CN108219513A - 一种羧基荧光素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羧基荧光素的制备方法。将偏苯三甲酸酐和间苯二酚于甲烷磺酸中混合，进行回流反应，反应结束后，将反应液加入3‑5℃的水中搅拌，过滤得到沉淀，将沉淀溶于氢氧化钠水溶液中，滴加硫酸的水溶液直至沉淀不产生为止，过滤干燥得到5（6）‑羧基荧光素，将得到的5（6）‑羧基荧光素和新戊酰氯混合于无水二氯甲烷中，室温搅拌后用盐酸水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，直接在滤液中加入二环己基碳二亚胺以及N‑羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌后用水洗涤，直接对有机层减压蒸发除去溶剂，然后用硅胶柱层析分离产物，用甲苯和乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂，分别得到新戊酰‑5‑羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰‑6‑羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。
Description
技术领域
本发明涉及化学品的制备方法，具体地说，是一种羧基荧光素的制备方法。
背景技术
羧基荧光素及其衍生物是检测蛋白质DNA序列的重要的荧光染料，寻找和发现羧基荧光素及其衍生物的合成路线是科研人员一直努力的方向。作为一种荧光染料，可与蛋白质、核酸生物大分子结合，广泛应用于生物学研究，如核酸探针等。
本发明提供了一种羧基荧光素的制备方法，在本发明的研究过程中经过大量的实验探索，采用了偏苯三甲酸酐、间苯二酚和甲烷磺酸，首先制备得到了5（6）- 羧基荧光素。在制备过程中，我们令人惊奇的发现，将偏苯三甲酸酐、间苯二酚和甲烷磺酸的反应液先用氢氧化钠溶液处理后再用硫酸溶液中和后得到了高纯度的5（6）- 羧基荧光素，操作过程简单、产物容易分离。在制备得到5（6）- 羧基荧光素后，本发明的研究人员直接将5（6）- 羧基荧光素和新戊酰氯在二氯甲烷混合反应后，经过处理不需要蒸发掉溶剂，直接在溶剂二氯甲烷中和二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺反应得到含有少量水分的混合体系，根据二氯甲烷的特性，不经脱水直接减压蒸发除掉溶剂得到混合物，然后采用硅胶柱层析分离产物，用甲苯和乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂，分别得到了新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，整个过程一气呵成，没有进行分离，直接连续处理后得到了两个目标产物。
在整个发明过程中，为了找到可以同时制备新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯的方法，利用我们丰富的专业基本功，结合数百次的实验，创新性的完成了本发明，在5（6）- 羧基荧光素的制备过程中，反应结束后采用优选的氢氧化钠的溶液将开始得到的沉淀溶解，然后用硫酸水溶液重新中和至出现沉淀，对反应过程中携带的杂质进行了有效清除，提高了5（6）- 羧基荧光素的纯度，为后续反应打下了基础。在制备新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯的过程中，采用制备的5（6）- 羧基荧光素和新新戊酰氯在二氯甲烷混合反应后经过连续优选的实验处理过程，没有分离，采用负压蒸发后直接得到了新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯和混合物，在负压蒸发之前，并没有采用无水硫酸钠对溶液体系进行干燥，由于二氯甲烷的特点，如果在减压蒸发之前的溶液中含有少量水分，在负压蒸发时残余的水分和二氯甲烷有共沸，可以将少量水分共沸带出，减少了操作步骤，操作过程明显简化，提高了产出效率。对得到的新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯混合物，采用优选的洗脱剂甲苯和乙酸乙酯的混合溶剂进行了洗脱，分别得到了高收率的新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。
发明内容
本发明的目的是提供一种羧基荧光素的制备方法，本方法在制备得到5（6）- 羧基荧光素后，直接在二氯甲烷溶液中和新戊酰氯反应，不经分离出产物，直接加入二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺，得到的产物经过优化的甲苯和乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行柱层析分离后得到目标产物，该方法路线简单，操作方便，为同时制备戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯提供了打下了良好的基础。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
将偏苯三甲酸酐和间苯二酚于甲烷磺酸中混合，进行回流反应，反应结束后，将反应液加入3-5℃的水中搅拌，过滤得到沉淀，将沉淀溶于一定浓度的碱溶液中，滴加一定浓度的酸直至沉淀不产生为止，过滤干燥得到5（6）- 羧基荧光素，将得到的5（6）- 羧基荧光素和新戊酰氯混合于溶剂中，室温搅拌后用盐酸水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，直接在滤液中加入二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌后用水洗涤，对有机层减压蒸发除去溶剂，然后用硅胶柱层析分离产物，用选定的洗脱剂进行洗脱，分别得到新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。
所述的一定浓度的碱为4mol/L的氢氧化钠水溶液。
所述的一定浓度的酸为49%的硫酸水溶液。
所述的洗脱剂为甲苯和乙酸乙酯的混合溶剂。
本发明所述的一种羧基荧光素的制备方法，更具体地，包含以下步骤：
将偏苯三甲酸酐和间苯二酚于甲烷磺酸中混合，进行回流反应，反应结束后，将反应液加入3-5℃的水中搅拌，过滤得到沉淀，将沉淀溶于4mol/L的氢氧化钠水溶液中，滴加49%的硫酸水溶液直至沉淀不产生为止，过滤干燥得到5（6）- 羧基荧光素，将得到的5（6）- 羧基荧光素和新戊酰氯混合于无水二氯甲烷中，室温搅拌后用盐酸水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，直接在滤液中加入二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌后用水洗涤，直接对有机层减压蒸发除去溶剂，然后用硅胶柱层析分离产物，用甲苯和乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂，分别得到新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。
具体实施方式
下面是本发明的实施例，所述的实施例只是用来说明本发明，而不应当被视为是对本发明的限制。
实施例1
将5.8g偏苯三甲酸酐6.5g和间苯二酚于20ml甲烷磺酸中混合，进行回流反应12小时，反应结束后，将反应液加入到100ml3-5℃的水中搅拌，过滤得到沉淀，将沉淀溶于4mol/L的20ml氢氧化钠水溶液中，滴加49%的硫酸水溶液直至沉淀不产生为止，过滤干燥得到13.5g5（6）- 羧基荧光素，将得到的5（6）- 羧基荧光素和24ml新戊酰氯混合于200ml无水二氯甲烷中，室温搅拌后用300ml盐酸水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，直接在滤液中加入15.0g二环己基碳二亚胺以及8.8gN-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌后用水洗涤，直接对有机层减压蒸发除去溶剂，然后用硅胶柱层析分离产物，用甲苯和乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂，分别得到2.7g新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与2.7g新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。
实施例2
将58g偏苯三甲酸酐65g和间苯二酚于200ml甲烷磺酸中混合，进行回流反应12小时，反应结束后，将反应液加入到1L3-5℃的水中搅拌，过滤得到沉淀，将沉淀溶于4mol/L的200ml氢氧化钠水溶液中，滴加49%的硫酸水溶液直至沉淀不产生为止，过滤干燥得到140g 5（6）-羧基荧光素，将得到的5（6）- 羧基荧光素和24ml新戊酰氯混合于500ml无水二氯甲烷中，室温搅拌后用700ml盐酸水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，直接在滤液中加入153g二环己基碳二亚胺以及90gN-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌后用水洗涤，直接对有机层减压蒸发除去溶剂，然后用硅胶柱层析分离产物，用甲苯和乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂，分别得到28g新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与28g新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。
以上对本发明所提供的一种羧基荧光素的制备方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (5)
1.一种羧基荧光素的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：将偏苯三甲酸酐和间苯二酚于甲烷磺酸中混合，进行回流反应，反应结束后，将反应液加入3-5℃的水中搅拌，过滤得到沉淀，将沉淀溶于一定浓度的碱溶液中，滴加一定浓度的酸直至沉淀不产生为止，过滤干燥得到5（6）- 羧基荧光素，将得到的5（6）- 羧基荧光素和新戊酰氯混合于溶剂中，室温搅拌后用盐酸水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，直接在滤液中加入二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌后用水洗涤，直接对有机层减压蒸发除去溶剂，然后用硅胶柱层析分离产物，用选定的洗脱剂进行洗脱，分别得到新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。
2.如权利要求1所述的一种羧基荧光素的制备方法，其特征在于，所述的一定浓度的碱为4mol/L的氢氧化钠水溶液。
3.如权利要求1所述的一种羧基荧光素的制备方法，其特征在于，所述的一定浓度的酸为49%的硫酸水溶液。
4.如权利要求1所述的一种羧基荧光素的制备方法，其特征在于，所述的洗脱剂为甲苯和乙酸乙酯的混合溶剂。
5.如权利要求1所述的一种羧基荧光素的制备方法，包含以下步骤：
将偏苯三甲酸酐和间苯二酚于甲烷磺酸中混合，进行回流反应，反应结束后，将反应液加入3-5℃的水中搅拌，过滤得到沉淀，将沉淀溶于4mol/L的氢氧化钠水溶液中，滴加49%的硫酸水溶液直至沉淀不产生为止，过滤干燥得到5（6）- 羧基荧光素，将得到的5（6）- 羧基荧光素和新戊酰氯混合于无水二氯甲烷中，室温搅拌后用盐酸水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，直接在滤液中加入二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌后用水洗涤，直接对有机层减压蒸发除去溶剂，然后用硅胶柱层析分离产物，用甲苯和乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂，分别得到新戊酰-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯与新戊酰-6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。
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