MX2013013255A - Articulos de deteccion de salmonella y metodos de uso. - Google Patents
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Abstract
Se proporciona un artículo para detectar microorganismos Salmonella. El artículo comprende un medio nutritivo, altamente selectivo y una pluralidad de sistemas indicadores. Se proporciona también un método de uso del artículo para detectar los microorganismos Salmonella.
Description
ARTICULOS DE DETECCION DE SALMONELLA Y METODOS DE USO
Antecedentes de la Invención
Los microorganismos Salmonella son un agente causal significativo de enfermedades llevadas por los alimentos. Estos microorganismos pueden ser encontrados en carnes no cocidas, vegetales, alimentos lácteos y procesados, tales como crema de cacahuate. Una infección por salmonella puede dar como resultado síntomas de enterocolitis tales como fiebre, dolor abdominal y diarrea, así como nausea ocasional y vómito. Las instalaciones grandes para la fabricación de alimento son fuentes de productos alimenticios contaminados que pueden ser distribuidos a grandes números de consumidores, muchos de quienes pueden llegar a infectarse con las - bacterias .
Breve Descripción de la Invención
En general, la invención se refiere a un artículo, un sistema y un método para detectar un microorganismo. En particular, el sistema y el método pueden ser utilizados para detectar microorganismos que pertenecen al género Salmonella . El artículo de la invención incluye un medio nutritivo y una combinación altamente selectiva de agentes que previenen sustancialmente el crecimiento de la mayoría de los microorganismos al tiempo que permiten el crecimiento de los microorganismos Salmonella . El artículo incluye además hasta
Ref. 244908
tres sistemas indicadores, sirviendo cada sistema indicador una función única para indicar la posible presencia del microorganismo Salmonella . Cuando el artículo de la invención indica la posible presencia de un microorganismo Salmonella, un cuarto sistema indicador único puede ser utilizado además para indicar la presencia de un microorganismo Salmonella. Ventajosamente, el sistema y el método pueden ser utilizados para indicar la presencia de un microorganismo Salmonella dentro de varias horas después de que es iniciado el método.
En un aspecto, la presente descripción proporciona un dispositivo de cultivo para detectar un microorganismo objetivo. El dispositivo de cultivo puede comprender un medio de crecimiento selectivo que incluye nutrientes para facilitar el crecimiento del microorganismo objetivo y una pluralidad de agentes selectivos que incluye Cefsulodina, Ácido Nalidíxico, Estreptomicina, Meticilina y sales biliares. El dispositivo de cultivo puede comprender además un primer sistema indicador diferencial y un agente de gelificación.
En cualquier modalidad, el dispositivo de cultivo puede comprender además un sistema indicador no diferencial para indicar la presencia del microorganismo objetivo. En cualquiera de las modalidades anteriores, el primer sistema indicador diferencial puede comprender un indicador de pH. En cualquiera de las modalidades anteriores, el dispositivo de
cultivo puede comprender además un segundo sistema indicador diferencial para indicar la presencia de un microorganismo no objetivo. En cualquiera de las modalidades anteriores, el segundo indicador diferencial puede comprender un substrato cromogénico de enzima ß-galactosidasa . En cualquiera de las modalidades anteriores, el medio de crecimiento selectivo puede comprender un medio de crecimiento selectivo, rehidratable , seco, en donde el agente de gelificación comprende un agente de gelificación soluble en agua, frío, seco. En cualquiera de las modalidades anteriores, el dispositivo de cultivo puede ser un dispositivo de cultivo de película delgada.
En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un método de detección de un microorganismo Salmonella . El método puede comprender la provisión de una muestra líquida, cualquiera de los dispositivos de cultivo • anteriores, y un tercer sistema indicador diferencial. El método puede comprender además poner en contacto un volumen predefinido de la muestra, en el dispositivo de cultivo, con el medio de crecimiento selectivo; el primer sistema indicador; el sistema indicador no diferencial, si está presente; el sistema segundo indicador, si está presente; y el agente de gelificación para formar un dispositivo de cultivo inoculado. El método puede comprender además la incubación del dispositivo de cultivo inoculado para un
primer periodo de tiempo; la observación del medio de crecimiento para detectar una indicación de una posible presencia en la muestra del microorganismo objetivo; cuando existe una indicación de la posible presencia del microorganismo objetivo, poner en contacto el tercer sistema indicador diferencial con el medio de crecimiento hidratado; y observar el tercer sistema indicador diferencial en el medio de crecimiento hidratado para una indicación de la presencia del microorganismo objetivo.
En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un método para la detección de microorganismo
Salmonella . El método puede comprender la provisión de una muestra, cualquiera de los dispositivos de cultivo de película delgada, anteriormente mencionados, y un tercer sistema indicador diferencial. El método puede comprender además, en el dispositivo de cultivo, poner en contacto un volumen predefinido de un líquido acuoso libre de Salmonella. con el medio de crecimiento selectivo el primer sistema indicador diferencial; el sistema indicador no diferencial, si está presente; el segundo sistema indicador diferencial, si está presente; y el agente de gelificación para formar un medio de crecimiento hidratado. El método puede comprender además la inoculación del medio de crecimiento hidratado con la muestra para formar un dispositivo de cultivo inoculado; la incubación del dispositivo de cultivo inoculado por un
primer periodo de tiempo; la observación del medio de crecimiento hidratado para detectar una indicación de una posible presencia en la muestra del microorganismo objetivo; cuando existe una indicación de la posible presencia del microorganismo objetivo, poner en contacto el tercer sistema indicador diferencial con el medio de crecimiento hidratado; y observar el tercer sistema indicador diferencial en el medio de crecimiento hidratado para una indicación en la presencia del microorganismo objetivo.
En cualquiera de las modalidades anteriores del método, la detección de una indicación de la posible presencia del microorganismo objetivo puede comprender además observar una colonia que reacciona con el sistema indicador no diferencial y el primer sistema indicador diferencial pero no reacciona con el segundo sistema indicador diferencial. En
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cualquiera de las modalidades anteriores, después el contacto del. segundo componente con el medio de crecimiento hidratado, el método puede comprender además incubar el dispositivo de cultivo por un segundo periodo de tiempo. En cualquiera de las modalidades anteriores de método, la incubación del dispositivo de cultivo inoculado por un primer periodo de tiempo puede comprender incubar el dispositivo de cultivo inoculado por aproximadamente 0.5 horas hasta aproximadamente 24 horas. En cualquiera de las modalidades anteriores del método, la incubación del dispositivo de cultivo inoculado
por un segundo periodo de tiempo puede comprender la incubación del dispositivo de cultivo inoculado por aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 360 minutos.
En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un sistema para detectar un microorganismo salmonella. El sistema puede comprender un dispositivo de cultivo que comprende un medio nutritivo que es altamente selectivo para los microorganismos Salmonella y al menos dos sistemas indicadores diferenciales, en donde un primer sistema indicador diferencial es un indicador positivo del microorganismo Salmonella, y un segundo sistema indicador diferencial es un indicador negativo del microorganismo salmonella. El sistema puede comprender además un artículo de detección que comprende un tercer sistema indicador diferencial, en donde el tercer sistema indicador diferencial es un indicador positivo del microorganismo Salmonella .
En cualquier modalidad del sistema, cada uno del segundo y tercer sistemas indicadores diferenciales, puede comprender un sustrato enzimático cromogénico, en donde cada substrato enzimático cromogénico comprende un componente carbohidrato y un cromóforo. En cualquier modalidad del sistema, cada uno del segundo y tercer sistemas indicadores diferenciales puede comprender el mismo cromóforo. En cualquier modalidad del sistema, el segundo sistema indicador diferencial puede comprender un indicador cromogénico de la
actividad de la enzima ß-galactosidasa . En cualquier modalidad del sistema, el tercer sistema indicador diferencial comprende un indicador cromogénico de la actividad de la enzima a-galactosidasa .
Las palabras "preferido" y "preferentemente" se refieren a las modalidades de la invención que pueden proporcionar ciertos beneficios, bajo ciertas circunstancias. No obstante, otras modalidades pueden también ser preferidas, bajo las mismas u otras circunstancias. Además, la indicación de una o más modalidades preferidas no implica que otras modalidades no sean útiles, y no se pretende excluir otras modalidades del alcance de la invención.
El término "sistema indicador diferencial", como se utiliza en la presente, se refiere a un sistema indicador general tal como un colorante indicador, por ejemplo, que no distingue diferentes tipos de microorganismos.
El término "sistema indicador diferencial" como se utiliza en la presente, se refiere a un sistema indicador que distingue entre dos o más tipos de microorganismos. En algunas modalidades, un sistema indicador diferencial puede comprender, por ejemplo, un carbohidrato y un indicador de pH, en donde el sistema puede distinguir entre los microorganismos que fermentan el carbohidrato a productos finales ácidos y los microorganismos que no fermentan el carbohidrato a productos finales ácidos. En algunas
modalidades, un sistema indicador diferencial puede comprender un sustrato enzimático cromogénico o fluorogénico, en donde el sistema puede distinguir entre los microorganismos que comprenden una enzima para reaccionar con 5 el sustrato enzimático y los microorganismos que no comprenden una enzima para reaccionar con el sustrato enzimático .
Los términos "comprende" y variaciones de los mismos no tienen un significado limitante donde estos 10 términos aparezcan en la descripción y las reivindicaciones.
Como se utiliza en la presente, "un", "uno", "una", "el", "la", "las" "al menos uno", y "uno o más" son utilizados intercambiablemente. De este modo, por ejemplo, un microorganismo puede ser interpretado para dar a entender ^ "uno o más microorganismos.
El término "y/o" significa uno o todos los elementos, listados o una combinación de cualesquiera dos o más de los elementos listados.
También en la presente, las indicaciones de los ^ intervalos numéricos por puntos finales incluyen todos los números incluidos dentro de este intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5, etc.).
La breve descripción de la presente invención no está destinada a describir cada modalidad escrita o cada implementación de la presente invención. La descripción que
sigue ejemplifica más particularmente las modalidades ilustrativas. En varios sitios a todo lo largo de la solicitud, se proporciona la guía a través de listas de ejemplos, cuyos ejemplos pueden ser utilizados en diversas combinaciones. En cada caso, la lista indicada sirve únicamente como un grupo representativo, y no debe ser interpretada como una lista exclusiva.
Los detalles adicionales de estas y otras modalidades se describen en las Figuras anexas y la descripción siguiente. Otras características, objetivos y ventajas se volverán aparentes a partir de la descripción y las figuras, y a partir de las reivindicaciones.
Breve Descripción de las Figuras
La Figura 1 es una vista superior en perspectiva de una modalidad de un dispositivo de cultivo para detectar los microorganismos Salmonella de acuerdo a la presente descripción.
La Figura 2 es una vista superior del dispositivo de cultivo de la Figura 1, que muestra el dispositivo de cultivo en una posición "abierta" para inocular el
r *
dispositivo .
Descripción Detallada de la Invención
Los métodos actuales para detectar los microorganismos Salmonella en muestras de alimentos incluyen el uso de un procedimiento de enriquecimiento selectivo para
incrementar el número y/o la concentración de microorganismos objetivo (Salmonella) , con relación a los microorganismos no objetivo, (por ejemplo, En erojbacteriaceae no Salmonella: Citrobacter, E. coli, Proteus/Morganella/Providencia, no-Enterobactericeae : Aeromonas, etc. Después del procedimiento de enriquecimiento, el cual típicamente dura de 16 a 48 horas, el cultivo resultante puede ser probado para la presencia de los microorganismos Salmonella mediante una variedad de técnicas que son conocidas en la materia tales como, por ejemplo, técnicas de siembra en placa, técnicas de inmunodiagnóstico (por ejemplo, ELISA, inmunocromatografía) , y técnicas genéticas (por ejemplo, Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR por sus siglas en Inglés) , Reacción en Cadena de Polimerasa de Fase Inversa (rt-PCR, por sus siglas en Inglés) , y técnicas de hibridación) . Cada una de las técnicas requiere tiempo adicional para identificar a los microorganismos Salmonella, requieren operadores altamente entrenados para llevar a cabo las técnicas y/o para interpretar los resultados, y frecuentemente requieren reactivos, dispositivos y/o equipo costosos.
La presente descripción proporciona un dispositivo de cultivo para detectar los microorganismos Salmonella . La Figura 1 muestra una vista superior en perspectiva de una modalidad de un dispositivo de cultivo 110 parcialmente abierto, de acuerdo a la presente descripción. El dispositivo
de cultivo 110 es similar en construcción a los dispositivos de cultivos de película seca descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,565,783, la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.
El dispositivo de cultivo 110 comprende un substrato pobre en agua de autosoporte 112 y una lámina de cubierta 124. En una posición cerrada, la lámina de cubierta 124 yace adyacente al sustrato 112.
El sustrato 112 es preferentemente una película relativamente rígida de un material tal como poliéster, polipropileno o poliestireno, el cual no absorberá o de otro modo no será afectado por el agua. Las películas de poliéster de espesor de aproximadamente 101.6 micrómetros (0.004 pulgadas) hasta 177.8 µt (0.007 pulgadas) de espesor, películas de polipropileno de aproximadamente 101.6 micrómetros (0.004 pulgadas) hasta 203.2 micrómetros (0.008 pulgadas) de espesor, y películas de poliestireno de aproximadamente 0.381 micrómetros (0.015 pulgada) de espesor se ha encontrado que funcionan bien. Otros sustratos adecuados incluyen un papel con un recubrimiento de polietileno u otro recubrimiento a prueba de agua. El sustrato 12 puede ser ya sea transparente u opaco, dependiendo de si se desea observar o no las colonias bacterianas a través del sustrato. Para facilitar el conteo de las colonias bacterianas, el sustrato 12 tiene
preferentemente un patrón cuadriculado impreso sobre el mismo.
El sustrato 12 está recubierto sobre su superficie superior con una capa de un adhesivo 116 que sirve para retener el polvo 114, el cual comprende un agente de gelificación seco y/o nutrientes en una monocapa uniforme para la hidratación fácil. El adhesivo 116 debe ser insoluble en agua y no inhibitorio para el crecimiento de los microorganismos. Preferentemente, el adhesivo 116 es suficientemente transparente cuando está húmedo para hacer posible la observación de las colonias bacterianas a través de la película recubierta con el adhesivo 116. Se prefiere que el adhesivo 116 sea sensible a la presión. No obstante, los aditivos controlados por calor en donde una sustancia de más bajo punto de fusión es recubierta sobre una sustancia de más alto punto de fusión, pueden ser también utilizados.
Los adhesivos activados por agua tales como el mucílago pueden ser también útiles. El adhesivo 116 debe ser recubierto sobre el sustrato 112 en un espesor que es preferentemente menor que el diámetro de las partículas del agente de gelificación en polvo y/o los nutrientes. El objetivo es aplicar suficiente adhesivo 116 para adherir las partículas al sustrato, pero no tanto que las partículas se lleguen a incrustar completamente en el adhesivo 116.
Una monocapa uniforme de polvo 114 es deseada con
suficiente área superficial expuesta para la hidratación. En general, una capa adhesiva en el intervalo de espesor de 5.08 micrometros (0.002 pulgadas) hasta 7.7 micrometros (0.005 pulgadas) es adecuado. Un adhesivo preferido 116 es un copolímero de acrilato de isooctilo/acrilamida (en una proporción molar de 94/6) . Otros adhesivos sensibles a la presión que pueden ser utilizados incluyen el acrilato de isooctilo/ácido acrílico (en una proporción molar de 95/5 a 94/6) y caucho de silicona. Los adhesivos que se vuelven lechosos después de la exposición al agua son menos preferidos, pero pueden ser utilizados en conjunto con un sustrato no transparente o donde no se requiere la visualización de las colonias.
Una monocapa de polvo soluble en agua fría 114 es adherida uniformemente a la capa adhesiva 116. El polvo 114 comprende al menos un ingrediente seleccionado del grupo que consiste de un agente de gelificación, uno o más nutrientes para desarrollar los microorganismos, y una mezcla de un agente de gelificación y uno o más nutrientes para desarrollar los microorganismos. Como se utiliza en la descripción y en las reivindicaciones, el término "polvo" designa un material en partículas finamente divididas que tiene un diámetro promedio de menos de 400 micrometros. Como se utiliza en la descripción en las reivindicaciones, el término "soluble en agua fría" designa un material que forma
una solución en agua a temperatura ambiente.
La "solubilidad en agua fría" de los polvos empleados en los dispositivos de la presente invención puede resultar, por ejemplo, de la inclusión en estos polvos de un agente de gelificación apropiado. Los agentes de gelificación adecuados para la inclusión en el polvo 114 incluyen agentes de gelificación naturales y sintéticos que forman soluciones en agua a temperatura ambiente. Los agentes de gelificación tales como hidroxietilcelulosa , carboximetilcelulosa , poliacrilamida , goma de algarrobo y soluciones en forma de algina en agua a temperatura ambiente y son agentes de gelificación apropiados para proporcionar polvos que son "solubles en agua fría" .
Como se indicó, el polvo 114 puede comprender únicamente un agente de gelificación. Donde el dispositivo, como es fabricado, contiene un polvo que comprende únicamente el agente de gelificación, el usuario final agrega sus propios nutrientes especiales "adaptados" para el tipo de microorganismos que él desea desarrollar. Por ejemplo, los nutrientes en polvo seco pueden ser suspendidos en un líquido que se evapora rápidamente tal como etanol o "Freón" . En otros casos, los nutrientes en polvo seco pueden ser suspendidos o disueltos en soluciones acuosas. Una alícuota de líquido es agregada a la superficie del substrato 112 que ha sido recubierta previamente con el adhesivo y el agente de
gelificación. El líquido se deja evaporar, dejando amplios nutrientes junto con el agente de gelificación.
Donde el agente de gelificación es incluido en el polvo 114, una cantidad suficiente del agente de gelificación es adherida al substrato 112, de modo que una cantidad predeterminada de agua o una muestra acuosa, por ejemplo, 1 de 3 mililitros, colocada sobre el sustrato, formará un gel que tiene una viscosidad de aproximadamente 1500 cps o más cuando se mide a 60 rpm con un viscosímetro Brookfield Modelo L VF a 25°C. Los geles de esta viscosidad permitirán el manejo conveniente y el apilamiento, y proporcionarán identificación de las distintas colonias. La mayoría de los casos, 0.025 a 0.050 gramos de goma guar sobre un área superficial de 20.26 era2 (3.14 pulgadas2) proporcionará un gel suficientemente viscoso cuando se hidrate con uno a 3 mililitros de una muestra acuosa. El tamaño de las partículas de polvo puede ser utilizado para controlar el peso del recubrimiento por área unitaria. Por ejemplo, recubrimientos de goma guar de aproximadamente malla 100 hasta un peso de aproximadamente 0.025 gramos/disco de 5 cm (2 pulgada) de diámetro; y un recubrimiento de goma guar de malla 400 hasta un peso de aproximadamente 0.025 gramos/disco de 5 cm (2 pulgadas) de diámetro. Si se requieren cantidades adicionales del agente de gelificación y/o de los nutrientes, la lámina de cubierta 124 de esta modalidad puede también ser
recubierta, como se describe en la presente.
En cualquier modalidad, los dispositivos de cultivo de la presente descripción pueden comprender un indicador no diferencial tal como cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) , por ejemplo. En algunas modalidades, puede ser deseable incorporar un sistema indicador no diferencial dentro del polvo 114. Alternativamente, el sistema indicador no diferencial (por ejemplo, un colorante) puede ser incorporado en el adhesivo 116. Los colorantes adecuados son aquellos que son metabolizados por cualquier microorganismo en crecimiento, y que provocan que las colonias sean coloreadas para una visualización más fácil. Los ejemplos de tales colorantes incluyen cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) , rojo de p-toliltetrazolio, violeta de tetrazolio, azul de veratril-tetrazolio y colorantes relacionados.
1
Para algunos usos puede ser deseable formar un medio lo suficientemente rígido para permitir la inoculación de los microorganismos mediante estrías. Para formar un medio susceptible de soportar estrías, puede ser deseable incluir una pequeña cantidad de agente de reticulación en el polvo 114, donde el polvo 114 incluye un agente de gelificación . Por ejemplo, con la goma guar, los agentes de reticulación tales como tetraborato de potasio, sales de aluminio o de calcio pueden ser agregados en una cantidad de menos de 1.0 % en peso del polvo 114. Se debe ser cuidadoso en seleccionar
un agente de reticulación que no afecte sustancialmente el crecimiento del microorganismo pretendido.
La lámina de cubierta 124 es preferentemente transparente para facilitar la visualización y, opcionalmente , para contar las colonias bacterianas, y es substancialmente impermeable a las bacterias y al vapor de agua. Como se utiliza en la descripción y en las reivindicaciones, "substancialmente impermeable a la bacterias y al vapor de humedad" designa las láminas de cubierta que previenen la contaminación no deseada del medio deshidratado durante el embarque, almacenamiento y uso de los dispositivos, y que proporcionan un ambiente que soportará el crecimiento de los microorganismos durante el periodo de incubación. En general, la lámina de cubierta 124 tendrá las mismas propiedades que el substrato 112, pero no necesitará ser tan rígido. Un material preferido para la lámina de cubierta 124 es una película de polipropileno biaxialmente orientada de 40.64 micrómetros (1.6 milésimas de pulgada). La lámina de cubierta 124 puede ser recubierta con una capa opcional de adhesivo (no mostrada) . En ciertas modalidades preferidas, la lámina de cubierta 124 puede ser adherida al substrato 112 vía una cinta adhesiva de doble lado 126 o un adhesivo sensible a la presión únicamente, por ejemplo.
Recubierto sobre al menos una porción de una superficie de la lámina de cubierta 124 está un revestimiento
120 y que está sustancialmente libre de agua y que consiste esencialmente de un material reconstituible con agua fría, que comprende un componente seleccionado del grupo que consiste de un agente de gelificación, uno o más agentes selectivos, uno o más nutrientes para desarrollar microorganismos, un sistema indicador no diferencial, uno o más sistemas indicadores diferenciales, y una combinación de cualesquiera dos o más de los componentes anteriores. Como se utiliza en la descripción y en las reivindicaciones, la frase "sustancialmente libre de agua" designa un recubrimiento que tiene un contenido de agua no mayor de aproximadamente el contenido de agua del recubrimiento deshidratado, una vez que éste se ha dejado equilibrar con el ambiente circunvecino.
El material empleado de recubrimiento 120 es reconstituible en agua fría. Como se utiliza en la a
descripción y en las reivindicaciones, "reconstituible en agua fría" designa el material que forma una solución, sol o gel en agua a temperatura ambiente. Los agentes de gelificación adecuados para la inclusión en el recubrimiento de esta modalidad (si tales están contenidos en el recubrimiento) incluyen los agentes de gelificación anteriormente descritos que forman soluciones en agua a temperaturas ambientales. Además, se ha encontrado que el agar, después de que éste ha sido disuelto en agua a ebullición y depositado como un recubrimiento, es un material
que es "reconstituible en agua fría" .
Una mezcla de recubrimiento preferida es preparada al mezclar los siguientes ingredientes:
Peptona Proteosa No. 3 50 gramos
Peptona Porcina 14 gramos
Extracto de Levadura 6 gramos
Cloruro de Sodio 10 gramos
Ácido MOPS 3.2 gramos
Sal de sodio de MOPS 5.2 gramos
Rojo de fenol 1.0 gramos
Sales Biliares No. 3 2.0 gramos
5-Bromo-4-Cloro-3-Indoxil^-D-galactopiranósido 0.8 gramos
Guar 13 gramos
Agua Desionizada 1 Litro
Podrá ser apreciado por una persona de experiencia ordinaria en la técnica,, que la mezcla anterior incluye al menos dos agentes selectivos (por ejemplo, cloruro de sodio y sales biliares No. 3) . Podrá ser apreciado además por una persona de experiencia ordinaria en la técnica que la mezcla anterior incluye al menos dos componentes (por ejemplo, rojo de fenol y 5-Bromo-4 -Cloro-3 - Indoxil-P-D-galactopiranósido) que puede funcionar como un indicador diferencial o una porción de un sistema indicador diferencial. Por ejemplo, el rojo de fenol puede ser utilizado en una formulación con un
compuesto metabolizable (por ejemplo, 2-desoxi-D-ribosa o urea) para formar un sistema indicador diferencial para indicar la presencia de un microorganismo tal como un microorganismo Salmonella, por ejemplo. Los microorganismos Salmonella pueden fermentar la 2-desoxi-D-ribosa a sus productos ácidos, con lo cual se produce una zona ácida que puede ser visualmente detectada en presencia de un indicador de pH. Los microorganismos Salmonella pueden reaccionar además con el 5-Bromo-4-Cloro-3-Indoxil-p-D-galactopiranósido para formar colonias de color negro. Los microorganismos No-Salmonella (por ejemplo, microorganismo coliformes) pueden reaccionar con el 5-Bromo-4-Cloro-3-Indoxil^-D-galactopiranósido, formando colonias de color verde azul. Sorprendentemente, aun cuando los sustratos enzimáticos cromogénicos anteriormente mencionados comprenden ambos el mismo cromóforo (5 -Bromo-4 -Cloro-3 -Indoxil- ) , en el artículo de la invención de. la . resente descripción, éstos son hidrolizados por los microorganismos para producir productos coloreados visualmente distintos. Los sistemas indicadores pueden ser incorporados dentro de dispositivos de cultivo en una capa adhesiva, una capa de polvo y/o un recubrimiento rehidratable seco.
Además de los ingredientes selectivos listados en la mezcla anterior, la mezcla de recubrimiento puede comprender además una combinación altamente selectiva de
antibióticos que permiten el crecimiento de los microorganismos Salmonella, al tiempo que previenen sustancialmente el crecimiento de una variedad de otros microorganismos (por ejemplo, no objetivo) . Un ejemplo no limitante de la combinación incluye una mezcla de sal sódica de Cefsulodina (aproximadamente 12 mg/L) , Sal sódica de Ácido Nalidíxico (aproximadamente 4 mg/L) , sal de sulfato de Estreptomicina (aproximadamente 4 mg/L) , y sal de sodio de meticilina (aproximadamente 45 mg/L) .
Con referencia nuevamente a la Figura 1, la lámina de cubierta 124 incluye un elemento espaciador 118 aplicado a la superficie de la lámina de cubierta 124 que enfrenta el sustrato 112. El elemento espaciador 118 incluye un orificio circular 122 cortado a través del centro para exponer el recubrimiento rehidratable seco 120 sobre la lámina de cubierta 124. Las paredes del orificio 122 proporcionan un pozo de tamaño y forma predeterminados para confinar el medio después de la hidratación. El elemento espaciador 118 debe ser lo suficientemente grueso para formar un pozo del volumen deseado, por ejemplo, 1, 2 ó 3 mililitros. La espuma de polietileno de celdas cerradas o la espuma de poliestireno son materiales preferidos para el elemento espaciador 118, pero cualquier material que sea hidrofóbico (no humectante) , inerte para los microorganismos, y capaz de resistir la esterilización, puede ser utilizado.
También mostrada en la Figura 1 está una perforación 120 que atraviesa la lámina de cubierta 124. La perforación 126 facilita la apertura del dispositivo de cultivo 110 y, en algunas modalidades, puede mantener el dispositivo de cultivo 110 abierto, como se muestra en la Figura 2.
La Figura 2 muestra una vista superior de un dispositivo de cultivo 110 abierto de la presente descripción. En la Figura 2 se muestra el substrato 112, la lámina de cubierta 124, el elemento espaciado 118, el orificio 122 y la perforación 126. En esta posición, una muestra líquida (no mostrada) puede ser colocada dentro del substrato 112 o en el pozo formado por el elemento espaciador 118 para inocular la placa.
Un dispositivo de cultivo de película delgada de la presente descripción puede ser utilizado para probar una muestra, para la presencia de un microorganismo Salmonella. Los materiales de muestra incluyen materiales de muestra que son sospechosos de contener un microorganismo Salmonella. El material de muestra puede ser un líquido, un sólido, un sólido suspendido disperso en un líquido, un hidrogel . En cualquiera de las modalidades, la muestra puede comprender microorganismos y/o materiales (por ejemplo, alimentos, bebidas) que han sido sometidos a una o más técnicas de preparación de muestra, incluyendo pero no limitadas a
concentración (por ejemplo, mediante filtración, precipitación, aglomeración, centrifugación, absorción, y/o adsorción) enriquecimiento (por ejemplo, enriquecimiento de crecimiento selectivo) y purificación (por ejemplo, purificación cromatográfica) .
En una modalidad, un volumen predefinido de muestra líquida puede ser puesto en contacto con el recubrimiento sobre la lámina de cubierta y el polvo sobre el substrato para tratar el dispositivo de cultivo y formar un dispositivo de cultivo inoculado. En una modalidad alternativa, los recubrimientos reconstituibles en agua del dispositivo de cultivo pueden ser hidratados con un líquido acuoso (por ejemplo, agua estéril) y la muestra debe ser aplicada (por ejemplo, por pipeta, torunda, bucle) , opcionalmente utilizando la técnica de placa estriada, al dispositivo de cultivo hidratado. Preferentemente, un recubrimiento en el dispositivo de cultivo comprende un primer sistema indicador (por ejemplo, 2-desoxi-D-Ribosa y un indicador de pH tal como rojo de fenol) , un sistema indicador no diferencial (por ejemplo, TTC) y un segundo sistema indicador (por ejemplo 5-bromo-4-cloro-3-indoxi-p-D-galactopiranósido, "X-gal") .
Opcionalmente, el dispositivo de cultivo puede comprender un inductor para una actividad microbiana asociada con uno o más de los sistemas indicadores tales como el isopropil-(3-D-tiogalactósido, un inductor de la actividad de la enzima ß-
galactosidasa . Otro sistema indicador diferencial utilizado para indicar la presencia de un microorganismo Salmonella comprende urea y un indicador de pH tal como rojo de fenol, por ejemplo.
Después de inocular el dispositivo de cultivo, el dispositivo de cultivo puede ser incubado por un periodo de tiempo para facilitar el desarrollo de los microorganismos
Salmonella . Una persona de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá la temperatura óptima para facilitar el crecimiento de la Salmonella . El dispositivo de cultivo puede ser incubado por aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 48 horas, preferentemente a aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 24 horas, más preferentemente 0.5 horas hasta aproximadamente 6 horas .
Después del periodo de incubación, el medio de cultivo inoculado puede ser observado para una indicación de una posible presencia de. un microorganismo Salmonella. Una indicación es la aparición de colonias rojas debido a la formación del colorante de formazán a partir de TTC. Aún más, una zona acida que rodea una colonia rojJa indica q¾ue las bacterias en la colonia fermentaron la 2 -desoxi -D-ribosa a subproductos ácidos, una reacción que puede indicar que la colonia comprende el microorganismo Salmonella . Si la colonia tiene una zona de color azul-verde asociada con una reacción con X-gal, esto indica que la colonia probablemente no es un
microorganismo Salmonella .
La presencia de colonias rojas rodeadas por una zona ácida (por ejemplo, una zona amarilla cuando el indicador de pH es rojo de fenol) sugiere la presencia de un microorganismo Salmonella en el dispositivo de cultivo. Este presunto resultado puede ser además apoyado por la puesta en contacto de otro indicador diferencial (por ejemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indoxi- -D-galactopiranósido) con la colonia. En algunas modalidades, esto puede ser realizado por la apertura de la placa y la aplicación de una solución de 5-bromo-4-cloro-3-indoxi- -D-galactopiranósido al medio de crecimiento. Alternativamente, ésto puede ser realizado por la apertura de la placa y la aplicación de un artículo rehidratable , seco, que comprende un recubrimiento que incluye el 5-bromo-4-cloro-3-indoxi-p-D-galactopiranósido. El artículo puede ser elaborado como se describe en la Patente de los Estados Unidos No .6.022 , 682., la. cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. Este 5-bromo-4-cloro-3-indoxi^-D-galactopiranósido es puesto en contacto con la zona de crecimiento del dispositivo de cultivo por un periodo de tiempo tal como, por ejemplo aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 360 minutos. Opcionalmente , el contacto puede ocurrir a una temperatura elevada (por ejemplo 37 °C) .
Después del contacto del 5-bromo-4-cloro-3-indoxi-ß-D-galactopiranósido con el medio de crecimiento, el
dispositivo de cultivo puede ser observado para un color muy oscuro (por ejemplo casi negro (asociado con las colonias) . Cualquier colonia roja asociada con una zona ácida y un color muy oscuro (por ejemplo, casi negro) a partir de la hidrólisis del 5-bromo-4-cloro-3-indoxi^-D-galactopiranósido es muy probablemente un microorganismo Salmonella .
MODALIDADES
La modalidad 1 es un dispositivo de cultivo para detectar un microorganismo objetivo, que comprende:
un medio de crecimiento selectivo que incluye nutrientes para facilitar el crecimiento del microorganismo objetivo y una pluralidad de agente selectivos que incluyen Cefsulodina, Ácido Nalidíxico, Estreptomicina, Meticilina y sales biliares;
un primer sistema indicador diferencial; y un agente de gelificación;
La modalidad 2 es el dispositivo de. cultivo de la modalidad 1, que comprende además un sistema indicador no diferencial para indicar la presencia del microorganismo obj etivo .
La modalidad 3 es el dispositivo de cultivo de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el primer sistema indicador diferencial comprende un indicador de pH.
La modalidad 3 es el dispositivo de cultivo de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el primer
sistema indicador diferencial que comprende además un segundo sistema indicador diferencial para indicar la presencia de un microorganismo no objetivo.
La modalidad 5 es el dispositivo de cultivo de la modalidad 4, en donde el segundo sistema indicador diferencial comprende un sustrato cromogénico de enzima ß-galactosidasa .
La modalidad 6 es el dispositivo de cultivo de la modalidad 4 o la modalidad 5, que comprende un inductor de actividad de enzima ß-galactosidasa microbiana.
La modalidad 7 es el dispositivo de cultivo de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el medio de crecimiento selectivo comprende un medio de crecimiento selectivo, rehidratable , seco, en donde el agente e gelificación comprende un agente de gelificación soluble en agua, frío, seco.
La modalidad de 8 es el dispositivo de cultivo de la modalidad 7, en donde el dispositivo de cultivo comprende un dispositivo de cultivo de película delgada.
La modalidad 9 es un sistema para detectar un microorganismo Salmonella, que comprende:
un dispositivo de cultivo que comprende un medio nutritivo que es altamente selectivo para los microorganismo Salmonella y al menos dos sistemas indicadores diferenciales, en donde un primer sistema indicador diferencial es un
indicador positivo del microorganismo Salmonella , en donde un segundo sistema indicador diferencial es un indicador negativo del microorganismo; y
un artículo de detección que comprende un tercer sistema indicador diferencial, en donde el tercer sistema indicador diferencial es un indicador positivo del microorganismo Salmonella;
La modalidad 10 es el sistema de la modalidad 9, en donde cada uno del segundo y tercer sistemas indicadores diferenciales comprende un sustrato de enzima cromogénica, en donde cada sustrato de enzima cromogénica, en donde cada sustrato de enzima cromogénica comprende un carbohidrato y un cromóforo .
En donde cada uno del segundo y el tercer sistema indicador diferencial comprende el mismo cromóforo.
La modalidad 12 es el sistema de cualquiera de las modalidades 9 a la 11, en donde el segundo sistema indicador diferencial comprende un indicador cromogénico de actividad de enzima beta-galactosidasa .
La modalidad 13 es el sistema de cualquiera de las modalidades 9 a la 11, en donde el tercer sistema indicador diferencial comprende un indicador cromogénico de la actividad de la enzima ß-galactosidasa .
La modalidad 14 es un método para detectar los microorganismos Salmonella, que comprende:
proporcionar una muestra líquida, el dispositivo de cultivo de cualquiera de las modalidades 1 a la 8, y un tercer sistema indicador diferencial;
poner en contacto un volumen predefinido de la muestra, en el dispositivo de cultivo, con el medio de crecimiento selectivo; el primer sistema indicador; el sistema indicador no diferencial, si está presente; el segundo sistema indicador, si está presente; y el agente de gelificación para formar un dispositivo de cultivo inoculado;
incubar el dispositivo de cultivo inoculado, por un primer periodo de tiempo;
observar el medio de crecimiento inoculado para detectar una indicación de una posible presencia en la muestra del microorganismo objetivo;
cuando existe una indicación de la posible presencia del microorganismo objetivo, se pone en contacto el tercer sistema indicador diferencial con el medio de crecimiento hidratado; y
observar el tercer sistema indicador diferencial en el medio de crecimiento hidratado para una indicación de la presencia del microorganismo objetivo.
La modalidad 15 es un método para detectar los microorganismos Salmonella, que comprende: proporcionar una muestra, el dispositivo de cultivo de la modalidad 8, y un tercer sistema indicador diferencial;
en el dispositivo de cultivo, se pone en contacto un volumen predefinido de un líquido acuoso libre de Salmonella con el dispositivo de cultivo selectivo; el primer dispositivo de cultivo; el sistema indicador no diferencial, si está presente; el segundo sistema indicador diferencial, si está presente; y el agente de gelificación para formar un medio de crecimiento hidratado;
inocular el medio de crecimiento hidratado con la muestra, para formar un dispositivo de cultivo inoculado;
incubar el dispositivo de cultivo inoculado por un primer periodo de tiempo; observar el medio de crecimiento hidratado para detectar una indicación de una posible presencia en la muestra del microorganismo objetivo;
cuando existe una indicación de la posible presencia del microorganismo objetivo, se pone en contacto el tercer sistema indicador diferencial con el medio de crecimiento hidratado; y
observar el tercer sistema indicador diferencial en el medio de crecimiento hidratado para una indicación de la presencia del microorganismo objetivo.
La modalidad 16 es el método de la modalidad 14 o 15, en donde la detección de una indicación de la posible presencia del microorganismo objetivo, comprende además observar una colonia que reacciona con el sistema indicador no diferencial y el primer sistema indicador diferencial,
pero no reacciona con el segundo sistema indicador diferencial .
La modalidad 17 es el método de cualquiera de las modalidades 14 a la 16 en donde, después de poner en contacto el segundo componente con el medio de crecimiento hidratado, el método comprende además incubar el dispositivo de cultivo por un segundo periodo de tiempo.
La modalidad 18 es el método de cualquiera de las modalidades 14 a la 17, en donde la incubación del dispositivo de cultivo inoculado por un primer periodo de tiempo comprende incubar el dispositivo de cultivo inoculado por aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 24 horas.
La modalidad 19 es el método de la modalidad 18 en donde la incubación del dispositivo de cultivo inoculado por primer periodo de tiempo comprende incubar el dispositivo de cultivo inoculado, por aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 6 horas .
La modalidad 20 es el método de cualquiera de las modalidades 14 a la 19, en donde la incubación del dispositivo de cultivo inoculado por un segundo periodo de tiempo comprende incubar el dispositivo de cultivo inoculado, por aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 360 min.
EJEMPLOS
La presente invención no debe ser considerada limitada a los ejemplos particulares descritos más adelante,
sino más bien debe entenderse que cubre todos los aspectos de la invención como se describe claramente en las reivindicación anexas. Diversas modificaciones, procesos equivalentes, así como numerosas estructuras en las cuales puede ser aplicable la presente invención, serán fácilmente aparentes para aquellas personas expertas en la técnica a la cual la presente invención está dirigida, después de la revisión de la presente descripción. A no ser que se establezca de otro modo, todos los porcentajes y partes están en peso. Los materiales, a no ser que se establezca de otro modo son comercialmente disponibles de Alpha Biosciences, Baltimore, MD.
Materiales
Ejemplo 1. Preparación de un artículo de Detección de Salmonella.
Un miembro base para una placa de cultivo de película delgada fue preparado de acuerdo al Ejemplo 4 de la Patente de los Estados Unidos No. 5,409,838 excepto que el adhesivo fue recubierto sobre un papel recubierto con polietileno a prueba de agua que tenía líneas cuadriculadas de 12.7 mm (0.5 pulgadas) sobre éste. Una composición de polvo fue preparada mediante el mezclado de dos partes en peso de 2 -desoxi -D-ribosa (2DR) y 98 % partes de goma guar (M150 guar MEYPROGAT goma, Meyhall Chemical AG) . Una pequeña cantidad (menos de 0.5 %) de sílice (sílice CAB-O-SIL, Cabot
Corp., Boston MA) fue agregada como fuera necesario para el procesamiento. La mezcla de polvo fue luego salpicada sobre el papel recubierto con adhesivo, e inclinada y golpeada ligeramente para eliminar el polvo en exceso.
Una mezcla de caldo fue preparada al agregar los materiales listados en la Tabla 1 a 1 litro de agua desionizada en un recipiente, y mezclada de acuerdo al método descrito en el Ejemplo 1 de la Patente de los Estados Unidos No. 6, 022,682.
Tabla 1
* de Biosynth AG, Switzerland
Una mezcla de agente selectivo fue preparada al agregar 12 mg de sal de sodio de cefsulodina (Research Productos International, Chicago, IL) , 4 mg de la sal sódica del Ácido Nalidíxico (Sigma Aldrich, St . Louis MO) , 4 mg de Sal de sulfato de Estreptomicina (Sigma) , 45 mg de meticilina (Sigma), 0.4 mg de isopropil-B^-galactopiranósido (Sigma), y 2 g de urea (EMD) , a 20 mi de agua desionizada, y se agitó en un matraz de vidrio hasta que se disolvió completamente. El caldo fue enfriado aproximadamente a 40°C y la mezcla fue agregada con agitación vigorosa.
Una película de cubierta y las placas de cultivo de película delgada fueron preparadas como se describe en el Ejemplo VI de la Patente de los Estados Unidos No. 6,022,682 excepto que el caldo selectivo fue recubierto sobre el lado tratado en corona de una película de poliéster de 73.6 um
(2.9 milésimas de pulgada) de espesor para la película de cubierta. Las placas medían aproximadamente 7.6 cm por 10.2 cm con un círculo de 5 cm de diámetro cortado a partir de la espuma para proporcionar un pozo aproximadamente en el centro de la placa.
Ejemplo 2. Método de detección de los Microorganismos Salmonella
Un cultivo puro de bacterias Salmonella (3M Culture Designation FSDCC SAL140 que fue aislado de una mezcla de carne) se inoculó dentro de Agua de Peptona Amortiguada
(Merck Darmstadt, Alemania) y se incubó toda la noche a 37 °C. El caldo resultante tuvo una concentración de aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias/ml (ufc/ml) . El caldo fue diluido en Agua de Peptona Amortiguada Estéril hasta una concentración final de aproximadamente 1 x 106 ufc/ml.
La placa de cultivo de película delgada del Ejemplo 1 fue preparada para estriado por adición de 1.5 mL de Amortiguador de Butterfield aproximadamente a la mitad de la posición del pozo sobre el recubrimiento de polvo. La película de cubierta fue cerrada y la placa fue incubada toda la noche a 37 °C. Las placas fueron analizadas para los conteos de colonias. Puntos rojos que indican las colonias fueron aparentes.
Ejemplo 3. Uso de un Artículo Indicador para Detectar los Microorganismos Salmonella
Un disco descrito en los Ejemplos 1 y 2 de la Patente de los Estados Unidos No. 61/428,722, que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad, es colocado sobre la parte superior de las colonias y el disco es incubado a 37 °C. El disco es examinado para el crecimiento después de 3, 4 y 5 horas.
La descripción completa de todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones, y el material electrónicamente disponible citado en la presente son incorporados por referencia. En el caso de que exista
cualquier inconveniencia entre la descripción de la presente solicitud y la o las descripciones de cualquier documento incorporado en la presente por referencia, gobernará la descripción de la presente solicitud. La descripción detallada anterior y los ejemplos han sido dados para claridad de entendimiento únicamente. No deben entenderse limitaciones innecesarias a partir de la misma. La invención no está limitada a los detalles exactos mostrados y descritos, ya que las variaciones obvias para una persona experta en la técnica serán incluidas dentro de la invención definida por las reivindicaciones.
Todos los encabezados son para la conveniencia del lector y no deben de ser utilizados para limitar el significado del texto que sigue al encabezado, a no ser que así se especifique. Pueden ser realizadas diversas modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Estas y otras modalidades están dentro de alcance de las siguientes reivindicaciones.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la
^ ^
práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (10)
1. Un dispositivo de cultivo para detectar un microorganismo objetivo, caracterizado porque comprende: un medio de crecimiento selectivo que incluye nutrientes para facilitar el crecimiento del microorganismo objetivo, y una pluralidad de agentes selectivos que incluyen cefsulodina, ácido nalidíxico, estreptomicina, meticilina y sales biliares; un primer sistema indicador diferencial; y un agente de gelificación.
2. El dispositivo de cultivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un sistema indicador no diferencial para indicar la presencia del microorganismo objetivo.
3. El dispositivo de cultivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además un segundo sistema indicador diferencial para indicar la presencia de un microorganismo no objetivo.
4. El dispositivo de cultivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de crecimiento selectivo comprende un medio de crecimiento selectivo, rehidratable , seco, en donde el agente de gelificación comprende un agente de gelificación soluble en agua, frío, seco.
5. El dispositivo de cultivo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende un dispositivo de cultivo de película delgada.
6. Un sistema para la detección de un microorganismo Salmonella, caracterizado porque comprende: un dispositivo de cultivo que comprende un medio nutritivo que es altamente selectivo para los microorganismos Salmonella, y al menos dos sistemas indicadores diferenciales, en donde un primer sistema indicador diferencial es un indicador positivo del microorganismo Salmonella, en donde un segundo sistema indicador diferencial es un indicador negativo del microorganismo Salmonella; y un artículo de detección que comprende un tercer sistema indicador diferencial, en donde el tercer sistema indicador diferencial es un indicador positivo del microorganismo Salmonella .
7. Un método para detectar los microorganismos Salmonella, caracterizado porque comprende: proporcionar una muestra líquida, el dispositivo de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un tercer sistema indicador diferencial; poner en contacto un volumen predefinido de la muestra, en el dispositivo de cultivo, con el medio de crecimiento selectivo; el primer sistema indicador; el sistema indicador no diferencial, si está presente; el segundo sistema indicador, si está presente; y el agente de gelificación para formar un dispositivo de cultivo inoculado; incubar el dispositivo de cultivo inoculado, por un primer periodo de tiempo; observar el medio de crecimiento inoculado para detectar una indicación de una posible presencia en la muestra del microorganismo objetivo; cuando existe una indicación de la posible presencia del microorganismo objetivo, se pone en contacto el tercer sistema indicador diferencial con el medio de crecimiento hidratado; y observar el tercer sistema indicador diferencial en el medio de crecimiento hidratado para una indicación de la presencia del microorganismo objetivo.
8. Un método para detectar microorganismos Salmonella, caracterizado porque comprende: proporcionar una muestra, el dispositivo de cultivo de conformidad con la reivindicación 5, y un tercer sistema 1 indicador diferencial; en el dispositivo de cultivo, se pone en contacto un volumen predefinido de un líquido acuoso libre de Salmonella , con el medio de crecimiento selectivo; el primer sistema indicador diferencial; el sistema indicador no diferencial, si está presente; el segundo sistema indicador diferencial, si está presente; y el agente de gelificación para formar un medio de crecimiento hidratado; inocular el medio de crecimiento hidratado con la muestra para formar un dispositivo de cultivo inoculado; incubar el dispositivo de cultivo inoculado, por un primer periodo de tiempo; observar el medio de crecimiento hidratado para detectar una indicación de una posible presencia en la muestra del microorganismo objetivo; cuando existe una indicación de la posible presencia del microorganismo objetivo, se pone en contacto el tercer sistema indicador diferencial con el medio de crecimiento hidratado; y observar el tercer sistema indicador diferencial en el medio de crecimiento hidratado para una indicación de la presencia del microorganismo objetivo.
9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la detección de una indicación de la posible presencia del microorganismo objetivo, que comprende además observar una colonia que reacciona con el sistema indicador no diferencial y el primer sistema indicador diferencial, pero no reacciona con el segundo sistema indicador diferencial .
10. El método de cultivo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque después de poner en contacto el segundo componente con el medio de crecimiento hidratado, y comprende además incubar el dispositivo de cultivo por un segundo periodo de tiempo.
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