JP6949721B2 - 内蔵型嫌気性環境生成培養装置 - Google Patents
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Description
本出願は、その開示が参照によって完全に本明細書に組み込まれている、2015年4月29日出願の米国仮特許出願第62/154,684号の優先権を主張するものである。
多数の細菌は酸素に対して感受性があり、酸素存在下では増殖しない。このような嫌気性微生物の生存率を測定することは、種々の環境において有用であり得る。例えば、嫌気性微生物が食品加工施設及び/又は包装施設に存在するかどうかを測定することが重要であり得る。医療環境にて嫌気性微生物の存在を測定すること、例えば、診断検査で病原菌の存在を測定することもまた重要であり得る。別の例として、水処理施設では水のサンプルを試験し、このような微生物の有無を決定している。
広くは、本開示はサンプル中の微生物の検出、及び所望により計数に関する。特に、本開示は、微耐気性、微好気性、偏性嫌気性微生物の増殖及び検出に関する。増殖及び検出を、内蔵型の改変された環境生成培養装置を使用して実施できる。改変された環境生成装置は、低濃度の溶存酸素、及び任意により、高濃度の溶存二酸化酸素を有する、水性増殖培地を生成するために、水性液体で活性化される。
更に別の態様において、本開示はサンプル中の嫌気性微生物を検出する方法を提供する。方法は、サンプルを上記実施形態のいずれかの装置の増殖区画に堆積させる工程と、嫌気性微生物の増殖を促進させる条件下で装置をインキュベートする工程と、増殖区画内の嫌気性微生物のコロニーの指標を検出する工程とを含み得る。
本開示の任意の実施形態を詳しく説明する前に、本発明はその適用において、以下の説明に述べる又は以下の図面に例示する構成の細部及び構成要素の配置に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施又は実行することができる。更に、本明細書で使用される専門用語及び用語は、説明目的のためであり、制限とみなされるべきではないと理解される。本明細書における「含む(including)」、「備える(comprising)」又は「有する(having)」、及びこれらの変形の使用は、その後に挙げられる項目及びその等価物、並びに追加的な項目を包含することを意図される。別段の指示又は限定がない限り、「接続(connected)」及び「結合(coupled)」という用語及びこれらの変形は広義に使用されるものであり、直接的及び間接的な接続及び結合を包含する。更に、「接続」及び「連結」は、物理的又は機械的な接続又は連結に制限されるものでない。本開示の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、構造上又は論理上の変更を加えることもできることを理解されたい。更に、「前」、「後」、「上」、「下」などの用語は、各要素の互いに対する関係を説明するためにのみ用いられるものであり、装置の特定の向きを説明すること、装置に必要とされる又は求められる向きを指示又は示唆すること、あるいは本明細書に記載される発明が、使用時にどのように使用、装着、表示、又は配置されるかを特定することを目的とするものでは決してない。
実施形態Aは、
防水性基部と、基部に取り付けられた防水性カバーシートと、それらの間に配置された増殖区画とを含む、本体であって、増殖区画が、周辺部と、増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを有し、
周辺部の一部分が、防水性シールによって画定され、この部分が、周辺部の50%超を含む、本体と、
増殖区画内で基部に接着された、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤と、
増殖区画内に配置された、乾燥した第1酸素除去試薬と、を備える、装置である。
カバーシートが、増殖区画の少なくとも一部分において、その上に配置された、第2接着剤層を備え、
第2乾燥成分が、増殖区画内で、第2接着剤層に接着されている、先行する実施形態のいずれか1つに記載の装置である。
周縁部と、
離間した第1区分及び第2区分を備える、第1主面と、
第1主面の反対側の第2主面と、
第1区分を、第2区分に対して並置して重ねるように配置するための折り目と、を含む防水性基材を備える本体であって、
第1区分及び第2区分は、増殖区画の内壁を画定し、この増殖区画は、周辺部と、増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを含み、
周辺部の一部分が、防水性シールによって画定され、この部分が、周辺部の50%超を含む、本体と、
増殖区画内で基部に接着された、冷水可溶性ゲル化剤と、
前記増殖区画内に配置された、乾燥した第1酸素除去試薬と、を備える、装置である。
防水性基材が、第2区分の少なくとも一部の上に配置された第3接着剤層を含み、
第2乾燥成分が、増殖区画内で、第3接着剤層に接着されている、実施形態AKに記載の装置である。
サンプルを、先行する請求項のいずれか一項の装置の増殖区画内に堆積する工程と、
嫌気性微生物の増殖を促進させる条件下で装置をインキュベートする工程と、
増殖区画内の嫌気性微生物のコロニーの指標を検出する工程と、を含む、方法である。
防水性基部と、基部に取り付けられた防水性カバーシートと、それらの間に配置された増殖区画とを含む、本体であって、増殖区画が、周辺部と、前記増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを有し、
周辺部の一部分が、防水性シールによって画定され、この部分が周辺部の50%超を含む、本体と、
増殖区画内で基部に接着された、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤と、
増殖区画内に配置された、乾燥した二酸化酸素生成試薬と、を備える、装置である。
75μm(3.0ミル)ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム(Melanex 454,Tekra,New Berlin,WI)は、米国特許第5,409,838号の実施例1に記載される、イソオクチルアクリレート/アクリルアミド感圧接着剤(PSA)でコーティングされた。シリコーンでコーティングされた紙剥離ライナー(D#63 BL KFT H/O 548440/000;Loprex GmbH,Stuttgart,Germany)の中央から7.62cm×10.16cm(3インチ×4インチ)平方を取り除いたものが、接着剤の境界をマスクするために使用された。露出した接着剤は、冷水可溶性ゲル化剤、及び酸素除去試薬/還元剤の様々な混合物で粉末コーティングされた(表1)。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれ、その後、剥離ライナーが除去された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、フィルムの粉末コーティングされた部分の7.62cm(3インチ)の辺の1つの上の接着剤に接着された。125μm(5ミル)PETフィルム(Melanex 454,Tekra,New Berlin,WI)はその後、残っている露出した接着剤へと積層され、剥離ライナーが一方の端部を封止するのを防いでいるパウチが形成された。
75μm(3.0ミル)ミルポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム(Melanex 454,Tekra,New Berlin,WI)は、米国特許第5,409,838号の実施例1に記載される、イソオクチルアクリレート/アクリルアミド感圧接着剤(PSA)でコーティングされた。中央から7.62cm×10.16cm(3インチ×4インチ)平方を取り除いたシリコーンコーティングした紙剥離ライナーが、接着剤の境界をマスクするために使用された。露出した接着剤は、冷水可溶性ゲル化剤、及び酸素除去試薬/還元剤(表1)の様々な混合物で粉末コーティングされた。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれ、その後、剥離ライナーが除去された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、フィルムの粉末コーティングされた部分の7.62cm(3インチ)の辺の1つの上の接着剤に接着された。剥離ライナーが接着された2枚の粉末コーティングしたフィルムが、このような方法で作製され、粉末コーティングされた部分が向かい合って重複し、接着された剥離ライナーも同様に重複するようにして、互いに積層された(図2参照)。
75μm(3.0ミル)ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム(Melanex 454,Tekra,New Berlin,WI)は、米国特許第5,409,838号の実施例1に記載される、イソオクチルアクリレート/アクリルアミド感圧接着剤(PSA)でコーティングされた。接着剤は、冷水可溶性ゲル化剤、及び酸素除去試薬/還元剤の様々な混合物で粉末コーティングされた(表1)。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれた。粉末コーティングされたフィルムは、7.62cm×10.16cm(3インチ×4インチ)の矩形に切断され、接着剤でコーティングされたPETの10.16cm×12.7cm(4インチ×5インチ)の断片の中央に配置された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、粉末コーティングされたキャリアフィルムの7.62cm(3インチ)の辺の1つの上の、接着剤コーティングされたフィルムに接着された。125μm(5ミル)PETフィルム(Melanex 454,Tekra,New Berlin,WI)はその後、残っている露出した接着剤へと積層され、剥離ライナーが一方の端部を封止するのを防いでいるパウチが形成された。
75μm(3.0ミル)ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム(Melanex 454,Tekra,New Berlin,WI)は、米国特許第5,409,838号の実施例1に記載される、イソオクチルアクリレート/アクリルアミド感圧接着剤(PSA)でコーティングされた。接着剤は、冷水可溶性ゲル化剤、及び酸素除去試薬/還元剤の様々な混合物で粉末コーティングされた(表1)。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれた。粉末コーティングされたフィルムは、7.62cm×10.16cm(3インチ×4インチ)の矩形に切断され、接着剤でコーティングされたPETの10.16cm×12.7cm(4インチ×5インチ)の断片の中央に配置された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、粉末コーティングされたキャリアフィルムの7.62cm(3インチ)の辺の1つの上の、接着剤コーティングされたフィルムに接着された。2つの構成体が、このような方法で作製され、粉末コーティングされたキャリアフィルムが向かい合って重複し、接着された剥離ライナーも同様に重複するようにして、互いに積層された(図5参照)。
構成体の1つ目は、75μm(3.0ミル)ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム(Melanex 454,Tekra,New Berlin,WI)を、米国特許第5,409,838号の実施例1に記載される、イソオクチルアクリレート/アクリルアミド感圧接着剤(PSA)でコーティングすることによって作製された。接着剤は、冷水可溶性ゲル化剤、及び酸素除去試薬/還元剤の様々な混合物で粉末コーティングされた(表1)。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれた。粉末コーティングされたフィルムは、7.62cm×10.16cm(3インチ×4インチ)の矩形に切断され、接着剤でコーティングされたPETの10.16cm×12.7cm(4インチ×5インチ)の断片の中央に配置された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、粉末コーティングされたキャリアフィルムの7.62cm(3インチ)の辺の1つの上の、接着剤コーティングされたフィルムに接着された。
SRB、Desulfovibrio desulfuricans(ATCC#29577;American Type Culture Collection,Manassas,VA)、及びDesulfovibrio vulgaris(ATCC#29579;American Type Culture Collection,Manassas,VA)のストック培地が、改変された乳酸ナトリウム培地(Yeast Extract 1g(Becton Dickinson Corp,New Franklin,NJ)、MgSO4−7H2O 1g(EMD Millipore,Billerica,MA)、NH4Cl 0.4g(JT Baker,Center Valley,PA)、K2HPO4 0.01g(MP Biochemicals LLC,Solon,OH)、NaCl 5g(EMD Millipore,Billerica,MA)、アスコルビン酸ナトリウム0.1g(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO)、乳酸ナトリウム(60%)4mls(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO)NaOHによりpH〜7.3)(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO)(ブチルゴムストッパー、及びアルミニウムクリンプを使用して、Balch tube内で97%窒素/3%水素雰囲気において、オートクレーブした直後にチューブに入れられた)が増殖及び維持された。培地は、気体入りの1mLシリンジを使用して、改変された乳酸ナトリウム培地のチューブに、1/100に希釈することによって、毎週継代させた。培地は30℃で48時間インキュベートされ、その後5日にわたり、4℃に維持された。6度目の継代の後、培地は破棄されて、冷凍庫から新たに接種された。
実施例1〜5の装置が以下のように接種された。サンプル(5又は10mls)は、これらを直接注いで、又は10mL無菌ピペットを使用して、装置内に配置された。剥離ライナーが取り除かれて、サンプルを増殖ゾーンの上部へと押して空気を排除するために、装置を2枚の平行なプレキシガラスプレートの間で摺動させた。このとき装置の口部で露出したPSAは、シールを形成するために互いに押し付けられ、装置はインキュベーションするために平らに配置された。インキュベーションは、細菌の増殖を可能にする時間、最大10日間、30℃で行われた。コロニーは、細菌硫化水素生成物と、培地中に存在する鉄との組み合わせから沈殿する、不溶性硫化鉄の生成により生じる、小さな黒い斑点として視覚化された。
実施例4の装置は、表1の粉末コーティング混合物1〜9を使用して構成された。実施例6の、Desulfovibrio desulfuricans(ATCC#29577)、及びDesulfovibrio vulgaris(ATCC#29579)のストック培地が、表2に記載の好気性培地内で順次希釈された。5mlsの量の10−6希釈物が接種され、装置は、実施例7に詳述されるようにインキュベートされた。96時間後、装置はSRBの増殖を点検され、結果は表3に報告されている。
実施例4の装置は、表1の粉末コーティング混合物1、及び10〜12を使用して構成された。実施例6の、Desulfovibrio vulgaris(ATCC#29579)のストック培地が、表4に記載の好気性培地内で順次希釈された。5mlsの量の10−5希釈物が接種され、装置は、実施例7に詳述されるようにインキュベートされた。72時間後、装置はSRBの増殖を点検され、結果は表3に報告されている。
実施例3の装置は、図3に示される別のキャリアウェブ形状で構成された。
実施例4の装置は、図3に示される別のキャリアウェブ形状で構成された。
実施例5の装置は、図3に示される別のキャリアウェブ形状で構成された。
実施例5の装置は、表1の粉末コーティング混合物11を使用して構成された。実施例6の、Desulfovibrio vulgaris(ATCC#29579)のストック培地が、リン酸緩衝食塩水(Sigma)内で順次希釈された。5mlsの量の10−5、10−6、及び10−7希釈物が接種され、装置は、実施例7に詳述されるようにインキュベートされた。120時間後、装置はSRBの増殖を点検され、結果は表3に報告されている。
実施例3の装置は、表1の粉末コーティング混合物2を使用して構成された。実施例6の、Desulfovibrio desulfuricans(ATCC#29577)、及びDesulfovibrio vulgaris(ATCC#29579)のストック培地が、表2の好気性培地内で順次希釈された。2、3、4、5mlsの量の10−7希釈物が接種され、装置は、実施例7に詳述されるようにインキュベートされた。72時間後、装置はSRBの増殖を点検され、結果は表5に報告されている。
75μm(3.0ミル)ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム(Melanex 454,Tekra,New Berlin,WI)は、米国特許第5,409,838号の実施例1に記載される、イソオクチルアクリレート/アクリルアミド感圧接着剤(PSA)でコーティングされた。接着剤は、表1の混合物2で粉末コーティングされた。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれた。粉末コーティングしたフィルムは、7.62cm×10.16cm(3インチ×4インチ)矩形に切断された。2つの矩形が、粉末付きの面が向かい合うようにして、両面テープを使用して、7.62cm(3インチ)の一辺に沿って接合された。
75μm(3.0ミル)ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム(Melanex 454,Tekra,New Berlin,WI)は、米国特許番号第5,409,838号の実施例1に記載される、イソオクチルアクリレート/アクリルアミド感圧接着剤(PSA)でコーティングされた。接着剤は、表1の混合物2で粉末コーティングされた。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれた。粉末コーティングしたフィルムは、7.62cm×10.16cm(3インチ×4インチ)矩形に切断された。
比較例1の装置が構成され、実施例6のDesulfovibrio desulfuricans(ATCC#29577)のストック培地に、アスコルビン酸オキシダーゼ(Calzyme Laboratories,San LuisObispo,CA)が追加され、最終的な濃度が4U/mLになるように、表2に記載の好気性培地内で順次希釈された。3mLの10−5、10−6、及び10−7希釈物が、上部フィルムを持ち上げ、下部フィルムの中央にサンプルを分配し、上部フィルムを静かに戻すことによって接種された。プレートは周囲温度で、又は97%のN2 3%のH2の気体でパージした嫌気性チャンバ内で、30℃でインキュベートされた。72時間後、装置はSRBの増殖を点検され、結果は表6に報告されている。
比較例2の装置が構成され、実施例6のDesulfovibrio desulfuricans(ATCC#29577)のストック培地に、アスコルビン酸オキシダーゼ(Calzyme Laboratories,San Luis Obispo,CA)が追加され、最終的な濃度が4U/mLになるように、表2に記載の好気性培地内で順次希釈された。3mlsの量の10−5、10−6、及び10−7希釈物が、上部フィルムを持ち上げ、下部フィルムの中央にサンプルを分配し、上部フィルムを静かに戻すことによって接種された。プレートは周囲温度で、又は97%のN2 3%のH2の気体でパージした嫌気性チャンバ内で、30℃でインキュベートされた。72時間後、装置はSRBの増殖を点検され、結果は表6に報告されている。
実施例3の装置が構成されたが、ただし、バッキングフィルムは、75μm(3ミル)PETの代わりに、48ga PET/98ga WOPP/0.00035インチホイル/2mil Barex(Technipaq,Crystal Lake,IL)であり、粉末コーティング混合物は以下であった;M150 Guar 5g(DuPont Danisco,Copenhagen,Denmark)、Fortefiber HB Ultra 89.3g(Dow Chemical Company,Midland,MI)、FeSO4−7H20 3g(JT Baker,Center Valley,PA)、アスコルビン酸ナトリウム 0.60g(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO)、チオグリコール酸ナトリウム:1.5g(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO)、CaSO4:0.60g(JT Baker,Center Valley,PA)。表1のように、FeSO4−7H2O、及びアスコルビン酸ナトリウムが粉砕された。実施例6の、Desulfovibrio desulfuricans(ATCC#29577)、及びDesulfovibrio vulgaris(ATCC#29579)のストック培地が、以下の好気性培地内で順次希釈された;K2HPO4 0.56g/L(MP Biochemicals LLC,Solon,OH)、KH2PO4 0.11g/L(MP Biochemicals LLC,Solon,OH)、NH4Cl 1.0g/L(JT Baker,Center Valley,PA)、MgSO4−7H2O 3.0g/L(EMD Millipore,Billerica,MA)、60%Na Lactate 4.0mL/L(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO)、Bacto Yeast Extract 1.0g/L(Becton Dickinson Corp,New Franklin,NJ)、Bacto Tryptone 1g/L(Becton Dickinson Corp,New Franklin,NJ)、Resazurin:1mg/L(MP Biochemicals LLC,Solon,OH)、ATCC Vitamin Mix 10mL/L(American Type Culture Collection,Manassas,VA)、ATCC Trace Mineral Mix 10mL/L。pHは、水酸化ナトリウムにより7.3に調節され、フィルター滅菌された。5mlsの量の10−6、及び10−7希釈物が接種され、装置は、実施例7に詳述されるようにインキュベートされた。96時間後、装置はSRBの増殖を点検された。この時点において、両方の株菌は、容易に数えられる単一のコロニーで良好に増殖した。
Claims (5)
- 防水性基部と、前記基部に取り付けられた防水性カバーシートと、それらの間に配置された増殖区画とを含む、本体であって、前記増殖区画が、周辺部と、前記増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを有し、前記周辺部の一部分が、防水性シールによって画定され、前記部分が、前記周辺部の50%超を含む、本体と、
前記増殖区画内で前記基部に接着された、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤と、
前記増殖区画内に配置された、乾燥した粉末である第1酸素除去試薬と、を備え、
前記第1酸素除去試薬が、水性液体で水和された場合に機能する試薬である、装置。 - 前記第1酸素除去試薬、乾燥した第2酸素除去試薬、乾燥した還元試薬、乾燥した栄養素、指示薬、及びこれらの成分のうちのいずれか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される第1乾燥成分が、前記基部に接着されている、請求項1に記載の装置。
- 前記基部は、前記増殖区画の少なくとも一部分において、その上に配置された第1接着剤層を含み、前記第1乾燥成分が、前記増殖区画内で、前記第1接着剤層に接着されている、請求項2に記載の装置。
- 前記第1酸素除去試薬、前記第2酸素除去試薬、前記還元試薬、前記栄養素、前記指示薬、及び前記成分のうちのいずれか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される第2乾燥成分が、前記カバーシートに接着されている、請求項2に記載の装置。
- 前記カバーシートが、前記増殖区画の少なくとも一部分において、その上に配置された、第2接着剤層を備え、
前記第2乾燥成分が、前記増殖区画内で、前記第2接着剤層に接着されている、請求項4に記載の装置。
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