KR101532845B1 - 미생물의 검출 및 계수 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생존 미생물을 함유할 것으로 의심되는 시료 중의 생존 미생물을 검출하고 계수하는 방법으로서, (1) 상기 시료의 생존 미생물을 회복 화합물 및 증식 배지와 접촉시키는 단계, (2) 단계 (1)의 생성물을 인큐베이션하는 단계, 및 (3) 상기 생존 미생물을 검출하고 정량하는 단계를 포함하고, 상기 미생물은 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 종이고, 상기 회복 화합물은 (a) 세린; (b) 트레오닌; (c) 10-6 내지 10-2 mM의 용량의 칼슘 이온을 포함하는 화합물; (d) 10-6 내지 10-2 mM의 용량의 마그네슘 이온을 포함하는 화합물; (e) 칼륨 이온을 포함하는 화합물; (f) 글루탐산 또는 이의 염; 및 (g) 피루브산 또는 이의 염을 포함하는 것인 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 레지오넬라 뉴모필라 종의 생존 미생물을 함유할 것으로 의심되는 시료 중의 상기 생존 미생물을 검출하고 계수하기 위한 키트를 개시한다.

Description

미생물의 검출 및 계수{DETECTION AND ENUMERATION OF MICROORGANISMS}
본 발명은 시료 중의 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 종의 생존 미생물(viable microorganism)을 검출하고 계수하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용하는 데 적합한 키트를 포함한다. 상기 방법 및 키트를 이용하면 생존 미생물을 더 신속하게 정량할 수 있다.
레지오넬라균은 흙과 비해양 수생 서식지와 같은 축축하고 습한 환경 어디에나 흔히 존재한다. 이 균은 또한 온수 및 냉수 설비, 공기 조절 시스템의 냉각탑 및 가습기에서도 발견할 수 있다.
레지오넬라, 특히 레지오넬라 뉴모필라는 종종 감염자에게 치사적일 수 있는 급성 세균성 폐렴(일반적으로 "레지오넬라병 또는 재향군인병(legionnaires disease)"으로 알려짐)을 유발할 수 있는 병원균이다.
전통적으로, 레지오넬라 뉴모필라의 검출 및 계수는 세포 배양에 의해 이루어진다. 이 방법은 배양 가능한 세균을 플레이트 카운트를 이용하여 측정하거나 필터 멤브레인법을 이용하여 마이크로 콜로니를 측정함으로써 수행될 수 있다. 이러한 기법들은 콜로니 또는 마이크로 콜로니를 형성할 수 있는 그 능력에 의해 생균의 수를 평가한다. 불행히도, 이러한 방법들에는 콜로니 또는 마이크로 콜로니가 형성될 수 있도록 하기 위해 통상 3 내지 10일이 소요된다. 수리 시설이 여전히 가동되어야 하는 경우, 이 기간 동안 허용할 수 없는 인체 감염의 위험이 있다.
전체 레지오넬라균을 검출하기 위한 다른 방법으로는 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 기법을 들 수 있다. PCR은 시험관내 효소 복제에 의해 DNA 단편을 증폭하기 위해 DNA 폴리머라제를 이용한다. 이 기법이 진행되는 동안, 생성된 DNA가 복제를 위한 주형으로서 사용되며, 이는 DNA 주형이 기하급수적으로 증폭되는 연쇄 반응을 유발한다. PCR을 이용하면, 1 카피 또는 몇 카피의 DNA 단편을, 수백만 카피 이상의 DNA 단편을 생성함으로써 증폭시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 문헌[Diederen et al., J Med Microbiol. 2007 Jan; 56 (Pt 1):94-101]에 기재되어 있다.
그러나, PCR의 단점은 시료가 중합 반응 억제제를 포함하는 경향이 있고 이로 인해 정량적인 결과를 일관되게 제공하지 못한다는 것이다. 게다가, 이 기법은 사전 DNA 정제 단계에 좌우되는데, 정제 단계에 의해 DNA가 유실될 수 있고, 그 결과 존재하는 레지오넬라가 과소평가될 수 있다. 이러한 단점들이 정량적인 리얼타임 PCR에 의해 어느 정도까지는 극복된다. 그러나, 이 기법은 생균과 비생균을 구별할 수 없다.
또 다른 기법은 형광 인시추 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridisation: FISH)이며, 이 기법에서는 형광 물질로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 세균 세포 내로 침투한다. 리보솜 핵산(rRNA)은 표적으로서 알려진 프로브에 대한 정확한 서열을 가지며, 프로브는 스스로 그 표적에 결합하고 임의의 후속 세척 단계에 의해 제거되지 않는다. 그 후, 프로브가 고정된 세균은 형광 신호를 방출한다. 그 후 이 형광 신호를 유세포분석, 고상 세포분석, 또는 에피형광 현미경법(epifluorescent microscopy) 등의 기법에 의해 정량할 수 있다. 전형적인 FISH 기법은 문헌[Dutil S et al., J Appl Microbiol. 2006 May;100(5):955-63]에 기재되어 있다. 그러나, FISH 기법만을 이용하면, 생 레지오넬라 뉴모필라의 총수를 검출할 수는 있으나, 불행히도 이 방법은 분열함으로써 그 결과 콜로니를 형성할 수 있는 레지오넬라 뉴모필라균만을 독점적으로 확인할 수는 없다.
생(viable) 레지오넬라 뉴모필라를 계수하는 다른 방법은 ChemChrome V6을 이용하는 것을 포함하며, 문헌[Delgado-Viscogliosi et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Jul;71(7):4086-96]에 기재되어 있다. 이 방법에 의하면 레지오넬라 뉴모필라를 정량할 수 있을 뿐만 아니라 생균과 비생균을 구별할 수 있다. 이 방법은 항체 및 세균 생존력 마커(ChemChrome V6)를 이용한 레지오넬라 세포의 특이적 검출과 계수를 위한 에피형광 현미경법을 병용한다. 그러나, 이 기법이 생균과 비생균을 구별한다 해도, 이 기법이 콜로니 형성 세균을 별도로 식별하지는 못한다.
US 20070218522는 생 레지오넬라 및 다른 종속영양 호기성 세균을 검출하고 정량하기 위한 방법 및 조성물을 개시하며, 이 방법은 레지오넬라의 신속한 검출과 정량을 위한 흡수성 배지, 성장 촉진 및 성장 선택성 물질을 포함하는 딥슬라이드를 사용하는 것을 포함한다. 이 기법은 손상된 세균은 계수하지 못한다.
EP 1329515는 과산화수소를 포함하는 기상 환경을 피루브산의 염을 포함하는 한천 증식 배지와 접촉시켜 미생물의 콜로니를 발달시킴으로써 과산화수소를 포함하는 기상 환경에서 미생물의 존재를 테스트하는 방법에 관한 것이다.
영양 한천 플레이트와 같은 증식 배지 상에서의 콜로니의 증식을 이용하는 기법은 일반적으로 더 정확한 것으로 간주된다. 따라서, 플레이트 계수법은 총 생균수를 얻기 위한 방법의 바람직한 선택으로 되어 있다. 이 방법은 일반적으로 미생물을 포함하는 것으로 의심되는 시료를 고체 영양원 또는 증식 배지를 포함하는 플레이트 상에 도말하는 것을 의미한다. 이러한 기법을 일반적으로 플레이팅(plating)이라 부른다. "총 생균수"란 관찰자가 식별할 수 있는 집단을 형성할 수 있는 세균의 총수를 의미한다. 일반적으로 이것은 영양 한천 플레이트와 같은 증식 배지의 표면 상의 볼 수 있는(가시적) 콜로니를 의미한다.
그러나, 환경에서의 레지오넬라 뉴모필라와 같은 미생물은 미생물이 그 환경의 상황에서 성장하여 증식하는 것을 막는 하나 이상의 스트레스에 노출될 수 있다. 그와 같이 스트레스를 받은 미생물은 보통의 배양 조건 하에 분열하지 못하거나 눈에 보이는 콜로니를 형성하지 못한다. 이 환경에서 미생물 세포 집단은 일반적으로 기아, 살생물제의 존재, 열충격 및 건조와 같은 환경 조건으로 인해 스트레스를 받는다. 게다가, 이러한 세포들은 취약한 생리학적 상태로 존재할 수 있으며, 이 상태에서는 미생물 플레이팅 기법이 대기중 산소의 존재의 인하여 이미 스트레스를 받은 미생물의 스트레스를 악화시킬 수 있다. 또한, 이로 인하여 스트레스를 받은 세균의 인위적 사멸이 초래되어 총 생균수가 과소평가되는 결과로 이어질 수 있다.
또한, 플레이팅법에 의한 생 레지오넬라 뉴모필라의 과소평가는 그 병원성으로 인하여 위험을 초래할 수 있다.
1970년대 이래로, 활성산소종(ROS)의 스캐빈저가 플레이팅 과정 중에 산화 스트레스의 영향을 제한하는 데 사용되어야 한다고 보고되고 있다. 이것은 문헌[Speck et al., repair and enumeration of injured coliforms by plating procedure, Appl Microbiol 29, 549-50 (1975)]; 문헌[Martin et al., Catalase: its effect on microbial enumeration. Appl Environ Microbiol 32, 731-4 (1976)]; 문헌[Brewer et al., Beneficial effects of catalase or pyruvate in most-probable-number technique for the detection of Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol 34, 797-800 (1977)]; 문헌[McDonald et al., Enhanced recovery of injured Escherichia coli by compounds that degrade hydrogen peroxide or block its formation. Appl Environ Microbiol 45, 360-5 (1983)]; 문헌[Marthi et al., Resuscitation effects of catalase on airborne bacteria. Appl Environ Microbiol 57, 2775-6 (1991)]; 문헌[Busch and Donnelly Development of repair-enrichment broth for resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes and Listeria innocua. Appl Environ Microbiol 58, 14-20 (1992)]; 및 문헌[Dukan et al., Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrested Escherichia coli cells. J Biol Chem 274, 26027-32 (1999)]에 의해 보고되었다.
그러나, 상기에 언급된 모든 경우에 있어서, 본 발명의 발명자들은 ROS가 화합물이 ROS와 화학적으로 반응하는 직접적인 경로에 의해 환원될 것이라고 생각한다.
문헌[Berube et al., "Rapid detection and identification of Legionella pneumophila by membrane immunoassay", Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55, 1640-1641]은 모노클로날 항체를 사용한 면역블롯 분석에 의해 레지오넬라 뉴모필라를 검출하고 확인하는 것에 관해 기재한다. 손상 세균의 문제를 다루기 위한 수단은 제공되어 있지 않다.
문헌[Pine et al., (Role of keto acids and reduced-oxygen-scavenging enzymes in the growth of Legionella species. J Clin Microbiol 23, 33-42 (1986))]은 케토산과 환원 산소 스캐빈징 효소를 첨가하는 것의 필요성은 레지오넬라 뉴모필라의 증식을 최적화하기 위한 것임을 기재하고 있고 이들 물질을 이 미생물의 표준 계수에 사용되는 배지 중에 사용하는 것을 제시하고 있다.
그러나, 케토산 및 환원 산소 스캐빈징 효소의 사용만으로는 회복시키고자 하는 스트레스를 받은 레지오넬라 뉴모필라를 회복시켜서 정확한 계수를 할 수 있도록 하기에 충분하지 않다. 이것은 특히 완충 차콜 효모 추출물(BCYE) 한천 배지와 같은 레지오넬라 뉴모필라를 위한 특정 증식 배지를 사용하는 경우에 그러하다. 실제로, 레지오넬라 뉴모필라의 정확한 계수에 유용한 표준 배지의 최적화에 관한 입수 가능한 데이터는 없다.
WO 2009 121726은 레지오넬라 뉴모필라 생균을 1종 이상의 회복 화합물 및 증식 배지와 접촉시킨 후 인큐베이션 단계와 생균 정량 단계를 거침으로써 시료 중의 레지오넬라 뉴모필라 생균을 검출하고 계수하는 방법을 개시한다. 상기 회복 화합물은 직접 또는 간접적으로 미생물의 대사에 영향을 주어 미생물의 산화 스트레스를 줄인다. 피루베이트 및 글리콜산을 포함하는 회복 화합물이 제시되어 있다. 이 방법은 종래의 방법보다 더 짧은 기간 내에 생 레지오넬라 뉴모필라를 더 정확히 계수하기 위한 우수한 수단을 제공한다.
그러나, 생 레지오넬라 뉴모필라를 더욱 더 정확하고 더욱 더 신속하게 계수하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이 바람직할 것이다. 또한, 이것을 더 넓은 스펙트럼의 레지오넬라 뉴모필라 균주에 대해 달성하는 것이 바람직할 것이다.
따라서, 본 발명에 따르면, 발명은 생존 미생물을 함유할 것으로 의심되는 시료 중의 생존 미생물을 검출하고 계수하는 방법으로서,
(1) 상기 시료의 생존 미생물을 회복 화합물 및 증식 배지와 접촉시키는 단계,
(2) 단계 (1)의 생성물을 인큐베이션하는 단계, 및
(3) 상기 생존 미생물을 검출하고 정량하는 단계
를 포함하고, 상기 미생물은 레지오넬라 뉴모필라 종이고, 상기 회복 화합물은
(a) 세린;
(b) 트레오닌;
(c) 10-6 내지 10-2 mM의 용량의 칼슘 이온을 포함하는 화합물;
(d) 10-6 내지 10-2 mM의 용량의 마그네슘 이온을 포함하는 화합물;
(e) 칼륨 이온을 포함하는 화합물;
(f) 글루탐산 또는 이의 염; 및
(g) 피루브산 또는 이의 염
을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명자들은 본 발명의 방법에서 상기 화합물들을 회복 화합물로서 함께 사용할 경우 레지오넬라 뉴모필라균의 잠복기가 현저히 줄어든다는 것을 발견하였다. 실제로, 본 발명자들은 이것이 더 넓은 스펙트럼의 레지오넬라 뉴모필라 균주에 대해 달성된다는 것을 발견하였다.
이론에 한정되는 것은 아니지만, 피루베이트, 글루타메이트 및 특정 농도의 칼슘 및 마그네슘 이온의 조합이 산화 스트레스를 직접 또는 간접적으로 제거하거나 줄이는 데 있어서 유익한 효과를 가져오는 것으로 생각되며, 칼륨 이온이 삼투압 충격을 감소시키는 한편 세린 및 트레오닌이 대사를 증진시키는 것으로 생각된다. 회복 화합물의 이러한 특별한 조합이 산화 스트레스를 제거하거나 줄이고 삼투압 충격을 감소시키고 대사를 증진하는 데 있어서 상승작용적 개선을 제공하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명에서는, 세린 또는 트레오닌의 바람직한 용량이 시료의 부피에 대하여 회복 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%일 수 있다. 바람직하게는, 이 용량이 일반적으로 0.05 내지 2.5%, 예를 들어 0.1 내지 2%, 대개 0.5 내지 1%의 범위이다. 글루탐산(또는 이의 염) 및/또는 피루브산(또는 이의 염)은 시료의 부피에 대하여 회복 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%의 바람직한 용량으로 사용된다. 바람직하게는, 이 용량은 대개 0.05 내지 2.5%, 예를 들어 0.1 내지 2%, 종종 0.5 내지 1%의 범위이다.
칼슘 이온, 마그네슘 이온 또는 칼륨 이온을 포함하는 화합물 각각은 임의의 적절한 염일 수 있다. 바람직하게는, 이것은 적어도 요구되는 용량을 제공하기에 충분하도록 수용성이어야 한다. 이 염은 임의의 적절한 반대이온을 가질 수 있다. 당업자라면 임의의 경우에 반대이온이 레지오넬라 뉴모필라와 같은 미생물에 대해 알려진 독소가 아니어야 한다는 것을 알 것이다. 일반적으로, 반대이온으로는 클로라이드, 설페이트, 니트레이트 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
상기에 언급한 바와 같이, 화합물이 칼슘 이온을 포함할 경우, 이것은 10-6 내지 10-2 mM의 용량으로 사용되어야 하며, 바람직하게는 이것은 10-5 내지 10-3 mM, 더 바람직하게는 5×10-4 내지 5×10-3 mM의 범위 내, 특히 약 10-4 mM이다. 상기에 언급한 바와 같이 마그네슘 이온을 포함하는 화합물의 경우, 그 용량이 10-6 내지 10-2 mM이어야 하며, 바람직하게는 이 용량은 10-5 내지 10-3 mM, 더 바람직하게는 5×10-4 내지 5×10-3mM의 범위 내, 특히 약 10-4mM이다.
칼륨 이온을 포함하는 회복 화합물은 바람직하게는 1 내지 10-4 mM, 예를 들어 10-1 내지 10-3 mM, 더 바람직하게는 5×10-1 내지 5×10-2 mM, 특히 약 10-2 mM일 수 있는 용량으로 사용되어야 한다.
회복 화합물은 함께 사용되며, 이는 이들 화합물이 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있음을 의미한다. "순차적으로"란 각각의 화합물을 실질적으로 잇달아 첨가하는 것을 의미한다. "동시에"란 2종 이상의 회복 화합물을 시료에 함께 첨가하는 것을 의미한다. 또한, 2종 이상의 회복 화합물을 제제로 통합함으로써 회복 화합물을 개별적으로 첨가하지 않아도 되게 하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명자들은 회복 화합물 피루베이트, 글루타메이트, 칼슘 함유 및 마그네슘 함유 화합물이 미생물의 산화 스트레스를 감소시키도록 미생물의 대사에 직접 또는 간접적으로 작용하는 것으로 생각한다. 본 발명자들은, 이러한 방식으로, 피루베이트, 글루타메이트, 칼슘 함유 및 마그네슘 함유 회복 화합물이 미생물에 내인적으로 작용하는 것으로 생각한다.
"산화 스트레스"란 ROS의 농도(내인적 생성 또는 외인적 내전)와 반응성 중간체를 용이하게 해독하거나 일어난 손상을 효율적으로 회복할 수 있는 미생물의 능력의 불균형을 의미한다. 미생물의 정상 대사 과정의 이러한 파괴는 자유 라디칼과 산화 물질, 예컨대 과산화수소의 형성으로 인한 독성 효과를 유발할 수 있으며, 이는 미생물 세포의 성분들, 예를 들어 DNA, 단백질 또는 지질에 대한 손상을 초래할 수 있다.
미생물의 대사에 영향을 유발하는 것은 미생물 세포 내의 자연적인 내부 화학적 과정에의 변화를 유발하는 것을 의미한다.
"내인적"이라고 하는 것은 산화 스트레스를 감소시키기 위해 미생물 세포 내에서 변화가 일어나는 것을 의미한다. 이것은 예를 들어 미생물 내의 대사 과정에의 변화일 수 있다. 이것은 또한 미생물 세포 내의 ROS의 제거를 포함할 수 있다.
또한, 피루베이트, 글루타메이트, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온이 ROS의 형성을 직접 또는 간접적으로 억제하고/하거나 ROS를 분해할 수 있는 것으로 생각된다. ROS에 대해 간접적 영향을 미치는 그러한 화합물은 미생물의 대사를 방해함으로써 그러한 작용을 할 수 있다. 회복 화합물의 이와 같은 조합은, 예를 들어 산소 호흡(호기성 호흡) 중에 ROS를 내인적으로 간접적으로 감소시키는 것으로 간주될 수 있다.
칼륨 화합물은 삼투압 충격을 감소시키는 데 도움을 준다. "삼투압 충격"이란 세포 주변 환경과 세포 내부 사이의 용질 농도의 불균형을 의미한다. 이러한 불균형은 세포막을 관통하는 물의 이동에 급격한 변화를 유발하여 세포 손상을 초래할 수 있다. 손상된 세포 또는 변형된 세포는 삼투압 스트레스에 훨씬 더 민감하여, 이러한 유형의 스트레스로 인해 생존력을 상실할 수 있다.
세린 및 트레오닌은 미생물 대사를 변경하는 것으로 생각된다. 이것은 세린 및 트레오닌이, 제한된 또는 감소된 대사를 갖는 세포에서 대사율 증진을 직접 또는 간접적으로 유도하는 것으로 생각되는 대사 경로에 관여한다는 것을 의미한다. 이러한 두 분자를 이용함으로써 세포는 향상된 성장을 나타낼 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 회복 화합물의 상기에 언급된 조합은 ROS를 감소 또는 제거하는 것과 삼투압 충격을 감소시키는 것과 대사를 개선시키는 것을 함께 상승작용적으로 개선시킨다. 이것은 특히 종래에 가능했던 것보다 더 넓은 스펙트럼의 레지오넬라 뉴모필라 균주에 유효하다.
본 발명자들은 본 발명이, 더 넓은 스펙트럼의 레지오넬라 뉴모필라 균주에 대해, 스트레스를 받은 레지오넬라 뉴모필라 세포의 회복을 유도하고 이로써 총 생균수를 더 정확히 제공한다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 또한, 본 발명의 방법이 소요되는 인큐베이션 시간의 길이를 추가로 단축시킨다는 것을 발견하였다. 일반적으로, 본 발명자들은 본 발명의 방법이 인큐베이션 시간을 수시간 단축시킬 수 있고 어떤 경우에는 적어도 1일 또는 2일 단축시킬 수 있다는 것을 알게 되었다.
놀랍게도, 본 발명자들은 또한 본 발명의 방법이 간섭 미생물, 즉 레지오넬라 뉴모필라가 아닌 미생물을 감소시킬 수 있다는 것을 알게 되었다.
적절하게는 스트레스를 받은 레지오넬라 뉴모필라 미생물 세포를 본 발명에 따른 회복 화합물의 조합과 접촉시키는 것을 포함하는 본 발명의 방법은 바람직하게는 ROS의 형성을 억제하고/하거나 ROS를 감소시키고/시키거나 ROS를 제거하고 삼투압 충격을 감소시키고 대사를 개선하며, 이것은 스트레스를 받은 세포의 회복을 유도하는 경향이 있다.
레지오넬라 뉴모필라 미생물을, 시료를 수집한 후 회복 화합물과 직접 접촉시킬 수 있다. 따라서, 이 미생물을 포함할 것으로 생각되는 시료수를 수집한 용기가 이미 회복 화합물을 포함하고 있어도 좋다. 대안으로, 레지오넬라 뉴모필라를 함유하는 시료수를 수집한 후, 이것을 분석 목적을 위해 회복 화합물을 함유하는 희석수로 희석할 수 있다. 또 다른 대안으로, 경우에 따라 희석시킨 시료를 회복 화합물을 함유하는 증식 배지와 접촉시키거나, 미생물을 증식 배지와 접촉시킨 후 회복 화합물을 적용할 수 있다. 시료가 수집되면, 본 발명에 따른 방법을 수행하기가 편리해질 때까지 이것을 저장하는 것이 바람직하다. 저장하는 동안 모든 회복 화합물을 통합하는 것이 바람직할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 함께 사용되는 모든 회복 화합물은 시료의 희석 단계 또는 저장 단계 동안 미생물과 접촉되어야 한다.
본 발명의 한 형태는 바람직하게는 시료를 상기 회복 화합물을 함유하는 회복 배지, 바람직하게는 비선택성 회복 배지와 접촉시키고, 그 후 이것을 증식 배지, 바람직하게는 선택성 증식 배지와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 회복 배지는 액체이고, 더 바람직하게는 브로쓰(broth)이다. 회복 배지가 액체일 경우, 이것을 액체 회복 방법이라 칭하는 것이 적절하다. 일반적으로 액체 회복 방법에서는 시료를 먼저 본 발명에 따른 조합을 함유하는 액체 배지에 도입한다. 이상적으로는, 액체 회복 방법은 스트레스를 받은 세균을 비선택성 액체 배지에서 회복할 수 있게 한다. 바람직하게는, 액체 회복 방법은 액체 배지로서 브로쓰를 이용한다. 일반적으로, 그 후, 레지오넬라 뉴모필라 미생물을 포함하는 액체 배지를 증식 배지로 옮긴다. 스트레스를 받은 미생물은 증식 배지로 옮겨지기 전에 회복되거나 증식 배지와 접촉한 후 회복된다. 더 바람직하게는, 증식 배지는 선택성 증식 배지이다. 일반적으로, 미생물을 포함하는 액체 배지를 선택성 한천 증식 배지 플레이트와 같은 선택성 증식 배지 플레이트에 플레이팅한다.
다른 바람직한 형태에서, 단계 (1)은 상기 시료를 상기 회복 화합물의 조합을 함유하는 증식 배지, 바람직하게는 비선택성 증식 배지와 접촉시키고, 그 후 이것을 역시 상기 회복 화합물을 함유하는 회복 배지와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 상기 회복 배지는 비선택성 회복 배지이고, 더 바람직하게는 고체이며, 특히 바람직하게는 선택성 한천 증식 배지이다. 회복 배지가 고체일 경우, 이것을 고체 회복 방법이라 칭한다. 일반적으로, 고체 회복 방법은 시료를 본 발명에 따른 회복 화합물의 조합을 함유하는 비선택성 증식 배지와 접촉시키는 것을 포함한다. 그 후, 이것을 회복 화합물 또는 회복 화합물의 조합을 함유하는 선택성 증식 배지와 접촉시킬 수 있다. 이러한 형태에서, ROS의 형성을 방지하거나 ROS를 감소시키거나 제거하는 선택성 성분들 및 화합물 또는 화합물들은 비선택성 배지로 확산된다. 바람직하게는, 비선택성 증식 배지는 비선택성 한천 증식 배지일 수 있다. 적절하게는, 이 형태에서, 시료를 임의의 비선택성 한천 상에 플레이팅하고, 그 후 ROS의 형성을 방지하거나 ROS를 감소시키거나 제거하는 화합물 또는 화합물들은 함유하는 선택성 한천 증식 배지를 비선택성 한천 증식 배지 상에 적층한다.
또 다른 대안의 형태에서, 시료를 회복 화합물의 조합을 이미 함유하고 있는 선택성 증식 배지에 가할 수 있다. 이러한 선택성 증식 배지는 선택성 한천 증식 배지일 수 있다. 시료의 플레이팅은 이미 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또 다른 대안의 형태에서, 시료를 에어로졸의 형태로 물로부터 수집할 수 있다. 일반적으로, 에어로졸은 냉각탑 도는 공기 조절 장치에서 형성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 따라 테스트하기 전에 에어로졸로부터 물을 응축시킨다. 대안의 바람직한 형태에서, 단계 (1)은 에어로졸로부터의 시료를 상기 회복 화합물의 조합을 함유하는 회복 배지, 바람직하게는 비선택성 회복 배지를 함유하는 희석수와 접촉시키고, 그 후 이것을 역시 상기 회복 화합물의 조합을 함유하는 증식 배지와 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 전술한 모든 형태에서, 증식 배지는 레지오넬라 뉴모필라의 증식에 적합해야 한다. 적합한 증식 배지 유형은 문헌에 보고되어 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 일반적으로, 증식 배지는 활성탄 및 시스테인을 함유해야 한다.
선택성 증식 배지는 선택성 한천 증식 배지인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 완충 차콜 효모 추출물(buffered charcoal yeast extract: BCYE) 한천 증식 배지이다. BCYE 증식 배지는 항생제 보충물의 첨가에 의해 선택성이 된다. 항생제를 함유하는 매우 바람직한 BCYE 증식 배지는 GVPC(글리신, 반코마이신, 폴리믹신 B, 사이클로헥시미드)로서 알려져 있다.
플레이팅법은 문헌에 보고되어 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다. 일반적으로, 이 방법은 페트리 디쉬에 놓여진 한천 겔 상에 다량의 시료수를 가하는 것을 포함한다. 이것을 페트리 디쉬법 또는 한천 플레이팅법이라 칭할 수 있다. 한천 플레이팅의 목적은 미생물을 함유할 것으로 의심되는 물(세균 현탁액이라 칭함)의 분액, 일반적으로 100 ㎕를 페트리 디쉬의 고체 배지 상에 스프레딩하는 것이다. 세균 현탁액을 한천 플레이트 상에 스프레딩하기 위해 유리 비드 또는 세포 스크레이퍼가 이용될 수 있다. 스프레딩 후, 액체의 대부분은 한천에 의해 흡수되고 세균을 갖는 얇은 막이 한천 표면 상에 남게 된다. 인큐베이션에 의해, 한천 표면 상에 콜로니 형태의 세균 증식이 발생한다. 인큐베이션은, 문헌에 잘 보고되어 있고 당업자에게 공지되어 있는, 미생물에 가장 적합한 온도에서 수행된다. 일반적으로, 이 온도는 30℃ 내지 50℃, 예를 들어 약 37℃이다.
회복 화합물의 조합은 미생물의 산화 스트레스를 감소시키는 데 효과적인 양으로 첨가되어야 한다. 바람직하게는, 이 양은 미생물 세포에서 ROS를 감소시키거나 실질적으로 제거하는 데 효과적인 양이다.
실제로, 본 발명자들은 회복 화합물의 조합을 이용할 경우, 특히 액체 배지에서, 레지오넬라 뉴모필라의 증식에서의 유도기(lag phase)가 유의적으로 단축된다는 것을 발견하였다. 액체 배지에서의 유도기의 이러한 단축은 한천 플레이트 상에서 가시적인 콜로니를 얻는 데 필요한 시간의 단축으로 이어진다.
또한, 회복 배지 및/또는 증식 배지와 함께 케토산 및/또는 환원 산소 스캐빈징 효소를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 케토산 및/또는 환원 산소 스캐빈징 효소는 본 발명에 따른 회복 화합물로 간주되지 않는다. 그러나, 이들 화합물 중 하나 또는 둘 다를 회복 화합물의 상기 조합 중 어느 하나와 함께 포함하는 것이 유익할 수 있다.
생존 미생물을 검출하고 정량하는 것은 문헌에 보고된 공지의 기법 중 어느 것을 이용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 이것은 영양 한천 플레이트와 같은 증식 배지의 표면 상의 가시적 콜로니를 계수하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 방법은 레지오넬라 뉴모필라의 존재에 대해 정확한 정량적인 측정을 용이하게 한다. 또한, 인큐베이션 시간이 현저히 단축될 수 있다. 이 방법은 공업용 냉각수, 음용수 및 자연수로 이루어진 군에서 선택되는 어느 것으로부터 얻은 시료 중의 레지오넬라 뉴모필라를 검출하는 데 적합하다.
본 발명은 또한 레지오넬라 뉴모필라 종의 생존 미생물을 함유할 것으로 의심되는 시료 중의 상기 생존 미생물을 더 정확하게 검출하고 계수하기 위한 키트로서,
(1) 회복 화합물,
(2) 증식 배지,
(3) 인큐베이션을 위한 수단,
(4) 미생물을 검출하고 정량하기 위한 수단
을 포함하고, 상기 미생물은 레지오넬라 뉴모필라 종이고, 상기 회복 화합물은
(a) 세린;
(b) 트레오닌;
(c) 칼슘 이온을 포함하는 화합물;
(d) 마그네슘 이온을 포함하는 화합물;
(e) 칼륨 이온을 포함하는 화합물;
(f) 글루탐산 또는 이의 염; 및
(g) 피루브산 또는 이의 염
을 포함하는 것인 키트를 포함한다.
상기 키트는 또한 본 발명의 제1 양태와 관련하여 설명한 실시형태 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 키트는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하고, 특히 더 넓은 스펙트럼의 레지오넬라 뉴모필라 균주와 관련하여, 레지오넬라 뉴모필라의 더 정확한 계수를 가능하게 한다.
이하에서는 실시예에 의해 본 발명을 예시한다.
실시예
화합물의 선택 및 그 최적 농도의 결정
상이한 화합물의 효과를 측정하기 위해, 2개의 기준을 비교한다: 보충된 배양 배지와 비보충 배양 배지를 사용하여 잠복기와 성장률을 관찰한다. 간단히 설명하면, 잠복기는 흡광도 0.1 내지 600 nm에 도달하는 데 필요한 시간으로 추정한다. 테스트된 모든 화합물에 대해, 잠복기 증가(gain of latency)(GT로 나타냄)는 참조 배지(YEC)에서 얻은 잠복기와 보충된 배지에서 얻은 잠복기 간의 차이로 구한다. 동일한 조건에서, 성장률 비(ratio of growth rate)(RVC로 나타냄)는 참조 배지에서 얻은 성장률과 보충된 배지(YEC + X)에서 얻은 성장률 간의 비로서 정의된다. 참조 배지(YEC)에서, 레지오넬라 뉴모필라 균주는 5 내지 15시간의 시간 지연(time lag)을 보이고, 0.1 내지 0.3의 흡광도(OD로 나타냄)에 도달하기 위해 약 10시간이 필요하다.
각각의 경우에 회복 화합물로서 세린 또는 트레오닌을 이용할 경우, 다양한 레지오넬라 뉴모필라 균주에 대해 잠복기 및/또는 성장률 개선이 관찰된다. 다양한 용량 범위에 대해서, 예를 들어 시료의 부피에 대해 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%의 범위에 대해서 개선이 관찰되며, 최적 용량은 약 1 g/L이다.
10-6 내지 10-2 mM, 특히 10-4 mM의 용량으로 염화칼슘 또는 염화마그네슘을 사용할 경우, 다수의 레지오넬라 뉴모필라 균주에 대해 잠복기 및/또는 성장률에 있어서의 개선이 관찰된다.
1 내지 10-4 mM, 특히 10-2 mM의 용량으로 염화칼륨을 이용할 경우, 다수의 레지오넬라 뉴모필라 균주에 대해 잠복기 및/또는 성장률에 있어서의 개선이 관찰된다.
특히 효과적인 회복 화합물 조합은 다음을 포함한다:
조합 A
1 g/L의 피루베이트, 1 g/L의 세린, 1 g/L의 트레오닌, 1 g/L의 글루탐산, 10-4 mM 염화칼슘, 10-4 mM 염화마그네슘.
조합 B
1.5 g/L의 피루베이트, 1.5 g/L의 세린, 1.5 g/L의 트레오닌, 1 g/L의 글루탐산, 10-4 mM 염화칼슘 및 10-4 mM 염화마그네슘.
조합 C
2 g/L의 피루베이트, 2.5 g/L의 세린, 1 g/L의 트레오닌, 1 g/L의 글루탐산, 10-4 mM 염화칼슘, 10-4 mM 염화마그네슘 및 1.16×10-2 mM 염화칼륨.
이러한 결과들은 몇 가지의 조합이 특히 상이한 균주를 함유하는 액체 배지에서의 증식에 유익하다는 것을 보여준다.

Claims (17)

  1. 생존 미생물을 함유할 것으로 의심되는 시료 중의 생존 미생물을 검출하고 계수하는 방법으로서,
    (1) 상기 시료의 생존 미생물을 회복 화합물 및 증식 배지와 접촉시키는 단계,
    (2) 단계 (1)의 생성물을 인큐베이션하는 단계, 및
    (3) 상기 생존 미생물을 검출하고 정량하는 단계
    를 포함하고, 상기 미생물은 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 종이고, 상기 회복 화합물은
    (a) 시료의 부피에 대하여 회복 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%의 양인 세린;
    (b) 시료의 부피에 대하여 회복 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%의 양인 트레오닌;
    (c) 10-6 내지 10-2 mM의 용량의 칼슘 이온을 포함하는 화합물;
    (d) 10-6 내지 10-2 mM의 용량의 마그네슘 이온을 포함하는 화합물;
    (f) 시료의 부피에 대하여 회복 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%의 양인 글루탐산 또는 이의 염; 및
    (g) 시료의 부피에 대하여 회복 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%의 양인 피루브산 또는 이의 염
    을 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 회복 화합물은 (e) 칼륨 이온을 포함하는 화합물을 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (1)이 상기 시료를 상기 회복 화합물을 함유하는 회복 배지와 접촉시키고, 그 후 이것을 증식 배지와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 회복 배지는 비선택성 회복 배지인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 증식 배지는 선택성 증식 배지인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 회복 배지가 액체인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 액체는 브로쓰인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단계 (1)이 상기 시료를 증식 배지와 접촉시키고, 그 후 이것을 상기 회복 화합물을 함유하는 회복 배지와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 증식 배지는 비선택성 증식 배지인 방법.
  10. 제3항, 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 회복 배지가 선택성 회복 배지인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 회복 배지는 고체인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 고체는 선택성 한천 증식 배지인 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)이 상기 시료를 상기 회복 화합물을 함유하는 증식 배지와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 증식 배지가 완충 차콜 효모 추출물(buffered charcoal yeast extract: BCYE) 또는 GVPC 한천 증식 배지인 방법.
  15. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 회복 배지 및 증식 배지 중 하나이상이 케토산 및 환원 산소 스캐빈징 효소 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  16. 레지오넬라 뉴모필라 종의 생존 미생물을 함유할 것으로 의심되는 시료 중의 상기 생존 미생물을 더 정확하게 검출하고 계수하기 위한 키트로서,
    (1) 회복 화합물,
    (2) 증식 배지,
    (3) 인큐베이션을 위한 수단,
    (4) 미생물을 검출하고 정량하기 위한 수단
    을 포함하고, 상기 미생물은 레지오넬라 뉴모필라 종이고, 상기 회복 화합물은
    (a) 시료의 부피에 대하여 회복 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%의 양인 세린;
    (b) 시료의 부피에 대하여 회복 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%의 양인 트레오닌;
    (c) 10-6 내지 10-2 mM의 용량의 칼슘 이온을 포함하는 화합물;
    (d) 10-6 내지 10-2 mM의 용량의 마그네슘 이온을 포함하는 화합물;
    (f) 시료의 부피에 대하여 회복 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%의 양인 글루탐산 또는 이의 염; 및
    (g) 시료의 부피에 대하여 회복 화합물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5%의 양인 피루브산 또는 이의 염
    을 포함하는 것인 키트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 회복 화합물은 (e) 칼륨 이온을 포함하는 화합물을 더 포함하는 것인 키트.
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