JPS59224695A - グルコ−ス−２−オキシダ−ゼ産生微生物の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は微生物学の分野、さらに詳しくは、微生物、こ
とに、グルコース−２−オキシダーゼ産生微生物の選択
およびスクリーニングに関する。

発明の背景 生物を用いる工業的方法の経済性を、用いる生物の改良
により改善するために、従来がら、種々の方法が採用さ
れている。これらは、生物の株改良プログラムの他層に
入れることのできる技術を構成する。該方法の改善効率
は生物のタイプおよび最終生成物の性質に依存する。

いずれの株の改良プロクラムの成功も、対象となる生物
に遺伝的変化を生じさせることの容易さ、あるいは、す
て（こ自然に存在する遺伝的変化を評価することの容易
さに直接影響される。

胞子、ｍ体または／Ｊ＼菌糸フラグメントの平板培養後
、寒天培地−Ｆ：、（こ現われるコロニーは大部分が遺
伝的に同一の菌体群からなるが、いくらかの菌体は該コ
ロニーの増殖の間の自然突然変異または最初のプロパギ
ュールにおける核異質性により相違することがある。

醗酵工業の初期において、株改良胚形質の主要源を与え
る、現存する培養菌における自然突然変異の発生はごく
まれであった。改良株の第二の姉は自然自体、すなわち
、改良された特性を有する未知の株を自然界から単離す
ることであった。

生じた遺伝的変化の生物学的および化学的理解が深まる
にっれ、株改良プログラムはこの新しい知識をその理論
的基礎にとり込んできた。例えば、遺伝的変化を生じさ
せるために変異誘発を生じさせ、ついで、すぐれた株を
スクリーニングし、選択し、精製することは醗酵生産物
の収率を向上させるもつとも効率的な手段の１つである
。変異プログラムは、得られた新しい株によって示され
る高い生産性が必然的にコストを低下させる点て醗酵工
業において非常に重要なことである。

現在、実際番こ用いる変異誘発原および実際の変異誘発
条件の選択が株改良プログラムの間に回収される変異株
のタイプおよび数を決定するうえで重要な役割を果すこ
とが知られてＧ）る。一般に、変異誘発操作で得られた
新しい株を回収するために２つの方法が用いられている
。それらは訳択とスクリーニングである。

スクリーニングの５ステムでは、変異誘発処理て死滅し
たものを除き、全ての株を増殖させ、単■した各株番こ
ついて所望の特性を同定するために試験しなけれはなら
ない。何千万もの単耐株を試験しなけれはならないので
、この方法は非常に労働集爬Ｊ的である。

選択システムでは、所望の特性を有する少数の株と、該
特性を持たない曲の全ての株の間の増殖に差が生じるよ
う番こ実験条件を選択する。例えば、丁 選択すべき株はその実験条件では増殖しないが、△ 選択しない株は増殖するように条件を選定する。

かくして、ρ過または他の方法で増殖する株を除去する
ことにより、試験するために残る菌数は著しく減少する
。別°法として、選択すべき株は増殖するが、選択しな
い株は抑制されるように条件を選定してもよく、これで
も試、験すべき菌数は効１ス的に減少する。

変異誘発は株改良の分野では非常番こ有効なものである
か、いくつかの制約がある。例えば、改良プログラムを
続けていく結果、株中にたんたん変異が蓄債される番こ
っれ、飽和レベルに達する。かかる株について、さらに
選択を行なうと、しはしば、現Ｔ’ｒ−する変異の復帰
による生産性の損失が生じる。

変異誘発による改良プログラムは、株が改良されるべき
活性を有するという仮定に基いており、かかるプログラ
ム【こはさらに基本的な制約が存在する。換ｉシｆずれ
ば、生物は、いずれかの遺伝子物質の機能に関する遺伝
的改良プログラムを考える以前ｆ・こ、該遺伝子物質の
合成を指令する情報をその遺伝的レパートリ−に有して
いなければならない。

これらの制約を減じるため（こ種々の遺伝的方法が開発
されている。例えは、雑種形成技術は数多くの異なった
株間の遺伝的組換えを可能にする。

雑種形成は有性生殖または体細胞融合や異種接合体形成
のような無性方法によって行なうことができる。組換１
）ＮΔ技術の出現は改良プログラム番こおける制約をさ
らに減じている。非常に相違する遺伝的背景を有する生
物間で遺伝子を伝達できることは実質的１こ制約のない
、改良する遺伝情報の供給源を提供するものである。こ
の遺伝子工学技術の出現は、新しい株自体を単離し、発
展させるという観点からではなく、むしろ、すでに確立
されている株に移入できる、わずか１つの遺伝子の供給
源として、再び天然の遺伝的変異源に対する興味をわか
せている。

変異株の源、それが天然であるか、自然突然変異である
か、変異誘発によるものか、あるいは、有性、無性また
は遺伝子工学的方法番こよる組換型であるか（こ関係な
く、スクリーニングおよび選択の方法は、多数の株から
所望の株を回１■するうえで、やはりジＩ−常に重要で
ある。

本発明（こおいて、株改良プログラム（こ関して特に興
味深いｍｍの生物はグルコースのフルク）　−スへの異
性化に有用なものである。

食用グルコースの大部分はトウモロコシ澱粉の酵素的氷
解物、すなわち、商業的なコーン・シロップとして供給
される。一般（こ、グルコースの甘味はシュークロース
の６０〜８０％とされており、それに和尚して低価格で
販売されている。グルコースイソメラーゼ活性を有する
酵素を用いてグルコースをシュークロースよリモいっ’
Ｃウ１ｔイア　ルクト−スに異性化することが以前から
知られている。好ましくは、かかる酵素は、該酵素を支
持体マトリックスと架橋させるか、ジエチルアミノエチ
ルセルＶ１−スまたは多孔質ガラスのような亮分子−支
持体７トリツクスに抱括させるなどして、不溶性支持体
に固定化したものである。クルコース（７Ｊ　Ｊ４　性
化は、１時フルクトース・コーン・シロップ（ＨＦ　Ｃ
Ｓ　）と呼ばれている、代表的にはフルクトースを４２
〜５０％含有する平衡混合物を与える。

近年、まず、酵素的１こグルコースをグルコーソンに変
換し、ついて、このグルコーソンを化学的にフルクトー
スに還元すること（こよってクルコースのフルクトース
への実質的に完全な変換を行なうことが提案されている
。例えば、米国特許第４２４６３４７号によると、グル
コース−２−オキシダーゼ活性を有する酵素、好ましく
は、ポリポラス・オブツサス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ　０
ｂｔｕ’＋ｕｓ）またはアスペルギルス、オリサｘ　（
Ａｓｐｅｒｇｉｌ　Ｉｕｓ　０ｒｙｚａｅ）から得られ
た酵素を用い、同時に生成する過酸化水素を除去または
利用しながら、水溶液中で少なくとも約９５％の１）−
グルコースをＤ−グルコーソンに酵素的に酸化し、つい
て、該Ｄ−グルコーソンを１〕−フルクトースに水素添
加ｌ、ている。当該分野で知られているように現在まで
好ましいとされている微生物であるポリポラス・オブツ
サスから得られたグルコース−２−オキシダーゼは、こ
の微生物の朝糸体を酵素源として用いると、低い酵素活
性しか得られないので、主として菌体を含有しない抽出
液の形で用いられている。

こレラの１）　＋　クルコースから１）−グルコーソン
およびＩ）−グルコ°−ソンから１）−フルクトースへ
の変換は、つき゛に示す反応式をこ従い進行するものと
考えられる。

１）−グルコース　　　　　　　Ｄ−グルコーンン（Ｄ
−アラヒノー２−へキツスロース）１〕−グルコーソン
　　　　　Ｄ−フルク！・−ス（Ｄ−アラビノ−２− ヘキソス■１−ス〕 近年、米国特許第４４４２２０７号（Ｉ−１ｏｒｗａｔ
ｈ）’において、多くの担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙ
ｃｅｔｅｓ）７％著しい量のグルコースイソメラーゼお
よびグルコース−２−オキシダーゼを産生することが開
示されている。これらの知見が、特に、前記のようなフ
ルクトース製造法番こかんがみて、グルコース−２−オ
キシダーゼ産生株の回収用の大規模で効率的なスクリー
ニング・システムの開発の根拠を与えている。かかるス
クリーニング・システムを提供することか本発明の主な
目的である。

発明の１既要 本発明は、あらゆる微生物番こよるグルコース−２−オ
キシダーゼ産生の増加または減少を検出するための迅速
なスクリーニング方法を提供するものである。

本発明のグルコース−２−オキシダーゼ産生についての
微生物のスクリーニング法は、該微生物の増殖を促進し
、かつ、該酵素の触媒作用用の基質を与える固体または
半固体培地上に該微生物の懸濁液を接種してスクリーニ
ング平板を形成し・、Ｍ　接種培地を、グルコース−２
−オキシダーゼの合成を促曲する条件下でインキュベー
トし、ついで、クルコース−２−オキシダーゼ触媒作用
による生成物の存在を、分析指示薬との反応（こよって
検出してグルコース−２−オキシダーゼ活性を示すコロ
ニ、−を系内にて同程する工程からなる。

微生物は、固体または半固体培地の平板表向に接種され
る。培地は、その株に必要な全ての基礎的な栄養成分な
らびに所望の酵素の合成促進または該酵素の検出の助け
〔こ必要となるいずれもの特定の因子を含有する。酵素
生成物の存在について各コロニー周囲の培地を分析する
。本発明Ｏこ関して特に有用な分析法は、微生物コロニ
ーに対して非破壊的なものである。しかしながら、滑性
の試薬でも、その分析反応が迅速で、該苛性試薬による
処理後も、コロニー中に生存菌体の残存が保証されるよ
うな場合には、該試薬を酵素活性の評価において短時間
の暴露（ご用いてもよい。かくして、該酵素を産生ずる
コロニーは単離およびそれ以後の評価用の閑体淵として
直接用いることができ、株維持のための各スクリーニン
グ平板をレプリカ平板培養する必要性をなくすことがで
きる。

本発明はクルコーク−２−オキシダーゼ産生微生物を早
期に検出てきる点て、こと（こ有用である。

詳細な説明 本発明の１つの具体例（こよれば、まず、スクリーニン
グすべき微生物を含有する土壌試料を、該微生物の増殖
および該微生物番こよるグルコース−２−オキシダーゼ
の合成を促進する培地上で平板培養する。該微生物の増
殖およびそれに伴なう酵素活性の発逐に充分な時間後、
スクリーニング平板に重層を行なう。該重層は、グルコ
ース−２−オキシダーゼ用の追加の基＠を含有するの番
こ加え。

クルコース−２−オキシダーゼ作用の生成物の１つ、す
なわち、グルコーソンの安定化を行なうことができる。

グルコース−２−オキシダーゼ作用番こよる生成物の酢
漬に充分な時間経過後、該重層したスクリーニング平板
に分析用指示薬を加え、クルコース−２−オキシダーゼ
を合成できる微生物を該指示薬の陽性反応により同定す
る。つし）で、該指示薬の陽性反応を示すスクリーニン
グ平板の区域から微生物を回収し、植継ぎし、グルコー
ス−２−オキシダーゼの存在を再確認できる。

本発明の第２の具体例において、グルコース−２−オキ
シダーゼの産生について微生物をスクリーニングする方
法は、該微生物の増殖を促進し、該酵素番こよろ過酸化
水素生成用の基質を与える固体または１を固体培地上に
該微生物の懸濁液を接種してスクリーニング平板を形成
し、該接種培地をグルコース−２−オキシダーゼの合成
を促進する条件下でインキュベートし、ついて、過酸化
水素のイｒ在を、分析指示薬との反応によって検出して
グルコース−２−オキシダーゼ活性を示すコロニーを系
内て同定する工程からなる。

この第２の具体例においては、ます、スクリーニングす
べき微生物を含む土壌試＊−４を、ソルボースを含有す
る培地上で平板培養する。ソルボースは、所１衣の微生
物の増殖用の灰索源となるのに加えて、グルコース−２
−オキシダーゼの基質ともなる。微生物がグルコース−
２−オキシダーゼによってンルボースを代謝する番こ従
い、該代謝の生成物の１つ、過酸化水素が培地中で発生
する。ついで、適当な分析指示薬との反応により過酸化
水素産生コロニーを同定することができ、過酸化水素産
生コロニーを培養平板から単離する。この方法は拮抗酵
素作用源を除くことにより、偽陽性コロニーの数を減少
する点でことに有用である。

株改良の１つの基準はその微生物によって産生さ紅る具
体的な酵素の活性および／または量における変化である
。本発明はこれを利用して、迅速で、経費のかからない
、非労働集約的なグルコース−２−オキシダーゼ産生微
生物の系内（ｉ＋ｉ・＋５ｉｔｕ）スクリーニング法を
確立するものである。本発明の好ましい具体例において
は、試験すべき微生物群を固体培地上で平板培養する。

不発明番こよるスクリーニングに適した微生物には、細
菌、放線菌、菌類、単細胞藻類が包含されるが、本発明
は、担子菌類の菌類のスクリーニングにこと（こ有用で
ある。

担子菌類は比較的増殖の遅い微生物で、発芽の開始から
可視コロニーの形成まで〔こ３〜７日かかることも異常
でばない。この長い発育期が担子菌類の自然界からのス
クリーニングおよび選択をことに困＆、ｔｌｌｊ　Ｈこ
している。例えば、担子菌類および他の土壌微生物を含
有する土壌試料をスクリーニング平板培地に接種し、３
〜７日間インキュベートして担子菌類を増殖させる場合
、該土壌試料（こ混入した他の増殖の早い微生物が該平
板上で過剰に増殖する。

担子菌類がグルコース−２−オキシダーゼを産生するこ
とが証明され、該酵素がグルコースのフルクトースへの
変換に有用であるという事実（米　□国特許第４４．４
２２０７　（Ｈｏｒｗａｔｌつ）ｉコカんがみ、グルコ
ース−２−オキシダーゼ産生番こついての、大規模な、
効率的な担子菌類のスクリーニング法は明らかに有用で
ある。しかしながら、前記のごとく、担子菌類の増殖が
遅いために、該菌類のスクリーニング操作の過程で酵素
活性の早期検出が必要となる。対象となる微生物の発育
過程の早期に、その微生物の酵素活性を検出てきること
は、土壌試料のスクリーニングにおいて有用（例えば。

混入微生物の過剰増殖防止）であるばかりでなく、３〜
７日間の発育期間の減少は明らかに利点であるので、株
改良目的のための担子菌類の純培養をスクリーニングす
る場合においても有用である。

クルコース−２−オキシダーゼ産生担子菌類の早期検出
を容易にするうえにおいて、該発芽菌類が測定可能な量
の所望の酵素を生成することを見出した。すなわち、本
発明の好ましい具体例によれは、グルコース−２−オキ
シダーゼ反応の少なくとも１つの生成物が、適当な分析
指示薬との反応により、該発育微生物を囲む区域で検出
される。

この検出された反応生成物が、グルコース−２−オキシ
ダーゼ産生菌体が増殖し、独立した可視コロニーを形成
するはるか以前に該菌体を検出できる「化学的顕微鏡」
としての役目を果す。

胞子形成担子菌類の場合、該胞子を囲む区域におけるグ
ルエース−２−オキシダー４作用の反応生成物の放出に
よって、適当な試薬によって検出てきる丁代謝の影」が
できる。すなわち、陽性試薬反応（こよって示された区
域から発芽胞子を回収することにより、該発芽胞子はそ
の発育過程の非常に早期にｔｌｌｌＮすることができる
。

本発明におりる関連酵素反応はつぎの式で示すことがで
きる。

ＩＩＯ Ｕ　　Ｃ０１１ 「 ＩＩ　　Ｃ：　　ＯＩｌ Ｃ１１２０１１ １）−グルコース Ｃ夏１　（） Ｃ４よＯ １ｌ−Ｃ−０１１ １ｌ−Ｃ−０１１ Ｃ１１２０１，Ｉ Ｄ−グルコーソン （Ｄ−アラビノ−２−へキツスロース）関連のない酵素
作用によっても生じうる過酸化水Ｎとｕなり、”ｙ”ル
コーソンはグルコース−２−オキシダーゼ作用に特有の
生成物であるので、グルコーソンの測定はグルコース−
２−オキシダーゼ活性と直接相関する。

本発明の１具体例によれば、試料を固体平板培地に接種
し、グルコース−２−オキシダーゼ含有微生物が発育し
、該微生物により該酵素が生成するに充分な時間インキ
ュベーションする。こノ時間は土壌試書中の微生物の濃
度や組成のような種々のパラメータに依存するが、約２
４〜約９６時間の範囲とすることができる。一般に、約
７２時間のインキュベーション時間が好ましい。

最初のインキュベーション期間経過後、検出すべき生成
物がグルコーソンの場合、グルコース−２−オキシダー
ゼ用の基質（例えば、グルコース）からなり、好ましく
は、フッ化ナトリウムのようなグルコーソン安定化物質
を含有する第２の培地を平板（こ重層する。フッ化ナト
リウムの存在はグルコーソンの代謝を抑制し、該生成物
を該微生物およびその周囲の培地中ζこ蓄積させる。か
くして、該不安定な物質は代謝的（こ隔離され、適当な
分析指示薬との反応醗こより、より容易（こ同定できる
。

グルコーソンが蓄積するに充分な時間、例えば、約１２
〜約２４時間、好ましくは、約１６時間の後、重層した
スクリーニング平板を、適当な分析指示薬の添加ｌこよ
り、グルコーソンの存在メこつぃて分析する。

２．４−ジニトロフェニルヒドラジンがこの分析に有用
な試薬であることが判明した。これはグルコーソンと共
にヒドラゾンを形成し、グルコース−２−メキシダーゼ
産生微生物の周囲またはその」−に赤橙色の沈澱を生じ
る。約２０％の陽性反応がグルコーンンからのもの以外
のヒドラゾン誘導体によることが判明しているが、該グ
ルコーンン読導体の存在は、酢酸エチルでの抽出、高圧
液体クロマトグラフィ＝（ｉ（Ｐ　Ｌ　Ｃ）　ｌこよる
分析で容易に確認される。

本発明の１つの具体例によれば、スクリーニング平板の
各ヒドラゾン陽性区域の試料を二重に採取し、１つの試
料をＨＰ　Ｌ’Ｃ分析に付してグルコーンン読導体の存
在を確認し、もう１つの試料を微生物の単用、植継ぎ用
に保持する。

指示薬による偽陽性反応の数を減じるため、本発明は特
別ｆこ選択した炭素源の使用も提供するものである。例
えば、グルコース−２−オキシダーゼの天然の基質であ
るグルコースを用いる場合、他の過酸化水素発生酵素（
例えは、グルコースのりｌレフロン酸とＩ（２０２への
酸化を触媒するグルコース−１−オキシダーゼ）ｉこよ
るグルコースの代謝から５種々の偽陽性が生じる。グル
コース−２−オキシダーゼは拮抗するグルコース−１−
オキシダーゼが利用できない他の炭水化物基質も許容す
るので、かかる基質を偽陽性反応の減少に用いる。偽陽
性反応を減少させる適当な唯一の炭素源にはソルボース
またはキシロースのような基質が包含される。ソルボー
スまたはキシロースはＩ独°Ｃも、組合せても用いるこ
とがてきるが、低コストおよび反応速度がより良好なこ
とから、ソルボースが好ましい。

グルコース−２−オキシダーゼの存在下、ソルボースは
５−ケトフルクトースｔこ変化し、　Ｉ（２０□を発生
するが、ソルボースはグルコース−１−オキシダーゼに
は許容されない基質である。さらに、スクリーニング平
板中でのソルボースの存在はある種の微生物のコロニー
形成を促進するが、コロニーの大きさを小さくし、した
がって、該微生物の拡散を制限する。このコロニーの大
きさを制限することは、■平板当り、より多数のコロニ
ーを評価できるという利点も有している。

用いるソルボースまたはキシロースの債は通常、約０．
１〜爬１５％、好ましくは、約１〜３％の範囲である。

つぎに実施例を挙げて本発明をざら番こ詳しく説明する
。

実施例１ この実施例では、重層法を用いてグルコーソンの存在を
検出する土壌試料のグルコース−２−オキシダーゼｉ拍
生微生物番こついてのスクリーニンクを説明する。

土壌試料を大型スクリーニング平板（培地１．５１／平
板）に接種し、２５　”Ｃで７２時間インキュベーショ
ンする。

ベース層培地の組成はつぎのとおりである。

グルコース　　　　　　　　　　　１％Ｗ／Ｖペプトン
　　　　　　　　　１％Ｗ／Ｖ寒天　　　　　　　　　
　　１５％Ｗ／Ｖｐ　Ｉ−１５，８ インキユベ一シヨン期間後、っぎの組成の培地０．５４
つつで重層する。

グルコース　　　　　　　　　４％Ｗ／ＶＮａＦ　　　
　　　　　　　　　　Ｏ，０２Ｍ寒天　　　　　　　　
　１．５％Ｗ／ＶｐＴ−１７，０ 重層した平板を２５°Ｃで１６時間インキュベーション
し、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとの反応によ
り、グルコーンンの存在について平板を分析する。

コ（７）２．４−ジニトロフェニルヒドラジン（２，４
−ｌ）　Ｎ　ｌ）　ＩＩ　）　ハ２．４−　Ｄ　Ｎ　Ｐ
　Ｈ８０９’ｅ’ｌａ硫酸４００ｒｙｔ／′ｊこ溶解し
°、攪拌しながら、注意して水６００ｍ１をゆっくりと
加え、ついて、９５％エタノ−１ｖ２０００ｙｙｔｌを
加えて調製する。得られた溶液をブフナーｒ斗で沖過し
、ｌ：３に稀釈して寒天平板上（こ噴霧する。

２．４−ＤＮ］’１１試薬を平板に噴霧し、１時間後、
該試薬とグルコーソンの反応により、グルコース産生−
オキシダーゼ産生轍生物の周囲またはそのＪｊこ赤橙色
域が発生する。

陽性反応域から試料を採取し、高圧液体クロマトグラフ
ィーでグルコーソン−１）　Ｎ　、Ｐ　Ｈ＋Ｍ　４　体
の存在を確認し、所望の微生物を単離し、植継ぐ。

実施例２ この実施例では噴霧法を用いてグルコーソンの存在を検
出する土壌試料のグルコース−２−オキ生 シダーゼ産生微物についてのスクリーニングを説△ 明する。

実施例１と同様に、ベース層培地を調製し、接種し、イ
ンキュベーションスル。

７２時間後、ベース層にっぎの組成の培地を噴霧する。

グルコース　　　　　　　　　　６％Ｗ／ＶＮａＦ　　
　　　　　　　　　　　　０．０２Ｍ寒天　　　　　　
　　　　　０５％Ｗ／ＶｐＨ７，０ ２５′Ｃで１６時間インキュベーション後、実施例１と
同様−こ、噴霧した平板のグルコーソンの存在について
分析する。

実施例３ この実施例では過酸化水素の検出による土壌試料のグル
コース−２−オキシダーゼ産生微生物についてのスクリ
ーニングを説明する。

試料を大型スクリーニング平板（培地１．５１／平板）
に接種し、２５゛Ｃで４８〜７２時間インキュベーショ
ンする。

培地の組成はつぎのとおりである。

ンルボース　　　　　　　　　２．０％Ｗ／Ｖペプトン
　　　　　　　　　１．０％Ｗ／ＶＮａＦ　　　　　　
　　　　　　１ｍ、Ｍ寒天　　　　　　　　　　　２．
０％Ｗ／ＶｐＨ５，８ インキユベ一シヨン期間後、平板に過酸化水素検出用指
示薬を噴霧する。

指示薬はっぎの組成のＡ　Ｂ　−ｆ　Ｓストック溶液２
部とパーオキシダーゼ・ストック溶Ｃ夜３部を混合して
調製する。

Ａ　Ｒ−１’　Ｓストック溶液 Ａ　Ｉｓ　Ｔｓ　＋７）　２．６５＜Ｗ／Ｖ水溶液Ａ　
Ｂ　’ｉ’　Ｓは「１イコ染料、２，２−アジノージ−
（３−工ｆｗ−ベンゾチアゾリンスルホイード）テある
。

パーオキシダーゼ・ストック溶液 セイヨウワ→ノービ・パーオキシダーゼ１００単位／ゴ
水、ミリポアフィルタ−でｒ過 平板を３０°Ｃでさらに２４時間までインキュベーショ
ンする。紫色域の形成がグルコース−２−オキシダーゼ
産生微生物の存在を示す。

別法として、Ａｌ３Ｔ’Ｓｉ６よびパーオキシダーゼを
寒天と組合せて、重層として用いることもてき時計出願
人　ナビスコ・ブラング・インコーホレイテッド 代理　人弁理士　責　山　葆　ほか２名５２０−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １１１＋ａｌグルコース−２−オキシダーゼ産生微生物
   の増殖を促進し、該酵素の触媒作用用の基質を与える固
   体培地番こ該微生物の懸濁液を接種してスクリーニング
   平板を形成し、 （１）］該接種した培地を、グルコース−２−オキシダ
   ーゼの合成を促進する条件Ｆてインキュベーションし、 ｔｅ１分析指示薬とセての反応により、各コロニー周囲
   のグルコース−２−オキシダーゼ触媒反応生成物の存在
   を検出してグルコース−２−オキシダーゼ活性を示すコ
   ロニーを系内で同定する、工程からなることを特徴とす
   るグルコース−２−オキシダーゼ酵素産生に関する微生
   物スクリーニング方法。 （２）同定された微生物をスクリーニング平板から回収
   する工程を有する前記第（１）項の方法。 （３）該微生物が却Ｉ菌、放線菌、菌類または単細胞藻
   類である前記第［１１項の方法。 （４）該微生物が担子菌類である前記第（３）項の方法
   。 （５）該生成物がグルコーンンである前記第（１１項〜
   第（４）項いずれか１つの方法。 （６）該増殖促進酵素基質が濃度約１〜約６％のクルコ
   ・−スである前記第（５）項の方法。 （７）グルコースが濃度約２％で存在する目ＩＪ記第（
   ５）または第（６）項の方法。 （８）指示薬が２，４−ジニトロフェニルヒドラジンで
   あるｈｉＪ記第（５）項〜第（７）項いずれか１つの方
   法。 （９）該生成物が過酸化水素である前記第（月頃〜第（
   ４）項いずれか１つの方法。 （ｌＯ）該培地が、キシロースまたはンルポースからな
   る１１■から選はれる適当な増殖促進基質で形成される
   前記第（９）頃の方法。 （ｌり該培地がｔＦＪ　ｏ、　５％〜約５％Ｗ／ＶのＶ
   ／レボースからなる前記第（ｌの項の方法。 （１２）該培地が約２％Ｗ／Ｖのンルホースからなる前
   記第（１１）項の方法。 （１３）該指示薬がセイヨウワサビ・パーオキシダーゼ
   からなる前記第（印項〜第（１２）項いずれが１つの方
   法。