CN102971433A - 微生物的检测和计数 - Google Patents
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Abstract
用于检测并计数怀疑含有所述微生物的样品中的存活微生物的方法：(1)使所述样品的所述微生物与修复化合物和生长培养基接触，和(2)温育步骤(1)的产物，和(3)检测并计数所述存活微生物，其中所述微生物是嗜肺军团菌种，并且其中所述修复化合物包含(a)丝氨酸;(b)苏氨酸;(c)10-6到10-2mM剂量的含有钙离子的化合物;(d)10-6到10-2mM剂量的含有镁离子的化合物;(e)含有钾离子的化合物；(f)谷氨酸或其盐，和(g)丙酮酸或其盐。本发明还公开了用于检测并计数怀疑含有所述微生物的样品中的嗜肺军团菌种的存活微生物的试剂盒。
Description
本发明涉及检测并计数样品中嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）种的微生物的方法。本发明还包括适合于用于该方法的试剂盒。该方法和试剂盒能够更快速地定量存活微生物。
军团菌（Legionella）在湿润或潮湿环境，如土壤和非海洋水生环境中广泛存在。也可以在暖水和冷水设备、空调系统的冷却塔和水加湿器中发现它们。
军团菌，尤其是嗜肺军团菌是引起急性细菌性肺炎的病原菌，所述急性细菌性肺炎一般称为“军团病”，对被感染的个体经常是致命的。
通过细胞培养完成嗜肺军团菌的常规检测和计数。该方法可通过使用平板计数测定可培养的细菌或通过使用过滤膜方法测定小菌落来完成。这些技术通过存活细菌形成菌落或小菌落的能力来评估该存活细菌。不幸的是，此类方法一般需要3到10天来允许形成所述菌落或小菌落。虽然水设备仍然运行，但这段时间内具有感染人的不可接受的危险。
用于检测总的军团菌微生物的其他方法包括PCR（聚合酶链式反应）技术。PCR使用DNA聚合酶通过体外酶复制来扩增一段DNA。在该技术进行的过程中，所产生的DNA用作引起链式反应的复制模板，在所述链式反应中DNA模板成指数扩增。PCR使得能够通过产生数百万或更多拷贝的DNA片段来扩增单个或少数拷贝的DNA片段。通常，该方法由Diederen等,J Med Microbiol.2007 Jan;56(Pt 1):94-101描述。
然而，PCR的缺点是样品倾向于含有聚合反应抑制剂，因而不能始终如一地提供定量结果。此外，该技术依赖于先前的DNA纯化步骤，其可导致DNA损失，因此低估了所存在的军团菌。在一定程度上，可通过定量的实时PCR克服这些缺点。然而，该技术仍然不能区分存活细胞和非存活细胞。
另一技术是荧光原位杂交(FISH)，其中荧光物质标记的寡核苷酸探针渗透到细菌细胞内。其中核糖体核酸(rRNA)具有探针的正确序列，称为靶标，所述探针会将其自身附着到其靶标上并且不会被任何后续洗涤步骤去除。其中固定探针的细菌然后会发射荧光信号。然后通过技术，如流式细胞术、固相细胞计量术或epifluorescent显微镜技术来定量该荧光信号。Dutil S等J Appl Microbiol.2006 May;100(5):955-63描述了典型的FISH技术。然而，单独使用所述FISH技术，可检测存活嗜肺军团菌的总数，但不幸的是该方法不能专门鉴定仅那些能够分裂并因此产生菌落的嗜肺军团菌细菌。
用于计数存活嗜肺军团菌的其他方法包括ChemChrome V6并由Delgado-Viscogliosi等Appl Environ Microbiol.2005Jul;71(7):4086-96进行了描述。该方法允许定量嗜肺军团菌并区分存活细菌和非存活细菌。其组合了使用抗体和细菌存活标记(ChemChrome V6)特异性检测军团菌细胞与使用epifluorescent显微镜来计数。然而，尽管该技术可以区分存活细胞和非存活细胞，但不能够单独鉴定那些形成菌落的细菌。
US 20070218522描述了用于检测并定量存活军团菌和其他异养需氧菌的方法和组合物，所述方法包括使用dipslides，所述dipslides包括吸收培养基、促进生长和生长选择性物质，用于快速检测并定量军团菌小菌落。该技术不计数受损的细菌。
EP 1329515涉及通过使气体环境与包含丙酮酸盐的琼脂生长培养基接触并允许微生物菌落生长来检测包含过氧化氢的气体环境中微生物存在的方法。
一般认为涉及生长培养基（如营养琼脂平板）上的菌落生长的技术是更精确的。因此，平板计数方法仍然是用于获得总存活计数的方法的优选选择。这一般表示将怀疑含有微生物的样品应用到含固体营养源或生长培养基的平板上。该技术一般称作平板接种。总存活计数表示能够产生观察者可分辨的菌群的细菌总数。通常，这将表示在生长培养基（如营养琼脂平板）的表面上的可见菌落。
然而，环境中的微生物（如嗜肺军团菌）可能会遭受阻止微生物在其环境条件下生长并繁殖的一种或多种胁迫。此类受胁迫的微生物在正常培养条件下将根本不会分裂或形成可见菌落。在环境中，由于环境条件，如饥饿、存在杀生物剂、热激和干燥，通常一定比例的微生物细胞会受到胁迫。此外，这些细胞可处于易损生理状态下，其中由于存在大气氧气，平板接种微生物的技术可加重那些早已受胁迫的微生物细胞的胁迫。此外，这可导致受胁迫的细菌非天然死亡，导致低估总存活计数。
此外，利用平板接种方法低估存活嗜肺军团菌可能在其病原性方面变得有害。
自从20世纪70年代以来，已经报道了应该将活性氧类别(ROS)的清除剂用于限制平板接种方法过程中氧化胁迫的影响。Speck等,repair andenumeration of injured coliforms by a plating procedure,Appl Microbiol29,549-50(1975);Martin等Catalase:its effect on microbial enumeration.Appl Environ Microbiol 32,731-4(1976);Brewer等Beneficial effects ofcatalase or pyruvate in a most-probable-number technique for thedetection of Staphylococcus aureus.Appl Environ Microbiol 34,797-800(1977);McDonald等,Enhanced recovery of injured Escherichia coli bycompounds that degrade hydrogen peroxide or block its formation.ApplEnviron Microbiol 45,360-5(1983);Marthi等)Resuscitation effects ofcatalase on airborne bacteria.Appl Environ Microbiol 57,2775-6(1991);Busch and Donnelly Development of a repair-enrichment broth forresuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes and Listeria innocua.Appl Environ Microbiol 58,14-20(1992);和Dukan等,Oxidative stressdefense and deterioration of growth-arrested Escherichia coli cells.J BiolChem 274,26027-32(1999)报道了该方面。
然而，在所有上述情况中，本发明的发明人相信可通过其中化合物与ROS发生化学反应的直接途径来减少ROS。
Bérubé等,"Rapid detection and identification of Legionellapneumophila by membrane immunoassay",Applied and EnvironmentalMicrobiology,1989,55,1640-1641描述了使用单克隆抗体通过免疫印迹测定来检测与鉴定嗜肺军团菌。没有提供用于解决受损细菌的问题的方法。
Pine等(Role of keto acids and reduced-oxygen-scavenging enzymes inthe growth of Legionella species.J Clin Microbiol 23,33-42(1986))的文章描述了添加酮酸和还原氧清除酶的必要性是为了优化嗜肺军团菌的生长，并建议在用于标准计数该微生物的培养基中使用这些物质。
然而，酮酸和还原氧清除酶的单独使用不足以修复待修复的受胁迫嗜肺军团菌细胞并允许精确的计数。当使用用于嗜肺军团菌的特定生长培养基（如缓冲炭酵母浸膏(BCYE)琼脂培养基）时尤其如此。实际上，没有得到关于优化用于精确计数嗜肺军团菌的标准培养基的数据。
WO 2009 121726描述了通过使微生物与至少一种修复化合物和生长培养基接触，随后通过温育步骤，并检测和定量存活微生物来检测并计数样品中存活嗜肺军团菌的方法。所述修复化合物直接或间接引起对代谢的影响，以减少微生物的氧化胁迫。提示修复化合物包括丙酮酸盐和羟基乙酸。所述方法为在比先前方法更短的时间跨度内更精确计数存活嗜肺军团菌提供了极好手段。
然而，期望提供用于甚至更精确且甚至更快速计数存活嗜肺军团菌的改良方法。此外，还期望这在更广谱的嗜肺军团菌菌株上实现。
因此根据本发明，我们提供了用于检测并计数怀疑含有所述微生物的样品中的存活微生物的方法
(1)使所述样品的所述微生物与修复化合物和生长培养基接触，和
(2)温育步骤(1)的产物，和
(3)检测并定量所述存活微生物，其中所述微生物是嗜肺军团菌种，并且其中所述修复化合物包含
(a)丝氨酸;
(b)苏氨酸;
(c)10-6到10-2mM剂量的含有钙离子的化合物;
(d)10-6到10-2mM剂量的含有镁离子的化合物；
(e)含有钾离子的化合物；
(f)谷氨酸或其盐，和
(g)丙酮酸或其盐。
我们已经发现在本方法中结合使用这些化合物作为修复化合物显著缩短了嗜肺军团菌微生物的潜伏期。实际上，我们已经发现这在更广谱嗜肺军团菌菌株中实现。
不受理论限制，认为丙酮酸盐、谷氨酸盐和特定浓度的钙离子和镁离子的组合产生了直接或间接去除或减少氧化胁迫的有益作用，并且认为钾离子降低了渗透压休克，而丝氨酸和苏氨酸增强了代谢。相信修复化合物的这种特殊组合在去除或减少氧化胁迫、降低渗透压休克并增强代谢中提供了协同改善，由此实现了本发明的目标。
在本发明中，丝氨酸或苏氨酸的希望剂量基于样品体积中修复化合物的重量可以在0.01到5%之间。希望这一般会在0.05到2.5%的范围内，例如在0.1到2%，经常在0.5到1%的范围内。根据样品体积中修复化合物的重量，以0.01和5%的希望剂量使用谷氨酸（或其盐）和/或丙酮酸（或其盐）。希望这将经常介于0.05和2.5%之间，例如0.1和2%，经常在0.5和1%的范围内。
含钙离子、镁离子或钾离子的每一种化合物可以是任何合适的盐。期望它们是水溶性的，至少足以允许溶解所需剂量。所述盐可以具有任何合适的抗衡离子。技术人员在任何情况下均将意识到，对微生物例如嗜肺军团菌而言，抗衡离子不应该是已知的毒素。通常，所述抗衡离子将包括但不限于氯化物、硫酸盐、硝酸盐等。
如上所指，当所述化合物含有钙离子时，它应该以10-6到10-2mM的剂量使用，优选会在10-5到10-3mM的范围内，更优选5x10-4到5x10-3，尤其在10-4左右。如上所指，对于含镁离子的化合物，剂量应为10-6到10-2mM，优选会在10-5到10-3mM的范围内，更优选5x10-4到5x10-3mM，尤其在10-4mM左右。
期望含有钾离子的修复化合物应该以1到10-4mM，例如10-1到10-3mM，更优选5x10-1到5x10-2mM，尤其是10-2mM左右的剂量使用。
所述修复化合物结合使用，这表示它们可同时或顺序使用。顺序表示基本上一个接一个地加入每一种化合物。同时表示在同一时间向样品中加入两种或多种修复化合物。也期望将两种或多种修复化合物组合成制剂，并从而否定了修复化合物的单独添加。
我们相信，修复化合物丙酮酸盐、谷氨酸盐、所含钙和镁以降低微生物的氧化胁迫的方式直接或间接作用于微生物的代谢。这样，我们相信，丙酮酸盐、谷氨酸盐、含钙离子和镁离子的修复化合物内源性地作用于微生物。
氧化胁迫表示ROS（内源基因产生或外源基因内收）的浓度与微生物容易地解毒活性中间体或有效地修复所得损伤的能力之间的不平衡。对微生物正常代谢过程的这种破坏可引起毒性作用，这是由于自由基和氧化剂（如过氧化物）的形成可导致对微生物细胞的组分，例如DNA、蛋白质或脂类的损伤。
引起对微生物代谢的作用表示引起对微生物细胞内的自然固有化学过程的改变。
对内源性的参考表示改变在微生物细胞内发生以减少氧化胁迫。这例如可以是微生物内代谢过程的改变。其也可以包括去除微生物细胞内的ROS。
此外，相信丙酮酸盐、谷氨酸盐、钙离子和镁离子可直接或间接抑制ROS的形成和/或降解所述ROS。对ROS发挥间接作用的这种化合物可通过干扰微生物的代谢来完成该过程。认为修复化合物的这种组合例如可在有氧呼吸过程中间接内源性地减少ROS。
钾离子化合物帮助减少渗透压休克。渗透压休克表示细胞周围的环境和细胞内的环境之间溶质浓度的失衡。该失衡引起了水通过细胞膜移动的快速改变，并引起细胞损伤。受损的细胞或改变的细胞对渗透胁迫敏感得多并且由于该类型的胁迫会丧失活力。
相信丝氨酸和苏氨酸修饰微生物的代谢。这表示丝氨酸和苏氨酸参与代谢途径，认为所述代谢途径直接或间接诱导具有受限的或降低的代谢的细胞中增强的代谢速率。使用这两种分子，细胞能够显示改善的生长。
期望本发明修复化合物的前述组合协同地改善减少或去除ROS、减少渗透压休克和改善代谢的组合。相比于之前，这对更广谱的嗜肺军团菌菌株尤其如此。
我们已经发现本方法诱导修复受胁迫的嗜肺军团菌细胞穿过更广谱的嗜肺军团菌菌株，并因此更精确地提供总存活计数。意外的是，我们还发现本方法还减少所需温育时间的量。一般而言，我们发现所述方法可以减少温育时间数小时，并且在一些情况下至少一天或两天。
意外的是，我们还发现本发明方法可以引起干扰微生物（即除嗜肺军团菌以外的那些微生物）的减少。
适当地涉及使受胁迫的嗜肺军团菌微生物细胞与本发明的修复化合物组合接触的本发明方法令人希望的抑制ROS的形成和/或减少和/或去除ROS、减少渗透压休克并改善代谢，并且该方法倾向于诱导修复受胁迫的细胞。
收集样品后可直接使嗜肺军团菌微生物与修复化合物接触。因此，其中收集水样品（相信其含有微生物）的容器可能早已经包含了所述修复化合物。或者，一旦已经收集了含有嗜肺军团菌的水样品，则为了分析目的可以利用含修复化合物的稀释水将其稀释。在其他备选方案中，任选地已经被稀释的样品可以与含有修复化合物的生长培养基接触，或者可在将微生物与所述生长培养基接触后应用所述修复化合物。一旦已经收集了样品，可以期望将其进行储藏，直至可以方便地进行本发明的方法。期望在储藏过程中掺入所有的修复化合物。
优选地，用于本发明的结合的所有修复化合物应该在稀释步骤或样品储藏过程中与微生物接触。
期望本发明的一种形式涉及使所述样品与修复培养基，优选非选择性修复培养基（含有所述修复化合物）接触，然后使其与生长培养基，优选与选择性生长培养基接触。优选地，所述修复培养基是液体，并且更优选是培养液。当所述修复培养基是液体时，这适当地称为液体修复方法。通常在液体修复方法中，首先将样品引入含有本发明的组合的液体培养基中。理想情况是，所述液体修复方法允许受胁迫的细菌在非选择性液体培养基中进行修复。优选地，所述液体修复方法会使用培养液作为液体培养基。一般而言，然后会将含嗜肺军团菌微生物的液体培养基转移到生长培养基上。所述受胁迫的微生物在转移到生长培养基之前已经进行了修复或与生长培养基接触后进行修复。更优选地，所述生长培养基是选择性生长培养基。通常，会将含有微生物的液体培养基平板接种到选择性生长培养基平板上，如选择性琼脂生长培养基平板。
在备选的优选形式中，步骤（1）包括使所述样品与生长培养基，优选含有修复化合物的所述组合的非选择性生长培养基接触，然后使其与也含有所述修复化合物的修复培养基接触。优选地，所述修复培养基是非选择性修复培养基，更优选是固体，并特别优选选择性琼脂生长培养基。当所述修复培养基是固体时，这将被称为固体修复方法。通常，所述固体修复方法会涉及使样品与含有本发明的修复化合物组合的非选择性生长培养基接触。随后这可以与含有修复化合物或修复化合物组合的选择性生长培养基接触。在这种形式中，选择性成分和防止ROS形成、减少或去除ROS的一种或多种化合物会扩散到非选择性培养基中。期望所述非选择性生长培养基可以是非选择性琼脂生长培养基。适当地在这种形式中，可以将样品平铺到任何非选择性琼脂上，然后将含有防止ROS形成、减少或去除ROS的一种化合物或多种化合物的选择性琼脂生长培养基覆盖到所述非选择性琼脂生长培养基上。
在其他备选形式中，可将样品应用到早已含有修复化合物组合的选择性生长培养基中。该选择性生长培养基可以是选择性琼脂生长培养基。可如先前所述进行样品的平板培养。
在其他备选形式中，可从水中收集气溶胶形式的样品。通常，所述气溶胶定位在冷却塔或空调中。期望在根据本发明方法检测前从所述气溶胶中冷凝水。在备选优选形式中，步骤(1)包括使来自气溶胶的所述样品与含有修复培养基的稀释水，优选含有修复化合物的所述组合的非选择性修复培养基接触，然后使其与也含有修复化合物的所述组合的生长培养基接触。
在本发明的所有上述形式中，生长培养基应该适合于嗜肺军团菌的生长。在技术人员熟知的文献中记载了合适的生长培养基类型。通常，所述生长培养基应该含有活性碳和半胱氨酸。
优选选择性生长培养基是选择性琼脂生长培养基，并更优选是缓冲炭酵母浸膏(BCYE)琼脂生长培养基。BCYE生长培养基通过添加抗生素补充物会变得有选择性。含有抗生素的高度期望的BCYE生长培养基称为GVPC(甘氨酸、万古霉素、多粘菌素B、放线菌酮)。
在文献中记载了平板培养方法并为技术人员所熟知。通常，所述方法会涉及将一定量的这些水样品应用到已经置于培养皿中的琼脂凝胶上。这可称为培养皿方法或琼脂平板培养法。琼脂平板培养的目的是将等分试样（通常是怀疑含有微生物的100μl水，称为细菌悬浮液）涂布到培养皿中的固体培养基上。玻璃珠或细胞刮棒可用于将细菌悬浮液涂布到琼脂平板上。涂布后，大多数液体被琼脂吸收，具有细菌的薄层保留在琼脂表面上。通过温育，菌落形式的细菌生长在琼脂表面上发生。所述温育会在最适合于微生物的温度下发生，其在文献中得到了很好的记载并为技术人员所知。通常，所述温度会在30°C到50°C之间，例如在37°C左右。
以有效降低微生物的氧化胁迫的量加入修复化合物的组合。优选地，这会是有效减少或基本上去除微生物细胞中ROS的量。
实际上，我们已经发现使用修复化合物的组合引起了嗜肺军团菌特别在液体培养基中的生长过程中滞后期显著缩短。液体培养基中滞后期的这种缩短导致了在琼脂平板上获得存活菌落所需的时间减少。
也期望包括酮酸和/或还原氧清除酶与修复培养基和/或生长培养基。不认为酮酸和/或还原氧清除酶是本发明的修复化合物。然而，包括一种或两种这些化合物与修复化合物的任何上述组合是有益的。
可通过文献中记载的任何已知技术进行检测并定量存活微生物。通常，这表示计数生长培养基（如营养琼脂平板）表面上的存活菌落。
本发明的方法利于精确定量测定嗜肺军团菌的存在。此外，温育时间可以显著减少。所述方法适合于检测来自任何选自工业冷却水、饮用水和天然水的样品中的嗜肺军团菌。
本发明还包含用于更精确检测并计数怀疑含有所述微生物的样品中的嗜肺军团菌种的存活微生物的试剂盒，其包含
(1)修复化合物，
(2)生长培养基，
(3)温育手段，
(4)检测并定量微生物的手段，
其中所述微生物是嗜肺军团菌种，并且其中所述修复化合物包含
(a)丝氨酸;
(b)苏氨酸;
(c)含有钙离子的化合物;
(d)含有镁离子的化合物
(e)含有钾离子的化合物。
(f)谷氨酸或其盐，和
(g)丙酮酸或其盐。
试剂盒还含有本发明第一方面所述的任何实施方案。
试剂盒适合于本发明方法使用并能够更精确地计数嗜肺军团菌，尤其是更广谱的嗜肺军团菌菌株。
以下实施例阐明了本发明。
实施例
选择化合物并测定其最佳浓度
为了测定不同化合物的影响，比较2个标准：利用培养基和补充培养基未补充培养物观察潜伏期和生长速率。对了简化，通过获得600nm处0.1的光密度所必需的时间来评估潜伏期。对于所检测的所有化合物，通过在参照培养基(YEC)上获得的和补充培养基上获得的潜伏期之间的差异来获得潜伏期的增加（由GT表示）。在相同条件下，生长速率的比例（表示为RVC）定义为在参照培养基上获得的生长速率与在补充培养基(YEC+X)上获得的生长速率之间的比例。在参照培养基(YEC)中，嗜肺军团菌菌株具有5小时到15小时之间的时间滞后，并需要大约10小时来达到0.1到0.3的光密度（表示为OD）。
当在每一种情况下使用丝氨酸或苏氨酸作为修复化合物时，观察到了多种嗜肺军团菌菌株的潜伏期和/或生长速率的提高。基于化合物的重量对样品体积，在例如0.01到5%的剂量范围内观察到了提高，最佳剂量为每升大约1g。
当使用10-6到10-2mM，尤其是10-4mM剂量的氯化钙或氯化镁时，观察到了许多嗜肺军团菌菌株的潜伏期和/或生长速率的改善。
当使用1到10-4mM，尤其是大概10-2mM剂量的氯化钾时，观察到了许多嗜肺军团菌菌株的潜伏期和/或生长速率的改善。
修复化合物的特别有效的组合包括：
组合A
每升1g丙酮酸盐、每升1g丝氨酸、每升1g苏氨酸、每升1g谷氨酸、10-4mM氯化钙、10-4mM氯化镁。
组合B
每升1.5g丙酮酸盐、每升1.5g丝氨酸、每升1.5g苏氨酸、每升1g谷氨酸、10-4mM氯化钙和10-4mM氯化镁。
组合C
每升2g丙酮酸盐、每升2.5g丝氨酸、每升1g苏氨酸、每升1g谷氨酸、10-4mM氯化钙、10-4mM氯化镁和1.16x10-2mM氯化钾。
结果显示，几种组合尤其是对含有不同菌株的液体培养基中的生长有益。
Claims (9)
1.用于检测并计数怀疑含有存活微生物的样品中所述存活微生物的方法，包括
(1)使所述样品的所述微生物与修复化合物和生长培养基接触，和
(2)温育步骤(1)的产物，和
(3)检测并定量所述存活微生物，
其中所述微生物是嗜肺军团菌种，并且其中所述修复化合物包含
(a)丝氨酸;
(b)苏氨酸;
(c)10-6到10-2mM剂量的含有钙离子的化合物;
(d)10-6到10-2mM剂量的含有镁离子的化合物;
(e)含有钾离子的化合物。
(f)谷氨酸或其盐，和
(g)丙酮酸或其盐。
2.前述权利要求任一项的方法，其中步骤(1)包括使所述样品与含有所述修复化合物的修复培养基，优选非选择性修复培养基接触，然后使其与生长培养基，优选选择性生长培养基接触。
3.权利要求2的方法，其中所述修复培养基是液体，优选是培养液。
4.前述权利要求任一项的方法，其中步骤(1)包括使所述样品与生长培养基，优选非选择性生长培养基接触，然后使其与含有所述修复化合物的修复培养基接触。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述修复培养基是选择性修复培养基，优选固体，更优选选择性琼脂生长培养基。
6.前述权利要求任一项的方法，其中步骤(1)包括使所述样品与含有所述修复化合物的生长培养基接触。
7.前述权利要求任一项的方法，其中所述生长培养基是缓冲炭酵母浸膏(BCYE)或GVPC琼脂生长培养基。
8.前述权利要求任一项的方法，其中所述修复培养基和/或生长培养基包括酮酸和/或还原氧清除酶。
9.用于更精确检测并计数怀疑含有嗜肺军团菌种的存活微生物的样品中所述存活微生物的试剂盒，其包含
(1)修复化合物，
(2)生长培养基，
(3)温育手段，
(4)检测并定量所述微生物的手段，
其中所述微生物是嗜肺军团菌种，并且其中所述修复化合物包含
(a)丝氨酸;
(b)苏氨酸;
(c)含有钙离子的化合物；
(d)含有镁离子的化合物；
(e)含有钾离子的化合物；
(f)谷氨酸或其盐，和
(g)丙酮酸或其盐。
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