JPH0692955A - 水溶性のクマリン誘導体、その製造方法および酵素基質としてまたは酵素基質の製造のための使用 - Google Patents

水溶性のクマリン誘導体、その製造方法および酵素基質としてまたは酵素基質の製造のための使用

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JPH0692955A
JPH0692955A JP4182797A JP18279792A JPH0692955A JP H0692955 A JPH0692955 A JP H0692955A JP 4182797 A JP4182797 A JP 4182797A JP 18279792 A JP18279792 A JP 18279792A JP H0692955 A JPH0692955 A JP H0692955A
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    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/20—Coumarin derivatives

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 水溶性のクマリン誘導体の提供。 【構成】 一般式（Ｉ）に相当するクマリン誘導体，β
−ケトンエステルを出発原料とする該クマリン誘導体の
製造方法ならびに出発原料となるβ−ケトンエステル
類，および，酵素の調剤過程における酵素基質として一
般式（Ｉ）のクマリン誘導体を使用すること。 〔式中，Ｒ１は−｛ＯＣＨ（Ｒ８）ＣＨ２｝ＯＣＨ２Ｒ
７を表わし；Ｒ２〜Ｒ６はＨ、ハロゲン等であるが，特
にＲ４は酵素基質の合成を目的に適切な基を当該クマリ
ン誘導体に導入することを可能とする連結基，たとえば
−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＣＨ（Ｃ
Ｈ３）２，であることが望ましい。こゝにＲ７はＯＨ，
ＮＨ２，ＣＯＯＨ等の置換基，Ｒ８はＨまたはＣＨ３で
ある〕

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な水溶性のクマリン
誘導体および親水性基を有する新規なβ−ケトン誘導体
から出発するその製造方法を対象とする。
【０００２】クマリンは極めて広範な用途を示す重要な
分子の一族である。実際に、クマリンは凝固阻止剤とし
て作用することができる薬物学の分野の外に、その光学
的特性（蛍光および化学発光）のために非常に有用であ
る。例えば、 −レーザー用の着色剤、 −光学用途の蛍光剤、 −診断薬の調剤に利用される酵素基質の合成用製品、お
よび −同様に診断薬の分野において利用される生物学的分子
の標識。
【０００３】
【従来の技術】ところが、これらの広範な用途のため
に、クマリンは水または親水性溶媒（例えば、アルコー
ル）およびまた混合溶媒（水−有機溶媒混合物）に並以
下のまたは悪い溶解度を有する不便さを有するので、そ
れはクマリンの性能およびその使用の可能性を減じる。
酵素基質の製造の場合には、ａ）染料または蛍光剤と、
ｂ）生化学的分子（例えば、アミノ酸、ペプチド、糖ま
たはリン酸）の間の化学的組合せを行うことが最も多
い。かくして形成された基質は次のような特性を示さな
ければならない。
【０００４】１） ａ）の着色または蛍光の特徴は基質
において無効になるかまたは極端に減退されなければな
らない。 ２） 基質は開裂を受けるため特定の酵素と反応するこ
とができなければならない ３） 開裂は着色剤または蛍光剤を再生させ、かくして
色または蛍光を回復させなければならない ４） この回復は、それらの基質が酵素の調剤に役立つ
ことができるため、使用される酵素の量に比例しなけれ
ばならない。
【０００５】既知のクマリン誘導体の中で、酵素基質の
製造のため現在までに利用されたものは、７−アミノ−
４−メチルクマリン、７−アミノ−クマリン−４−メタ
ンスルホン酸および７−アミノ−４−トリフルオロメチ
ルクマリンであり、それらはＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂ
ｕｌｌ．Ｖｏｌ．２５，１９７７，ｐ．３６２−３６
３、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．Ｖｏ１．３６，
１９８８，ｐ．３４９６−３５０２および国際特許出願
第８０／０２２９５号に記載されている。
【０００６】ロイシンと組合わされて、７−アミノ−４
−メチルクマリンは、例えば、Ｌ−ロイシンアミノペプ
チダーゼのための基質として利用されることかできる。
このクマリンは、例えばβ−ナフチルアミンのような基
質として慣習的に使用されているアミンよりも約１４倍
も高い最大蛍光強度で非常な蛍光を放つので、非常に興
味深いものである。他方では、アミノクマリンとアミド
に相当する基質との間には蛍光強度の重要な差がある。
【０００７】しかしながら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂ
ｕｌｌ．Ｖｏｌ．３６，ｐ，３４９６−３５０２（１９
８８）に示されているように、このアミノクマリンの水
への溶解度があまりに少ないので、このアミノクマリン
と共に水と有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）
の混合物を使用しなければならない。これは、エンセフ
ァリナーゼのような多数の酵素が有機溶媒に敏感である
ので、不都合である。そのうえ、有機溶媒の存在は調剤
の過程を複雑にする。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】さらに、このクマリン
の水への溶解度を改良するために、４の位置のメチル基
は、より親水性の高いスルホンメタン基により置換され
た。しかしながら、この後者のアミノクマリンはかなり
複雑である。そのうえ、それは多くの酵素のために不都
合である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明はまさしく新規な
水溶性のクマリン誘導体を対象とするものであり、この
誘導体はクマリン核の４の位置にポリエーテル鎖の存在
のおかげで改良された水への溶解度を与えて前記の不都
合を緩和し、だからといって蛍光と着色の特性を改変す
ることはない。
【００１０】それらのクマリン誘導体は次の式に相当す
る。
【化９】 式中、 １） Ｒ１は式 −（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＣＨ２Ｒ７、または −（ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）ｍＯＣＨ２Ｒ７、 に相当する基を表わし、上式中のｍは１〜３０の整数で
あり、そしてＲ７ −水素原子 −ハロゲン原子
【化１０】 −アルキル、アルコキシまたはアリール基で、ハロゲン
原子、フェニル基、ＣＦ３、ＯＨ、ＯＲ８、ＳＨ、ＳＲ
８、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ９、ＮＨ２、ＮＨＲ８、ＮＲ８
Ｒ１０、ＳＯ３ＨおよびＳＯ３Ｒ９の中から選ばれた少
なくとも１つの置換基により置換された（前式中Ｒ８は
アルキルまたはアリール基であり、Ｒ９はアルキルまた
はアリール基、ＮＨ４またはＭ１／ｖ（（Ｍは原子価ｖ
の金属である））であり、そしてＲ１０はアルキルまた
はアリール基、あるいはＲ８とＲ１０は一緒に飽和また
は不飽和の、場合によりＯ ，ＳおよびＮの中から選ば
れたヘテロ原子を含む、炭化水素の環を形成することが
できる）または置換されない基を表わす、
【００１１】２） Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同
一または異なることができ、次の基 −水素原子 −ハロゲン原子、 −ＮＨ２、 −ＮＨＲ８、 −ＮＲ８Ｒ１０、 −ＮＨＲ１１、 −ＮＲ８Ｒ１１、 −ＳＨ −ＳＲ８ −ＳＲ１１ −ＯＨ −ＯＲ８ −ＯＲ１１ （上式中、Ｒ８とＲ１０は前記の意味を有し、そしてＲ
１１は、保護されたまたは保護されないアミノ酸、保護
されたまたは保護されないペプチド、カルボン酸および
脂肪酸の中から選ばれた化合物より誘導されたアシル
基、ＰＯ３Ｒ２基（（Ｒは水素原子またはアルキルであ
る））または糖誘導体を表わす）、または−アルキルま
たはアルコキシ基で、ハロゲン原子、ＯＨ、ＯＲ８、Ｓ
Ｈ、ＳＲ８、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ９、ＮＨ２、ＮＨ
Ｒ８、ＮＲ８Ｒ１０、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３Ｒ９、Ｓ
Ｒ１１、ＯＲ１１、ＣＦ３、ＮＨＲ１１およびＮＲ８Ｒ
１１（Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は前記の意味を
有する）の中から選ばれた少なくとも１つの置換基によ
り置換されたまたは置換されない基、を表わす。または
【００１２】３） Ｒ２とＲ３、Ｒ３とＲ４またはＲ４
とＲ５は一緒に５〜８の炭素原子からなる飽和または不
飽和の環状核を形成するか、またはＮ、ＯおよびＳの中
から選ばれたヘテロ原子の少なくとも１つを含むヘテロ
環核を形成する。あるいは
【００１３】４） Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それらが
つながれているフェニル核と一緒に多環核を、場合によ
りＮ、ＯおよびＳの中から選ばれた１つまたは複数のヘ
テロ原子を含む縮合された３つの環に形成する。または
【００１４】５） Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それらが
つながれているフェニル核と多環核を、場合によりＮ、
ＯおよびＳの中から選ばれた１つまたは複数のヘテロ原
子を含む縮合された３つの環に形成する。および
【００１５】６） Ｒ６は、 −水素原子、 −ハロゲン原子、 −ＣＯＯＨ、 −ＣＯＯＲ９（Ｒ９は前記の意味を有する）、 −アルキル基で、ハロゲン原子、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯ
Ｈ、ＣＯＯＲ９、ＯＲ８、ＳＲ８、ＳＯ３ＨおよびＳＯ
３Ｒ９（Ｒ８とＲ９は前記の意味を有する）の中から選
ばれた少なくとも１つの置換基により置換されたまたは
置換されない基を表わす。
【００１６】上記の式において、アルキルまたはアルコ
キシ基は一般に１〜１０の炭素原子、好ましくは１〜５
の炭素原子を有する線状または枝分れの基を意味する。
用語アリール基はベンゼン、ナフタレンのような芳香族
炭化水素から誘導された基を意味する。そのような基の
例として、フェニル基、ナフチル基をあげることができ
る。用語炭化水素環は３〜１０の炭素原子を有する飽和
または不飽和の環式炭化水素を意味する。それらが１つ
または複数のヘテロ原子を含む場合には、例えば、ピペ
リジン、ピリジン、ピペラジン、ピロール、フラン、ピ
ラン、モルホリンが主要なものとなり得る。Ｒ１１のた
めに利用されるアミノ酸は天然のアミノ酸、特に酵素の
ための基質を作るために役立つもの、であることができ
る。これらの酸は、遊離のアミン官能基のところで（例
えば、カルボベンゾキシ、フルオレニルメトキシカルボ
ニル、ｔ−ブトキシ−カルボニルなどの基により）保護
されることができる。
【００１７】使用されるペプチドは複数のアミノ酸、特
に天然のアミノ酸から形成されたものである。これらの
ペプチドにおいて、右旋性のまたは合成のアミノ酸が連
鎖の中に組み込まれることができる。それらのペプチド
はそのうえ遊離にとどまっているアミン官能基のところ
で（例えば、カルボベンゾキシ、フルオレニルメトキシ
カルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、スクシニルなど
の基により）改変されることができる。
【００１８】Ｒ１１のために使用される糖類は、グルコ
ース、アンノース、ガラクトースのよような単糖類であ
ることができる。もしＲ１１がカルボベンゾキシアルキ
ニル基であるならば、トリプシンの基質が得られる。も
しＲ１１がピログルタミル基であるならば、ピログルタ
ミルアミノペプチダーゼの基質が得られる。もしＲ１１
がγ−グルタミル基であるならば、７−グルタミルトラ
ンスフェラーゼの基質を得る。
【００１９】Ｒ２とＲ３、Ｒ３とＲ４またはＲ４とＲ５
が環を作る場合には、前述の炭化水素環およびヘテロ環
が主要となり得る。Ｒ２、Ｒ３およびＲ４またはＲ３、
Ｒ４およびＲ５がフェニル核と共に、場合により１つま
たは複数のヘテロ原子を含む多環核を形成する場合に
は、例えば次の核が問題になり得る。
【化１１】
【００２０】Ｒ９を表わす金属Ｍは、例えば、ナトリウ
ムのようなアルカリ金属であることができる
【００２１】前記の式（Ｉ）において、ポリエーテル鎖
を含む基Ｒ１の存在はクマリン誘導体に水溶性を与える
ことを可能にするが、他方少なくとも１つの置換基
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５の存在は前記誘導体に、そ
の他の特性、例えば、クマリンの蛍光および化学発光の
特性を強化するとか、酵素の基質を構成するとか、ある
いは酵素の調剤のために使用し得る酵素基質の合成を可
能にするなどの特性を与えることができる。
【００２２】さらに、本発明の第１の実施態様によれ
ば、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはＮ
Ｈ２、ＮＨＲ８、ＮＨＲ１１、ＮＲ８Ｒ１１、ＳＨ、Ｏ
Ｈ、ＳＲ１１またはＯＲ１１（Ｒ８およびＲ１１は前記
の意味を有する）を表わす。
【００２３】本発明のこの第１の態様において、好まし
くは、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のただ１つがＮ
Ｈ２、ＮＨＲ８、ＮＨＲ１１、ＮＲ８Ｒ１１、ＳＨ、Ｏ
Ｈ、ＳＲ１１またはＯＲ１１を表わす。その場合に、そ
の他は一般に水素原子を表わす。また好ましくは、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ５は水素原子を表わしかつＲ４は前
記の置換基の１つを表わす。
【００２４】この第１の実施態様は特に、酵素の調剤の
ための酵素基質として、または酵素基質の製造のための
中間体としてクマリン誘導体の使用に適する。
【００２５】実際に、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５がＮ
Ｈ２、ＮＨＲ８、ＮＨＲ１１、ＳＨ、およびＯＨの中か
ら選ばれた基、例えばＮＨ２またはＯＨを表わす場合に
は、クマリン誘導体を、酵素基質の実現のために適当な
化合物に、その化合物と前記の置換基との反応により容
易に結合させることができる。これらの誘導体には非常
に有利な中間生成物を構成する。なぜならば、ただ１種
の誘導体から出発して、その生成物を適当な化合物と反
応させることにより非常に広い種類の酵素基質を実現さ
せることができるからである
【００２６】Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５がＮＨ
Ｒ１１、ＮＲ８Ｒ１１、ＳＲ１１またはＯＲ１１を表わ
す場合には、Ｒ１１はクマリン誘導体に酵素基質となる
特性を与えるように選ばれる。
【００２７】そのような基質の例として、式（１）にお
いてＲ４がＮＨＲ１１を表わしかつＲ１１が次式、 （ＣＨ３）２ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）− のＬ−ロイシンより誘導された基であるクマリンの誘導
体をあげることができ、そしてこれはＬ−ロイシンアミ
ノペプチダーゼの基質となる。
【００２８】その他の基質の例として、式（１）におい
てＲ４がＮＨＲ１１を表わしかつＲ１１は次式の基の中
から選ばれるクマリンの誘導体をあげることができる。
【化１２】
【００２９】基質の製造、場合によりポリペプチド基質
の製造のための中間体として使用できるクマリン誘導体
の例として、式（Ｉ）においてＲ４がＮＨ２、ＯＨまた
は次式の基の中から選ばれる基を表わす式（Ｉ）のクマ
リン誘導体をあげることができる。
【化１３】
【００３０】一般に、本発明の第１の実施態様において
Ｒ６は水素を表わすが、しかしそれはまた水溶性および
蛍光の改良を可能ならしめる置換基を表わすこともでき
よう。
【００３１】本発明の第２の実施態様によれば、それは
特に蛍光性製品または着色剤として使用されるクマリン
誘導体を目的とするが、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の
少なくとも１つはＮＨ２、ＮＨＲ８、ＮＲ８Ｒ１０、Ｏ
Ｈ、ＯＲ８、ＳＨ、ＳＲ８または置換されたまたはされ
ないアルキル基を表わすが、それはクマリンの蛍光また
は着色の特性、または水溶性を強化するためである。こ
の第２の実施態様のある変形において、Ｒ２、Ｒ３およ
びＲ４またはＲ３、Ｒ４およびＲ５は、それらが結合す
るフェニル核と共に、縮合された３つの環および窒素原
子を含む多環核を形成し、それはまた蛍光性または着色
性を強化することを可能にする。本発明の前記２つの実
施態様において、Ｒ１は好ましくは−（ＯＣＨ２Ｃ
Ｈ２）ｍＯＣＨ２Ｒ７を表わす。例として、Ｒ７は水素
原子、ＣＯＯＲ９またはＣＯＯＨを表わすことができ
る。
【００３２】本発明のクマリン誘導体は、親水性基Ｒ１
を含む新規なβ−ケトンエステルから出発して、Ｐｅｃ
ｈｍａｎの反応を用いる古典的な方法により製造される
ことができる。
【００３３】また、本発明は同様に一般式 Ｒ１−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ６）−ＣＯＯＲ１２ （ＩＩ） （式中、Ｒ１とＲ６は前記の意味を有し、そしてＲ１２
はアルキル基、アリール基またはシクロアルキル基を表
わす）に相当する新規なβ−ケトンエステルを対象とす
る。好ましくは、Ｒ６は水素原子である
【００３４】Ｒ１２を表わすアルキル基またはアリール
基は、先に式（Ｉ）に関連して述べられたものと同じ種
類のものであることができる。シクロアルキル基は一般
に５〜７の炭素原子を有する 好ましくは、Ｒ１２のために１〜４の炭素原子を有する
アルキル基、例えばメチル基またはエチル基が使用され
る。それらのβ−ケトンエステルは式Ｒ１−ＣＨ２−Ｃ
ＯＯＨの酸から出発して古典的な方法により製造される
ことができる。
【００３５】これらのβ−ケトンエステルの製造方法
は、例えば次の段階を含む。 １） 式Ｒ１−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ１は前記に
おいて与えられた意味を有する）の酸を該酸のイミダゾ
リドまたはクロリドに変換する。
【００３６】２） 該酸のイミダゾリドまたはクロリド
を式、
【化１４】 の環式エステルと反応させてアシル化誘導体を形成す
る。および
【００３７】３） 該アシル化誘導体を式Ｒ１２ＯＨの
アルコールと反応させて式（ＩＩ）のβ−ケトンエステ
ルを得る。
【００３８】出発原料の酸Ｒ１−ＣＨ２−ＣＯＯＨは市
販製品であるかまたは古典的な方法により製造できるも
のである。
【００３９】式（ＩＩＩ）のエステルは市販されている
（メルドラム酸）かまたはメルドラム酸あるいはマロン
酸ジエチルから出発してまたはマロン酸のＣＨ２に連続
する二度の置換を実施して古典的方法により製造するこ
とができる。
【００４０】本発明の式（Ｉ）のクマリン誘導体を製造
するため、前記の式（ＩＩ）のβ−ケトンエステルを次
式のフエノール
【化１５】 （式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は前記の意味を有
する）と反応させる。
【００４１】この縮合反応（Ｐｅｃｈｍａｎｎの反応）
はエタノール中で酸、例えばＨ２ＳＯ４、ＨＣｌ、ＣＦ
３ＣＯＯＨまたはそれらの塩、例えば塩化アルミニウ
ム、塩化亜鉛、塩化スズ、の存在で行われることができ
る。
【００４２】Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５の１つがＮＨＲ
１１、ＮＲ８Ｒ１１、ＳＲ１１またはＯＲ１１の型の置
換基である場合には、一般にまずその置換基がＮＨ２、
ＮＨＲ８、ＳＨまたはＯＨであるクマリン誘導体を製造
し、そしてＲ１１を提供することのできる化合物との反
応により望みの置換基にそれを変換することが特に好ま
れる。
【００４３】かくして、Ｒ１１がアミノ酸から誘導され
た基である場合には、そのアミノ酸（一般にそのアミン
官能基を保護されている）または脂肪酸を、ＮＨ２また
はＮＨＲ８、ＳＨまたはＯＨの置換基を含むクマリン誘
導体と反応させて、ペプチド型またはエステル型の結合
を形成させることができる。その反応のために使用され
るフェノール類は古典的方法により製造されることがで
きるかまたは市販されている。
【００４４】前記の式（ＩＩ）のケトンエステルの利用
は興味深い。なぜならば、それはある種の酵素により開
裂されることのできる不安定な基（例えば、ＣＯ−ＮＨ
型の）の仲介なしに直接クマリン核にポリエーテル型の
連鎖を含むことを可能にするからである。
【００４５】前記に見られたように、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４
およびＲ５の１つの上にＲ１１を含む本発明の第１の実
施態様に対応するクマリン誘導体は、酵素の調剤の際に
酵素の基質として使用されることができる。
【００４６】この調剤のために、前記誘導体をそのまま
で、あるいは酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭酸塩、トリ
フルオロ酢酸塩の形で、使用することができる。
【００４７】そのような調剤を行うためには、まず最初
に、式（Ｉ）においてＲ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５がＮ
ＨＲ１１、ＮＲ８Ｒ１１、ＳＲ１１またはＯＲ１１を表
わしかつＲ１１は調剤すべき酵素のため基質の役割をな
すことができる、式（Ｉ）のクマリン誘導体の溶液を作
り、かくして作られたクマリン誘導体溶液の蛍光強度を
測定し、次に調剤すべき酵素の溶液、の試料をこの溶液
に加えてから、一定の時間（例えば、６分間）の後に、
その溶液の蛍光強度を測定する。それから、同じ条件で
調剤を行いながら酵素の既知の濃度を有する複数の試料
から作り上げられた、酵素濃度の関数として蛍光強度の
変化を示す検量曲線から調剤すべき溶液の酵素濃度を決
定する。
【００４８】その調剤のときに、調剤すべき試料中に存
在する酵素はその酵素基質を加水分解して、クマリンの
誘導体、例えばＲ４がＮＨ２、ＮＨＲ８、ＯＨまたはＳ
Ｈを表わす式（Ｉ）の誘導体を再生するが、それはＲ４
がＮＨＲ１１、ＳＲ１１、ＮＲ８Ｒ１１またはＯＲ１１
を表わす誘導体よりもはるかに多量の蛍光を示す。蛍光
活性の回復は試料の酵素の量に比例している。
【００４９】本発明のその他の特徴および利点は次に述
べる例証として当を得たかつ限定的でない実施例を添布
の図面を参照しながら読むことにより一層明らかになる
であろう。
【００５０】
【実施例】例１ ３，６，９−トリオキサデカノイルエチルアセテ
ート（化合物１）の製造 この化合物は式（ＩＩ）のβ−ケトンエステルであり、
ただし −Ｒ１＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＣＨ３ −Ｒ１２＝Ｃ２Ｈ５ である。第１の容器の中で、４００ｍｌのジクロロメタ
ンの中に２９ｇの３，６，９−トリオキサデカン酸
（０．１６モル）の無水溶液を作る。次に前記溶液に、
攪拌しながら２８．３ｇ（０．１７４モル）のカルボニ
ルジイミダゾールを導入して、攪拌を２時間続ける。第
２の容器の中に、２４．６５ｇのメルドラム酸の４００
ｍｌの無水ジクロロメタン中溶液を入れ、次いで−５℃
に冷却させてから、１２．９ｇのピリジンの２４ｍｌの
ジクロロメタン中溶液を加える。第２の容器を−５℃に
保ちながら、３０分間に亘りかつ光を遮断して、第１の
容器の溶液を入れてから、４０℃に１５分間加熱する。
その後１６５ｍｌの氷水を加えて冷し、次に放置して沈
降させる。その有機相を１２０ｍｌの２．５Ｎ ＨＣｌ
で洗ってから、次に１２０ｍｌの食塩水で洗い、そして
蒸発乾固させる。その残渣を次に５００ｍｌの無水エタ
ノール中に採取してから、１５０分間還流させる。その
後真空蒸発、蒸留を行い、かくして１２．１ｇの化合物
１を得るが、これは収率３０％に相当する。
【００５１】この化合物は次の特徴を有する。 １） ５４Ｐａにおける沸点：１４０−１４５℃ ２） 溶離液としてブタノール／酢酸／水混合物（６
０：２０：２０）を用いる蛍光シリカの薄層クロマトグ
ラフィ（ＴＬＣ）：Ｒｆ＝０．７（２５４ｎｍの紫外光
下で、ヨウ素蒸気および２，４−ＤＮＰＨにより展開す
る）。 ３） ＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトル
【００５２】図１および２はそれぞれプロトンおよびＣ
１３のＮＭＲスペクトルを示す。これらのスペクトルは
生成物の構造を確認するものである。
【００５３】例２ １０−カルボキシベンジル−３，
６，９−デカノイルエチルアセテート（化合物２）の製
造 この化合物は式（ＩＩ）に従うβ−ケトンエステルであ
り、ただし −Ｒ１＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ
２−Ｃ６Ｈ５ −Ｒ１２＝ｅｔｈｙＬｅ， −Ｒ６＝Ｈ である。この製造のため、出発原料は３，６，９−トリ
オキサ−ウンデカン−１，１１−二酸であり、これはジ
カルボジイミドの存在でカップリングによりモノベンジ
ルエステルに変換される。モノベンジルエステルは次に
例１と同じ操作手順を用いてβ−ケトンエステルに変換
される。 ａ） ３，６，９−トリオキサウンデカン−１，１１−
二酸の次式のモノベンジルエステル （化合物３）の製
造 ＨＯＯＣ−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２−ＯＣＨ２−
ＣＯＯ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５ １０．８ｇのベンジルアルコールと０．７ｇのアミノピ
リジン（ＤＭＡＰ）を８８．９ｇの３，６，９−トリオ
キサウンデカン−１，１１−二酸のＣＨ２Ｃｌ２ ７０
０ｍｌ中無水溶液に導入する。５℃に冷して、２０．６
ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）を４
０ｍｌの無水ジクロロメタン中に導入する。室温で２時
間攪拌する。生成した沈殿を濾別する。濾液を、１５０
ｍｌの１Ｎ塩酸、１５０ｍｌの水、それから２回２００
ｍｌの０．８Ｎ重炭酸ナトリウムで洗う。重炭酸塩溶液
に３Ｎ塩酸を加えてそのｐＨを２に調整する。次にそれ
を３回１５０ｍｌのジクロロメタンで抽出する。その有
機抽出液を蒸発乾固させると、これは１１．７ｇのモノ
ベンジルエステル（化合物３）を与えるが、収率３８％
に相当する。
【００５４】この生成物は次の特徴を有する。 １） 溶離液としてブタノール、酢酸および水（６０：
２０：２０）の混合物を用いる蛍光シリカ薄層クロマト
グラフィは０．５のＲｆを与える（２５４ｎｍの紫外光
下でおよびヨウ素蒸気により展開する）。 ２） 質量分析（アンモニアイオン化） 図３はこの生成物の質量スペクトルを示す。３１３（Ｍ
＋１）と３３０（Ｍ＋１８）は生成物の質量が３１２で
あることを確認する。 ３） ＮＭＲスペクトル（２００ＭＨｚ） 図４はプロトンのスペクトルを示し、そしてこの生成物
の構造を確認する。
【００５５】ｂ） １０−カルボキシベンジル−３，
６，９−デカノイルエチルアセテート（化合物２）の製
造 第１の容器の中で、ａ）において調製された１０ｇのモ
ノベンジルエステル（化合物３）のジクロロメタン１６
ｍ１中溶液を作る。次に、攪拌しながら、これに５．７
１ｇ（０．０３５モル）のカルボニルジイミダゾールを
導入してから、攪拌を２時間続ける。第２の容器の中
に、５．０４ｇのメルドラム酸の１６ｍｌの無水ジクロ
ロメタン中溶液を入れ、次いで−５℃に冷却させてか
ら、２．５ｇのピリジンの６ｍｌのジクロロメタン中溶
液を加える。まだ−５℃にある前記第２の容器の中に、
３０分間に亘ってかつ空気を遮断して、第１の容器のイ
ミダゾリド溶液を入れ、それから４０℃に１５分間加熱
する。冷却しながら、２４ｍｌの氷水を加え、次に沈降
させ、有機相を１５ｍｌの２．５Ｎ塩酸および１５ｍｌ
の飽和食塩溶液で洗ってから、有機相を蒸発乾固させる その残渣を１００ｍｌの無水エタノール中に採取して、
１５０分間還流させてから、真空蒸発させる。精製を、
ＣＨ２Ｃｌ２／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（９０：
１０）の混合物を溶離液として用いて、シリカカラム上
で行う。これは、収率３９％に相当する４．７ｇの化合
物２（画分２３〜４３）を与える。
【００５６】この生成物は次の特徴を有する。 １） 薄層クロマトグラフィ 蛍光シリカＫ６Ｆおよびプタノール−酢酸−水（６０：
２０：２０）混合物を溶媒として用いて、０．５５のＲ
ｆを得る（２５４ｎｍと３６５ｎｍで、およびヨウ素に
より展開する）。
【００５７】例３ ７−アミノ−４−（２′，５′，
８′−トリオキサノニル）−クマリン（化合物４、次
式）の製造
【化１６】 この化合物は次の基を有する式（Ｉ）に一致する。 −Ｒ１＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＣＨ３ −Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ、および −Ｒ４＝ＮＨ２ １００ｍｌの丸底フラスコに１５ｇ（０．０６モル）の
化合物１、６．６ｇ（０．０６モル）の３−アミノフェ
ノール、４５ｍｌの無水エタノールおよび９．５ｇの塩
化亜鉛を入れる。その反応混合物を攪拌しながら沸とう
するまで２４時間加熱し、それから８００ｍｌのジクロ
ロメタンと６００ｍｌの水の混合液の中へ注入する。放
置して沈降させ、水相を２回２００ｍｌのジクロロメタ
ンで抽出してから、その有機相を一緒にして１２０ｍｌ
の水で洗う。蒸発乾固させる。５０ｍｌのエチルアセタ
ートの中で結晶化させ、次に得られた粗生成物を、エチ
ルアセタートを溶離液としてシリカカラム上で精製す
る。これは、収率１５％に相当する２．６７ｇの化合物
４を与える。
【００５８】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＬＣ（蛍光シリカＫ６Ｆ、エチルアセター
ト）：Ｒｆ＝０．５（２５４ｎｍ、３５６ｎｍ、Ｉ２で
展開する）。 ２） 質量分析（アンモニアによる化学イオン化） 図６はその質量スペクトルを示し、Ｍ＋１＝２９４のピ
ークは２９３の分子量を確認する。 ３） ＮＭＲ（２００ＭＨｚ） 図７は得られたプロトンのスペクトルを示し、そしてこ
の生成物の構造を確認する。 ４） 水中の溶解度：０．４ｇ／ｌ（１．３３ｍＭ）
【００５９】例４ ７−ジメチルアミノ−４−（２′，
５′，８′−トリオキサノニル）−クマリン（次式の、
化合物５）の製造
【化１７】 ２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコの中に２．０６ｇ
（１５ミリモル）の３−ジメチルアミノフェノール、
３．７２ｇ（１５ミリモル）の化合物１、７ｍｌの無水
エタノールおよび２．３５ｇの塩化亜鉛を入れる。攪拌
しながら２４時間沸とうさせ、そしてその溶液を２００
ｍｌのジクロロメタンと１５０ｍｌの水の混合液の中へ
注入する。その水相を２回５０ｍｌのジクロロエタンで
抽出してから、その有機相を一緒にして５０ｍｌの水で
洗い、次いで蒸発乾固させる。得られた生成物をエチル
アセテートを溶離液として用いてシリカカラム上で精製
する。これは、収率７０％に相当する３．３６ｇの化合
物５を与える。
【００６０】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＬＣ（蛍光シリカＫ６Ｆ、エチルアセテー
ト）：Ｒｆ＝０．５５（２５４ｎｍ、３６５ｎｍでヨウ
素により展開する） ２） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図８は得られたスペクトルを示し、Ｍ＋１＝３３２のピ
ークは３２１の子量を確認する。
【００６１】例５ ７−ジエチルアミノ−４−（２′，
５′，８′−トリオサノニル）−クマリン（化合物６、
次式）の製造
【化１８】 例４の操作手順が前記化合物を化合物１から製造するた
めに採用されるが、ただし２．０６ｇの３−ジメチルア
ミノフェノールの代りに２．４８ｇ（１５ミリモル）の
３−ジエチルフェノールを使用し、また粗生成物をシリ
カカラム上で精製するが、溶離液としてＣＨ２Ｃｌ
２を、次いで２種のＣＨ２Ｃｌ２−ＴＨＦ混合液（９
５：５および９０：１０）を使用する。これは、収率６
０％に相当する３．１ｇの化合物６を与える。
【００６２】この生成物は次の特徴を有する １） ＴＬＣ（蛍光シリカＫ６Ｆ、ブタノール、酢酸、
６０：２０：２０）：−Ｒｆ＝０．６８（２５４ｎｍ、
３５６ｎｍでおよびヨウ素で展開する）。 ２） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図９はこのスペクトルを示し、そしてＭ＋１＝３５０の
ピークは分子量３４９を確認する。 ３） ＮＭＲ（２００ＭＨｚ） 図１０はプロトンのスペクトルを示し、それはこの化合
物の構造を確認する。
【００６３】例６ ２，３，６，７−テトラヒドロ−９
−（２′，５′，８′−トリオキサノニル）−１Ｈ，５
Ｈ，１１Ｈ−（１）一ベンゾピラノ−（６，７， ８−
ｉｊ）−キノリジノン−１１（化合物７、次式）の製造
【化１９】 １００ｍｌの丸底フラスコの中に３ｇの８−ヒドロキシ
ジュロリジン、３．９３ｇのエチル−３，６，９−トリ
オキサデカノエート、１２ｍｌの無水エタノールおよび
２．４９ｇの塩化亜鉛を入れる。攪拌しながら沸とうす
るまで２４時間加熱し、それからフラスコの中味を、２
００ｍｌのジクロロメタンと１５０ｍｌの水の混合液の
中へ注入する。その水相を２回５０ｍｌのジクロロメタ
ンで抽出し、そしてそれらの有機相を５０ｍｌの水で洗
ってから、蒸発乾固させる。その粗生成物をシリカカラ
ム上で溶離液としてＣＨ２Ｃｌ２を、次にＣＨ２Ｃｌ２
−ＴＨＦ（９０：１０）混合液を使用して精製し、得ら
れた油を水の中で結晶化させる。これは、収率５２％に
相当する３．０９ｇの化合物７を与える。
【００６４】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＬＣ（蛍光シリカＫ６Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ２−ＴＨ
Ｆ、９０：１０） −Ｒｆ＝０．６（２５４ｎｍ、３５６ｎｍでおよびヨウ
素により展開） ２） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図１１は得られたスペクトルを示し、Ｍ＋１＝３７４の
ピークは３７３の分子量を確認する。 ３） ＮＭＲ（２００ＭＨｚ） ４） 水中の溶解度：０．２ｇ／リットル ５） エタノール：水混合液（３０：７０）の中の溶解
度：３ｇ／リットル 図１２はこの生成物のスペクトルを示し、そしてそれは
期待された構造を確認する。
【００６５】例７ ２，３，６，７−テトラヒドロ−９
−（９′−カルボキシエチル−２′，５′，８′−トリ
オサノニル）−１Ｈ，５Ｈ−１１Ｈ−（１）−ベンゾピ
ラノ−（６，７，８−ｉｊ）−キノリジノン−１１（化
合物、次式）の製造
【化２０】 １００ｍｌの丸底フラスコの中に２．２３ｇの８−ヒド
ロキシジュロリジン、４．６ｇの化合物２、１３．５ｍ
ｌの無水エタノールおよび１．８５ｇの塩化亜鉛を入れ
る。攪拌しながら沸とうするまで２４時間加熱し、それ
からフラスコの中味を、４５０ｍｌのジクロロメタンと
１７０ｍｌの水の混合液の中へ注入する。その水相を２
回５０ｍｌのジクロロメタンで抽出し、そしてそれらの
有機相を５０ｍｌの水で洗ってから、次に蒸発乾固させ
る。その粗生成物をシリカカラム上で溶離液としてＣＨ
２Ｃｌ２を、次にＣＨ２Ｃｌ２：ＴＨＦ（９５：５）を
使用して精製する。これは、収率６０％に相当する５．
２５ｇの化合物８を与える。
【００６６】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＬＣ（蛍光シリカＫ６Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ２−ＴＨ
Ｆ（９５：５） Ｒｆ＝０．４２（２５４ｎｍ、３５６ｎｍでおよびヨウ
素により展開） ２） 質量スペクトル（電子衝撃） 図１３は得られたスペクトルを示し、そしてＭ＝４４５
のピークはこの生成物の構造を確認する。
【００６７】例８ ２，３，６，７−テトラヒドロ−９
−（９′−カルボキシ−２′，５′，８′−トリオキサ
ノニル）−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−（１）−ベンゾピラノ
−（６，７， ８−ｉｊ）−キノリジノン−１１（化合
物９、次式）の製造
【化２１】 ３．１７ｇ（７．１１ミリモル）の化合物８を６３ｍｌ
のメタノールに溶解させてから、６２６ｍｇ（１５ミリ
モル）のソーダを含む９５ｍｌの水を導入する。攪拌し
ながら１時間かつ光を遮断して５０℃に加熱し、それか
ら温度を２０℃に下げる。３Ｎ ＨＣｌでｐＨ１．５ま
で酸性化してから、次いで３０分間攪拌する。３Ｎソー
ダでｐＨを６．４となし、３０分間攪拌する。メタノー
ルの一部を真空蒸発させてから、不純物を２００ｍｌの
ジクロロメタンで抽出し、次いで蒸発乾固させ、そして
残渣を５０ｍｌのエタノールに採取する。その無機塩を
濾別してから、乾燥させる。これは２．５ｇの化合物９
を油状で与えるが、それは徐々に固化し、そして収率８
４％に相当する。
【００６８】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＬＣ（蛍光シリカＫ６Ｆ、ブタノール−酢酸−
水（６０：２０：２０） −Ｒｆ＝０．４５（２５４ｎｍ、３５６ｎｍでおよびヨ
ウ素により展開） ２） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図１４は得られたスペクトルを示し、そしてＭ＝２５６
のピークは、置換基Ｒ１に相当する側鎖の炭素と第１の
酸素との間のフラグメンテーションを表わす。 ３） ＮＭＲスペクトル 図１５はプロトンのスペクトルを示し、そしてこの化合
物の構造を確認する。
【００６９】例９ ７−ヒドロキシ−４−（２′，
５′，８′−トリオキサノニル）−クマリン（化合物１
０、次式）の製造
【化２２】 ２５ｍｌの丸底フラスコの中に３．３ｇ（０．０３モ
ル）のレゾルシノール、７．４ｇ（０．０３モル）の化
合物１および７．５ｍｌのトリフルオロ酢酸を入れる。
７５℃で５時間攪拌してから、フラスコの中味を３００
ｇの水と氷混合物に注入する。抽出を２回１５０ｍｌの
ブタノールで行い、そしてそのブタノール相を２回５０
ｍｌの水で洗う この粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィによりエ
チルアセタートを溶離液として用いて精製し、そして最
純の画分をエタノール−水画分（３０：７０）の中で再
結晶させる。これは、収率２３％に相当する２ｇの化合
物を与える。
【００７０】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＬＣ（蛍光シリカＫ６Ｆ、エチルアセテート） −Ｒｆ＝０．４８（２５４ｎｍ、３５６ｎｍでヨウ素に
より展開） ２） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図１７は得られたスペクトルを示し、そして２９５（Ｍ
＋１）と３１２（Ｍ＋１８）は分子量２９４を確認す
る。 ３） プロトンのＮＭＲスペクトル（２００ＭＨｚ） 図１８は得られたスペクトルを示し、そしてこの化合物
の構造を確認する。 ４） 水中の溶解度：１ｇ／ｌ ５） 水−エタノール混合物（９０：１０）中の溶解
度：７ｇ／ｌ。
【００７１】例１０ ４−（２′，５′，８′−トリオ
キサノニル）−エスクレチン（化合物１１、次式）の製
造
【化２３】 １００ｍｌの丸底フラスコの中に３．０５ｇ（１２ミリ
モル）のトリアセトキシベンゼン、３ｇ（１２ミリモ
ル）の化合物１および次に１４ｍｌの硫酸を入れる。８
０℃に３０分間加熱してから、次いで冷却し、そして５
０ｍｌの水と５０ｍｌのｎ−ブタノールの混合物に注入
する。その有機相を分離し、４回５０ｍｌの水ですすぎ
洗いし、次に真空乾燥を行う。その生成物をシリカカラ
ム上でジクロロメタン−メタノール混合液（７５：２
５）を溶離液として用いて精製する。精製画分を蒸発さ
せ、ジクロロメタン中に採取し、次に不溶分を除去して
から、濃縮して乾固させる。これは、収率８％に相当す
る２７０ｍｇの化合物１１を与える。
【００７２】この生成物の特徴は次の通りである。 １） ＴＬＣ（蛍光シリカＫ６Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ２−Ｍｅ
ＯＨ、７５：２５） −Ｒ１＝０．８５（２５４ｎｍ、３５６ｎｍで塩化第二
鉄により展開） ２） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図１９は得られたスペクトルを示し、３１１（３１０＋
１）と３２８（３１１＋１７）のピークは生成物の分子
量を確認する。 ３） プロトンのＮＭＲ（２００ＭＨｚ） 図２０は得られたスペクトルを示し、そしてそれはこの
化合物の構造を確認する。
【００７３】例１１ Ｎ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−
ロイシン−４−（２′，５′，８′−トリオキサノニ
ル）−７−クマリニルアミド（化合物１２、次式）の製
造
【化２４】 この例では、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ
Ｉ）を用いて酵素基質を製造するために、化合物４をＮ
−カルボベンジルオキシ−Ｌ−ロイシンと結合させる。
２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコの中で、１．０６
ｇ（４ミリモル）のＮ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−ロ
イシンと１．１７ｇ（４ミリモル）の化合物４を１０ｍ
ｌのジメチルホルムアミドに溶解させる。攪拌しなが
ら、９８９ｍｇ（４．８ミリモル）のＤＣＣＩを導入
し、次いで２時間攪拌してから、生成した沈殿を濾別す
る。５０ｍｌと５０ｍｌのジクロロメタンの混合液に注
ぎ、次にその有機相を２０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ、２０ｍ
ｌの０．５％重炭酸ナトリウムおよび２０ｍｌの水で洗
う。その溶液をそれから乾燥および濃縮して乾固させ
る。これは２ｇの化合物１２を与え、それは収率９２．
６％に相当する。
【００７４】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＬＣ（蛍光シリカＫ６Ｆ、ブタノール−酢酸−
水６０：２０：２０） −Ｒｆ＝０．７２（２５４および３５６ｎｍで展開） ２） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図２１は得られたスペクトルを示し、５４１（Ｍ＋１）
および５５８（Ｍ＋１８）は５４０の分子量を確認す
る。
【００７５】例１２ Ｎ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−
ロイシン−４−（２′，５′，８′−トリオキサノニ
ル）−７−クマリニルアミド（化合物１２）の製造 この例は、例１１の化合物１２を製造するため別の方法
を使用する。ここでは化合物４とＮ−カルボベンジルオ
キシ−Ｌ−ロイシンとの結合を、Ｎ−カルボベンジルオ
キシ−Ｌ−ロイシンの混合無水物の中間体形成の後で行
う。湿気を遮断して、２５０ｍｌの丸底フラスコの中に
７２ｍｌの無水ＴＨＦ、３，６２ｇ（１３．７ミリモ
ル）のＮ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−ロイシンおよび
１．４５ｇ（１４．３ミリモル）のＮ−メチルモルホリ
ンを導入する。−１５℃に冷却させ、次に１．９６ｇ
（１４．３ミリモル）のイソブチルクロロホルマートを
導入して、反応を５分間行わせる。この温度で、４５分
以内に４ｇ（１３．７ミリモル）の化合物４のＴＨＦ１
４４ｍｌ中溶液を導入する。これに続いてさらに１時間
−１５℃で攪拌し、それから２０℃で翌日まで攪拌す
る。不溶の生成物を濾別してから、蒸発乾固させる。そ
の残渣を５０ｍｌのジクロロメタンで採取してから、２
０ｍｌの１Ｎ ＨＣ１、２０ｍｌの０．５％重炭酸ナト
リウムおよび２０ｍｌの水で洗い、次に乾燥および濃縮
して乾固させる。これは１７．８ｇの化合物１２を与
え、それは収率９１．５％に相当する。この生成物は例
１１のものと同じ特徴を有する。
【００７６】例１３ Ｌ−ロイシン−４−（２′，
５′，８′−トリオキサノニル）−７−クマリニルアミ
ドヒドロクリド（化合物１３、次式）の製造
【化２５】 この化合物は前記の化合物１２から接触水素化によりロ
イシンからＮ−カルボベンジルオキシ基をまず除去する
ことにより製造される。水素化用フラスコの中に４８ｍ
ｌのエタノール、８．５ｇの化合物１２および２．５５
ｇの、５％の木炭に担持させたパラジウムを導入する。
窒素でパージしてから、水素を導入しながら大気圧およ
び室温で５時間攪拌する。触媒を濾別して、蒸発乾固さ
せる。得られた生成物をシリカカラムクロマトグラフィ
によりＴＨＦを溶離液として用いて精製する。これは
２．７ｇの化合物１３を与えるが、それは収率４２％に
相当する。次にこれを相当する塩酸塩にするため、２．
７ｇの化合物を５．５ｍｌのメタノールに溶解させてか
ら、７３０μｌの濃塩酸を加える。次にこれを真空蒸発
により乾固させ、６ｍｌのイソプロパノールを加えて、
２４時間冷蔵する。生成した沈殿を濾別し、濾液をエチ
ルエーテルで希釈することにより再び生成物を採集す
る。かくして２ｇの化合物１３の塩酸塩を得るが、これ
は収率６８％に相当する
【００７７】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＨＣ ａ） 蛍光シリカＫ６Ｆ、ブタノール−酢酸−水 ６０：２０：２０ −Ｒｆ＝０．４６（２５４ｎｍ，３５６ｎｍでニンヒド
リンにより展開） ｂ） 蛍光シリカＫ６Ｆ、ＴＨＦ −Ｒｆ＝０．２５（２５４ｎｍ，３５６ｎｍでニンヒド
リンにより展開） ２） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図２２は得られたスペクトルを示し、そして４０７（Ｍ
＋１）と４２４（Ｍ＋１８）のピークは４０６の分子量
を確認する。 ３） ＮＭＲスペクトル 図２３はプロトンのスペクトルを示すが、これは得られ
た生成物の構造を確認する。
【００７８】例１４ この例は化合物１３の特性およびそのロイシンペプチダ
ーゼの水溶性基質としての使用を研究するものである。 １．分光用セル内の酵素活性の研究 ＡＴＣ、すなわち７−アミノ−４−（２′，５′，８′
−トリオキサノニル）−クマリン（これは加水分解生成
物である）の痕跡の、基質Ｌｅｕ ＡＴＣ（化合物１
３）中の可能な存在の結果として、ロイシンアミノペプ
チダーゼの酵素活性を測定する反応速度法が用いられ
た。すなわち、そのシグナルは２分間と１２分間の蛍光
強度の差から成る方法である。この方法で加水分解の前
に存在したＡＴＣの影響を除くことができる。 ａ）最適波長の測定 ＡＴＣおよびロイシン−ＡＴＣ（化合物１３）の励起お
よび発光スペクトルを、ｐＨ７．８のＴｒｉｓ緩衝液中
１０−７Ｍ溶液を基準としてプロットした。得られた極
大値が表１に、７−アミノ−４−メチル−クマリン（Ｌ
ｅｕ−ＡＭＣ）または７−アミノ−４−クマリニル−メ
タンスルホン酸（ＧｌｙＧｌｙＡｒｇＡＭＣＳ）から誘
導された市販の基質の対応する極大値と共に示されてい
る。
【表１】
【００７９】化合物１３（Ｌｅｕ−ＡＴＣ）および対応
する加水分解生成物（ＡＴＣ）の励起および蛍光スペク
トルの位置はＡＭＣおよびＡＭＣＳ誘導体のそれらの中
間であるが、そのストークスシフトはより大きい。測定
のために使用された波長において、加水分解生成物と基
質の等モル濃度における蛍光強度の比はＡＴＣにつき約
４００、ＡＭＣにつき３００そしてＡＭＣＳにつき２５
０である。従って、基質の蛍光は加水分解生成物のそれ
により干渉されない。
【００８０】ｂ）酵素反応の特徴の測定 反応の初速度は次の試薬を使用して化合物１３（Ｌｅｕ
−ＡＴＣ）から成る基質の２×１０−５モル／ｌと２×
１０−３モル／ｌの間の濃度につき研究された。 −例１３の結晶性Ｌｅｕ−ＡＴＣ塩酸塩：４×１０−５
〜４×１０−３モル／ｌの水溶液。 −ロイシンアミノペプチダーゼ（シグマ、参照Ｎ５００
６）：０．２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液中７．５３μｇ／ｍｌ
の水溶液、ｐＨ７．８。 −Ｔｒｉｓ緩衝液： 溶液Ａ：０．２Ｍ Ｔｒｉｓ，すなわち、２４．２３ｇ
／ｌ 溶液Ｂ：０．１Ｍ ＨＣ１。
【００８１】この緩衝液は２５ｍｌの溶液Ａと３３．７
ｍｌの溶液Ｂを混合してから１００ｍｌの水を補って調
製される。ｐＨは７．８でなければならない。 −１．１７Ｎ過塩素酸溶液（純酸の１／１０希釈液） この測定のため、最初に次の範囲の基質濃度（化合物１
３、Ｌｅｕ−ＡＴＣ）の試料を、各試験管の中に調製す
る：０−２−４−１０−２０−５０−１００−２００×
１０−５Ｍ（最終の濃度）。各管に１．５１μｇ／ｍｌ
の濃度のロイシンアミノペプチダーゼを加え、すべてを
３７℃に予熱されたｐＨ７．８のＴｒｉｓ緩衝液に溶解
する。その間それらの管は３７℃に温度調節された水浴
の中に入っている。２分間後に各管から２５０μｌが取
り出されて、２５０μｌの過塩素酸溶液と７５０μｌの
水を含む管に注入される。同じ操作を６分間後に繰返
す。すべての管を１／１０００に希釈する。蛍光強度Ｉ
Ｆを３７０／４８０ｎｍで測定する。６分と２分におけ
る強度の差ＩＦ（６）−ＩＦ（２）がシグナルを構成す
る。対応するＡＴＣ濃度は１０−９と１０−８Ｍの間の
検量範囲に関して計算される。それらの結果を次の表２
に示す。
【表２】
【００８２】速度定数ｋｃａｔは比Ｖｍ／Ｅｚにより計
算され、そこでＶｍはμモル／ｓ／ｍｇ／Ｅｚ単位の最
大速度であり、μモルで表わされた１ｍｇ中の酵素の量
である。ロイシンアミノペプチドの分子量は３００００
０である。
【００８３】図２４は初速度（μｍ／分）の進化をμｍ
で表わされた基質の濃度（Ｌｅｕ／ＡＴＣ）の関数とし
て例示する曲線である。この曲線はミカエリス（Ｍｉｃ
ｈａｅｌｉｓ）の動力学に特徴的な双曲線的行動をす
る。実験点は非線形回帰（Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェ
ア）により該当する方程式に対して調整され、そして親
和性定数Ｋｍ、最大速度Ｖｍおよび速度定数ｋｃａｔ
（最大速度の酵素濃度に対する比）の決定を可能にし
た。それらの結果は、既知の基質のそれらと比較されて
表３に示されている。
【表３】
【００８４】Ｌｅｕ−ＡＴＣのロイシンアミノペプチダ
ーゼに対する親和性は他の２種の基質のそれよりも良い
が、一方反応速度はより高い。これは反応媒体が、他の
基質の場合と違って、有機溶媒を含まないという事実に
よるかも知れない。さらに、Ｌｅｕ−ＡＴＣとＬｅｕ−
ＡＭＣを比較すると、水溶性の側鎖Ｒ１の存在は酵素反
応に害とならず、そしてそれは７−アミノ−４−クマリ
ニル−メタン−スルホン酸より誘導された基質に比較し
て有利であることが明らかになる。後者において水溶性
のスルホン基は最大速度と親和性を著しく減少させる。
【００８５】ｃ）反応の分析的特徴の測定 反応条件は先行する段階に従って決定された。Ｌｅｕ−
ＡＴＣ基質の濃度は最大速度（１ｍＭ）を与えるように
選択された。反応時間は、１２分間と２分間の蛍光強度
の差を測定することにより１２分とされた。定量化限界
を評価するため、反復性を測るため、および線形性を試
験するために、６ｇの酵素を以前と同じ試薬を使用しか
つ次の範囲を与えて、０−０．０５−０．１０−０．２
５−０．５０−１μｇ／ｍｌの濃度を含めて調製した。
【００８６】 Ｅｚ（ｍｇ／ｍｌ） ０ ０．０５ ０．１０ ０．２５ ０．５０ １ Ｌｅｕ−ＡＴＣ （４×１０−３Ｍ） ２５０ ２５０ ２５０ ２５０ ２５０ ２５０ 緩衝液Ｔｒｉｓ ７５０ ７４０ ７３０ ７００ ６５０ ５５０ 酵素５μｇ／ｍｌ ０ １０ ２０ ５０ １００ ２００
【００８７】評価を行うために、７５０μｌの水＋２５
０μｌの１，１７Ｎ過塩素酸溶液を含む一連の試験管を
準備し、そして２分の時点で、それに２５０μｌの各酵
素濃度段階の試料を移し入れた。同じことを１２分の時
点で行った。これに続いて、すべての試験管を水で１／
２０００に希釈してから、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＬ
Ｓ３Ｂの蛍光形によりゲイン２で蛍光（３７０／４８０
ｎｍ）の読みを行った。
【００８８】その得られた結果は図２５に示され、同図
は蛍光強度の変化を酵素濃度（μｇ／ｍｌ）の関数とし
て示す平均検量線を表わす。この検景線は線形回帰によ
り定められた。平均標準偏差は勾配について１５３±
７．３６であり、そして切片につき−３．１０±１．１
６である。
【００８９】線形性試験は５％しきい値（Ｆ＝０．５５
４）で有意である。定量化限界は、比−３ｂ／ａにより
計算されると、０．０２μｇ／ｍｌである。反復性は、
変異係数により評価されると、０．０５μｇ／ｍｌで１
７％、０．２５μｇ／ｍｌで８％そして１μｇ／ｍｌで
４％である。したがって、検出限界は、Ｌｅｕ−ＡＭＣ
により得られる０．０３μｇ／ｍｌよりも良好である。
【００９０】例１５ Ｎ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−
アルギニル−４−（２′，５′，８′−トリオキサノニ
ル）−７−クマリニルアミドヒドロクロリド（化合物１
４、次式）の製造
【化２６】 この例では化合物４が、結合剤またはカップリング剤と
してジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）を使
用してＮ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−アルギニンと結
合される。１００ｍｌの丸底フラスコ中で３．４５ｇ
（１０ミリモル）のＮ−カルボベンジルオキシ−アルギ
ニン塩酸塩および１．４６７ｇ（５ミリモル）の化合物
４を１５ｍｌのジメチルホルムアミド中に溶解させる。
攪拌しながら１．０５ｇ（５ミリモル）のＤＣＣｌを導
入して、攪拌を２４時間続ける。これに続き濾過と沈殿
の除去を行う。溶媒を真空蒸発させ、そして２５ｍｌの
エチルアセタートと２．５ｍｌのメタノールの混合液に
より採取する。分離する油を１，５ｍｌのＤＭＦと５ｍ
ｌのメタノールの混合液により採取し、それに徐々に６
０ｍｌのエチルアセタートを加える。形成されたガム状
の沈殿物は真空デシケーター中で固化する：２．１４
ｇ。得られた粗生成物をシリカカラム上で溶離液として
ジクロロメタン、メタノールおよび酢酸の８５：１５：
５および次に８５：２０：５の三元混合物を使用して精
製する。採取された１０ｍｌの画分３４の上に、画分１
９〜３０を濃縮させる。その濃縮物を、２回エタノール
中に採取してから再蒸発させ、エーテルに加えて攪拌す
る。その生成物を濾別して真空乾燥すると、収率１９．
５％の６０５ｍｇを与える。
【００９１】この生成物は次の特徴を有する。 １）ＴＬＣ 蛍光シリカＫ６Ｆ：溶離溶媒：ジクロロメタン／メタノ
ール／酢酸８５：２０：５−２５４および２５６ｎｍ
（青紫スポット）；Ｒｆ０．６３ ２）ＮＭＲスペクトル 図２６はプロトンのスペクトルを示し、得られた生成物
の構造を確認しかつ酢酸分子との溶媒和を示す。 ３）質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン化） 図２７は得られたスペクトルを示す。その分子はひどく
分裂されており、そして化合物４の分子を表わす２９４
（２９３＋１）の主ピークは最も安定な部分である。
【００９２】例１６ この例はトリプシンによるＺ−Ａｒｇ−ＡＴＣ（化合物
１４）の加水分解を研究する。 １）最適波長の測定 ＡＴＣおよびＺ−Ａｒｇ−ＡＴＣの励起および発光スペ
クトルを、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含むｐＨ８の５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ緩衝液中１０−７Ｍ溶液に基ずいてプロッ
トした。Ｚ−Ａｒｇ−ＡＴＣの励起および発光スペクト
ルはそれぞれ図２８と２９に示されている。得られた極
大値はＬｅｕ−ＡＴＣの対応する極大値と共に表４に示
されている。
【表４】
【００９３】ＡＴＣのアミンの上にＬｅｕの代りにＡｒ
ｇの存在はそのスペクトルの赤の方への僅かな変位に導
く（深色効果）。それは測定波長に対して同じ方向への
変化を課して製品の蛍光における基質の干渉を阻止す
る。
【００９４】２）酵素反応の特徴 ａ）試薬 −結晶性Ｚ−Ａｒｇ−ＡＴＣ塩酸塩（Ｓｅｒａｔｅ
ｃ）：Ｔｒｉｓ緩衝液中１０−３Ｍ溶液、ｐＨ８．０±
ＣａＣｌ２、１０ｍＭ。 −ブタの膵臓トリプシン（ＳＩＧＭＡ Ｔ０１３４）：
Ｔｒｉｓ緩衝液中１０−３Ｍ溶液、ｐＨ８．０＋ＣａＣ
ｌ２、１０ｍＭ。 −Ｔｒｉｓ緩衝液：溶液Ａ：０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、すな
わち、２４．２３ｇ／ｌ＋ＣａＣｌ２、４０ｍＭ、すな
わち５．８８ｇ／ｌ； 溶液Ｂ：０．１Ｍ ＨＣｌ。 この緩衝液Ｂは２５０ｍｌの溶液Ａと２６８ｍｌの溶液
を混合し、そして水を加えて１ｌにすることにより調製
される。 −酢酸塩緩衝液：溶液Ａ：０．０２Ｍ酢酸； 溶液Ｂ：０．０２Ｍ酢酸ナトリウム。 この緩衝液は等量の溶液ＡとＢを混合することにより調
製されてｐＨ４．７５の緩衝液を得る。 −１．１７Ｎ過塩素酸水溶液（純酸の１／１０希釈
液）。 ｂ）操作手順 次の範囲の基質濃度の試料をそれぞれの試験管の中に調
製した：０−０．２−Ｏ．５−１−２−５−１０×１０
−４Ｍ（最終の濃度）。各管に６．６７μｇ／ｍｌの濃
度のトリプシンを加え、そしてすべてをＴｒｉｓ緩衝液
ｐＨ８．０＋ＣａＣｌ２、１０ｍＭ中に室温で溶解させ
た。酵素を時点０において加える。２分後に、各管から
２５０μｌを取り出して２５０μｌの１．１７Ｎの過塩
素酸および５００μｌの水を含む管に注入する。それら
の試験管を遠心分離し、次にその酢酸塩緩衝液中に１／
２５０に希釈する。同じ操作を１７分の時点で繰返す。
蛍光強度を３８０／４９０／ｎｍで測定する。１７分と
２分における強度の差がシグナルを構成する。対応する
ＡＴＣ濃度を５×１０−９から２×１０−７Ｍまでの検
量範囲と比較して計算する。それらの結果は次の表５に
示されている。
【表５】
【００９５】これに続いてＫｍ、Ｖｍ、ｋｃａｔおよび
ｋｃａｔおよびｋｃａｔ／Ｋｍ比を測定した。得られた
結果は表６に示されている。その表はまた比較のためＺ
−Ｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣおよびＢｚ ＤＬ Ａｒｇ−ＡＭ
ＣおよびＢｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣにより得られた値も
示す。
【表６】
【００９６】かくして、Ｋｍは０．１９５ｍＭであり、
そしてＶｍは３．１６μＭ／ｍｉｎである。最大速度は
４７４ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇＥｚであり、ｋｃａｔ＝
０．１９ｓ−１および９７５Ｍ−１ｓ−１のＫｃａｔ／
Ｋｍ比に対応する。それゆえ基質Ｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ＡＴ
Ｃは、親和性と活性の観点からＢｚ−ＤＬ−Ａｒｇ−Ａ
ＭＣに比較し得る。しかし、最大速度はＺ−Ｌ−Ａｒｇ
−ＡＭＣの約４〜５倍下である。この差は考慮に値いせ
ず、もう少し長い時間により補償されることができる。
【００９７】３）分析的特徴 最終酵素濃度０−０．４２−０．８４−１．６７−３．
３３−６．６７μｇ／ｍｌを含む６段階の検量範囲を調
製した。各検量線は線形回帰により定められた。平均標
準偏差は勾配につき２．４５×１０−３±０．００３×
１０−３であり、そして切片について４．８０×１０
−３±２．５３×１０−３である。線形性試験は５％し
きい値（Ｗ＝０．２４５）で有意である。定量限界は、
比３σｂ／ａにより計算されると、０．０５μｇ／ｌで
ある。反復性は、変異係数により評価されると、０．４
２μｇ／ｍｌで９．４％、０．８４μｇ／ｍｌで５．９
％および６．６７μｇ／ｍｌで１．３％である。Ｚ−Ｌ
−Ａｒｇ−ＡＴＣによるトリプシンの検出限界は、それ
ゆえＡＭＣから誘導された基質により得られるものと同
程度である。
【００９８】例１７ Ｎ−カルボベンジルオキシピログ
ルタミル−４−（２′，５´，８´−トリオキサノニ
ル）−７−クマリニルアミド（化合物１５、次式）の製
造
【化２７】 この例では、化合物４がカップリング剤としてジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）を使用してＮ−カ
ルボベンジルオキシピログルタミン酸とカップリングさ
れる。１００ｍｌの丸底フラスコ中で２．２４ｇ（８．
５ミリモル）のＮ−カルボベンジルオキシピログルタミ
ン酸および２．５ｇの化合物４（８．５ミリモル）を３
０ｍｌのジメチルホルムアミド中に溶解させる。攪拌し
ながら１．７６ｇ（８．５ミリモル）のＤＣＣＩを導入
して、攪拌を２０時間続ける。これに続き濾過と沈殿の
除去を行う。その濾液を１５０ｍｌの水と１５０ｍｌの
ジクロロメタンの混合液に注ぐ。その有機相を４×１０
０ｍｌの１Ｎ塩酸、１００ｍｌの水、１００ｍｌの５％
重炭酸塩および５０ｍｌの水で洗う。有機相を硫酸マグ
ネシウムで乾燥させてから、真空蒸発を行う。その残渣
を２０ｍｌのエチルアセタート中で結晶化すると２．５
ｇの収量（５６％）を与える。この生成物は次の特徴を
有する。 １） ＴＬＣ 蛍光シリカＫ６Ｆ：溶離液：エタノール
／シクロヘキサン／ＴＨＦ３０：７０：５、２５４およ
び３５６ｎｍ（青紫スポット）で展開、Ｒｆ＝０．１
６。 ２） ＮＭＲスペクトル 図３０はプロトンのスペクトルを示し、得られた生成物
の構造を確認する。 ３） 質量スペクトル：（アンモニアによる化学イオン
化） 図３１は得られたスペクトルを示す。その５３９のピー
クは＋１７の分子ピークを表わす。
【００９９】例１８ ピログルタミル−４−（２′，
５′，８′−トリオキサノニル）−７−クマリニルアミ
ド（化合物１６）の製造
【化２８】 この例では、化合物１５がテトラヒドロフラン中に溶解
されて水素化される。水素化用フラスコ中に７０ｍｌの
テトラヒドロフラン、２．４ｇの化合物１５および３６
０ｍｇの１０％木炭に担持されたパラジウムを入れる。
窒素でパージしてから、水素を導入する。大気圧および
室温で５時間攪拌を行う。触媒を濾別して後、蒸発させ
て乾固に至らせ、４０ｍｌのエチルアセタート中で再結
晶させると、１．３２ｇの収量（７４．５％）を与える
【０１００】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＬＣ 蛍光シリカＫ６Ｆ；溶離液：ジクロロメタン／メタノー
ル９０：１０；２５４および３５６ｎｍで展開（青紫ス
ポット）−Ｒｆ＝０．３９° ２） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図３２は得られたスペクトルを示す。４０５におけるピ
ークは分子ピークを表わし、４２２のピークは＋１７分
子ピークを表わす。 ３） ＮＭＲスペクトル 図３３はプロトンのスペクトルを示し、得られた生成物
の構造を確認する。
【０１０１】例１９ Ｎ−カルボベンジルオキシ−α−
ベンジルエステルγ−グルタミル−４−（２′，５′，
８′−トリオキサノニル）−７−クマリニルアミド（化
合物１７、次式）の製造
【化２９】 この例では、化合物４がＮ−カルボベンジルオキシグル
タミン酸のα−ベンジルエステルとカップリングされ
る。１００ｍｌの丸底フラスコ中で、７．４３ｇ（０．
０２モル）のＮ−カルボベンジルオキシグルタミン酸の
α−ベンジルエステル、３．２４ｇのヒドロキシベンゾ
トリアゾール、５．８７ｇ（０．０２モル）の化合物４
が５５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解される。５℃
に冷やし、攪拌しながら、４．１３ｇのジシクロヘキシ
ルカルボジイミドＤＣＣＩ（０．０２モル）を導入す
る。５℃に１時間保った後、それを室温で２０時間攪拌
し、次に濾過と沈殿の除去を行う。溶媒を真空蒸発させ
てから、１３５ｍｌの５％重炭酸塩溶液および２００ｍ
ｌのエチルアセタートにより採取する。その有機相を３
×１３５ｍｌの１Ｎ塩酸、１３５ｍｌの５％重炭酸塩溶
液および１３５ｍｌの水で洗う。その有機溶液を乾燥さ
せてから、生成物をシリカカラム上でエチルアセタート
を溶離液として用いて精製する。画分４１〜７７から
３．３７ｇ（３０％）の純生成物が得られる。
【０１０２】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＬＣ 蛍光シリカＫ６Ｆ；溶離液：エチルアセタート；２５４
および３５６ｎｍ（青紫スポット）で展開；Ｒｆ＝０．
４５。 ２） ＮＭＲスペクトル 図３４はプロトンのスペクトルを示し、期待された生成
物の構造を確認する。
【０１０３】例２０ γ−グルタミル−４−（２′，
５′，８′−トリオキサノニル）−７−クマリニルアミ
ド（化合物１８、次式）の製造
【化３０】 この例では、化合物１７がテトラヒドロフラン溶液中で
水素化される。水素化用フラスコ中に１１４ｍｌのテト
ラヒドロフラン、３．８２ｇの化合物１７および７６４
ｍｇの１０％木炭担持パラジウムを導入する。窒素でパ
ージしてから、水素を導入する。大気圧および室温で８
時間攪拌を行う。触媒を濾別した後、その触媒中に結晶
化していた生成物を２×４００ｍｌの沸とうメタノール
により抽出する。そのメタノールを真空濃縮して１００
ｍｌの容積にする。結晶化する生成物を遠心分離し、メ
タノールで１回すすぎ洗いしてから真空乾燥させると
１．５５ｇの収量（６５％）を与える。
【０１０４】この生成物は次の特徴を有する。 １） ＴＬＣ 蛍光シリカＫ６Ｆ；溶離液ブタノール／酢酸／水６０：
２０：２０；２５４および３５６ｎｍ（青紫スポット）
で展開；Ｒｆ＝０．３５（ニンヒドリンで展開）。 ２） ＮＭＲスペクトル 図３５はプロトンのスペクトルを示し、期待された生成
物の構造を確認する。 ３） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図３６は得られた生成物のスペクトルを示す。分子のピ
ーク（Ｍ＋１）＝４０５および化合物４（アミドのフラ
グメンテーション）の（２９３＋１）のピークがある。
【０１０５】例２１ ωＦｍｏｃ α−Ｂｏｃ Ｌ−リ
ジル−４−（２′，５′，８′−トリオキサノニル）−
７−クマリニルアミド（化合物１９、次式）の製造
【化３１】 この例では、化合物４がカップリング剤としてジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（ＤｃｃＩ）を用いての−Ｆｍ
ｏｃ α−Ｂｏｃ Ｌ−ロイシンとカップリングされ
る。５０ｍｌの丸底フラスコ中で２ｇ（４．２７ミリモ
ル）のω−Ｆｍｏｃ α−Ｂｏｃ−Ｌ−リジンと１．２
５ｇ（４．２７ミリモル）の化合物４を１５ｍｌのジメ
チルホルムアミドに溶解する。攪拌しながら、０．８８
１ｇ（４．２７ミリモル）のＤＣＣＩを導入し、続いて
２０時間の攪拌、濾過および沈殿の除去を行う。溶媒を
真空蒸発させ、その残渣を４０ｍｌのジクロロメタンに
より採取し、続いて４０ｍｌの１Ｎ塩酸および２回４０
ｍｌの水で洗う。硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次に
真空蒸発させる。その濃縮物をシリカカラムクロマトグ
ラフィにより溶離液としてｎ−ブタノール、エチルアセ
タートおよびシクロヘキサノン３０：２０：３０の三元
混合物を用いて精製する。６５の１０ｍｌ画分に採集
し、５１〜６５の画分を濃縮した。収量１．５２ｇ（４
８％）。
【０１０６】この生成物は次の特徴を有する。 １） ｍｐ＝１４７〜１４７．５℃ ２） ＴＬＣ 蛍光シリカＫ６Ｆ；溶離液ｎ−ブタノール／エチルアセ
タート／シクロヘキサノン３０：２０：３０；２５４と
３５６ｎｍ（青紫スポット）で展開；Ｒｆ＝０．６３ ３） ＮＭＲスペクトル 図３７はプロトンのスペクトルを示し、得られた生成物
の構造を確認する。 ４） 質量スペクトル（アンモニアによる化学イオン
化） 図３８は得られたスペクトルを示す。５２２および５３
９（５２２＋１７）のピークは、生成物がＦＭＯＣ基で
切断されるので（７４３−２２２＋１）、生成物の質量
（７４３）を確認する。
【０１０７】上に述べた実施例の中で、化合物４、１
０、１２〜１７および１９は酵素基質の製造のための中
間体、特に化合物１２〜１７および１９の場合にはポリ
ペプチド、として使用されることができる。化合物１
３、１４、１６および１９は酵素基質として使用される
ことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペク
トルである。
【図２】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペク
トルである。
【図３】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図４】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペク
トルである。
【図５】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図６】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図７】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペク
トルである。
【図８】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図９】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図１０】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図１１】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図１２】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図１３】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図１４】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図１５】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図１６】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図１７】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図１８】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図１９】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図２０】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図２１】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図２２】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図２３】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図２４】本発明の酵素期基質の場合における酵素反応
の初速度（μＭ／分）を、気質濃度（μＭ／分）の関数
として表す曲線である。
【図２５】蛍光強度を酵素濃度（μｇ／ｍｌ）の関数と
して表す検量線である。
【図２６】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図２７】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図２８】本発明の化合物の励起スペクトルである。
【図２９】本発明の化合物の発光スペクトルである。
【図３０】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図３１】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図３２】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図３３】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図３４】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図３５】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペ
クトルである。
【図３６】本発明の化合物の質量スペクトルである。
【図３７】本発明の化合物のＮＭＲ（核磁気共鳴）スベ
クトルである。
【図３８】本発明の化合物の質量スペクトルである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミシェル トド フランス国マルジェンシ，リュ アンリ デュラン ４ (72)発明者 ステファン ルヴェロ フランス国パリ，リュ ノトル ダム デ シャンプ 65

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中、 １） Ｒ１は式 −（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＣＨ２Ｒ７、または −（ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）ｍＯＣＨ２Ｒ７、 に相当する基を表わし、ｍは１〜３０の整数であり、そ
    してＲ７は −水素原子、 −ハロゲン原子、 【化２】 −アルキル、アルコキシまたはアリール基で、ハロゲン
    原子、フェニル基、ＣＦ３、ＯＨ、ＯＲ８、ＳＨ、ＳＲ
    ８、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ９、ＮＨ２、ＮＨＲ８、ＮＲ８
    Ｒ１０、ＳＯ３ＨおよびＳＯ３Ｒ９の中から選ばれた少
    なくとも１つの置換基により置換された（前式中Ｒ８は
    アルキルまたはアリール基であり、Ｒ９はアルキルまた
    はアリール基、ＮＨ４またはＭ１／ｖ（Ｍは原子価ｖの
    金属である）であり、そしてＲ１０はアルキルまたはア
    リール基、あるいはＲ８とＲ１０は一緒に飽和または不
    飽和の、場合によりＯ，ＳおよびＮの中から選ばれたへ
    テロ原子を含む、炭化水素環を形成することができる）
    または置換されない基を表わし、 ２） Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一または異な
    ることができ、次の基 −水素原子、 −ハロゲン原子、 −ＮＨ２、 −ＮＨＲ８、 −ＮＲ８Ｒ１０、 −ＮＨＲ１１、 −ＮＲ８Ｒ１１、 −ＳＨ −ＳＲ８ −ＳＲ１１ −ＯＨ −ＯＲ８ −ＯＲ１１ （上式中、Ｒ８とＲ１０は前記の意味を有し、そしてＲ
    １１は、保護されたまたは保護されないアミノ酸、保護
    されたまたは保護されないペプチド、カルボン酸および
    脂肪酸の中から選ばれた化合物より誘導されたアシル
    基、ＰＯ３Ｒ２基（Ｒは水素原子またはアルキル基であ
    る）、または糖誘導基を表わす）、または −アルキルまたはアルコキシ基で、ハロゲン原子、Ｏ
    Ｈ、ＯＲ８、ＳＨ、ＳＲ８、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ９、Ｎ
    Ｈ２、ＮＨＲ８、ＮＲ８Ｒ１０、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ
    ３Ｒ９、ＳＲ１１、ＯＲ１１、ＣＦ３、ＮＨＲ１１およ
    びＮＲ８Ｒ１１（Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は前
    記の意味を有する）の中から選ばれた少なくとも１つの
    置換基により置換されたまたは置換されない基、 を表わす、または ３） Ｒ２とＲ３、Ｒ３とＲ４またはＲ４とＲ５は一緒
    に５〜８の炭素原子からなる飽和または不飽和の環状核
    を形成するか、またはＮ、ＯおよびＳの中から選ばれた
    ヘテロ原子の少なくとも１つを含むヘテロ環核を形成す
    る、あるいは ４） Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合しているフ
    ェニル核と一緒に多環核を、場合によりＮ、ＯおよびＳ
    の中から選ばれた１つまたは複数のヘテロ原子を含む縮
    合された３つの環に形成する、または ５） Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれらが結合しているフ
    ェニル核と多環核を、場合によりＮ、ＯおよびＳの中か
    ら選ばれた１つまたは複数のヘテロ原子を含む縮合され
    た３つの環に形成する、および ６） Ｒ６は −水素原子 −ハロゲン原子 −ＣＯＯＨ、 −ＣＯＯＲ９（Ｒ９は前記の意味を有する）、 −アルキル基で、ハロゲン原子、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯ
    Ｈ、ＣＯＯＲ９、ＯＲ８、ＳＲ８、ＳＯ３ＨおよびＳＯ
    ３Ｒ９（Ｒ８とＲ９は前記の意味を有する）の中から選
    ばれた少なくとも１つの置換基により置換されたまたは
    置換されない基を表わす、に相当するするクマリンの誘
    導体。
  2. 【請求項２】 Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくと
    も１つはＮＨ２、ＮＨＲ１１、ＮＨＲ８、ＮＲ
    ８Ｒ１１、ＳＨ、ＯＨ、ＳＲ１１、またはＯＲ１１（Ｒ
    ８およびＲ１１は請求項１において与えられた意味を有
    する）を表わす、請求項１に記載のクマリン誘導体。
  3. 【請求項３】 Ｒ４はＮＨ２、ＮＨＲ８、ＮＨＲ１１、
    ＳＨまたはＯＨを表わし、かつＲ２、Ｒ３およびＲ５は
    水素原子を表わす、請求項２に記載のクマリン誘導体。
  4. 【請求項４】 Ｒ４はＮＨ２、ＯＨまたは次式 【化３】 の基の中から選ばれた基を表わす、請求項３に記載の誘
    導体。
  5. 【請求項５】 Ｒ４はＮＨＲ１１、ＮＲ８Ｒ１１、ＳＲ
    １１またはＯＲ１１を表わす、請求項２に記載の誘導
    体。
  6. 【請求項６】 Ｒ４はＮＨＲ１１を表わし、そしてＲ
    １１は次式 【化４】 の基の中から選ばれた基である、請求項５に記載の誘導
    体。
  7. 【請求項７】 Ｒ１は（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＣＨ
    ３を、そしてＲ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は水素原子を
    表わす、請求項６に記載の誘導体。
  8. 【請求項８】 Ｒ１は（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＣＨ
    ３を、そしてＲ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は水素原子を
    表わす、請求項４に記載の誘導体。
  9. 【請求項９】 Ｒ６は水素原子を表わす、請求項１より
    ３までおよび５のいずれか１項に記載のクマリン誘導
    体。
  10. 【請求項１０】 Ｒ１は（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＣＨ３
    を表わす、請求項２，３および５のいずれか１項に記載
    のクマリン誘導体。
  11. 【請求項１１】 ｍは２に等しい、請求項１０に記載の
    クマリン誘導体。
  12. 【請求項１２】 Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なく
    とも１つはＮＨ２、ＮＨＲ８、ＮＲ８Ｒ１０、ＯＨ、Ｏ
    Ｒ８、ＳＨ、ＳＲ８または置換されたあるいは置換され
    ないアルキル基を表わす、請求項１に記載のクマリン誘
    導体。
  13. 【請求項１３】 Ｒ２、Ｒ３およびＲ４、あるいは
    Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それらが結合するフェニル核
    と共に、縮合された３つの環および窒素原子を含む多環
    核を形成する、請求項１に記載のクマリン誘導体。
  14. 【請求項１４】 一般式 【化５】 （式中、Ｒ１とＲ６は請求項１において与えられた意味
    を有し、そしてＲ１２はアルキル、アリールまたはシク
    ロアルキル基である）に相当するβ−ケトンエステル。
  15. 【請求項１５】 Ｒ６は水素原子である、請求項１４に
    記載のβ−ケトンエステル。
  16. 【請求項１６】 Ｒ１２は１〜４の炭素原子のアルキル
    基である、請求項１４と１５のいずれか１項に記載のβ
    −ケトンエステル。
  17. 【請求項１７】 Ｒ１２はエチル基である、請求項１６
    に記載のβ−ケトンエステル。
  18. 【請求項１８】 Ｒ１は一般式 −（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＣＨ２Ｒ７ （式中、Ｒ７は水素原子またはＣＯＯＲ９であり、かつ
    Ｒ９はベンジル基である）の基を表わす、請求項１４よ
    り１７までのいずれか１項に記載のβ−ケトンエステ
    ル。
  19. 【請求項１９】 次の段階、 １） 式Ｒ１−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ１は請求項
    １において与えられた意味を有する）の酸を該酸のイミ
    ダゾリドまたはクロリドに変換する、 ２） 該酸のイミダゾリドまたはクロリドを式、 【化６】 の環式エステルと反応させてアシル化誘導体を形成す
    る、および ３） 該アシル化誘導体を式Ｒ１２ＯＨのアルコールと
    反応させて式（ＩＩ）のβ−ケトンエステルを得る、 から成る、請求項１４より１８までのいずれか１項に記
    載の式（ＩＩ）のβ−ケトンエステルを製造する方法。
  20. 【請求項２０】 式 【化７】 のβ−ケトンエステルを式 【化８】 （上式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は前記
    の意味を有し、Ｒ１２はアルキル、アリールまたはシク
    ロアルキル基を表わす）のフェノールと反応させる、請
    求項１より１３までのいずれか１項に記載の式（１）の
    クマリン誘導体を製造する方法。
  21. 【請求項２１】 酵素の調剤を目的とする該酵素の基質
    を合成するための、請求項３，４および８のいずれか１
    項に記載のクマリン誘導体の使用
  22. 【請求項２２】 酵素の調剤の過程における酵素の基質
    としての、請求項５，６および７のいずれか１項に記載
    のクマリン誘導体の使用
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