CS196314B2 - Process for preparing new chromogenous substrates specific especially for thrombine - Google Patents

Process for preparing new chromogenous substrates specific especially for thrombine Download PDF

Info

Publication number
CS196314B2
CS196314B2 CS764544A CS454476A CS196314B2 CS 196314 B2 CS196314 B2 CS 196314B2 CS 764544 A CS764544 A CS 764544A CS 454476 A CS454476 A CS 454476A CS 196314 B2 CS196314 B2 CS 196314B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
group
substrate
arg
reaction
product
Prior art date
Application number
CS764544A
Other languages
English (en)
Inventor
Ekenstam Bo T Af
Leif E Aurell
Karl G Claeson
Birgitta G Karlsson
Original Assignee
Kabi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Ab filed Critical Kabi Ab
Publication of CS196314B2 publication Critical patent/CS196314B2/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/064—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for omega-amino or -guanidino functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/30—Naphthyl amides, e.g. beta-NA, 2-NA, 4-methoxy-beta-naphthylamine, i.e. 4MNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových chromogenních substrátů pro thrombin - -a obdobné enzymy. Substráty, ' vyrobené způsobem podle vynálezu jsou zvláště vhodné pro kvantitativní stanovení thrombinu nebo pro výzkum reakcí, při nichž thrombin 'vzniká, je inhibován nebo se spotřebovává, ' nebo pro stanovení faktorů, - které mají vliv nebo se účastní těchto reakcí, například pro stanovení antithrombinu, prothrombinu a heparinu.
Syntetické substráty pro stanovení enzymu mají velké výhody ve srovnání se substráty přírodními za - předpokladu, že jsou splněny určité podmínky, jako- dobrá citlivost a dobrá specifičnost pro enzym, rozpustnost ve vodě nebo v biologické kapalině, v níž se zkouška provádí a snadná zjistitelnost některých štěpných produktů.
Jeden z -dosud nejlepších substrátů - pro stanovení thrombinu je popsán ve švédském patentu - č. - 380 257 a sestává z chromogenního tripeptidového derivátu vzorce A
Bz—Phe—Val—Arg—ipNA (S-2180)
..... (A).
Vy^'^í^1tl.ení použitých zkratek aminokyselin a dalších -zkratek bude dále uvedeno.
Tento - substrát má velkou citlivost pro thrombin - a - při enzymatické- hydrolýze poskytuje jako chromoforní produkt - -p-nitroanilin, který je možno snadno stanovit spektrofotometricky. Substrát S-2160 má však určité omezení vzhledem ke své - poměrně nízké rozpustnosti 1 mg/ml. Tato nízká rozpustnost má tu nevýhodu, - že je nutno pracovat velmi blízko - hranice nasycení pro substrát, aby bylo možno dosáhnout dostatečné koncentrace substrátu. V těchto případech může dojít při stanovení enzymu v různých - - biologických systémech ke vzniku sraženiny substrátu jako takového nebo ke vzniku sraženiny komplexu bílkoviny a substrátu. Tyto - sraženiny jsou příčinou chybného odečtení spektrofotometrických hodnot a -tím i chybného stanovení enzymu. Substrát S-2160 je podstatně rozpustnější, nahradí-li se benzoylová skupina atomem vodíku za vzniku sloučeniny B
H—Phe—Val—Arg—pNA (B).
Tímto způsobem uvolněná protonizovaná aminoskupina na Phe zvyšuje rozpustnost, avšak současně přibližně 30x snižuje rychlost, při níž štěpí thrombin substrát. Tyto skutečnosti jsou uvedeny v tabulce I. Mimoto existuje ještě možnost, že substrát mů186314 že být ve zkou-maném-biologickém roztoku nežádoucím způsobem - rozložen - na N-terminálním konci působením aminopeptidáz.
Způsobem podle vynálezu je substrát vzorce B dále modifikován tak, žé· se Val nahradí cyklickou iminokysellnou (Aze, Pro nebo Pip) a současně se L—Phe nahradí D—Phe. Jak bylo možno očekávat, jsou takto získané substráty velmi rozpustné, zcela neočekávaně však stoupá nebo alespoň neklesá aktivita k thrombinu, která je obvykle 30 až 5x vyšší než aktivita ·pro odpoví dající substrát, který· obsahuje pouze L-aminokyseliny, jak - je. rovněž . uvedeno .-v tabulce I. Mimoto jsou nové. substráty · přibližně o . 4Q0 % . citlivější než - S-2160. D-aminokyseliria na- N-terminálním konci chrání substrát · · před nežádoucím - rozložením působením aminopeptidáz, protože tyto enzymy jsou specifické pro L-aminokyseliny.
•Předmětem vynálezu - je tedy - způsob výroby · chromogenních - substrátů, · specifických zejména pro . thrombin, - pro diagnostické účely s obecným· vzorcem
kde .
Ri · znamená · atom vodíku . . . nebo . -hydroxy- . skupinu,
Rz znamená nitrofenyl, naftyl, nitronaftyl, methoxynaftyl, chinolyl nebo nitrochinolyl a n znamená - celé - číslo 1, 2 nebo - 3, dále také farmaceuticky přijatelných solí těchto sloučenin, vyznačující se tím, že se postupně provádí reakce aminokyselin s C-terminálním arginylovým zbytkem, který je popřípadě · ·již ·· opatřen -.-chrpmoforní skupinou R2, ·· ktéfá·· · současně . chrání -- karboxylovou skupinu, · nebo s · C-terminálním arginylovým zbytkem· opatřeným· odštěpitelnou ochrannou skupinou na karboxylové- · skupině, dále se na· chráněný tripeptidový - derivát · - naváže chromoforní · skupina ‘ - Rz, -popřípadě se - · syntetizuje · N-termináiní · dipeptidový - fragment, který se pak -.váže . na arginylovou skupinu, popřípadě - · již opatřenou · chromoforní - skupinou Rz, potom se takto získaný produkt čistí filtrací na gelu·. .-a popřípadě . ještě chromatografií- - na iontoměniči.
Při · syntéze nových- · - - chromogenních substrátů je možno· užít - · běžně · užívaných - ochranných · skupin a reakčních · · metod, · tak jak· se · užívají v - chemii . peptidů. ;
Jako ochranná · skupina na · tf-aminoskupině je · výhodná zejména karboxybenzoxyskupina nebo p-butyloxykarbonylová . skupina nebo jiná obdobná skupina příbuzné povahy, jako p-methox.yskupina, p-nitroskupina nebo p-methoxyfenylazokarbobenzoxyskupina.
Jako ochranná skupina pro á-guanidovou skupinu arginilové skupiny-je výhodná. . pro-. tonizace, skupina NOz- - -nebo p-toluensulfonylová skupina.
K ochraně hydroxyskupiny tyrosinového zbytku se . s výhodou užije t-butyl nebo benzyl. Jako· odštěpitelná skupina, chránící karboxylovou.....skupinu, se s výhodou užije methylester, ethylester nebo benzylester.
Reakce mezi dvěma aminokyselinami nebo mezi dipeptidem a aminokyselinou se provádí aktivací α-karboxylové skupiny. Aktivovaný derivát se . izoluje nebo se vytváří přímo· v reakční směsi. Jde například o p-nitrofenylester, trichlorfenylester, pentachlorfenylester nebo N-hydroxysukcinimidester, symetrický nebo asymetrický anhydrid, kyselý · .azid - nebo .. -Nih.ydroxybenzotriazolester.- . .· ·’
Syntéza- .se· provádí . tak, . že - se - postupně provádí reakce aminoskupin · s C-terminálním- arginylovým zbytkem, který je popřípadě - již. - opatřen . chromoforní skupinqu,· která . - současně· . chrání karboxylovou skupinu,· nebo 'je tento konec - opatřen odštěpitelnou ochrannou . skupinou- . na - karboxylové · skupině a chromoforní skupina - se váže . -na chráněný tripeptidový derivát, nebo . se syntetizuje. - Nfterminální · dipeptidový fragment . jako takový . a tento fragment se - - pak váže - na arginylovou skupinu, popřípadě - již -opatřenou chromoforní skupinou, tak . - jak - bylo shora - uvedeno.
Nezávisle na reakčním způsobu - se -meziprodukt i . výsledné - produkty čistí - filtrací na. gelu,., protože tento způsob čištění umožňuje . rychlé provádění - - reakce· a zajišťuje maximální výtěžky.
Eluáty po gelové filtraci se analyzují chromatografií na tenké . vrstvě, stejným. .- .způsobem je možno- analyzovat i částečně- odpařené nebo usušené výsledné produkty, a meziprodukty.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady. ..... .....
V následující tabulce budou uvedeny -užité·;. · zkratky: aminokyselin, u . nichž . jde-. . o - L196314
-formy, není-11 jinak uvedeno, a další zkratky: . .
Zkratky:
Arg = arginin
Aze.. = kyselina 2-azetidinkarboxylová
Phe = fenylalanín
Plp - kyselina plpekollnová
Pro = prolin
Val valin
AcOH = kyselina octová
Bz ''= benzoyl
Cbo- = karbobenzoxyskupina
DMF = dimethylformamid
Et3N = triethylamin
EtOAc = ethylacetát
HMPTA = triamid kyseliny N,N,N‘,N‘,N“,N“-hexamethylfosfo- < řečné
GPC = gelová filtrace
MeOH - methanol
-QpNP = p-nitrofenoxyskupina
-pNA = p-nitronilid
TLC = chromatografie na tenké vrstvě.
Chromatografie na tenké vrstvě;
Pro tento typ chromatografie byly užity předem připravené hladké desky silikagelu Fž54 (Merck] jako absorpční, materiál. Bylo užito těchto rozpouštědel:
• “Pí: čhlóroform : MeOH 9 :1 (objemový poměr)
A: n-butanol: AcOH : voda 3:2:1 (objemový poměr) . ; v
Po skončené chromatografií se deska prohlíží v ultrafialovém světle při 254 rim a pak se vyvíjí postupně reakčním činidlem, sestávajícím z chloru a o-toluidiňú běžným způsobem. V případě, že se uvádí, že produkt byl homogenní při chromatografii na tenké vrstvě, znamená to, že analýza byla prováděna na mikrogřamovém množství. Uvedené hodnoty Rf jsou výsledky z oddělených chromatografických stanovení.
Gel Sephadex<R) G-15, užitý pro filtraci na gelu je dextranový gel. s příčnými můstky. Gel Sephadex,R) LH-20 je hydroxypropylovaný dextranový gél s příčnými můstky. Iontoměnič Sephadex(R) QAE-25 je dextranový gel s příčnými můstky a s diethýl-(2-hydroxypropyl ] aminoethylovou funkční skupinou. Všechny tyto přípravky byly získány od Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,'Švédsko.
Metody pro syntézu
I. CbOA^Al’g. (N02) pNA'. í' \ '
35,3 g (10 inmolů) bezvodého Cbo—-Arg(NOzj-^-OH se rozpustí ve 200 ml bezvodé6 ho, čerstvě destilovaného HMPTA při teplotě místnosti, načež se za stálého míchání a nepřístupu vody přidá 10,1 g (100 ínmolů) Et3N a 24,6 g (150 mmolů) p-nitrofenylisokyanátu. Po reakční době 24 hodin se rozto.k vlije do 2 litrů 2% roztoku hydrogenkarbonátu sodného za stálého míchání. Vytvořená sraženina se oddělí filtrací, promyje se 2% roztokem hydrogenkarbonátu, vodou, 0,5 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a vodou,‘načež se vysuší. Surový produkt se extrahuje teplým methanolem a nerozpustný podíl se oddělí filtrací. Filtrát se čistí chromatografií na sloupci přípravku Sephadex,R> LH-20 v methanolu, к elucl se rovněž užije methanolu. Výtěžek je 29,8 g (63 %).
Analýza: produkt je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě při použití Pi (Rf: 0,34). ··'··: , ' [ajp24 ; 20,5° (c - 1,9, DMF)
II. Cbo—Pro—Arg(NOž)—pNa
4,8 g (10 mmolů) Cbo—Arg(NOž)—pNa se uvede v suspenzi ve 25 ml bezvodé kyseliny octové, potom se přidá 15 ml 5,6 N HBr v kyselině octové. Po reakční době 50 minut při teplotě místnosti se roztok vlije za' energického míchání do 300 ml bezvodého. étheru. Etherická fáze se zfiltruje za odsávání a- získaná sraženina se promyje 2x 100 ml etheru. Takto získaný HBr.H— —Arg(NOr)-rpNa se suší ve vakuu na NaOH při teplotě 43 °C Í6 hodin, načež se rozpustí ve 25 ml dimethylformamidu a vzniklý roztok sé zchladí na —10 °C. Pak.se přidá triethylamin v množství dostatečném к tomu, aby byl indikátorový papírek na pH těsně nad povrchem stále zvlhčen a reakce aby byla : slabě zásaditá. Toto množství je obvykle 1,9 ml. Sraženina komplexu tríethylaminu a bromovodíku se oddělí filtrací a přidá se 4,1 g (11 mmolů) Cbo— —Pro—lOpNP. Po-další hodině se přidá ještě 0,7 ml tríethylaminu a po dalších 4 hodinách', se'znovu přidá totéž množství triethylaminu. Roztok se pak neChá přes noc zteplat na teplotu místnosti. Aby bylo možno zabránit tomu, že přebytek Cbo—Pro— —OpNP znečistí výsledný produkt při gelové' ‘ filtraci vzhledem к obdobnému elučnímu objemu, přidá se do použitého systému 0,5 ml (5 mmolů) n-butylaminu. Po 30 minutách še přidá 10 mmolů zředěného roztoku kyseliny chlorovodíkové, reakční směs se odpaří na rotační odparce, pak se smísí s dvojnásobným množstvím vody, načež se voda slije. Zbytek se rozpustí v methanolu a chromatografuje se na sloupci přípravku Sephadex(R) LH-20, nabob.tiwléip V methanoluyT.elučníni činidlem je- j r Bj®ěž! methanol. Zfekaný produkt byl homogenní při chromatografii na tenké vrstvě.
Výtěžek: 5,5 g (96 %).
Analýza: chromatografie na tenké vrstvě při použití Pi (Rf = 0,28).
[a)D24 _330o (c = 1,0, DMF).
III. Cbo—Pip—Arg(NO2)—pNA
Způsob se provádí obdobně jako - způsob II. ......
Výtěžek: 5,1 g (86 %).
Analýza: produkt ' byl homogenní při chromatografii na tenké vrstvě v Pi (Rf: 0,30). [a]D24 -28,2° (c = 1,0, DMF).
IV. Cbo—Phe—Pip—Arg(NO2)—pNA
2,9 g (5 mmolů) - Cbo—Pip—Arg (NO2) — —pNA -se dekarbobenzoxyluje v HBr v kyselině octové, vysráží a - promyje etherem a zbaví' vody způsobem podle reakce- II. HBr—H—Pip—Arg(NO2)—pNA se pak rozpustí v 15 ml 'dimethylformamidu. Roztok sě zchladí na —10 °C, slabě se alkalizuje 0,9 ml triethylamlnu a zfiltruje. - Pak se přidá 3,0 g (7,15 mmolů) Cbo—Phe—OpNP a ještě 0,65 g - (5 mmolů) N-hydroxybenzotriazolu jako katalyzátoru. Po 1 hodině se přidá dalších 0,35 ml triethylaminu a totéž ' se opakuje po dalších 4 hodinách. Reakční roztok se nechá zteplat - přes noc na teplotu místnosti. Roztok -se odpaří do sucha na rotační odparce. Odparek -se - rozpustí v ethylacetátu a smísí s 2% ' roztokem hydrogenkarbonátu sodného ve vodě a pak se odpaří. Odparek se - rozpustí v methanolu a chromatografuje se na přípravku ' - Sephadex(R) LH-20 v methanolu, elučním činidlem je rovněž méthanol. Získaný produkt - je homogenní - - při chromatografii na tenké vrstvě.
Výtěžek: 2,7 g (73%).
Analýza: chromatografii na tenké vrstvě při použití Pi (Rf: 0,35).
[«]d24 '—32,9° (c = 1,0, DMF).
V. Cbo—D—Phe—Plp—Arg(NO2) —pNa
Postup- se provádí obdobným způsobem jako -reakční schéma - IV.
Výtěžek: 2,6 g (70%).
Analýza: produkt je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě při použití - Pi (Rf: 0,44).
(a)D24 —38,4° (c = 1,0, - DMF).
VI. Cbo—Phe—Pro—ArgfNOz) — pNA
Postup se provádí ' obdobným - způsobem jako reakční schéma IV.
Výtěžek: 2,9 g (80%). . ---Analýza: - produkt je homogenní při -'chromatografii na tenké - ' vrstvě - - - - při - -použití- Pi (Rf: 0,38).
[«]d24 —39,2° (c = 1,0, DMF).
VII. Cbo—D—Phe—Pro—Arg(NO2)—pNA
Postup se provádí obdobným způsobem jako reakční schéma IV.
Výtěžek: 3,1 g - (86%).
Analýza: ' - produkt je homogenní při - chromatografii na tenké vrstvě - při použití Pi (Rf: 0,46).
[«]Ό2ΐ_6β2° (c = 1,0, DMF).
VIII. H—D—Phe—Pro—Afg—pNA . 2HC1
175 mg (0,246 mmolů) - Cbo—D—Phe— —Pro—Arg(NO2)—pNA -se zbaví ochranné skupiny reakcí s 5 ml bezvodého fluorovodíku v přítomnosti 0,3 ml anisolu v přístroji podle Sakaklbary, ' sestrojeném k tomuto účelu na dobu 60 minut -při teplotě'' 0°C. ' Po skončené reakci a po odďestilování veškerého fluorovodíku ' se surový ' - produkt -čistí ve. dvou stupních:
a) Provádí se filtrace ha sloupci gelu Sephadex,R) G-15 po nabobtnání ve- 33%roztoku - kyseliny - octové ve vodě, přičemž téhož prostředí se užije k - rozpuštění produktu i - k eluci. Čistý produkt se -pak lyofilizuje z vodného roztoku - kyseliny ' octové.
b) - Provádí 'se chromatografie na - sloupci iontoměniče Sephadex(R> QAE-25 v chloridové formě po nabobtnání ve směsi methanolu a vody v poměru- 95 :5, téhož prostředíse užije k rozpuštění produktu . ' i - k eluci. Produkt - - se ' pak lyofilizuje -z - - vodného - roztoku:
Výtěžek: 120 mg (80%). ...... .
Analýza: produkt ' - je 'homogenní při chromatografii ' na - tenké vrstvě při použití --A (Rf; 0,29). Obsah chloridů 11,53 % ' (teoretické ' množství -11,6 %).
[a]D24- —122° - (c '- — 0,5, 50 -% - AcOH).
IX. H—Phe—Pro—Arg—pNA . 2HC1
Reakce se provádí obdobným způsobemjako reakční schéma VIII.
Výtěžek: (71%).'
Analýza: produkt je homogenní při chromatografii na tenké -vrstvě při použití A (Rf: 0,22). Obsah chloridů je ' 11,Ó %' (teoretické množství 11,6 - %).
[a]D24 —73,0° (c = 0,5, 50' %. AcOH).
X. H—D—Phe—Plp—Arg—pNA . 2HC1
Reakce se provádí obdobným způsobem jako při reakčním schématu VIII.
Výtěžek: (721%).
Analýza: produkt je homogenní -při chromatografii na tenké vrstvě - při ' použití A - (Rf:
0,44). Obsah chloridů je 11,4 % - (teoretické množství 11,3 %).
[celo24 —109° (с - 0,4, 50% vodný roztok AcOH).
XI. H—Phe—Pip—Arg—pNA, 2ЦС1
Reakce se provádí obdobným žpůsobem jako při reakčním schématu VIII,
Výtěžek: (55%).
Analýza: Produkt je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě při použití A (Rf: 0,41). Obsah chloridů 11,3 % (teoretické množství 11,3 %j.
[a]o24 —80,3° (c = 0,5, 50% vodný roztok AcOH).
XII. Cbo—D—Tyr(OBzl)—Pip—Arg(NOž) — —pNA
Reakce se provádí obdobným způsobem jako při reakčním schématu IV.
Výtěžek: 3,2 g (75%).
Analýza: produkt je homogenní při chromatografll na tenké vrstvě při použití P) (Rf: 0,50).
XIII. H—D—Tyr—Pip—Arg—pNA
Reakce se provádí obdobným způsobem jako při reakčním schématu VIII.
Výtěžek: (68%).
Analýza: produkt je homogenní při chroma.tografli na tenké vrstvě při použití Pi (Rf: 0,44). Obsah chloridů je 10,8 % (teoretické množství 11,1 %).
(a]D 24 —75,2° (c = 0,5, 50% vodný roztok AcOH).
XIV. Cbo—Aze—Arg(NOž)—pNA
Reakce se provádí obdobným způsobem jako při reakčním schématu II.
Výtěžek: 4,2 g (75%).
Analýza: produkt je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě při použití Pí (Rf: 0,27).
XV. Cbo—D—Phe—Aze—ArgfNOz)— pNA
Reakce se provádí obdobným způsobem jako při reakčním schématu XIV.
Výtěžek: 2,4 g (69%).
Analýza: produkt je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě při použití Pi (Rf: 0,47).
XVI. H—D—Phe—Aze—Arg—pNA . 2HC1
Reakce se provádí obdobným způsobem jako při reakčním schématu VIII.
Výtěžek: (71%).
Analýza: produkt je homogenní při chro10 matografil na tenké vrstvě při použití A (Rf: 0,21). Obsah chloridů je 1,6 % (teoretické množství 11,9 %).
[a]D 24 —130° (c = 0,5, 50 % AcOH).
XVII. Cbo—Arg(NOz)—jSNA
7,2 g (20 mmolů) bezvodého Cbo—Arg(NO2)—OH se rozpustí ve 400 ml tetrahydrofuranu. Přidá sfe 2,0 g (20 mmolů) triethylamlnu, načež se roztok zchladí na —10° Celsia za úplného nepřístupu vody. Ke zchlazenému roztoku se pak v průběhu 10 minut přidá roztók 2,7 g (20 mmolů) isobutylchlormravenčanu ve 20 ml tetrahydrofuranu a po dalších 10 minutách se přidá ještě 344 g (20 mmolů) /J-naftylaminu. Reakční směs se nechá zteplat na teplotu místnosti a při této teplotě se nechá stát 24 hodiny. Pak se reakční směs odpaří ve vakuu do sucha, promyje se 3 až 5 x destilovanou vodou, 3 až 5x5% roztokem hydrogenkarbonátu sodného a znovu 3 až 5x destilovanou vodou, načež se suší ve vakuu. Produkt se rozpustí v methanolu a chromatografuje na sloupci přípravku Sephadex,R) LH-20 v methanolu, elučním činidlem je rovněž methanol. Získaný produkt je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě.
Výtěžek: 8,1 g (84%).
Analýza: produkt je homogenní při chr©matografii 11a tenké vrstvě při použití Pt (Rf: 0,40).
[a]D 23 +7,4° (c = 1,0, DMF).
XVIII. Cbo—Pip—Arg(NO2)—/JNA
Reakce se provádí obdobným způsobe» jako při reakčním schématu II.
Výtěžek: 4,8 g (82%).
Analýza: produkt je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě při použití Pi (Rf: 0,36).
XIX. Cbo—D—Phe—Pip—Arg(NO2)—/?NA
Reakce se provádí obdobným způsobem jako v reakčním schématu IV.
Výtěžek: 2,6 g (71%).
Analýza: produkt je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě v Pi (Rf: 0,48).
XX. H—D—Phe—Pip—Arg—βΝΑ . 2HC1
Reakce se provádí obdobným způsobem jako v reakčním schématu VIII.
Výtěžek: (68%).
Analýza: produkt jé homogenní při chromatografii na tenké vrstvě při použití Pi (Rf: 0,44). Obsah chloridů je 11,2 % (teoretické množství 11,3 %).
190314
12 [α]η24 —105° (c = 0,5, 50'% vodný roztok AcOH).
XXI. Cbo—Arg (NOaJ—NA (4-OMe)
Reakce se provádí obdobným způsobemjako v reakčním schématu XVII.
Výtěžek: 7,1 g (70%).
Analýza: produkt je homogenní- při chromatografii na tenké vrstvě při použití Pi (Rf: 0,42).
XXII. Cbo—. Pip—Arg(NO2)—(SNA (4-OMe)
Reakce se provádí obdobným- způsobem jako v reakčním schématu II. ___
---Уу.ЧУ'' ;
Výtěžek: 4,9 g (79%). '
Analýza: produkt je homogenní při chromatografíi ňa tenké -vrstvě při použití -Pi (Rf: 0,38).
XXIII. CbO—D—Phe—Pip—Arg [ NO2) — —/?NA . 2HC1
Reakce se provádí obdobným způsobem jako v reakčním schématu IV.
Výtěžek: 2,7 g (70%).
Analýza: produkt je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě při použití Pi (Rf: - 0,51).
XXIV. H—D—Phe—Pip—Arg— —/3NA (4-OMe) . 2HC1
Reakce -se -provádí obdobným způsobem jako - v reakčním schématu VIII.
Výtěžek: (64%').
Analýza: produkt je homogenní - -při chromatografii na tenké vrstvě při použití A (Rf: - 0,44). Obsah -chloridů je 10,4 % (teoretické množství 10,7 %).
[arlD'2'4 —102° (c =- 0,5, 50% vodný roztok AcOH).
Stanovení thrombinu pomocí chromogenních substrátů
Substráty, - připravené - způsobem podle jednotlivých příkladů se užijí - ke stanovení thrombinu následujícím- způsobem;
Stanovení je založeno na tom, že stejné produkty, vznikající při enzymatické hydrolýze- mají v ultrafialovém světle spektrum zcela odlišné od spektra substrátu. Například substrát -z příkladu X, H—D—Phe— —Pip—Arg—pNA, má absorpční maximum při 315 nm -a molární extinkční koeficient 12 50'0. Pří 405 nm absorpce - substrátu je φ měř nulová. Na rozdíl od toho má p-nítroanilin, který se odštěpuje ze substrátu - při enzymatické hydrolýze absorpční maximum při 380 nm a molární extinkční o-keftcient 13- 200, přičemž - -tento koeficient - klesá již při 405 nm na 9620. Je tedy možno- stanovením při 405- nm snadno zjistit množství vytvořeného p-nitroanilinu, toto množství je přímo úměrné stupni enzymatické hydrolý- . zy a tento - stupeň je opět přímo úměrný účinnému množství thrombinu. Pro' ostatní substráty, vyrobené způsobem podle vynálezu, existují obdobné podmínky, takže- příslušné stanovení bylo- vždy prováděno při 405 nm.
V následující tabulce I jsou srovnány relativní reakční rychlosti dříve- známého substrátu S-2160, jeho- nebenzoylované - formy a substrátů, vyrobených způsobem podle vynálezu. Z tabulky jsou zřejmé přednosti substrátů - podle vynálezu, které reagují 4krát rychleji s thrombinem, než nejlepší dříve Známý substrát S-2160, - přičemž jsou - lOkrát rozpustnější ve- vodě než tento substrát. Při reakci bylo užito 0,4 NIH/ml thrombinu a 0,1 μ-mol/ml substrátu.
' TABULKA I
Substrát Relativní reakční rychlost Rozpustnost ve vodě (mg/ml)
A [S-2160) Bz—Phe—Vol—Arg—pNA 100 0,1
B H—Phe—Val—Arg—pNA 3 1
IX H—Phe—Pro—Arg—pNA 15 1
VIII H—D—Phe—Pro—Arg—pNA 400 3
XI 'H—Phe—Pip—Arg—pNA 9 1
X H—D—Phe—Pip—Arg—pNA 420 3

Claims (1)

  1. PREDMET vynalezu
    Způsob výroby nových chromogenních substrátů, specifických zejména pro throm bin, pro diagnostické účely s obecným vzorcem kde
    R1 znamená átom vodíku nebo hydroxyskúpinu,
    R2 znamená nitrofeny], naftyl, ňitronaftyl, methoxynaftyl, chiholyl nebo nitrochinolyl, n znamená celé číslo 1, 2 nebo 3, dále také farmaceuticky přijatelných solí těchto sloučenin, vyznačující se tím, že se postupně provádí reakce aminoskupin s C-terminálním arginylovým· zbytkem, který je popřípadě již opatřen chromoforní skupinou Rž, která současně chrání karboxylovou Sku pinu, nebo s C--erminálním arginylovým zbytkem, . opatřeným odštěpitelnou ochrannou . skupinou na karboxylové skupině, načež se na chráněný tripeptidový derivát . naváže chromoforní skupina R2, popřípadě se syntetizuje N-terminální dipeptidový fragment, který se pak váže na arginylovou skupinu, popřípadě již opatřenou chromoforní skupinou R2, načež se takto získaný .produkt čistí filtrací na gelu a popřípadě ještě. chromatografií na iontoměniči.
CS764544A 1975-07-11 1976-07-08 Process for preparing new chromogenous substrates specific especially for thrombine CS196314B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7507975-6A SE407405B (sv) 1975-07-11 1975-07-11 Nya kromogena trombinsubstrat

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS196314B2 true CS196314B2 (en) 1980-03-31

Family

ID=20325116

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS764544A CS196314B2 (en) 1975-07-11 1976-07-08 Process for preparing new chromogenous substrates specific especially for thrombine

Country Status (22)

Country Link
JP (1) JPS5224590A (cs)
AT (1) AT348686B (cs)
AU (1) AU497547B2 (cs)
BE (1) BE843970A (cs)
CA (1) CA1068261A (cs)
CH (1) CH622287A5 (cs)
CS (1) CS196314B2 (cs)
DD (1) DD128691A5 (cs)
DE (1) DE2629195C3 (cs)
DK (1) DK145799C (cs)
ES (1) ES449739A1 (cs)
FI (1) FI56525C (cs)
FR (1) FR2317280A1 (cs)
GB (1) GB1510926A (cs)
IL (1) IL49829A (cs)
IT (1) IT1062605B (cs)
NL (1) NL188355C (cs)
NO (1) NO142576C (cs)
PL (1) PL103003B1 (cs)
SE (1) SE407405B (cs)
SU (1) SU719492A3 (cs)
ZA (1) ZA763586B (cs)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5255593A (en) * 1975-10-30 1977-05-07 Ajinomoto Kk Measuring method of enzyme activity
DE2757992A1 (de) * 1977-12-24 1979-06-28 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur prothrombin-bestimmung
DE2812943C3 (de) * 1978-03-23 1981-05-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagens zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin im Plasma
US4289498A (en) * 1979-01-08 1981-09-15 Ortho Diagnostics, Inc. One-stage prothrombin assay and compositions useful therein
EP0018002B1 (de) * 1979-04-24 1983-02-09 Marcel Jozefonvicz Neues Bestimmungsverfahren für Proteasen und Antiproteasen
FR2471410A2 (fr) * 1979-12-17 1981-06-19 Jozefonvicz Marcel Perfectionnements apportes a un procede de dosage des proteases et des anti-proteases et notamment des proteases et antiproteases des systemes de la coagulation et du complement
DE3005540A1 (de) * 1980-02-14 1981-08-20 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagens zur bestimmung der biologischen aktivitaet von heparin im plasma
DK155051C (da) * 1980-05-06 1989-07-03 Pentapharm Ag Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf
JPS5856695A (ja) * 1981-09-28 1983-04-04 Nitto Boseki Co Ltd 新規なトロンビン測定用基質
DE3211254A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens
DK201084A (da) * 1983-04-28 1984-10-29 Kimberly Clark Co Fremgangsmaade til bestemmelse af cathepsin b i naervaerelse af andre proteolytiske enzymer, og forbindelser til anvendelse ved fremgangsmaaden
CN101180405A (zh) 2005-05-20 2008-05-14 株式会社三菱化学药得论 酶分析方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL42124A (en) * 1972-05-02 1977-02-28 Kabi Ab Substrate for the determination of proteolytic enzymes
SE380257B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser

Also Published As

Publication number Publication date
SU719492A3 (ru) 1980-02-29
JPS5224590A (en) 1977-02-24
FI762010A7 (cs) 1977-01-12
ZA763586B (en) 1977-05-25
IT1062605B (it) 1984-10-20
ATA463976A (de) 1978-07-15
DK145799B (da) 1983-03-07
PL103003B1 (pl) 1979-05-31
ES449739A1 (es) 1978-01-16
IL49829A (en) 1978-12-17
NO142576B (no) 1980-06-02
IL49829A0 (en) 1976-08-31
NL7607104A (nl) 1977-01-13
SE7507975L (sv) 1977-01-12
DD128691A5 (de) 1977-12-07
NO762407L (cs) 1977-01-12
NL188355B (nl) 1992-01-02
FI56525C (fi) 1980-02-11
AU497547B2 (en) 1978-12-14
DK312676A (da) 1977-01-12
DK145799C (da) 1983-08-29
FR2317280A1 (fr) 1977-02-04
CA1068261A (en) 1979-12-18
DE2629195A1 (de) 1977-01-13
FI56525B (fi) 1979-10-31
DE2629195C3 (de) 1983-11-17
FR2317280B1 (cs) 1980-05-16
CH622287A5 (en) 1981-03-31
SE407405B (sv) 1979-03-26
JPS5615239B2 (cs) 1981-04-09
GB1510926A (en) 1978-05-17
NO142576C (no) 1980-09-10
AT348686B (de) 1979-02-26
BE843970A (fr) 1976-11-03
NL188355C (nl) 1992-06-01
AU1530576A (en) 1978-01-05
DE2629195B2 (de) 1980-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4061625A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4440678A (en) Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
US4016042A (en) Substrate for the quantitative determination of enzymes
SU1277904A3 (ru) Способ получени трипептидов
NO142074B (no) Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser
PL90746B1 (cs)
NO135362B (cs)
NO142812B (no) Nye diagnostisk aktive kromogene enzymsubstrater
CS196314B2 (en) Process for preparing new chromogenous substrates specific especially for thrombine
DE2936543A1 (de) Chromogene verbindungen
US4428874A (en) Tripeptide derivatives
US4247454A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4568636A (en) Tripeptide derivatives
US4216142A (en) Chromogenic substrates for the proteolytic enzymes
DE3045430C2 (de) &amp;alpha;-Hydroxyacyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide und deren Verwendung
US4169015A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
EP0280610B1 (fr) Dipeptides, procédé de préparation et utilisation dans le dosage de protéases
US4162941A (en) Method for determining a proteolytic enzyme
AU602527B2 (en) Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use
US4629695A (en) Peptide derivatives and use thereof as substrates for quantitatively assaying enzymes
JPS62122599A (ja) 酵素活性測定用ペプチド誘導体及びその使用法
JPH0776232B2 (ja) ペプチド誘導体及びその使用方法
JPH0244518B2 (ja) Tanpakubunkaikosooteiryobunsekisuruhoho