JP2000316597A - 基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別方法 - Google Patents
基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は院内感染の原因菌として問題になって
いるＥＳＢＬ産生菌の確認を容易に行う鑑別方法を提供
する。 【解決手段】本発明の課題はセフポドキシム含有ディス
クとセフポドキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディ
スクとの組合せを用いるディスク拡散法によるＥＳＢＬ
産生菌鑑別法、もしくはセフポドキシム含有液体培地と
セフポドキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地
との組合せを用いた微量液体希釈法（ＭＩＣ測定）によ
るＥＳＢＬ産生菌鑑別法により達成された。
いるＥＳＢＬ産生菌の確認を容易に行う鑑別方法を提供
する。 【解決手段】本発明の課題はセフポドキシム含有ディス
クとセフポドキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディ
スクとの組合せを用いるディスク拡散法によるＥＳＢＬ
産生菌鑑別法、もしくはセフポドキシム含有液体培地と
セフポドキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地
との組合せを用いた微量液体希釈法（ＭＩＣ測定）によ
るＥＳＢＬ産生菌鑑別法により達成された。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は基質拡張型β−ラク
タマーゼ（Extended Spectrum Beta-Lactamase、ＥＳＢ
Ｌ）産生菌の鑑別方法およびそれに用いる鑑別用ディス
クおよび鑑別用液体希釈培地に関する。
タマーゼ（Extended Spectrum Beta-Lactamase、ＥＳＢ
Ｌ）産生菌の鑑別方法およびそれに用いる鑑別用ディス
クおよび鑑別用液体希釈培地に関する。
【０００２】なお、本発明では次の略語を使用すること
がある。
がある。
【略語表】ＥＳＢＬ：基質拡張型β−ラクタマーゼ ＣＰＤＸ：セフポドキシム ＣＡＺ：セフタジジム ＣＴＸ：セフォタキシム ＡＺＴ：アズトレオナム ＣＴＲＸ：セフトリアキソン ＣＶＡ：クラブラン酸 ＡＭＰＣ：アモキシシリン ＳＢＴ：スルバクタム ＴＡＺ：タゾバクタム ＣＡＭＨＢ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培
地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Broth) ＮＣＣＬＳ：米国臨床検査標準委員会 (National Commi
tee for Clinical Laboratory Standards) ＭＩＣ：最小発育阻止濃度
地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Broth) ＮＣＣＬＳ：米国臨床検査標準委員会 (National Commi
tee for Clinical Laboratory Standards) ＭＩＣ：最小発育阻止濃度
【０００３】
【従来の技術】β−ラクタマーゼは、β−ラクタム系抗
菌薬を加水分解して不活化する酵素で、従来のβ−ラク
タマーゼは第一、第二世代のβ−ラクタム剤を分解し、
不活化していた。そこでこの酵素に対抗するために第三
世代の薬剤が開発され使用されてきたが、最近これらの
薬剤を分解する酵素を持った耐性菌が出現している。こ
のように第一、第二世代のβ−ラクタム剤に対するβ−
ラクタマーゼを持った菌が突然変異を起こし、その菌が
産生する分解可能な基質の種類を広げた酵素を基質拡張
型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）と呼び、その菌がＥＳ
ＢＬ産生菌と呼ばれている。１９８０年代中頃から欧米
を中心にＣＴＸやＣＡＺ等に耐性を示すＥＳＢＬ産生菌
として肺炎桿菌や大腸菌が分離されるようになり臨床上
の問題となっている。最近は日本においてもＥＳＢＬ産
生菌が分離され、特に院内感染の原因菌として問題視さ
れている。ＥＳＢＬは、尿、喀痰、便などの臨床材料か
ら分離されているが、その産生するＥＳＢＬは、欧米で
はＴＥＭ型やＳＨＶ型の酵素が主であるが、日本ではＴ
ｏｈｏ型が多く、またＫＩＴ型やＭＥＮ型も見られる。
[1][2][3][4][5]。
菌薬を加水分解して不活化する酵素で、従来のβ−ラク
タマーゼは第一、第二世代のβ−ラクタム剤を分解し、
不活化していた。そこでこの酵素に対抗するために第三
世代の薬剤が開発され使用されてきたが、最近これらの
薬剤を分解する酵素を持った耐性菌が出現している。こ
のように第一、第二世代のβ−ラクタム剤に対するβ−
ラクタマーゼを持った菌が突然変異を起こし、その菌が
産生する分解可能な基質の種類を広げた酵素を基質拡張
型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）と呼び、その菌がＥＳ
ＢＬ産生菌と呼ばれている。１９８０年代中頃から欧米
を中心にＣＴＸやＣＡＺ等に耐性を示すＥＳＢＬ産生菌
として肺炎桿菌や大腸菌が分離されるようになり臨床上
の問題となっている。最近は日本においてもＥＳＢＬ産
生菌が分離され、特に院内感染の原因菌として問題視さ
れている。ＥＳＢＬは、尿、喀痰、便などの臨床材料か
ら分離されているが、その産生するＥＳＢＬは、欧米で
はＴＥＭ型やＳＨＶ型の酵素が主であるが、日本ではＴ
ｏｈｏ型が多く、またＫＩＴ型やＭＥＮ型も見られる。
[1][2][3][4][5]。
【０００４】このＥＳＢＬ産生菌の検出法としては種々
の報告があるが、標準化された方法は無く、ＥＳＢＬ産
生菌の確認に関しては未だ混乱した状態にあり、わずか
にＮＣＣＬＳが示した暫定的検出案が実用可能な方法と
して示されているにすぎない。ＮＣＣＬＳは、１９９９
年１月に１年間の試用期間を定めて、ディスク法および
微量液体希釈法による、暫定的な検出法、確認法のガイ
ドライン（M100-S9）を公表した。[6][7]。
の報告があるが、標準化された方法は無く、ＥＳＢＬ産
生菌の確認に関しては未だ混乱した状態にあり、わずか
にＮＣＣＬＳが示した暫定的検出案が実用可能な方法と
して示されているにすぎない。ＮＣＣＬＳは、１９９９
年１月に１年間の試用期間を定めて、ディスク法および
微量液体希釈法による、暫定的な検出法、確認法のガイ
ドライン（M100-S9）を公表した。[6][7]。
【０００５】このＮＣＣＬＳのディスク法暫定案[6]
は、スクリーニング試験法と確認試験法に分かれてい
る。スクリーニング試験はディスク拡散標準法に準拠し
て行われる。それぞれ、ＣＰＤＸ １０μg、ＣＡＺ
３０μg、ＡＺＴ ３０μg、ＣＴＸ３０μg、ＣＴＲＸ
３０μgを含有するディスクを用いて、試験菌を３５
℃１６−１８時間ミューラーヒントン寒天培地上で好気
培養し、形成される阻止円の直径を測定し、これらのデ
ィスクの阻止円径がどれか一つでも下記の基準以下の場
合に「ＥＳＢＬ産生を疑う」とされている。
は、スクリーニング試験法と確認試験法に分かれてい
る。スクリーニング試験はディスク拡散標準法に準拠し
て行われる。それぞれ、ＣＰＤＸ １０μg、ＣＡＺ
３０μg、ＡＺＴ ３０μg、ＣＴＸ３０μg、ＣＴＲＸ
３０μgを含有するディスクを用いて、試験菌を３５
℃１６−１８時間ミューラーヒントン寒天培地上で好気
培養し、形成される阻止円の直径を測定し、これらのデ
ィスクの阻止円径がどれか一つでも下記の基準以下の場
合に「ＥＳＢＬ産生を疑う」とされている。
【０００６】確認試験もディスク拡散標準法に準拠して
行われる。ＣＡＺディスク（３０μg）とＣＡＺ／ＣＶ
Ａディスク（３０μg／１０μg）との組合わせ、およ
び、ＣＴＸディスク（３０μg）とＣＴＸ／ＣＶＡディ
スク（３０μg／１０μg）との組合わせを用い、スクリ
ーニングでＥＳＢＬが疑われた試験菌を３５℃１６−１
８時間ミューラーヒントン寒天培地上で好気培養し、形
成される阻止円の直径を測定し、どちらかの組合せにお
いてＣＶＡ添加ディスクの阻止円径が無添加ディスクよ
り５mm以上大きいものをＥＳＢＬとしている。つまり、
例えばＣＡＺディスクの阻止円が１６mmで、ＣＡＺ／Ｃ
ＶＡディスク阻止円が２１mmのとき、その菌はＥＳＢＬ
と判定される。
行われる。ＣＡＺディスク（３０μg）とＣＡＺ／ＣＶ
Ａディスク（３０μg／１０μg）との組合わせ、およ
び、ＣＴＸディスク（３０μg）とＣＴＸ／ＣＶＡディ
スク（３０μg／１０μg）との組合わせを用い、スクリ
ーニングでＥＳＢＬが疑われた試験菌を３５℃１６−１
８時間ミューラーヒントン寒天培地上で好気培養し、形
成される阻止円の直径を測定し、どちらかの組合せにお
いてＣＶＡ添加ディスクの阻止円径が無添加ディスクよ
り５mm以上大きいものをＥＳＢＬとしている。つまり、
例えばＣＡＺディスクの阻止円が１６mmで、ＣＡＺ／Ｃ
ＶＡディスク阻止円が２１mmのとき、その菌はＥＳＢＬ
と判定される。
【０００７】同様にＮＣＣＬＳの微量液体希釈法（ＭＩ
Ｃ法）暫定案[7]は、スクリーニング試験法と確認試験
法に分かれている。スクリーニング試験は微量液体希釈
法標準法に準拠して行われる。それぞれ、ＣＰＤＸ １
μg/ml、ＣＡＺ １μg/ml、ＡＺＴ １μg/ml、ＣＴＸ
１μg/ml、ＣＴＲＸ １μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ
に、試験菌を接種し、３５℃１６−２０時間好気培養
し、これらの薬剤のどれか一つでも試験菌が発育した場
合に「ＥＳＢＬ産生を疑う」とされている。つまり、い
ずれかの薬剤で２μg/ml以上のＭＩＣを示した場合にＥ
ＳＢＬ産生が疑われる。
Ｃ法）暫定案[7]は、スクリーニング試験法と確認試験
法に分かれている。スクリーニング試験は微量液体希釈
法標準法に準拠して行われる。それぞれ、ＣＰＤＸ １
μg/ml、ＣＡＺ １μg/ml、ＡＺＴ １μg/ml、ＣＴＸ
１μg/ml、ＣＴＲＸ １μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ
に、試験菌を接種し、３５℃１６−２０時間好気培養
し、これらの薬剤のどれか一つでも試験菌が発育した場
合に「ＥＳＢＬ産生を疑う」とされている。つまり、い
ずれかの薬剤で２μg/ml以上のＭＩＣを示した場合にＥ
ＳＢＬ産生が疑われる。
【０００８】確認試験も微量液体希釈法標準法に準拠し
て行われる。ＣＡＭＨＢを基礎培地に用い、ＣＡＺを
０．２５−１２８μg/ml含有する希釈系列とＣＡＺ／Ｃ
ＶＡを０．２５／４−１２８／４μg/ml含有する希釈系
列との組合せ、および、ＣＴＸを０．２５−６４μg/ml
含有する希釈系列とＣＴＸ／ＣＶＡを０．２５／４−６
４／４μg/ml含有する希釈系列との組合せを用い、スク
リーニングでＥＳＢＬが疑われた試験菌を接種し、３５
℃１６−２０時間好気培養し、試験菌の最小発育阻止濃
度（ＭＩＣ）を求め、どちらかの組合せにおいて薬剤単
独のＭＩＣと合剤のＭＩＣが３管（８倍）以上差が出た
ものをＥＳＢＬとしている。つまり、例えばＣＡＺのＭ
ＩＣが８μg/mlで、ＣＡＺ／ＣＶＡ合剤のＭＩＣが１μ
g/mlのとき、その菌はＥＳＢＬと判定される。
て行われる。ＣＡＭＨＢを基礎培地に用い、ＣＡＺを
０．２５−１２８μg/ml含有する希釈系列とＣＡＺ／Ｃ
ＶＡを０．２５／４−１２８／４μg/ml含有する希釈系
列との組合せ、および、ＣＴＸを０．２５−６４μg/ml
含有する希釈系列とＣＴＸ／ＣＶＡを０．２５／４−６
４／４μg/ml含有する希釈系列との組合せを用い、スク
リーニングでＥＳＢＬが疑われた試験菌を接種し、３５
℃１６−２０時間好気培養し、試験菌の最小発育阻止濃
度（ＭＩＣ）を求め、どちらかの組合せにおいて薬剤単
独のＭＩＣと合剤のＭＩＣが３管（８倍）以上差が出た
ものをＥＳＢＬとしている。つまり、例えばＣＡＺのＭ
ＩＣが８μg/mlで、ＣＡＺ／ＣＶＡ合剤のＭＩＣが１μ
g/mlのとき、その菌はＥＳＢＬと判定される。
【０００９】しかしこのＮＣＣＬＳ法は未だ暫定案であ
って、確定された標準法ではなく、また一般の病院や検
査室ではＣＶＡの入手に問題があり、容易に実施できる
試験方法ではない。さらに、欧米と日本のＥＳＢＬの発
現型の違い／頻度によるものと思われるが、日本型のＥ
ＳＢＬではＣＡＺ／ＣＶＡ、ＣＴＸ／ＣＶＡを用いる確
認試験では鑑別できないものが多数見られることが確認
されている。[8]。また[4]や[5]には、市販のＡＭＰＣ
／ＣＶＡディスクを利用したダブルディスク法やその他
の鑑別方法が記載されているが、それらはＮＣＣＬＳ法
に準拠しておらず、また実験手技や判定に熟練を要する
方法である。
って、確定された標準法ではなく、また一般の病院や検
査室ではＣＶＡの入手に問題があり、容易に実施できる
試験方法ではない。さらに、欧米と日本のＥＳＢＬの発
現型の違い／頻度によるものと思われるが、日本型のＥ
ＳＢＬではＣＡＺ／ＣＶＡ、ＣＴＸ／ＣＶＡを用いる確
認試験では鑑別できないものが多数見られることが確認
されている。[8]。また[4]や[5]には、市販のＡＭＰＣ
／ＣＶＡディスクを利用したダブルディスク法やその他
の鑑別方法が記載されているが、それらはＮＣＣＬＳ法
に準拠しておらず、また実験手技や判定に熟練を要する
方法である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、手技や判定に熟練を要せず、ＮＣＣＬＳ法と同様の
操作で容易にかつ正確にＥＳＢＬ産生菌を確認できる鑑
別方法、およびそれに用いる鑑別用ディスクおよび鑑別
用液体培地を提供することにある。
は、手技や判定に熟練を要せず、ＮＣＣＬＳ法と同様の
操作で容易にかつ正確にＥＳＢＬ産生菌を確認できる鑑
別方法、およびそれに用いる鑑別用ディスクおよび鑑別
用液体培地を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】かかる実状において本発
明者らは鋭意努力の結果、β−ラクタマーゼの基質とし
てＣＰＤＸを用い、ＣＰＤＸとβ−ラクタマーゼ阻害剤
を組み合わせると容易にＥＳＢＬが確認できることを見
いだし、本発明を完成した。
明者らは鋭意努力の結果、β−ラクタマーゼの基質とし
てＣＰＤＸを用い、ＣＰＤＸとβ−ラクタマーゼ阻害剤
を組み合わせると容易にＥＳＢＬが確認できることを見
いだし、本発明を完成した。
【００１２】本発明は、 （１）ＣＰＤＸ含有ディスクとＣＰＤＸ／β−ラクタマ
ーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、を用いるＥＳＢＬ
産生菌鑑別法 （２）ＣＰＤＸ含有ディスクとＣＰＤＸ／β−ラクタマ
ーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、および、以下の
(1)(2)の群より選択される１以上の組合せを用いるＥＳ
ＢＬ産生菌鑑別法 (1)ＣＡＺ含有ディスクとＣＡＺ／β−ラクタマーゼ阻
害剤含有ディスクとの組合せ、(2)ＣＴＸ含有ディスク
とＣＴＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組
合せ （３）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（１）
（２）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 （４）１ディスク当たりの薬剤量がそれぞれＣＰＤＸ
５−１５μg、ＣＡＺ２０−４０μg、ＣＴＸ ２０−４
０μg、のディスクと、それぞれにβ−ラクタマーゼ阻
害剤としてＣＶＡ ５−２０μgを添加したディスクと
の組合せを用いる（１）−（３）記載のＥＳＢＬ産生菌
鑑別法 （５）直径６．３５mmの円形濾紙製のディスクを用いる
ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法において、試験菌を接種したミ
ューラーヒントン寒天培地平板上に、ＣＰＤＸ１０μg
を含有する単剤ディスクと、ＣＰＤＸ １０μgおよび
ＣＶＡ １０μgを含有する合剤ディスクとを載せ、３
５℃で１６−１８時間好気培養し、形成される阻止円の
直径を測定し、合剤ディスクの阻止円が単剤ディスクの
阻止円より５mm以上大きいとき、その菌をＥＳＢＬ産生
菌と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法 （６）ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有す
るディスク （７）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（６）記
載のディスク （８）１ディスク当たり、ＣＰＤＸ ５−１５μgおよ
びクラブラン酸ＣＶＡ５−２０μgを含有する（７）記
載のディスク、である。
ーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、を用いるＥＳＢＬ
産生菌鑑別法 （２）ＣＰＤＸ含有ディスクとＣＰＤＸ／β−ラクタマ
ーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、および、以下の
(1)(2)の群より選択される１以上の組合せを用いるＥＳ
ＢＬ産生菌鑑別法 (1)ＣＡＺ含有ディスクとＣＡＺ／β−ラクタマーゼ阻
害剤含有ディスクとの組合せ、(2)ＣＴＸ含有ディスク
とＣＴＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組
合せ （３）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（１）
（２）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 （４）１ディスク当たりの薬剤量がそれぞれＣＰＤＸ
５−１５μg、ＣＡＺ２０−４０μg、ＣＴＸ ２０−４
０μg、のディスクと、それぞれにβ−ラクタマーゼ阻
害剤としてＣＶＡ ５−２０μgを添加したディスクと
の組合せを用いる（１）−（３）記載のＥＳＢＬ産生菌
鑑別法 （５）直径６．３５mmの円形濾紙製のディスクを用いる
ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法において、試験菌を接種したミ
ューラーヒントン寒天培地平板上に、ＣＰＤＸ１０μg
を含有する単剤ディスクと、ＣＰＤＸ １０μgおよび
ＣＶＡ １０μgを含有する合剤ディスクとを載せ、３
５℃で１６−１８時間好気培養し、形成される阻止円の
直径を測定し、合剤ディスクの阻止円が単剤ディスクの
阻止円より５mm以上大きいとき、その菌をＥＳＢＬ産生
菌と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法 （６）ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有す
るディスク （７）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（６）記
載のディスク （８）１ディスク当たり、ＣＰＤＸ ５−１５μgおよ
びクラブラン酸ＣＶＡ５−２０μgを含有する（７）記
載のディスク、である。
【００１３】つまり、本発明はＣＰＤＸ単剤を含有する
ディスクと、ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤の
２薬剤を合わせて含有するディスクを組み合わせて用い
ることを特徴とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法であり、それ
に用いるディスクである。本法に使用可能なβ−ラクタ
マーゼ阻害剤としてはＣＶＡ、ＳＢＴ、ＴＡＺがある
が、その中でも本発明にはＣＶＡが好ましい。またＣＶ
Ａはリチウム塩等の金属塩の形態で差し支えない。また
本法にＮＣＣＬＳ法に記載のＣＡＺとＣＡＺ／ＣＶＡデ
ィスクおよびＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組み
合わせを加えて行うとさらに感度が向上する。本発明に
使用するディスクの材質は特に規定されない。各薬剤が
含浸可能でかつ乾燥可能なもので、さらに使用時に各薬
剤が培地中に放出される材質であれば種々の物質が使用
可能である。またその形状および大きさも特に規定され
ない。それぞれの材質、形状、大きさに応じて、それぞ
れの判定基準を設定すれば良いのである。もし、判定基
準をＮＣＣＬＳと同様に設定するのであれば、材質は通
常のＫＢディスクに用いるペーパー濾紙が適しており、
その形状・大きさは直径６．３５mmの円形が好ましい。
本発明のＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクは製造方法に工夫を
加えることにより安定化され、通常のＫＢディスクと同
様に市場に流通可能である。
ディスクと、ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤の
２薬剤を合わせて含有するディスクを組み合わせて用い
ることを特徴とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法であり、それ
に用いるディスクである。本法に使用可能なβ−ラクタ
マーゼ阻害剤としてはＣＶＡ、ＳＢＴ、ＴＡＺがある
が、その中でも本発明にはＣＶＡが好ましい。またＣＶ
Ａはリチウム塩等の金属塩の形態で差し支えない。また
本法にＮＣＣＬＳ法に記載のＣＡＺとＣＡＺ／ＣＶＡデ
ィスクおよびＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組み
合わせを加えて行うとさらに感度が向上する。本発明に
使用するディスクの材質は特に規定されない。各薬剤が
含浸可能でかつ乾燥可能なもので、さらに使用時に各薬
剤が培地中に放出される材質であれば種々の物質が使用
可能である。またその形状および大きさも特に規定され
ない。それぞれの材質、形状、大きさに応じて、それぞ
れの判定基準を設定すれば良いのである。もし、判定基
準をＮＣＣＬＳと同様に設定するのであれば、材質は通
常のＫＢディスクに用いるペーパー濾紙が適しており、
その形状・大きさは直径６．３５mmの円形が好ましい。
本発明のＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクは製造方法に工夫を
加えることにより安定化され、通常のＫＢディスクと同
様に市場に流通可能である。
【００１４】また本発明は、 （９）ＣＰＤＸ含有液体培地とＣＰＤＸ／β−ラクタマ
ーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、を用いるＥＳＢＬ
産生菌鑑別法 （１０）ＣＰＤＸ含有液体培地とＣＰＤＸ／β−ラクタ
マーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、および、以下の
(1)(2)の群より選択される１以上の組合せを用いるＥＳ
ＢＬ産生菌鑑別法 (1)ＣＡＺ含有液体培地とＣＡＺ／β−ラクタマーゼ阻
害剤含有液体培地との組合せ、(2)ＣＴＸ含有液体培地
とＣＴＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組
合せ （１１）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（９）
（１０）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 （１２）ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/ml、ＣＡＺ
０．２５−１２８μg/ml、ＣＴＸ ０．２５−１２８μ
g/ml、をそれぞれ含有する液体培地と、それぞれにβ−
ラクタマーゼ阻害剤としてＣＶＡ ２−１０μg/mlを添
加した液体培地との組合せを用いる（９）−（１１）記
載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 （１３）薬剤を含有させたＣＡＭＨＢの希釈系列を用い
る微量液体希釈法によるＥＳＢＬ産生菌の鑑別法におい
て、ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/mlを含有する単剤
液体培地と、ＣＰＤＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８
／４μg/mlを含有する合剤液体培地とに、試験菌を接種
し、３５℃で１６−２０時間好気培養し、試験菌のＭＩ
Ｃを測定し、合剤液体培地のＭＩＣが単剤液体培地のＭ
ＩＣより８倍以上小さいとき、その菌をＥＳＢＬ産生菌
と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法 （１４）ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有
する液体培地 （１５）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（１
４）記載の液体培地 （１６）ＣＰＤＸ０．２５−１２８μg/mlおよびＣＶＡ
２−１０μg/mlを含有する（１５）記載の液体培地、で
もある。
ーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、を用いるＥＳＢＬ
産生菌鑑別法 （１０）ＣＰＤＸ含有液体培地とＣＰＤＸ／β−ラクタ
マーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、および、以下の
(1)(2)の群より選択される１以上の組合せを用いるＥＳ
ＢＬ産生菌鑑別法 (1)ＣＡＺ含有液体培地とＣＡＺ／β−ラクタマーゼ阻
害剤含有液体培地との組合せ、(2)ＣＴＸ含有液体培地
とＣＴＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組
合せ （１１）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（９）
（１０）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 （１２）ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/ml、ＣＡＺ
０．２５−１２８μg/ml、ＣＴＸ ０．２５−１２８μ
g/ml、をそれぞれ含有する液体培地と、それぞれにβ−
ラクタマーゼ阻害剤としてＣＶＡ ２−１０μg/mlを添
加した液体培地との組合せを用いる（９）−（１１）記
載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 （１３）薬剤を含有させたＣＡＭＨＢの希釈系列を用い
る微量液体希釈法によるＥＳＢＬ産生菌の鑑別法におい
て、ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/mlを含有する単剤
液体培地と、ＣＰＤＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８
／４μg/mlを含有する合剤液体培地とに、試験菌を接種
し、３５℃で１６−２０時間好気培養し、試験菌のＭＩ
Ｃを測定し、合剤液体培地のＭＩＣが単剤液体培地のＭ
ＩＣより８倍以上小さいとき、その菌をＥＳＢＬ産生菌
と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法 （１４）ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有
する液体培地 （１５）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（１
４）記載の液体培地 （１６）ＣＰＤＸ０．２５−１２８μg/mlおよびＣＶＡ
２−１０μg/mlを含有する（１５）記載の液体培地、で
もある。
【００１５】つまり、本発明はＣＰＤＸ単剤を含有する
液体培地と、ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤の
２薬剤を合わせて含有する液体培地とを組み合わせて用
いることを特徴とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法であり、そ
れに用いる液体培地でもある。本法に使用可能なβ−ラ
クタマーゼ阻害剤としてはＣＶＡ、ＳＢＴ、ＴＡＺがあ
るが、その中でも本発明にはＣＶＡが好ましい。またＣ
ＶＡはリチウム塩等の金属塩の形態で差し支えない。ま
た本法にＮＣＣＬＳ法に記載のＣＡＺとＣＡＺ／ＣＶＡ
液体培地およびＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡ液体培地との組
み合わせを加えて行うとさらに感度が向上する。本発明
に使用する液体培地は、試験菌の生育が阻害や促進され
ない液体培地で希釈系列の作成が容易なものであれば特
に限定されない。それぞれの条件に応じて、それぞれの
判定基準を設定すれば良いのである。もし、ＭＩＣを測
定し、判定基準をＮＣＣＬＳと同様に設定するのであれ
ば、ＮＣＣＬＳと同様に、ＣＡＭＨＢが本発明には好ま
しい。
液体培地と、ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤の
２薬剤を合わせて含有する液体培地とを組み合わせて用
いることを特徴とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法であり、そ
れに用いる液体培地でもある。本法に使用可能なβ−ラ
クタマーゼ阻害剤としてはＣＶＡ、ＳＢＴ、ＴＡＺがあ
るが、その中でも本発明にはＣＶＡが好ましい。またＣ
ＶＡはリチウム塩等の金属塩の形態で差し支えない。ま
た本法にＮＣＣＬＳ法に記載のＣＡＺとＣＡＺ／ＣＶＡ
液体培地およびＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡ液体培地との組
み合わせを加えて行うとさらに感度が向上する。本発明
に使用する液体培地は、試験菌の生育が阻害や促進され
ない液体培地で希釈系列の作成が容易なものであれば特
に限定されない。それぞれの条件に応じて、それぞれの
判定基準を設定すれば良いのである。もし、ＭＩＣを測
定し、判定基準をＮＣＣＬＳと同様に設定するのであれ
ば、ＮＣＣＬＳと同様に、ＣＡＭＨＢが本発明には好ま
しい。
【００１６】またさらに本発明の液体培地は、その希釈
系列を９６穴プレート等の適当な容器に分注し、生培地
として供給されても良いし、凍結保存や乾燥保存が可能
であるので、凍結状態・乾燥状態で供給されても良い。
系列を９６穴プレート等の適当な容器に分注し、生培地
として供給されても良いし、凍結保存や乾燥保存が可能
であるので、凍結状態・乾燥状態で供給されても良い。
【００１７】
【作用】本発明ではＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶ
Ａディスクとを組み合わせて用いるだけで、ＥＳＢＬの
検出が高率で可能であるがさらに、ＮＣＣＬＳ法に記載
のＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスクとの組合
せ、およびＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクと
の組合せとともに試験を行うとさらに検出率が増加す
る。またディスク法のみならず、微量液体希釈法による
ＭＩＣ測定にも応用可能であり、ＣＰＤＸ液体培地とＣ
ＰＤＸ／ＣＶＡ液体培地の組合せにより、さらにＣＡＺ
とＣＡＺ／ＣＶＡ、ＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡとの組み合
わせを併せて行うことにより、ＥＳＢＬを高率で検出で
きる。ＥＳＢＬのような耐性菌の出現はそれぞれの地域
で使用される薬剤の種類に左右されるものであるので、
ヨーロッパ、米国、日本とでは汎用される抗菌薬の種類
が異なり、ＥＳＢＬについてもβ−ラクタマーゼが作用
する基質となる薬剤の種類はそれぞれの国により異なっ
ているものと推定される。従っていわゆる日本型のＥＳ
ＢＬの検出にはＣＰＤＸ／ＣＶＡが適しているものと推
定される。
Ａディスクとを組み合わせて用いるだけで、ＥＳＢＬの
検出が高率で可能であるがさらに、ＮＣＣＬＳ法に記載
のＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスクとの組合
せ、およびＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクと
の組合せとともに試験を行うとさらに検出率が増加す
る。またディスク法のみならず、微量液体希釈法による
ＭＩＣ測定にも応用可能であり、ＣＰＤＸ液体培地とＣ
ＰＤＸ／ＣＶＡ液体培地の組合せにより、さらにＣＡＺ
とＣＡＺ／ＣＶＡ、ＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡとの組み合
わせを併せて行うことにより、ＥＳＢＬを高率で検出で
きる。ＥＳＢＬのような耐性菌の出現はそれぞれの地域
で使用される薬剤の種類に左右されるものであるので、
ヨーロッパ、米国、日本とでは汎用される抗菌薬の種類
が異なり、ＥＳＢＬについてもβ−ラクタマーゼが作用
する基質となる薬剤の種類はそれぞれの国により異なっ
ているものと推定される。従っていわゆる日本型のＥＳ
ＢＬの検出にはＣＰＤＸ／ＣＶＡが適しているものと推
定される。
【００１８】以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細
に説明する。なお、下記実施例は単に説明のためのもの
であり、本発明を何ら限定するものではない。
に説明する。なお、下記実施例は単に説明のためのもの
であり、本発明を何ら限定するものではない。
【００１９】実施例１ ＣＶＡ含有ディスクの作成 ＮＣＣＬＳガイドライン[6]に従い、ビーチャム社より
購入したＣＶＡを精製水に溶解し、１０００μg/mlの溶
液を作成した。栄研化学（株）製直径６．３５mmのＫＢ
ディスクＣＰＤＸ（１０μg含有）、ＣＡＺ（３０μg含
有）、ＣＴＸ（３０μg含有）にそれぞれ上記ＣＶＡ溶
液１０μl（１０μg含有）を滴下し、５０℃で２０分間
乾燥し、ＣＰＤＸ／ＣＶＡディスク（１０／１０μg含
有）、ＣＡＺ／ＣＶＡディスク（３０／１０μg含
有）、ＣＴＸ／ＣＶＡ（３０／１０μg含有）ディスク
を作成した。本ディスクは冷所保存(２−１０℃)で１年
間使用可能であった。
購入したＣＶＡを精製水に溶解し、１０００μg/mlの溶
液を作成した。栄研化学（株）製直径６．３５mmのＫＢ
ディスクＣＰＤＸ（１０μg含有）、ＣＡＺ（３０μg含
有）、ＣＴＸ（３０μg含有）にそれぞれ上記ＣＶＡ溶
液１０μl（１０μg含有）を滴下し、５０℃で２０分間
乾燥し、ＣＰＤＸ／ＣＶＡディスク（１０／１０μg含
有）、ＣＡＺ／ＣＶＡディスク（３０／１０μg含
有）、ＣＴＸ／ＣＶＡ（３０／１０μg含有）ディスク
を作成した。本ディスクは冷所保存(２−１０℃)で１年
間使用可能であった。
【００２０】実施例２ ＥＳＢＬ産生菌の阻止円直径の
測定 ＥＳＢＬ産生菌であることが確認されている大腸菌２
株、肺炎桿菌２株、およびＥＳＢＬではない大腸菌２
株、肺炎桿菌２株を用いて、実施例１で作成したディス
クを用いて、阻止円の直径を測定した。純培養した試験
菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭ
ｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したもの
を綿棒を用いてミューラーヒントン寒天培地表面に均一
に接種した。その上にＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／Ｃ
ＶＡディスク、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディス
ク、ＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクを載せ、
３５℃で１８時間好気培養し、それぞれの阻止円直径を
シャーレの裏からmm単位で正確に測定した。結果を表１
（ＥＳＢＬ産生菌）、表２（非ＥＳＢＬ産生菌）に示
す。
測定 ＥＳＢＬ産生菌であることが確認されている大腸菌２
株、肺炎桿菌２株、およびＥＳＢＬではない大腸菌２
株、肺炎桿菌２株を用いて、実施例１で作成したディス
クを用いて、阻止円の直径を測定した。純培養した試験
菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭ
ｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したもの
を綿棒を用いてミューラーヒントン寒天培地表面に均一
に接種した。その上にＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／Ｃ
ＶＡディスク、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディス
ク、ＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクを載せ、
３５℃で１８時間好気培養し、それぞれの阻止円直径を
シャーレの裏からmm単位で正確に測定した。結果を表１
（ＥＳＢＬ産生菌）、表２（非ＥＳＢＬ産生菌）に示
す。
【００２１】
【表１】 ＥＳＢＬ産生菌 ───────────────────────────────── 菌名 薬剤名 （阻止円直径 mm） ───────────────────────────────── CPDX CPDX/CVA CAZ CAZ/CVA CTX CTX/CVA ─────────────────────────────────E.coli 4119 0 25 23 29 0 29E.coli 4138 0 24 23 27 0 28K.pneumoniae 4120 0 24 23 26 0 27K.pneumoniae 4135 0 25 23 28 0 26 ─────────────────────────────────
【００２２】
【表２】 非ＥＳＢＬ産生菌 ───────────────────────────────── 菌名 薬剤名 （阻止円直径 mm） ───────────────────────────────── CPDX CPDX/CVA CAZ CAZ/CVA CTX CTX/CVA ─────────────────────────────────E.coli 2711 24 27 29 29 31 31E.coli 2712 25 27 30 29 31 32K.pneumoniae 2716 27 27 28 28 31 31K.pneumoniae 2717 28 27 30 29 33 32 ─────────────────────────────────
【００２３】各菌の阻止円直径は表１および表２に示す
とおりであった。表１（ＥＳＢＬ産生菌）において、各
菌はＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合
せにおいて、その阻止円径の差が５mm以上であるので、
全てＥＳＢＬと判定された。ＣＡＺディスクとＣＡＺ／
ＣＶＡディスクとの組合せにおいては、E.coli 4119株
および K.pneumoniae 4135株は、その阻止円径の差が５
mm以上であるので、ＥＳＢＬと判定されたが、E.coli 4
138株および K.pneumoniae4120株はその差が５mm未満で
あるのでＥＳＢＬとは判定されなかった。ＣＰＤＸディ
スクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいて
は、各菌ともその阻止円径の差は５mm以上であった。表
２（非ＥＳＢＬ産生菌）において、各菌はＣＡＺディス
クとＣＡＺ／ＣＶＡディスクとの組合せおよびＣＴＸデ
ィスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいて、
その阻止円径の差が５mm未満であるので、すべてＥＳＢ
Ｌとは判定されなかった。ＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ
／ＣＶＡディスクとの組合せにおいても、各菌ともその
阻止円径の差は５mm未満であった。従って、ＮＣＣＬＳ
法と同様に、本発明におけるＣＰＤＸディスクとＣＰＤ
Ｘ／ＣＶＡディスクとの阻止円直径の差が５mm以上の
時、試験菌をＥＳＢＬ産生菌と判定することにした。
とおりであった。表１（ＥＳＢＬ産生菌）において、各
菌はＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合
せにおいて、その阻止円径の差が５mm以上であるので、
全てＥＳＢＬと判定された。ＣＡＺディスクとＣＡＺ／
ＣＶＡディスクとの組合せにおいては、E.coli 4119株
および K.pneumoniae 4135株は、その阻止円径の差が５
mm以上であるので、ＥＳＢＬと判定されたが、E.coli 4
138株および K.pneumoniae4120株はその差が５mm未満で
あるのでＥＳＢＬとは判定されなかった。ＣＰＤＸディ
スクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいて
は、各菌ともその阻止円径の差は５mm以上であった。表
２（非ＥＳＢＬ産生菌）において、各菌はＣＡＺディス
クとＣＡＺ／ＣＶＡディスクとの組合せおよびＣＴＸデ
ィスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいて、
その阻止円径の差が５mm未満であるので、すべてＥＳＢ
Ｌとは判定されなかった。ＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ
／ＣＶＡディスクとの組合せにおいても、各菌ともその
阻止円径の差は５mm未満であった。従って、ＮＣＣＬＳ
法と同様に、本発明におけるＣＰＤＸディスクとＣＰＤ
Ｘ／ＣＶＡディスクとの阻止円直径の差が５mm以上の
時、試験菌をＥＳＢＬ産生菌と判定することにした。
【００２４】実施例３ ＥＳＢＬ産生菌および非産生菌
の確認 ＰＣＲ法による耐性遺伝子の検出でＥＳＢＬ産生菌もし
くは非産生菌であることが確認されているEscherichia
coli １９株（内ＥＳＢＬ産生菌１３株）、Klebsiella
pneumoniae ２３株（内ＥＳＢＬ産生菌１８株）を試験
菌として用い、実施例２と同様に培養し、各阻止円の直
径を測定し、ＣＶＡ含有ディスク阻止円径が無添加ディ
スクより５mm以上大きい菌をＥＳＢＬと判定した。結果
を表３に示す。表３においてtypeの欄にESBLsの記載の
ある菌はＰＣＲ法にてＥＳＢＬ産生菌であることが確認
されている菌である。また各薬剤の欄でESBLの記載のあ
る菌は、阻止円直径の差よりＥＳＢＬと判定された菌で
ある。
の確認 ＰＣＲ法による耐性遺伝子の検出でＥＳＢＬ産生菌もし
くは非産生菌であることが確認されているEscherichia
coli １９株（内ＥＳＢＬ産生菌１３株）、Klebsiella
pneumoniae ２３株（内ＥＳＢＬ産生菌１８株）を試験
菌として用い、実施例２と同様に培養し、各阻止円の直
径を測定し、ＣＶＡ含有ディスク阻止円径が無添加ディ
スクより５mm以上大きい菌をＥＳＢＬと判定した。結果
を表３に示す。表３においてtypeの欄にESBLsの記載の
ある菌はＰＣＲ法にてＥＳＢＬ産生菌であることが確認
されている菌である。また各薬剤の欄でESBLの記載のあ
る菌は、阻止円直径の差よりＥＳＢＬと判定された菌で
ある。
【００２５】
【表３】 ────────────────────────────────── 菌名 type 薬剤名 ────────────────────────────────── CPDX CAZ CTX ──────────────────────────────────Escherichia coli 4119 ESBLs ESBL ESBL ESBLEscherichia coli 4121 ESBLs ESBL ESBL ESBLEscherichia coli 4122 ESBLs ESBL ESBL ESBLEscherichia coli 4123 ESBLs ESBL ESBL ESBLEscherichia coli 4138 ESBLs ESBL ESBLEscherichia coli 4140 ESBLs ESBL ESBL ESBLEscherichia coli 4141 ESBLs ESBLEscherichia coli 4142 ESBLs ESBLEscherichia coli 4143 ESBLs ESBLEscherichia coli 4148 ESBLs ESBLEscherichia coli 4149 ESBLs ESBLEscherichia coli 4150 ESBLs ESBLEscherichia coli 4173 ESBLs ESBLEscherichia coli 2711Escherichia coli 2712Escherichia coli 2713Escherichia coli 2714Escherichia coli 2715Escherichia coli 3087Klebsiella pneumoniae 4120 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4124 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4125 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4126 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4127 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4128 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4135 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4143 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4153 ESBLs ESBLKlebsiella pneumoniae 4155 ESBLs ESBLKlebsiella pneumoniae 4156 ESBLs ESBLKlebsiella pneumoniae 4157 ESBLs ESBLKlebsiella pneumoniae 4160 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4161 ESBLsKlebsiella pneumoniae 4162 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4169 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4171 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4172 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 2716Klebsiella pneumoniae 2717Klebsiella pneumoniae 2718Klebsiella pneumoniae 2719Klebsiella pneumoniae 2720 ────────────────────────────────── 感 度 94% 39% 61% ────────────────────────────────── 特異性 100% 100% 100% ────────────────────────────────── 一致率 95% 55% 71% ──────────────────────────────────
【００２６】上表において、感度とは（ＥＳＢＬと正し
く判定された菌数）／（全ＥＳＢＬ産生菌数）を表し、
特異性とは（非ＥＳＢＬと正しく判定された菌数）／
（全非ＥＳＢＬ産生菌数）を表し、一致率とは（ＥＳＢ
Ｌ・非ＥＳＢＬを正しく判定された菌数）／（全検体
数）を表している。言い換えれば、感度はＥＳＢＬがＥ
ＳＢＬとして判定される確率をいい、特異性はＥＳＢＬ
でないものがＥＳＢＬでないと判定される確率をいい、
一致率はそれぞれが正しく判定される確率を表す。つま
りＣＰＤＸで言えば、感度は２９／３１＝９４％とな
り、特異性は１１／１１＝１００％となり、一致率は４
０／４２＝９５％となる。
く判定された菌数）／（全ＥＳＢＬ産生菌数）を表し、
特異性とは（非ＥＳＢＬと正しく判定された菌数）／
（全非ＥＳＢＬ産生菌数）を表し、一致率とは（ＥＳＢ
Ｌ・非ＥＳＢＬを正しく判定された菌数）／（全検体
数）を表している。言い換えれば、感度はＥＳＢＬがＥ
ＳＢＬとして判定される確率をいい、特異性はＥＳＢＬ
でないものがＥＳＢＬでないと判定される確率をいい、
一致率はそれぞれが正しく判定される確率を表す。つま
りＣＰＤＸで言えば、感度は２９／３１＝９４％とな
り、特異性は１１／１１＝１００％となり、一致率は４
０／４２＝９５％となる。
【００２７】上表に示すようにＣＰＤＸディスクとＣＰ
ＤＸ／ＣＶＡディスクとの組合せで９４％の感度が得ら
れた。さらにＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディス
ク、ＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合
せの結果を加えるとE.coli 4173株もＥＳＢＬと判定さ
れるので感度は９７％に増加する。ＮＣＣＬＳ法に従っ
て、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスク、ＣＴＸ
ディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せのみで判
定すると感度は６５％に留まり、ＮＣＣＬＳ法では問題
があることが解る。
ＤＸ／ＣＶＡディスクとの組合せで９４％の感度が得ら
れた。さらにＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディス
ク、ＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合
せの結果を加えるとE.coli 4173株もＥＳＢＬと判定さ
れるので感度は９７％に増加する。ＮＣＣＬＳ法に従っ
て、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスク、ＣＴＸ
ディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せのみで判
定すると感度は６５％に留まり、ＮＣＣＬＳ法では問題
があることが解る。
【００２８】実施例４ 患者検体の判定 ＥＳＢＬ産生菌感染が疑われる患者５名の糞便検体よ
り、大腸菌を分離し、実施例２と同様に操作し、それぞ
れの阻止円直径を測定し、判定を行った。結果を表４に
示す。
り、大腸菌を分離し、実施例２と同様に操作し、それぞ
れの阻止円直径を測定し、判定を行った。結果を表４に
示す。
【００２９】
【表４】 検体１−４はＥＳＢＬ産生菌と判定された。検体４はＮ
ＣＣＬＳ法ではＥＳＢＬとは判定されず、本法によりＥ
ＳＢＬが判明した。
ＣＣＬＳ法ではＥＳＢＬとは判定されず、本法によりＥ
ＳＢＬが判明した。
【００３０】実施例５ 微量液体希釈法（ＭＩＣ測定）
によるＥＳＢＬ産生菌および非産生菌の確認 実施例３で使用したＥＳＢＬ産生菌もしくは非産生菌で
あることが確認されているEscherichia coli １９株
（内ＥＳＢＬ産生菌１３株）、Klebsiella pneumoniae
２３株（内ＥＳＢＬ産生菌１８株）を試験菌として用
い、ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/mlを含有するＣＡ
ＭＨＢ液体培地（希釈系列）とＣＰＤＸ／ＣＶＡ ０．
２５／４−１２８／４μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体
培地（希釈系列）の組合せと、ＣＡＺ ０．２５−１２
８μg/mlとＣＡＺＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／
４μg/mlの組合せ、ＣＴＸ ０．２５−１２８μg/mlと
ＣＴＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／４μg/mlの組
合せを用い、ＮＣＣＬＳガイドラインに従い、微量液体
希釈法で試験菌を培養し、ＭＩＣを測定した。２倍希釈
で作成した各薬剤濃度のＣＡＭＨＢ液体培地を９６穴の
マイクロタイタープレートに１００μlずつ分注した。
純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨ
ンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるま
で培養したものを希釈し、培地１mlあたりの菌数が約１
０4個になるように各穴に接種し、３５℃で１８時間好
気培養したのち、それぞれの最小発育阻止濃度（ＭＩ
Ｃ）を測定した。合剤のＭＩＣが単剤のＭＩＣより３管
（８倍）以上離れているものをＥＳＢＬと判定した。結
果を表５に示す。
によるＥＳＢＬ産生菌および非産生菌の確認 実施例３で使用したＥＳＢＬ産生菌もしくは非産生菌で
あることが確認されているEscherichia coli １９株
（内ＥＳＢＬ産生菌１３株）、Klebsiella pneumoniae
２３株（内ＥＳＢＬ産生菌１８株）を試験菌として用
い、ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/mlを含有するＣＡ
ＭＨＢ液体培地（希釈系列）とＣＰＤＸ／ＣＶＡ ０．
２５／４−１２８／４μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体
培地（希釈系列）の組合せと、ＣＡＺ ０．２５−１２
８μg/mlとＣＡＺＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／
４μg/mlの組合せ、ＣＴＸ ０．２５−１２８μg/mlと
ＣＴＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／４μg/mlの組
合せを用い、ＮＣＣＬＳガイドラインに従い、微量液体
希釈法で試験菌を培養し、ＭＩＣを測定した。２倍希釈
で作成した各薬剤濃度のＣＡＭＨＢ液体培地を９６穴の
マイクロタイタープレートに１００μlずつ分注した。
純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨ
ンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるま
で培養したものを希釈し、培地１mlあたりの菌数が約１
０4個になるように各穴に接種し、３５℃で１８時間好
気培養したのち、それぞれの最小発育阻止濃度（ＭＩ
Ｃ）を測定した。合剤のＭＩＣが単剤のＭＩＣより３管
（８倍）以上離れているものをＥＳＢＬと判定した。結
果を表５に示す。
【００３１】
【表５】 ────────────────────────────────── 菌名 type 薬剤名 ────────────────────────────────── CPDX CAZ CTX ──────────────────────────────────Escherichia coli 4119 ESBLs ESBL ESBL ESBLEscherichia coli 4121 ESBLs ESBL ESBL ESBLEscherichia coli 4122 ESBLs ESBL ESBL ESBLEscherichia coli 4123 ESBLs ESBL ESBL ESBLEscherichia coli 4138 ESBLs ESBL ESBLEscherichia coli 4140 ESBLs ESBL ESBL ESBLEscherichia coli 4141 ESBLs ESBLEscherichia coli 4142 ESBLs ESBLEscherichia coli 4143 ESBLs ESBLEscherichia coli 4148 ESBLs ESBLEscherichia coli 4149 ESBLs ESBLEscherichia coli 4150 ESBLs ESBLEscherichia coli 4173 ESBLs ESBLEscherichia coli 2711Escherichia coli 2712Escherichia coli 2713Escherichia coli 2714Escherichia coli 2715Escherichia coli 3087Klebsiella pneumoniae 4120 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4124 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4125 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4126 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4127 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4128 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4135 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4143 ESBLs ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4153 ESBLs ESBLKlebsiella pneumoniae 4155 ESBLs ESBLKlebsiella pneumoniae 4156 ESBLs ESBLKlebsiella pneumoniae 4157 ESBLs ESBLKlebsiella pneumoniae 4160 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4161 ESBLsKlebsiella pneumoniae 4162 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4169 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4171 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 4172 ESBLs ESBL ESBL ESBLKlebsiella pneumoniae 2716Klebsiella pneumoniae 2717Klebsiella pneumoniae 2718Klebsiella pneumoniae 2719Klebsiella pneumoniae 2720 ────────────────────────────────── 感 度 94% 39% 61% ────────────────────────────────── 特異性 100% 100% 100% ────────────────────────────────── 一致率 95% 55% 71% ──────────────────────────────────
【００３２】実施例３と同様の結果が得られ、本発明は
微量液体希釈法でも高い感度、一致率を示した。またＣ
ＰＤＸの結果にＣＡＺおよびＣＴＸの結果を加えると、
実施例３と同様に、E.coli 4173株もＥＳＢＬと判定さ
れるので感度は９７％に増加する。ＮＣＣＬＳ法の組合
せのみで判定すると感度は６５％に留まる。
微量液体希釈法でも高い感度、一致率を示した。またＣ
ＰＤＸの結果にＣＡＺおよびＣＴＸの結果を加えると、
実施例３と同様に、E.coli 4173株もＥＳＢＬと判定さ
れるので感度は９７％に増加する。ＮＣＣＬＳ法の組合
せのみで判定すると感度は６５％に留まる。
【００３３】
【発明の効果】ＮＣＣＬＳのディスクを用いる方法で
は、試験を行う度にＣＶＡ溶液を作製し、ＣＡＺとＣＴ
Ｘのディスクに所定の濃度を添加する必要があり、操作
が煩雑である。また、溶解したＣＶＡは安定性が悪く、
十分な管理を行わなければ判定結果に影響を及ぼす。本
発明の合剤ディスクは薬剤の安定性が改良され、乾燥状
態であれば冷所で１年間使用可能であるので、要時調製
の煩雑さが無く、安定した成績が得られる。また本発明
の液体培地は、９６穴プレート等の適当な容器に分注
し、生培地として供給されても良いし、凍結保存や乾燥
保存が可能であるので、凍結状態・乾燥状態で供給され
ても良い。その結果、面倒な要時調製が不要となる。
は、試験を行う度にＣＶＡ溶液を作製し、ＣＡＺとＣＴ
Ｘのディスクに所定の濃度を添加する必要があり、操作
が煩雑である。また、溶解したＣＶＡは安定性が悪く、
十分な管理を行わなければ判定結果に影響を及ぼす。本
発明の合剤ディスクは薬剤の安定性が改良され、乾燥状
態であれば冷所で１年間使用可能であるので、要時調製
の煩雑さが無く、安定した成績が得られる。また本発明
の液体培地は、９６穴プレート等の適当な容器に分注
し、生培地として供給されても良いし、凍結保存や乾燥
保存が可能であるので、凍結状態・乾燥状態で供給され
ても良い。その結果、面倒な要時調製が不要となる。
【００３４】耐性菌、特にＥＳＢＬのような耐性菌の出
現はそれぞれの地域で使用される薬剤の種類に左右され
る。医療保険制度などの関連でヨーロッパ、米国、日本
とでは汎用される抗菌薬の種類が異なり、ＥＳＢＬにつ
いてもβ−ラクタマーゼが作用する基質となる薬剤の種
類はそれぞれの国により異なっている。ＮＣＣＬＳのＥ
ＳＢＬの確認法では基質としてＣＡＺとＣＴＸを用いて
いるが、これは米国での薬剤の使用状況を基本に作成さ
れているためと考えられ、いわゆる日本型のＥＳＢＬの
実状に適合していない。日本国内では投与量等の関係上
これら２薬剤よりもＣＰＤＸの使用頻度が高いため、Ｅ
ＳＢＬの検査を目的とした基質としてはＣＰＤＸを用い
る方が、より確実にＥＳＢＬの鑑別が可能になる。ＥＳ
ＢＬ産生菌感染症は治療しうる抗菌薬が存在する。従っ
て、的確な診断と適切な抗菌薬の選択を行えば、ＭＲＳ
ＡやＶＲＥと異なり、治療が比較的容易である。本発明
により、ＥＳＢＬ産生菌の存在が容易に確認でき、より
効果的な治療や耐性菌の蔓延を防ぐことができる。
現はそれぞれの地域で使用される薬剤の種類に左右され
る。医療保険制度などの関連でヨーロッパ、米国、日本
とでは汎用される抗菌薬の種類が異なり、ＥＳＢＬにつ
いてもβ−ラクタマーゼが作用する基質となる薬剤の種
類はそれぞれの国により異なっている。ＮＣＣＬＳのＥ
ＳＢＬの確認法では基質としてＣＡＺとＣＴＸを用いて
いるが、これは米国での薬剤の使用状況を基本に作成さ
れているためと考えられ、いわゆる日本型のＥＳＢＬの
実状に適合していない。日本国内では投与量等の関係上
これら２薬剤よりもＣＰＤＸの使用頻度が高いため、Ｅ
ＳＢＬの検査を目的とした基質としてはＣＰＤＸを用い
る方が、より確実にＥＳＢＬの鑑別が可能になる。ＥＳ
ＢＬ産生菌感染症は治療しうる抗菌薬が存在する。従っ
て、的確な診断と適切な抗菌薬の選択を行えば、ＭＲＳ
ＡやＶＲＥと異なり、治療が比較的容易である。本発明
により、ＥＳＢＬ産生菌の存在が容易に確認でき、より
効果的な治療や耐性菌の蔓延を防ぐことができる。
【００３５】
【参考文献】[1]医学の歩み、１８５（５）、３１３、
１９９８ [2]臨床と微生物、２６（２）、１０３、１９９９ [3]臨床と微生物、２６（２）、１２１、１９９９ [4]臨床と微生物、２６（２）、１４７、１９９９ [5]Medical Technology、２７（４）、３５３、１９９
９ [6]NCCLS Document、１９（１）、３６、１９９９ [7]NCCLS Document、１９（１）、７５、１９９９ [8]内部データ、第４７回日本化学療法学会総会（１９
９９年６月１１−１２日、東京）において発表予定
１９９８ [2]臨床と微生物、２６（２）、１０３、１９９９ [3]臨床と微生物、２６（２）、１２１、１９９９ [4]臨床と微生物、２６（２）、１４７、１９９９ [5]Medical Technology、２７（４）、３５３、１９９
９ [6]NCCLS Document、１９（１）、３６、１９９９ [7]NCCLS Document、１９（１）、７５、１９９９ [8]内部データ、第４７回日本化学療法学会総会（１９
９９年６月１１−１２日、東京）において発表予定
Claims (16)
- 【請求項１】セフポドキシム含有ディスクとセフポドキ
シム／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合
せ、を用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法 - 【請求項２】セフポドキシム含有ディスクとセフポドキ
シム／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合
せ、および、以下の(1)(2)の群より選択される１以上の
組合せを用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法 (1)セフタジジム含有ディスクとセフタジジム／β−ラ
クタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、(2)セフォ
タキシム含有ディスクとセフォタキシム／β−ラクタマ
ーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ - 【請求項３】β−ラクタマーゼ阻害剤がクラブラン酸で
ある請求項１、２記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 - 【請求項４】１ディスク当たりの薬剤量がそれぞれセフ
ポドキシム ５−１５μg、セフタジジム ２０−４０
μg、セフォタキシム ２０−４０μg、のディスクと、
それぞれにβ−ラクタマーゼ阻害剤としてクラブラン酸
５−２０μgを添加したディスクとの組合せを用いる
請求項１−３記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 - 【請求項５】直径６．３５mmの円形濾紙製のディスクを
用いるＥＳＢＬ産生菌の鑑別法において、試験菌を接種
したミューラーヒントン寒天培地平板上に、セフポドキ
シム１０μgを含有する単剤ディスクと、セフポドキシ
ム １０μgおよびクラブラン酸 １０μgを含有する合
剤ディスクとを載せ、３５℃で１６−１８時間好気培養
し、形成される阻止円の直径を測定し、合剤ディスクの
阻止円が単剤ディスクの阻止円より５mm以上大きいと
き、その菌をＥＳＢＬ産生菌と判定する、ＥＳＢＬ産生
菌の鑑別法 - 【請求項６】セフポドキシムおよびβ−ラクタマーゼ阻
害剤を含有するディスク - 【請求項７】β−ラクタマーゼ阻害剤がクラブラン酸で
ある請求項６記載のディスク - 【請求項８】１ディスク当たり、セフポドキシム ５−
１５μgおよびクラブラン酸 ５−２０μgを含有する請
求項７記載のディスク - 【請求項９】セフポドキシム含有液体培地とセフポドキ
シム／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合
せ、を用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法 - 【請求項１０】セフポドキシム含有液体培地とセフポド
キシム／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合
せ、および、以下の(1)(2)の群より選択される１以上の
組合せを用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法 (1)セフタジジム含有液体培地とセフタジジム／β−ラ
クタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、(2)セフォ
タキシム含有液体培地とセフォタキシム／β−ラクタマ
ーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ - 【請求項１１】β−ラクタマーゼ阻害剤がクラブラン酸
である請求項９、１０記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 - 【請求項１２】セフポドキシム ０．２５−１２８μg/
ml、セフタジジム ０．２５−１２８μg/ml、セフォタ
キシム ０．２５−１２８μg/ml、をそれぞれ含有する
液体培地と、それぞれにβ−ラクタマーゼ阻害剤として
クラブラン酸 ２−１０μg/mlを添加した液体培地との
組合せを用いる請求項９−１１記載のＥＳＢＬ産生菌鑑
別法 - 【請求項１３】薬剤を含有させた陽イオン調整ミューラ
ー・ヒントン液体培地の希釈系列を用いる微量液体希釈
法によるＥＳＢＬ産生菌の鑑別法において、セフポドキ
シム ０．２５−１２８μg/mlを含有する単剤液体培地
と、セフポドキシム／クラブラン酸 ０．２５／４−１
２８／４μg/mlを含有する合剤液体培地とに、試験菌を
接種し、３５℃で１６−２０時間好気培養し、試験菌の
最小発育阻止濃度を測定し、合剤液体培地の最小発育阻
止濃度が単剤液体培地のそれより８倍以上小さいとき、
その菌をＥＳＢＬ産生菌と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の
鑑別法 - 【請求項１４】セフポドキシムおよびβ−ラクタマーゼ
阻害剤を含有する液体培地 - 【請求項１５】β−ラクタマーゼ阻害剤がクラブラン酸
である請求項１４記載の液体培地 - 【請求項１６】セフポドキシム ０．２５−１２８μg/
mlおよびクラブラン酸 ２−１０μg/mlを含有する請求
項１５記載液体培地
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13410999A JP4437849B2 (ja) | 1999-05-14 | 1999-05-14 | 基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13410999A JP4437849B2 (ja) | 1999-05-14 | 1999-05-14 | 基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000316597A true JP2000316597A (ja) | 2000-11-21 |
| JP4437849B2 JP4437849B2 (ja) | 2010-03-24 |
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ID=15120675
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13410999A Expired - Lifetime JP4437849B2 (ja) | 1999-05-14 | 1999-05-14 | 基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4437849B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002024707A1 (fr) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisya | Composes cephemes et reactifs de detection de beta-lactamases a large spectre, contenant ces composes |
| WO2005056820A1 (ja) * | 2003-12-15 | 2005-06-23 | Japan Health Sciences Foundation | クラスC型β‐ラクタマーゼ産生菌の簡易検出法 |
| JP2012095678A (ja) * | 2005-02-10 | 2012-05-24 | Biomerieux | 耐性微生物の特異的検出用の培地 |
| US10782291B2 (en) | 2006-12-19 | 2020-09-22 | Becton Dickinson And Company | Chromogenic medium for the detection and identification of Vancomycin resistant enterococci and method therefor |
-
1999
- 1999-05-14 JP JP13410999A patent/JP4437849B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002024707A1 (fr) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisya | Composes cephemes et reactifs de detection de beta-lactamases a large spectre, contenant ces composes |
| US6897304B2 (en) | 2000-09-22 | 2005-05-24 | Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Cephem compounds and ESBL-detecting reagents containing the same |
| WO2005056820A1 (ja) * | 2003-12-15 | 2005-06-23 | Japan Health Sciences Foundation | クラスC型β‐ラクタマーゼ産生菌の簡易検出法 |
| JPWO2005056820A1 (ja) * | 2003-12-15 | 2007-12-06 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | クラスＣ型β−ラクタマーゼ産生菌の簡易検出法 |
| JP4669962B2 (ja) * | 2003-12-15 | 2011-04-13 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | クラスＣ型β−ラクタマーゼ産生菌の簡易検出法 |
| JP2012095678A (ja) * | 2005-02-10 | 2012-05-24 | Biomerieux | 耐性微生物の特異的検出用の培地 |
| US10494658B2 (en) | 2005-02-10 | 2019-12-03 | Biomerieux Sa | Medium for the specific detection of resistant microorganisms |
| US11111518B2 (en) | 2005-02-10 | 2021-09-07 | Biomerieux | Medium for the specific detection of resistant microorganisms |
| US10782291B2 (en) | 2006-12-19 | 2020-09-22 | Becton Dickinson And Company | Chromogenic medium for the detection and identification of Vancomycin resistant enterococci and method therefor |
| US11604190B2 (en) | 2006-12-19 | 2023-03-14 | Becton Dickinson And Company | Chromogenic medium for the detection and identification of vancomycin resistant enterococci and method therefor |
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| Publication number | Publication date |
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| JP4437849B2 (ja) | 2010-03-24 |
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