JPH06504987A - 光活性化合物、それらの合成法および発蛍光団としての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 光活性化合物、それらの合成法および発蛍光団としての使用本発明は、生物学的 システム中に導入され且つそこで光線によって放出されることができる、フルオ レセインおよびローダミン染料を基剤とした新規の保護されたすなわち「ケージ 」有機化合物に関する。これらの光活性化合物すなわち光活性化しうる発蛍光団 は、タンパク質を標識する場合に用いるのに適している。

化合物の製造方法を更に記載する。

分子種に対する蛍光標識の結合による細胞性および他の生物学的システムの構造 および力学の研究は周知の且つ広範に用いられたアプローチである。近年報告さ れた技術は蛍光の光活性化および散逸（ＦＰＤ）である。この技術は最初にウェ ア（Ｗａｒｅ）らによってＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ修、リス、ニューヨ ークに記載された。ＦＰＤｉｆＩｉ定の基本的特徴は、最初は非蛍光性であるが 、適当な波長の短パルスの光に暴露された時に蛍光性になる分子標識の結合であ る。このような分子を光活性化しうる発蛍光団（ＰＡＦ）と称する。

クラフト（Ｋｒａｆｆｔ）ら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９８８＋　１ １０．３１０〜３０３に、二官能化フルオレセインを基剤とした光活性化しうる 発蛍光団化合物が記載されている。このような化合物の開発は、フルオレセイン が２種類の互変異性体、すなわち蛍光性キサンチン−３−オン型または非蛍光性 ラクトン型のどちらかとして存在しうるという事実に原因を発していた。化合物 は２個のフェノール性酸素のジアルキル化によって非蛍光性ラクトン互変異性体 で保持され、そのエーテル基の一方は、ラクトン構造の開環を引き起こして蛍光 性キサンチン−３−オン互変異性体を生じる光開裂反応に感受性である。

本発明は、一方において、電子吸引基をアミン基上に導入することによって芳香 族システム中の電子の非局在化を減少させることによりローダミンの蛍光が失わ れるということを示している。

ミッチソン（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ）、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｅｌｌ　 Ｂｉｏｌｏ　、上０９．１９８９．６３７〜６５２に、カルボキシフルオレセイ ンの誘導体の使用、クラフトら（前掲書中）の研究に基づくその合成法が記載さ れている。化合物は非蛍光性であるが、３６５　ｎｍの波長の光に対する暴露に よって蛍光型に変換することができる。この光活性化しうる蛍光プローブを球状 タンパク質チューブリンに共有結合させ且つ組織培養中の分裂細胞中に微量注射 した（そこにおいて、それは機能的紡錘体中に取り込まれた）。

上記にもかかわらず、クラフトらおよびミッチソンによって記載された化合物は 、合成の困難さを含むある種の欠点を有する。例えば、それらの製造方法では２ 個のフェノール性酸素の一方に対して単一の光感受性基を完全に置換させること ができないし、そしてこの結果として大規模なりロマトグラフィーによる精製が 必要となる。これは、光活性化しつる化合物中において１％程度の少量の遊離発 蛍光団の存在が、生物学的研究でのその有効な使用を厳重に制限するのに十分で あるという理由で重要な点である。クラフトらおよびミッチソンによって記載さ れた化合物は、更に、生物学的分子の標識付けを考える場合に重要な特性である 水への溶解度を相対的に欠いている。更に、クラフトらおよびミッチソンの化合 物はいずれもフルオレセインを基剤としている。光学的性質が異なる一定範囲の プローブが望ましいということは理解される。

したがって、光活性化しうる発蛍光団として用いるのに適当であり、そして結晶 性中間体を取り込む一層制御された合成法を有し、更に、改良された性質、例え ば、水への溶解度およびタンパク質の特定部位に結合する能力または親油性およ び脂質構造に対して結合する能力を有する更に別の化合物が必要である。

本発明はこのような化合物およびそれらの製造方法を提供することを探求してい る。

本発明により、下記の式（Ｉ）および（Ｉ　Ｉ）（式中、Ｘは、ＮＯ２基をオル ト位に有する、場合により置換したベンジル基であり、 Ｚは式 を有する基であり、 Ｒ，Ｒ’およびＹはそれそわ、場合により置換した基であり、Ｒ′は水素または アルキルであり、そしてｍおよびｎはそれぞれ１〜６の整数であり、ｑは１〜２ ０の整数である） を有する化合物およびそれらの塩を提供する。

基Ｒ，Ｒ’およびＹはそれぞれ場合により置換されており、これによって水への 可溶化およびタンパク質反応性機能を化合物中に導入することが可能になる。

当業者は、利用可能な様々な置換基および最終化合物に対して所望の性質または 特性を与えるものを選択するための基準を容易に理解する。例えば、基Ｒ，Ｒ’ およびＹは、カルボキシレート若しくはスルホネートなどのイオン化しつる官能 基でおよび／またはマレイミド、ハロアセテート若しくは反応性エステルなどの タンパク質標識に特異的な官能基で別個にすなわちそれぞれに置換した低級（０ １〜Ｃ６）アルキル鎖であることができる。構造（１）に示した多官能性側鎖は Δつのこのような例を表わす。Ｒ′は水素またはアルキルであり、最も典型的に は低級（０１〜Ｃ６）アルキルである。

化合物（１）および（Ｉ　＋）は光開裂可能であり且つ光活性化しうる発蛍光団 として有用である。発蛍光団が化合物（１）中にフルオレセインを含み且つ化合 物（Ｉ　Ｉ）中にローダミンを含むことは理解される。更に、置換基Ｚの側鎖の 同一性に応じて化合物（１）は十分な水への溶解度かまたは強親油性を示し、そ してこれは明らかにそれらの使用範囲に影響を与えるということが理解される。

本発明の特に好ましい光活性化しうる化合物は下記の式を有する。

本発明により、化合物（１）を製造する方法を更に提供し、それは下記の反応順 序を含む。

Ｎ） （リ　（２） （ｉｉ） （ｉ　ｉ　ｉ） （コ）（Ｓ） （ｉｖ） Ｃ９） 発蛍光団成分がローダミンである適当な別のアプローチにおいて、本発明は化合 物（Ｉ　Ｉ　Ｉ）を製造する方法を更に提供し、それは下記の反応順序を含む。

（ｉ） （ｉ　１） （１２）　（ｔ３） （ｖ） り且つ本発明のもう一つの態様である。

本発明の更にもう一つの態様は、化合物（７）を製造する方法であり、下記の反 応順序１で示した工程を含む。

÷赤四ｈｌレムｋｈ　／　Ｙ　Ｓわレバ／Ｔ　Ｔ）　ｒ謙止Ｉ列面比哨七ｉ−＋ １１デ置わ１ｈ不児”Ｆ３ＵＪｉ畠グ勿（１）εよひ（１ｋ）は尤開統■叱でゐ り、七して例λは、タンパク質および脂質構造の標識用に光活性化しうる発蛍光 団として用いられる。

例えば、それらを用いてタンパク質のシスティン側鎖の部分に標識することがで きる。このような標識されたタンパク質を生物学的システム中に導入し、そして その生物学的システムの現場で蛍光化合物を生成するように光活性化させる。続 いて蛍光シグナルの宿命にしたがう。微量注射技術などの導入を達成する方法は 周知であり、ここで詳細に説明する必要はない。

化合物の光分解に必要な条件は、慣用的な光開裂可能なオルト−ニトロベンジル 化合物の場合と同じである。波長が３００〜３５０ｎｍの光は、キセノンアーク フラッシュランプまたは３４７ｎｍ周波数の二重暗紅色レーザーによって生じる ことができるように、この目的に適している。フィルターを透過した（３００〜 ３５０ｎｍ）水銀またはキセノンアークランプ源からの長期間の暴露は、高時間 分解能が必要とされない場合に全く適切である。光活性化しつる発蛍光団は、生 物学的システム中の適当な空間的分解を達成するように顕微鏡を介して照射する ことができる。

このように、本発明は光活性化しつる発蛍光団として用いるのに適した一定範囲 の新規の化合物を提供し、そしてそれは新規の中間体化合物（７）の使用によっ て合成される。化合物は十分な水への溶解度を示し、典型的には、タンパク質分 子中のシスティン側鎖のチオール基との単純で且つ特異的な反応を有し且つそれ らの目的の使用に望ましい分光特性を有する。式（１）を有するある種の化合物 は極めて親油性であり、したがって脂質構造の標識付けで用いるのに適している 。それらを生成する方法は比較的完全であり、効率よく、そして十分な収量を生 じる。

本発明の化合物（１）および（Ｉ　Ｉ）は、生物学的研究での使用に関して設計 され、そして例えば、前述の蛍光の光活性化および散逸（ＦＰＤ）技術で用いる のに理想的に適している。理解されるように、いったん標識が生物学的システム 中に導入されたら、標識された分子、典型的にはタンパク質の移動および機能並 びに細胞システムの他の成分とのそれらの相互作用が引続き起こることが可能で ある。従来、発蛍光団で標識されたタンパク質が細胞内構造に特有の繊維状タン えば、有糸分裂）についての有用な情報を提供することができる。本発明の化合 物（Ｉ）および（Ｉ　Ｉ）により、蛍光標識を細胞中の局部的な点で放出するこ とができ、そして次に、標識されたタンパク質の宿命が時間の相関的要因として 引続き生じることができるという更に別の利点が存在する。これにより、細胞性 システムにおける空間的移動および拡散速度の研究が可能になる。

ここで、本発明の化合物および方法を下記の実施例によって更に例証する。実施 例１および３は本発明のケージフルオレセイン化合物の製法に関し；実施例２は この製法で用いた新規の中間体化合物の合成法を論及する。実施例４は、タンパ ク質チオールをケージフルオレセイン化合物で標識することを実証する。実施例 ５はローダミンを基剤とした化合物の製法を例証することを含み、アミンの一つ のアシル基がアセチルである化学のモデルを論及する（すなわち、それは電子吸 引によって蛍光を阻止するが光開裂可能ではない）。実施例６は本発明のケージ フルオレセイン化合物の合成に関し、それは極めて親油性である。

ルエーテルエステル（１）の加水分解によって製造した。例えば、熱アセトン（ １００ｍｌ）中に溶解したエーテルエステル（１；２ｇ）を１．２５Ｍ−ＮａＯ Ｈ（６０ｍｌ）で処理し、そしてその溶液を還流しながら１２分間加熱した後、 水（２００ｍｌ）に注加した。溶液を濃ＨＣＩで酸性にし、そして沈殿した固体 を濾過し、水で洗浄し、そしてエタノールから再結晶させてモノエーテル（２） を黄色結晶（０，８３ｇ、４６％）　、ｍ、ｐ、２０６〜７℃α鴬値１２０５℃ ）として得た。

この化合物の製法はクラフト、スットン（Ｓｕｔｔｏｎ）およびカミングズ（Ｃ ｕｍｍｆｎｇｓ）　２の方法に基づいた。たとえば、アリルエーテル（２；０、 ８０ｇ）の乾燥ベンゼン（１４，５ｍ１）および乾燥テトラヒド口フラン（４， ５ｍ１）中懸濁液を臭化２−ニトロベンジル（０，７４６ｇ）および酸化銀（１ ）（１，０２ｇ）で処理し且つ暗所中において還流しながら１６時間撹拌した。

混合物を冷却し、濾過し、そして酢酸エチルで沈殿を洗浄した。合わせた９３８ ５シリカゲル）によって精製した。生成物を含む両分を合わせ、溶媒を蒸発させ 、そして残留物をエーテルで摩砕して、生成物（３）を、酢酸エチル−石油エー テルからプレートとして晶出した無色固体（０，６８ｇ；６２％）、ｍ。

１）、１７１〜２℃として得た。償測値：Ｃ，７１，１，Ｈ，４，２，Ｎ。

２．７．Ｃ３ｏＨ２１Ｎ０４の計算値：Ｃ，７１，０，Ｈ，４，２，Ｎ、２．　 ８％）。

化合物を、対応するエチルエステルに関するストライヒャー（Ｓｔｒｅｔｃｈｅ ｒ）およびラインスハーゲン（Ｒｅｉｎｓｈａｇｅｎ）　３の方法の変法によっ て製造した。例えば、ｔ−プチルカルバゼート（５，２８ｇ）、ブロモ酢酸ｔ− ブチル（７，８０ｇ）およびトリエチルアミン（４，０６ｇ）の乾燥ベンゼン（ ４０ｍｌ）中溶液を還流しながら１６時間加熱し、冷却し、そして濾過した。濾 液を飽和ＮａＨＣＯａおよびブラインで洗浄し、乾燥させ、そして蒸発させた。

残留物を、ピルビン酸（４，４ｇ）を含むエタノール（８５ｍｌ）中に溶解させ 、そして４Ｍ−ＮａＯＡｃ　（１１，５ｍ１）を加えた。室温で１時間放置後、 混合物をエーテルで希釈し、飽和Ｎ　ａ　ＨＣＯａおよびブラインで洗浄し、乾 燥させ、そして蒸発させた。残留物を蒸留して生成物（４）を、放置状態で晶出 した無色粘稠液体（２，８ｇ；２８％）、ｍ、ｐ、４８〜９℃として生成した。

　Ｃ起測値：Ｃ，５４，Ｏ；Ｈ，９，３，Ｎ、１０．９５゜Ｃ１１Ｈ２２Ｎ２０ ４の計算値：Ｃ，５３，６；Ｈ，９，０；Ｎ、１１．　４％）。

Ｎ’−（ｔ−ブトキシカルボニルメチル’）　−Ｎ’　−（２−（２，５−ジヒ ドロ−２，５−ジオキソピロール−１−イル）アセチル）ヒドラジンカルボン酸 ｔ−ブチル［（６）但し、ｍ、ｎ＝１］ ２．５−ジヒドロ−２，５−ジオキソピロール−１−イル酢酸（８２１ｍｇ）の 塩化チオニル（１５，９ｍ１）中懸濁液を還流しながら０．５時間加熱し、そし て過剰の塩化チオニルを真空下で除去した。残留物を乾燥トルエンを用いて２回 蒸発させて、塩化２．５−ジヒドロ−２，５−ジオキソピロール−１−イルアセ チル［（５）但し、ｍ；１］を無色の、容易に加水分解される液体として得た。

（化合物はあまり好都合ではない経路５によって予め製造された）。粗製酸塩化 物を乾燥エーテル（２５ｍｌ）中に溶解させ、そしてヒドラジンカルボキシレー ト［（４）但し、ｎ＝１．　１．　３０ｇ］およびトリエチルアミン（５８８ｍ ｇ）の乾燥エーテル（２５ｍ　ｌ　）中氷冷溶液に滴加した。混合物を水浴中で １時間撹拌した後、酢酸エチルで希釈し、水、希ＨＣ１，飽和ＮａＨＣＯａおよ びブラインで洗浄し、乾燥させ、そして蒸発させた。残留物を酢酸エチル−石油 エーテルから結晶化して、化合物（６）を無色プレート（１，６７ｇ；８２％） 、ｍ、ｐ。

１５７〜９℃として生成した償測値：Ｃ，５３，１；Ｈ，６，７，Ｎ。

１０−　８−　Ｃ１７Ｈ２ｓ　Ｎ　ａ　Ｏ７の計算値：Ｃ，５３，２５，Ｈ，６ ，６，Ｎ。

１１．０％）。

化合物（６；　４００ｍｇ）をトリフルオロ酢酸（１，５ｍ１）中に溶解させ、 室温で１時間保持した。トリフルオロ酢酸を減圧下で蒸発させ、残留物を無水Ｈ Ｃ１のジオキサン（４ｍｌ）中２Ｍ溶液中に再溶解させた。無色結晶は数分後に 分離し始め、溶液を乾燥イソプロピルエーテル（１０ｍｌ）で希釈し、濾過し、 そしてイソプロピルエーテルで沈殿を洗浄し、そして乾燥させて、ジオキサン０ ．５当量の溶媒和を含む塩酸塩（７）を生成した（２５６ｍｇ、７９％）。

２−ニトロペンジノぼりルフルオレセイン（３；　５１ｍｇ）のＣＨ２ＣＨ２Ｃ １２（１０およびＭｅＯＨ（０，２ｍ１）中溶液を一５０℃まで冷却し、そして ｔ、１．　ｃ、分析（シリカゲル；酢酸エチル−石油エーテル１：１）によって 出発物質の完全な消耗を示されるまで（約３０分間）、オゾン化酸素流で処理し た。溶液を窒素でパージし、硫化ジメチル（０，１０ｍ１）で処理し、そして室 温まで１時間にわたって加温した後、更に１時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し 、水およびブラインで洗浄し、乾燥させ、そして蒸発させた。残留物をフラッシ ュクロマトグラフィー（酢酸エチル−揮発油１：１）によって精製してアルデヒ ド［（８）但し、Ｘ＝２−二トロベンジル］を、’Ｈ−ＮＭＲ分光分析法によっ て特性決定された淡色ガム（３６ｍｇ）としてを得た。この材料をジメチルホル ムアミド（０，２ｍ１）中に溶解し、そしてヒドラジド塩酸塩［（７）但し、ｍ 。

ｎ＝１　；２６ｍｇ］のＥｔＯＨ（０，３ｍ１）および２Ｍ−ＮａＯＡｃ（０， ０６ｍ１）中溶液で処理した。溶液を暗所において室温で２時間保持した後、酢 酸エチルで希釈し、そして１Ｍクエン酸およびブラインで洗浄し、乾燥させ、そ して蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル−メタノ ール−酢酸９５：５：０．５）によって精製して、生成物（９）を、ＩＨ−ＮＭ Ｒによって特性決定された淡色ガム（２４ｍｇ）として生成した。材料をＥｔＯ Ａｃ中の希溶液として暗所において４℃で貯蔵した。

マレイミド基に対する２−メルカプトエチルスルホネートの付加後、光分解の量 子収量は０．６５（照射３００〜３５０ｎｍ）であり、発蛍光団の放出速度は７ Ｓ−１であり、双方の測定値はｐＨ７，０および２２℃においてであった。

実施例４ タンパク質チオールのケージフルオレセイン−マレイミド（９）による標識ミオ シン軽鎖−１（ＬＣ−１）を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ／２ｍＭ　ＥＤＴＡ／２ｍ ＭジチオトレイトールのｐＨ７，５の溶液中に１ｍｇ／ｍｌで溶解させ、そして １５分間保持した後、１０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ／２ｍＭ　ＥＤＴＡ／２ｍＭアスコ ルビン酸塩、ｐＨ６，５に対して２時間透析した。一つのアリコートＡ（１ｍｌ ）を、４００ｍＭリン酸ナトリウム／２ｍＭアスコルビン酸塩／８ｍＭＮ−エチ ルマレイミドを含む溶液、ｐＨ７，５のアリコート（０，１０ｍ１）で処理し、 そして室温で２０分間インキュベートした。もう一つのアリコートＢ（１ｍｌ） を、４００ｍＭリン酸ナトリウム／２ｍＭアスコルビン酸塩を含む溶液、ｐＨ７ ，５のアリコート（０，１０ｍ１）で処理した直後に、インキュベートＡおよび Ｂを、８ｍＭケージフルオレセイン−マレイミド［（９）但し、Ｘ＝２−二トロ ベンジル、ｆｆＬ　ｎ＝１］のジメチルホルムアミド中溶液のアリコート（０， １０ｍ１）で処理した。各溶液を暗所において室温で３０分間保持した後、１０ ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５中の４０ｍＭメルカプトエタノールのアリコー ト（５０μ）を加えることによって過剰の試薬を急冷した。各インキュベートを 暗所において１０ｍＭ）リス−ＨＣ１，ｐＨ７，５に対して２時間透析し、そし て同１衝液中においてセファデックス（ＳｅｐｈａｄｅＡ　Ｇ５０　（乾燥重量 １ｇ）上でゲル濾過を行った。タンパク質を含む画分をプールし、そしてフルオ レセインの最大放出が観察されるまで（１００Ｗランプで約３０秒間）アリコー トに照射した（３００〜３５０　ｎｍ波長バンド）。照射された溶液を５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲル電気泳動（標識タンパク質的２μｇ／トラック）によっ て分析し、そしてそのゲルを紫外線照明下で写真に撮って蛍光バンドを検出した 。引続きのクーマシーブル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）による染色によ り、ミオシン軽鎖−１の位置が確認された。図１はその実験結果を示し且つ遊離 染料、すなわち、タンパク質に共有結合していないし且つ電気泳動実験中に解離 する遊離染料の有意の量の存在を示す。モノ（Ｍｏｎｏ）Ｑカラム（ファーマシ ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））上でのｆ、ｐ、１．　ｃ、によるケージフルオレセ イン標識タンパク質の更に別の処理により、上記のように分析した場合に非共有 結合染料を完全に含まない画分が得られた。

非対称ローダミンの合成は、長期間に達成された方法、例えば、参考文献６およ びその論及にしたがった。３−アミノフェノール（０，５７ｇ）　、２−　（２ −ヒドロキシ−４−ジエチルアミノベンゾイル）安息香酸（１，５ｇ）および濃 硫酸（９ｍｌ）の混合物を１０５℃で４時間加熱し、冷却し、そしてＫＯＨ（１ ８，９ｇ）の水（５０ｍｌ）中氷冷溶液に徐々に注加した。溶液を希ＫＯＨでｐ Ｈ２〜３に調整し、沈殿を真空中で濾過し且つ乾燥させた。乾燥固体をＭｅｏＨ 中に溶解させ、無機塩から濾過し、そして蒸発させて、粗製ローダミン（１０） が暗色固体（１，９２ｇ、１０７％）として残った。この材料をＭ　ｅ　ＯＨ（ ２０ｍｌ）中に溶解させ、塩化水素を溶液中に２０分間、続いて溶液を６０℃で 加熱しながら更に３時間通気した。溶液を約７ｍｌまで濃縮し、水で希釈し、（ １１）を暗色固体（２，２ｇ；１０５％）として生成した、λｍａｘ５３１．５ ｎｍ（ε６６．３００）。

３−アミノ−６−ジニチルアミノー９−（２−メトキシカルボニルフェニル）キ サンチン（１５） この化合物の製法は、センスイ（Ｓｅｎｓｕｉ）、ゴング（Ｇｏｎｄａ）および オバタ（Ｏｂａｒａ）７の方法に基づいた。例えば、粗製エステル（１１）の一 部分（０，５０ｇ）をＭｅＯＨ（２５ｍｌ）中に溶解させ、そして水素化ホウ素 ナトリウムを、最初の暗赤色が消色するまで少量ずつ２時間にわたって加えた発 させて、ｔ、１．ｃ、（シリカゲル；ベンゼン）においてキサンチン（１５）の 存在を無色スポット、Ｒ約０．５として示す淡色ガム（３５５ｍｇ）を残し、そ れは光および空気に対する暴露によって急速に赤変した。

３−アセトアミノ−６−ジニチルアミノー９−（２−メトキシカルボニルフェニ ル）キサンチン（１６） アミノキサンチン（１５；　１７５ｍｇ）をＣＨＣｌ３中に溶解させ且つトリエ チルアミン（４５０ｍｇ）および塩化アセチル（１７５ｍｇ）で処理した。溶液 を室温で１時間撹拌し、蒸発乾固させ、そして最初に非極性不純物を溶離する酢 酸エチル−揮発油（３：　５）を用い、次にアセチル化生成物（１６）を淡桃色 泡（１０２ｍｇ；５２％）として生成した後に溶媒を除去するクロロホルムを用 ｔ＋）るフラッシュクロマトグラフィーによって主要な成分を単離した。生成物 の構造を確証した’ＨＮＭＲスペクトルの具体的な特徴はδ６．　１１　（ｓ、 ＬＨ，Ｈ−９）および２．　０９　（ｓ、３Ｈ，アセチル）でのシグナルであっ た。

類似の化合物は、クロロギ酸２−ニトロベンジルまたはクロロギ酸１−（２−ニ トロフェニル）エチルを塩化アセチルの代わりに用いた場合に得られた。

テトラクロロベンゾキノン酸化によるこの化合物の製法は、センスイ、ゴングお よびオバタ７の方法に基づいた。アセトアミノ化合物（１６：　１００ｍｇ）を 氷酢酸（０，５ｍ１）中に溶解させ、テトラクロロベンゾキノン（１００ｍｇ； １．８当量）を加えた。溶液の色は直ちに深赤色に変わった。クロロホルム（３ ｍｌ）を加え、溶液を室温で１時間撹拌した後、クロロホルムで更に希釈し、そ して飽和ＮａＨＣＯａで洗浄し、乾燥させ、そして蒸発させた。残留物を、非極 性成分を溶離するＣＨＣｌ　−ＥｔＯＨの２０：１で、次に、ＣＨＣｌ３−Ｅｔ ０Ｈの１０：１および４：１でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し て、深赤色固体（７８ｍｇ）として得られた生成物（１７）を溶離した。

２．４０）は、還元された前駆体（１６）でのその位置と比較したところ、提案 された構造と一致した。

反応順序２（１７） 化合物（１１）［Ｒ，Ｒ’　、Ｒ’　＝Ｅｔ、Ｙ＝Ｈ］および（１７）の相対蛍 光強度は約５７＝１であった。

実施例６ ３’　−〇−（２−二トロベンジル）　−６’　−０−（３，４−ジアザ−５− オキソエイニス−２−エン−１−イル）フルオレセイン（１８）アルデヒド（８ ）を、実施例３で記載したように、２−ニトロベンジルアリルフルオレセイン（ ３；５１ｍｇ）のオゾン分解によって製造し、そしてパルミチンヒドラジド（４ ０ｍｇ、カーティアス（Ｃｕｒｔｉｕｓ）およびデルシャフト（Ｄｅｌｌｓｃｈ ａｆｔ）　８によって記載されたように製造された）のエタノール（０，９ｍ１ ）およびテトラヒドロフラン（０，３ｍ１）中溶液と混合した。

溶液を還流しながら１時間加熱し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物をフラツ 定された無色ガラス（４６ｍｇ）として得た。

生成物は下記の式を有する。

これは、極めて親油性のケージフルオレセイン化合物であり且つ脂質二重層また は他の脂質構造を標識する場合に用いるのに適している。

１、Ｃ，Ｄ、ハード（Ｈｕｒｄ）およびり、シュマーリング（Ｓｃｈｍｅｒｌｉ ｎｇ）、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９３７．旦旦。

１１３゜ ２、Ｇ、Ａ、　クラフト（Ｋｒａ　ｆ　ｆ　ｔ）　、　Ｗ、　Ｒ，スットン（Ｓ ｕｔｔｏｎ）およびＲ，Ｔ、カミングズ（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ）、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈ ｅｍ、Ｓｏｃ。

、１９８８．１１０，３０１゜ ３、Ｗ、ストライヒャ−（Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ）およびＨ，ラインスハーゲン（ Ｒｅｉｎｓｈａｇｅｎ）、Ｃｈｅｍ、Ｂｅｒ、、１９７５．１０８，８１３゜４ 、Ｄ、Ｈ，リッチ（Ｒｉｃｈ）、Ｐ、Ｄ、ゲゼルヒエン（Ｇｅｓｅｌ　１ｃｈｅ ｎ）、Ａ、）ング（Ｔｏｎｇ）、Ａ、チューン（Ｃｈ　ｕ　ｅ　ｎ　ｇ）および Ｇ、　Ｋ、プフナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）、ＪｌＭｅｄ。

Ｃｈｅｍ、、１９７５，１８．１００４゜５、Ｌ、ボール（Ｐａｕｌ）、Ａ、デ ィトｖ　−（Ｄ　ｉ　ｔ　ｔｍａ　ｒ）およびＧ。

ラッシュ（Ｒｕｓｃｈ）、Ｃｈｅｍ、Ｂｅｒ、、１９６７．１００，２７５７゜ ６、Ｃ，Ｄ、リッチ−（Ｒｉｔｃｈｉｅ）、Ｊ、Ａ、ウニニガー（Ｗｅｎｎ　ｉ 　ｇｅ　ｒ）およびＪ、Ｈ，ジジーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、Ｊ、Ａｓｓ。

Ｏｆｆ、Ａ　ｒｉｃ、Ｃｈｅｍ、、１９５９．４２，７２０゜７、Ｈ，センスイ （Ｓｅｎｓｕｉ）　、Ｍ、ゴング（Ｇｏｎｄａ）およびＴ。

オバタ（Ｏｂａｒａ）、欧州特許出願第１８４１１４号明細書。

８、Ｔ、カーティアス（Ｃｕｒｔｉｕｓ）およびＦ、　Ｈ，デルシャフト（Ｄｅ ｌｌｓｃｈａｆｔ）、Ｊ、Ｐｒａｋｔ、Ｃｈｅｍ、、１９０１．６４，４１９゜ 図１に対する指針 列２および７は等質量のタンパク質を含むが、列２のＬＣ−１…例４でのインキ ュベートＡ）は、ケージフルオレセイン−マレイミドでの処理の前にＮ−エチル マレイミドで予め処理された。列７のＬＣ−１はインキュベートＢから誘導さｔ ｘケージフルオレセインの特異的取り込みを示す。標識タンパク質において記載 したように、調製試料は電気泳動の前に照射されてケージ種の蛍光を放出し、そ してゲルを紫外線照射下で写真に撮って、蛍光種を可視化した。

、　、ｋＰＣＴ／ＧＢ　９１１０１９４１国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）▲数式、化学式、表等があります▼（ ＩＩ）（式中、Ｘは、ＮＯ２基をオルト位に有する、場合により置換したベンジ ル基であり、 Ｚは式 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼を 有する基であり、 Ｒ，Ｒ′およびＹはそれぞれ、場合により置換した基であり、Ｒ′′は水素また はアルキルであり、 ｍおよびｎはそれぞれ１〜６の整数であり、そしてｑは１〜２０の整数である） の一方を有する化合物およびそれらの塩。 ２．基Ｒ，Ｒ′およびＹの一つまたはそれ以上が、化合物に対して水への可溶化 および／またはタンパク質反応性機能を与える置換基を有する請求項１に記載の 化合物。 ３．基Ｒ，Ｒ′およびＹの一つまたはそれ以上が、イオン化しうる官能基でおよ び／またはタンパク質標識に特異的な官能基で別個にすなわちそれぞれに置換し たＣ１〜Ｃ６アルキル鎖である請求項１または請求項２に記載の化合物。 ４．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項１に記載の化合物。 ５．下記の反応順序 （ｉ）▲数式、化学式、表等があります▼（１）→▲数式、化学式、表等があり ます▼（２）（ｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼（２）→▲数式、化学 式、表等があります▼（３）（ｉｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼（３ ）→▲数式、化学式、表等があります▼（４）（ｉｖ）▲数式、化学式、表等が あります▼（６）▲数式、化学式、表等があります▼（７）↓▲数式、化学式、 表等があります▼（９）（式中、Ｘは、ＮＯ２基をオルト位に有する、場合によ り置換したベンジル基であり、そして ｍおよびｎはそれぞれ１〜６の整数である）を含み、請求項１に記載の化合物（ Ｉ）およびその塩を製造する方法。 ６．下記の反応順序 （ｉ）▲数式、化学式、表等があります▼→▲数式、化学式、表等があります▼ （１０）（ｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼（１０）→▲数式、化学式 、表等があります▼（１１）（ｉｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼（１ １）→▲数式、化学式、表等があります▼（１２）（ｉｖ）▲数式、化学式、表 等があります▼（１２）→▲数式、化学式、表等があります▼（１３）（ｖ）▲ 数式、化学式、表等があります▼（１３）→▲数式、化学式、表等があります▼ （１４）（式中、Ｘは、ＮＯ２基をオルト位に有する、場合により置換したベン ジル基であり、 Ｒ，Ｒ′およびＹはそれぞれ、場合により置換した基であり、Ｒ′′は水素また はアルキルであり、そしてｍおよびｎはそれぞれ１〜６の整数である）を含み、 請求項１に記載の化合物（ＩＩ）およびその塩を製造する方法。 ７．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（７）（式中、ｍおよびｎはそれぞれ１〜６ の整数である）を有する化合物。 ８．下記の反応順序 ▲数式、化学式、表等があります▼ ｉ▲数式、化学式、表等があります▼（４）→▲数式、化学式、表等があります ▼（５）↓ ▲数式、化学式、表等があります▼（７）←ｉｉ▲数式、化学式、表等がありま す▼（６）試薬：（ｉ）Ｅｔ３Ｎ／ベンゼン／ 熱；（ｉｉ）Ｅｔ３Ｎ／Ｅｔ２Ｏ／０°；（ｉｉｉ）ＣＦ３ＣＯ２Ｈ；（ｉｖ） ＨＣＩ／ジオキサン反応順序１ を含む請求項７に記載の化合物を製造する方法。 ９．請求項１に記載の化合物の光活性化しうる発蛍光団としての使用。 １０．請求項１に記載の化合物の使用を含む、タンパク質の配向、構造または移 動を研究しまたは決定する方法。