CN102942553A - 一种6-羧基荧光素的制备方法 - Google Patents

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本发明公开了一种6-羧基荧光素的制备方法，所述的方法包括以下步骤：a、反应步骤；b、结晶步骤；c、水解步骤。本发明与现有技术相比，使用金属催化剂四氯化锡（SnCl4）选择性催化反应，制备6-羧基荧光素，在分离纯化中选择合适的混合溶剂的比例及纯化方法，将所需产物6-羧基荧光素与副产物5-羧基荧光素比例从1:1提高到2.6:1, 分离产率提高到原来的1.9倍 (从32%提高到61%左右)。大大降低了生产成本，减化了提纯过程， 为制备广泛用于荧光标记生物大分子的6-羧基荧光素及其衍生物提供了一种高效实用的新工艺方法，具有很高的应用价值。

Description

一种6-羧基荧光素的制备方法
技术领域
本发明属于6-羧基荧光素的制备方法，具体涉及选择性金属催化制备6-羧基荧光素的制备方法。
背景技术
6-羧基荧光素作为一种广泛使用的荧光染料，其相关衍生物可与蛋白、抗体，多肽，核酸和磷脂等生物大分子结合，广泛应用于生物科学和医药研究，如用于核酸探针，实时PCR 和药物靶标标记技术等。但是，现有制备6-羧基荧光素的方法中，有一个共同的难题，就是在生成6-羧基荧光素的同时，有约等量的5-羧基荧光素生成 (参考文献：Yuichiro Ueno, Guan-Sheng Jiao & Kevin Burgess, Synthesis, 2004 (15), 2591-2593)。由于5-羧基荧光素与6-羧基荧光素互为位置异构体, 性质很相近，当反应产物的组成比例为6-羧基荧光素：5-羧基荧光素近为1:1 时，将使分离6-羧基荧光素与5-羧基荧光素相当困难。即使分离，由于两异构体相互交叉，损失较大，产率较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于一种制备6-羧基荧光素的新工艺方法。
本发明解决技术问题的技术方案为：一种6-羧基荧光素的制备方法，包括以下步骤：
a、反应步骤：
室温下，在反应容器中，将间苯二酚类物质溶于甲基磺酸，再加入偏苯三酸酐，室温搅拌均匀，加入四氯化锡，升温至90-110˚C，保温6-10小时后，将反应体系冷至室温，得到反应溶液；
偏苯三酸酐、间苯二酚类物质、四氯化锡的摩尔比为1：2：0.2-0.22
b、结晶步骤
将反应溶液倒入冰水溶液中，搅拌10-15分钟， 产物沉淀析出，过滤，干燥，再用甲醇和己烷混合溶液（甲醇：己烷的体积比为1: 4）进行重结晶，过滤，干燥，得到6-羧基荧光素甲基磺酸加合物；
c、水解步骤：
将6-羧基荧光素甲基磺酸加合物加入4 M NaOH水溶液中，室温搅拌1-2小时后，得到6-羧基荧光素钠盐；6-羧基荧光素甲基磺酸加合物与NaOH的摩尔比为1: 1.2-1.3；
再将6-羧基荧光素钠盐溶液加入6 N HCl 水溶液中，室温搅拌1-2小时后，产物沉淀析出，干燥至恒重，得到自由酸式6-羧基荧光素， 6-羧基荧光素钠盐与HCl的摩尔比为1：0.5-0.6。
所述的间苯二酚类物质的结构式如下：
Figure BDA0000225622301
在式中，R1、R2 为氢、卤素、烷基。
本发明的反应原理如下：
Figure BDA0000225622302
本发明使用金属催化剂四氯化锡（SnCl4）选择性催化反应，制备6-羧基荧光素，在分离纯化中选择合适的混合溶剂的比例及纯化方法，将所需产物6-羧基荧光素与副产物5-羧基荧光素比例从1:1提高到2.6:1, 分离产率提高到原来的1.9倍 (从32%提高到61%左右)。大大降低了生产成本，减化了提纯过程， 为制备广泛用于荧光标记生物大分子的6-羧基荧光素及其衍生物提供了一种高效实用的新工艺方法，具有很高的应用价值。
具体实施方式
实施例1：
Figure BDA0000225622303
a、反应步骤：
室温下，在反应容器中，将间苯二酚2 (resorcinol, 57.2 g, 0.52 mol) 溶于甲基磺酸(methanesulfonic acid , 520 ml) 中，加入偏苯三酸酐 1 (1,2,4-benzenetricarboxylic anhydride, 50 g, 0.26 mol)， 室温搅拌10分钟后，加入四氯化锡 (SnCl4, 6.1 ml, 0.055 mol)，加热，在90 ˚C下反应，6小时后，HPLC表明反应完全， 停止反应，将反应体系冷至室温，得到反应溶液；
b、结晶步骤
将反应溶液倒入4 升冰水溶液中，搅拌10分钟， 产物沉淀析出。过滤，干燥，干燥后的粗产物用甲醇和己烷（甲醇：己烷 体积比为1: 4）进行结晶。过滤，干燥， 得6-羧基荧光素甲基磺酸加合物。
c、水解步骤：
将6-羧基荧光素甲基磺酸加合物加入4 M NaOH水溶液80毫升，在室温处搅拌1小时后，得到6-羧基荧光素钠盐。
将6-羧基荧光素的钠盐溶液加入6 N HCl 水溶液22毫升，在室温搅拌1小时后，产物沉淀析出，干燥至恒重，得到自由酸式6-羧基荧光素(简称6-羧基荧光素或6-FAM), 59.1 克，HPLC 纯度为98%,产率为61%。
6-羧基荧光素的结构通过UV; 1H NMR; LC-MS (M–) 来证实。
6-羧基荧光素: λex = 492 nm; λem = 517 nm in 0.1 M Tris pH 8.0. 紫外吸收. λmax = 492 nm in 0.1 N NaOH; 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) –, 计算值 C21H11O7, 375.32; 实测值 375.2.
实施例2：
a、反应步骤：
室温下，在反应容器中，将4-氯间苯二酚3 (4-Chlororesorcinol, 75.2 g, 0.52 mol) 溶于甲基磺酸(methanesulfonic acid , 620 ml) 中，加入偏苯三酸酐 1 (1,2,4-benzenetricarboxylic anhydride, 50 g, 0.26 mol)， 室温搅拌15分钟后，加入四氯化锡 (SnCl4, 6.7 ml, 0.057 mol)，加热，在105 ˚C下反应，6小时后，HPLC表明反应完全， 停止反应，将反应体系冷至室温，得到反应溶液；
b、结晶步骤
将反应溶液倒入4 升冰水溶液中，搅拌10分钟， 产物沉淀析出。过滤，干燥，干燥后的粗产物用甲醇和己烷（甲醇：己烷 体积比为1: 4）进行结晶。过滤，干燥， 得2’,7’-二氯-6-羧基荧光素甲基磺酸加合物。
c、水解步骤：
将6-羧基荧光素甲基磺酸加合物加入4 M NaOH水溶液84毫升，在室温处搅拌2小时后，得到2’,7’-二氯-6-羧基荧光素钠盐。
将2’,7’-二氯-6-羧基荧光素钠盐溶液加入6 N HCl 水溶液26毫升，在室温搅拌1小时后，产物沉淀析出，干燥至恒重，得到自由酸式2’,7’-二氯-6-羧基荧光素, 71.6克，HPLC 纯度为97%,产率为60%。
6-羧基荧光素的结构通过UV; 1H NMR; LC-MS (M–) 来证实。
6-羧基荧光素: λex = 498 nm; λem = 521 nm in 0.1 M Tris pH 8.0. 紫外吸收. λmax = 498 nm in 0.1 N NaOH; 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) –, 计算值 C21H9Cl 2O7, 444.21; 实测值 444.2.
实施例3：
Figure BDA0000225622305
a、反应步骤：
室温下，在反应容器中，将4-甲基间苯二酚4 (4-methylresorcinol, 64.6 g, 0.52 mol) 溶于甲基磺酸 (methanesulfonic acid , 600 ml) 中，加入偏苯三酸酐 1 (1,2,4-benzenetricarboxylic anhydride, 50 g, 0.26 mol)， 室温搅拌10分钟后，加入四氯化锡 (SnCl4, 5.8 ml, 0.052 mol)，加热，在95 ˚C下反应，6小时后，HPLC表明反应完全， 停止反应，将反应体系冷至室温，得到反应溶液；
b、结晶步骤
将反应溶液倒入4 升冰水溶液中，搅拌10分钟， 产物沉淀析出。过滤，干燥，干燥后的粗产物用甲醇和己烷（甲醇：己烷 体积比为1: 4）进行结晶。过滤，干燥， 得2’,7’-二甲基-6-羧基荧光素甲基磺酸加合物。
c、水解步骤：
将2’,7’-二甲基-6-羧基荧光素甲基磺酸加合物加入4 M NaOH水溶液80毫升，在室温处搅拌1小时后，得到2’,7’-二甲基-6-羧基荧光素钠盐。
将6-羧基荧光素的钠盐溶液加入6 N HCl 水溶液22毫升，在室温搅拌1小时后，产物沉淀析出，干燥至恒重，得到自由酸式2’,7’-二甲基-6-羧基荧光素, 66.5克，HPLC 纯度为98%,产率为62%。
2’,7’-二甲基-6-羧基荧光素的结构通过UV; 1H NMR; LC-MS (M–) 来证实。
2’,7’-二甲基-6-羧基荧光素: λex = 502 nm; λem = 527 nm in 0.1 M Tris pH 8.0. 紫外吸收. λmax = 502 nm in 0.1 N NaOH; 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) (ppm) 8.3 (s, 1 H), 8.26 (d, 1 H), 8.21 (d, 1H), 7.5 (2 H), 6.3(2H), 2.2 (s, 6H); LC-MS: m/z for (M-H) –, 计算值 C23H15O7, 403.37; 实测值 403.3。

Claims (4)

1.一种6-羧基荧光素的制备方法，包括以下步骤：a、反应步骤；b、结晶步骤；c、水解步骤。
2.根据权利要求1一种6-羧基荧光素的制备方法，其特征在于：
所述的a、反应步骤：
室温下，在反应容器中，将间苯二酚类物质溶于甲基磺酸，再加入偏苯三酸酐，室温搅拌均匀，加入四氯化锡，升温至90-110˚C，保温6-10小时后，将反应体系冷至室温，得到反应溶液；
偏苯三酸酐、间苯二酚类物质、四氯化锡的摩尔比为1：2：0.2-0.22。
2、根据权利要求1一种6-羧基荧光素的制备方法，其特征在于：
所述的b、结晶步骤：
将反应溶液倒入冰水溶液中，搅拌10-15分钟， 产物沉淀析出，过滤，干燥，再用甲醇和己烷混合溶液（甲醇：己烷的体积比为1: 4）进行重结晶，过滤，干燥，得到6-羧基荧光素甲基磺酸加合物。
3.根据权利要求1一种6-羧基荧光素的制备方法，其特征在于：
所述的c、水解步骤：
将6-羧基荧光素甲基磺酸加合物加入4 M NaOH水溶液中，室温搅拌1-2小时后，得到6-羧基荧光素钠盐；6-羧基荧光素甲基磺酸加合物与NaOH的摩尔比为1: 1.2-1.3；
再将6-羧基荧光素钠盐溶液加入6 N HCl 水溶液中，室温搅拌1-2小时后，产物沉淀析出，干燥至恒重，得到自由酸式6-羧基荧光素，6-羧基荧光素钠盐与HCl的摩尔比为1：0.5-0.6。
4.根据权利要求1一种6-羧基荧光素的制备方法，其特征在于：
所述的所述的间苯二酚类物质的结构式如下：
Figure FDA0000225622291
在式中，R1、R2 为氢、卤素、烷基。
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