JP6722687B2 - 微生物を増殖又は貯蔵するためのデバイス及びキット、並びにその製造及び使用方法 - Google Patents
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Description
明細書及び特許請求の範囲の全体を通して特定の用語が使用されており、大部分は周知であるが、いくらか説明を必要とするものもある。本明細書で使用されるとき、以下のとおりであると理解すべきである。
特に記載のない限り、実施例及び本明細書の残りの部分における全ての部、百分率、及び比率などは、重量による。特に記載のない限り、全ての化学物質は、Sigma−Aldrich Chemical Company(St.Louis,MO)などの化学物質供給業者から入手可能である。
図8A〜8Cを参照すると、塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)を含有するイソオクチルアクリレート/アクリルアミド感圧性接着剤(PSA)14、24がコーティングされた1.6milの2軸配向ポリプロピレン(BOPP)フィルム12、22を、米国特許第5,409,838号の実施例1に記載のように作製した。直径6cmの円を取り除いたシリコーンコート紙剥離ライナー(例えば、D#63 BL KFT H/O 548440/000;Loprex GmbH(Stuttgart,Germany))を使用して、それぞれ第1層12及び第2層22のシート上の接着剤14、24を覆った。露出した接着剤に、粘土(例えば、LAPONITE EP、BYK Additives Inc.(Gonzales,TX))16、26を粉末コーティングした。粉末を均一に塗布し、余分な粉末を、フィルムを手で振盪することによって接着剤層から除去し、続いて剥離ライナーを除去した。図8Aのデバイスに関しては、それ以上何も行わなかった。8Bのデバイスでは、直径61mmの円形開口部を有する発泡体スペーサ(ポリスチレンフォーム;幅76mm×長さ102mm×厚さ0.57mm)18を、第1層12の接着剤コーティング側に接着積層し、8Cのデバイスでは、直径61mmの円形開口部を有する新しいシリコーンコート紙剥離ライナー(例えば、D#63 BL KFT H/O 548440/000;Loprex GmbH(Stuttgart,Germany))13を、剥離側を外にして第1の接着剤被覆層12の上に配置した。上記の構造のそれぞれにおいて、デバイスの縁部に向かう試料の濡れ広がりは、第2のフィルム22上の露出された疎水性接着剤24によって停止され、発泡体ダム18(図8B)又は剥離ライナー13(図8C)によっても停止される。図8Dは、図8A〜8Cと同じフィルム(1.6milのBOPP)12、22及び接着剤(イソオクチルアクリレート/アクリルアミドPSA)14、24を使用して作製した、パターンコーティングされた接着剤層を図示する。次いで、パターンコーティングされた接着剤14、24に、ゲル化剤(LAPONITE EP、BYK Additives Inc.(Gonzales,TX))16、26を粉末コーティングした。接着剤のない領域上の粉末を、ブラシで払い取った。図8Dの構造は、発泡体ダム又は剥離ライナーを用いた複雑な構造を必要としない。
LAPONITEをベースとした培養デバイスを、図8Aのように構築した。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(Xen29、パーキンエルマー)を、37℃で振盪しながらTSB(バクトトリプチックソイブロス、Becton,Dickinson and Company(New Jersey))中で一晩増殖させた。TSBで10倍段階希釈を実施し、各希釈液1mLを、別々のLAPONITEをベースとする培養デバイスに入れた。37℃で24時間のインキュベーション後、細菌によるTTCの還元によって生じる赤色のコロニーは認められなかった。更に詳しく調べると、黄色ブドウ球菌(S. aureus)のコロニーは、小さなクリーム色〜黄色の不規則な円として肉眼で見ることができ、これらはTTCを転換しなかった。実験を、大腸菌(Escherichia coli)ATCC#25922(EZ−CFU,Microbiologics(St.Cloud,Minnesota))増殖を用いて繰り返し、黄色ブドウ球菌(S. auresus)と同様に希釈及び接種し、希釈液に40ug/mLのTTC(Sigma−Aldrich Chemical Company(St.Louis,MO))を添加した。赤色のコロニー(TTC還元)は、この場合も認められず、大腸菌(E.coli)のコロニーを肉眼ではっきりと見ることができた。所要の希釈液におけるコロニー数は、黄色ブドウ球菌(S. aureus)及び大腸菌(E. coli)の両方について、1mLの希釈液を生菌数測定用(Aerobic Count、AC)ペトリフィルム(3M company(St.Paul,MN))に接種することによって得られた数とほぼ同じであった。実施例2は、本開示によるデバイスによって微生物が増殖及び検出され得ることを実証する。
LAPONITEベースの培養デバイスを、多くの種類の市販の粘土(表1)を使用して図8Cのように構築し、本用途に好適な粘土組成物を決定した。各デバイスの上部シートを下部シートから剥がし、1mLのTSB(バクトトリプチックソイブロス、Becton,Dickinson and Company(New Jersey))を下部シートの円の中央にアプライした。次いで、上部シートを下部シートを覆う位置に戻した。湿潤性を評価し、「優良な湿潤性」は、追加の外力、例えば、プラスチック製の延展デバイス(ペトリフィルムカビ・酵母測定用プレートスプレッダー、3M Company(St.Paul,Minnesota))を必要とすることなく、粘土表面を完全に被覆することとして定義した。被覆所要時間は測定しなかったが、速度に注意した。ゲル化時間は、接種したデバイスを5分間静置した後、シートの縁部を持ち上げ、水が粘土領域から流れ出るか否かを確認することによって評価した。「優良なゲル化時間」は、粘土表面から流れる水が認められないこととして定義した。後剥離は、いったん形成されたゲルスラブの一体性を決定するために、調査した。上部シートを再度下部から剥離することによって、粘土表面が目に見えて乱れない場合、その後剥離は優良と定義した。
LAPONITE培養デバイスは、(1)下部フィルム12を疎水性の紙(耐水性ポリマー層でコーティングした漂白クラフト紙)に置き換えたこと、及び(2)粘土粉末コートが16.6重量%の粉末微生物栄養素(好適な配合物は、米国同時係属出願第61/949631号の表7に見ることができる)を含有したこと、を除いて、図8Cのように構築した。大腸菌(Escherichia coli)ATCC #25922(EZ−CFU,Microbiologics(St.Cloud,Minnesota))を、37℃で振盪しながらTSB(バクトトリプチックソイブロス、Becton,Dickinson and Company(New Jersey))中で一晩増殖させた。大腸菌(E. coli)の10倍段階希釈を、バターフィールド緩衝液(3M Company(St.Paul,MN))の9mL管で実施し、そこに40ug/mLの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−gal,Sigma−Aldrich Chemical Company(St.Louis,MO))を添加した。各希釈液1mLをLAPONITEデバイスに接種し、1mLを従来の生菌数測定用(AC)PETRIFILM(3M Company(St.Paul,MN))に接種し、37℃で24時間インキュベートした。コロニーは淡青〜暗青色の斑点(X−gal転換の代謝産物)としてはっきりと見ることができ、所与の希釈液のコロニー数は、LAPONITEデバイスとAC PETRIFILMとの間でほぼ同じであった。次いで、上記の実験を、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)株15981(Valle J et al. Mol Microbiol.2003 May;48(4)1075−87)を使用し、X−galを100ug/mLの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−アセテート(Biosynth(Staad,Switzerland))で置き換えたことを除いて、まったく同様に繰り返した。上記のように、コロニーは淡青〜暗青色の斑点としてはっきりと見ることができ、所与の希釈液のコロニー数は、LAPONITEデバイスとAC PETRIFILMとの間でほぼ同じであった。
LAPONITE培養デバイスは、粉末微生物栄養素を添加せずに、実施例4のように構築した。大腸菌(Escherichia coli)ATCC #25922(EZ−CFU,Microbiologics(St.Cloud,Minnesota))を、37℃で振盪しながらTSB(バクトトリプチックソイブロス、Becton,Dickinson and Company(New Jersey))中で一晩増殖させた。大腸菌(E. coli)の10倍段階希釈を、大腸菌(E. Coli)用蛍光指示薬(4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルクロニド、濃度は機密)を含有する細菌用培地であるColilert(IDEXX laboratories(Westbrook,Maine))で実施した。各希釈液1mLをLAPONITEデバイスに接種し、約14時間後、実体顕微鏡(Zeiss Luminar.V12にAxiocam MRc5を使用)を365nmの励起線及び400nmのロングパスフィルタ−と共に使用してプレートを画像化した。コロニーは、大量の蛍光が中心に隔離された個別のゾーンとして見ることができた。4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルクロニドの細菌転換の蛍光生成物(4−メチルウンベリフェロン)は、可溶性であり、プレート全体に自由に拡散することから、明白に画定された中心を有する個別の蛍光ゾーンが可視化されたことは、意外であった。
天然ガムは、製造物品を滅菌するために必要なレベルの電離放射線(例えば、ガンマ線又は電子線[電子ビーム])に曝露すると分解することが知られている。照射された天然ガムは、鎖切断を起こし、水和したときに所与の粘土のゲルを形成する能力を失う。粘土は、他方、電離放射線に非常に耐性があることが知られている。培養デバイスを、実施例5のように構築し、ホイルパウチに封入して、ガンマ線(10、20、30、40、及び50kgy)に曝露した。大腸菌(Escherichia coli)ATCC #25922(EZ−CFU,Microbiologics(St.Cloud,Minnesota))を、37℃で振盪しながらTSB(バクトトリプチックソイブロス、Becton,Dickinson and Company(New Jersey))中で一晩増殖させた。大腸菌(E. coli)の10倍段階希釈を、TSB(バクトトリプチックソイブロス、Becton,Dickinson and Company(New Jersey))の9mL管で実施し、そこに100ug/mLの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロニド(X−glus(Staad,Switzerland))を添加した。各希釈液1mLをLAPONITEデバイスに接種し、1mLを従来の生菌数測定用(AC)PETRIFILM(3M Company(St.Paul,MN))に接種し、37℃で24時間インキュベートした。コロニーは淡青〜暗青色の斑点(X−gal転換の代謝産物)としてはっきりと見ることができ、所与の希釈液のコロニー数は、LAPONITEデバイスとAC PETRIFILMとの間でほぼ同じであった。LAPONITEベースの培養デバイスのゲル化は、50kgy以下のガンマ線量によって影響を受けなかった。
コーティング後に接着剤が1.59mg/in2を含有するように、大量のTTCを添加したことを除き、米国特許第5,409,838号の実施例1のように、疎水性の紙(耐水性ポリマー層がコーティングされた漂白クラフト紙)を塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)を含有するイソオクチルアクリレート/アクリルアミド感圧性接着剤(PSA)でコーティングすることによって、下部フィルムを作製した。下部フィルムを、次に、グアーガム(Sigma Aldrich(St.Louis,MO))と16.6重量%の粉末微生物栄養素(好適な配合物は、米国同時係属出願第61/949631号の表7に見ることができる)との混合物でコーティングした。粉末コーティングの前に、接着剤上にマスクを置かなかった。上部フィルムを、図8A〜Cの上部フィルムのように構築し、100%のLAPONITE EP(BYK Additives(Wesel,Germany))でコーティングした。粉末コーティングの前に、接着剤上にマスクを置かなかった。この構造では、下部フィルムにコーティングされたグアーが、試料を培養デバイス内に維持するのに十分なほど試料濡れ広がりを遅くすることから、円内の粉末コーティングと接着剤をマスクする必要はない。大腸菌(Escherichia coli)ATCC #25922及び黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC #25923(EZ−CFU,Microbiologics(St.Cloud,Minnesota))を、37℃で振盪しながらTSB(バクトトリプチックソイブロス、Becton,Dickinson and Company(New Jersey))中で一晩増殖させた。各生物の10倍段階希釈を、バターフィールド緩衝液(3M Company(St.Paul,MN))の9mL管で実施し、各希釈液1mLをLAPONITEデバイスに接種し、上部フィルムを単純に閉じ、スプレッダーは使用しなかった。比較のため、複製試料を、生菌数測定用(AC)PETRIFILM(3M Company(St.Paul,MN))に接種した。プレートを、37℃で24時間培養した。高レベルのTTCを用いたLAPONITEデバイスで得られたコロニー数は、生菌数測定用(AC)PETRIFILM(3M Company(St.Paul,MN))のコロニー数とほぼ同じであった。図7は、ヘクトライト粘土がTTCを吸収し、そのため、高濃度のTTCを、微生物に有害又は致死的となると一般的に考えられる濃度で指示薬として使用できるという驚くべき結果を示す。
Claims (13)
- 微生物の増殖又は貯蔵のためのデバイスであって、
a)第1層の表面の第1部分を含む第1層であって、前記部分に第1の粘土を含む第1の水膨潤性ゲル化剤が固着されており、前記第1の粘土は未変性ヘクトライト、有機変性ヘクトライト、又はこれらの組み合わせを含む、第1層と、
b)前記第1層から分離可能であり、第2層の表面の第1部分を含む、第2層であって、前記部分に第2の水膨潤性ゲル化剤が固着されている、第2層と、を含む、デバイス。 - 前記第1層が、前記表面の第2部分を更に含み、前記第1層の前記第2部分が、第1層、接着剤、剥離ライナー、ダム、又はこれらの組み合わせを含む、請求項1に記載のデバイス。
- 前記第2の水膨潤性ゲル化剤が第2の粘土を含む、請求項1又は請求項2に記載のデバイス。
- 前記第1の粘土が、少なくとも1種の小板形状を備える、請求項1〜3のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記第1の水膨潤性ゲル化剤が接着剤によって前記第1層に固着され、前記接着剤は前記第1層の表面の第1部分のみに配置されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記第1の粘土が、有機変性ヘクトライトを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のデバイス。
- 第1層、第2層、又はその両方の上に配置された指示薬を更に含み、上記指示薬が、塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)を少なくとも0.5mg/cm2の量で含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のデバイス。
- 微生物の増殖又は貯蔵のためのデバイスを製造する方法であって、
表面を備える第1層を提供する工程と、
第1の粘土を含む第1の水膨潤性ゲル化剤を前記第1層の表面の第1部分に固着する工程と、
表面を備える第2層を提供する工程と、
第2の水膨潤性ゲル化剤を前記第2層の表面の第1部分に固着する工程と、
前記第1層を前記第2層に積層する工程と、を含み、前記第1の水膨潤性ゲル化剤は、少なくとも部分的に前記第2の水膨潤性ゲル化剤と接触し、
前記第1の粘土は未変性ヘクトライト、有機変性ヘクトライト、又はこれらの組み合わせを含む、方法。 - 前記第1の水膨潤性ゲル化剤を前記第1層に固着する工程が、接着剤の層を前記第1層の表面上に配置することと、前記第1の粘土より疎水性の高い材料を前記第1層の第2部分を覆って配置することと、前記接着剤層を前記第1の水膨潤性ゲル化剤でコーティングすることと、を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記第1の水膨潤性ゲル化剤を前記第1層に固着する工程が、接着剤の層を前記第1層の表面の前記第1部分上に配置することと、前記接着剤層を前記第1の水膨潤性ゲル化剤でコーティングすることと、を含み、
前記第1層の表面の第2部分上に配置された前記第1の水膨潤性ゲル化剤のうちの少なくともいくらかを除去する工程を更に含む、請求項8に記載の方法。 - 前記デバイスを除染又は滅菌する工程を更に含み、前記除染又は滅菌する工程が、10kgy〜50kgyの線量の電離放射線への曝露を含む、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中の少なくとも1種の微生物を検出及び計数する方法であって、
請求項1〜7のいずれか一項に記載のデバイスを提供する工程と、
前記第1層を前記第2層から分離する工程と、
少なくとも1種の微生物を含有する試料のアリコートを前記第1の水膨潤性ゲル化剤又は前記第2の水膨潤性ゲル化剤に添加して、接種されたデバイスを形成する工程と、
前記第1層を前記第2層に再度積層する工程と、
前記接種されたデバイスをインキュベートする工程と、を含む、方法。 - 前記アリコートの添加後、前記第1層を前記第2層に再度積層する前に、前記第1のゲル化剤が混合されない、請求項12に記載の方法。
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