DD268000A1 - Verfahren zur bestimmung der aktivitaet kohlenwasserstoffe oxidierender mikroorganismenpopulationen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivitaet von Kohlenwasserstoffe oxidierenden Mikroorganismen mittels Durchflusscytometrie. Erfindungsgemaess erfolgt die Bestimmung an einer Probe der Mikroorganismenpopulation durch Inkubieren einer nicht fluoreszierenden organischen Verbindung mit den Mikroorganismen und Vermessen der dadurch entstandenen fluorochromierten Zellen mittels Scanning-Fluoreszenzmikroskop oder Durchflusscytometer und Auswertung der erhaltenen Histogramme.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Kohlenwasserstoffe oxidierenden Mikroorganismenpopulationen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sicn auf Prozesse der technischen Mikrobiologie, welche Methan und dB«rjen Homologe allein oder zusammen mit anderen Verbindungen für die mikrobielle StoffWandlung einsetzen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Oie Aktivität von Kohlenwasserstoffe oxidierenden Mikroorganismen wird entweder mit Hilfe der Bestimmung von Parametern des mikrobiellen Wachstums, wie spezifische Wachstumsgeschwindigkeit, spezifischer Substratverbrauch oder spezifische Produktbildungsrate bestimmt. Solche Best.immungsmethoden sind inbezug auf die Bestimmung der Aktivität der Mikroorganismen zur Oxidation von Kohlenwasserstoffen als indirekte Methoden zu bezeichnen. Ihre Aussagefähigkeit wurde bereits in der Literatur kritisiert (HUMPHREY, A. Process Biochem. 12 (1972) 19). Andererseits ist es möglich aus Homogenaten der Mikroorganismenpopulation eine enzymatische Aktivität zum Beispiel die der Monooxigenase zu bestimmen (DALTON, H. Adv. Appl. Microbiol. 26 (1980) 71). Diesem Verfahren haftet der Mangel an, daß die an der Population gemessenen Mittelwerte zur Beurteilung dos Zustandes der Population selbst herangezogen werden. Solche Mittelwerte sind aber mehrdeutig gegenüber der Population und haben deshalb eine sehr eingeschränkte Aussagefähigkeit (BAILEY, J.E. et al. Ann. N.Y. Acad. Sei. 326 (1979) 7). Eine eindeutige Methode zur Bestimmung der Aktivität von Kohlenwasserstoffe oxidierenden Mikroorganismenpopulationen ist bisher noch nicht bekannt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, eine Methode zu finden, die eine eindeutige Bestimmung der Aktivität von Mikroorganismenpopulationen, die Kohlenwasserstoffe oxidieren, gestattet.

Wesen eier Erfindung

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, geeignete Reagentien zu finden, die spezifisch auf die Aktivität der Kohlenwasserstoffoxidation ansprechen und eine eindeutige Aktivitätsbestimmung ermöglichen. ErfindungsgemäQ wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß nichtfluoreszierends organische Verbindungen, die ein^n P/ridin- beziehungsweise einen Pyranring enthalten, der partiell hydriert sein kann und weitere aromatische Ringe anelliert oder substituiert enthält sowie reaktive oder polare Gruppen tragen, die unlösliche Salze oder Kupplungsprodukte bilden können, verwendet werden.

_#Oie Aktivitätsbystimmung wird an Pop'Jlationsprwben vorgenommen, die dem Prozeß entnommen und aus dem Medium mechanisch separiert wurden. Die in Pufferlösung resuspendierten Mikroorganismen wercian mit der nichtfluoreszierenden organischen Verbindung bei 30 - AO⁰C inkubiert und das gebildete Fluorochrom in den Zellen deren ionischo Zusätze als Salz oder durch Kupplungareaktionen mit den reaktiven Gruppen fixiert. Nach dem mechanischen Separieren der fixierten, fluorochrnmlerten Zellen werden diese in Puffer resuspendiert und mittels eines Scanningfluoreszenzmikroskopes oder eines Durnhflußcytometers analysiert. Die Histogramme werden nach Mittelwert und Varianz beurteilt und daraus d\e Aktivität der Kohlenwasserstoffe oxidierenden Mikroorganismenpopulation bestimmt. OaG erfindungsgemäßß Verfahren erlaubt eine eindeutige Beurteilung des Zustandes von Kohlenwasserstoffe oxidierenden Mikroorganismen und erhöht damit die Sicherheit im optimalen Betreiben der entsprechenden Prozesse der tr.ikrobiellen Stoff Wandlung,

Oie Erfindung wird an einem Beispiel erläutert:

Die aus dem Fermentor gezogene Probe einer methanutilisierenden Kultur Mcthylococcus caDsulatus wird auf eine Konzentration von etwa 1 mg Bakterientrockonmasse pro Milliliter eingestellt, mechanisch separiert und in dem gleichen Volumen einer Karbonatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 versetzt, die 0,3 mg Aminoxanthen pro Milliliter enthält. Nach 20 Minuten Inkubieren bei 30"C werden die Bakterien mechanisch abgetrennt und mittels eines Karbonatpuffei?s vom pH-Wert 6,5 auf eine Konzentrtion von 0,5 mg Biomasse pro Milliliter resuspendiert.

In dem Puffer waren 0,1 mg/ml Nitrobenzaldehyd suspendiert. Nach zehnminütigem Inkubierei bei lO'C ist das Fluorochrom ausreichend fixiert. Die mechanisch separierten Bakterien werden zweimal mit Karbonatpuffer mit einem pH-Wert von 6,5 gewaschen und danach auf 5 . 10 Zellen pro Milliliter Karbonatpuffer eingestellt. Oie im DurchfluOcytometer mit 480 nm angeregten Zellen wurden klassifiziert. Die Kanalzahl des Mittelwertes lag bei 95 und der Variationskoeffizient bei 14 %. Diese Meßzahlen entsprechen der maximal erreichbaren Aktivität.

Claims (1)

1. Patentanspruch

   Verfahren zur Bestimmung der Aktivität Kohlenwasserstoffe oxidierenden Mikroorganismenpopulationen mittels DurchfluOcytometrie, gekennzeichnet dadurch, daß eine Probe der Mikroorganismenpopulation mit nicht fluoreszierenden organischen Verbindungen, die einen Pyridinring bzw. einen Pyranring enthalten, der partiell hydriert sein kann und weitere aromatische Ringe anelliert oder substituiert enthalten sowie polare oder reaktive Gruppen tragen, in Pufferlösung, bei einem pH-Wert > 3 und einer Temperatur von 30 bis 4O⁰C inkubiert, das in den Zellen gebildete Fluorochrom durch chemische Zusätze oder zugefügte Kupplungskomponenten fixiert und mittels Scanning-Fluoreszenzmikroskop oder DurchfluQcytometurs in bekannter Weise analysiert und an den so erhaltenen Histogrammen die Aktivität
   bestimmt wird.