WO2005056820A1

WO2005056820A1 - クラスC型β‐ラクタマーゼ産生菌の簡易検出法

Info

Publication number: WO2005056820A1
Application number: PCT/JP2004/018630
Authority: WO
Inventors: Tetsuya Yagi; Jun-Ichi Wachino; Yoshichika Arakawa
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2003-12-15
Filing date: 2004-12-14
Publication date: 2005-06-23
Also published as: CA2549697A1; EP1710318A4; JPWO2005056820A1; JP4669962B2; EP1710318A1; US20070254332A1

Abstract

検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬を、距離を置いて点在させ、固体培地を培養し、培養後、β−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円が、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤側に拡張したか否かで判定。検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬の混合物、並びにβ−ラクタム薬を、距離を置いて点在させ、固体培地を培養し、培養後、上記混合物の周囲に形成される阻止円と、β−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円の違いにより判定。クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク及びβ−ラクタム薬を含有するディスクを、１つずつストリップ状の基体に配置した判別用キット。クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬を含有するディスク及びβ−ラクタム薬を含有するディスクを、１つずつストリップ状の基体に配置したク判別用キット。クラスC型β-ラクタマーゼの簡易な検出法及びこの方法を実施するためのキットを提供する。

Description

明細書

クラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌の簡易検出法

技術分野

[0001] 本発明は、 j3 -ラクタマーゼの中でも、クラス C型 j3 -ラクタマーゼに特異性の高い阻害剤を用いたクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌の簡易検出法に関する。

背景技術

[0002] β -ラクタマーゼ産生は、腸内細菌をはじめとするグラム陰性菌の β -ラクタム剤に対する主要な耐性機序である。即ち、 β -ラクタマーゼは βラタタム系抗菌薬の βラタタム環を加水分解し抗菌力を失わせる細菌産生酵素の一つである。

[0003] [ β -ラクタマーゼの種類とその産生菌検出法についてのこれまでの研究]

β -ラクタマーゼには、その構造上の特徴からクラス A、 B、 C、 Dの 4つのグループがある。本発明者らは、これまでに臨床上大きな問題となっているクラス Aの基質拡張型 β -ラクタマーゼ (ESBL)の検出法として Twin testを、クラス Bのメタ口- β -ラタタマーゼの検出法として SMA法（特開 2000-224998号公報）を開発し、広く普及されるに至っている。

[0004] クラス C型 β -ラクタマーゼは、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa)、ェンテロバクタ一属（Enterobacter spp.)、シトロバクタ一'フロインディ（Citrobacter freundii)、大腸菌（ Escherichia coli)など院内感染の原因菌となることの多い菌種の染色体上にあるものや、未だ報告例は少ないが我が国でも見出されているプラスミド上に存在するものがある。クラス C型 j3 -ラクタマーゼは、ペニシリン系ゃセファロスポリン系の薬剤に対する耐性を付与するため臨床上問題となっていて、その産生菌の簡易な検出法の開発が待たれる。

[0005] クラス C型 β -ラクタマーゼの検出法としては、セフォキシチンによるクラス C型 /3 -ラクタマーゼ産生菌の誘導性をみる方法や、粗酵素液を用いた 3次元法などの報告はある。しかし、いずれも、判定法や方法の簡便さや平明さにおいて難があり普及するに至っていない。

[0006] そこで本発明の目的は、クラス C型 β -ラクタマーゼの簡易な検出法を提供することにある。より具体的には、本発明は、クラス C型ーラクタマーゼ産生菌を判別する方法であって、病院の検査室においても実施することが可能な程簡便な方法を提供することにある。

[0007] さらに本発明は、上記方法を利用して、より簡便にクラス C型 /3—ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を実施できるキット及びこのキットを用いたクラス C型ーラクタマーゼ産生菌を判別する方法を提供することにある。

発明の開示

[0008] 上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。

[1]検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び i3—ラタタム薬を、距離を置いて点在させ、上記固体培地を培養し、培養後、上記 i3—ラタタム薬の周囲に形成される阻止円力上記クラス C型 i3 -ラクタマーゼ阻害剤側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。

[2] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤と β一ラタタム薬との間の距離が、培養期間中にクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤が拡散する範囲と β一ラタタム薬が拡散する範囲とが重複するように設定する、 [1]に記載の方法。

[3] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク及び β一ラタタム薬を含有するディスクを用いて、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β—ラタタム薬をそれぞれ点在させる [1]または [2]に記載の方法。

[4]検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び /3—ラタタム薬の混合物、並びに /3—ラタタム薬を、距離を置いて点在させ、上記固体培地を培養し、培養後、上記混合物の周囲に形成される阻止円と、上記 β—ラタタム薬の周囲に形成される阻止円の違レ、により、検出対象である菌がクラス C型 [3 -ラクタマーゼ産生菌か否力、を判別する方法。

[5] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β一ラタタム薬を含有するディスク及び β —ラタタム薬を含有するディスクを用いて、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β - ラタタム薬の混合物、並びに β一ラタタム薬をそれぞれ点在させる [4]に記載の方法。

[6]クラス C型 -ラクタマーゼ阻害剤がボロン酸化合物である [1]一 [5]のいずれかに記載の方法。

[7]ボロン酸化合物が 3-ァミノフエ二ルボロン酸である [6]に記載の方法。

[8] β -ラクタム薬が第 3世代セフヱム薬である [1]一 [7]のレ、ずれかに記載の方法。

[9]第 3世代セフヱム薬がセフタジジムまたはセフオタキシムである [8]に記載の方法

[ 10]クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク及び β—ラタタム薬を含有するディスクを、 1つずつストリップ状の基体に配置したことを特徴とするクラス C型 β - ラクタマーゼ産生菌判別用キット。

[11]クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β—ラタタム薬を含有するディスク及び β —ラタタム薬を含有するディスクを、 1つずつストリップ状の基体に配置したことを特徴とするクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌判別用キット。

[12] [10]または [11]に記載のキットを検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に置き、培養を行い、培養後、 2つのディスクの周囲に形成される阻止円の違いにより、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌か否力を判別する方法

[13] —ラタタム薬を段階的に希釈して含有し、かつ等濃度のクラス C型 -ラタタマーゼ阻害剤を含有する複数の液体培地を用意し、各液体培地に、検出対象である菌を接種し、培養を行い、培養後、 MICの低下から、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。

[14]MICの低下が 8倍以上である場合、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌であると判定する、 [13]に記載の方法。

[15]クラス C型 j3 -ラクタマーゼ阻害剤がボロン酸化合物である [13]または [14]に記載の方法。

[16]ボロン酸化合物が 3-ァミノフエニルボロン酸である [15]に記載の方法。

[17] /3—ラタタム薬が第 3世代セフエム薬である [13]— [16]のいずれかに記載の方法。

[18]第 3世代セエフエム薬がセフタジジムまたはセフオタキシムである [17]に記載の方法。 [0009] 本発明によれば、クラス C型 βーラクタマーゼ産生菌を、病院の検査室にぉレ、ても実施することが可能な程簡便な方法で判別することができる。

さらに本発明によれば、より簡便にクラス C型ーラクタマーゼ産生菌を判別する方法を実施できるキット及びこのキットを用いたクラス C型 β—ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を提供することがある。

発明を実施するための最良の形態

[0010] 後述するが、ボロン酸化合物やモノバタタム誘導体 Syn2190などは、クラス C型 β -ラクタマーゼを阻害する物質として報告されている。しかし、これらの阻害剤を用いてクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌を判別する方法は、知られていない。

[0011] [本発明の方法の第 1の態様]

本発明の方法の第 1の態様は、検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラス C型 -ラクタマーゼ阻害剤及び i3—ラタタム薬を、距離を置いて点在させ、上記固体培地を培養し、培養後、上記ラタタム薬の周囲に形成される阻止円が、上記クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法である。

[0012] 本発明に用いられる固体培地は、通常の薬剤感受性試験等に汎用されている固体培地でよい。固体培地は、例えば、炭素源、窒素源等の栄養分を含む寒天培地であること力 Sできる。そのような固体培地としては、例えばミュラーヒントン寒天培地 (Dif co社)等を挙げること力 Sできる。

[0013] 上記固体培地の表面に検出対象である菌を塗布する。固体培地表面への菌の塗布方法や条件等は、薬剤感受性試験等で採用されているものをそのまま使用できる。例えば、日本化学療法学会標準法または NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)で定められたディスク拡散法で指定されている方法を用レ、、ミュラーヒントン寒天培地に菌を塗布することができる。

[0014] 次いで、検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び -ラクタム薬を、距離を置いて点在させる。各薬剤の点在には、具体的には、 β—ラタタム薬を含有するディスクとクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスクを用いることが適当である。ラタタム薬を含有するディスクは、市販品があり、これを用レ、ること力 sできる。また、一ラタタム薬は、治療薬として市販されてレ、るものから適宜選択することが出来、例えば、第 3世代セフエム薬、セファマイシン薬等であることができる。また、第 3世代セフエム薬、セファマイシン薬としては、例えば、セフタジジム、ラタモキセフ、セフメノキシム、セフォタキシム等を挙げることができる。但し、これらの薬剤に限定される意図ではない。尚、ディスクとして市販品がない場合でも、適当な寸法及び形状の濾紙に /3—ラタタム薬を、必要により、溶媒を用いて含浸させることで作成することができる。

[0015] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスクは、適当な寸法及び形状の濾紙にクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を含浸させることで作成することができる。クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤は、クラス C型 β -ラクタマーゼに対して阻害効果を有する薬剤から適宜選択することができる。クラス C型 β -ラクタマーゼに対して阻害効果を有する薬剤としては、例えば、ボロン酸化合物、ホウ酸、モノバタタム誘導体、フヱ二ルァセチルダリシル異項環誘導体等を挙げることができる。

さらに、ボロン酸化合物としては、例えば、 3-ァミノフエ二ルボロン酸、 3-ニトロフエニルボロン酸、 2-チォフェンボロン酸、ベンゾ [b]チォフェン- 2-ボロン酸等を挙げることができる。

[0016] β一ラタタム薬及びクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤の点在量は、各薬剤の固体培地表面での拡散性や培養時間 (拡散時間)、さらにはクラス C型 β -ラクタマーゼに対する阻害効果の強度等を考慮して適宜決定できる。例えば、；3 -ラタタム薬の場合、セフタジジムでは点在量を 30 μ gとすることが適当であり、またクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤の場合、 3-ァミノフエニルボロン酸では、 300— 500 /i gの範囲とすることが適当である。

但し、これらはあくまでも目安であり、検查対象とする菌の種類に応じて、 β—ラクタム薬の周囲に形成される阻止円の形状や大きさ等を考慮して適宜変化させることができる。

[0017] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤と β一ラタタム薬との間の距離は、両者の相互作用を利用してクラス C型 /3 -ラクタマーゼ産生菌を検出するという観点から、培養期間中にクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤が拡散する範囲と β一ラタタム薬が拡散する範囲とが重複するように設定することが適当である。

[0018] β—ラタタム薬及びクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤の拡散範囲は、各薬剤の種類と点在量、及び培養条件 (主に時間)により変化するので、両者が拡散する範囲が重複するようにクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤と β一ラタタム薬との距離は、ディスクの中心間距離にして、例えば、 1一 2cm程度であることが適当である。

[0019] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β—ラタタム薬を表面に置いた固体培地は、培養される。培養条件は、例えば、 35— 37°C、 12 36時間の範囲とすることができる。但し、培養条件、特に時間は、上記薬剤の拡散範囲との兼ね合いを考慮して適宜決定する。

[0020] 上記培養により、固体培地表面に置かれた β—ラタタム薬及びクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤は、固体培地表面及び内部を拡散する。対象とする菌がクラス C型 - ラクタマーゼ産生菌である場合、この菌は、クラス C型 j3 -ラクタマーゼを産生することによりーラクタム薬に対する感受性が低下する。従って、固体培地表面にーラクタム薬だけを置いたのでは、阻止円は観察されないか、観察されても、ディスクに近接した小さな阻止円が形成されるだけである。

[0021] ところが、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を βラタタム薬にある程度の距離で配置すると、 β ラタタム薬とクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤との拡散範囲が重複する位置にある β—ラタタム薬の周囲には、対象とする菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌であっても阻止帯が観察される。

これは、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤により、クラス C型 β -ラクタマーゼの活性が阻害され、その結果、ラタタム薬が菌の生育を妨げることができるようになったためである。ここで観察される阻止帯の形状は、一ラタタム薬の拡散範囲とクラス C 型 β -ラクタマーゼ阻害剤の拡散範囲との重複の程度により変化するが、一般的には、歪んだ形になる。即ち、 -ラタタム薬の周囲に形成される阻止円は、クラス C型 /3 - ラクタマーゼ阻害剤側に拡張する。この形状が変化した阻止円は、クラス C型 -ラタタマーゼ阻害剤の拡散範囲と重複しない位置にある β一ラタタム薬の周囲に形成される阻止円とは、大きさの違レ、から明確に区別できる。

[0022] 一方、検查対象がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌でない場合には、 2つの場合がある。 i3 _ラタタム薬が菌の生育を妨げ、大きめの阻止円を形成する感受性菌である場合とクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌ではないが、 β—ラタタム薬によっては菌の生育が妨げられず阻止円が形成されない場合 (例えば、クラス Αまたは Β β ラタタマーゼ産生菌等の菌の場合)である。前者は、クラス C型 j3 -ラクタマーゼ産生菌でないので、 -ラタタム薬のみの薬剤感受性試験で判別できる。即ち、クラス C型 /3 -ラクタマーゼ阻害剤を併用しない場合でも /3—ラタタム薬の周囲にゆがみのない大きな阻止円が形成され、判別できる。後者は、クラス C型 /3 -ラクタマーゼ阻害剤を併用せずに β一ラタタム薬のみを使用した薬剤感受性試験ではクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌であるのか否かは判別できない。それに対して本発明の方法では、クラス C型 - ラクタマーゼ阻害剤を近接して配置した場合でも、 βラタタム薬の周囲には阻止円が形成されないか、あるいは形成されたとしてもクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤により変形、ゆがみを形成しない。従って、本発明の方法では、クラス C型 -ラクタマーゼとクラス Αまたは Β βーラクタマーゼ産生菌とを判別することが可能である。

[0023] [本発明の方法の第 2の態様]

本発明の方法の第 2の態様は、検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β—ラタタム薬の混合物、並びに β—ラタタム薬を、距離を置いて点在させ、上記固体培地を培養し、培養後、上記混合物の周囲に形成される阻止円と、上記ラタタム薬の周囲に形成される阻止円の違いにより、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法である。

[0024] 本発明の第 2の態様で用いる固体培地、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β - ラタタム薬は、本発明の方法の第 1の態様で用レ、るものと同様である。また、固体培地の培養条件も、本発明の方法の第 1の態様で用レ、るものと同様である。

[0025] 本発明の方法の第 2の態様では、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β—ラクタム薬の混合物、並びに β—ラタタム薬をそれぞれ点在させる際、クラス C型 β -ラタタマーゼ阻害剤と β一ラタタム薬を含有するディスク及び β一ラタタム薬を含有するデイスクを用いることが好ましい。一ラタタム薬を含有するディスクは、本発明の方法の第 1 の態様で用レ、るものと同様である。クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β—ラタタム薬を含有するディスクは、例えば、 β ラタタム薬を含有するディスクに、クラス C型 β - ラクタマーゼ阻害剤をさらに含浸させることで作成することができる。

[0026] 本発明の方法の第 2の態様では、本発明の方法の第 1の態様と異なり、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β一ラタタム薬の混合物と β一ラタタム薬との間の距離は、培養期間中に前記混合物中のクラス C型 -ラクタマーゼ阻害剤が拡散する範囲と /3—ラタタム薬（混合物ではない）が拡散する範囲とが重複するように設定する必要はない。むしろ、各点在点（好ましくは各ディスク）からの薬剤の拡散する範囲は重複しない様に設定する。例えば、ディスクの中心距離にして 3cm以上離して点在させる。

[0027] β—ラタタム薬だけの場合、クラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌が産生するクラス C型

/3 -ラクタマーゼの作用により、菌の生育はほとんど、または全く妨げられない。従つて、阻止円は観察されないか、または観察されても小さい。

[0028] それに対して、 /3—ラタタム薬とクラス C型 /3 -ラクタマーゼ阻害剤との混合物の場合では、対象とする菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌であっても大きな阻止円が観察される。これは、クラス C型 -ラクタマーゼ阻害剤により、クラス C型 -ラクタマーゼの活性が阻害され、その結果、一ラタタム薬が菌の生育を妨げること力 Sできるようになったためである。従って、ラタタム薬のみの周囲に形成される阻止円（形成されない場合もあるが）とは大きさの違レ、から明確に区別できる。すなわち、阻止円径 5 mm以上の拡大が認められれば、クラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌と判定できる。

[0029] 一方、検査対象がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌でなレ、場合には、 2つの場合がある。 i3 _ラタタム薬が菌の生育を妨げ、大きめの阻止円を形成する感受性菌である場合とクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌ではないが、 β—ラタタム薬によっては菌の生育が妨げられず阻止円が形成されない場合 (例えば、クラス Αまたは Β β—ラタタマーゼ産生菌等の菌の場合)である。前者は、クラス C型 j3 -ラクタマーゼ産生菌でないので、 -ラタタム薬のみの薬剤感受性試験で判別できる。即ち、クラス C型 /3 -ラクタマーゼ阻害剤を含む、含まないにかかわらず 2つのディスクの周囲に同程度の大きな阻止円が形成され、判別できる。後者は、クラス C型 /3 -ラクタマーゼ阻害剤を併用せずに β一ラタタム薬のみを使用した薬剤感受性試験ではクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌であるのか否かは判別できなレ、。それに対して本発明の方法では、クラス C型 i3—ラクマターゼ阻害剤を含む場合も含まない場合も阻止円は形成されないか、形成されても小さぐ両者の阻止円の大きさはほとんど変化しない。従って、本発明の方法では、クラス C型 β -ラクタマーゼとクラス Αまたは Β βーラクタマーゼ産生菌とを判別することが可能である。

[0030] [本発明のキット]

本発明のクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌判別用キットは、

(1)クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク及び β一ラタタム薬を含有するディスクを、 1つずつストリップ状の基体に配置したことを特徴とするものと、（2)クラス C型 [3 -ラクタマーゼ阻害剤及び β一ラタタム薬を含有するディスク及び β—ラタタム薬を含有するディスクを、 1つずつストリップ状の基体に配置したことを特徴とするものとが有る。

(1)のクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌判別用キットは、上記本発明の方法の第 1の態様に用いられ、（2)のクラス C型 -ラクタマーゼ産生菌判別用キットは、上記本発明の方法の第 2の態様に用いられる。

[0031] 本発明のキットに使用する β ラタタム薬を含有するディスクは上記本発明の方法で説明したものと同様のディスクを使用できる。また、クラス C型 -ラクタマーゼ阻害剤を含有させるためのディスクは、濾紙等のクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を含有させることができるものであれば良い。また、クラス C型 -ラクタマーゼ阻害剤及び —ラタタム薬を含有するディスクは、 β ラタタム薬を含有するディスクにクラス C型 β - ラクタマーゼ阻害剤を含浸させたものであることができる。これらのディスクをストリップ状の基体に一列に配置する。

[0032] ストリップ状の基体の形状や寸法には特に制限はない。このキットを使用する固体培地の大きさ等を考慮して適宜決定できる。尚、ストリップ状の基体は、阻止円の判読を容易にするため、透明性の高い素材で形成することもできる。各ディスクの間隔や /3—ラタタム薬のディスク中の含有量等は、上記本発明の方法において説明したと同様の点を考慮して適宜決定できる。

[0033] 上記本発明のキットを用いるクラス C型 j3 -ラクタマーゼ産生菌の判別方法は、上記のキットを検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に置き、培養を行い、培養後、 2つのディスクの周囲に形成される阻止円の違いにより、検出対象である菌がクラス C型 -ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する。この方法は、上記キットを用いること以外は、上記本発明の方法をそのまま用いることができる。

[0034] [本発明の方法の第 3の態様]

本発明の方法の第 3の態様は、微量液体希釈法に基づく方法である。この方法では、まず、 /3—ラタタム薬を段階的に希釈して含有し、かつ等濃度のクラス C型 -ラタタマーゼ阻害剤を含有する複数の液体培地を用意する。

液体培地としては、例えば、ミューラー'ヒントン液体培地 (Ditco社)等を用いることができる。

β—ラタタム薬及びクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤は、本発明の方法の第 1の態様で説明したものと同様である。

液体培地中での一ラタタム薬の段階的な希釈の程度は、例えば、 0.5 256 μ g/mlの範囲とすることができる。

また、各液体培地中のクラス C型 -ラクタマーゼ阻害剤の濃度は等しくし、例えば、 3-アミノフヱニルボロン酸であれば、例えば、 200 /i g/mlとすることができる。

[0035] このように準備された各液体培地に、検出対象である菌を接種し、培養を行う。培養条件は、固体培地を用いる場合と同様にすることができる。

[0036] 培養後、 MICの低下から、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌か否かを判別することができく。具体的には、 MICの低下が 8倍以上である場合、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌であると判定することができる。実施例

[0037] 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例 1(本発明の方法の第 1の態様）

被検菌を NCCLSの推奨するディスク拡散法に基づく方法でミューラー'ヒントン寒天培地に接種した。被検菌としては以下の表 1に示すものを用いた。

[0038] [表 1] 被検菌名

E. cloacae HKY226

C.freundi HKY543

S.marcescens S94

P. aeruginosa 03-192

K.pneumoniae MOX-1

E.coli CMY-2

pneumoniae DHA-l[+CTX-M9] 一

pneumoniae SHV-12クラス A

K.pneumoniae IMP-1クラス B

[0039] その上に APBを 300 μ gしみ込ませたディスク (栄研化学製、直径 6mm)を置き、その

(直径 6mm)を中心距離にして約 18mm離して配置した。図 1及び 2に写ったシャーレの上段の 3つのディスクが左から、 CAZ、 APB、 CTXのディスクである。

発育阻止帯の状況及び形状を下記表 2に記載する。

[0040] [表 2]

被検菌名

E. cloacae ディスク間距離を 10mmに配置すると CAZ、CTXの周 HKY226 囲には APBのディスクに引っ張られるように阻止円が認められる。陽性

C.freundi APBのディスク周囲には阻止円を認めないが、 CAZ、 HKY543 CTX のディスク周囲には阻止円がみられ、いずれも

APBのディスクに引っ張られるように変形している陽性

S.marcescens CAZ、 CT 両方のディスクの周囲に阻止円が認められ、 S94 いずれも APBのディスクに引っ張られるように変形が認められる。陽性

P.aeruginosa CAZのディスク周囲にのみ阻止円が認められ、 APBデ 03-192 イスクの方に変形拡大している。陽性

K.pneumoniae P.aeruginosa 03-192 に同じ (陽性）

MOX-1

E.coli CMY-2 S.marcescens S94 に同じ (陽性）

K.pneumoniae CAZ、CTXディスク共に周囲に阻止円が認められ、 CAZ DHA-1[+CTX-M9] のみに APBディスクに向かって引っ張られるように変形がみられる。陽性

K.pneumoniae CTXディスク周囲に阻止円が認められるが APBデイス SHV-12クラス A クに向かって変形はみられない。陰性

K.pneumoniae SHV-12 に同じ (陰性）

IMP-1クラス B

[0041] クラス C型 j3 -ラクタマーゼ産生菌では、図 1及び 2に示すように、ー晚培養後 CAZまたは CTXの周囲の発育阻止帯が APBのディスクに引っ張られるようにゆがんで観察された。即ち、一ラタタム薬 (CAZまたは CTX)の周囲に形成される阻止円力 S、クラス C 型 β -ラクタマーゼ阻害剤 (APB)側に拡張しており、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌であることが判定できる。それに対して、クラス C以外のクラス A やクラス B β -ラクタマーゼ産生菌では発育阻止円のゆがみは認められな力た。

[0042] 実施例 2(本発明の方法の第 2の態様）

被検菌を上記実施例 1と同様にミューラー'ヒントン寒天培地に接種し、 CAZの KBデイスク (直径 6mm)を中心距離にして 3cm以上離して配置した。一方の CAZディスクに APBを 300 μ gしみ込ませ、ー晚培養後 2つの CAZディスクの周囲の発育阻止円の径を測定した。図 1及び 2に写ったシャーレの下段の 2つのディスクが左から、 CAZ、 CAZ+APBのディスクである。結果を下記表 3にコメントともに示す。

[表 3]

[0044] クラス C型 -ラクタマーゼ産生菌では、図 1及び 2に示すように、 5mm以上の径の拡大 (APBを含まないディスクに対して)が見られ、クラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌と判定できる。それに対して、クラス C以外のクラス Αやクラス B β -ラクタマーゼ産生菌では発育阻止円の拡大は認められなかった。

[0045] 実施例 3 (本発明の方法の第 3の態様）

CAZを段階希釈したミューラー'ヒントン液体培地と、 CAZの段階希釈に 200 μ gの APBを加えたミューラー'ヒントン液体培地を作製し、被検菌を NCCLSの推奨する微量液体希釈法に基づいた方法で接種した。一晩培養後 MICを測定した。結果を以下の表 4に示す。 [0046] [表 4]

CAZ :セフタジジム、 CA :クラブラン酸、 SMA:メルカプト酢酸ナトリウム、 APB： 3-ァミノフエニルボロン酸

CAは 4 μ g/ml、 SMAは 500 μ g/nl、 APBは 200 μ g/ml、の濃度で使用した。

[0047] CAZのみの MICに比べて、 CAZ+APBの MICが 8倍以上低下した場合、クラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌と判定した。実施例 1及び 2でクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌と判定された菌は、いずれも 8倍以上の MICの低下が認められた。それに対して、クラス C以外のクラス Αやクラス B β -ラクタマーゼ産生菌では MICの低下は認められなかつた。

尚、 CAZ + CA及び CAZ + SMAの場合、前者はクラス A型 /3—ラクタマーゼ産生菌においてのみ CAZの場合に比べて 8倍以上の MICの低下がみられ、後者の場合はクラス B型 j3—ラクタマーゼ産生菌においてのみ CAZの場合に比べて 8倍以上の MICの低下を認める。

産業上の利用可能性

[0048] 本発明は、病院の検査室においても実施することが可能な程簡便なクラス C型 i3 - ラクタマーゼの簡易な検出法を提供することができる。

図面の簡単な説明 [図 1]実施例 1及び 2の結果を示す。

[図 2]実施例 1及び 2の結果を示す。

Claims

請求の範囲

[1] 検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び /3 -ラタタム薬を、距離を置いて点在させ、上記固体培地を培養し、培養後、上記 /3 -ラタタム薬の周囲に形成される阻止円力上記クラス C型 j3 -ラクタマーゼ阻害剤側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。

[2] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤と β -ラクタム薬との間の距離が、培養期間中にクラス C型 -ラクタマーゼ阻害剤が拡散する範囲と β -ラクタム薬が拡散する範囲とが重複するように設定する、請求項 1に記載の方法。

[3] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク及び β -ラクタム薬を含有するデイスクを用いて、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β -ラクタム薬をそれぞれ点在させる請求項 1または 2に記載の方法。

[4] 検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β -ラクタム薬の混合物、並びに β -ラクタム薬を、距離を置いて点在させ、上記固体培地を培養し、培養後、上記混合物の周囲に形成される阻止円と、上記 i3 _ ラタタム薬の周囲に形成される阻止円の違いにより、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。

[5] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β -ラクタム薬を含有するディスク及び β -ラクタム薬を含有するディスクを用いて、クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β -ラクタム薬の混合物、並びに β -ラクタム薬をそれぞれ点在させる請求項 4に記載の方法。

[6] クラス C型 j3 -ラクタマーゼ阻害剤がボロン酸化合物である請求項 1一 5のいずれか 1 項に記載の方法。

[7] ボロン酸化合物が 3-ァミノフエニルボロン酸である請求項 6に記載の方法。

[8] β -ラクタム薬が第 3世代セフエム薬である請求項 1一 7のいずれ力 4項に記載の方法

[9] 第 3世代セフエム薬がセフタジジムまたはセフオタキシムである請求項 8に記載の方法。

[10] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク及び β -ラクタム薬を含有するデイスクを、 1つずつストリップ状の基体に配置したことを特徴とするクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌判別用キット。

[11] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤及び β -ラクタム薬を含有するディスク及び β -ラクタム薬を含有するディスクを、 1つずつストリップ状の基体に配置したことを特徴とするクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌判別用キット。

[12] 請求項 10または 11に記載のキットを検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に置き、培養を行い、培養後、 2つのディスクの周囲に形成される阻止円の違いにより、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。

[13] β -ラクタム薬を段階的に希釈して含有し、かつ等濃度のクラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤を含有する複数の液体培地を用意し、各液体培地に、検出対象である菌を接種し、培養を行い、培養後、 MICの低下から、検出対象である菌がクラス C型 -ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。

[14] MICの低下が 8倍以上である場合、検出対象である菌がクラス C型 β -ラクタマーゼ産生菌であると判定する、請求項 13に記載の方法。

[15] クラス C型 β -ラクタマーゼ阻害剤がボロン酸化合物である請求項 13または 14に記載の方法。

[16] ボロン酸化合物が 3-ァミノフエ二ルボロン酸である請求項 15に記載の方法。

[17] β -ラタタム薬が第 3世代セフヱム薬である請求項 13— 16のいずれ力 1項に記載の方法。

[18] 第 3世代セエフエム薬がセフタジジムまたはセフオタキシムである請求項 17に記載の方法。