ)のクロマトグラフィーによっ
て、600:60:16の塩化メチレンとメタノールと酢酸を用
いて溶離した精製した。色素溶液を濃縮し、稀HClと酢
酸エチルを添加した。有機層を乾燥(MgSO4)し、20mg
のDEBまで濃縮した。
実施例XII.1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−5−(および
6−)カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセインNHSエ
ステルの生成 NAN(10mg)を2mlの酢酸エチルに溶解し、NHS(10m
g)とDCC(5mg)を添加した。20分後、溶液は暗赤色と
なり結晶性の固体が現われた。600:60:16の塩化メチレ
ンとメタノールと酢酸を用いたシリカゲルの薄層クロマ
トグラフィーでは完全にNHSエステルに変換したことを
示した。酢酸エチル溶液を稀HClで洗浄し、乾燥(MgS
O4)させて赤色固体(15mg)まで濃縮した。
実施例XIII.DNA配列分析において色素標識プライマーと
してALF−、BUB−、LOU、およびNAN−オリゴヌレクオチ
ド共役体を使用 アプライド・バイオシステムズ(フォスター市、CA)
のモデル370A自動DNAシーケンサーを用いる鎖末端アプ
ローチにおいて色素の全フルオレセインセットを用いて
標識を付けた。この製造業者のプロトコル(ここに参考
文献として加えるユーザーブレタンDNAシーケンサーモ
デル370、第2号、1987年8月12日発行)に従って、M13
中の未知のDNAを増幅し、ゲル電気泳動分離のための別
々に標識を付けたDNAフラグメントを調製した。色素標
識プライマーを上記の実施例に記載したように調製し
た。即ち、各色素のNHSエステルを調製し、5′−アミ
ノヘキシル誘導M13ユニバーサルプライマー(5′−TCC
CAGTCACGACGTTGT−3′)と反応させて、4つの異なる
ジデオキシ反応混合物に対して色素標識プライマーを生
成した。次の変更例は標準プロトコルに作り変えた:ジ
デオキシシチジン反応においてプライマーを標識付けし
た5−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、ジ
デオキシアデノシン反応においてプライマーを標識付け
した2′,7′−ジメトキシ−5−カルボキシ−4,7−ジ
クロロフルオレセイン、ジデオキシグアノシン反応にお
いてプライマーを標識付けした2′,7′−ジメトキシ−
4,5−ジクロロ−6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオ
レセイン、ジデオキシチミジン反応においてプライマー
を標識付けした1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−5−カル
ボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、各反応からの
標識付けしたDNAフラメンドを次のモル比:1:1:4:2のddC
反応:ddA反応:ddG反応:ddT反応で、ゲルに装填するため
に一緒に合わせ、535、550、565、および580nmに中心を
置いた10nmバンドパスフィルターを使用する改良フィル
ターホイールを用いて検出を行った。
実施例XIV.DNA配列分析において色素標識プライマーと
してALF−、BUB−、DEB−、およびNAN−オリゴヌクレオ
チド共役体を使用 次のことを除いては、実施例XIIIに述べたと同じ方法
に従った:(i)ジデオキシグアノシン反応においてプ
ライマーを標識付けした1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−
4′,5′−ジクロロ−5−カルボキシ−4,7−ジクロロ
フルオレセイン、(ii)各反応からの標識付けしたDNA
フラグメントを次のモル比:1:1:2:15のddC反応:ddA反
応:ddG反応:ddT反応で、ゲルに装填するために一緒に合
わせ、そして(iii)5nmバンドパスフィルターは540、5
60、580、および610nmに中心を置いた。
本発明の好適例の前記開示は例証し説明することを目
的にして示されたものである。この開示されたその形態
に本発明を網羅するものでもなくこれに限定するつもり
もなく、明らかに上記教示において多くの改良および変
更が可能である。これらの好適例は本発明の基本および
その実際の反応を良く説明するために選択され記載され
たものであり、これによってこの分野の当業者には種々
の変更および予期される特定の用途に適合するような種
々の改良が可能である。本発明の範囲はさらに請求の範
囲によって画定するつもりである。
フロントページの続き (72)発明者 コンネル,チャールス アール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94062 レッドウッド シティ,キング ストリート 167 (72)発明者 ハーシイ,エヌ デイビス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94070 サン カルロス、エルム スト リート 800 ナンバー 208 (72)発明者 チャケリアン,バージン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94403 サン マテオ、アイビイ スト リート 1940 アパート ビー (72)発明者 ウー,サム リー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94061 レッドウッド シテイ,カルロ ス アベニュ 450 (72)発明者 フング,スチーブン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94306 パロ アルト,アドベ プレイ ス 420 (56)参考文献 特開 昭62−249049(JP,A) 特開 昭63−109370(JP,A) 特開 昭60−242368(JP,A) 米国特許4811218(US,A)

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】電気泳動により分離される試料中の多数の
    蛍光により標識付けされた標的核酸を検出する方法が次
    の工程から成り: 第1の蛍光信号を発生することができる4,7−ジクロロ
    フルオレセイン化合物を用いて少なくとも1つの標的核
    酸に標識付けし; 第2の蛍光信号を発生することができる第2の蛍光化合
    物を用いて少なくとも1つの他の標的核酸に標識付け
    し、各第1と第2の蛍光信号が各他の第1と第2の蛍光
    信号からスペクトルにより分解でき; 互いに異なる標的核酸を分離するために有効な条件下に
    標的核酸を電気泳動により分離し; 各標的核酸の電気泳動移動度と蛍光信号に基づいて異な
    る標的核酸を同定し; 前記4,7−ジクロロフルオレセイン化合物が次式によっ
    て示される化合物群から選択されて成る方法。 式中、 A′は水素、フッ素、塩素、カルボキシル基、スルホニ
    ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり; B′はフッ素、塩素、カルボキシル、またはスルホニル
    基であり; X′は水素、フッ素、または塩素であり; Z1は水素または、Z2と共にとるときは、ベンゾ基であ
    り; Z2は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
    基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
    ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはZ1
    と共にとるときは、ベンゾ基であり; Z3およびZ4は別々に水素、ハロゲン、低級アルキル基、
    低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニル
    基、メチルアミノ基またはアミノ基であり; Z5は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
    基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
    ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはZ6
    と共にとるときは、ベンゾ基であり;そして Z6は水素であり、またはZ5と共にとるときは、ベンゾ基
    であり; A′、Z2、Z3、Z4、およびZ5の少なくとも1つは標的核
    酸に結合するためカルボキシル基、スルホニル基、メチ
    ルアミノ基またはアミノ基である。
  2. 【請求項2】前記第2の蛍光化合物が次式で表されるフ
    ルオレセイン色素である請求項1記載の方法。 式中、 Aは水素、フッ素、塩素、カルボキシル基、スルホニル
    基、メチルアミノ基またはアミノ基であり; Bはフッ素、塩素、カルボキシル、またはスルホニル基
    であり; Xは水素、フッ素、または塩素であり; R1は水素または、R2と共にとるときは、ベンゾ基であ
    り; R2は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
    基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
    ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはR1
    と共にとるときは、R2はベンゾ基であり; R3とR4は別々に水素、ハロゲン、低級アルキル基、低級
    アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニル基、メ
    チルアミノ基またはアミノ基であり、 R5は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
    基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
    ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはR6
    と共にとるときは、ベンゾ基であり; そして R6は水素、またはR5と共にとるときは、ベンゾ基であ
    り、 A、R2、R3、R4およびR5の少なくとも1つは標的核酸に
    結合するためカルボキシル基、スルホニル基、メチルア
    ミノ基またはアミノ基である。
  3. 【請求項3】AおよびA′が別々にカルボキシル基、ス
    ルホニル基、またはアミノ基であり; BおよびB′が別々にカルボキシル基またはスルホニル
    基であり; XおよびX′が水素であり; R2は単独でとるとき、水素、メチル基、エチル基、メト
    キシ基、エトキシ基、または塩素であり; Z2は単独でとるとき、水素、メチル基、エチル基、メト
    キシ基、エトキシ基、または塩素であり; R3,R4、Z3、およびZ4は別々に水素、メチル基、エチル
    基、メトキシ基、エトキシ基、塩素、カルボキシル基、
    スルホニル基、アミノ基、またはメチルアミノ基であ
    り; R5は単独でとるとき、水素、メチル基、エチル基、メト
    キシ基、エトキシ基、または塩素であり; Z5が、単独でとるとき、水素、メチル基、エチル基、メ
    トキシ基、エトキシ基、または塩素であり;そして A、R2、R3、R4、およびR5の1つのみがカルボキシル
    基、スルホニル基、メチルアミノ基、またはアミノ基で
    あり、そして、A′、Z2、Z3、Z4、およびZ5の1つのみ
    がカルボキシル基、スルホニル基、メチルアミノ基、ま
    たはアミノ基である請求項2記載の方法。
  4. 【請求項4】DNA配列分析のチェインターミネーター法
    において、同じ種類のDNAフラグメントが同じ末端塩基
    を有し同じ蛍光染料で標識付けされるように、4種類の
    DNAフラグメントが形成されているタイプの該方法の改
    良が: 少なくとも1種類のDNAフラグメントを、次式によって
    示される群から選択される4,7−ジクロロフルオレセイ
    ン化合物で標識を付けて成る方法。 式中、 A′は水素、フッ素、塩素、カルボキシル基、スルホニ
    ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり; B′はフッ素、塩素、カルボキシル、またはスルホニル
    基であり; X′は水素、フッ素、または塩素であり; Z1は水素または、Z2と共にとるときは、ベンゾ基であ
    り; Z2は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
    基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
    ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはZ1
    と共にとるときは、ベンゾ基であり; Z3およびZ4は別々に水素、ハロゲン、低級アルキル基、
    低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニル
    基、メチルアミノ基またはアミノ基であり; Z5は単独でとるときは、水素、ハロゲン、低級アルキル
    基、低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニ
    ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり、またはZ6
    と共にとるときは、ベンゾ基であり;そして Z6は水素であり、またはZ5と共にとるときは、ベンゾ基
    であり; A′、Z2、Z3、Z4、およびZ5の少なくとも1つは標的核
    酸に結合するためカルボキシル基、スルホニル基、メチ
    ルアミノ基またはアミノ基である。
  5. 【請求項5】A′およびB′はカルボキシルであり;X′
    は水素であり;Z2は単独でとるときは、水素、塩素、メ
    チル、エチル、エトキシ、またはメトキシ基であり、Z3
    およびZ4は別々に水素、塩素、メチル、エチル、メトキ
    シ、またはエトキシ基であり;そしてZ5は単独でとると
    きは、水素、塩素、メチル、エチル、エトキシ、または
    メトキシ基である請求項4記載の方法。
  6. 【請求項6】Z1、Z3、Z4、およびZ6は水素であり、そし
    てZ2およびZ5はメトキシ基である請求項5記載の方法。
  7. 【請求項7】Z1およびZ6は水素であり、Z3およびZ4は塩
    素であり、そしてZ2およびZ5はメトキシ基であり、また
    はZ1およびZ2は共にとるときはベンゾ基であり;Z5とZ6
    は共にとるときはベンゾ基であり、そしてZ3およびZ4
    塩素である請求項5記載の方法。
  8. 【請求項8】Z1およびZ2は共にとるときはベンゾ基であ
    り;Z5とZ6は共にとるときはベンゾ基であり、そしてZ3
    およびZ4は水素である請求項5記載の方法。
  9. 【請求項9】Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、およびZ6は水素であ
    る請求項5記載の方法。
  10. 【請求項10】DNA配列分析のチェインターミネーター
    法において異なる末端ジデオキシヌクレオチドをもつポ
    リヌクレオチドを識別する方法が、次の工程: 第1、第2、第3、および第4の種類のポリヌクレオチ
    ドの混合物を形成し、 第1の種類の各ポリヌクレオチドが3′−末端ジデオキ
    シアデノシンをもち、5−および6−カルボキシルフル
    オレセイン、5−および6−カルボキシ−4,7−ジクロ
    ロフルオレセイン、2′,7′−ジメトキシ−5−および
    6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、2′,
    7′−ジメトキシ−4′,5′−ジクロロ−5−および6
    −カルボキシフルオレセレン、2′,7′−ジメトキシ−
    4′,5′−ジクロロ−5−および6−カルボキシ−4,7
    −ジクロロフルオレセイン、1′,2′,7′,8′−ジベン
    ゾ−5−および6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオ
    レセイン、および1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−4′,
    5′−ジクロロ−5−および6−カルボキシ、4,7−ジク
    ロロフルオレセインから成る群から選ばれた第1の色素
    を用いて標識付けされ、 第2の種類の各ポリヌクレオチドが3′−末端ジデオキ
    シチミジンをもち、5−および6−カルボキシルフルオ
    レセイン、5−および6−カルボキシ−4,7−ジクロロ
    フルオレセイン、2′,7′−ジメトキシ−5−および6
    −カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、2′,
    7′−ジメトキシ−4′,5′−ジクロロ−5−および6
    −カルボキシフルオレセレン、2′,7′−ジメトキシ−
    4′,5′−ジクロロ−5−および6−カルボキシ−4,7
    −ジクロロフルオレセイン、1′,2′,7′,8′−ジベン
    ゾ−5−および6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオ
    レセイン、および1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−4′,
    5′−ジクロロ−5−および6−カルボキシ−4,7−ジク
    ロロフルオレセインから成る群から選ばれた第2の色素
    を用いて標識付けされ、 第3の種類の各ポリヌクレオチドが3′−末端ジデオキ
    シグアノシンをもち、5−および6−カルボキシルフル
    オレセイン、5−および6−カルボキシ−4,7−ジクロ
    ロフルオレセイン、2′,7′−ジメトキシ−5−および
    6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、2′,
    7′−ジメトキシ−4′,5′−ジクロロ−5−および6
    −カルボキシルフルオレセレン、2′,7′−ジメトキシ
    −4′,5′−ジクロロ−5−および6−カルボキシ−4,
    7−ジクロロフルオレセイン、1′,2′,7′,8′−ジベ
    ンゾ−5−および6−カルボキシ−4,7−ジクロロフル
    オレセイン、および1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−
    4′,5′−ジクロロ−5−および6−カルボキシ−4,7
    −ジクロロフルオレセインから成る群から選ばれた第3
    の色素を用いて標識付けされ、 第4の種類の各ポリヌクレオチドが3′−末端ジデオキ
    シシトシンをもち、5−および6−カルボキシルフルオ
    レセイン、5および6−カルボキシ−4,7−ジクロロフ
    ルオレセイン、2′,7′−ジメトキシ−5−および6−
    カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、2′,7′
    −ジメトキシ−4′,5′−ジクロロ−5−および6−カ
    ルボキシルフルオレセイン、2′,7′−ジメトキシ−
    4′,5′−ジクロロ−5−および6−カルボキシ−4,7
    −ジクロロフルオレセイン、1′,2′,7′,8′−ジベン
    ゾ−5−および6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオ
    レセイン、および1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−4′,
    5′−ジクロロ−5−および6−カルボキシ−4,7−ジク
    ロロフルオレセインから成る群から選ばれた第4の色素
    を用いて標識付けされ、 第1、第2、第3、および第4の色素がお互いからスペ
    クトルにより分離することができ; 類似した大きさのポリヌクレオチドのバンドが形成され
    るように、混合物中のポリヌクレオチドをゲル上の電気
    泳動により分離し; ゲル上のバンドを照射ビームを用いて照射し、この照射
    ビームは色素に蛍光を生じさせることができ;そして バンド中のポリヌクレオチドの種類を色素の蛍光または
    吸収スペクトルによって同定する、 各工程から成る識別方法。
  11. 【請求項11】前記第1の種類の各ポリヌクレオチド
    を、前記第1の色素を前記3′−末端ジデオキシアデノ
    シンに結合させて標識付けし、前記第2の種類の各ポリ
    ヌクレオチドを、前記第2の色素を前記3′末端ジデオ
    キシチミジンに結合させて標識付けし、前記第3の種類
    の各ポリヌクレオチドを、前記第3の色素を前記3′−
    末端ジデオキシグアノシンに結合基に結合させて標識付
    けし、そして前記第4の種類の各ポリヌクレオチドを、
    前記第4の色素を前記3′−末端ジデオキシシトシンに
    結合させて標識付けする、請求項10記載の方法。
  12. 【請求項12】前記ジデオキシアデノシンが2′,3′−
    ジデオキシ−7−デアザアデノシンであり、前記ジデオ
    キシシチジンが、2′,3′−ジデオキシシチジンであ
    り、前記ジデオキシグアノシンが2′,3′−ジデオキシ
    −7−デアザグアノシン、または2′,3′−ジデオキシ
    −7−デアザイノシンであり、前記ジデオキシチミジン
    が2′,3′−ジデオキシウリジンである、請求項11記載
    の方法。
  13. 【請求項13】前記2′,3′−ジデオキシシチジンまた
    は2′,3′−ジデオキシウリジンの5位の炭素を前記第
    2の色素または前記第4の色素の5または6位の炭素
    に、それぞれ結合し、そして前記2′,3′−ジデオキシ
    −7−デアザアデノシンまたは2′,3′−ジデオキシ−
    7−グアノシンまたは2′,3′−ジデオキシ−7−デア
    ザイノシンの7位の炭素を前記第1の色素または前記第
    3の色素の5または6位の炭素に、それぞれ結合してい
    る、請求項12記載の方法。
  14. 【請求項14】前記2′,3′−ジデオキシシチジンまた
    は2′,3′−ジデオキシウリジンの5位の炭素を前記第
    2の色素または前記第4の色素の5または6位の炭素に
    カルボキシアミノアルキニル基によって、それぞれ結合
    し、そして前記2′,3′−ジデオキシ−7−デアザアデ
    ノシンまたは2′,3′−ジデオキシ−7−グアノシンま
    たは2′,3′−ジデオキシ−7−デアザイノシンの7位
    の炭素を前記第1の色素または前記第3の色素の5また
    は6位の炭素にカルボキシアミノアルキニル基によっ
    て、それぞれ結合している、請求項13記載の方法。
  15. 【請求項15】前記カルボキシアミノアルキニル基が3
    −カルボキシアミノ−1−プロピニル基である、請求項
    14記載の方法。
  16. 【請求項16】前記ジデオキシアデノシンが2′,3′−
    ジデオキシ−7−デアザアデノシンであり、前記ジデオ
    キシシチジンが、2′,3′−ジデオキシシチジンであ
    り、前記ジデオキシグアノシンが2′,3′−ジデオキシ
    −7−デアザグアノシン、または2′,3′−ジデオキシ
    −7−デアザイノシンであり、そして前記ジデオキシチ
    ミジンが2′,3′−ジデオキシウリジンである、請求項
    10記載の方法。
  17. 【請求項17】前記第1の色素が2′,7′−ジメトキシ
    −5−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセインであ
    り、前記第4の色素が5−カルボキシ−4,7−ジクロロ
    フルオレセインであり、前記第3の色素が2′,7′−ジ
    メトキシ−4′,5′−ジクロロ−6−カルボキシ−4,7
    −ジクロロフルオレセインまたは1′,2′,7′,8′−ジ
    ベンゾ−4′,5′−ジクロロ−5−カルボキシ−4,7−
    ジクロロフルオレセインであり、そして前記第2の色素
    が1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−5−カルボキシ−4,7
    −ジクロロフルオレセインである、請求項16記載の方
    法。
  18. 【請求項18】次式で示される化合物。 式中、 A′は水素、フッ素、塩素、カルボキシル基、スルホニ
    ル基、メチルアミノ基またはアミノ基であり; B′はフッ素、塩素、カルボキシル基、またはスルホニ
    ル基であり; X′は水素、フッ素、または塩素であり; Z3およびZ4は別々に水素、ハロゲン、低級アルキル基、
    低級アルキルオキシ基、カルボキシル基、スルホニル
    基、メチルアミノ基またはアミノ基であり;そして A′、Z3、およびZ4の少なくとも1つはカルボキシル
    基、スルホニル基、メチルアミノ基またはアミノ基であ
    る。
  19. 【請求項19】A′がカルボキシル基、スルホニル基、
    またはアミノ基であり;B′がカルボキシル基またはスル
    ホニル基であり;X′が水素であり;Z3およびZ4が別々に
    水素、ハロゲン、メチル基、メトキシ基、エチル基、エ
    トキシ基、カルボキシル基、スルホニル基、またはメチ
    ルアミノ基である請求項18記載の化合物。
  20. 【請求項20】A′、Z3およびZ4の1つのみがカルボキ
    シル基、スルホニル基、メチルアミノ基、またはアミノ
    基である請求項18記載の化合物。
  21. 【請求項21】A′、およびB′がカルボキシル基であ
    り、Z3が水素または塩素であり、そしてZ4が水素または
    塩素である請求項18記載の化合物。
JP3500838A 1989-11-14 1990-11-13 分子プロ―ブとしての4,7―ジクロロフルオレセイン色素 Expired - Lifetime JP2523423B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US436,455 1989-11-14
US07/436,455 US5188934A (en) 1989-11-14 1989-11-14 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH05500860A JPH05500860A (ja) 1993-02-18
JP2523423B2 true JP2523423B2 (ja) 1996-08-07

Family

ID=23732469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3500838A Expired - Lifetime JP2523423B2 (ja) 1989-11-14 1990-11-13 分子プロ―ブとしての4,7―ジクロロフルオレセイン色素

Country Status (6)

Country Link
US (1) US5188934A (ja)
EP (1) EP0500779B1 (ja)
JP (1) JP2523423B2 (ja)
AT (1) ATE179215T1 (ja)
DE (1) DE69033067T2 (ja)
WO (1) WO1991007507A1 (ja)

Families Citing this family (258)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5821058A (en) * 1984-01-16 1998-10-13 California Institute Of Technology Automated DNA sequencing technique
USRE43096E1 (en) * 1984-01-16 2012-01-10 California Institute Of Technology Tagged extendable primers and extension products
US5863403A (en) * 1984-03-29 1999-01-26 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Digital DNA typing
US5571388A (en) * 1984-03-29 1996-11-05 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescense labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels thereof
US6086737A (en) * 1984-03-29 2000-07-11 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescence labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels therefor
US4729947A (en) * 1984-03-29 1988-03-08 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska DNA sequencing
US6004446A (en) * 1984-03-29 1999-12-21 Li-Cor, Inc. DNA Sequencing
US6207421B1 (en) 1984-03-29 2001-03-27 Li-Cor, Inc. DNA sequencing and DNA terminators
US5360523A (en) * 1984-03-29 1994-11-01 Li-Cor, Inc. DNA sequencing
US5654442A (en) 1989-11-14 1997-08-05 The Perkin-Elmer Corporation 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
WO1994005688A1 (en) 1992-09-03 1994-03-17 Applied Biosystems, Inc. 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
US5869255A (en) * 1994-02-01 1999-02-09 The Regents Of The University Of California Probes labeled with energy transfer couples dyes exemplified with DNA fragment analysis
US6028190A (en) * 1994-02-01 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Probes labeled with energy transfer coupled dyes
US5654419A (en) * 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US5582705A (en) * 1995-05-19 1996-12-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Multiplexed capillary electrophoresis system
US5614386A (en) * 1995-06-23 1997-03-25 Baylor College Of Medicine Alternative dye-labeled primers for automated DNA sequencing
US5861287A (en) * 1995-06-23 1999-01-19 Baylor College Of Medicine Alternative dye-labeled primers for automated DNA sequencing
US5728529A (en) * 1995-06-23 1998-03-17 Baylor College Of Medicine Alternative dye-labeled ribonucleotides, deoxyribonucleotides, and dideoxyribonucleotides for automated DNA analysis
US5641633A (en) * 1995-11-15 1997-06-24 Becton, Dickinson And Company Fluorescence polarization detection of nucleic acids
US6020481A (en) 1996-04-01 2000-02-01 The Perkin-Elmer Corporation Asymmetric benzoxanthene dyes
US6162931A (en) 1996-04-12 2000-12-19 Molecular Probes, Inc. Fluorinated xanthene derivatives
US5863727A (en) * 1996-05-03 1999-01-26 The Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US5800996A (en) * 1996-05-03 1998-09-01 The Perkin Elmer Corporation Energy transfer dyes with enchanced fluorescence
US7388092B2 (en) * 1996-05-03 2008-06-17 Applera Corporation Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes
US5847162A (en) * 1996-06-27 1998-12-08 The Perkin Elmer Corporation 4, 7-Dichlororhodamine dyes
US7825237B2 (en) * 1996-05-03 2010-11-02 Applied Biosystems, Llc Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes
US5945526A (en) 1996-05-03 1999-08-31 Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US6080852A (en) 1996-06-27 2000-06-27 The Perkin-Elmer Corporation 4,7-dichlororhodamine dyes
US6017712A (en) * 1996-06-27 2000-01-25 Lee; Linda 4,7-dichlororhodamine dyes
US7550570B2 (en) * 2000-05-25 2009-06-23 Applied Biosystems, Llc. 4,7-dichlororhodamine dyes labeled polynucleotides
US5821356A (en) * 1996-08-12 1998-10-13 The Perkin Elmer Corporation Propargylethoxyamino nucleotides
US5853992A (en) * 1996-10-04 1998-12-29 The Regents Of The University Of California Cyanine dyes with high-absorbance cross section as donor chromophores in energy transfer labels
CA2281205A1 (en) * 1997-02-12 1998-08-13 Eugene Y. Chan Methods and products for analyzing polymers
US6130101A (en) * 1997-09-23 2000-10-10 Molecular Probes, Inc. Sulfonated xanthene derivatives
US6008379A (en) * 1997-10-01 1999-12-28 The Perkin-Elmer Corporation Aromatic-substituted xanthene dyes
US5958694A (en) 1997-10-16 1999-09-28 Caliper Technologies Corp. Apparatus and methods for sequencing nucleic acids in microfluidic systems
US6289229B1 (en) 1998-01-20 2001-09-11 Scimed Life Systems, Inc. Readable probe array for in vivo use
US6080868A (en) 1998-01-23 2000-06-27 The Perkin-Elmer Corporation Nitro-substituted non-fluorescent asymmetric cyanine dye compounds
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US5948648A (en) * 1998-05-29 1999-09-07 Khan; Shaheer H. Nucleotide compounds including a rigid linker
US6653462B2 (en) 1998-05-29 2003-11-25 Applera Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6908770B1 (en) 1998-07-16 2005-06-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Fluid based analysis of multiple analytes by a sensor array
US6153411A (en) 1998-10-30 2000-11-28 American Water Works Company, Inc. Methods and kits for detection of Cryptosporidium parvum using immunomagnetic separation and amplification
US6432642B1 (en) * 1999-01-15 2002-08-13 Pe Corporation (Ny) Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection
US7022517B1 (en) 1999-07-16 2006-04-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for the delivery of samples to a chemical sensor array
AU773679B2 (en) 1999-07-16 2004-06-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for the delivery of samples to a chemical sensor array
US6358684B1 (en) 1999-08-27 2002-03-19 Pe Corporation UV excitable fluorescent energy transfer dyes
US6218124B1 (en) 1999-08-27 2001-04-17 Pe Corporation Method for detecting oligonucleotides using UV light source
US6569685B1 (en) 1999-10-05 2003-05-27 The Molecular Sciences Institute, Inc. Protein fingerprint system and related methods
WO2001055703A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of preparing a sensor array
US6221604B1 (en) 2000-02-07 2001-04-24 Pe Corporation Electron-deficient nitrogen heterocycle-substituted fluorescein dyes
US6887664B2 (en) 2000-06-06 2005-05-03 Applera Corporation Asynchronous primed PCR
CA2425663C (en) * 2000-10-11 2009-12-29 Applera Corporation Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers
WO2002044425A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US20020197622A1 (en) * 2001-01-31 2002-12-26 Mcdevitt John T. Method and apparatus for the confinement of materials in a micromachined chemical sensor array
WO2002063270A2 (en) * 2001-02-05 2002-08-15 Board Of Regents, The University Of Texas System The use of mesoscale self-assembly and recognition to effect delivery of sensing reagent for arrayed sensors
ATE496139T1 (de) * 2001-03-09 2011-02-15 Boston Probes Inc Kombinationsoligomere betreffende verfahren, kits und zusammensetzungen
US6887690B2 (en) * 2001-06-22 2005-05-03 Pe Corporation Dye-labeled ribonucleotide triphosphates
US7668697B2 (en) * 2006-02-06 2010-02-23 Andrei Volkov Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level
US7052512B2 (en) * 2001-07-18 2006-05-30 Boston Scientific Scimed, Inc. Fluorescent dyed lubricant for medical devices
US6764710B2 (en) 2001-07-18 2004-07-20 Scimed Life Systems, Inc. Light emitting markers for use with substrates
CA2453390A1 (en) * 2001-07-25 2003-02-06 Applera Corporation Time-delay integration in electrophoretic detection systems
US20050032060A1 (en) * 2001-08-31 2005-02-10 Shishir Shah Arrays comprising pre-labeled biological molecules and methods for making and using these arrays
US8569516B2 (en) * 2001-09-07 2013-10-29 Elitech Holding B.V. Compounds and methods for fluorescent labeling
US6972339B2 (en) 2001-09-07 2005-12-06 Epoch Biosciences, Inc. Compounds and methods for fluorescent labeling
US7335470B2 (en) 2001-10-12 2008-02-26 Perkinelmer, Las, Inc. Compilations of nucleic acids and arrays and methods of using them
US7439346B2 (en) * 2001-10-12 2008-10-21 Perkinelmer Las Inc. Nucleic acids arrays and methods of use therefor
US20030165935A1 (en) 2001-11-21 2003-09-04 Vann Charles S. Digital assay
US20030180769A1 (en) * 2002-02-05 2003-09-25 Metzker Michael L. Substituted 4,4-difluoro-4-bora-3A,4A-diaza-s-indacene compounds for 8-color DNA sequencing
US6916621B2 (en) * 2002-03-27 2005-07-12 Spectral Genomics, Inc. Methods for array-based comparitive binding assays
US7419784B2 (en) * 2002-04-02 2008-09-02 Dubrow Robert S Methods, systems and apparatus for separation and isolation of one or more sample components of a sample biological material
US7150967B2 (en) * 2002-04-08 2006-12-19 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Fluorescent tags for amino acid and nucleic acid analysis
AU2003228711C1 (en) 2002-04-26 2010-01-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and system for the detection of cardiac risk factors
EP2161276A3 (en) * 2002-09-08 2010-05-26 Applera Corporation Methods, compositions and libraries pertaining PNA dimer and PNA oligomer systhesis
JP4694201B2 (ja) * 2002-09-20 2011-06-08 インテグレイテッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレイテッド アントラキノン消光色素、それらの製造方法及び使用
WO2004097371A2 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System System and method for the detection of analytes
US7432298B2 (en) * 2003-05-09 2008-10-07 Applied Biosystems Inc. Fluorescent polymeric materials containing lipid soluble rhodamine dyes
WO2004101709A1 (en) * 2003-05-09 2004-11-25 Applera Corporation Phenyl xanthene dyes
US7651850B2 (en) * 2003-05-16 2010-01-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Image and part recognition technology
US9317922B2 (en) 2003-05-16 2016-04-19 Board Of Regents The University Of Texas System Image and part recognition technology
US20060029948A1 (en) * 2003-09-19 2006-02-09 Gary Lim Sealing cover and dye compatibility selection
US7570443B2 (en) 2003-09-19 2009-08-04 Applied Biosystems, Llc Optical camera alignment
US7417726B2 (en) * 2003-09-19 2008-08-26 Applied Biosystems Inc. Normalization of data using controls
WO2005028629A2 (en) * 2003-09-19 2005-03-31 Applera Corporation Whole genome expression analysis system
WO2005040357A2 (en) * 2003-10-24 2005-05-06 Epoch Biosciences, Inc. Compounds and methods for fluorescent labeling
EP1687609B1 (en) * 2003-10-28 2014-12-10 Epoch Biosciences, Inc. Fluorescent probes for dna detection by hybridization with improved sensitivity and low background
WO2005049849A2 (en) * 2003-11-14 2005-06-02 Integrated Dna Technologies, Inc. Fluorescence quenching azo dyes, their methods of preparation and use
US7504495B2 (en) * 2003-11-20 2009-03-17 Exiqon A/S Quencher compositions comprising anthraquinone moieties
JP4127204B2 (ja) * 2003-12-17 2008-07-30 セイコーエプソン株式会社 液晶表示装置の製造方法
DE602004030041D1 (de) 2003-12-22 2010-12-23 Univ Pennsylvania Verfahren und zusammensetzungen zur identifikation von rna-bindenden proteinen
US20050186606A1 (en) * 2004-02-11 2005-08-25 Schroeder Benjamin G. Methods and compositions for detecting nucleic acids
US8101431B2 (en) * 2004-02-27 2012-01-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems
US8105849B2 (en) * 2004-02-27 2012-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements
US20050255485A1 (en) * 2004-05-14 2005-11-17 Livak Kenneth J Detection of gene duplications
EP2471923B1 (en) 2004-05-28 2014-08-20 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
WO2006016978A1 (en) * 2004-06-30 2006-02-16 Applera Corporation Analog probe complexes
WO2006020947A2 (en) 2004-08-13 2006-02-23 Epoch Biosciences, Inc. Phosphonate fluorescent dyes and conjugates
EP2302051B1 (en) 2004-11-12 2015-01-07 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US20060292586A1 (en) * 2004-12-17 2006-12-28 Schroth Gary P ID-tag complexes, arrays, and methods of use thereof
US20060166238A1 (en) * 2004-12-22 2006-07-27 Ramsing Niels B Probes, libraries and kits for analysis of mixtures of nucleic acids and methods for constructing the same
WO2006074233A2 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 Applera Corporation Polypeptides having nucleic acid binding activity and compositions and methods for nucleic acid amplification
AU2006210553A1 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Ab Advanced Genetic Analysis Corporation Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing
EP2241637A1 (en) 2005-02-01 2010-10-20 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension
US20070065948A1 (en) 2005-03-15 2007-03-22 Applera Corporation Use of antibody-surrogate antigen systems for detection of analytes
US20060252079A1 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Applera Corporation Fluorescent detection system and dye set for use therewith
CA2601554A1 (en) 2005-05-20 2006-11-30 Integrated Dna Technologies, Inc. Compounds and methods for labeling oligonucleotides
AU2006309284B2 (en) 2005-05-31 2012-08-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions related to determination and use of white blood cell counts
US8445194B2 (en) 2005-06-15 2013-05-21 Callida Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
US20070087360A1 (en) * 2005-06-20 2007-04-19 Boyd Victoria L Methods and compositions for detecting nucleotides
EP2508867A1 (en) * 2005-06-24 2012-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Systems and methods including self-contained cartridges with detection systems and fluid delivery systems
WO2007005666A2 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 Board Of Regents, The University Of Texas System System and method of analyte detection using differential receptors
US20070059713A1 (en) 2005-09-09 2007-03-15 Lee Jun E SSB-DNA polymerase fusion proteins
US7741467B2 (en) * 2005-10-05 2010-06-22 Roche Molecular Systems, Inc. Non-fluorescent energy transfer
CA2624896C (en) 2005-10-07 2017-11-07 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
WO2007120265A2 (en) 2005-11-14 2007-10-25 Applera Corporation Coded molecules for detecting target analytes
SG170028A1 (en) * 2006-02-24 2011-04-29 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
EP2495337A1 (en) 2006-02-24 2012-09-05 Callida Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
US20070218490A1 (en) * 2006-03-15 2007-09-20 Integrated Dna Technologies, Inc. Nucleic acid monomers with 2'-chemical moieties
US9677123B2 (en) 2006-03-15 2017-06-13 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
CA2649725A1 (en) * 2006-04-19 2007-10-25 Applera Corporation Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing
US20080124726A1 (en) 2006-05-26 2008-05-29 Althea Technologies, Inc. Biochemical analysis of partitioned cells
CA2663962A1 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Mir-15, mir-26, mir-31,mir-145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216, mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US7910354B2 (en) * 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090111706A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by amplification
US7897737B2 (en) 2006-12-05 2011-03-01 Lasergen, Inc. 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
US7893227B2 (en) * 2006-12-05 2011-02-22 Lasergen, Inc. 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing
CN101622348A (zh) * 2006-12-08 2010-01-06 奥斯瑞根公司 作为治疗性干预靶标的miR-20调节的基因和途径
EP2104735A2 (en) * 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-21 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
EP2104734A2 (en) * 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
AU2007333109A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Functions and targets of let-7 micro RNAs
WO2008073764A2 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Alcon Research, Ltd. Substantially pure fluorescein
US20090175827A1 (en) * 2006-12-29 2009-07-09 Byrom Mike W miR-16 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
US20080300798A1 (en) * 2007-04-16 2008-12-04 Mcdevitt John T Cardibioindex/cardibioscore and utility of salivary proteome in cardiovascular diagnostics
US20080274458A1 (en) * 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
US20090232893A1 (en) * 2007-05-22 2009-09-17 Bader Andreas G miR-143 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
WO2008154333A2 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 Asuragen, Inc. Mir-34 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US7816135B2 (en) 2007-07-05 2010-10-19 Becton, Dickinson And Company Method of analyzing lymphocytes
CA2694030A1 (en) 2007-07-31 2008-12-18 Nitto Kasei Co., Ltd. Composition for measuring the binding affinity between nucleic acid and test substance, and use thereof
EP2198050A1 (en) 2007-09-14 2010-06-23 Asuragen, INC. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US20090191553A1 (en) * 2007-10-01 2009-07-30 Applied Biosystems Inc. Chase Ligation Sequencing
US20090186015A1 (en) * 2007-10-18 2009-07-23 Latham Gary J Micrornas differentially expressed in lung diseases and uses thereof
US20090171078A1 (en) * 2007-11-20 2009-07-02 Applied Biosystems Inc. Method of sequencing nucleic acids using elaborated nucleotide phosphorotiolate compounds
US8017338B2 (en) * 2007-11-20 2011-09-13 Life Technologies Corporation Reversible di-nucleotide terminator sequencing
US8071562B2 (en) * 2007-12-01 2011-12-06 Mirna Therapeutics, Inc. MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2009086156A2 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Asuragen, Inc. Mir-10 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090263803A1 (en) * 2008-02-08 2009-10-22 Sylvie Beaudenon Mirnas differentially expressed in lymph nodes from cancer patients
US8440168B2 (en) * 2008-03-24 2013-05-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Image-guided therapy of myocardial disease: composition, manufacturing and applications
EP2271757A2 (en) * 2008-03-26 2011-01-12 Asuragen, INC. Compositions and methods related to mir-16 and therapy of prostate cancer
US20090258928A1 (en) * 2008-04-08 2009-10-15 Asuragen, Inc. Methods and compositions for diagnosing and modulating human papillomavirus (hpv)
US8258111B2 (en) * 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
WO2009152353A2 (en) 2008-06-11 2009-12-17 Lasergen, Inc. Nucleotides and nucleosides and methods for their use in dna sequencing
US20100179213A1 (en) * 2008-11-11 2010-07-15 Mirna Therapeutics, Inc. Methods and Compositions Involving miRNAs In Cancer Stem Cells
US20100159452A1 (en) * 2008-12-22 2010-06-24 Roche Molecular Systems, Inc. Method For Detecting a Target Nucleic Acid in a Sample
US20100294952A1 (en) * 2009-01-15 2010-11-25 Northwestern University Controlled agent release and sequestration
US20100255487A1 (en) 2009-03-27 2010-10-07 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for single molecule sequencing using energy transfer detection
EP3150619B1 (en) 2009-05-21 2019-09-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Universal tags with non-natural nucleobases
AU2010249421A1 (en) 2009-05-22 2011-12-08 Asuragen, Inc. miRNA biomarkers of prostate disease
US8735074B2 (en) 2009-08-28 2014-05-27 Asuragen, Inc. MiRNA biomarkers of lung disease
US9547007B2 (en) 2009-09-22 2017-01-17 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Methods and compositions for in-vivo enzyme capture
GB0922377D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Arab Gulf University The Mutant LDL receptor
CA2794485C (en) 2010-03-26 2018-05-22 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods for enhancing nucleic acid hybridization
US9506057B2 (en) 2010-03-26 2016-11-29 Integrated Dna Technologies, Inc. Modifications for antisense compounds
US7956169B1 (en) 2010-06-16 2011-06-07 Chemgenes Corporation Synthesis of novel azo-dyes and their use in oligonucleotide synthesis
US9410194B2 (en) 2010-06-21 2016-08-09 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods for synthesis and/or detection of nucleic acids
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
JP6053684B2 (ja) 2010-09-07 2016-12-27 インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド アンチセンス化合物の修飾
WO2012058633A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Latham Gary J mPCR METHODS FOR ANALYZING REPEAT SEQUENCES
CN107326073A (zh) 2010-12-29 2017-11-07 生命技术公司 作为荧光参考标准品的 ddao 化合物
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
US20120190021A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
WO2012118745A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Arnold Oliphant Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination
JP5893442B2 (ja) * 2011-03-04 2016-03-23 国立大学法人宇都宮大学 チロシナーゼ活性阻害剤
US8809238B2 (en) 2011-05-09 2014-08-19 Fluidigm Corporation Probe based nucleic acid detection
JP6196968B2 (ja) 2011-05-24 2017-09-13 エリテックグループ・ベスローテン・フェンノートシャップElitechgroup B.V. メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出
AU2012309824A1 (en) 2011-09-12 2013-04-18 Abbvie Biotherapeutics Inc. Artificial NK cells and uses thereof
EP3670523B1 (en) 2011-09-13 2021-08-11 Agilent Technologies, Inc. 3'-oh unblocked, fast photocleavable terminating nucleotides and their use in methods for nucleic acid sequencing
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
EP2766498B1 (en) 2011-10-14 2019-06-19 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
WO2013138937A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 UNIVERSITé LAVAL A nucleic acid detection method comprising target specific indexing probes (tsip) comprising a releasable segment to be detected via fluorescence when bound to a capture probe
CN109082462B (zh) 2012-05-21 2022-10-28 斯克利普斯研究所 样品制备方法
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
EP2820418B1 (en) 2012-07-20 2017-12-06 President and Fellows of Harvard College Cell based quality control bioassays for nutriceutical and medicinal products
US9476089B2 (en) 2012-10-18 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of making oligonucleotide probes
EP2909341A2 (en) 2012-10-18 2015-08-26 Oslo Universitetssykehus HF Biomarkers for cervical cancer
WO2014093291A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 Advandx, Inc. Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest
US9289502B2 (en) 2013-03-08 2016-03-22 Emerald Therapeutics, Inc. Preparation of oligo conjugates
WO2014164479A1 (en) 2013-03-11 2014-10-09 Elitech Holding B.V. Methods for true isothermal strand displacement amplification
US9347095B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays for mutation detection
US9540685B2 (en) 2013-03-15 2017-01-10 President And Fellows Of Harvard College Methods of identifying homologous genes using FISH
US9328384B2 (en) 2013-05-13 2016-05-03 Elitechgroup B.V. Droplet digital PCR with short minor groove probes
US20150191794A1 (en) 2014-01-05 2015-07-09 Biomirna Holdings Ltd. Lung Cancer Determinations Using MIRNA
WO2015120382A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 The Johns Hopkins University Predicting response to epigenetic drug therapy
AU2015305570C1 (en) 2014-08-19 2020-07-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided systems for probing and mapping of nucleic acids
CA2957614C (en) 2014-08-19 2022-09-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for nucleic acid detection
US10450562B2 (en) 2014-09-09 2019-10-22 Igenomx International Genomics Corporation Methods and compositions for rapid nucleic acid library preparation
EP3221469B1 (en) 2014-11-21 2020-01-15 Nanostring Technologies, Inc Enzyme- and amplification-free sequencing
WO2016094330A2 (en) 2014-12-08 2016-06-16 20/20 Genesystems, Inc Methods and machine learning systems for predicting the liklihood or risk of having cancer
EP3230467A1 (en) 2014-12-12 2017-10-18 ELITechGroup B.V. Methods and compositions for detecting antibiotic resistant bacteria
JP2017538418A (ja) 2014-12-12 2017-12-28 エリテックグループ・ベスローテン・フェンノートシャップElitechgroup B.V. 抗生物質耐性細菌を検出する方法および組成物
US10913944B2 (en) 2015-01-12 2021-02-09 Life Technologies Corporation Methods, systems and compositions thereof for nucleic acid library quality control and quantification
ES2971094T3 (es) 2015-04-07 2024-06-03 Polyskope Labs Detección de uno o más patógenos
WO2016179090A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Vanderbilt University Monitoring and analysis of nucleic acid hybridization state and amplification using l-dna
EP3292214A1 (en) 2015-05-04 2018-03-14 Academisch Medisch Centrum Method of quantifying mirnas using normalization
WO2017015543A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Asuragen, Inc. Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating a/t-rich segments
WO2017044651A2 (en) 2015-09-10 2017-03-16 Beckman Coulter, Inc. Short oligonucleotide quenchers for reduction of taqman probe baseline fluorescence
RU2757416C2 (ru) 2016-04-06 2021-10-15 Лайф Текнолоджис Корпорейшн Композиции, способы и наборы для синтеза и обнаружения нуклеиновых кислот
CN109715825B (zh) 2016-05-16 2023-01-06 纳米线科技公司 用于检测样品中目标核酸的方法
MA54568A (fr) 2016-07-01 2021-10-27 Carlsberg As Substitutions de nucléotides prédéterminées
WO2018045162A1 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Biogen Ma Inc. Biomarkers predictive of primary progressive multiple sclerosis and uses thereof
CA3043489A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
WO2018111946A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing detection
DK3565905T3 (da) 2017-01-04 2022-07-25 Mgi Tech Co Ltd Nukleinsyresekvensering ved hjælp af affinitetsreagenser
WO2018223053A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
CN110914448A (zh) 2017-06-02 2020-03-24 昂飞股份有限公司 使用差异性标记的等位基因特异性探针分析混合样品的基于阵列的方法
WO2019104070A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Nanostring Technologies, Inc. O-nitrobenzyl photocleavable bifunctional linker
JP2021523723A (ja) 2018-05-14 2021-09-09 ナノストリング テクノロジーズ,インコーポレイティド 化学的組成物とそれを利用する方法
KR20210107737A (ko) 2018-12-20 2021-09-01 라이프 테크놀로지스 코포레이션 개질된 로다민 염료 및 생물학적 분석에서의 그 용도
SG11202106121SA (en) 2018-12-20 2021-07-29 Life Technologies Corp Asymmetric rhodamine dye and use thereof in biological assays
EP3719144A1 (en) 2019-04-05 2020-10-07 Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario de la Paz (FIBHULP) Mir-151a-3p as an universal endogenous control for exosome cargo normalization
WO2021013592A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Universitario La Paz (Fibhulp) Method for determining the response to treatment of a patient affected by non-small cell lung carcinoma (nsclc)
CN114786473B (zh) 2019-10-10 2023-12-19 嘉士伯有限公司 制备突变植物的方法
JP2022552013A (ja) 2019-10-18 2022-12-14 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 臨床規模および工業規模の無傷の組織の配列決定
WO2021080629A1 (en) 2019-10-23 2021-04-29 Elitechgroup, Inc. Methods for true isothermal strand displacement amplification
WO2021178893A2 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Singular Genomics Systems, Inc. Linked paired strand sequencing
EP4153606A2 (en) 2020-07-13 2023-03-29 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of sequencing complementary polynucleotides
WO2022020731A2 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Life Technologies Corporation Compositions, systems and methods for biological analysis involving energy transfer dye conjugates and analytes comprising the same
KR20230056683A (ko) 2020-07-23 2023-04-27 라이프 테크놀로지스 코포레이션 생물학적 분석에 사용하기 위한 에너지 전달 염료 접합체
AU2021343471A1 (en) 2020-09-16 2023-05-04 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using the same
US20220228200A1 (en) 2021-01-19 2022-07-21 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for internally controlled in situ assays
EP4251770A4 (en) 2021-02-08 2024-05-29 Singular Genomics Systems Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCING COMPLEMENTARY POLYNUCLEOTIDES
WO2022192671A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
US11884977B2 (en) 2021-03-12 2024-01-30 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
EP4294920A1 (en) 2021-04-27 2023-12-27 Singular Genomics Systems, Inc. High density sequencing and multiplexed priming
WO2022256324A1 (en) 2021-06-01 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyte detection and probe resolution
US20230084407A1 (en) 2021-06-02 2023-03-16 10X Genomics, Inc. Sample analysis using asymmetric circularizable probes
CN117651855A (zh) 2021-07-13 2024-03-05 10X基因组学有限公司 用于制备具有可控厚度的聚合基质的方法
US20230057571A1 (en) 2021-08-03 2023-02-23 10X Genomics, Inc. Nucleic acid concatemers and methods for stabilizing and/or compacting the same
EP4326898A1 (en) 2021-08-16 2024-02-28 10X Genomics, Inc. Probes comprising a split barcode region and methods of use
CA3229091A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Caribou Biosciences, Inc. Exonuclease-coupled real-time endonuclease activity assay
US20230242974A1 (en) 2021-12-27 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for rolling circle amplification
WO2023141588A1 (en) 2022-01-21 2023-07-27 10X Genomics, Inc. Multiple readout signals for analyzing a sample
WO2023164570A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Insitro, Inc. Pooled optical screening and transcriptional measurements of cells comprising barcoded genetic perturbations
US11795505B2 (en) 2022-03-10 2023-10-24 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleic acid delivery scaffolds
WO2023192616A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence
US20240002902A1 (en) 2022-05-06 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
WO2023215603A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for in situ analysis of v(d)j sequences
WO2023220300A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for in situ sequencing
WO2023245190A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 10X Genomics, Inc. Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis
WO2024036304A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 10X Genomics, Inc. Puma1 polymerases and uses thereof
US20240084373A1 (en) 2022-08-16 2024-03-14 10X Genomics, Inc. Ap50 polymerases and uses thereof
WO2024081869A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 10X Genomics, Inc. Methods for analysis of biological samples
WO2024102736A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 10X Genomics, Inc. Immobilization methods and compositions for in situ detection
US20240158852A1 (en) 2022-11-16 2024-05-16 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for assessing performance of in situ assays

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4329461A (en) * 1980-01-11 1982-05-11 Syva Company Fluorescent thyroid hormone conjugates and their uses
EP0050684B1 (en) * 1980-10-27 1986-01-22 Syva Company Novel ether substituted fluorescein compounds as fluorescers and quenchers
GB8500360D0 (en) 1985-01-07 1985-02-13 Bristol University Of Polymers
US4855225A (en) * 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
US4811218A (en) * 1986-06-02 1989-03-07 Applied Biosystems, Inc. Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing
US4997928A (en) * 1988-09-15 1991-03-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
JPH05500860A (ja) 1993-02-18
US5188934A (en) 1993-02-23
ATE179215T1 (de) 1999-05-15
DE69033067D1 (de) 1999-05-27
WO1991007507A1 (en) 1991-05-30
EP0500779A1 (en) 1992-09-02
DE69033067T2 (de) 1999-10-21
EP0500779B1 (en) 1999-04-21
EP0500779A4 (ja) 1994-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2523423B2 (ja) 分子プロ―ブとしての4,7―ジクロロフルオレセイン色素
JP4554224B2 (ja) 分子プローブとしての4,7−ジクロロフルオレセイン染料
JP3386473B2 (ja) 非対称ベンゾキサンテン染料
EP0496749B1 (en) Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination
US6649598B2 (en) 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
EP0940450B1 (en) Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US20020058272A1 (en) UV excitable fluorescent energy transfer dyes
JP2001518479A (ja) 芳香族置換キサンテン色素
US6218124B1 (en) Method for detecting oligonucleotides using UV light source