JP5118336B2 - 腸球菌検出用培地 - Google Patents

Description

本発明は、腸球菌及び薬剤耐性腸球菌の選択的検出用培地に関する。

腸球菌（Enterococcus）は、健常者の回腸や口腔、外陰部などからしばしば分離される常在性のグラム陽性球菌であり、病原性は弱いとされている。しかしながら、腸球菌の中には、術後の心内膜炎などの原因菌になるものもあり、またバンコマイシン耐性腸球菌などの薬剤耐性腸球菌は院内感染や鶏肉などの食品からの感染により、腹膜炎、術創感染症、肺炎、敗血症などを起こすことがある。従って、腸球菌及び薬剤耐性腸球菌を食品や環境試料から検出することは重要である。

腸球菌の検出培地としては、一般にＫＦ（Kenner Fecal）寒天培地やＡＣ（アザイド−クエン酸）ブイヨン培地が用いられている（非特許文献１）。これらは粉末の状態では、腸球菌の選択性の点から０．１％以上のアジ化ナトリウムを必要とするため、市販の培地ではアジ化ナトリウムを別に添加している。また、アジ化ナトリウムを含んでいる状態の粉末培地や簡易培地ではアジ化ナトリウムの総重量が０．１％以上になり毒性指定となるため、鍵付の保管庫で保管する必要がある（非特許文献２）。一方、生培地の状態ではアジ化ナトリウムは総重量の０．１％未満となるため、毒物指定にならないため、鍵付の保管庫は必要で無くなるが、使用期限が短く、かつ冷蔵にて保管しなければならない。また、バンコマイシン耐性腸球菌培地は存在するが生培地のため、使用期限が短く、かつ冷蔵保管が必要である。
新 細菌培地学講座−下II−＜第二版＞株式会社 近代出版 監修 坂崎利一 著者 田村一満・吉崎悦郎・三木寛二 1990年1月20日発行 毒物及び劇物取締法 別表第１第２８号 最終改正：平成18年4月21日政令第176号

従って、本発明の目的は、アジ化ナトリウムの含有量が０．１％未満であっても、正確に腸球菌を検出でき、かつ常温保存可能な腸球菌及び薬剤耐性腸球菌検出用培地を提供することにある。

そこで本発明者は、培地中のアジ化ナトリウム濃度が０．１％未満であっても選択性が良好で精度良く腸球菌及び薬剤耐性腸球菌を検出できる培地について種々検討したところ、アジ化ナトリウムを０．００１〜０．０９９重量％とし、一定量のアミノグリコシド系抗生物質及びβ−グルコシダーゼの基質となる色原体化合物を併用すれば腸球菌が精度良く検出できることを見出した。さらに、これにグリコペプチド系抗生物質を配合すれば、薬剤耐性腸球菌が精度良く検出できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、アジ化ナトリウムを０．００１〜０．０９９重量％、アミノグリコシド系抗生物質を使用時の濃度として０．０１〜１，０００mg／Ｌ、及びβ−グルコシダーゼの基質となる色原体化合物を含有する腸球菌検出用培地及び当該培地を用いた腸球菌の検出方法を提供するものである。
さらに本発明は、上記培地にさらにグリコペプチド系抗生物質を含有する薬剤耐性腸球菌検出用培地及び当該培地を用いた。薬剤耐性腸球菌の検出方法を提供するものである。

本発明の培地は、乾燥状態の培地であっても、アジ化ナトリウム含有量が少ないので毒性指定とならず、保管及び流通性が簡便であるとともに、腸球菌及び薬剤耐性腸球菌の検出精度が良好である。

本発明の培地には、腸球菌の選択剤としてのアジ化ナトリウムを０．００１〜０．０９９重量％（以下、単に％で示す）を含有する。アジ化ナトリウムが０．００１％未満では、腸球菌の選択性が十分でなく、０．１％以上では毒性指定となる。好ましいアジ化ナトリウムの含有量は腸球菌の選択性の点から、０．０１〜０．０９９％であり、より好ましくは０．０６〜０．０９７％である。ここでアジ化ナトリウムの濃度は、使用時でなく、培地自体中の濃度である。

本発明の培地には、アジ化ナトリウムとの併用による腸球菌の選択性の点から、アミノグリコシド系抗生物質を使用時の濃度として０．０１〜１，０００mg／Ｌを含有する。アミノグリコシド系抗生物質単独でも、アジ化ナトリウム０．１％未満単独でも腸球菌の選択性は十分ではないが、両者を併用することにより腸球菌の選択性が得られる。また、アミノグリコシド系抗生物質の含有量が０．００１mg／Ｌ未満では十分な選択性が得られず、１，０００mg／Ｌを超えると発育不良となる。好ましいアミノグリコシド系抗生物質含有量は０．０１〜１０mg／Ｌ、より好ましくは０．１〜１．０mg／Ｌである。本発明において、使用時の濃度とは、被検試料添加後の濃度である。例えば、培地が乾燥培地の場合、乾燥培地に被検試料液を添加した後の濃度である。

当該アミノグリコシド系抗生物質としては、硫酸ゲンタマイシン、硫酸ジベカシン、トブラマイシン、硫酸シソマイシン、硫酸ネチルマイシン、硫酸ミクロノマイシン、硫酸アミカシン、硫酸アストロマイシン、硫酸イセパマイシン等が挙げられるが、硫酸ゲンタマイシンが特に好ましい。

また、本発明培地には、腸球菌のみを特定の色の発色コロニーとして検出するためにβ−グルコシダーゼの基質となる色原体化合物を含有する。当該化合物としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、エスクリン等が挙げられる。これらの化合物の培地中の含有量は、腸球菌の検出性の点から使用時の濃度として０．０１〜１０ｇ／Ｌ、さらに０．０１〜０．６ｇ／Ｌ、特に０．１〜０．３ｇ／Ｌが好ましい。

さらに本発明培地に、グリコペプチド系抗生物質、例えばバンコマイシン、テイコプラニン等を配合すれば、院内感染で重要なＶＲＥ（バンコマイシン耐性腸球菌）をはじめとする種々の薬剤耐性腸球菌の検出培地とすることができる。これらのグリコペプチド系抗生物質のうち、バンコマイシンが特に好ましい。グリコペプチド系抗生物質の培地中の含有量は、薬剤耐性腸球菌の選択性の点から、使用時の濃度として１〜６４mg／Ｌ、さらに４〜３２mg／Ｌ、特に４〜８mg／Ｌが好ましい。

本発明の培地には、上記成分の他、栄養成分、無機塩、糖類、pH調整剤、グラム陰性菌抗生物質、グラム陽性菌抗生物質、その他の抗菌性物質等を配合することができる。

栄養成分としては、ペプトン、酵母エキス、獣肉エキス、魚肉エキス等が好ましい。無機塩類としては、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩；クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩等が挙げられる。糖類としては、単糖類及びオリゴ糖類が使用でき、例えばラクトース、シュークロース(白糖)、キシロース、セロビオース、マルトース等が挙げられる。グラム陰性菌抗生物質としては硫酸ポリミキシンＢ、コリスチン硫酸塩、アズトレオナム、カルモナム、ナリジクス酸が挙げられる。グラム陽性菌抗生物質としてはエリスロマイシン、クリンダマイシンが挙げられる。その他の抗生物質としてプロタミン硫酸塩、ポリリジン、グリシン、ソルビン酸が挙げられる。

本発明培地の形態は特に限定されず、通常の寒天培地の他、シート状簡易培地（（特開昭５７−５０２２００号）（特開平６−１８１７４１号）例えばメッシュを有する繊維状吸水シートに担持させた構造（特開平９−１９２８２号、特開２０００−３２５０７２））とすることもできる。

本発明培地を用いて、被検体中の腸球菌又は薬剤耐性腸球菌を検出するには、当該培地に検体を添加して３５±２℃、２４〜４８時間培養した後に、コロニーの着色を観察すればよい。

本発明培地に適用される検体としては、魚介類等の生鮮食料品、海水、調理場、病院などのふき取り検体等が挙げられるが、これらの検体を予めトリプトソーヤブイヨン培地で培養した培養液やさらにこれを増菌用培地で培養した培養液も用いることができる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１
（１）培地の作製
ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、リン酸水素二カリウム４ｇ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ、クエン酸鉄アンモニウム０．５ｇ、アジ化ナトリウム０．０４５ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド０．３ｇ、寒天１５ｇを１リットルの精製水に加え２０％炭酸ナトリウム水溶液にてpHを８．０に合わせた後、１００℃、２０分間加温溶解する。溶解後培地が冷めたことを確認し、ろ過滅菌したゲンタマイシン硫酸塩を０．０００９ｇ／Ｌになるように加え良く撹拌した後、プラスチックシャーレ（９０φmm）に２０mLずつ分注して培地が固まるまで静置し、本発明の腸球菌用培地を作製した。

（２）菌株の供試
供試菌株はトリプトソイブイヨン（ビブリオ属は３％食塩加トリプトソイブイヨン）で２４時間前培養したものを用い、これを生理食塩水で希釈し本発明の腸球菌用培地に接種した。

ミクロプランターを用いて各菌株を供試したところ、本発明培地上では腸球菌は青色の発色コロニーを形成し、その他の菌株は発育阻止されるか腸球菌とは異なる性状のコロニーを形成する。また、ゲンタマイシンを欠いた場合腸球菌以外の株が青色コロニーを形成する。

実施例２
本発明培地組成をメッシュを有する繊維状吸水シートに担持させた構造（特開２０００−３２５０７２）を利用した簡易培地に適用した場合のコロニーの性状及び発育菌数を測定した。

本発明腸球菌用培地組成は寒天のみならず簡易培地にも応用可能である。またアジ化ナトリウムは０．００１〜０．０９９％の範囲で含まなければ腸球菌以外において青色の発色が出てしまうことがわかる。

実施例３
本発明培地組成をメッシュを有する繊維状吸水シートに担持させた構造（特開２０００−３２５０７２）を利用した簡易培地に適用した場合のコロニーの性状を測定した。

腸球菌のみが発育に影響を与えることなく青色コロニーを形成した。

実施例４
本発明培地組成をメッシュを有する繊維状吸水シートに担持させた構造（特開２０００−３２５０７２）を利用した簡易培地に適用し、バンコマイシン添加の有無を比較した。

本発明腸球菌用培地にバンコマイシンなどの抗生物質を加えることにより、特定の抗生物質に対する耐性腸球菌用培地として適用できることを示している。

Claims (6)

1. アジ化ナトリウムを０．００１〜０．０９９重量％(使用時の濃度は、０．０４５ｇ／Ｌ)、硫酸ゲンタマイシンを使用時の濃度として０．０１〜１０mg／Ｌ、並びに、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド及び３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選ばれるβ−グルコシダーゼの基質となる色原体化合物の少なくとも１種を含有する腸球菌検出用乾燥培地（クリスタルバイオレットを０．１〜１．５mg／Ｌ含有する培地を除く。）。
2. さらに、グリコペプチド系抗生物質を含有し、薬剤耐性腸球菌検出用である請求項１記載の腸球菌検出用乾燥培地。
3. グリコペプチド系抗生物質が、バンコマイシンである請求項２記載の腸球菌検出用乾燥培地。
4. アジ化ナトリウムを０．００１〜０．０９９重量％(使用時の濃度は、０．０４５ｇ／Ｌ)、硫酸ゲンタマイシンを使用時の濃度として０．０１〜１０mg／Ｌ、並びに、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド及び３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選ばれるβ−グルコシダーゼの基質となる色原体化合物の少なくとも１種を含有する乾燥培地（クリスタルバイオレットを０．１〜１．５mg／Ｌ含有する培地を除く。）に被検試料を接種して培養することを特徴とする腸球菌の検出方法。
5. 乾燥培地がさらにグリコペプチド系抗生物質を含有するものであり、検出対象が薬剤耐性腸球菌である請求項４記載の検出方法。
6. グリコペプチド系抗生物質が、バンコマイシンである請求項５記載の検出方法。