MXPA02000611A

MXPA02000611A - Medio de prueba para identificacion t diferenciacion de enterobacterias.

Info

Publication number: MXPA02000611A
Application number: MXPA02000611A
Authority: MX
Inventors: Geoffrey N Roth
Original assignee: Micrology Lab L L C
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2002-07-02
Also published as: ATE443774T1; JP2003531569A; EP1196624B1; WO2001006000A1; EP1196624A1; IL147596A; AU775050B2; US6787332B2; JP3971611B2; CA2379954A1; DE60043011D1; CA2379954C; US6350588B1; US20020090668A1; AU6224700A; IL147596A0

Abstract

Se describe un medio de prueba que permite la cuantificacion y diferenciacion bajo luz ambiental de agregados de entidades biologicas que producen enzimas especificas, que pueden incluir coliformes generales, E. coli, Aeromonas y Salmonella o Shigella. Se describen sustratos no cromogenicos que producen un precipitado no difundible sustancialmente negro, no sujeto a interferencia de otros sustratos cromogenicos presentes en el medio de prueba. En una forma preferida, los sustratos se seleccionan de tal manera que las colonias de E. coli presentes en el medio de prueba se muestran como sustancialmente negras, las colonias de coliformes generales como un color azul-violeta, las colonias de Aeromonas como un color generalmente rojo-rosa, y colonias de Salmonella o Shigella como un color generalmente verde azulado-verde. Tambien se describe un inhibidor y un metodo para hacer un medio de prueba que incorpora el inhibidor.

Description

MEDIO DE PRUEBA PARA IDENTIFICACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un medio de prueba y método para la detección, cuantificación, identificación y/o diferenciación de materiales biológicos en una muestra que puede contener una pluralidad de diferentes materiales biológicos. Las bacterias son el factor causante de muchas enfermedades de humanos, animales y vegetales superiores, y se transmiten comúnmente con transportadores tales co o el agua, bebidas, alimento y otros organismos. La prueba de estos portadores potenciales de bacterias es de importancia critica y descansa generalmente en "organismos indicadores". Borrego et al., Microbiol . Sem. 13:413-426, (1998). Por ejemplo, Escherichia coli (E. coli) es un miembro gram negativo de la familia de Enterobacteriaceae que es parte de la flora intestinal normal de los animales de sangre caliente, y su presencia indica contaminación fecal (por ejemplo, aguas negras sin tratar) . Aún cuando la mayoría de las cepas de E. coli no son la causa actual de la enfermedad, su presencia es un fuerte indicio de la posible presencia de patógenos asociados con la enfermedad intestinal, tal como cólera, disenteria y hepatitis entre otros. Por consiguiente, E. coJi se ha vuelto un organismo indicador principal de la contaminación fecal, y como un resultado, cualquier método que diferencia e identifica E. coli de otras bacterias es muy útil. Otros miembros de la familia de Enterobacteriaceae comúnmente referidos como "coliformes generales", especialmente los géneros Ci trobacter, Enterobacter y Klebsiella, también se consideran para ser organismos indicadores significativos de la calidad del agua, bebidas y alimentos. Por lo tanto, las pruebas para identificar y diferenciar coliformes generales de E. coli también son muy útiles. También, diversas especies de géneros Aeromonas han mostrado ser no solamente patógenos potenciales, sino que tienen una correlación a otros organismos indicadores (Pettibone et al., J. Appl . Mi crobiol . 85:723-730 (1998)). Se ha carecido de métodos de prueba actuales para identificar, separar y enumerar Aeromonas spp. de las Enterobacteriaceae muy similares y la mayoría de los métodos actuales que utilizan sustratos de enzima no separan Aeromonas spp. de Enterobacteriaceae debido a sus perfiles bioquímicos casi idénticos. Cualquier método que depende de la identificación de coliformes generales por medio de un sustrato ß-galactósido no diferencia Aeromonas spp. de los coliformes generales o elimina Aeromonas de la muestra por el uso de inhibidores específicos (antibióticos tales como cefsulodina) . Brenner et al., Appl . Envir. Microbio . 59:3534-44 (1993) . No diferencian, identifican, y enumeran Aeromonas junto con E. coli y coliformes generales. Landre et al., Letters Appl . Microbiol . 26:352-354 (1998). Se necesitan métodos de prueba mejorados para identificar, separar y enumerar efectivamente tales tipos de bacterias, y existe una búsqueda continua de métodos y aparatos más rápidos, más precisos, más fáciles de usar y más versátiles en esta área. Se han utilizado numerosos métodos de prueba para determinar, identificar y enumerar uno o más organismos indicadores. Algunos de estos métodos de prueba solamente indican la presencia o ausencia del microorganismo, mientras que otros intentan también cuantificar uno o más de los organismos particulares en la muestra de prueba. Por ejemplo, una prueba cualitativa referida como la prueba de presencia/ausencia (o P/A) , puede utilizarse para determinar la Presencia o Ausencia de coliformes y E. coli en una muestra de prueba. Un medio de prueba que incluye el sustrato 0-nitrofenil-*-D-galactopiranosido (ONPG) , de ß-galactosidasa, y el sustrato 4-metil-u?abrelliferil-ß-D-glucuronido (MUG) , de ß-glucoronidasa, se inocula con la muestra de prueba. Para diferenciar los coliformes generales de E. coli , esta prueba descansa en el hecho de que generalmente todos los coliformes producen ß-galactosidasa, mientras que solamente E. coli también produce *-glucuronidasa además de ß-galactosidasa. Si algunos coliformes están presentes (incluyendo E. coli ) , el medio de caldo se vuelve de un color amarillo debido a la actividad de la enzima galactosidasa sobre el material de ONPG, causando la liberación de un pigmento amarillo difundible. Si E. coli está presente, el medio de caldo demostrará una fluorescencia azul cuando se irradia con rayos ultravioletas, debido a la descomposición del reactivo MUG con la liberación del tinte fluorogénico causado por la producción de la enzima glucuronidasa. Estas reacciones son muy especificas, y permiten identificar la presencia de ambos coliformes en general, asi como E. coli en una muestra sencilla. Una desventaja de esta prueba es que no es directamente cuantitativa para cualquier tipo bacteriano, puesto que ambos reactivos producen pigmentos difundibles. Una segunda desventaja es que puede existir una reacción coliforme falso positivo si Aeromonas spp. está presente en la muestra de prueba. Esto ha mostrado ser posible aún cuando existen inhibidores presentes que supuestamente previenen que esto ocurra (Landre et. al., Lettera Appl . Microbiol . 26:352-354 (1998)). La prueba también requiere equipo especifico para producir los rayos ultravioleta. Adicionalmente, esta prueba puede usarse solamente para detectar coliformes y E. coli . Otros microorganismo importantes, tales como la cepa E. coli 0157 que es glucuronidasa negativa, no se detectan, ni otros microorganismo que no producen galactosidasa-glucuronidasa.

El método de Agar Bilis Rojo Violeta (VRBA) se ha usado para determinar la cantidad de coliformes y E. coli en una muestra de prueba. El medio de prueba usado en este método incluye sales biliares (para inhibir no coliformes), lactosa y el indicador de pH rojo neutro. Puesto que los coliformes (incluyendo E. colí ) crecen en el medio, la lactosa se fermenta con producción de ácido, y el rojo neutro en el área de la colonia bacteriana se vuelve un color rojo ladrillo. Los resultados de esta prueba no son siempre fáciles de interpretar, y para determinar la presencia de E. coli , deben realizarse pruebas de seguimiento para confirmar, tales como fermentación de caldo de lactosa verde brillante, crecimiento en caldo de EC a 44.5°C y estriando sobre Agar Azul de Metileno Eosina (EMBA) . El método de Filtro de Membrana (MF) utiliza filtros microporo a través de los cuales se pasan las muestras de manera que las bacterias son retenidas sobre la superficie del filtro. Este método se usa más frecuentemente cuando las poblaciones bacterianas son pequeñas, y se necesita una muestra grande para obtener números adecuados. El filtro se coloca después sobre la superficie de un medio seleccionado, incubado, y las colonias bacterianas que crecen sobre la superficie del filtro de membrana se cuentan y evalúan. Este método se usa ampliamente y proporciona buenos resultados cuando se combina con los reactivos y medios apropiados. Una desventaja de este método es que es caro y consume tiempo. Tampoco trabaja bien con muestras sólidas, o muestras con cuentas de partículas altas. El método MF puede usarse junto con el método inventivo descrito en esta solicitud. El método de m-Endo se usa también para determinar la cantidad de E. coli y coliformes generales y es un método oficial aprobado por USEPA para probar la calidad del agua. El medio se usa comúnmente con un filtro de membrana y E. coli y las unidades que forman colinas de coliformes generales (CFU) crecen como colonias obscuras con un resplandor verde metálico dorado. Debido a una probada alta proporción de error falso positivo, las colonias típicas deben confirmarse con pruebas adicionales. Standard Methods for the Examination of water and Wastewater 20th Edition, 9-10 & 9-60 (1998) . Otras pruebas, tales como el número más probable (MPN) , utiliza caldos que contienen lactosa (LST, BGLB, EC) para estimar los números de coliformes generales y E. coli pero también se han mostrado que tienen proporciones altas o error asi como que son incómodas y lentas para producir resultados. Evans et al., Appl . Envir. Microbiol . 41:130-138 (1981) . El reactivo 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido (X-gal) es un conocido compuesto de prueba para identificar coliformes. Cuando la enzima ß-galactosidasa producida por coliformes obra sobre él, X-gal forma un precipitado azul Índigo insoluble. X-gal puede incorporarse dentro de un medio nutriente tal como una placa de agar, y si una muestra que contiene coliformes está presente, los coliformes crecerán como colonias azul Índigo, X-gal tiene la ventaja sobre el compuesto ONPG descrito anteriormente, en que forma un precipitado insoluble en agua más que un compuesto difundible, permitiendo con eso hacer una determinación cuantitativa de coliformes cuando la muestra de prueba se incorpora dentro o sobre un medio solidificado, o cuando las colonias de coliformes crecen sobre la superficie de un filtro de membrana que descansa sobre una almohadilla saturada con un medio líquido o sobre un filtro de membrana que descansa sobre un medio sólido. Adicionalmente. No requiere el uso de luz ultravioleta. Un compuesto similar, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-glucuronido (X-gluc) es un conocido compuesto de prueba para identificar E. coli . Cuando la enzima ß-glucuronidasa producida por la mayoría de E. coli actúa sobre él, X-gluc forma un precipitado azul índigo insoluble. X-gluc tiene la ventaja sobre el compuesto MUG, descrito anteriormente, de que forma un precipitado insoluble en agua más que un compuesto difundible, permitiendo con eso hacer una determinación cuantitativa de E. coli cuando la muestra de pruebas se incorpora dentro o sobre un medio solidificado.

X-gluc y su habilidad para identificar E. coli se describe en atkings, et al., Appl . Envir. Microbiol . 54:1874-1875 (1998) . Un compuesto similar, indoxil-ß- D-glucuronido, que también producen colonias azules bien definidas de E. coli , se describió en Ley, et al., Can . J. Microbiol . 34:690-693 (1987) . Aunque X-gal y X-gluc son útiles por separado en la determinación cuantitativa de coliformes (X-gal) o E. coli (X-gluc), estos compuestos indicadores tienen la desventaja de que contienen el mismo componente cromogénico. Por lo tanto, no pueden usarse juntos para identificar y distinguir E. coli y coliformes generales en una prueba sencilla con una muestra sencilla, puesto que generan colonias azul índigo idénticamente matizadas. Una persona que usa juntos ambos reactivos sería capaz de identificar cuantitativamente el número total de coliformes, como si X-gal se usará solo, pero no sería capaz de indicar cuales de las colonias eran de E. coli y cuales otras eran coliformes además de E. coli . Un método de prueba y medio de prueba recientemente desarrollados comercial y altamente exitosos para identificar y diferenciar cuantitativamente coliformes generales y E. coli en una muestra de prueba se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,210,022, y 5,393,662, las cuales comparten invención común con la presente solicitud y las cuales se incorporan por la presente para referencia. Este método y el medio de prueba mejoran los métodos de la técnica anterior permitiendo la identificación cuantitativa de coliformes generales y E. coli en una muestra sencilla. No son necesarias pruebas confirmatorias adicionales. La muestra de prueba se agrega a un medio que contiene un sustrato para ß-galactosidasa, tal como 6-cloroindolil-*- D-galactosido, y un sustrato para ß-glucuronidasa, tal como 5-bromo-4-cloro-3-indolil-*- D-glucuronido (X-gluc) . El sustrato para ß-galactosidasa es capaz de formar un precipitado insoluble en agua de un primer color al reaccionar con ß-galactosidasa, y el sustrato para ß-glucuronidasa es capaz de formar un precipitado insoluble en agua de un segundo color, que contrasta con el primer color, al reaccionar con ß-glucuronidasa. Como un resultado, los coliformes generales pueden cuantificarse enumerando las colonias del primer color (que tienen actividad de ß-galactosidasa) , y E. coli puede cuantificarse enumerando las colonias del segundo color (que tienen actividad de ß-galactosidasa y ß-glucuronidasa) . Esta tecnología se ha copiado ampliamente. Otro método y aparato de prueba recientemente desarrollados proporcionan excelentes resultados para la diferenciación e identificación de coliformes generales, cepas de E. coli y E. coli 0157 y enterobacterias no coliformes. El método y medio de prueba se describen en la Patente Norteamericana No. 5,726,031, que comparte invención común con la presente solicitud, y la cual se incorpora por la presente para referencia. Una cierta clase de sustratos, referidos en la presente como "no cromogénicos" se han usado para detectar diversos microorganismos. Una porta objetos de inmersión para detectar E. coli usando hidroxi-quinolina-ß- D-glucuronido se describe por Dalet et al., J. Clin, Microbiol , 33(5):1395-8 (1995) . Similarmente, una técnica para la detección de E. coli en un medio basado en agar usando 8-hidroxiquinolina-ß-D-glucuronido se describe por James et al., Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A], 267 (3) : 316-21 (1988). En la WO 98/55644 para Perry, et al., (DI) y en un articulo en el Journal of Clinical Microbiology fechado en marzo de 1999, pp 766-768, intitulado ABC Médium, A New Chromegenic Agar for Selective Isolation of Salmonella spp. por J. Perry, et al., (D2), se describe un medio y método de prueba para la identificación de Salmonella . El medio incorpora dos sustratos. El primero es 3,4-ciclohexenoesculetin-ß-D-galactosido (CHE-GAL) , y el segundo es 5 bromo- bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosido (X-GAL) . En este medio las cepas de Salmonella se visualizan como colonias verdes mientras que los otros miembros detectados de las Enterobacteriaceae parecen como colonias negruzcas o transparentes. Este medio tiene la desventaja de que solamente Salmonella puede identificarse específicamente y distinguirse de otros géneros de bacterias. Con base en la necesidad de identificar diversas bacterias en agua y otras fuentes, sería ventajoso tener un medio que pudiera identificar y diferenciar otras bacterias distintas a Salmonella . En Applied and Environmental Microbiology, octubre de 1996, pp. 3868-3870, en un articulo intitulado Evaluation of Cyclohexanoesculetin-ß-D-Galactosido (CHE-GAL) and 8-Hydroxyquinoline-ß-D-Galactoside (8HXO-GAL) , as Substrates for the Detection of ß-Galactoside por A. James, et al., se describe la síntesis y evaluación de CHE-GAL y 8HXQ-GAL y se compara con X-GAL. Solamente se probó un sustrato a la vez en esta evaluación; sin embargo se sugiere que CHE-GAL podria combinarse potencialmente con un compuesto fluorogénico para enumerar simultáneamente E. coli y coliformes totales en un filtro de membrana sencillo como se conoció con X-GAL. A. James, et al., no evaluó esta combinación de CHE-GAL con un fluorogénico para determinar si la combinación sería exitosa. También sería deseable tener un medio de prueba que pudiera diferenciar e identificar al menos tres entidades biológicas juntas así como una que identificara específicamente la entidad de Aeromonas . Es deseable mejorar adicionalmente los colores distintivos generados en el medio de prueba. Es decir, en el medio de prueba de la técnica anterior que detecta y distingue dos entidades biológicas, puede surgir la confusión entre los dos colores que se muestran en el medio. Adicionalmente, es deseable ser capaz de identificar y diferenciar otros organismos cercanamente relacionados, tales como miembros de las familias Aeromonaceae, Vibrionaceae, y Salmonella y Shigella spp. Por ejemplo, el género Aeromonas está cercanamente relacionado a los coliformes y da un patrón de prueba bioquímico casi idéntico. Adicionalmente, el género Vibrio es también un tipo importante de bacterias que crece bajo las mismas condiciones generales que los coliformes. Se conoce distinguir colonias de Aeromonas de coliformes generales probando todas las colonias en una muestra dada por la presencia de citocromo oxidasa. Indeseablemente, sin embargo, esto requiere otro conjunto de prueba. Adicionalmente, Aeromonas es común en agua y alimento, y está comúnmente indicada en muestras de prueba como coliformes generales, lo cual resulta en un alto error falso positivo para coliformes generales por los métodos de prueba más comunes. Puede prevenirse que la Aeromonas interfiera con los resultados de coliformes agregando algunos antibióticos al medio. Sin embargo, las cantidades de antibiótico agregadas deben controlarse cuidadosamente. Adicionalmente, los antibióticos que se han usado convencionalmente tiene lapsos de vida cortos en los medios de manera que pierden su potencia rápidamente en otras condiciones distintas a la congelada. Puede ser frecuentemente deseable ser capaz de cultivar, identificar y enumerar Aeromonas spp. lo cual no puede hacerse si están inhibidas. Adicionalmente, en aquellos casos en donde es deseable inhibir Aeromonas, es deseable un método mejor para hacerlo así, uno en el cual la vida de anaquel del medio no se reduzca apreciablemente por la inclusión de un inhibidor. Adicionalmente, es también deseable distinguir las cepas de Salmonella y Shigella de E. coli, coliformes generales y Aeromonas . La presente invención supera las desventajas de los métodos de la técnica anterior al proporcionar un método y medio de prueba para identificar y diferenciar cuantitativa o cualitativamente entidades biológicas azul en una muestra de prueba que puede incluir una pluralidad de diferentes entidades biológicas. La presente invención introduce el uso de sustratos "no cromogénicos" para mejorar la distinción entre los colores múltiples producidos por distintas entidades biológicas presentes en el medio de prueba de la invención. Inesperadamente, se ha descubierto que otros sustratos "cromogénicos" presentes en el medio de prueba de la invención no interfieren con el color sustancialmente negro logrado con el sustrato no cromogénico. Es decir, siempre y cuando una entidad biológica dada sea sensible a las agregaciones de sustrato no cromogénicas de la misma, presentes en el medio de prueba mostrará un color sustancialmente negro - independiente de si tal entidad biológica es sensible a uno, dos o más sustratos cromogénicos que también están presentes en el medio. La presente invención explota esta propiedad no exploradas hasta ahora de los sustratos no cromogénicos. En una forma de la misma, la presente invención proporciona un medio de prueba para detectar, identificar y calificar o cuantificar una primera y segunda entidades biológicas. El medio de prueba incluye un medio de base nutriente que incluye iones de una sal, un sustrato cromogénico y un sustrato no cromogénico. La primera entidad biológica es sensible al sustrato no cromogénico mientras que la segunda entidad biológica es sensible al sustrato cromogénico. En este medio de prueba, las agregaciones de la primera entidad biológica presente en el medio de prueba son sustancialmente negras y las agregaciones de la segunda entidad biológica presente en el medio de prueba, son de un segundo color, siendo el segundo color distinguible del sustancialmente negro. En una forma preferida, el medio de prueba de la invención cuenta por la primera entidad biológica que es sensible al sustrato cromogénico además del sustrato no cromogénico. En tal caso, las agregaciones de la primera entidad biológica presente en el medio de prueba se mostrarán no obstante como sustancialmente negras. Significativamente, aún cuando las agregaciones de la primera entidad biológica son sensibles al primer y segundo sustratos en la forma preferida, estas agregaciones aún se muestran como sustancialmente negras en el medio de prueba. Esto es, el sustrato cromogénico no interfiere con el color sustancialmente negro. Ventajosamente, esta propiedad del sustrato no cromogénicos permite identificar diversas entidades biológicas diferentes y diferenciar en un medio sencillo, agregaciones de cada entidad biológica que tiene un color visualmente distinguible. En otra forma preferida del medio de la invención anteriormente descrito, el medio incluye adicionalmente el antibiótico ácido nalidíxico para inhibir el crecimiento de Aeromonas, spp. ventajosamente, se ha encontrado que el ácido nalidíxico, en comparación con cefsulodina, no reduce significativamente la vida de anaquel del medio de prueba que lo incorpora. En esta conexión, otra forma de la presente invención proporciona un método para hacer un medio de prueba para detectar al menos un primer tipo de entidad biológica e inhibir el crecimiento de un segundo tipo de entidad biológica en el medio. El método incluye los pasos de combinar los sustratos deseados con un medio base de nutrientes; agregar un inhibidor al medio, y esterilizar después del medio al someter el medio al menos 100°C. Debido a que el inhibidor se agrega como un paso inicial, la subsecuente adición estéril de inhibidor es innecesaria. En otra forma de la misma, la presente invención proporciona un medio de prueba para detectar, identificar y calificar o cuantificar una segunda y tercera entidad biológica. El medio de prueba incluye un medio base de nutrientes que incluye iones de una sal. Se proporciona un primer y segundo sustratos cromogénicos y un sustrato no cromogénico en el medio de prueba. La primera y segunda entidades biológicas son sensibles al primer y segundo sustratos cromogénicos, respectivamente, y la tercera entidad biológica es sensible al sustrato no cromogénico. Las agregaciones de la primera entidad biológica presente en el medio de prueba son de un primer color, las agregaciones de la segunda entidad biológica presente en el medio de prueba son de un segundo color, y las agregaciones de la tercera entidad biológica presente en el medio de prueba son sustancialmente negras. En una forma preferida, el medio de prueba de la invención cuenta por la tercera entidad biológica que es sensible al primer y/o el segundo sustrato cromogénico además del sustrato no cromogénico. En tal caso, las agregaciones de la tercera entidad biológica se mostrarán no obstante como sustancialmente negras. Debe apreciarse que el uso de un sustrato no cromogénico junto con uno o más sustratos cromogénicos aumenta sinergísticamente el número de entidades biológicas que puede detectarse y distinguirse en un medio sencillo y aumenta sinergísticamente las combinaciones de color posibles para un conjunto dado de entidades biológicas al ser detectadas. Dicho de otra forma, incluir un componente no cromogénico como uno de los sustratos aumenta sinergísticamente el grado de libertad para seleccionar otros sustratos y los colores correspondientes para un medio de prueba. Esto es así debido a que una agregación de la identidad biológica que es sensible al sustrato no cromogénico se mostrará confiablemente como sustancialmente negra. No necesitan explicarse efectos de color con los sustratos no cromogénicos. Por ejemplo, en un medio de prueba que incluye tres sustratos cromogénicos de un sustrato no cromogénico, evitan al menos tres efectos combinados de combinación de color usando el componente no cromogénico, en comparación con el uso de cuatro componentes cromogénicos. La presente invención, en otra forma de la misma, proporciona un medio de prueba capaz de detectar, cuantificar, y diferenciar coliformes generales y/o E. coli spp. bajo luz ambiental. El medio de prueba comprende un medio basado en nutrientes que incluye una sal. Se proporciona en el medio un primer sustrato capaz de formar un primer componente insoluble en agua de un primer color en la presencia de E. coli y los iones de la sal. El primer color es sustancialmente negro. Se proporciona un segundo sustrato capaz de formar un segundo componente insoluble en agua de un segundo color en la presencia de coliformes generales. El segundo color se distingue visualmente del primer color. Así, las colonias de E. coli presentes en el medio de prueba se indican por el primer color sustancialmente negro y las colonias de coliformes generales se indica por el segundo color. En una forma preferida de la invención anterior, el medio de prueba incluye adicionalmente un tercer sustrato capaz de formar un tercer componente insoluble en agua de un tercer color en la presencia de Salmonella o Shigella spp. El tercer color se distingue del primer y segundo colores, por lo cual el medio de prueba es capaz de cuantificar y/o diferenciar E. coli , coliformes generales y Salmonella o Shigella spp. adicionalmente, se seleccionan sustratos tales que los coliformes generales presentes en el medio de prueba también reaccionarán con el tercer sustrato para formar un componente insoluble en agua que incluye el tercer color. Consecuentemente, las colonias de coliformes generales se indican en el medio de prueba como un cuarto color, siendo el cuarto color una combinación del segundo color y el tercer color. El cuarto color se distingue visualmente del primer y tercer color. Aún adicionalmente, pueden seleccionarse sustratos tales que la Aeromonas spp. forman un componente insoluble del segundo color al reaccionar con el segundo sustrato, pero no el primer y tercer sustrato. Así, en el medio de prueba de la invención, las colonias de E. coli serán generalmente negras, las colonias de coliformes generales serán del cuarto color, las colonias de Aeromonas serán del segundo color y las colonias de Shigella o Salmonella serán del tercer color. En otra forma de la misma, la presente invención proporciona un método para detectar, cuantificar y diferenciar bajo luz ambiental coliformes generales, E. coli y al menos uno de los géneros Aeromonas, Salmonella o Shigella en una muestra de prueba. El método comprende los pasos de proporcionar un medio base de nutrientes que incluye el primer, segundo y tercer sustratos. Cada uno de los sustratos es capaz de formar un componente insoluble en agua en la presencia de al menos uno de coliformes generales, E. coli , Aeromonas, Salmonella o Shigella . Se seleccionan sustratos tales que las colonias de E. coli producidas en el medio de prueba son de un primer color, las colonias de coliformes generales producidas en el medio de prueba son de un segundo color, y las colonias de una de Aeromonas y Salmonella o Shigella producidas en el medio de prueba son de un tercer color. Cada uno de los colores es visualmente distinguible. El medio de prueba se inocula con la muestra de prueba y se incuba después. El medio de prueba se examina después por la presencia de las primeras colonias que tienen el primer color, las segundas colonias que tienen el segundo color, y las terceras colonias que tienen el tercer color. Las primeras colonias son E. coli , las segundas colonias son coliformes generales, y las terceras colonias son una de Aeromonas, Salmonella o Shigella . En una forma preferida de la misma, el método de la invención incluye adicionalmente agregar iones de una sal al medio de prueba para reaccionar con uno o más de los sustratos. Al hacerlo asi, se produce un precipitado que muestra un color sustancialmente negro en la presencia de la enzima específica para ese sustrato. Un compuesto preferido para formar el color sustancialmente negro en la presencia de los iones de la sal, consiste de un ß-D-glucuronido. Estos compuestos liberan una aglicona cuando se hidrolizan lo cual forma un complejo sustancialmente negro insoluble en la presencia de iones. En otra forma preferida del método de la invención, el método comprende adicionalmente examinar el medio de prueba por la presencia de cuartas colonias que tienen un cuarto color, en donde se seleccionan sustratos tales que las colonias de Aeromonas sean del tercer color y las colonias de Salmonella y Shigella sean del cuarto color, siendo el cuarto color visualmente distinguible del primer, el segundo y el tercer colores. De mayor preferencia, se seleccionan los sustratos para que el primer color sea sustancialmente negro, el segundo color seas sustancialmente azúl-violeta, el tercer color sea sustancialmente rojo-rosa y el cuarto color sea sustancialmente verde azul-verde. En otra forma preferida del método de la invención, se seleccionan sustratos tales que las colonias de Aeromonas así como las colonias de Plesiomonas y Vibrios están indicadas como el tercer color. Una ventaja de la presente invención es que usan un sustrato no cromogénico junto con uno o más sustratos cromogénicos y aumenta sinergísticamente con eso los grados de libertad de diseño para seleccionar colores para el medio de prueba de la invención. Esto es así debido a que los sustratos cromogénicos no interfieren con el precipitado sustancialmente negro formado por el sustrato no cromogénico. Otra ventaja de la presente invención es que permite la cuantificación, identificación y diferenciación de cuatro (4) cepas bacterianas diferentes simultáneamente en un medio de prueba sencillo usando una muestra de prueba sencilla, bajo iluminación ambiental. Se evitan las pruebas subsecuentes con su concomitante gasto de tiempo extra y costos extras. Desde luego, el medio de prueba de la invención de la presente invención también podría usarse simplemente para propósitos cualitativos, como una mera prueba de presencia/ausencia (P/A) . Aún otra ventaja de la presente invención es que los sustratos se seleccionan de manera que los colores son fáciles de distinguir visualmente uno de otro sin la necesidad de luz UV u otros auxiliares visuales, distintos a, tal vez, medios de amplificación. Por ejemplo, en una modalidad preferida, las colonias de E. coli se indican claramente por un precipitado que tiene un color sustancialmente negro, las colonias de coliformes generales se indican por un color azul-violeta, las colonias de Aeromonas se indican por un color rojo-rosa, y las colonias de Salmonella y Shigella se indican por un color verde azul-verde. Debido a que estos colores son tan distintos visualmente, la confusión entre los colores se reduce en gran medida cuando se comparan con los medios de la técnica anterior. Otra ventaja del medio de prueba de la presente invención es su flexibilidad y facilidad de uso. La temperatura de incubación no es crítica puesto que el crecimiento y la diferenciación de los organismos mencionados pueden ocurrir dentro de un rango óptimo. Por lo tanto, se evitan pasos de resucitación y no ocurre la inhibición de cepas sensibles a la temperatura. También, puede usarse equipo barato. Aún otra ventaja de la presente invención es que se intensifica la distinción de color obtenida en un medio de prueba para identificar y diferenciar E. coli de coliformes generales. En un medio de prueba preferido, las colonias de E. coli presentan un color sustancialmente negro, mientras que los coliformes generales presentan un color rojo-rosa, siendo la distinción entre ellas mucho más aparente que en los medios de prueba de la técnica anterior. Por lo tanto, se reduce en gran medida la confusión entre los dos colores. Aún otra ventaja de la presente invención es que permite la identificación y diferenciación de Aeromonas spp. de coliformes generales. Los medios de prueba de la técnica anterior requieren indeseablemente usar un inhibidor de cefsulodina para prevenir el crecimiento de Aeromonas spp en la presente. Sin embargo, el uso de cefsulodina como un inhibidor requiere un paso extra en el proceso, viz., adición estéril de antibiótico esterilizado por filtro, y es difícil de controlar. Adicionalmente, la presencia de cefsulodina reduce significativamente la vida de anaquel efectiva del medio. Adicionalmente, el uso de un inhibidor, obviamente, previene la detección y cuantificación de Aeromonas spp. Ventajosamente, con la presente invención, Aeromonas spp. puede detectarse, cuantificarse, y diferenciarse de los coliformes generales en un medio sencillo. Como una ventaja relacionada, si es no obstante deseado inhibir el crecimiento de colonias de Aeromonas spp. en el medio de prueba, la presente invención proporciona un medio superior para hacer así. Específicamente, las formas preferidas de la presente invención emplean ácido nalidíxico como un inhibidor, el cual ha mostrado tener un efecto perjudicial mucho menor a la vida de anaquel del medio que lo incorpora. Adicionalmente, el ácido nalidíxico puede agregarse como parte de la formulación del medio inicial antes de la esterilización, evitando con eso un paso del proceso costoso y difícil que se requiere con cefsulodina. Finalmente, el ácido nalidíxico es mucho menos caro que la cefsulodina. Otra ventaja de la presente invención es que puede proporcionar un medio de prueba para la prueba cualitativa o cuantitativa. Esto es, los medios de prueba de acuerdo con la presente invención pueden usarse como meros dispositivos de prueba de presencia/ausencia, o pueden hacerse para cuantificar diversas entidades biológicas que se muestran como colonias de color diferente sobre el medio de prueba de la invención. El método y medio de la presente invención permite la detección, cuantificación, identificación y diferenciación simultánea de una diversidad de entidades biológicas seleccionadas en una muestra de poblaciones de entidades biológicas mezcladas. El método y medio de la invención son particularmente útiles para la detección, cuantificación, identificación y diferenciación de E. coli y coliformes generales, y adicionalmente la identificación y diferenciación cuantitativa de otras entidades biológicas seleccionadas, que incluyen especies bacterianas de Aeromonas, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, y Vibrio. El método y medios de prueba que incorporan la presente invención utilizan el hecho de que la actividad enzimática de las entidades biológicas y específicamente de las bacterias varía con el género y/o familia de las bacterias de interés. El método y los medios de prueba que incorpora la presente invención utilizan adicionalmente el hecho de que pueden usarse diversos complejos de sustrato que identifican enzima para identificar enzimas específicas con la producción de colores distintivos. Significativamente, el método y los medios de prueba que incorpora la presente invención explotan el hecho de que los sustratos cromogénicos presentes en un medio de prueba no interfieren con el color sustancialmente negro producido por los sustratos no cromogénicos. Mientras que los sustratos no cromogénicos son conocidos en la técnica, per se, sus propiedades distintivas en presencia de sustratos cromogénicos no se han reconocido. Sin embargo, el comportamiento de un sustrato no cromogénico en un medio que incluye una combinación de sustratos cromogénicos es único. Para ilustrar, las agregaciones de una identidad biológica que es sensible a dos sustratos cromogénicos se mostrará típicamente en un medio de prueba como una combinación de los dos colores producidos durante el desdoblamiento de los dos sustratos respectivos. Si se involucran tres sustratos cromogénicos, el efecto de color combinado podría ser prohibitivamente difícil de predecir y explicar. Adicionalmente, las variaciones inherentes en la cantidad de las enzimas producidas por las cepas particulares de las entidades biológicas pueden resultar en diferentes tintes o matices de colores durante el desdoblamiento de los sustratos cromogénicos. Consecuentemente, los colores pueden ser difíciles de distinguir para una persona no profesional que examina el medio de prueba. Los sustratos cromogénicos deben seleccionarse por lo tanto en vista de los otros sustratos cromogénicos planeados para inclusión en un medio de prueba dado. Tal no es el caso con los componentes no cromogénicos. Mientras que las agregaciones de las entidades biológicas son sensibles de los sustratos cromogénicos además de los sustratos no cromogénicos pueden mostrarse en el medio de prueba como teniendo un "halo" coloreado o fluorescente, tales agregaciones no obstante aparecen sustancialmente negras y son por lo tanto fáciles de identificar. A diferencia de los sustratos cromogénicos, se logran múltiples "grados de libertad" con los componentes no cromogénicos al no tener que tomar en cuenta efectos de color combinados. Usar un sustrato no cromogénico permite a un medio de prueba sencillo diferenciar cuatro (4) cepas bacterianas diferentes con cuatro (4) colores visualmente distinguible. El color negro es superior porque es difícil de confundir. Adicionalmente, la pigmentación sustancialmente negra no difunde de manera que la ubicación de las colonias se conoce exactamente y las colonias pueden contarse precisamente. Los sustratos no cromogénicos producen un compuesto quelado insoluble que es diferente del dímero que se produce por los sustratos cromogénicos. El medio y método de prueba de la invención permite no solamente una detección, cuantificación o identificación y diferenciación cualitativa de coliformes generales y E. coli , sino también de Salmonella, Shigella y Aeromonas, así como Plesiomonas y Vibrio . Las especies de Plesiomonas y Vibrios se determinan pero no se diferencian de las especies de Aeromonas puesto que están muy estrechamente relacionadas. Definiciones Las entidades biológicas, tales como coliformes generales, E. coli , etc . , se refieren en la presente como siendo "sensibles" a algunos sustratos cromogénicos y no cromogénicos. Más específicamente, una entidad biológica producirá predeciblemente enzimas especificas cuando la entidad está presente en un medio de prueba tal como el descrito posteriormente. Estas enzimas desdoblaran selectivamente los sustratos cromogénicos y no cromogénicos. Durante el desdoblamiento, estos sustratos producen un color en el medio de prueba. El mecanismo para producir el color es diferente para los sustratos cromogénicos y no cromogénicos como se describe posteriormente. Los microorganismos que tienen actividad de ß-galactosidasa incluyen aquellos comúnmente conocidos por la designación de "coliformes". Existen diversas definiciones de "coliforme" pero la aceptada generalmente incluye bacterias que son miembros de la familia de Enterobacteriaceae, y tienen la habilidad de fermentar el azúcar lactosa con el desprendimiento de gas y ácido. La mayoría de los coliformes son positivos para a- y ß-galactosidasa. Esto es, producen tanto a- como ß-galactosidasas . Los microorganismos que tiene actividad de ß-glucuronidasa además de la actividad de galactosidasa incluyen principalmente la mayoría de las cepas de Escherichia coli . Esto es, E. coli es positiva para a- y ß-galactosidasa asi como ß-glucuronidasa. El término "coliformes generales" como se usa en esta solicitud se refiere a coliformes distintos a las diversas cepas de E. coli . Estos "coliformes generales" son microorganismos que no forman esporas, gram negativos que tienen generalmente actividad de a- y ß-galactosidasa (es decir, termentadores de lactosa) , pero no tienen actividad de ß-glucuronidasa, y tienen la habilidad de fermentar el azúcar sorbitol. Para propósitos de esta especificación un "sustrato cromogénico" es un sustrato que no necesita químicos adicionales presentes en el medio de prueba durante la hidrólisis para la producción de color. Esto es, un sustrato cromogénico se desdobla por la enzima específica que corresponde a ese sustrato para formar un dímero con el color que se concentra en el área de desdoblamiento del sustrato. Se conocen muchos sustratos cromogénicos en la técnica. Para propósitos de esta especificación "cromogénico" incluye sustratos fluorogénicos . Los productos de los sustratos fluorogénicos requieren luz ultravioleta (UV) para detectarse y son más solubles que los sustratos cromogénicos preferidos, así no son por lo tanto generalmente preferidos para uso con el medio de prueba descrito posteriormente. Algunos sustratos, referidos en la presente como "no cromogénicos", producen un precipitado obscuro, sustancialmente negro en la presencia de iones de una sal de actividad enzimática. Por ejemplo, 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido, cuando se incluye en un medio junto con una sal que produce iones tal como citrato de amonio férrico, producirá un precipitado sustancialmente negro en la presencia de ß-glucuronidasa producida por E. coli u otras entidades biológicas. Más específicamente, durante el desdoblamiento del sustrato no cromogénico por la enzima particular, se forma un complejo insoluble en agua sustancialmente negro en el medio. El precipitado sustancialmente negro consiste de los iones férricos y la aglicona liberada cuando el sustrato se hidroliza por la glucuronidasa de E. coli . Este precipitado es un compuesto quelado que no difunde. Tampoco es el color sustancialmente negro susceptible a interferencia de compuestos cromogénicos presentes en el medio de prueba. Para propósitos de esta especificación un "sustrato no cromogénico" significa que un químico además de aquellos usados con los componentes cromogénicos debe estar presente en el medio de prueba cuando el sustrato de desdobla por su enzima correspondiente. El precipitado sustancialmente negro formado con eso es una combinación del complejo sustrato-sal y no es un dímero como se forma por los "compuestos cromogénicos" . Para propósitos de esta especificación, la expresión "bajo luz ambiental" se refiere al espectro visible, es decir, colores que pueden verse y distinguirse a simple vista. Una colonia presente en un medio de prueba que requiere luz ultravioleta para verse, por ejemplo, no caería bajo la definición "bajo luz ambiental". Sin embargo, debe entenderse que el término "bajo luz ambiental" incluye usar un dispositivo de amplificación, si es necesario. La amplificación puede ser especialmente útil cuando se cuentan colonias numerosas. El término "visualmente distinguibles" se refiere a dos o más colores que pueden diferenciarse bajo luz ambiental. Para propósitos de esta especificación, el término "sustancialmente negro" incluye café obscuro a negro, y también incluye negro con diversos halos coloreados, tales como rojo-violeta, verde, fluorescente, etc. Para propósitos adicionales de esta especificación, los nombres de colores citados en la presente se dan como guía, pero debe entenderse que los nombres de los colores pueden leerse ampliamente. Esto es, puede haber traslapamiento entre los colores citados. Esto es debido a que, como se discutió, las entidades biológicas producen diversas cantidades de enzimas, lo cual a su vez afecta el tinte o matiz de color resultante. El término "sustrato de ß-galactosidasa" como se usa en la presente se refiere a un ß-galactosido que comprende galactosa unida por enlace ß- a un sustituyente que forma un compuesto coloreado insoluble en agua cuando se libera por la acción de ß-galactosidasa sobre el sustrato. Similarmente, el término "a- galactosidasa" como se usa en la presente se refiere a a-galactosido que comprende galactosa unida por un enlace a- a un sustituyente que forma un compuesto coloreado insoluble en agua cuando se libera por la acción de *-galactosidasa sobre el sustrato. El término "sustrato ß-glucuronidasa" como se usa en la presente se refiere a un ß-glucuronido que comprende ácido glucurónico unido por *-enlace a un sustituyente que forma un precipitado coloreado insoluble en agua cuando se libera por la acción de ß-glucuronidasa sobre el sustrato. Los sustratos y compuestos de a- y ß-galactosidasa y cualquier otro sustrato descrito en la presente así como los sustratos y compuestos de ß-glucuronidasa y cualquier otro sustrato descrito en la presente pueden comprender sales carboxiladas formadas al hacer reaccionar una base adecuada con el grupo galactosido o carboxilglucurónico apropiado. Las base adecuadas incluyen hidróxidos o carbonatos de metal alcalino o metal alcalinotérreo, por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de magnesio, y carbonatos correspondientes; y. bases de nitrógeno tales como amoniaco y alquilaminas tales como trimetilamina, trietilamina y ciclohexilamina. Diseñar un medio de prueba para entidades biológicas especificas Algunos miembros de la familia de Enterobacteriaceae pueden distinguirse por la presencia de actividad de a-galactosidasa en la ausencia de actividad de ß-galactosidasa, o viceversa. Por ejemplo, la mayoría de Salmonella y Shigella spp. son positivas para a-galactosidasa, pero negativas para ß-galactosidasa. Similarmente, Aeromonas spp. puede distinguirse de otros miembros de la familia de Enterobacteriaceae por la presencia de actividad de ß-galactosidasa en la ausencia de actividad de a-galactosidasa. El método y medio que incorpora la presente invención se diseñan para aprovechar estas características distintivas. Por ejemplo, la especificidad de la actividad enzimática para Salmonella y Aeromonas spp. , en oposición a coliformes generales, puede explotarse, como se ilustra posteriormente. El método descrito en la presente es particularmente adecuado para la detección, cuantificación o identificación y diferenciación cualitativa de las diferentes clases de microorganismos descritos previamente, a saber, coliformes generales, E. coli, Aeromonas y Salmonella y Shigella spp. Aunque el método de la invención es particularmente adecuado para estos microorganismos particulares, no se limita al mismo. En cambio, las técnicas descritas en la presente tienen aplicación para la identificación y diferenciación de una amplia diversidad de entidades biológicas. Esto es, las entidades biológicas específicas son "sensibles" a diversos sustratos. Más particularmente, estas entidades biológicas producen o contienen predeciblemente enzimas conocidas. Pueden seleccionarse sustratos, cromogénicos o no cromogénicos, que en la presencia de una o unas enzimas particulares, formarán un componente insoluble de un color predecible y distinguible. Pueden seleccionarse sustratos múltiples para identificar simultáneamente una pluralidad de entidades biológicas distintas en un medio de prueba sencillo, siendo identificables las agregaciones de cada entidad distinta por un color separado distinguible. Adicionalmente, aún cuando las modalidades preferidas descritas en la presente distinguen todas las diversas agregaciones presentes en un medio de prueba bajo luz ambiental, como ese término se define en la presente, tal no es necesario. Por ejemplo, diversos sustratos descritos en la presente requieren el uso de luz ultravioleta para que las agregaciones presentes en el medio sean vistas. La Tabla 1 enlista diversas enzimas cuya presencia puede detectarse usando algunos de los sustratos enlistados en la Tabla II.

TABLA I TABLA II Diversos Sustratos y Color Durante el Desdoblamiento sustratos de 6-cloro-3-indolilo Rosa sustratos de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo Verde azulado sustratos de 3-indoliio Verde azulado sustratos de N-metilindolilo Verde sustratos de nitrofenilo Amarillo sustratos de n'itroanilina Amarillo sustratos de 8- idroxiquipolina (y ion de sai) Sustancialmente negro sustratos de cictoexenoescutetina (y ion de sal) Sustancialmente negro sustratos de esculeüna (y ion de sal) Sustancialmente negro sustratos de quinolina (y ion de sal) Sustancialmente negro sustratos de 5-yodo-3-indolilo Purpura sustratos de 5-Bromo-6-cloro-3-indolilo Magenta sustratos de 6-f luoro-3-indolilo Rosa sustratos de coumapna Fluoresente sustratos de f luoresceina Fluoresente sustratos de rodamma" Fluoresente sustratos de resorurun Fluoresente Los compuestos de sustrato específicos aplicables para uso con el medio de prueba de la presente invención están disponibles como sigue: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido (X-gal) es un sustrato de ß-galactosidasa comercialmente disponible que produce un precipitado insoluble que tiene un color aproximadamente verde azulado cuando reacciona con ß-galactosidasa y está disponible a partir Biosynth International, Naperville, IL. 6-cloro-3-indolil-ß- D-glucuronido es un compuesto que produce un precipitado insoluble que tiene un color magenta, la preparación del cual se describe en la Patente Norteamericana No. 5,210,022 antes mencionada incorporada para referencia y está disponible a partir de Research Organics, Cleveland, OH. El compuesto 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß- D-glucoronido (X-gluc) es un ß-glucuronido comercialmente disponible que produce un precipitado insoluble que tiene un color aproximadamente verde azulado cuando reacciona con ß-glucuronidasa. Similarmente, el indoxil-ß-glucoronido es un compuesto similar, la preparación del cual se describe en el artículo antes mencionado por Ley et al., Can . J. Microbiol . , la descripción del cual se incorpora para referencia. Otro ß-galactosido adecuado es el compuesto 6-cloro-3-indolil-ß- D-galactosido que produce un precipitado insoluble que tiene un color rosa/magenta, la preparación del cual se describe en la Patente Norteamericana No. 5,210,022 antes mencionado. Otros compuestos adecuados aplicables como sustratos en la práctica de la presente invención se especifican en la Patente Norteamericana No. 5,210,022, todos los cuales se incorporan en la presente para referencia. El sustrato 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido es un ß-glucuronido comercialmente disponible que, en la presencia de iones metálicos tales como fierro, produce un precipitado insoluble que tiene un color sustancialmente negro cuando reacciona con ß-glucuronidasa y en la presencia de otros sustratos a- o ß-galactosido. El 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido está disponible a partir de Biosynth International, Naperville, IL. Adicionalmente, una sal que proporciona iones adecuados para uso con la presente invención es el citrato de amonio férrico, disponible a partir de Sigma Chemical, St Louis, MO. Los sustratos de ciclohexenoesculetina se describen en James, et al., Appl . & Envir. Micro. 62:3868-3870 (1996) y en la presencia de iones férricos, producen un precipitado sustancialmente negro e insoluble. Los sustratos de N-metil-indolilo tales como N-metilhidroxi-ß-D-galactopiranosido están comercialmente disponibles a partir de Biosynth International, Naperville, IL. Los sustratos de nitrofenilo tales como 2-nitrofenil-ß- D-galactopiranosido, están comercialmente disponibles a partir de Biosynth International, Naperville, IL. Similarmente, los compuestos de nitroanilina están comercialmente disponibles para síntesis a través de Sigma Chemical, St Louis, MO. Otros sustratos que producen un color sustancialmente negro incluyen sustratos de esculetina tales como ciclohexenoesculetina-ß- D-galactosido, los cuales de describen en James, et al., Appl . & Envir. Micro . 62:3868-3870 (1996) . Los sustratos de quinolina tales como 8-hidroxiquinolina-ß- D-galactopiranosido y 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido están disponibles a través de Biosynth International, Naperville, IL. Los sustratos de yodo-indolilo, tales como 5-yodo-3-indolilo-ß- D-galactopiranosido están disponibles a través de Biosynth International, Naperville, IL. Diversos sustratos fluorescentes están disponibles para uso con la presente invención. Los sustratos de coumarina, tales como sustrato de 4-metilumbeliferilo y sustratos de 5-trifluorometilumbeliferilo están comercialmente disponibles a partir de Biosynth International, Naperville, IL. También son adecuados sustratos de fluoreceina, sustratos de rodamina y sustratos de resorufina. No se conoce una fuente comercial para estos tres sustratos pero los componentes están disponibles a partir de Sigma Chemical, St Louis, MO. Mientras que se han enumerado ejemplos específicos de sustratos adecuados para uso con la presente invención anteriormente, no debe interpretarse, como que limita la invención de ninguna forma. En cambio, alguien con experiencia común en la técnica puede usar la Tabla IV y V posterior para identificar un número virtualmente ilimitado de sustratos. Preparación del Medio de Prueba El medio de prueba se forma combinando los sustratos deseados con un medio base de nutrientes. El medio base de nutrientes puede ser cualquier medio de cultivo conocido en la técnica para proporcionar el mantenimiento y reproducción de células vivas. Generalmente, tales medios incluyen nutrientes, reguladores, agua y algunas veces un agente gelante. Los agentes gelantes posibles incluyen agares, pectinas, carrageninas, alginatos, algarrobilla y xantinas entre otros. Lo siguiente es un ejemplo de la preparación de un medio de prueba adecuado para uso en esta invención. Este ejemplo coincide con el Ejemplo 1, posterior. Los sustratos 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido, 5-Bromo- 4-cloro-3-indolil-a- D-galactopiranosido, . y 6-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido se agregan en cantidades de 250 mg/L de medio; 70 mg/L de medio; y 175 mg/L de medio, respectivamente. Los sustratos se agregan directamente al medio caliente (75°-85°C) (fórmula posterior) en un mezclador antes de la esterilización. Puede hacerse un medio de agar estándar agregando 15 gm de goma de agar de calidad bacteriológica a la siguiente fórmula de nutrientes Digerido Pancreático de Caseína 5.0 gm Extracto de Levadura 3.0 gm Fosfato Dipotásico .3 gm Agua Desionizada 990 ml Citrato de Amonio Férrico 800 mg en 10 ml de agua desionizada (esterilizado separadamente de los otros componentes) y esterilizando después a 121°C durante 15 minutos. El medio debe ajustarse para resultar en un pH de 7.0. El medio de agar esterilizado se deja caer a una temperatura de 45°C en un baño de agua y después se agrega la solución estéril que contiene los sustratos preparados como se describió anteriormente. El medio se mezcla completamente y se vierte dentro de placas de petri estériles en un volumen de 20 ml/placa. Un medio de prueba basado en pectina puede prepararse usando los mismos pasos descritos anteriormente excepto que se usan 25gm de pectina de metoxilo bajo como el agente solidificante y el medio se vierte a temperatura ambiente dentro de placas de petri que contienen una capa de gel delgada que contiene iones calcio que combinan con la pectina para formar un gel sólido. Un medio de cultivo de pectina adecuado se describe en la Patente Norteamericana No. 4,241,186 y Patente Norteamericana No. 4,282,317, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Un medio basado en pectina se prefiere sobre un medio de agar estándar debido a que tiene las ventajas de conveniencia e independencia de temperatura para el usuario. El uso de medios de pectina está bien descrito y aceptado como un resultado de estudios en colaboración con AOAC y otras investigaciones publicadas y en residencia. Un medio de pectina adecuado está comercialmente disponible a partir de Micrology Laboratories, LLC bajo la marca comerial Easygel®. El medio de base acuosa sin el agente gelante está disponible a partir de Micrology LAbs, Goshen IN., para uso con los filtros de membrana. Inoculación del Medio de Prueba con la Mezcla El medio de prueba puede inocularse con una muestra a ser probada por la presencia de microorganismos por cualquier método conocido en la técnica para inocular un medio con una muestra que contiene microorganismos. Por ejemplo, la muestra a ser probada puede agregarse a las placas de petri entes de agregar el medio base de nutrientes (técnica de placa vertida) o extenderse sobre la superficie de las placas después que se han enfriado y solidificado (técnica de estregado o rayado de placas) . Las muestras liquidas también pueden filtrarse a través de un filtro de membrana de microporo (.45 micrómetros de tamaño) el cual se coloca después sobre la superficie de un medio sólido o sobre una almohadilla saturada con el medio. Incubación del Medio de Prueba El medio de prueba inoculado se incuba durante un tiempo suficiente y a una temperatura tal para cultivar los microorganismos individuales presentes en la muestra en colonias detectables. Las condiciones de incubación adecuadas para cultivar microorganismos en un medio son conocidas en la técnica. Comúnmente, el medio de prueba se incuba durante aproximadamente 24-48 horas a una temperatura de aproximadamente 30°-40°C. A menos que se usen inhibidores de la población microbiana general, la población microbiana general así como los coliformes generales, E. coli Aeromonas spp. y Salmonella spp. y Shigella spp. crecerán en el medio de prueba incubado. Debido a que los precipitados formados son insolubles en el medio de prueba, permanecen en la inmediata vecindad de los microorganismos produciendo las diversas enzimas. Conforme los microorganismos se reproducen para formar colonias, las colonias muestran unidades formadoras de colonias que tienen el color producido por el sustrato particular. Por ejemplo, E. coli produce ß-galactosidasa y ß-galactosidasa, pero a diferencia de los coliformes generales y Aeromonas spp . , también produce ß-glucuronidasa. Por lo tanto, los precipitados insolubles de cada uno de los sustratos ß-galactosidasa, el sustrato a-galactosidasa y el sustrato ß-glucuronido se forman por la acción de las enzimas respectivas tales que las colonias de E. coli se muestran como un color sustancialmen6te negro, teniendo algunas veces un halo violeta azul alrededor. Los coliformes generales producen ß-galactosidasa y ß-galactosidasa y consecuentemente desdoblan los sustratos a-galactosidasa y ß-galactosidasa. En el ejemplo presente, el sustrato 5-Bromo- 4-cloro-3-indolil-a- D-galactosido produce un color azul verde o verde azulado, mientras que el 6-cloro-3-indolil-ß- D-galactosido produce un color rosa o rojo-rosa. Así, las colonias de coliformes generales se mostrarán como un color azul violeta, lo cual es una combinación de los colores producidos por cada uno de los a- y ß-galactosido, respectivamente . Significativamente, sin embargo, se ha encontrado que Aeromonas spp. que está estrechamente relacionada a los coliformes, y da un patrón de prueba bioquímico casi idéntico, son ß-galactosidasa positivos y a-galactosidasa negativos. Esto es, Aeromonas spp. no hidrolizará el sustrato a-galactosido. Por lo tanto, las colonias de Aeromonas presentes en el medio de prueba se mostrarán como colonias que tienen el color rosa-rojo producido por el sustrato 8-galactosido . Adicionalmente, se ha encontrado que la mayoría de los miembros de los géneros Salmonella y Shigella son positivos para a-galactosidasa, pero negativos para ß-galactosidasa. Esto es, Salmonella y Shigella no hidrolizarán el sustrato ß-galactosidasa. Por lo tanto, las colonias de Salmonella y Shigella presentes en el medio de prueba aparecerán como un color verde azulado o azul verde producido por el sustrato a-galactosido. Ocasionalmente, las colonias de Shigella aparecerán negras con un halo azul verde puesto que algunas cepas de Shigella son positivas para ß-glucuronidasa, y algunas cepas de Shigella aparecerán azul/púrpura puesto que algunas cepas inusuales son positivas para a-galactosidasa y ß-galactosidasa. Examen del medio de Prueba y enumeración de los Mi croorgani smos Los sustratos seleccionados para el ejemplo anterior producen tres colores distintos, y los coliformes generales están indicados por un cuarto color que es una combinación de dos de los tres colores. Esto es, las colonias de E. coli se muestran como sustancialmente negras, las colonias de coliformes generales se muestran como azul violeta, las colonias de Aeromonas se muestran como rojo-rosa, y las colonias de Salmonella y Shigella se muestran como verde azulado-verde. Mientras que los tintes individuales de estos colores pueden variar algo del medio de prueba debido a factores tales como producción de enzimas variable de las entidades biológicas, se ha encontrado que estos cuatro colores son suficientemente distintos de manera que es improbable la confusión entre ellos. Las colonias de cada tipo de microorganismo pueden enumerarse contando las colonias o por otros métodos conocidos en la técnica para enumerar microorganismos sobre una placa de prueba. El número de colonias de cada tipo indica el número de microorganismos de cada tipo originalmente presentes en la muestra antes de la incubación. INGREDIENTES OPCIONALES INHIBIDORES El método de la presente invención no requiere inhibidores. Sin embargo, el medio puede hacerse más selectivo para coliformes generales y E. coli si se desea por la adición de diversos compuestos que son inhibitorios de la población microbiana general, pero tienen poco o ningún efecto sobre los coliformes. Los siguientes son algunos compuestos que pueden usarse: a) sales biliares, aproximadamente 0.3 g/litro, b) lauriisulfato sódico, aproximadamente 0.2 g/litro, c) desoxicolato sódico, aproximadamente 0.2 g/litro, d) Tergitol 7, aproximadamente 0.1 ml/litro. El uso de uno o más de estos compuestos reduce la presencia de microorganismos base (no coliforme) y hace una placa menos desordenada y elimina la posibilidad de inhibición o interferencia por los organismos no coliformes en la muestra. El uso de algunos antibióticos puede lograr el mismo resultado. La cefsulodina se usa comúnmente en medios de prueba comúnmente disponibles para inhibir Aeromonas spp. Sin embargo, el uso de cefsulodina como un inhibidor requiere un paso extra en el proceso, a saber, la adición estéril de antibiótico esterilizado por filtro. Este paso es difícil de controlar. Adicionalmente, la presencia de cefsulodina reduce significativamente la vida de anaquel efectiva del medio. Se ha encontrado que el ácido Nalidíxico puede usarse en lugar de Cefsulodina para inhibir Aeromonas spp. con aproximadamente la misma eficiencia. El ácido nalidíxico es preferible debido a que puede sobrevivir la temperatura de aproximadamente 120°C alcanzada al poner en autoclave los medios de prueba. Por lo tanto, a diferencia de la cefsulodina, el ácido nalidíxico puede agregarse a los medios de prueba como parte de la formulación del medio inicial antes de la esterilización (véase, preparación del medio de prueba, anteriormente) . También, entender que aquella resistencia del ácido nalidixico a las condiciones ambientales desfavorables resultará en una vida de anaquel más larga para un medio que lo contenga en comparación con la cefsulodina.

INDUCTORES Es posible que la producción enzimática de los coliformes generales pueda mejorarse por la adición a las formulaciones de medio de cantidades muy pequeñas de sustancias conocidas como inductores de enzimas. Un inductor específico para ß-galactosidasa está disponible y se conoce químicamente como isopropil- ß-tiogalactopiranosido. El agregar aproximadamente 100 mg/litro de medio tiene un efecto positivo y notable sobre la velocidad de producción enzimática para algunas especies de coliformes. Otros inductores enzimáticos están disponibles y pueden agregarse a las formulaciones de medio si se juzga útil la producción enzimática mejorada. EJEMPLOS Se enlistan posteriormente ejemplos amplios de combinaciones de sustrato de enzima de medio de prueba para usarse en combinación con las fórmulas de nutrientes discutidas anteriormente u otras fórmulas de nutriente adecuadas que pueden prepararse para practicar la presente invención. La Tabla III ilustra la flexibilidad de las modalidades preferidas que incorporan la presente invención. La Tabla III es una matriz de algunas de las posibles combinaciones de cuatro colores disponibles para las entidades biológicas preferidas E. coli , coliformes generales, y al menos uno de los géneros Aeromonas, Salmonella o Shigella a ser detectados al usar las enseñanzas de esta descripción. Otras combinaciones de color son posibles. En muchos casos, en una pluralidad de diferentes sustratos se logrará un resultado deseado, siendo la única diferencia los colores detectados para una enzima específica. La selección de color preferida para la detección de E. coli se denota con un asterisco en la Tabla III dependiendo de los colores seleccionados para detectar otros microorganismos. Como se discutió anteriormente, el color sustancialmente negro se prefiere debido a que otros sustratos cromogénicos no interfieren con él y el color sustancialmente negro es fácil de distinguir de los otros colores. Como se discutió anteriormente, el uso de la Tabla III requiere tomar en cuenta el efecto de color combinado discutido anteriormente que se produce por la inclusión de sustratos cromogénicos múltiples en un medio sencillo. Por ejemplo, en referencia a la primera entrada de la Tabla III, puede entenderse que los coliformes generales aparecerán como una combinación de (1) rojo-rosa (magenta) y (2) verde azulado, siendo el color resultante azul violeta.. Este es el caso debido a que los coliformes generales son sensibles a dos sustratos cromogénicos. Similarmente los coliformes generales se mostrarán en un medio de prueba de acuerdo con la segunda entrada de la Tabla III como una combinación de ! 1 ) roj o-rosa (magenta) y (2 ) amarillo . TABLA III Posibilidades de color para la detección de microorganismos preferidos *= color preferido para E. coli . La Tabla IV es una lista parcial de patrones enzimáticos para entidades biológicas preferidas para ser detectadas de acuerdo con las enseñanzas de esta descripción. Debe entenderse que alguien con experiencia común en la técnica reconocería fácilmente que otras enzimas que se conocen y que se han producido, y enzimas que son conocidas solamente a un nivel teórico, también funcionarían satisfactoriamente .

La Tabla V es una matriz que enseña una amplia diversidad de sustratos y sus colores asociados para uso en medios de prueba de acuerdo con las enseñanzas de esta descripción. El lado izquierdo de la Tabla V indica los colores que resultarán cuando el componente cromogénico enlistado se desdobla de su sustrato correspondiente por la enzima específica para ese sustrato. En el caso de los componentes no cromogénicos el color es sustancialmente negro y el mecanismo de reacción requiere la presencia de iones de una sal durante el desdoblamiento del sustrato, como se explicó anteriormente.

Las enzimas de prueba que se producen por algunas entidades biológicas (véase Tabla IV) se encuentran del lado derecho de la Tabla V. Los "componentes de sustratos" se muestran a la izquierda de las enzimas de prueba especificas. Cada uno de los componentes de sustrato enlistados en el lado derecho de la Tabla V pueden combinarse con cualquiera de los componentes cromogénicos o no cromogénicos enlistados en el lado izquierdo de la Tabla V para identificar un sustrato específico para uso en un medio de pruebas. Puede por lo tanto entenderse que la Tabla V enseña una gran cantidad de sustratos posibles para uso de acuerdo con la presente invención. Muchos de los sustratos identificados por el uso anteriormente descrito de la Tabla V están comercialmente disponibles, mientras que el método para producir otros sustratos identificados se describen en la literatura. Aún otros sustratos identificados al usar la Tabla V son solamente teóricamente posibles. Los componentes no cromogénicos están incluidos en el fondo del lado izquierdo de la Tabla V, y son diferentes de los componentes cromogénicos debido a que no forman colores específicos durante el desdoblamiento. En cambio, los componentes de quinolina o esculetina combinan con iones de una sal (por ejemplo, sal férrica) , que debe estar presente en el medio cuando el sustrato se desdobla por la enzima específica. El precipitado sustancialmente negro formados por los componentes no cromogénicos es una combinación del complejo de quinolina o esculetina - fierro más que un dímero que se forme por los componentes cromogénicos. A diferencia de los componentes no cromogénicos, los componentes cromogénicos deben seleccionarse en vista de todos los otros componentes cromogénicos seleccionados para el medio y en vista de los patrones enzimáticos de las entidades a ser detectadas. La selección de los componentes cromogénicos debe maximizar la distinción entre los colores respectivos producidos. Aunque muchas diversas posibilidades de componente cromogénico y componente sustrato/enzima se enseñan en la Tabla V, otras posibilidades dentro del alcance de las reivindicaciones anexas sería posible para alguien con experiencia común en la técnica. Por ejemplo, como se muestra en la Tabla V, alguien con experiencia común en la técnica podría combinar un grupo N-acetilo con muchos de los azúcares de los componentes de sustrato listados en la Tabla V. Por ejemplo, un grupo N-acetilo podría combinarse con ß- D-manopiranosido para formar N-acetil-ß- D-manosaminida, siendo la enzima correspondiente N-acetil-ß- D-manosaminidasa. Cualquiera de los componentes cromogénicos o componentes no cromogénicos enlistados en el lado izquierdo de la Tabla V podría combinarse después con el componente de sustrato para identificar un sustrato. Si el sustrato está comercialmente disponible o se conoce el método para hacerlo, el sustrato podría usarse en un medio de prueba. Durante el desdoblamiento de sustrato por la enzima correspondiente en el medio de prueba, el color enlistado aparecerá. Generalmente, las enseñanzas de esta descripción pueden usarse como sigue para hacer un medio de prueba para detectar diversos microorganismos o tipos de células. Primero, se selecciona el microorganismo deseado a ser detectado y diferenciado. Los organismos preferidos a ser detectados son E. coli r coliformes generales, y al menos uno de los géneros Aeromonas, Salmonella o Shigella . Las enzimas producidas por los organismos seleccionados pueden identificarse con referencia a la Tabla IV. Equipado con el conocimiento de las enzimas específicas producidas por cada microorganismo, uno puede identificar después los componentes de sustratos correspondientes del lado derecho de la Tabla V. Dependiendo del color deseado, uno puede seleccionar un componente cromogénico o no cromogénico de la Tabla V a ser combinado con el componente sustrato para identificar un sustrato para inclusión en el medio de prueba. Si el sustrato identificado por eso está comercialmente disponible o el método de su síntesis es conocido, el sustrato puede usarse en el medio de prueba.

TABLA V La Tabla VI es un resumen conciso de los ejemplos específicos. TABLA VI- RESÚMENES DE EJEMPLOS EJEMPLO 1 Los microorganismos seleccionados para ser identificados, cuantificados y diferenciados son E. coli, coliformes generales Aeromonas , Salmonella o Shigella . Con referencia a la Tabla IV, E. coli produce la enzima Bgluc, y Bgluc no se produce por ninguno de los otros microorganismos deseados para ser detectados. Con referencia al lado derecho de la Tabla V, puede verse que la enzima de prueba Bgluc tiene un componente de sustrato correspondiente de ß- D-glucuronido. Así, un componente cromogénico o no cromogénico que produce un color distintivo durante el desdoblamiento de Bgluc debe seleccionarse del lado izquierdo de la Tabla V. La 8-hidroxiquinolina se selecciona por su color sustancialmente negro preferido. El primer sustrato identificado es por lo tanto 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido, la disponibilidad del cual se describió anteriormente. Una sal metálica tal como citrato de amonio férrico también se requiere y se agrega al medio de prueba así que, durante el desdoblamiento del sustrato por Bgluc, se forma un complejo insoluble en agua sustancialmente negro en el medio. El precipitado sustancialmente negro consiste de los iones férricos y la aglicona liberada cuando el sustrato se hidroliza por la glucuronidasa de E. coli . Con referencia adicional a la Tabla IV, Bgal, Bfud y Bglu son comunes para Aeromonas y los coliformes generales. Sin embargo, como se indica en la Tabla IV, Bgal, Bfud y Bglu no se producen generalmente por Salmonella y Shigella . Por lo tanto, un componente de sustrato que corresponde a una de Bgal, Bfud y Bglu puede seleccionarse del lado derecho de la Tabla V. Se selecciona Bgal y el componente de sustrato asociado ß- D-galactopiranosido. El componente cromogénico 6-cloro-3-indolil- produce un color rojo-rosa durante 1 desdoblamiento a partir de su sustrato en la presencia de Bgal y se selecciona como el componente cromogénico. El segundo sustrato es por lo tanto 6-cloro-3-indolil-a- D-galactopiranosido . De nuevo, refiriéndose a la Tabla IV, Bman, Aara y Agal son comunes a Salmonella , Shigella y coliformes generales. Sin embargo, como se indica en la Tabla IV, Bman, Aara y Agal no se producen por Aeromonas . Así, uno de Bman, Aara y Agal puede seleccionarse y su componente de sustrato asociado identificarse con referencia a la Tabla V. Se selecciona la enzima de prueba Agal y el componente de sustrato respectivo a- D-galactopiranosido. Después, debe seleccionarse un componente cromogénico de la Tabla V. Como se muestra en el lado izquierdo de la Tabla V, el componente cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolilo produce un color verde azulado durante el desdoblamiento de su sustrato asociado y por lo tanto se selecciona. El tercer sustrato es por lo tanto 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a- D-galactopiranosido. Los coliformes generales tienen un amplio patrón enzimático que es sensible al sustrato 6-cloro-3-indolil-ß-D-galactopiranosido y al sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a- D-galactopiranosido. Por lo tanto, los coliformes generales mostrarán un cuarto color distintivo que es una combinación de los colores producidos por los dos sustratos antes mencionados, respectivamente. En este caso el cuarto color será violeta azul, el cual es una combinación de rojo-rosa y verde azulado. Finalmente, como se ve en la Tabla IV, E. coli también presenta un amplio patrón enzimático y es sensible a tres de los sustratos seleccionados en este ejemplo, a saber, 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido, 6-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido, y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a- D-galactopiranosido. No obstante, las colonias de E. coli presentes en el medio de prueba mostrarán . un color sustancialmente negro debido a que, como se discutió anteriormente, el sustrato cromogénico no interfiere con el color sustancialmete negro. Ventajosamente, este color sustancialmente negro proporciona un medio superior para distinguir la E. coli , así como permite detectar, cuantificar, diferenciar e identificar cuatro microorganismos separados en un medio de prueba sencillo. Véase Tabla VI. EJEMPLO II Los microorganismos seleccionados para ser detectados, identificados, cuantificados y diferenciados son E. coli, como un primer color, coliformes generales Salmonella y Shigella como un segundo color; y Aeromonas como un tercer color. Con referencia a la Tabla IV, E. coli produce la enzima Bgluc, y Bgluc no se produce por ninguno de los otros microorganismos deseados para ser detectados. Con referencia al lado derecho de la Tabla V, puede verse que la enzima de prueba Bgluc tiene un componente de sustrato correspondiente de ß- D-glucuronido. Así, un componente cromogénico o no cromogénico que produce un color distintivo durante el desdoblamiento de Bgluc debe seleccionarse del lado izquierdo de la Tabla V. La 8-hidroxiquinolina se selecciona por su color sustancialmente negro preferido. El primer sustrato identificado es por lo tanto 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido, la disponibilidad del cual se describió anteriormente. Una sal metálica tal como citrato de amonio férrico también se requiere y se agrega al medio de prueba así que, durante el desdoblamiento del sustrato por Bgluc, se forma un complejo insoluble en agua sustancialmente negro en el medio. El precipitado sustancialmente negro consiste de los iones férricos y la aglicona liberada cuando el sustrato se hidroliza por la glucuronidasa de E. coli . Con referencia adicional a la Tabla IV, Bgal, Bfud y Bglu son comunes a Aeromonas y coliformes generales. Sin embargo, como se indica en la Tabla IV, Bgal, Bfud y Bglu no se producen por Salmonella o Shigella . Usando la Tabla V en la forma descrita anteriormente, se selecciona ß-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido como el segundo sustrato, que producirá un color rojo-rosa durante el desdoblamiento como se indica por la lista de componentes cromogénicos de la Tabla V. Como se ve en la Tabla IV, la enzima Bman es común para Salmonella/ Shigella pero no para Aeromonas . De la Tabla V el componente de sustrato asociado con Bman es ß-D-manopiranosido. En este ejemplo, se desea también producir el segundo color distintivo (rojo-rosa) con Salmonella/ 'Shigella así que, finalmente, las colonias de Salmonella/ Shigella, presentes en el medio de prueba se mostrarán como el mismo color como los coliformes generales presentes en el medio de prueba. Así, como el componente cromogénico es .6-cloro-3-indolil- y el tercer sustrato es por lo tanto 6-cloro-3-indolil-ß- D-manopiranosido. En este ejemplo, usando de nuevo la Tabla V, se identifica un cuarto sustrato que se desdoblará por una de las enzimas Bman, Aara, Agal comunes para Salmonella/ Shigella para producir un tercer color distintivo. Usando la Tabla V en la forma descrita anteriormente, el cuarto sustrato seleccionado es 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a- D-galactopiranosido, que produce un color verde azulado-verde en la presencia de Agal común para Salmonella/ Shigella . Los colores resultantes de las colonias presentes en el medio de prueba pueden predecirse como sigue. E. coli presenta amplio patrón enzimático que es positivo para cuatro de los sustratos seleccionados en este ejemplo, incluyendo el sustrato 8-hidroxi-glucuronido que produce un color sustancialmente negro durante el desdoblamiento en la presencia de los iones de la sal férrica. Las colonias de E. coli se muestran como sustancialmente negras. Aeromonas tiene un patrón enzimático que reacciona con solamente el sustrato 6-Cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido seleccionado en este ejemplo y por lo tanto las colonias de Aeromonas se muestran como rojo-rosa. Salmonella/ Shigella tiene un patrón enzimático que desdobla el tercero y cuarto sustrato seleccionados en este ejemplo y por lo tanto las colonias de Salmonella/ Shigella se muestran como púrpura-azul (una combinación de verde azulado y rojo-rosa) . Finalmente, los colinformes generales son positivos para cada uno de los segundo, tercer y cuarto sustratos seleccionados y las colonias de los mismos se muestran como púrpura-azul, indistinguibles de las colonias de Salmonella/ Shigella . Como se discutió anteriormente, cepas diferentes de todas las especies de los diversos géneros no producirán las mismas cantidades de las diversas enzimas, así que pueden existir ligeras variaciones en los tintes de púrpura-azul, por ejemplo. EJEMPLO IIIA Los microorganismos seleccionados a ser cuantificados y diferenciados en este ejemplo son E. coli como un primer color, coliformes generales y Aeromonas como un segundo color, y Salmonella/ Shigella como un tercer color. Con referencia a la Tabla IV, E. coli produce la enzima Bgluc, y Bgluc no se produce por ninguno de los otros microorganismos deseados para ser detectados. Con referencia al lado derecho de la Tabla V, puede verse que la enzima de prueba Bgluc tiene un componente de sustrato correspondiente de ß- D-glucuronido. Así, un componente cromogénico o no cromogénico que produce un color distintivo durante el desdoblamiento de Bgluc debe seleccionarse del lado izquierdo de la Tabla V. La 8-hidroxiquinolina se selecciona por su color sustancialmente negro preferido. El primer sustrato identificado es por lo tanto 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido, la disponibilidad del cual se describió anteriormente. Una sal metálica tal como citrato de amonio férrico también se requiere y se agrega al medio de prueba así que, durante ¡ el desdoblamiento del sustrato por Bgluc, se forma un compleja insoluble en agua sustancialmente negro en el medio. El precipitado sustancialmente negro consiste de los iones férricos y la aglicona liberada cuando el sustrato se hidroliza por la glucuronidasa de E. coli . Usando las Tablas IV y V en una forma similar a la descrita anteriormente con referencia a los Ejemplos I y II, se selecciona 6hCloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido como un segundo sustrato para combinarse con una de las enzimas Bgal, Bfud y Bglu comunes a los coliformes y Aeromonas, pero negativo para Salmonella/ Shigella para producir un segundo color distintivo L en este casos sustancialmente rojo-rosa. Similarmente, se selecciona como un tercer sustratc para combinarse on 6-Cloro-3-indolil-a- D-galactopiranosido, como un tercer sustrato para combinarse con Agal, la cual es común para coliformes y Salmonella/ Shigella, pero negativa para Aeromonas . Durante la reacción con la enzima como este sustrato también producirá el mismo segundo color distintivo, principalmente rpjo-rosa. Se elecciona 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosidjo como un cuarto sustrato para combinarse con la enzima Bgal, que es común para coliformes y Aeromonas, pero negativa péira Salmonella/ Shigella . Este cuarto sustrato i produce un colorr verde azulado-verde durante la reacción con Bgal EJEMPLO IIIC Un segiindo método independiente para producir los mismos tres coló)res como en el Ejemplo IIIA para los mismos cuatro componentes puede lograrse agregando ácido nalidíxico u otros antibióticos o inhibidores de Aeromonas a los componentes enlistados en el Ejemplo I. Al hacerlo así, la cefsulodina o ácido nalidíxico u otras sustancia actúa como un inhibidor para Aeromonas así que las colonias de Aeromonas no crecen. Si se elimina Aeromonas, entonces las colonias púrpura-azul soh de coliformes verdaderos. Si no se elimina, cualquier Aeromcnas se contará como parte de los coliformes lo cual algunas personas prefieren puesto que Aeromonas es un organismo indicapor importante EJEMPLO IV En esje ejemplo los microorganismos seleccionados para ser detectados cuantificados y diferenciados son E. coli , coliformes y Salmonella/ Shigella como un primer color distintivo y Aejromonas como un segundo color distintivo. Un i i medio de prueba que logra este resultado es el medio de prueba descrito en el Ejemplo II, excepto que se omite el primer sustrato y la sal metálica. Así, debido, a que el patrón enzimáti . Ico de E. coli reacciona con los mismos sustratos que el patrón enzimático para coliformes generales, i E. coli y los c[Dliformes generales serán del mismo color en este medio de prueba. Específicamente, las colonias de E. coli , coliformes y Salmonella/ Shigella se mostrarán como un color púrpura-azul, mientras que las colonias de Aeromonas se mostrarán como up color sustancialmente rojo-rosa. EJEMPLO V Los microorganismos seleccionados para ser detectados cuan,tificados y diferenciados con E. coli , coliformes generales y Aeromonas como un primer color distintivo, y Salmonella/ Shigella como un segundo color distintivo. Un medio de prueba que logra este resultado es el medio de prueba del Ejemplo 3 omitiéndose el primer sustrato en la sal metálica. En este medio de prueba, las colonias de E. coli , coliformes generales y Aeromonas se mostrarán como un color generalmente púrpura-azul, mientras que las colonias de Salmonella y Shigella se mostrarán como un color generalmente verde azulado-verde o como un color rojo-rosa. Opcionalmente, el 6-cloro-3-indolil-a- D-galactosido puedle reemplazarse con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß- D-galactosido así que las colonias de Salmonella se mostrarán como verde azulado, más que rosa. Una tercera forma de lograr el mismo resultado es como un antibiótico, preferiblemente ácido nalidíxico, para inhibir el crecimiento de las colonias de Aeromonas . Si se elimina Aeromonas, entonces las colonias púrpura-azul son todas coliformes verdaderas. Si no se elimina, ninguna Aeromonas será contada como parte de los coliformes lo cual algunas personas pueden preferir puesto que Aeromonas es un organismo indicador importante. EJEMPLO VI Los microorganismos seleccionados para ser detectados, cuantificados y diferenciados son E. coli y coliformes como un primer color distintivo, Aeromonas como un segundo color distintivo y Salmonella/ Shigella como un tercer color distintivo Un medio de prueba que logre esta resultado es el medio de prueba del Ejemplo I omitiéndose el primer ssuussttrraattoo yv llaa ssal metálica. En dicho medio de prueba, las colonias de E. coli y coliformes generales se mostrarán como púrpura-azul, les colonias de Aeromonas se mostrarán como generalmente rojo-rosa y las colonias de Salmonella o Shigella se mostrarán como generalmente verde azulado-verde. EJEMPLO VII Los microorganismos seleccionados para ser detectados, cuantificados y diferenciados son E. coli como un primer color distintivo que es sustancialmente negro; coliformes generales como un segundo color distintivo que es sustancialmente púrpura-azul; Aeromonas /Vibrio/ Plesiomonas como un tercer color distintivo que es sustancialmente rojo-rosa; y Salmoneljla o Shigella como un cuarto color distintivo que es sustancia|lmente verde azulado-verde. Con referencia a la Tabla IV, E. coli produce la enzima Bgluc, y Bgluc no se produce por ninguno de los otros microorganismos deseados para ser detectados. Por lo tanto, un sustrato que produce un color distintivo durante el desdoblamiento d? Bgluc debe seleccionarse de la Tabla V. 8-hidroxiquinolinajß- D-glucuronido produce un color sustancialmente negro en la presencia de Bgluc y sería la selección preferida de sustrato, como se explica posteriormente . Una sal metálica tal como citrato de amonio férrico también se agrega para formar un complejo insoluble en agua sustansialmente negro que consiste de los iones fféérrrriiccooss yv llaa aglicona liberados cuando el sustrato se hidroliza por la glucuronidasa de E. coli . Con referencia adicional a la Tabla IV, puede verse que la enzima Ngal y Naglu son comunes a los microorganismos Aeromonas, Plesiomonas y Vibrios. Por lo tanto, un sustrato adecuado para probar todos estos microorganismos como un color distintivo sencillo es 6-cloro-3-indolil-N-acetil-ß- D-galactosaminida, el cual produce un color sustancialmente rojo-rosa en la presencia de estas enzimas. i De nuefvo refiriéndose a la Tabla IV, Bman, Aara y Agal son comunes para Salmonella/ Shigella y coliformes i generales. Sin ejmbargo, como se indica en la Tabla IV, Bman, I Aara y Agal no e producen por Aeromonas . Por lo tanto puede seleccionarse un sustrato de la Tabla V que reacciona con uno de Bman, Aara y Agal para producir un tercer color distintivo. Como se muestra en la Tabla V, 5-bromo-4-cloro-3- indolil-a- D-ga ctosido produce un color verde azulado-verde en la presencia <tle Agal y se selecciona por lo tanto como un sustrato. En este medio de prueba las colonias de E. coli se mostrarán como sustancialmente negras, las colonias de coliformes genefrales se mostrarán como sustancialmente púrpura-azul, la colonias de Aeromonas, Vibrio y Plesiomonas E. coli coliformes generales como un primer color distintivo que es púrpura-azul; Aeromonas, Plesiomonas y Vibrios como un segundo color distintivo que es rojo-rosa; y Salmonella o Shi gella como un tercer color distintivo que es verde azulado-verde. Si este resultado puede lograrse con el medio de prueba como se describe en el Ejemplo 6 con la adición de 6-Cloro-3-indolil-N-acetil-ß- D-galactosaminida, al cual son sensibles cada uno de los microorganismos Plesiomonas, Vibrio y Aeromonas EJEMPLO X Los microorganismos seleccionados para ser detectados, cuar.tificados, y diferenciados en este ejemplo son coli y coliformes generales como un primer color; Aeromonas, Vi rl?o y Plesiomonas como un segundo color distintivo; y Salmonella o Shigella como un tercer color distintivo. Un medio de prueba adecuado que logra este resultado es el medio de prueba descrito en el Ejemplo 7 excepto que se omite el primer sustrato para detectar colonias de E. coli . En este ejemplo, las colonias de E. coli y coliformes generales se muestran como generalmente púrpura-azul, Aeromonas, Vibrio y Plesiomonas se muestran como generalmente rojo-rosa, y Salmonella o Shigella se muestra como generalment verde azulado-verde. La adición de 6-Cloro-3-indolil-ß- D-dalactopiranosido es necesaria para producir el color púrpura azul para las colonias de E. coli EJEMPLO XI Los microorganismos seleccionado para ser detectados, cuantificados y diferenciados en este ejemplo son E. coli como un color sustancialmente negro y coliformes generales como un color rojo-rosa. Con referencia a la Tabla IV, E. coli produce la enzima Bgluc, y Bgluc no se produce por ninguno de los otros microorganismos deseados para ser detectados. Por lo tanto, un sustrato que produce un color distintivo durante el desdoblamiento de Bgluc debe seleccionarse de la Tabla V. 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido produce un color obscuro en la presencia de Bgluc y sería la selección preferida de sustrato. Una sal metálica tal como citrato de amonio férrico también se agrega para formar un complejo insoluble en agua negro que consiste de los iones férricos y aglicona liberada cuando el sustrato se hidroliza por la glucuronidasa de E. coli . Con referencia adicional a la Tabla IV, Bgal, Bfud y Bglu son comunes a Aeromonas y coliformes generales. Sin embargo, como se indica en la Tabla IV, Bgal, Bfud y Bglu no se producen generalmente por Salmonella o Shigella . Por lo tanto, puede seleccionarse un sustrato de la Tabla V que reacciona con una de Bgal, Bfud y Bglu para producir un segundo color distintivo. 6-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido produce un color rosa en la presencia Bgal y se selecciona como el segundo sustrato.

Opcionalmente, el 6-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido puede reemplazarse con 5-bromo-6-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido de manera que las colonias de Aeromonas y coliformes generales se muestran como verde azulada en lugar de rosa. Como se nota, el segundo sustrato seleccionado resultará en colonias de Aeromonas que también se muestran como un color generalmente rojo-rosa. Para evitar el crecimiento de las colonias de Aeromonas se agrega un inhibidor, preferiblemente ácido nalidíxico. Así, las colonias de E. coli se mostrarán como sustancialmente negras, mientras que las colonias de coliformes generales se mostraran como un color rojo-rosa. EJEMPLO XII Los microorganismos seleccionados para ser detectados cuantificados y diferenciados en este ejemplo son E. coli , coliformes generales y Aeromonas spp. como un color sustancialmente negro y Salmonella o Shigella spp. como un segundo color distintivo. El primer sustrato seleccionado es 8-hidroxiquinolina-ß- D-galactosido, lo cual resulta en colonias de E. coli , coliformes generales y Aeromonas que se muestran como sustancialmente negras. El segundo sustrato seleccionado puede ser 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-a- D-galactopiranosido o 6-cloro-3-indolil-a- D-galactopiranosido. Si se selecciona el anterior de estos dos sustratos, las colonias de Salmonella o Shigella se mostrarán como un color verde azulado, mientras que si se selecciona el último de los dos sustratos anteriores, las colonias de Salmonella o Shigella se mostrarán como un color rojo-rosa. Opcionalmente, en este ejemplo, puede eliminarse Aeromonas agregando un inhibidor, preferiblemente ácido nalidíxico, como se discutió en detalle anteriormente. EJEMPLO XIII Los microorganismos seleccionados para ser detectados, cuantificados y diferenciados en este ejemplo son los mismos que en el Ejemplo 1 excepto que este ejemplo ilustra una corrección para falsos positivos. Esto es, es posible que alguno Enterobacter y Klebsiella spp. inusuales se mostrarán como colonias negras junto con E. coli en el medio de prueba descrito en el Ejemplo 1. Así, la cuenta de E. coli podría ser incorrectamente alta. En este ejemplo, se agrega 4-metil-umbrelliferil-ß-D-xilopiranosido al medio de prueba descrito en el Ejemplo 1. Al hacerlo así, Enterobacter y Klebsiella spp. que se muestran como colonias negras también fluorescen, permitiendo con eso la reducción en la cuenta de falso positivo de E. coli . Este ejemplo ilustra la flexibilidad de las modalidades que incorporan la presente invención. El componente fluorescente no interfiere con el color sustancialmente negro de manera que las colonias negras se distinguen fácilmente a simple vista. Además, bajo luz ultravioleta, los falsos positivo pueden detectarse y reducirse sustancialmente examinando las colonias negras por fluorescencia. EJEMPLO XIV Los microorganismos seleccionados para ser detectados, cuantificados, diferenciados e identificados son E. coli como un color sustancialmente negro y Salmonella spp. como rosa-rojo. Los coliformes generales son incoloros en este ejemplo. Con referencia al Ejemplo 1, E. coli es sensible a 8-hidroxi-quinolina-ß- D-glucuronido. Los coliformes generales, Salmonella, Shigella y Aeromonas no son sensibles a 8-hidroxi-quinolina-ß- D-glucuronido. Así, el primer sustrato seleccionado es 8-hidroxi-quinolina-ß- D-glucuronido. Con referencia a la Tabla IV, la enzima esterasa es positiva para Salmonella spp. pero no en ninguno de los otros microorganismos preferidos para ser detectados. Con referencia a la Tabla V, el sustrato 6-cloro-3-indolil-caprilato puede identificarse, y producirá un color rosa-rojo durante el desdoblamiento, y se selecciona por lo tanto como el segundo sustrato. En este medio de prueba, las colonias de E. coli se mostrarán como sustancialmente negras y las colonias de Salmonella o Shigella se mostrarán como rosa-rojo.

EJEMPLO XV Los microorganismos seleccionados para ser detectados, cuantificados, diferenciados e identificados son E. coli como un color sustancialmente negro, Salmonella spp. como azul-púrpura obscuro, y coliformes generales como rosa-rojo. Con referencia al Ejemplo I, E. coli es sensible a 8-hidroxi-quinolina-ß- D^glucuronido. Los coliformes generales, Salmonella , Shigella y Aeromonas no son sensibles a 8-hidroxi-quinolina-ß- D-glucuronido. Así, el primer sustrato seleccionado es 8-hidroxi-quinolina-ß- D-glucuronido. Con referencia a las Tablas IV y V puede identificarse 5-bromo-4-cloro-3-indolil-caprilato como el segundo sustrato para el cual son sensibles Salmonella o Shigella con referencia adicional a la Tabla V, el 5-bromo-4-cloro-3-indolil-caprilato forma un color verde azulado durante el desdoblamiento. 6-cloro-3-indolil-a- D-galactopiranosido, que produce un color rosa-rojo durante el desdoblamiento, se selecciona como el tercer sustrato al cual son sensibles E. coli coliformes generales y Salmonella o Shigella . En este ejemplo, las colonias de E. coli se muestran como sustancialmente negras, las colonias de coliformes generales se muestran como rojo-rosa, y Salmonella/ Shigella se muestran como azul-violeta (= rojo-rosa + verde azulado) . EJEMPLO XVI Los microorganismos seleccionados para ser detectados, cuantificados y diferenciados en este ejemplo son E. coli como un color sustancialmente negro y los coliformes generales como un segundo color distintivo. Con referencia a la Tabla IV, E. coli produce la enzima Bgluc, y Bgluc no se produce por ninguno de los otros microorganismos deseados para ser detectados. Por lo tanto, un sustrato que produce un color distintivo durante el desdoblamiento de Bgluc debe seleccionarse de la Tabla V. 8-hidroxiquinolina-ß- D-glucuronido produce un color obscuro en la presencia de Bgluc y sería la selección preferida de sustrato. Una sal metálica tal como citrato de amonio férrico también se agrega para formar un complejo insoluble en agua negro que consiste de iones férricos y aglicona liberada cuando el sustrato se hidroliza por la glucuronidasa de E. coli . Con referencia adicional a la Tabla IV, Bgal, Bfud y Bglu son comunes para Aeromonas y coliformes generales. Sin embargo, como se indica en la Tabla IV, Bgal, Bfud y Bglu no se producen generalmente por Salmonella/ Shigella . Por lo tanto, puede seleccionarse un sustrato de la Tabla V que reacciona con una de Bgal, Bfud y Bglu para producir un segundo color distintivo. 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido puede seleccionarse como el segundo sustrato, en cuyo caso las colonias de E. coli aparecerán como sustancialmente negras y las colonias de coliformes generales como verde azulado. Opcionalmente, puede seleccionarse 5-bromo-6-cloro-3-indolil-galactopiranosido como el segundo sustrato, en cuyo caso las colonias de E. coli aparecerán como sustancialmente negras y las colonias de coliformes generales aparecerán como un color magenta. Para evitar el crecimiento de las colonias de Aeromonas se agrega un inhibidor, preferiblemente ácido nalidíxico. Así, las colonias de E. coli se mostrarán como sustancialmente negras, mientras que las colonias de los coliformes generales se mostrarán como un color magenta. Aunque se han descrito anteriormente diversos ejemplos amplios que incorpora la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita por los ejemplos descritos en la presente. En realidad, la descripción y ejemplos anteriores enseñan a alguien con experiencia común un número virtualmente ilimitado de medios de prueba que estaría dentro del alcance . de las reivindicaciones anexas al mismo. Adicionalmente, mientras que esta invención se ha descrito como teniendo un diseño preferido, la presente invención puede modificarse adicionalmente dentro del espíritu y alcance de esta descripción. Esta solicitud intenta por lo tanto cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la invención que usa los principios generales. Adicionalmente, esta solicitud intenta cubrir tales desviaciones de la presente descripción conforme entran dentro de la práctica conocida o acostumbrada en la técnica a la cual esta invención pertenece y que caen dentro de los límites de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un medio de prueba para detectar, identificar y calificar o cuantificar una primera, segunda y tercera entidades biológicas, caracterizado porque comprende el medio de prueba: un medio base de nutrientes que incluye iones de una sal; un primer y segundo sustratos cromogénicos; y un sustrato no cromogénico; en donde, el primer y segundo sustratos cromogénicos forman un precipitado en la presencia de la primera y segunda entidades biológicas, respectivamente, y el sustrato no cromogénico forma un precipitado en la presencia de la tercera entidad biológica y los iones de la sal; con lo cual, las agregaciones de la primera entidad biológica presente en el medio de prueba son de un primer color, las agregaciones de la segunda entidad biológica presentes en el medio de prueba son de un segundo color, y las agregaciones de la tercera entidad biológica presentes en el medio de prueba son sustancialmente negras. 2. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer sustrato cromogénico forma un precipitado del primer color en la presencia de una enzima de la tercera entidad biológica, pero el primer color no interfiere con el precipitado del sustrato no cromogénico, tal que las agregaciones de la tercera entidad biológica son sustancialmente negras. 3. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el segundo sustrato cromogénico forma un precipitado de un cuarto color en la presencia de una enzima de la tercera entidad biológica, pero el cuarto color no interfiere con el precipitado del sustrato no cromogénico, tal que las agregaciones de la tercera entidad biológica son sustancialmente negras. . El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer sustrato cromogénico, forma un precipitado del primer color en respuesta a la segunda entidad biológica, y con lo cual el segundo color es una combinación del primer color formado del primer sustrato cromogénico y un cuarto color formado del segundo sustrato cromogénico en respuesta a las enzimas de la segunda entidad biológica. 5. Un método para detectar, cuantificar, calificar y diferenciar bajo luz ambiental coliformes generales, E. coli , y al menos uno de los géneros Aeromonas y Salmonella en una muestra de prueba, el método está caracterizado porque comprende: proporcionar un medio base de nutrientes que incluye un primer, segundo y tercer sustrtratos, formando cada uno de los sustratos un componente en la presencia de al menos uno de coliformes generales, E. coli , Aeromonas y Salmonella; seleccionar los sustratos de tal manera que las colonias de E. coli producidas en el medio de prueba son de un primer color, las colonias de los coliformes generales producidos en el medio de prueba son de un segundo color, y las colonias de al menos una de Aeromonas y Salmonella producidas en el medio de prueba son de un tercer color, siendo cada uno de los colores distinguible; inocular el medio de prueba con la muestra de prueba; incubar el medio inoculado; y examinar el medio incubado por la presencia de las primeras colonias que tienen el primer color, las segundas colonias que tienen el segundo color y las terceras colonias que tienen el tercer color, siendo las primeras colonias E. coli , siendo las segundas colonias coliformes generales, y siendo las terceras colonias al menos una de Aeromonas y Salmonella . 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende adicionalmente agregar una sal al medio de prueba para reaccionar con el primer sustrato para producir un componente insoluble en agua sustancialmente negro en la presencia de las primeras colonias. 7. El método de conformidad con la reivindicación 5, comprende adicionalmente examinar el medio de prueba por la presencia de cuatro colonias que tienen un cuarto color, caracterizado porque el sustrato se selecciona de tal manera que las colonias de Aeromonas son el tercer color y las colonias de Salmonella son el cuarto color, siendo el cuarto color distinguible del primer, el segundo y el tercer colores. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque los sustratos se seleccionan de tal manera que el cuarto color es sustancialmente verde azulado-verde . 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque los sustratos se seleccionan de tal manera que el primer color es sustancialmente negro. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque los sustratos se seleccionan de tal manera que el segundo color es sustancialmente azul-violeta. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque los sustratos se seleccionan de tal manera que el tercer color es sustancialmente rojo-rosa. 12. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque los sustratos se seleccionan de tal manera que las colonias de Aeromonas son el tercer color. 13. Un medio de prueba para detectar, cuantificar y diferenciar coliformes generales, E. coli , y al menos uno de los géneros Aeromonas y Salmonella, el medio de prueba está caracterizado porque comprende: un medio base de nutrientes que incluye iones de una sal; un primer sustrato que forma un primer componente insoluble en agua de un primer color en la presencia de E. coli ; un segundo sustrato que forma un segundo componente de un segundo color en la presencia de coliformes generales; y un tercer sustrato que forma un tercer componente de un tercer color en la presencia de uno de los géneros Aeromonas, Salmonella y Shigella siendo el tercer color distinguible del primer y segundo colores; siendo todos los colores distinguibles, siendo el primer color sustancialmente negro. 14. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el primer sustrato se selecciona a partir del grupo que consiste de 8-hidroxiquinolina-ß-D-glucuronido, en esculetinglucuronido, y ciclohexenoesculetina-ß-D-glucuronido . 15. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el primer sustrato consiste esencialmente de un ß-glucuronido. 16. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el segundo sustrato comprende un a-galactosido y el tercer sustrato comprende un ß-galactosido. 17. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el primer sustrato consiste esencialmente de un ß- D-glucuronido que combina con los iones de la sal para formar un compuesto sustancialmente no difundible. 18. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el tercer sustrato también forma el tercer componente del tercer color en la presencia de coliformes generales, y en donde el segundo y tercer colores se combinan para formar un cuarto color en la presencia de coliformes generales. 19. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el tercer color se forma en la presencia de Aeromonas, y el segundo sustrato también forma el segundo componente del segundo color en la presencia de Salmonella, con lo cual E. coli se indica en el medio de prueba como el primer color, Salmonella se indica por el segundo color, Aeromonas se indica por el tercer color, y los coliformes generales se indican por el cuarto color. 20. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la sal comprende una sal metálica y el primer componente es un precipitado insoluble en agua y formado por reacción con los iones y una enzima de E. coli , con lo cual el primer color es sustancialmente negro. 21. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el primer sustrato comprende un ß-glucuronido, el segundo sustrato comprende un a-galactosido, y el tercer sustrato comprende un ß-galactosido. 22. El medio de prueba de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el primer sustrato consiste esencialmente de 8-hidroxiquinolina- ß- D-glucuronido, el segundo sustrato consiste esencialmente de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a- D-galactosido, y el tercer sustrato consiste esencialmente de 6-cloro-3-indolil-ß- D-galactosido. 23. Un medio de prueba para detectar, cuantificar, identificar y/o diferenciar las colonias de Aeromonas de otras entidades biológicas, el medio de prueba está caracterizado porque comprende: un medio base que incluye un sustrato de ß-D-galactosido que forma un primer componente de un primer color en la presencia de una primera enzima; y un sustrato de a-D-galactosido capaz de formar un segundo componente de un segundo color en la presencia de una segunda enzima, siendo el segundo color distinguible del primer color, con lo cual las agregaciones de colonias de Aeromonas se indican por el primer color, y las agregaciones de colonias de Salmonella se indican por el segundo color, y con lo cual las colonias de E. coli y coliformes generales se indican por un tercer color, siendo el tercer color una combinación del primer y segundo colores.