CN116621804A - 5-和6-羧基荧光素类化合物异构体的化学动力学拆分方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种5‑和6‑羧基荧光素类化合物异构体的化学动力学拆分方法，在本发明中式V‑a和式V‑b的荧光素类化合物混合物，与式VI胺反应，选择性胺解掉双酰基保护的5‑羧基荧光素铵盐式V‑b中的一个酰基，其母核形成双阴离子铵盐式IX而溶解于体系中；双酰基保护的6‑羧基荧光素铵盐式V‑a则在选定条件下悬浮于溶剂中，过滤分离，实现异构体的拆分。本发明方法可以高效地拆分5‑和6‑羧基荧光素类化合物异构体，该方法在常规条件下可快速、稳定地拆分异构体，以替代低温长时间冷冻结晶的拆分方案，从而不依赖于特殊设备，更便于操作和提高工艺稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及荧光素制备技术领域，具体而言，涉及一种5-和6-羧基荧光素类化合物异构体的化学动力学拆分方法。
背景技术
荧光素类化合物（如6-FAM、6-TET、6-HEX、6-VIC和6-JOE等）已经成为寡核苷酸标记、蛋白检测及DNA测序的国际通用荧光染料。限于合成羧基取代荧光素类化合物的反应机理，通常得到的是5-和6-羧基荧光素异构体的混合物，两个异构体的性质比较接近，难于直接分离。
目前常用的有采用柱层析分离或制备色谱分离纯化的方式，但是上述方式适合小量制备，并且成本高、效率低。
文献（Rossi, F. M.; Kao, J. P. Y. Bioconjugate Chem. 1977, 8, 495）首先公开报道了一种5-和6-羧基荧光素类化合物异构体的拆分分离纯化方法，此后的多种文献和专利均参考这种方法进行异构体拆分。其原理是根据双特戊酰基保护的5-和6-羧基荧光素的二异丙胺盐在无水乙醇中的溶解度不同，用低温长时间冷冻析晶的方法，分离得到纯双特戊酰基保护的6-羧基荧光素的二异丙胺盐，再经酸化游离得到双特戊酰基保护的6-羧基荧光素，从而达到异构体分离的目的。此方法需长时间低温冷冻结晶，对温度的控制范围要求高，耗时耗能且可操作性较差，对设备规格要求高；拆分效果受底物的结构、纯度和杂质的影响较大；拆分量增加时，需要多次结晶才能达到纯度要求。此分离纯化工艺的稳定性不理想，效率低，不利于进行平稳的大规模制备。
因此，开发一种5-和6-羧基荧光素类化合物异构体的化学动力学拆分方法，适合工业化量产的制备6-羧基荧光素类化合物的方法至关重要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种5-和6-羧基荧光素类化合物异构体的化学动力学拆分方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：偏苯三酸酐类底物式I与间苯二酚类底物式II进行傅-克酰基化反应关环生成式III-a和式III-b的荧光素类化合物混合物；
步骤2：用式VIII酸酐对式III-a和式III-b的荧光素类化合物混合物的双羟基进行保护，得到式IV-a和式IV-b的双酰基保护的荧光素类化合物混合物；
步骤3：对式IV-a和式IV-b的双酰基保护的荧光素类化合物混合物，与式VII胺成盐，得到式V-a和式V-b的荧光素类化合物混合物；
步骤4：对式V-a和式V-b的荧光素类化合物混合物，与式VI胺反应，选择性胺解掉双酰基保护的式V-b的5-羧基荧光素铵盐中的一个酰基，其母核形成双阴离子铵盐式IX而溶解于体系中；双酰基保护的6-羧基荧光素铵盐式V-a则在选定条件下悬浮于溶剂中，过滤分离，实现异构体拆分；各个化合物具体结构如下：
；
；
其中X为卤素或氢，R1、R2各自独立的为氢、卤素、芳基、烷氧基；R8为烷基，其对应的酸酐可为乙酸酐、丙酸酐、异丁酸酐、特戊酸酐等；
式VII胺为可与式IV-a和式IV-b成盐的氨、一级胺、二级胺或三级胺，R3、R4、R5为对应的取代基，如氨、丙胺、正丁胺、二乙胺、二异丙胺、三乙胺等；
式VI胺为可与式V-b发生胺解反应的氨、一级胺或二级胺，R6、R7为对应的取代基，如氨、丙胺、正丁胺、二乙胺、二异丙胺等。
在一种实施方式中，在步骤4中，过滤分离得到滤饼，再经酸化游离得到式IV-a的双酰基保护的荧光素类化合物。
在一种实施方式中，在步骤4中，对于滤液中的式V-b的荧光素类化合物进行氨解至保护基完全脱除，然后酸化得到式III-b的荧光素类化合物，然后与酸酐反应，得到式IV-b的双酰基保护的荧光素类化合物。
在一种实施方式中，在步骤3中选用醚类、氯代烷烃类、芳烃类和酯类作为溶剂。在本发明中醚类、氯代烷烃类、芳烃类和酯类对式IV底物的溶解性好，而对式V铵盐的溶解性差。而极性非质子溶剂，如N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等，对式IV底物的溶解性好，对式V铵盐的溶解性也好，直接使用会导致式V铵盐的收率降低；对于醇类溶剂，如甲醇、乙醇等，对式IV底物的溶解性好，但形成式V铵盐的过程中，式V铵盐不易彻底析出，会使式V铵盐的收率降低。
在一种实施方式中，在步骤3中选用甲基叔丁基醚作为溶剂。
在一种实施方式中，在步骤4中选用醇类或醇类与其他溶剂组成的混合溶剂作为溶剂。醇类对式V铵盐有微溶能力并利于体系分散，对式IX双阴离子铵盐有良好的溶解能力。醚类（甲基叔丁基醚等）、氯代烷烃类（二氯甲烷等）、芳烃类（甲苯等）、酯类（乙酸乙酯等）等溶剂，因其对式V铵盐和式IX双阴离子铵盐的溶解能力都差，在用式VI胺进行胺解的过程中，达不到预期的动力学拆分分离的效果；对于极性非质子溶剂，如N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等，对式V铵盐和式IX双阴离子铵盐的溶解能力都好，在用式VI胺进行胺解的过程中，达不到预期的动力学拆分分离的效果。
在一种实施方式中，在步骤4中选用无水乙醇作为溶剂。
在一种实施方式中，式VII胺为三乙胺。
在一种实施方式中，式VI胺为二异丙胺。
本发明提供了一种5-和6-羧基荧光素类化合物异构体的化学动力学拆分方法。本发明利用5-和6-羧基荧光素类化合物异构体衍生保护基的活性差异，基于化学动力学原理，提出了一种在常规条件下可快速、稳定地拆分异构体的方法，以替代低温长时间冷冻结晶的拆分方案，从而不依赖于特殊设备，更便于操作和提高工艺稳定性。本发明的方法可以实现简便操作、低成本、易于大规模生产的目标。本发明方法可以高效地拆分5-和6-羧基荧光素类化合物异构体，适合于进行平稳的大规模制备。
实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明上述制备方法中所涉及的合成路线如下：
。
本发明详细的5-和6-羧基荧光素类化合物异构体的化学动力学拆分过程如下所示：
。
任选的，所述式I所示化合物包括如下结构：
。
任选的，所述式II所示化合物包括如下结构：
。
任选的，所述式III-a和式III-b所示化合物包括如下结构：
。
任选的，所述式VIII所示化合物包括如下结构：
任选的，所述式IV-a和式IV-b所示化合物包括如下结构：
任选的，所述式VII所示化合物包括如下结构：
。
任选的，所述式V-a和式V-b所示化合物包括如下结构：
。
任选的，所述式VI所示化合物包括如下结构：
。
任选的，所述式IX所示化合物包括如下结构：
。
实施例1 合成式III-a1和式III-b1
室温下，于1500mL甲烷磺酸中，搅拌下加入110.0g 3,6-二氯偏苯三酸酐（式I-1）和151.0g 2,4-二氯间苯二酚（式II-1），得到悬浮液。反应体系逐渐升温，体系溶清得到均一溶液，保温130~190℃反应12小时至反应完毕。降至室温，将反应液倒入3000mL水中进行淬灭，析出产物。过滤，滤饼用水洗涤至弱酸性，充分抽干后，于烘箱中干燥，得到红棕色固体256g（HPLC纯度：6-位异构体（式III-a1）37.5%，5-位异构体（式III-b1）53.2%）。
实施例2 合成式IV-a1和式IV-b1
室温下，于1280mL特戊酸酐（式VIII-1）中，搅拌下加入上一步得到的256g红棕色固体（式III-a1和式III-b1）。反应体系升温，回流反应2小时，反应结束。将反应液降温至60℃，在旋转蒸发仪上脱除未反应的特戊酸酐，得到浓稠的油状物。向油状物中加入3000mL甲基叔丁基醚，溶解油状物，得到均一溶液。用1500mL水洗涤一次，用1500mL饱和氯化铵溶液洗涤一次，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后，过滤，得到2550g滤液，将按照理论收率直接用于下一步合成（按理论产率估算质量浓度为12.4%；HPLC纯度：6-位异构体（式IV-a1）39.7%，5-位异构体（式IV-b1）53.7%）。
实施例3 合成铵盐式V-a1和式V-b1
取上一步得到的含（式IV-a1和式IV-b1）甲基叔丁基醚溶液637.5g（甲基叔丁基醚的体积比约为10V/W），降温至-10℃，搅拌下缓慢滴加10.7g三乙胺（式VII-1，1.0当量），逐渐析出类白色固体。滴加完毕，体系回温至20~30℃，继续搅拌3小时。过滤，滤饼用200mL甲基叔丁基醚洗涤，充分抽干后，晾干，得到76.8g类白色固体粉末。三步总收率85.7%（HPLC纯度：6-位异构体（式V-a1）40.7%，5-位异构体（式V-b1）57.4%）。
实施例4 合成铵盐式V-a1和式V-b1
取上一步得到的含（式IV-a1和式IV-b1）甲基叔丁基醚溶液637.5g，脱除溶剂，得到灰褐色油状物。将750mL二氯甲烷加入到油状物中（二氯甲烷的体积比约为10V/W），溶解得到均一溶液，降温至-10℃，搅拌下缓慢滴加10.7g三乙胺（式VII-1，1.0当量），逐渐析出类白色固体。滴加完毕，体系回温至20~30℃，继续搅拌1小时。过滤，滤饼用200mL二氯甲烷洗涤，充分抽干后，晾干，得到72.2g类白色固体粉末。三步总收率80.6%（HPLC纯度：6-位异构体（式V-a1）40.3%，5-位异构体（式V-b1）57.0%）。
实施例5 合成铵盐式V-a1和式V-b1
取上一步得到的含（式IV-a1和式IV-b1）甲基叔丁基醚溶液637.5g，脱除溶剂，得到灰褐色油状物。将750mL甲苯加入到油状物中（甲苯的体积比约为10V/W），溶解得到均一溶液，降温至-10℃，搅拌下缓慢滴加10.7g三乙胺（式VII-1，1.0当量），逐渐析出类白色固体。滴加完毕，体系回温至20~30℃，继续搅拌5小时。过滤，滤饼用200mL甲苯洗涤，充分抽干后，晾干，得到69.6g类白色固体粉末。三步总收率77.7%（HPLC纯度：6-位异构体（式V-a1）40.2%，5-位异构体（式V-b1）57.3%）。
实施例6 合成铵盐式V-a1和式V-b1
取上一步得到的含（式IV-a1和式IV-b1）甲基叔丁基醚溶液637.5g，脱除溶剂，得到灰褐色油状物。将750mL乙酸乙酯加入到油状物中（乙酸乙酯的体积比约为10V/W），溶解得到均一溶液，降温至-10℃，搅拌下缓慢滴加10.7g三乙胺（式VII-1，1.0当量），逐渐析出类白色固体。滴加完毕，体系回温至20~30℃，继续搅拌3小时。过滤，滤饼用200mL乙酸乙酯洗涤，充分抽干后，晾干，得到71.0g类白色固体粉末。三步总收率79.3%（HPLC纯度：6-位异构体（式V-a1）40.4%，5-位异构体（式V-b1）57.2%）。
综合实施例3、实施例4、实施例5和实施例6中所得数据进行比较分析，甲基叔丁基醚作为成盐溶剂，无论是收率还是产物的纯度都好于其他溶剂，是优选溶剂中的最佳选择；可用做上一步的后处理溶剂，得到的溶液直接用于成盐操作，提高操作效率。
实施例7 动力学拆分式V-a1和式V-b1
将实施例3得到的76.8g类白色固体粉末铵盐（式V-a1和式V-b1），搅拌下，加入到770mL（10V/W）无水乙醇中，得到悬浮溶液。将此悬浮溶液控温在-10~-5℃，滴加130g二异丙胺（式VI-1），滴加完毕，体系颜色逐渐变为暗红色。体系升温至15~25℃，继续保温搅拌，过程中对体系混合物取样过滤，测滤饼的纯度，如果6-位异构体比例＞90%，则开始过滤，用预冷至0~5℃的无水乙醇漂洗滤饼至滤液无色。母液暂存，收集滤饼，干燥，得到拆分后的（式V-a1）粗品31.5g，收率41.0%（HPLC纯度：6-位异构体（式V-a1）94.8%，5-位异构体（式V-b1）3.6%）。
实施例8 动力学拆分式V-a1和式V-b1
将实施例4得到的72.2g类白色固体粉末铵盐（式V-a1和式V-b1），搅拌下，加入到720mL（10V/W）无水甲醇中，得到悬浮溶液。将此悬浮溶液控温在-10~-5℃，滴加122g二异丙胺（式VI-1），滴加完毕，体系颜色逐渐变为暗红色。体系升温至15~25℃，继续保温搅拌，过程中对体系混合物取样过滤，测滤饼的纯度，如果6-位异构体比例＞90%，则开始过滤，用预冷至0~5℃的无水甲醇漂洗滤饼至滤液无色。母液暂存，收集滤饼，干燥，得到拆分后的（式V-a1）粗品20.4g，收率28.3%（HPLC纯度：6-位异构体（式V-a1）95.0%，5-位异构体（式V-b1）3.3%）。
实施例9 动力学拆分式V-a1和式V-b1
将实施例5得到的69.6g类白色固体粉末铵盐（式V-a1和式V-b1），搅拌下，加入到350mL（5V/W）无水甲醇和350mL（5V/W）甲基叔丁基醚的混合溶剂中，得到悬浮溶液。将此悬浮溶液控温在-10~-5℃，滴加118g二异丙胺（式VI-1），滴加完毕，体系颜色逐渐变为暗红色。体系升温至15~25℃，继续保温搅拌，过程中对体系混合物取样过滤，测滤饼的纯度，如果6-位异构体比例＞90%，则开始过滤，用预冷至0~5℃的1:1（V/V）的无水甲醇和甲基叔丁基醚混合溶剂漂洗滤饼至滤液无色。母液暂存，收集滤饼，干燥，得到拆分后的（式V-a1）粗品23.8g，收率34.2%（HPLC纯度：6-位异构体（式V-a1）94.0%，5-位异构体（式V-b1）4.1%）。
实施例10 动力学拆分式V-a1和式V-b1
将实施例6得到的71.0g类白色固体粉末铵盐（式V-a1和式V-b1），搅拌下，加入到710mL（10V/W）异丙醇中，得到悬浮溶液。将此悬浮溶液控温在-10~-5℃，滴加120g二异丙胺（式VI-1），滴加完毕，体系颜色逐渐变为暗红色。体系升温至15~25℃，继续保温搅拌，过程中对体系混合物取样过滤，测滤饼的纯度，如果6-位异构体比例＞90%，则开始过滤，用预冷至0~5℃的异丙醇漂洗滤饼至滤液无色。母液暂存，收集滤饼，干燥，得到拆分后的（式V-a1）粗品29.8g，收率42.0%（HPLC纯度：6-位异构体（式V-a1）91.2%，5-位异构体（式V-b1）6.5%）。
综合实施例7、实施例8、实施例9和实施例10中所得数据进行比较分析，无水乙醇作为动力学拆分的溶剂，从产物的收率和纯度看具有明显优势，可作为优选溶剂体系中的最佳选择。
实施例11 合成式IV-a1
将实施例7、实施例8、实施例9和实施例10得到的（式V-a1）粗品合并，共105.5g，加入1100mL二氯甲烷溶解，得到二氯甲烷悬浮溶液。将此悬浮溶液加入1100mL水，搅拌下，用1mol/L稀盐酸调节pH至3左右，固体全部溶解，室温搅拌0.5小时，静置分层。取有机相，加入600mL水和300mL饱和氯化铵溶液，搅拌0.5小时后，静置分层。取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤饼用200mL二氯甲烷淋洗，收集滤液。滤液脱除溶剂后得到油状物，向油状物中加入1100mL甲基叔丁基醚趁热溶解，得到澄清溶液。将溶液转入室温下，继续搅拌，逐渐析出白色固体。室温搅拌6小时，过滤，烘干，得到白色固体（式IV-a1）79.5g，收率85.6%（HPLC纯度：6-位异构体（式IV-a1）98.6%，5-位异构体（式IV-b1）0.5%；1H NMR（400MHz，CDCl3）：δ8.14（s，1H），δ 6.86（s，2H），δ 1.64（s，18H））。
实施例12 合成式III-b1
将实施例7、实施例8、实施例9和实施例10得到的滤液合并，加入300mL氨水，室温下搅拌反应，至保护基完全脱除。将反应液转入旋转蒸发仪，脱除溶剂，得到红棕色固体。加入1000mL无水乙醇，回流打浆3小时后，室温搅拌5小时，过滤。滤饼用100mL无水乙醇洗涤，充分抽干，得到红棕色固体。将得到的固体溶入2000mL水中，搅拌下缓慢滴加稀酸调节pH至＜1，析出大量白色固体。过滤，滤饼用500mL水洗涤后，充分抽干，再转入烘箱中烘干，得到白色固体（式III-b1）106.5g，收率43.4%（HPLC纯度：6-位异构体（式III-a1）0.6%，5-位异构体（式III-b1）96.7%）。
实施例13 合成式IV-b1
室温下，于600mL特戊酸酐（式VIII-1）中，搅拌下加入实施例12得到的106.5g白色固体（式III-b1）。反应体系升温，回流反应2小时，反应结束。将反应液降温至60℃，在旋转蒸发仪上脱除未反应的特戊酸酐，得到浓稠的油状物。向油状物中加入1500mL甲基叔丁基醚，溶解油状物，得到均一溶液。用800mL水洗涤一次，用800mL饱和氯化铵溶液洗涤一次，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后，过滤，收集滤液。滤液脱除溶剂后得到油状物，向油状物中加入30mL二氯甲烷和600mL甲基叔丁基醚趁热溶解，得到澄清溶液。将溶液转入室温下，继续搅拌，逐渐析出白色固体。室温搅拌16小时，过滤，得到白色固体（式IV-b1）125.3g，收率91.3%（HPLC纯度：6-位异构体（式IV-a1）0.4%，5-位异构体（式IV-b1）98.5%；1H NMR（400MHz，CDCl3）：δ 8.15（s，1H），δ 6.89（s，2H），δ 1.44（s，18H））。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (9)
1.5-和6-羧基荧光素类化合物异构体的化学动力学拆分方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：偏苯三酸酐类底物式I与间苯二酚类底物式II进行傅-克酰基化反应关环生成式III-a和式III-b的荧光素类化合物混合物；
步骤2：用式VIII酸酐对式III-a和式III-b的荧光素类化合物混合物的双羟基进行保护，得到式IV-a和式IV-b的双酰基保护的荧光素类化合物混合物；
步骤3：对式IV-a和式IV-b的双酰基保护的荧光素类化合物混合物，与式VII胺成盐，得到式V-a和式V-b的荧光素类化合物混合物；
步骤4：对式V-a和式V-b的荧光素类化合物混合物，与式VI胺反应，选择性胺解掉双酰基保护的式V-b的5-羧基荧光素铵盐中的一个酰基，其母核形成双阴离子铵盐式IX而溶解于体系中；双酰基保护的6-羧基荧光素铵盐式V-a则在选定条件下悬浮于溶剂中，过滤分离，实现异构体拆分；各个化合物具体结构如下：
；
；
其中X为卤素或氢，R1、R2各自独立的为氢、卤素、芳基、烷氧基；R8为烷基；
式VII胺为可与式IV-a和式IV-b成盐的氨、一级胺、二级胺或三级胺，R3、R4、R5为对应的取代基；
式VI胺为可与式V-b发生胺解反应的氨、一级胺或二级胺，R6、R7为对应的取代基。
2.根据权利要求1所述的化学动力学拆分方法，其特征在于，在步骤4中，过滤分离得到滤饼，再经酸化游离得到式IV-a的双酰基保护的荧光素类化合物。
3.根据权利要求1所述的化学动力学拆分方法，其特征在于，在步骤4中，对于滤液中的式V-b的荧光素类化合物进行氨解至保护基完全脱除，然后酸化得到式III-b的荧光素类化合物，然后与酸酐反应，得到式IV-b的双酰基保护的荧光素类化合物。
4.根据权利要求1所述的化学动力学拆分方法，其特征在于，在步骤3中选用醚类、氯代烷烃类、芳烃类和酯类作为溶剂。
5.根据权利要求4所述的化学动力学拆分方法，其特征在于，在步骤3中选用甲基叔丁基醚作为溶剂。
6.根据权利要求1所述的化学动力学拆分方法，其特征在于，在步骤4中选用醇类或醇类与其他溶剂组成的混合溶剂作为溶剂。
7.根据权利要求6所述的化学动力学拆分方法，其特征在于，在步骤4中选用无水乙醇作为溶剂。
8.根据权利要求1所述的化学动力学拆分方法，其特征在于，式VII胺为三乙胺。
9.根据权利要求1所述的化学动力学拆分方法，其特征在于，式VI胺为二异丙胺。
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Effective date of registration: 20231226 Address after: Building 23, No. 99 Shuhai Road, Songjiang District, Shanghai, 2016 Patentee after: Briggs Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd. Address before: 3078, 1st floor, Building 3, Yard 33, Zique Road, Haidian District, Beijing, 100094 Patentee before: Beijing Bailige Biotechnology Co.,Ltd. |
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Application publication date: 20230822 Assignee: Shanghai Baiweixin Technology Development Co.,Ltd. Assignor: Briggs Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd. Contract record no.: X2024980014332 Denomination of invention: Chemical kinetic separation method for isomers of 5- and 6-carboxyfluorescein compounds Granted publication date: 20230929 License type: Common License Record date: 20240909 |