JP2012504950A

JP2012504950A - メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ｍｒｓａ）バクテリア用の反応培地

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Publication number: JP2012504950A
Application number: JP2011530528A
Authority: JP
Inventors: シルヴァンオレンガ，; ドゥニロビション，; ジルザンバルディ，
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2008-10-08
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2012-03-01
Anticipated expiration: 2029-10-07
Also published as: WO2010040951A1; BRPI0920391A2; FR2936816B1; FR2936816A1; EP2344662A1; US20110165604A1; US8415115B2; ES2618076T3; CN102177248B; JP5780962B2; EP2344662B1; CN102177248A; BRPI0920391B1

Abstract

本発明は、セファロスポリン系統に属する第１の抗生物質と第２の抗生物質の所与の組合せの２つの抗生物質を含んでなる、メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）バクテリアを検出および／または同定するための反応培地であって、前記第１の及び第２の抗生物質はそれぞれ抑制濃度以下である反応培地に関する。

Description

本発明はメチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）バクテリアを検出するための培地に関する。更に、本発明は、この培地の使用、及びＭＲＳＡバクテリアを同定する方法に関する。

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌は、抗生物質のメチシリンと関連した抗生物質（例えばオキサシリン）に耐性があることによって特徴づけられる黄色ブドウ球菌の菌株である。この耐性は最も一般的には、修飾されたタンパク質ＰＬＰ２ａ（別名ＰＢＰ２ａまたはＰＢＰ２’）の産生につながる遺伝子ｍｅｃＡの発現によって与えられる。

ＭＲＳＡバクテリアは、院内感染の高いパーセンテージを示し、しばしば深刻で潜在的に致命的な健康問題の原因となる。最も一般的には介護スタッフを介して患者間で交差感染されるＭＲＳＡは、接触感染性が高く制御が非常に困難な流行性感染の原因となる。適切な治療に加えて、ＭＲＳＡ保菌者のスクリーニング及び感染した患者の隔離は、現在、公的機関（例えば米国医療疫学学会）によって推奨される最も有効方法となっている。従って、初期及び組織的スクリーニングは不可欠である。

ＭＲＳＡは、さまざまな技術によって検出することができる。例えば、分子生物学的技術によってＭＲＳＡを検出することは可能である。この点については、特に出願EP887424を挙げることができる。しかしながら、上記の方法は、ルーチンテストとしては高価であるし、資格のあるスタッフを必要とする。更に、黄色ブドウ球菌を検出するための従来の培養培地（例えば出願EP1390524に記載されている培地）を使用することが可能である。ＭＲＳＡの検出は、付加的な工程として、特異的な凝集検査（Slidex MRSA、ビオメリュー）によって、またはオキサシリン・ディスクの存在下で寒天内拡散法によって、実施される（Antibiogram Committee of the French Society for Microbiologyの推奨)。更に、抗生物質の存在下で、寒天培地上で、ＭＲＳＡである可能性があるバクテリアを培養してもよい。更に、上記の培地は、ＭＲＳＡの読取りと検出を容易にする発色性でもよい。特に、出願EP1543147に記載されている培地を挙げることができる。しかしながら、記載されている条件下でのホスファターゼ活性の検出はあまり特異的でないので、いくつかの他の酵素の活性の検出と組合わせる必要があり、そのため培地の繁殖力を減じさせ、そのコストを増大させる。

本発明は、メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）を分離して同定するために、感受性が高く、特異的であり、迅速な新規の検出培地を提供することによって、従来技術の隙間を埋めることを目的とする。驚くべきことに、本発明者は、抗生物質の組合せの使用は、所定の低濃度において、メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）を分離して同定するための優れた検出培地を得ること可能にすることを証明した。抗生物質は別々に使用すると、本発明による濃度でＭＲＳＡを区別することがいかなる形であれ可能ではないので、この効果は非常に驚きである。

更に続ける前に、以下に示す定義は、より明確に本発明を理解することを可能にするものであり、限定するものではない。
本発明のために、反応培地なる用語は、微生物（例えば黄色ブドウ球菌）の生存及び／又は増殖のために必要な成分の全てを含む培地を意味することを目的とする。この反応培地は、検出（revealing)培地のみとしても、あるいは培養且つ検出培地としても用いられる。前者の場合は、微生物は接種前に培養され、後者の場合は反応培地は更に培養培地を構成する。反応培地は、固体、半固体または液体であってもよい。

「固形培地」なる用語は、例えばゲル化培地を意味することを目的とする。本発明に係る培地はゲル化培地であることが望ましい。寒天は微生物を培養するための微生物学の従来のゲル化剤であるが、ゼラチンまたはアガロースを使用することも可能である。いくつかの数の製品が市販されており、コロンビア寒天、トリプチカーゼ大豆寒天、マッコンキー寒天、サブロー寒天またはさらに一般的にはthe Handbook of Microbiological Media (CRC Press)に記載されているものである。

本発明による反応培地は、その他の可能な添加物、例えばペプトン、一つ以上の成育因子、糖質、一つ以上の選択剤、緩衝液、一つ以上のゲル化剤等を含んでもよい。この反応培地は、すぐに使用できる、すなわちチューブ中またはフラスコ中にまたはシャーレ上において、接種する準備ができている液体またはゲルの形態であってもよい。この培地はフラスコ中でゲルの形態で提供され、培地はシャーレに注入される前に（１００℃に供して）再生させることが好ましい。好ましくは、本発明の培地は、選択培地、すなわち黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を助けるインヒビターを含んでなるる培地である。特に塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）、コリスチン、アンフォテリシン、アズトレオナム、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、デフェロキサミン及びビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９を挙げることができる。

本発明では、酵素又は代謝活性用の基質は、酵素活性のまたは代謝（例えば、特にオシダーゼ活性、好ましくはα-グルコシダーゼまたはエステラーゼ活性、好ましくはホスファターゼまたはペプチダーゼ活性、好ましくはコアグラーゼ活性または代謝糖質、好ましくはマンニトールの代謝）の直接的または間接的な検出を可能にする生成物を与えるために加水分解されることができる任意の基質から選択される。

天然基質でも合成基質であってもよい。基質の代謝によって、反応培地の又は生物の細胞の生理化学的性質に変化が生じる。この変化は、物理化学的方法、特に光学的方法、オペーレーターの視覚により、または分光計、電気、磁気等の計測器を使用して検出することができる。それは、吸収、蛍光または発光の変化のような光学的性質の変異であることが望ましい。

発色性基質として、インドキシル、フラボン、アリザリン、アクリジン、フェノキサジン、ニトロフェノール、ニトロアニリン、ナフトール、カテコール、ヒドロキシキノリンまたはクマリン系の基質を挙げることができる。本発明で使用する基質は、インドキシル系であることが好ましい。

蛍光性の基質として、ウンベリフェロン系またはクマリン系基質、レゾルフィン系、フェノキサジン系、ナフトール系、ナフチルアミン系、2'-ヒドロキシフェニル-ヘテロ環系または2'-アミノフェニル-ヘテロ環系基質、あるいは他にフルオレセイン系を挙げることができる。

α-グルコシダーゼ酵素活性のための基質として、特に基質5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド；ジヒドロキシフラボン-α-グルコシド; 3,4-シクロヘキセノエスクレチン-α-グルコシド; 8-ヒドロキシキノリン-α-グルコシド; 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド; 6-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ブロモ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ヨード-3-インドキシル-α-グルコシド; 6-フルオロ-3-インドキシル-α-グルコシド;アリザリン-α-グルコシド;ニトロフェニル-α-グルコシド; 4-メチルウンベリフェリル-α-グルコシド;ナフトールベンゼイン-α-グルコシド;インドキシル-Ｎメチル-α-グルコシド;ナフチル-α-グルコシド;アミノフェニル-α-グルコシド;ジクロロ・アミノフェニル-α-グルコシドを挙げることができる。本発明において使用する基質は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドと組合わせた5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドが好ましい。

ホスファターゼ酵素活性のための基質としては、特に基質5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシルリン酸；3,4-シクロヘキセノエスクレチンリン酸; 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシルリン酸; 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチルリン酸; 6-クロロ-3-インドキシルリン酸; 5-ブロモ-3-インドキシルリン酸; 5-ヨード-3-インドキシルリン酸; 6-フルオロ-3-インドキシルリン酸;ニトロフェニルリン酸; 4-メチルウンベリフェリルリン酸;インドキシル-Nメチルリン酸;ナフチルリン酸を挙げることができる。

コアグラーゼ基質としては、特に基質Boc-Val-Pro-Arg-7-アミド-4-メチルクマリン、Bz-Phe-Val-Arg-p-ニトロアニリド、Z-Gly-Pro-Arg-4メトキシ-βナフチルアミドとプラスミノーゲンを挙げることができる。通常は、これらの基質はプロトロンビンのソース、例えば、精製プロトロンビンまたは血漿と組合わせて使用される。本発明において使用する基質は、他の基質と組合わせてもよく、例えばオシダーゼ、特にβ-グルコシダーゼまたはβ-リボシダーゼ、エステラーゼ、特にホスファターゼまたはフォスフォリパーゼ、ペプチダーゼ及び特にコアグラーゼのための基質である。

本発明の基質は、広いｐＨ範囲において、特にｐＨ５．５〜１０、好ましくは特に６．５〜１０で使用することができる。本発明に係る培地がα-グルコシダーゼ酵素活性のための１つの基質又は複数の基質を含む場合に、基質の濃度は、好ましくは０．０１〜２ｇ／ｌであり、より好ましくは０．０２〜０．２ｇ／ｌであり、有利には０．１ｇ／ｌである。この基質濃度では、より良好な呈色反応コントラストが得られるためである。

基質は、更には代謝基質、例えば炭素源であってもよく、それは代謝生成物のうちの1つがある場合には、呈色反応を産生するインジケータに結合されている。糖質の代謝の場合、好ましくはｐＨ指示薬に結合されたマンニトールである。本発明のためには、セファロスポリン系統に属する抗生物質は、以下から選択される抗生物質が好ましい：
・第一世代のセファロスポリン、例えばセファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファドロキシル、セファゼドン、セファトリジン、セファピリン、セフラジン、セファセトリル、セフロダキシネ（Cefrodaxine）、セフテゾール
・第二世代のセファロスポリン、例えばセフォキシチン、セフロキシム、セファマンドール、セファクロル、セフォテタン、セフォニシド（Cefonicide）、セフォチアム、ロラカルベフ（Loracarbef）、セフメタゾール、セフプロジル、セホラニド；
・第三世代のセファロスポリン、例えばセフォタキシム、セフタジジム、セフスロジン（Cefsulodine）、セフトリアキソン、セフメノキシム、ラタモキセフ、セフチゾキシム、セフィキシム、セフォジジム、セフェタメト（Cefetamet）、セフピラミド、セフォペラゾン、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフジトレン、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフブペラゾン；
・第四世代のセファロスポリン、例えばセフェピム、セフピロム。
セフォキシチン、セフォテタン、セフメタゾール、セフブペラゾンまたはラタモキセフのようなセファマイシンは、セファロスポリン亜系統である。

本発明において、セファロスポリン系に属する抗生物質は、好ましくはセフォキシチンであり、セフォタキシムと組合わせられてもよい。本発明のために、カルバペネム系に属する抗生物質は、メロペネム、エルタペネム、イミペネム、ドリペネム、ファロペネムである。本発明において、カルバペネム系に属する抗生物質は、エルタペネムが好ましい。
本発明のために、アミノグリコシド系に属する抗生物質は、好ましくはアミカシン、ゲンタミシン、イセパマイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシンから選択される抗生物質が好ましい。

抑制濃度以下は、生物学的試料を使用する、黄色ブドウ球菌の調査に適している培養培地（例えばchromID^TMS. aureus培地（ビオメリュー））において、ＭＳＳＡの阻害のために必要な抗生物質の濃度より低い濃度を意味することを目的とする。この濃度は、セフォキシチンの場合はほぼ３ｍｇ／ｌより低く、セフォタキシムの場合はほぼ２ｍｇ／ｌより低く、エルタペネムの場合はほぼ１ｍｇ／ｌより低く、セフォペラゾンの場合はほぼ２ｍｇ／ｌより低く、セフポドキシムの場合はほぼ２ｍｇ／ｌより低く、セフジニルの場合はほぼ１ｍｇ／ｌより低い。

２つの抗生物質の所定の組合せなる用語は、２つの特定の抗生物質の組合せであって、各々２つが特定の抑制濃度以下である組合せを意味することを目的とする。上記の組合せは、特に実施例Ａのテストによって、決定することができる。

生物学的試料なる用語は、気管支、気管又は肺吸引試料または胸膜液試料からの、気管支肺胞洗浄からの、喀痰からの、血液からのまたは肺生検からの、関節滑液または囲心腔液からの臨床試料；体液又は任意の種類の食物に由来する食物試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体であっても固体であってもよく、非限定的に、血液、血漿、尿または糞便由来の臨床試料、または鼻から、会陰部から、のどから、皮膚から、損傷からまたは脳脊髄液から得られた試料、または食物試料を挙げることができる。この点で、本発明は、メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）バクテリアを検出しておよび／または同定するための反応培地に関する。これは、２つの抗生物質の所定の組合せは、セファロスポリン系に属する第１の抗生物質及び第２の抗生物質を含み、前記第１及び第２の抗生物質の各々は、抑制濃度以下である。

本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第１の抗生物質は、セファマイシン亜系統に属する。もう一つの本発明の好ましい実施形態によれば、前記第１の抗生物質は、セフォキシチンである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第２の抗生物質は、カルバペネム系に属する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第２の抗生物質は、セファロスポリン系に属する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第２の抗生物質は、アミノグリコシド系に属する。

本発明のある好ましい実施態様によれば、培地は酵素活性（好ましくはオシダーゼ、エステラーゼまたはペプチダーゼ活性）、または代謝活性（好ましくは糖質の代謝）を検出するための基質を更に含む。オシダーゼ活性の場合は、α-グルコシダーゼ活性が好ましい。エステラーゼ活性の場合は、ホスファターゼ活性が好ましい。ペプチダーゼ活性の場合は、コアグラーゼ活性が好ましい。糖質の代謝の場合、ｐＨ指示薬に結合させたマンニトールが好ましい。本発明の好ましい一実施形態によれば、基質は、オシダーゼ、好ましくはα-グルコシダーゼ、酵素活性を検出するための基質である。適切なα-グルコシダーゼ酵素活性のための前記基質はインドキシル-α-グルコシドであることが好ましい。使用する基質は5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド（X-N-メチル-α-グルコシド）であることが望ましい。好ましくは、この基質は０．０１〜２ｇ／ｌ、好ましくは０．０２〜０．３ｇ／ｌの濃度で培地に存在する。

本発明のある特定の実施態様によれば、前記培地は、第２の酵素又は代謝基質を含む。この基質は、α-グルコシダーゼ基質または別の基質であってもよい。この第２の基質はα-グルコシダーゼ基質であることが好ましい。前記培地が第２のα-グルコシダーゼ基質を含む場合、この基質は5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド（X-α-グルコシド）が好ましい。好ましくは、この第２の基質は０．０１から２g／ｌ、好ましくは０．０２〜０．３ｇ／ｌの濃度で培地に存在する。

本発明の好ましい一実施形態によれば、セファロスポリン系に属する前記第１のおよび／または第２の抗生物質は、以下から選択される：
・第一世代のセファロスポリン、例えばセファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファドロキシル、セファゼドン、セファトリジン、セファピリン、セフラジン、セファセトリル、セフロダキシネ（Cefrodaxine）、セフテゾール
・第二世代のセファロスポリン、例えばセフォキシチン、セフロキシム、セファマンドール、セファクロル、セフォテタン、セフォニシド（Cefonicide）、セフォチアム、ロラカルベフ（Loracarbef）、セフメタゾール、セフプロジル、セホラニド；
・第三世代のセファロスポリン、例えばセフォタキシム、セフタジジム、セフスロジン（Cefsulodine）、セフトリアキソン、セフメノキシム、ラタモキセフ、セフチゾキシム、セフィキシム、セフォジジム、セフェタメト（Cefetamet）、セフピラミド、セフォペラゾン、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフジトレン、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフブペラゾン；
・第四世代のセファロスポリン、例えばセフェピム、セフピロム。
本発明の好ましい一実施形態によれば、カルバペネム系に属する前記第２の抗生物質は、メロペネム、エルタペネム及びイミペネムから選択される。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフォキシチン−セフォタキシムまたはセフォキシチン−エルタペネムの組合せから選択される。

本発明の好ましい一実施形態によれば、培地は、黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を助ける少なくとも一つのインヒビターを更に含むことができる。例えば塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）、コリスチン、アンフォテリシン、アズトレオナム、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びデフェロキサミンである。

本発明の好ましい一実施形態によれば、培地は、ブドウ球菌属のバクテリアの増殖を助ける４つのインヒビターのインヒビター混合物を更に含んでなり、前記インヒビターはＬｉＣｌ、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム及びアンフォテリシンである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフォキシチンとセフォタキシムを含む。好ましくは、前記セフォキシチンの抑制濃度以下は、０．２５〜１．５ｍｇ／ｌ、好ましくは０．５から１ｍｇ／ｌである。好ましくは、前記セフォタキシムの抑制濃度以下は、０．２５〜１．５ｍｇ／ｌ、好ましくは０．５から１ｍｇ／ｌである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せはセフォキシチンとセフトリアキソンを含む。好ましくは、前記セフォキシチンの抑制濃度以下は、０．２５〜１．５mg／ｌ、好ましくは０．５〜１mg／ｌである。好ましくは、前記セフトリアキソンの抑制濃度以下は、０．２５〜１．５mg／ｌ、好ましくは０．５〜１mg／ｌである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフォキシチンとエルタペネムを含む。好ましくは、前記セフォキシチンの抑制濃度以下は、０．２５〜１．５mg／ｌ、好ましくは０．５〜１mg／ｌである。好ましくは、前記エルタペネムの抑制濃度以下は、０．５〜０．７５ｍｇ／ｌである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフォキシチンとセフポドキシムを含む。好ましくは、前記セフォキシチンの抑制濃度以下は、０．２５〜１．５mg／ｌ、好ましくは０．５〜１mg／ｌである。好ましくは、前記セフポドキシムの抑制濃度以下は、０．７５〜１mg／ｌ、好ましくは０．５〜１mg／ｌである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフォキシチンとセフォペラゾンを含む。好ましくは、前記セフォキシチンの抑制濃度以下は、０．２５〜１．５mg／ｌ、好ましくは０．５〜１mg／ｌである。好ましくは、前記セフォペラゾンの抑制濃度以下は、０．５〜０．７５mg／ｌ、好ましくは０．７５〜１mg／ｌである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフォキシチンとセフジニルを含む。好ましくは、前記セフォキシチンの抑制濃度以下は、０．２５〜１．５mg／ｌ、好ましくは０．２５〜０．７５mg／ｌである。好ましくは、前記セフジニルの抑制濃度以下は、０．０５〜０．５mg／ｌ、好ましくは０．１〜０．２５mg／ｌである。

更に、本発明は、メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）バクテリアを分離して同定するための、上記の通り反応培地のインビトロ使用にも関する。この培地を使用する場合、ＭＲＳＡは、有色の又は蛍光のコロニーを得ることを可能にする特異的なグルコシダーゼ活性によって検出されることが好ましい。他の黄色ブドウ球菌の種は、無色に見えるかまたは黄色ブドウ球菌コロニーのものとは異なる色または蛍光を有する。最後に、本発明は、生物学的試料において、メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）バクテリアを検出および／または同定する方法に関する。
上記は、以下を含む。
ａ）上記の反応培地に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）バクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）コロニーをＭＲＳＡコロニーと同定することを含む方法。
インキュベーションは、３０℃から４２℃で実施されることが好ましい。

ＭＲＳＡは、有色の又は蛍光のコロニーを得ることを可能にする特異的なグルコシダーゼ活性によって検出されることが好ましい。他の黄色ブドウ球菌の種は、無色に見えるかまたは黄色ブドウ球菌コロニーのものとは異なる色または蛍光を有する。

以下の実施例は、説明のために示すものであり、事実上限定するものでない。それらは、本発明をより明らかに理解することを可能にする。

実施例Ａ−本発明による２つの抗生物質の所定の組合せを決定するためのテスト
下記のテストは、使用する抗生物質に応じて、さらに一般的にいえば前記反応培地の調製において、本発明による２つの抗生物質の所定の組合せを定めるために実施することができる。
このテストの理解を補助するために、セフォキシチンとセフォタキシムの組合せの場合について、微生物菌株のキットを使用して実施する。上記はＭＳＳＡとＭＲＳＡとを含むが、このテストは当然に他の抗生物質について実施することができる。
生物学的試料の黄色ブドウ球菌を調査することに適している１０の反応培地（例えばchromID^TM S. aureus培地、ビオメリュー）及び様々な濃度のセフォキシチン（０〜３ｍｇ／ｌ）とセフォタキシム（０〜２ｍｇ／ｌ）は、０〜５ｍｇ／ｌの抗生物質の濃度を得るために用いる。さまざまな濃度は、例えば算数または幾何学的な分布によって均一に間隔をあけられる。

各々の培地は、各々の微生物菌株が、各々の培地に純培養で接種することができるというような方法で、等分される。適切なインキュベーション時間後、好ましくは１８〜２４時間後、適切な温度で、好ましくは３０〜３７℃で、培地が、ＭＲＳＡの最大数を明らかにすると同時に、ＭＳＳＡ菌株の最大数からそれらを区別することを可能にする、セフォキシチンとセフォタキシムの組合せを含む培地を選択するために調べられる。調整された各々の抗生物質の濃度について実験を繰り返すことが必要な場合がある。

実施例Ｂ − α−グルコシダーゼ基質を含む本発明の培地。
１．本発明の培地の調製
以下に実験において試験される培地は、基本培地としてchromID MRSA培地を含む培地（ビオメリューref. 43 451）及び以下の成分を含んでなる：
培地Ｔ：chromID MRSAコントロール培地（ref. 43 451)、特にX-N-メチル-α-グルコシド基質を濃度０．１ｇ／ｌで、セフォキシチンを４ｍｇ／ｌで含む。
培地Ｓ：培地Ｔ、更に２５、３７、４５又は５０ｍｇ／ｌの濃度の、Ｘ−α−グルコシド基質を含む。
培地Ａ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンはセフトリアキソンと、濃度１、２、４、８、１６、３２ｍｇ／ｌで置換されている。
培地Ｂ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは濃度１、２、４、８、１６、３２ｍｇ／ｌでセフォタキシムと置換されている。
培地Ｃ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは濃度０．１、０．２５、０．５、０．７５、１ｍｇ／ｌでエルタペネムと置換されている。
培地Ｄ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは、濃度０．５、１、１．５、２ｍｇ／ｌでセフォペラゾンと置換されている。
培地Ｅ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは、濃度０．５、１、１．５、２ｍｇ／ｌでセフポドキシムと置換されている。
培地Ｆ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは、下記の濃度で、セフォキシチン／セフォタキシム濃度と置換されている：

培地Ｇ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは、下記の濃度で、セフォキシチン／セフトリアキソンの組合せと置換されている：

培地Ｈ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは、下記の濃度で、セフォキシチン／エルタペネムの組合せと置換されている：

培地Ｉ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは、下記の濃度で、セフォキシチン／セフポドキシムの組合せと置換されている：

培地Ｊ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは、下記の濃度で、セフォキシチン／セフォペラゾンの組合せと置換されている：

培地Ｋ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは、下記の濃度で、セフォキシチン／セフォタキシムの組合せと置換され、更に黄色ブドウ球菌の増殖を助けるインヒビターの混合物を含む。

培地Ｌ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは、濃度０．２５、０．５、１、２、４、８ｍｇ／ｌで、セフジニルと置換されている。
培地Ｍ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）、セフォキシチンは、下記の濃度で、セフォキシチン／セフジニルの組合せと置換されている：

２．培地の接種と読取り
菌株（全て出願人のコレクションに由来するもの）のさまざまなセットは、生理食塩液に懸濁されて、分離したコロニーを得るために、培地上に接種された。皿は、４８時間、３７℃でインキュベートされた。形成されたコロニーは、インキュベーションの１８時間または２４時間後に、視覚的に調べられた。更に、呈色強度は、０〜４のスケールに従って観察された（０：呈色反応なし、４：非常に強度の呈色）。検出された菌株は、培地の上に有色のコロニーを形成している菌株に対応する。

３．結果：
３．１ − ２つのα−グルコシダーゼ基質を含むＭＲＳＡを検出するための培地

１又は２つのα−グルコシダーゼ基質の使用で得られた結果を表１に示す。

表１２つのα−グルコシダーゼ基質の使用によるコロニーの呈色反応の強度

第２のα-グルコシダーゼ基質の添加は、コロニーの呈色反応を強力に増大することを可能にし、従ってＭＲＳＡコロニーをよりよく正確に指摘することを可能にする。

３．２ − セフトリアキソン、セフォタキシム、エルタペネム、セフォペラゾン、セフポドキシムまたはセフジニルから選択される抗生物質を含むＭＲＳＡを検出するための培地

セフォキシチンが他の抗生物質に置換された場合に得られた結果を表２ａ〜２ｆに示す。
表２ａ−セフトリアキソンによるセフォキシチンの置換

表２ｂ−セフォタキシムによるセフォキシチンの置換

表２ｃ−エルタペネムによるセフォキシチンの置換

表２ｄ−セフォペラゾンによるセフォキシチンの置換

表２ｅ−セフポドキシムによるセフォキシチンの置換

表２ｆ−セフジニルによるセフォキシチンの置換

抗生物質セフォタキシム、セフトリアキソン、エルタペネム、セフポドキシム、セフォペラゾン及びセフジニルは、単独では、ＭＳＳＡからＭＲＳＡを区別可能な感受性と特異性を得ることができなかった。

３．３ −セフォキシチン／セフトリアキソン、セフォキシチン／セフォタキシム、セフォキシチン／エルタペネム、セフォキシチン／セフォペラゾンまたはセフォキシチン／セフポドキシムのペアーから選択される抗生物質の組合せを含む、ＭＲＳＡを検出するための培地。

抗生物質の組合せが使われた場合に得られた結果を表３に示す。

表３−抗生物質の組合せを使用した場合のＭＲＳＡコロニーの検出（全菌種の数につき検出された菌種の数として表示された検出）

上記の抗生物質の組合せは、単一の抗生物質が用いられた場合に得られた結果より、より優れた特異性とより優れた感受性を得ることができた。

３．４ −セフォキシチン／セフォタキシム抗生物質の組合せと黄色ブドウ球菌の増殖を助けるインヒビターの混合物を含む、ＭＲＳＡを検出するための培地。

抗生物質の組合せが使われた場合に得られた結果を表４に示す。

表４−セフォキシチン／セフォタキシム抗生物質の組合せ及びインヒビターの混合物が使用された場合のＭＲＳＡの検出（全菌種の数につき検出された菌種の数として表示された検出）

黄色ブドウ球菌の増殖を促進するインヒビター混合物と組合わせたセフォキシチン/セフォタキシム抗生物質の組合せは、優れた特異性と感受性を得ることが可能であった。

実施例Ｃ−ホスファターゼ基質を含有する、本発明の培地

実施例Ｂで示した実験に類似するが、α−グルコシダーゼ基質が、ホスファターゼ基質である6-クロロ-3-インドキシル・リン酸（ホスファターゼピンク）によって置換され、抗生物質の組合せがセフォキシチンとセフォタキシムである実験を実施した。
得られた結果を、表５に示す。

表５ホスファターゼ基質とセフォキシチン/セフォタキシム抗生物質の組合せを使用した場合のMRSAコロニーの検出

基質6-クロロ-3-インドキシルリン酸（ホスフェートピンク）と組合わせたセフォキシチン/セフォタキシム抗生物質の組合せにより、優れた特異性と感受性を得ることができた。

Claims

セファロスポリン系に属する第１の抗生物質と第２の抗生物質の２つの抗生物質の所定の組合せを含んでなる、メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）バクテリアを検出および／または同定するための反応培地であって、前記第１及び第２の抗生物質はそれぞれ抑制濃度以下である反応培地。
前記第１の抗生物質がセファマイシン亜系統に属する請求項１に記載の反応培地。
前記第２の抗生物質がカルバペネム系に属する請求項１又は２に記載の反応培地。
前記第２の抗生物質がセファロスポリン系に属する請求項１又は２に記載の反応培地。
酵素活性又は代謝活性を検出するための基質を更に含む請求項１から４の何れか一項に記載の反応培地。
前記酵素活性がオシダーゼ、エステラーゼ又はペプチダーゼ活性である請求項５に記載の反応培地。
前記オシダーゼ酵素活性がα-グルコシダーゼ活性である請求項６に記載の反応培地。
前記代謝活性が糖質の代謝である請求項５に記載の反応培地。
酵素活性又は代謝活性のための第２の基質を含む請求項１から８の何れか一項に記載の反応培地。
前記第２の基質はα-グルコシダーゼ酵素活性のための基質である請求項９に記載の反応培地。
セファロスポリン系に属する前記第１および／または第２の抗生物質が以下から選択される請求項１から１０の何れか一項に記載の反応培地：
・好ましくはセファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファドロキシル、セファゼドン、セファトリジン、セファピリン、セフラジン、セファセトリル、セフロダキシネ（Cefrodaxine）、セフテゾールから選択される第一世代のセファロスポリン；
・好ましくはセフォキシチン、セフロキシム、セファマンドール、セファクロル、セフォテタン、セフォニシド（Cefonicide）、セフォチアム、ロラカルベフ（Loracarbef）、セフメタゾール、セフプロジル、セホラニドから選択される第二世代のセファロスポリン；
・好ましくはセフォタキシム、セフタジジム、セフスロジン（Cefsulodine）、セフトリアキソン、セフメノキシム、ラタモキセフ、セフチゾキシム、セフィキシム、セフォジジム、セフェタメト（Cefetamet）、セフピラミド、セフォペラゾン、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフジトレン、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフブペラゾンから好ましくは選択される第三世代のセファロスポリン;
・好ましくはセフェピム、セフピロムから選択される第四世代のセファロスポリン。
前記第２の抗生物質がカルバペネム系に属しており、メロペネム、エルタペネム及びイミペネムから選択される請求項１から１１の何れか一項に記載の反応培地。
２つの抗生物質の組合せが、セフォキシチンとセフォタキシムとの組合せ、又はセフォキシチンとエルタペネムとの組合せから選択される、請求項１から１２の何れか一項に記載の反応培地。
メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）バクテリアを単離して同定するための請求項１から１３の何れか一項に記載の反応培地のインビトロ使用。
生物学的試料において、メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）バクテリアを検出および／または同定する方法であって、
ａ）請求項１から１３の何れか一項に記載の反応培地に、メチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）バクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）コロニーをＭＲＳＡコロニーと同定することを含む方法。