JP5717846B2

JP5717846B2 - 微生物の検出及び定量化

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Publication number: JP5717846B2
Application number: JP2013513032A
Authority: JP
Inventors: フォヴェヤニック; デュクレアドリアン; デュカサム; ペリアムマリナ
Original assignee: BASF SE; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: BASF SE; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2010-06-03
Filing date: 2011-06-01
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2031-06-01
Also published as: EP2576810B1; AU2011262289A1; EP2576810A1; JP2013526879A; CN102971433A; ZA201209731B; UA105296C2; RU2012157541A; SG185699A1; DK2576810T3; WO2011151793A1; HUE034961T2; RS56572B1; AU2011262289B2; KR20130030800A; MX2012013804A; CA2799628A1; KR101532845B1; MY160455A; MX336093B

Description

本発明は、試料においてレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）の種の生存微生物を検出及び計測するための方法に関する。本発明は、かかる方法における使用に好適なキットも含む。この方法及びキットは、生存微生物をより迅速に定量することを可能にする。

レジオネラ細菌は、湿ったか又は湿分のある環境、例えば土壌及び非海洋性水生居住環境において汎存性である。レジオネラ細菌はまた、温水及び冷水設備、エアーコンディショニングシステムの冷却塔及び水加湿器においても見出されることができる。

レジオネラ、特にレジオネラ・ニューモフィラは、急性細菌肺炎を生じる可能性のある病原菌であり、一般には、感染した個人にとってしばしば致命的である「レジオネラ病」として知られている。

従来は、レジオネラ・ニューモフィラの検出及び計測は、細胞培養により達成されている。この方法は、プレートカウントを用いて培養可能細菌の測定又はフィルターメンブラン法を利用してマイクロコロニーの測定により達成されてよい。これら技術は、生存細菌を、コロニー又はマイクロコロニーを形成するためのその能力により評価する。残念ながら、かかる方法は、通常は、コロニー又はマイクロコロニーを形成させるのに、３〜１０日間必要とする。水設備がなお作動中である場合には、この間にヒト感染の許容できない危険性が存在する。

全レジオネラ微生物を検出するための他の方法は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）技術を含む。ＰＣＲは、ｉｎｖｉｔｒｏ酵素複製によるＤＮＡ片の増幅のためにＤＮＡポリメラーゼを利用する。この技術の進行の間に、作成したＤＮＡを、ＤＮＡテンプレートが対数的に増幅する連鎖反応を生じる増幅のためのテンプレートとして使用する。ＰＣＲは、単一又はいくつかのコピーＤＮＡ片が、数百万以上のコピーのＤＮＡ片の作成により増幅されることを可能にする。典型的には、かかる方法は、Diederen et al., J Med Microbiol. 2007 Jan; 56 (Pt 1 ):94-101により説明されている。

しかし、ＰＣＲの欠点は、試料が重合反応抑制剤を含む傾向があり、そのため、定量的な結果を一貫して提供しないことである。さらに、この技術は、レジオネラ存在の結果的な過小評価を伴うＤＮＡ損失を生じうる、先行するＤＮＡ精製工程に依存する。ある程度、これら不利な点は、定量的であるリアルタイムＰＣＲにより克服される。しかし、この技術は、生細胞と非生細胞を区別できない。

別の技術は、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）であり、この場合には、蛍光物質によりラベル化されたオリゴヌクレオチドプローブが細菌細胞中に侵入する。リボソーム核酸（ｒＲＮＡ）が、標的として知られているプローブに対し正確な配列を有する場合には、プローブはそれ自体がその標的に付着して、後続のいかなる洗浄工程によっても除去されることはない。プローブが固定している細菌は、次に、蛍光シグナルを放出する。この蛍光シグナルは、次いで、フローサイトメトリー、固相サイトメトリー又は落射蛍光顕微鏡といった技術により定量されてよい。典型的なＦＩＳＨ技術は、Dutil S et alによりJ Appl Microbiol. 2006 May;100(5):955-63で説明されている。しかし、ＦＩＳＨ技術のみを用いると、生存レジオネラ・ニューモフィラの全数は検出できるが、しかし、残念ながら、この方法は、分裂でき、そして結果としてコロニーを作ることができるレジオネラ・ニューモフィラ細菌のみを排他的に同定することはできない。

生存レジオネラ・ニューモフィラの計測のための更なる方法は、Chem-Chrome V6を伴い、かつ、Delgado-Viscogliosi et al Appl Environ Microbiol. 2005 Jul;71 (7):4086-96により説明されている。この方法は、レジオネラ・ニューモフィラの定量化と、生存細菌及び非生存細菌の間の差別化を可能にする。これは、抗体及び細菌生存性マーカー（Chem-Chrome V6）を用いるレジオネラ細胞の特異的検出と計測のための落射蛍光顕微鏡の使用を組み合わせる。しかし、この技術は、生存細胞と非生存細胞を区別するものの、コロニー形成細菌を別個に同定することは可能でない。

ＵＳ２００７０２１８５２２は、生存レジオネラ及び他の従属栄養性の好気性細菌の検出及び定量のための方法及び組成物を説明し、そして、この方法はレジオネラのマイクロコロニーの迅速検出及び定量のために、吸収媒体、成長促進物質及び成長選択物質を含むdipslideの使用を含む。この技術は、損傷した細菌を計測しない。

ＥＰ１３２９５１５は、ピルビン酸の塩を含み、微生物のコロニーの発達を可能にする寒天成長媒体を、ガス環境に接触させることによって、過酸化水素を含むガス環境における微生物の存在についての試験方法に関する。

成長媒体上のコロニー成長を伴う技術、例えば栄養寒天プレートは、一般により正確であると考えられる。したがって、このプレートカウント法は、全生存カウントを獲得するための方法の好ましい選択肢のままである。このことは一般に、微生物を含むと疑われている試料を、固形栄養源又は成長媒体を含むプレート上に適用することを意味する。かかる技術は、一般にプレーティングと称される。全生存カウントとは、観察者により認識可能な集団を生じることができる細菌の全数を我々は意味する。典型的には、このことは、成長媒体、例えば栄養寒天プレートの表面上の可視コロニーを意味する。

しかし、環境中の微生物、例えばレジオネラ・ニューモフィラは、その環境状況においてこの微生物が成長し増殖することを妨げる１以上のストレスに曝露されてよい。かかるストレスを受けた微生物は、正常な培養条件下で全く分裂しないか又は可視コロニーを形成しない。この環境において、一部の微生物細胞は、環境状況、例えば飢餓、殺生物剤の存在、ヒートショック及び脱水のために一般にストレスを受けている。さらに、これら細胞は攻撃されやすい生理学的状態にあってよく、その状態では、微生物のプレーティング技術は、雰囲気酸素の存在のために、既にストレスを受けた微生物細胞のストレス化を悪化させてよい。さらに、このことは、このストレスを受けた細菌の人工的な死を導き、全生存カウントの過小評価を導く可能性がある。

加えて、プレーティング法での生存レジオネラ・ニューモフィラの過小評価は、その病原性に関して有害になる可能性がある。

１９７０年代から、活性酸素種（ＲＯＳ）のスカベンジャーが、プレーティングプロセスの間の酸化的ストレスの作用を制限するために使用されるべきであると報告されている。このことは、Speck et al, repair and enumeration of injured coliforms by a plating procedure, Appl Microbiol 29, 549-50 (1975); Martin et al Catalase: its effect on microbial enumeration. Appl Environ Microbiol 32, 731 -4 (1976); Brewer et al Beneficial effects of catalase or pyruvate in a most-probable-number technique for the detection of Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol 34, 797-800 (1977); McDonald et al, Enhanced recovery of injured Escherichia coli by compounds that degrade hydrogen peroxide or block its formation. Appl Environ Microbiol 45, 360-5 (1983); Marthi et al) Resuscitation effects of catalase on airborne bacteria. AppI Environ Microbiol 57, 2775-6 (1991 ); Busch and Donnelly Development of a repair-enrichment broth for resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes and Listeria innocua. Appl Environ Micro-biol 58, 14-20 (1992);及びDukan et al, Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrested Escherichia coli cells. J Biol Chem 274, 26027-32 (1999)により報告されている。

しかし、前述の全ての場合に、本発明の発明者は、ＲＯＳは、化合物が化学的にＲＯＳと反応する直接的経路により減少されると信じている。

Berube et al, "Rapid detection and identification of Legionella pneumophila by membrane immunoassay", Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55, 1640-1641は、モノクローナル抗体を用いたイムノブロットアッセイによるレジオネラ・ニューモフィラの検出及び同定を説明している。損傷した細菌の問題に対処するための手段は与えられていない。

Pine et alによる文献（Role of keto acids and reduced-oxygen-scavenging enzymes in the growth of Legionella species. J Clin Microbiol 23, 33-42 (1986)）は、ケト酸及び還元した酸素捕捉酵素の添加が、レジオネラ・ニューモフィラの成長を最適化するために必要であると説明し、そして、この微生物の標準的計測のために使用される媒体においてこれら材料を用いることを提案した。

しかし、ケト酸及び還元した酸素捕捉酵素の使用は、単独では、このストレスを受けたレジオネラ・ニューモフィラ細胞を修復しかつ正確な計測を可能にするように修復するには不十分である。このことは、レジオネラ・ニューモフィラのために特定の成長媒体、例えば緩衝化した炭酵母抽出物（ＢＣＹＥ）寒天媒体を使用する場合に、特に当てはまる。事実、レジオネラ・ニューモフィラの正確な計測のために有用な標準的な媒体の最適化に関するデータは入手可能でない。

ＷＯ２００９１２１７２６は、試料中の生存レジオネラ・ニューモフィラ微生物を、この微生物を少なくとも１の修復化合物及び成長媒体と接触させ、その後、インキュベーション及び生存微生物の検出及び定量化の工程が続くことにより、検出及び計測する方法を説明する。この修復化合物は直接的に又は間接的に、この微生物の酸化的ストレスを減少させるべく代謝に影響を生じる。ピルビン酸及びグリコール酸を含む修復化合物が提案されている。この方法は、従来法よりもより短期間で生存レジオネラ・ニューモフィラをより正確に計測するための優れた手段を提供する。

しかし、生存レジオネラ・ニューモフィラをよりいっそう正確にかつよりいっそう迅速に計測するための改善された方法を提供することが望ましい。さらに、このことをレジオネラ・ニューモフィラ株のより広いスペクトルにわたり達成することも望ましいものである。

こうして、本発明に応じて、我々は、生存微生物を、この微生物を含むと疑われている試料において検出及び計測するための方法であって、
（１）前記試料の前記微生物を修復化合物及び成長培地と接触させる工程、及び
（２）工程（１）の生成物をインキュベーションする工程、及び
（３）前記生存微生物を検出及び定量化する工程
を含み、その際、前記微生物がレジオネラ・ニューモフィラの種であり、前記修復化合物が、
（ａ）セリン、
（ｂ）トレオニン、
（ｃ）用量１０^-6〜１０^-2ｍＭでカルシウムイオンを含む化合物、
（ｄ）用量１０^-6〜１０^-2ｍＭでマグネシウムイオンを含む化合物、
（ｅ）カリウムイオンを含む化合物、
（ｆ）グルタミン酸又はその塩、
及び、
（ｇ）ピルビン酸又はその塩
を含む方法を提供する。

我々は、本方法において修復化合物として一緒に用いられるこれら化合物の使用が著しく、レジオネラ・ニューモフィラ微生物の潜在期間を著しく減少させたことを見出した。事実、我々は、このことがレジオネラ・ニューモフィラ株のより広いスペクトルにわたり達成されることを見出した。

理論に捕らわれることなく、ピルバート、グルタマート及び特定の濃度のカルシウム及びマグネシウムイオンの組み合わせが、直接的に又は間接的に酸化的ストレスの除去又は減少に有用な作用をもたらすと信じられており、そして、セリン及びトレオニンがこの代謝を促進する一方で、カリウムイオンが浸透ショックを減少させると考えられている。修復化合物のこの特殊な組み合わせが、酸化的ストレスの除去又は減少、浸透ショックの低下及び代謝の促進において相乗的な改善を提供し、これによって、本発明の課題を達成すると信じられている。

本発明では、セリン又はトレオニンの所望の用量は、試料の体積に対する修復化合物の質量に対し０．０１〜５％であってよい。望ましくは、これは通常は０．０５〜２．５％、例えば０．１〜２％、しばしば０．５〜１％の範囲である。グルタミン酸（又はその塩）及び／又はピルビン酸（又はその塩）は、試料の体積に対する修復化合物の質量に対し０．０１〜５％の所望の用量で使用される。望ましくは、これはしばしば０．０５〜２．５％、例えば０．１〜２％、しばしば０．５〜１％の範囲にある。

カルシウムイオン、マグネシウムイオン又はカリウムイオンを含む各化合物は、任意の好適な塩であってよい。望ましくは、これらは、所望の用量を可能にするため少なくとも十分に、水溶性でなければならない。塩は、任意の好適な対イオンを有してよい。当業者はいかなる場合にも、この対イオンが微生物、例えばレジオネラ・ニューモフィラにとって既知の毒素であってはならないことを理解するものである。典型的には、この対イオンは、塩化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオンその他を含むものであるが、これらに限定されない。

上で示したとおり、この化合物がカルシウムイオンを含む場合には、これは１０^-6〜１０^-2ｍＭの用量で使用されるべきであり、好ましくは１０^-5〜１０^-3ｍＭ、より好ましくは５×１０^-4５×１０^-3ｍＭの範囲内、特に約１０^-4ｍＭである。上で示したとおりマグネシウムイオンを含む化合物に関して、この用量は、１０^-6〜１０^-2ｍＭであることが望ましく、好ましくは１０^-5〜１０^-3ｍＭ、より好ましくは５×１０^-4〜５×１０^-3ｍＭの範囲内、特に約１０^-4ｍＭである。

カリウムイオンを含む修復化合物は、望ましくは、１〜１０^-4ｍＭ、例えば１０^-1〜１０^-3ｍＭ、より好ましくは５×１０^-1〜５×１０^-2ｍＭ、特に約１０^-2ｍＭであってよい用量で使用されるべきである。

修復化合物は一緒に使用され、このことは、これらが同時に又は逐次に使用されてよいことを意味する。逐次にとは、実質的に次々に各化合物を添加することを我々は意味する。同時にとは、２以上の修復化合物を前記試料に同じ時に添加することを我々は意味する。２以上の修復化合物を１の調合物へと組み合わせ、これによって、修復化合物の別個の添加をなくすことが所望されてもよい。

我々は、修復化合物ピルバート、グルタマート、カルシウム及びマグネシウム含有物が、微生物の酸化的ストレスを減少させるように、直接的又は間接的に微生物の代謝に作用すると信じている。このようにして、我々は、ピルバート、グルタマート、カルシウム及びマグネシウム含有修復化合物が、内因的に微生物に作用すると信じている。

酸化的ストレスとは、ＲＯＳ濃度（内因的生産又は外来的付加）と、反応性中間体を容易に解毒するか又は生じるダメージを効率的に修復する微生物の能力の間の不均衡を我々は意味する。

微生物の正常な代謝プロセスのかかる崩壊は、フリーラジカル及び酸化剤、例えば過酸化物の形成のために、毒性作用を生じる可能性があり、これは、微生物細胞の成分、例えばＤＮＡ、タンパク質又は脂質にダメージを導く可能性がある。

微生物の代謝に作用を引き起こすとは、微生物細胞内に天然の内部化学プロセスに変化をもたらすことを意味する。

内因的を参照すると、酸化的ストレスを減少させるために微生物細胞内に変化がもたらされることを意味する。このことは、例えば、微生物内の代謝プロセスに対する変化であってよい。これは、微生物細胞内のＲＯＳの除去も含んでよい。

さらに、ピルバート、グルタマート、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンは、直接的又は間接的に、ＲＯＳの形成の抑制及び／又はＲＯＳの分解をしてよいと信じられている。ＲＯＳに対して間接的な作用を発揮するかかる化合物は、微生物の代謝に干渉することによりこれをしてよい。修復化合物のかかる組み合わせは、例えば好気呼吸の間に、内在性ＲＯＳを間接的に減少させると考えられてよい。

カリウム化合物は、浸透ショックを減少させるのに役立つ。浸透ショックとは、細胞を取り囲む環境と細胞内の間の溶質濃度の不均衡を我々は意味する。この不均衡は、細胞膜を介した水移動における迅速な変化を引き起こし、かつ、細胞ダメージを導く可能性がある。損傷した細胞又は老化した細胞は、浸透ストレスに対しより敏感であり、そして、この種のストレスのために生存性を失う可能性がある。

セリン及びトレオニンは、微生物の代謝を改変すると信じられている。これにより、セリン及びトレオニンが、制限されたか又は減少した代謝を有する細胞内で促進した代謝速度を直接的又は間接的に誘発すると信じられている代謝経路に関与することを我々は意味する。これら２つの分子を使用すると、細胞は改善した成長を示すことができた。

望ましくは、本発明に応じた修復化合物の前述の組み合わせは、ＲＯＳの減少又は除去、浸透ショックの減少及び代謝の改善の組み合わせを相乗的に改善する。このことは、以前可能であったよりも、より広いスペクトルのレジオネラ・ニューモフィラ株の場合に特に当てはまる。

我々は、本方法が、より広いスペクトルのレジオネラ・ニューモフィラ株にわたりストレスを受けたレジオネラ・ニューモフィラ細胞の修復を誘発し、こうして、より正確に全生存カウントを提供することを見出した。予想外なことに、我々は、本方法がさらに、必要とされるインキュベーション時間の長さを減少させることも見出した。一般に、我々は、本方法は、数時間、ある場合には少なくとも１又は２日間、インキュベーション時間を減少できることを見出す。

予想外なことに、我々は、本発明の方法は、干渉する微生物、即ち、レジオネラ・ニューモフィラ以外の微生物の減少をもたらすことができることも見出した。

ストレスを受けたレジオネラ・ニューモフィラ微生物細胞を本発明の修復化合物の組み合わせと接触させることを好適に伴う本発明の方法は、所望のように、ＲＯＳ形成の抑制及び／又はＲＯＳの減少及び／又はＲＯＳの除去をし、浸透ストレスを低下させ、そして代謝を改善し、そして、このことはストレスを受けた細胞の修復を誘発する傾向にある。

レジオネラ・ニューモフィラ微生物は、試料の回収のさいに修復化合物と直接的に接触されてよい。こうして、その中に水の試料（微生物を含むと考えられている）が回収されるこの容器は、既に修復化合物を含んでよい。代わりに、レジオネラ・ニューモフィラを含む水の試料が回収されると、これは、分析目的で、修復化合物を含む希釈水で希釈されてよい。別の代替策では、この試料は、任意に希釈されているが、修復化合物を含む成長媒体と接触されてよく、又は、修復化合物は、微生物と成長媒体の接触後に適用されてよい。試料を回収すると、この試料を、本発明の方法を実施するのに便利になるまで、貯蔵することが望ましい可能性がある。貯蔵の間に全ての修復化合物を組み込むことが望ましい可能性がある。

好ましくは、本発明に応じて一緒に使用される全ての修復化合物は、希釈工程の間に又は試料の貯蔵の間に、微生物と接触されることが望ましい。

本発明の一形態は、望ましくは、前記試料を修復媒体、好ましくは非選択的修復媒体であって前記修復化合物を含むものと接触させ、次いでこれを成長媒体、好ましくは選択的成長媒体と接触させることを伴う。好ましくは、前記修復媒体は液体であり、より好ましくはブイヨンである。修復媒体が液体である場合には、これは、好適には、液体修復法と称される。典型的には、液体修復法においては、試料は本発明の組み合わせを含む液体媒体中に最初に導入される。理想的には、液体修復法は、非選択的液体媒体においてストレスを受けた細菌が修復することを可能にする。好ましくは、液体修復法は、液体媒体としてブイヨンを採用するものである。一般に、レジオネラ・ニューモフィラ微生物を含む液体媒体は、次いで、成長媒体に移される。ストレスを受けた微生物は、成長媒体への移動前に修復されているか、又は、成長媒体との接触の際に修復するものである。より好ましくは、成長媒体は、選択的成長媒体である。典型的には、微生物を含む液体媒体は、選択的成長媒体プレート、例えば選択的寒天成長媒体プレート上に播かれるものである。

代替的な好ましい一形態では、工程（１）は、前記試料を成長媒体、好ましくは非選択的成長媒体（前記の修復化合物の組み合わせを含む）と接触させ、次いで、これを修復媒体（やはり前記修復化合物を含む）と接触させることを含む。好ましくは、修復媒体は、非選択的修復媒体、より好ましくは固形物、特により好ましくは選択的寒天成長媒体である。修復媒体が固形物である場合には、これは固形物修復法と呼ばれるものである。典型的には、固形物修復法は、前記試料を非選択的成長媒体（本発明に応じた前記の修復化合物の組み合わせを含む）と接触させることを伴うものである。引き続き、これを、修復化合物又は修復化合物の組み合わせを含む選択的成長媒体と接触させることができる。この形態では、選択的成分、及び、ＲＯＳの形成を防止し、減少させ又は除去する１又は複数の化合物は、非選択的媒体中へと拡散する。望ましくは、非選択的成長媒体は、非選択的寒天成長媒体であってよい。好適には、この形態では、前記試料は任意の非選択的寒天上に播かれることができ、次いで選択的寒天成長媒体（ＲＯＳの形成を防止し、減少させ又は除去する１又は複数の化合物を含む）が、非選択的寒天成長媒体上にオーバーレイされる。

更なる代替的一形態において、この試料を、修復化合物の組み合わせを既に含む選択的成長媒体に適用してよい。かかる選択的成長媒体は、選択的寒天成長媒体であってよい。この試料のプレーティングは、以前に説明しているように実施されてよい。

更なる代替的一形態において、この試料は、エアロゾルの形の水から回収されてよい。典型的には、このエアロゾルは、冷却塔又はエアーコンディショナー中にあってよい。望ましくは、本発明の方法に応じた試験前にエアロゾルから水が凝縮されている。代替的な好ましい一形態において、工程（１）は、エアロゾルからの試料を、修復媒体を含む希釈水、好ましくは修復化合物の組み合わせを含む非選択的修復媒体と接触させ、次いで、これをやはり修復化合物の組み合わせを含む成長媒体と接触させることを含む。

本発明の前述の形態の全てにおいて、成長媒体は、レジオネラ・ニューモフィラの成長にとって好適であることが望ましい。好適な成長媒体タイプは、文献において記録されており、かつ、当業者に良く知られている。通常、成長媒体は、活性化炭素及びシステインを含むことが望ましい。

選択的成長媒体が選択的寒天成長媒体であり、より好ましくは緩衝化した炭酵母抽出物（ＢＣＹＥ）寒天成長媒体であることが好ましい。ＢＣＹＥ成長媒体は、抗生物質サプリメントの添加により選択的になるものである。抗生物質を有する極めて望ましいＢＣＹＥ成長媒体は、ＧＶＰＣ（グリシン、バンコマイシン、ポリミクシンＢ、シクロヘキシミド）として知られている。

プレーティング法は、文献において記録されており、かつ、当業者に良く知られている。典型的には、この方法は、ペトリ皿に配置されている寒天ゲル上に多量のこれら水試料を適用することを伴うものである。このことは、ペトリ皿法又は寒天プレーティング法と呼ばれてよい。寒天プレーティングの目的は、ペトリ皿中の固形媒体上にアリコート、典型的には１００μｌの、微生物を含むと疑われている水（細菌懸濁物と呼ばれる）を伸ばすことである。ガラスビーズ又はセルスクレーパーは、寒天プレート上の細菌懸濁物を伸ばすために使用できる。伸ばした後に、大抵の液体が寒天により吸収され、そして、細菌を有する薄層が寒天表面上に残存する。インキュベーションにより、コロニーの形の細菌成長が寒天表面で発達した。インキュベーションは微生物に最も好適な温度で行われ、このことは文献において十分記録されており、かつ、当業者に良く知られている。典型的には、この温度は３０℃〜５０℃、例えば約３７℃である。

修復化合物の組み合わせは、この微生物の酸化的ストレスを減少させるのに効果的な量で添加されることが望ましい。好ましくは、これは、微生物細胞中のＲＯＳを減少させるか又は実質的に除去するために効果的な量である。

事実、我々は、修復化合物の組み合わせの使用が、レジオネラ・ニューモフィラの発達の間の誘導期の著しい減少を、特に液体媒体においてもたらすことを見出した。液体媒体における誘導期のかかる減少は、寒天プレート上の可視可能なコロニーを獲得するために必要とされる時間の減少を生じる。

修復媒体及び／又は成長媒体にケト酸及び／又は還元した酸素捕捉酵素を含めることも望ましくあってよい。ケト酸及び／又は還元した酸素捕捉酸素は、本発明の修復化合物とはみなされない。にもかかわらず、これら化合物の１又は両方を、修復化合物の前述の組み合わせのいずれかに含めることが有用であってよい。

生存微生物の検出及び定量化は、文献において記録されている既知の技術のいずれかにより実施できる。典型的には、このことは、成長媒体、例えば栄養寒天プレートの表面の可視可能なコロニーのカウントを意味する。

本発明の方法は、レジオネラ・ニューモフィラの生存について正確な定量的決定を容易にする。さらに、インキュベーション時間は著しく減少されてよい。本方法は、工業的冷却水、飲料水及び天然水から選択される群の任意のものに由来する試料中のレジオネラ・ニューモフィラの検出に好適である。

本発明は、次のものを含む、レジオネラ・ニューモフィラの種の生存微生物を、この微生物を含むと疑われている試料においてより正確に検出及び計測するためのキットも組み込む：
（１）修復化合物、
（２）成長媒体、
（３）インキュベーション手段、
（４）微生物の検出及び定量化のための手段、
その際、前記微生物がレジオネラ・ニューモフィラの種であり、前記修復化合物が、次のものを含む
（ａ）セリン、
（ｂ）トレオニン、
（ｃ）カルシウムイオンを含む化合物、
（ｄ）マグネシウムイオンを含む化合物、
（ｅ）カリウムイオンを含む化合物、
（ｆ）グルタミン酸又はその塩、
及び
（ｇ）ピルビン酸又はその塩。

このキットは、本発明の第１の観点に関して説明した実施態様のいずれかを含んでもよい。

このキットは、本発明の方法を用いた使用のために好適であり、かつ、レジオネラ・ニューモフィラのより正確な計測を、特により広いスペクトルのレジオネラ・ニューモフィラ株に関して可能にする。

以下の実施例は、本発明を説明する。

実施例
化合物の選択及びその最適濃度の決定
様々な化合物の作用を測定するために、２つの尺度を比較する：潜時及び成長速度を培養媒体及び補給した媒体補給していない培地で観察する。簡素化のために、潜時を、６００ｎｍで０．１の光学密度を得るために必要な時間により見積もる。全ての試験した化合物について、潜時増大（ＧＴにより表す）が、参照媒体（ＹＥＣ）で獲得した潜時と補給した媒体で獲得した潜時の差により獲得される。同じ条件において、成長速度の比（ＲＶＣにより表す）が、参照媒体で獲得した成長速度と補給した媒体（ＹＥＣ＋Ｘ）で獲得した成長速度の間の比として定義される。参照媒体（ＹＥＣ）においては、Ｌ．ニューモフィラの株は、５ｈ〜１５ｈの時間差があり、０．１〜０．３の光学密度（ＯＤとして表される）に達するために約１０時間を必要とする。

セリン又はトレオニンを修復化合物として使用する場合に、各ケースで種々のレジオネラ・ニューモフィラ株について潜時及び／又は成長速度に改善が観察される。用量の範囲にわたり、例えば、試料の体積に対する化合物の質量に対して０．０１〜５％で、約１ｇ／リットルの最適用量でもって改善が見受けられる。

潜時及び／又は成長速度における改善は、多数のレジオネラ・ニューモフィラ株について、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムを１０^-6〜１０^-2ｍＭ、特に１０^-4ｍＭの用量で使用する場合に観察される。

潜時及び／又は成長速度における改善は、数々のレジオネラ・ニューモフィラ株について、塩化カリウムを１〜１０^-4ｍＭ、特に約１０^-2ｍＭの用量で使用する場合に観察される。

特に効率的な修復化合物組み合わせは次のものを含む：
組み合わせＡ
１ｇ／リットルピルバート、１ｇ／リットルセリン、１ｇ／リットルトレオニン、１ｇ／リットルグルタミン酸、１０^-4ｍＭ塩化カルシウム、１０^-4ｍＭ塩化マグネシウム。

組み合わせＢ
１．５ｇ／リットルピルバート、１．５ｇ／リットルセリン、１．５ｇ／リットルトレオニン、１ｇ／リットルグルタミン酸、１０^-4ｍＭ塩化カルシウム及び１０^-4ｍＭ塩化マグネシウム。

組み合わせＣ
２ｇ／リットルピルバート、２．５ｇ／リットルセリン、１ｇ／リットルトレオニン、１ｇ／リットルグルタミン酸、１０^-4ｍＭ塩化カルシウム、１０^-4ｍＭ塩化マグネシウム及び１．１６×１０^-2ｍＭ塩化カリウム。

この結果は、いくつかの組み合わせが、特に、異なる株を含む液体媒体において、成長にとって有益であることを示す。

Claims

生存微生物を、前記微生物を含むと疑われている試料において検出及び計測するための方法であって、
（１）前記試料の前記微生物を修復化合物及び成長媒体と接触させる工程、及び
（２）工程（１）の生成物をインキュベーションする工程、及び
（３）前記生存微生物を検出及び定量化する工程、
を含み、その際、前記微生物がレジオネラ・ニューモフィラの種であり、前記修復化合物が、
（ａ）用量０．０１〜５％（質量／体積）でセリン、
（ｂ）用量０．０１〜５％（質量／体積）でトレオニン、
（ｃ）用量１０^-6〜１０^-2ｍＭでカルシウムイオンを含む化合物、
（ｄ）用量１０^-6〜１０^-2ｍＭでマグネシウムイオンを含む化合物、
（ｆ）用量０．０１〜５％（質量／体積）でグルタミン酸又はその塩、
及び、
（ｇ）用量０．０１〜５％（質量／体積）でピルビン酸又はその塩
を含む方法。
前記修復化合物が、（ｅ）カリウムイオンを含む化合物をさらに含む請求項１記載の方法。
工程（１）が、前記試料を、前記修復化合物を含む修復媒体と接触させ、次いでこれを成長媒体と接触させることを含む請求項１又は２記載の方法。
前記成長媒体が選択的成長媒体である請求項３記載の方法。
前記修復媒体が非選択的修復媒体である請求項３又は４記載の方法。
前記修復媒体が液体である請求項３から５のいずれか１項記載の方法。
前記液体がブイヨンである請求項６記載の方法。
工程（１）が、前記試料を成長媒体と接触させ、次いでこれを前記修復化合物を含む修復媒体と接触させることを含む請求項１又は２記載の方法。
前記成長媒体が非選択的成長媒体である請求項８記載の方法。
前記修復媒体が選択的修復媒体である請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
前記選択的修復媒体が固形物である請求項１０記載の方法。
前記固形物が選択的寒天成長媒体である請求項１１記載の方法。
工程（１）が、前記試料を、前記修復化合物を含む成長媒体と接触させることを含む請求項１から１２のいずれか１項記載の方法。
前記成長媒体が、緩衝化した炭酵母抽出物（ＢＣＹＥ）又はＧＶＰＣ寒天成長媒体である請求項１から１３のいずれか１項記載の方法。
前記修復媒体及び／又は成長媒体が、ケト酸及び／又は還元した酸素捕捉酵素を含む請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
レジオネラ・ニューモフィラの種の生存微生物を、前記微生物を含むと疑われている試料においてより正確に検出及び計測するためのキットであって、
（１）修復化合物、
（２）成長媒体、
（３）インキュベーション手段、
（４）微生物を検出及び定量化するための手段、
を含み、
前記微生物がレジオネラ・ニューモフィラの種であり、かつ、前記修復化合物が
（ａ）用量０．０１〜５％（質量／体積）でセリン、
（ｂ）用量０．０１〜５％（質量／体積）でトレオニン、
（ｃ）用量１０ ^-6 〜１０ ^-2 ｍＭでカルシウムイオンを含む化合物、
（ｄ）用量１０ ^-6 〜１０ ^-2 ｍＭでマグネシウムイオンを含む化合物、
（ｆ）用量０．０１〜５％（質量／体積）でグルタミン酸又はその塩、
及び、
（ｇ）用量０．０１〜５％（質量／体積）でピルビン酸又はその塩
を含むキット。
前記修復化合物が、（ｅ）カリウムイオンを含む化合物をさらに含む請求項１６記載のキット。