ES2201124T3 - Medio para detectar enterococos en una muestra. - Google Patents
Medio para detectar enterococos en una muestra.Info
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Abstract
UN MEDIO PARA EL CULTIVO DE ENTEROCOCCI DE FORMA QUE SU DETECCION SE PUEDA REALIZAR DENTRO DE LAS 24 HORAS.
Description
Medio para detectar enterococos en una
muestra.
Esta invención pertenece al campo de la química,
la biología y la microbiología y se refiere a nuevos medios para
detectar la presencia de los microbios objetivos en una muestra de
un material posiblemente contaminado.
Los microorganismos están presentes de manera
omnipresente en las muestras biológicas y en los medios ambientales
adecuados para su crecimiento. Sin embargo, algunos han demostrado
ser perjudiciales para los organismos superiores y los medios para
detectar su presencia son importantes para preservar la salud
pública. Están disponibles muchos medios para detectar diferentes
tipos de microorganismos, y ofrecen diferentes ventajas con
respecto a la velocidad y la especificidad.
Todos los microorganismos tienen ciertos
requerimientos para su crecimiento y reproducción. En general, los
microorganismos requieren la presencia de lo siguiente para crecer:
una fuente de energía que incluya la luz y compuestos de carbono; y
una fuente de materias primas que incluya carbono, nitrógeno,
azufre, y fósforo así como trazas de otros minerales. Además, los
microorganismos deben estar presentes en un medioambiente adecuado
en el que se mantengan una temperatura, pH, salinidad y
concentración de oxígeno apropiados.
Un procedimiento común usado para detectar la
presencia de los microorganismos implica añadir una muestra a un
medio de cultivo que contiene todos los elementos necesarios para
permitir el crecimiento. La muestra puede ser natural o pretratada,
como por filtración con membrana, antes de ser añadida al medio de
cultivo, y el medio puede contener o no compuestos químicos tales
como antimetabolitos o antibióticos que son activos selectivamente
frente a microorganismos distintos de los microorganismos
objetivos. Usualmente, estos medios de cultivo se han esterilizado
para asegurar que no hay interferencias procedentes de microbios
contaminantes, y usualmente se requiere una etapa de incubación
bastante larga de 48 a 72 horas para proporcionar la detección
apropiada de los Enterococci. Adicionalmente, una vez que
se detecta el crecimiento en estos procedimientos, el microorganismo
objetivo debe ser confirmado usando uno o más de una serie de
ensayos específicos para una variedad de características físicas y
bioquímicas. Estos procedimientos son, por tanto, laboriosos y muy
largos.
Se han hecho muchos esfuerzos para simplificar y
acelerar los procedimientos de detección. Entre estos esfuerzos se
han hecho intentos de medir productos secundarios específicos de
bacterias individuales, ensayos de impedancia eléctrica, ensayos de
ATP, y ensayos de sustrato marcado con carbono-14.
La mayoría no han demostrado ser muy eficaces. También, se han
usado indicadores de crecimiento microbiano que cambian el color
sólo después del crecimiento microbiano. Normalmente, dichos
indicadores reaccionan químicamente con un producto secundario
metabólico producido por los microbios objetivos. Se han usado
también productos químicos que cambian el color en presencia de los
cambios de pH asociados con el crecimiento incluyendo rojo fenol,
azul de bromocresol, y rojo neutro. Por ejemplo, Golber, patente de
Estados Unidos Nº 3.206.317 usa rojo fenol en presencia de un medio
ácido producido por los productos de desecho bacterianos. Berger
et al., patente de Estados Unidos Nº 3.496.066 describen el
uso de compuestos que las bacterias convierten en productos
colorantes. Bochner, patente de Estados Unidos Nº 4.129.483
describe el uso de una sustancia no biodegradable que es reducida
para producir un cambio de color. En todas estas situaciones, el
indicador es una sustancia adicional y no una sustancia que sirva
también como una fuente de un nutriente requerido.
Edberg, patente de Estados Unidos Nº 4.925.789
describe el uso de un indicador nutriente que no sólo sirve como una
fuente de nutrientes, sino que también cambia de color después de
ser metabolizado. La patente, incorporada aquí como referencia,
proporciona un medio que contiene un indicador nutriente, el cual
cuando es metabolizado por una bacteria objetivo, libera un resto
que da un color u otro cambio detectable al medio. El procedimiento
tiene la ventaja de una especificidad enzimática única para
especies o grupos particulares de bacterias. Esto sugiere el uso de
antibióticos para seleccionar para cultivo de los microorganismos
objetivos y proporciona ejemplos específicos de ensayos basados en
medio líquido. Otros métodos usados previamente tales como los de
Kilian et al., Acta. Path. Microbiol. Scand. Sect. B \NAK7
271-276 (1979) y Damare et al., J. Food
Science 50:1736 (1985) describen el uso de medios basados en
agar sin antibióticos.
La densidad de Enterococcus es un medio
para predecir los riesgos para la salud pública asociados con las
aguas de recreo contaminadas. Hay dos métodos aceptados para el
análisis de la densidad de Enterococcus en las muestras de
agua, la técnica de los tubos múltiples para el número más probable
(MPN) y la técnica del filtro de membrana (MF) (Greenberg et al.,
Standard methods for the evaluation of water and wastewater
Eaton, A.D. (ed.) 18th ed. Asociación de la salud pública americana
(1992); y Mooney, K. et al., Testing the waters: a national
perspective on beach closings Natural Resources Defense
Council. (1992)). Los resultados basados en la técnica de los tubos
múltiples pueden no estar disponible hasta las 72 horas, y los
resultados de la técnica del filtro de membrana pueden no estar
disponibles hasta las 48 horas. El "procedimiento MPN"
implica un ensayo presuntivo de 24 a 48 horas en una serie de
caldos de cultivo de azida-dextrosa seguido por un
ensayo de confirmación a las 48 horas usando Enterococcus
agar selectivo y caldo de cultivo de infusión de
cerebro-corazón y NaCl al 6,5%. La técnica del
filtro de membrana implica la filtración por membrana de las
muestras de agua seguida por la incubación de una membrana estéril
prefiltrada en medios selectivos de Enterococcus. Los medios
de elección son o mE agar seguido de un ensayo de sustrato
EIA, o Enterococcus agar. Tales métodos pueden ser tediosos,
laboriosos y muy largos. Esto puede llevar a retrasos en la
notificación pública y, por tanto, a aumentar los riesgos para la
salud pública.
Panosian & Edberg, Journal of Clinical
Microbiology 27:1719-1722 (1989) describen un
método para la detección de S. Bovis y bacterias relacionadas que
comprende el cultivo de colonias de organismos sobre placas durante
periodos de 24 a 48 horas y de 18 a 24 horas seguido por la
transferencia de las colonias cultivadas a un medio de detección
que comprende
p-nitrofenil-\alpha-D-galactopiranosido
y
4-metilumbiliferil-\beta-D-glucósido.
Trepeta & Edberg, Antonie van Leeuwenhoek
53:273-277 (1987) describen un método para detectar
bacterias que poseen esculinasa y utilizan un medio de detección
que comprende
p-nitrofenil-\beta-D-glucopiranosido.
La presente invención aporta un medio que permite
la detección de microbios Enterococci en un ambiente licuado
o en una muestra biológica, dentro de un periodo de tiempo tan
corto como 24 horas. El presente medio es distinto de los medios
anteriores en los que se requieren aproximadamente de 48 a 72 horas
para obtener un resultado del ensayo para los Enterococci.
El medio permite también cuantificar la cantidad de
Enterococci presentes en una muestra y se puede usar en
métodos de cribado rápido.
El medio contiene una cantidad efectiva de
vitaminas, aminoácidos, elementos trazas e ingredientes salinos
necesarios para permitir la viabilidad y la reproducción de los
Enterococci en presencia de un indicador nutriente. El
indicador nutriente se proporciona en una cantidad suficiente para
permitir una señal característica detectable a ser producida en el
medio por el cultivo de los Enterococci. El medio contiene
adicionalmente cantidades efectivas de agentes selectivos que son
activos para evitar o inhibir el crecimiento de los microorganismos
que no son objetivo (es decir, los no enterococcos).
Los medios que han demostrado ser óptimos en esta
invención para la detección de los Enterococci en una
muestra incluyen (por litro) un tampón biológico (por ejemplo,
aproximadamente de 5,0 a 7,0 gramos de ácido
N-tris[hidroxi-metil]metil-3-amino-propanosulfónico,
ácido libre (ácido TAPS libre), y aproximadamente de 5,0 a 7,0
gramos de ácido
N-tris[hidroxi-metil]metil-3-amino-propanosulfónico,
sal de sodio (TAPS-sodio) o aproximadamente de 4,0
a 5,0 gramos de ácido HEPES libre y aproximadamente de 7,0 a 9,0
gramos de sal de sodio de HEPES)); y bicarbonato de sodio (por
ejemplo, aproximadamente de 1,5 a 2,5 gramos).
Adicionalmente, se proporcionan los siguientes
componentes en los medios en aproximadamente las cantidades
indicadas. Los expertos en la técnica entenderán que no se
requieren todos los componentes. También se pueden sustituir los
componentes por otros componentes de similares propiedades. Las
cantidades de los componentes pueden variar también.
Específicamente, el medio contiene (por litro) un contenido total
nitrogenada aproximadamente de 1,0 a 1,7 gramos (principalmente
procedente de sulfato de amonio). También se proporcionan los
aminoácidos requeridos para el cultivo de los microorganismos a ser
detectados. No todos los aminoácidos deben ser proporcionados, y la
cantidad relativa de cada uno puede variar. Los aminoácidos de
pueden proporcionar a partir de una variedad de fuentes. Se pueden
proporcionar de fuentes naturales (por ejemplo, extractos de
organismos completos), como mezclas o en forma purificada. Las
mezclas naturales pueden contener cantidades variables de tales
aminoácidos y vitaminas. Las cantidades específicas de tales
aminoácidos y vitaminas se indican más adelante. Los expertos en la
técnica reconocerán que se pueden usar muchas combinaciones
diferentes de aminoácidos y vitaminas en los medios de esta
invención. Normalmente, sólo se deben proporcionar los aminoácidos
que no se pueden sintetizar endógenamente por los microorganismos a
ser detectados. Sin embargo, se pueden proporcionar otros
aminoácidos sin apartarse del medio de la invención. Los contenidos
de aminoácidos son al menos los siguientes en aproximadamente las
siguientes cantidades (por litro): alanina (de 0,015 a 0,055
gramos); arginina (de 0,01 a 0,04 gramos); ácido aspártico (de 0,04
a 0,10 gramos), cistina (de 0,001 a 0,005 gramos), ácido glutámico
(de 0,05 a 0,15 gramos), glicina (de 0,01 a 0,03 gramos), histidina
(de 0,010 a 0,06 gramos), isoleucina (de 0,01 a 0,10 gramos),
leucina (de 0,03 a 0,08 gramos), lisina (de 0,03 a 0,07 gramos),
metionina (de 0,01 a 0,04 gramos), fenilalanina (de 0,01 a 0,04
gramos), prolina (de 0,02 a 0,08 gramos), serina (de 0,01 a 0,05
gramos), treonina (de 0,01 a 0,04 gramos), triptófano (de 0,002 a
0,006 gramos), tirosina (de 0,01 a 0,02 gramos), y valina (de 0,02
a 0,05 gramos).
Se pueden proporcionar sales como una fuente de
iones después de la disociación. Tales sales pueden incluir fosfato
de potasio (por ejemplo, aproximadamente de 0,5 a 1,5 gramos);
sulfato de cobre (por ejemplo, aproximadamente de 40 a 50 \mug);
sulfato de amonio (por ejemplo, aproximadamente de 4,0 a 6,0
gramos); yoduro de potasio (por ejemplo, aproximadamente de 50,0 a
150,0 \mug); cloruro férrico (por ejemplo, aproximadamente de
150,0 a 250,0 \mug); sulfato de manganeso (por ejemplo,
aproximadamente de 300,0 a 500,0 \mug); molibdato de sodio (por
ejemplo, aproximadamente de 150,0 a 250,0 \mug); sulfato de zinc
(por ejemplo, aproximadamente de 300,0 a 500,0 \mug); y cloruro
de sodio (por ejemplo, aproximadamente de 0,05 a 0,15 g). Se pueden
incluir otros restos inorgánicos para ayudar al cultivo microbiano.
Estos incluyen los siguientes (hasta un límite que no se ha
proporcionado todavía en las fuentes anteriores de los diferentes
productos químicos y se describen en cantidades por litro): fósforo
(aproximadamente 0,0005 g/l), potasio (aproximadamente 0,0004 g/l),
sodio (aproximadamente de 0,03 a 0,06 g/l) y trazas de calcio,
magnesio, aluminio, bario, cloruro, cobalto, cobre, hierro, plomo,
manganeso, sulfato, azufre, estaño y cinc.
\newpage
También deben proporcionarse las vitaminas
requeridas para el crecimiento y la reproducción de los
microorganismos que se quieren detectar. Éstas se pueden
proporcionar en una forma pura o como parte de medios más complejos.
Tales vitaminas pueden estar presentes en aproximadamente las
siguientes cantidades (por gramo de medio): biotina
(aproximadamente de 0,15 a 0,40 \mug/l), ácido pantoténico
(aproximadamente de 45,0 a 65,0 \mug/l), piridoxina
(aproximadamente de 6,0 a 9,0 \mug/l), riboflavina
(aproximadamente de 10,0 a 20,0 \mug/l), ácido fólico
(aproximadamente de 5,00 a 10,00 \mug/l), tiamina
(aproximadamente de 10,0 a 20,0 \mug/l), vitamina B_{12}
(aproximadamente de 0,20 a 0,30 \mug/l), y niacina
(aproximadamente de 15,0 a 25,0 \mug/l).
También se pueden proporcionar agentes
selectivos, y en particular antibióticos, que inhiben o evitan el
crecimiento de los organismos no objetivo. Se pueden proporcionar
muchos agentes selectivos, y los agentes selectivos usados
dependerán del microorganismo objetivo. Preferiblemente, los agentes
selectivos incluyen uno o más de los siguientes en concentraciones
que están dentro de los siguientes intervalos: sulfato de amikacina
(aproximadamente de 0,0045 a 0,0055 gramos/litro), anfotericina B
(aproximadamente de 0,00198 a 0,00242 gramos/litro), y bacitracina
(aproximadamente de 0,000476 a 0,00794 gramos/litro).
Alternativamente, pueden ser sustitutos el acetato de talio,
sulfato de neomicina, cicloheximida, tetraciclina, colistina,
ansiomicina o clindamicina.
Los expertos en la técnica reconocerán que el
carbono, nitrógeno, elementos trazas, vitaminas, aminoácidos y
agentes selectivos se pueden proporcionar de muchas formas. Algunos
ingredientes se pueden proporcionar en cantidades reducidas o se
pueden suprimir si pueden ser sintetizados endógenamente por los
microorganismos cuya presencia se va a determinar.
El indicador nutriente está presente en el medio
en una cantidad que es suficiente para mantener el crecimiento del
microbio objetivo hasta que se produzca una señal característica
detectable en el medio durante el crecimiento. Las vitaminas, los
aminoácidos, los elementos trazas, las sales y los indicadores
nutrientes, juntos, permiten un crecimiento suficiente del
organismo, de modo que se puede observar un cambio detectable en la
muestra. El indicador nutriente altera una característica
detectable de la muestra sólo cuando es metabolizado por un
organismo. Preferiblemente, altera una característica detectable
sólo cuando es metabolizado por el microbio objetivo. Por tanto, se
puede usar para confirmar la presencia o ausencia del microbio
objetivo en la muestra. Es preferible que el indicador nutriente se
elija de modo que sea partido para liberar la porción indicadora al
medio sólo por el microbio objetivo. Esto es, si están presentes en
la muestra otros microbios que puedan partir el indicador nutriente,
entonces el medio se forma de modo que estos otros microbios no
puedan crecer sustancialmente en el medio. Adicionalmente, aunque
se prefiere que el indicador nutriente sea la única fuente del tipo
específico de nutrientes para el microbio objetivo, el medio puede
contener otras de dichas fuentes, pero en cantidades que no
reducirán la especificidad del medio. Por ejemplo, el indicador
nutriente puede ser la única fuente de carbono para este
microorganismo. Alternativamente, pueden estar presentes otras
fuentes de carbono (por ejemplo, aminoácidos) que no son usadas de
forma preferencial por el microbio objetivo. Si se desea, pueden
estar presentes algunas pequeñas cantidades de otras fuentes de
carbono que podrían ser usadas de forma preferencial por el microbio
objetivo, pero la cantidad proporcionada es tal que no reduce la
especificidad del medio sin dicha fuente de carbono. Lo más
preferiblemente, el indicador nutriente es
4-metillumberiferil-\beta-D-glucopiranosido.
Otros indicadores nutrientes que se pueden usar en la invención
incluyen los siguientes:
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucopiranosido,
o-nitrofenil-\beta-D-glucopiranosido,
p-nitrofenil-\beta-D-
glucopiranosido,
resofuran-\beta-D-glucopiranosido,
6-bromo-2-naftil-D-glucopiranosido,
rose-\beta-D-glucopiranosido,
yoduro de
VQM-Glc(2-{2-[4-(D-glucopiranosiloxi)-3-metoxifenil]vinil)-1-metil-quinolinio,
y yoduro de
VBzTM-Gluc(2-{2-[4-(D-glucopiranosiloxi)-3-metoxifenil]vinil)-1-
metilbenzotiazolio.
El término "Enterococci" incluye los
siguentes microorganismos: Enterococcus avium, E. casseliflavus,
E. cecorum, E. columbae, E. dispar, E. durans, E. faecalis, E.
faecium, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtii, E.
psudoavium, E. raffinosus, E. saccharolyticus, E. seriolicida, E.
solitarius, y E. sulfureus. Entre ellos, Los E. avium, E.
durans, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum y E. hirae son
las cepas de origen fecal. El término no está limitado para indicar
cualquier número dado de estas especies y no significa que excluya
especies que todavía están por descubrir pero que más tarde pueden
ser identificadas e incluidas en este género por los expertos en la
técnica.
El término "Streptococci fecales"
incluye especies de las bacterias Streptococci presentes en
el tracto gastrointestinal de los organismos superiores. Incluye
organismos tales como S. Faecalis, S. Faecuim, S. Avium, y S.
Gallinarum. Los S. Faecalis, S. faecium, S. avium, y S.
Gallinarum son más comúnmente conocidos como Enterococci
y se incluyen aquí dentro de ese término.
El término "24 horas" indica el tiempo
requerido por aproximadamente 95% de las muestras líquidas que
contienen sólo aproximadamente de uno a diez Enterococci por
100 ml para mostrar un cambio característico detectable. La
temperatura, cantidad y el tipo de inductor enzimático presente, la
cantidad de nutrientes proporcionada en el medio, y la salud
relativa de las bacterias, afectan todos al tiempo de detección. La
cantidad de nutrientes tales como aminoácidos, vitaminas, y
elementos trazas proporcionada puede afectar a la velocidad de
crecimiento del microbio objetivo y por tanto al tiempo de
detección. El equilibrar térmicamente la muestra a una temperatura
de incubación de aproximadamente 35ºC después de añadir el medio
puede disminuir el tiempo requerido para la detección. La cantidad
de inductor enzimático también puede disminuir el tiempo para la
detección. Los inductores enzimáticos encontrados en el medio son
agentes que actúan como un inductor de la enzima que parte al
indicador nutriente. El inductor enzimático, por ejemplo, puede ser
un homólogo del indicador nutriente. Ejemplos de tales inductores
son conocidos en la técnica. La salud relativa de los microbios
afecta también al tiempo requerido para la detección. La adición de
agentes tales como piruvato que pueden ayudar a la recuperación de
organismos dañados puede, por tanto, acelerar la detección. Si
grandes cantidades de bacterias están presentes en la muestra, es
posible también una detección más rápida. En esta invención, los
medios proporcionados permiten la detección de pequeñas cantidades
de microbios objetivos (es decir, menos de 10/100 ml) en el periodo
de 24 horas, al menos el 95% de las veces. Se pueden usar métodos
estándar para determinar esta capacidad.
El término "medio" indica una mezcla sólida,
en polvo o líquida que contiene todos o sustancialmente todos los
nutrientes necesarios para permitir que un microbio crezca y se
reproduzca. Esta invención incluye tanto los medios que se
esterilizan como los medios que no son estériles.
El término "licuado" indica sustancialmente
en forma líquida, aunque también indica muestras pulverizadas u
homogeneizadas de sustancias sólidas que tienen al menos un
contenido líquido de 10%. La frase excluye un medio gelificado, tal
como ocurre en el agar.
Los términos "medioambiental" y
"biológico" indican tomado o procedente de una sustancia capaz
de mantener una o más formas de vida incluyendo algas, levaduras y
bacterias. Ejemplos incluyen, pero sin limitarse a ellos, aguas de
recreo, aguas marinas, aguas potables, efluyentes residuales, y
sustancias alimenticias.
El término "inoculación" indica en el
momento o cerca del momento en que la muestra medioambiental o
biológica licuada se mezcla con el medio de esta invención. Quiere
decir el momento en el que las dos sustancias se mezclan de forma
sustancial.
El término "cantidad efectiva" es una
cantidad dentro del intervalo que permite o favorece el crecimiento
y la reproducción de un microorganismo objetivo. Esto es, una
cantidad que permite que los microbios u otros organismos se adapten
al medio, sinteticen los constituyentes necesarios para la
reproducción y subsiguientemente se reproduzcan. No quiere decir
que sea específica y puede variar dependiendo de factores tales
como el tamaño de la muestra y la concentración de microorganismos.
Generalmente, el término indica la cantidad requerida para detectar
menos de 100 microbios objetivos por 1 ml de muestra, lo más
preferiblemente menos de 100 microbios por 100 ml de muestra, o
incluso 1 microbio por 100 ml de muestra.
Los términos "vitaminas",
"aminoácidos", "elementos trazas", y "sales" se
definen para que incluyan todas las moléculas, compuestos y
sustancias clasificadas en cada categoría por los expertos en la
técnica, tanto orgánicos como inorgánicos, y las categorías no
pretenden excluir ninguna sustancia que pueda ser necesaria o
propicia para mantener la vida.
El término "indicador nutriente" indica una
molécula o sustancia que contiene un resto que es una fuente para
un nutriente esencial y un resto que causa o produce un cambio
característico observable en el medio o en la muestra. Un indicador
nutriente incluye fuentes de nutrientes unidas o conjugadas con
cromógenos o fluorógenos. Las fuentes de nutrientes pueden
proporcionar vitaminas, minerales, elementos o ingredientes de
aminoácidos esenciales o carbono. Normalmente, como un
microorganismo progresa desde la fase en la que los nutrientes se
acumulan para la reproducción (fase lag) hasta la fase durante la
que realmente ocurre la reproducción a una velocidad relativamente
rápida (fase log), los requerimientos de nutrición aumentan.
Consecuentemente, se metabolizan cantidades mayores del indicador
nutriente y se produce un cambio característico y detectable.
Preferiblemente, el indicador nutriente incluye un resto nutriente
y un cromógeno o un fluorógeno. Los cromógenos incluyen cualquier
resto que produzca un cambio de color observable en el espectro
visible. Los fluorógenos incluyen cualquier resto que tenga
fluorescencia después de la exposición a una fuente de luz de
excitación. Ejemplos, incluyen, pero sin limitarse a ellos, restos
ortonitrofenilo, fenolftaleína, y 4- metilumbeliferona. Aunque el
indicador nutriente puede proporcionar la única fuente de un
nutriente esencial, se pueden proporcionar otras fuentes de tales
nutrientes, siempre que se mantenga la adecuada selectividad y
sensibilidad del medio.
El término "señal característica detectable"
incluye cualquier cambio en una muestra que se pueda detectar
mediante uno o más de los sentidos humanos. El término incluye
ejemplos tales como cambio de color en los intervalos de longitudes
de onda del espectro visible y no visible, un cambio de estado tal
como entre sólido, líquido y gas, una emisión de gas, o un cambio
de olor.
El término "microbio objetivo" indica el
microorganismo cuya presencia o ausencia se quiere detectar.
Preferiblemente, incluye especies de Enterococci y
Streptococci fecales que pueden vivir en el tracto
gastrointestinal de los organismos superiores.
En una realización preferida, el indicador
nutriente altera el color del medio específico para un microbio. El
cambio de color puede ser evidente en el intervalo de las
longitudes de onda del espectro visible o puede ser fluorescente lo
que es evidente en un intervalo de las longitudes de onda del
espectro visible después de exposición a una fuente de luz de
excitación. Esto se logra por la separación de un resto cromogénico
o de un resto fluorescente. Un resto cromogénico es un resto que
cambia el color de la muestra en el intervalo visible cuando está
en una forma no conjugada, esto no sin estar ya conjugada o unida
al resto nutriente. Un resto fluorescente es un resto que cambia el
color de la muestra en el intervalo no visible cuando está en una
forma no conjugada, esto es sin estar ya conjugada o unida al resto
nutriente. Ejemplos de restos cromogénicos que pueden estar
conjugados a un resto nutriente incluyen, pero sin limitarse a
ellos, restos de ortonitrofenilo que producen un color amarillo
cuando se liberan del indicador nutriente, y restos de fenolftaleína
que producen un color rojo cuando se liberan del indicador
nutriente. Ejemplos de restos fluorescentes incluyen, restos de
metillumbeliferilo que se vuelven fluorescentes a aproximadamente
366 nm cuando se liberan del indicador nutriente, y restos de
bromo-cloro-indol que se vuelven
azules cuando se liberan del indicador nutriente. Lo más
preferiblemente, el medio usa el resto fluorescente,
4-metillumbeliferil-\beta-D-glucopiranosido.
Preferiblemente, el medio contiene también uno o
más agentes selectivos tales como antibióticos que evitan o inhiben
que microbios distintos del microbio objetivo metabolizen el
indicador nutriente. Esto es, preferiblemente el medio contiene
agentes que son específicos para microbios distintos de
Enterococci o Streptococci fecales y evitan o inhiben
eficazmente el crecimiento de al menos algunos de estos microbios.
El término se define para incluir agentes tales como azida de sodio,
acetato de talio, ácido nalidíxico, sulfato de neomicina, sulfato
de gentamicina, sales biliares, cloruro de sodio, licloheximida,
tetraciclina, colistina, ansiomicina, clindamicina y polimicina B.
Preferiblemente, incluye sulfato de amikacina (por ejemplo,
aproximadamente de 0,0045 a 0,0055 g/litro), anfotericina B (por
ejemplo aproximadamente de 0,00198 a 0,00242 g/litro) y bacitracina
(por ejemplo aproximadamente de 0,000476 a 0,000794 g/litro).
El término "medio específico para un
microbio" indica un medio que permite un crecimiento sustancial
sólo del microbio objetivo. Esto incluye medios que contienen uno o
más antibióticos específicos para inhibir el crecimiento de
microorganismos distintos del microbio objetivo, e incluye medios
que alternativa o adicionalmente contienen uno o más indicadores
nutrientes que no son metabolizados preferiblemente por
microorganismos distintos del microbio objetivo en un grado
sustancial. El término "sustancial" como se usa en este
contexto, indica que el medio siempre permite la detección
específica (es decir, con una exactitud de al menos 95% o incluso
98%) y sensible (es decir, con unos niveles de detección de al menos
95% o incluso 98%) del microbio objetivo, como se mide por
procedimientos estándar.
En otra realización preferida, el medio contiene
un agente que actúa como un inductor de la enzima que divide al
indicador nutriente. Este agente, por ejemplo, puede ser un
homólogo del indicador nutriente. Tales inductores incluyen
isopropil-\beta-D-tiogalactosido
(IPTG) que induce la actividad de la
\beta-galactosidasa y
etil-\beta-D-tioglucosido
que induce la actividad de la
\beta-glucosidasa.
Preferiblemente, el medio permite la detección de
los Enterococci (incluyendo Streptococci fecales) en
24 horas. El medio está también preferiblemente en la forma de un
polvo no estéril, soluble en agua que permite la fácil adición a las
muestras líquidas.
En otro aspecto, la invención aporta un método
para detectar la presencia o ausencia de los Enterococci y
Streptococci fecales en una muestra licuada poniendo en
contacto la muestra con el medio descrito antes, incubando, y
monitorizando la mezcla de la muestra y el medio para determinar la
presencia o ausencia de la señal característica detectable. La
incubación se puede realizar a una serie de temperaturas, pero
preferiblemente se lleva a cabo entre 35ºC y 45ºC. Preferiblemente,
la señal característica detectable se puede observar en 24 horas.
La invención aporta la provisión de muestras preferiblemente de una
fuente de agua incluyendo agua fresca, agua marina, suministros de
agua potable o aguas residuales.
Otra característica de la invención es un método
para detectar la presencia o ausencia de un microbio objetivo en
una muestra medioambiental o biológica licuada preferiblemente
incluyendo la etapa de calentar la muestra a la temperatura de
incubación en un incubador líquido, y después añadir el medio
específico para el microbio. Lo más preferiblemente, la temperatura
de incubación es aproximadamente 35ºC. El término "incubador
líquido" indica un líquido calentado a una temperatura o
intervalo de temperaturas especificados. Este puede incluir
cualquier forma de baños de agua por ejemplo. Tal incubador es
ventajoso con respecto a los incubadores de aire usados
previamente, ya que el medio alcanza más rápidamente una temperatura
de incubación adecuada.
En otro aspecto adicional, la invención aporta un
método para cuantificar la cantidad o número de Enterococci
presentes en una muestra líquida poniendo en contacto una muestra
líquida con el medio descrito antes, situando la muestra líquida
que incluye el medio en recipientes, incubando la mezcla de la
muestra líquida y el medio, observando la cantidad y calidad de una
señal característica detectable, y comparando la cantidad y calidad
de una señal característica detectable con los valores más
probables. Este procedimiento de cuantificación compara la cantidad
y calidad de la característica que ha sido alterada,
preferiblemente un cambio de color, con los valores numéricos más
probables obtenidos de muestras en las que la concentración y el
cambio característico habían sido correlacionados con muestras de
las cuales se conoce la concentración de Enterococci o
bacterias. Véase, por ejemplo, Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of foods 3rd ed., editado por
Vanderzant y Splittstoesser, 1992. La técnica de los números más
probables permite la estimación de las concentraciones de las
bacterias que están por debajo de los límites detectables por otros
métodos.
En las realizaciones preferidas, la invención usa
el aparato descrito por Naqui et al. en la patente de Estados
Unidos Nº 5.518.892. La etapa de cuantificación incluye
proporcionar una muestra medioambiental o una muestra biológica en
una forma líquida, situar o distribuir la muestra dentro de la
bolsa porta-muestras descrita por Naqui, mezclar la
muestra con un medio para permitir y favorecer el crecimiento de las
bacterias viables, incubar la muestra, detectar la cantidad y
calidad del cambio de color, y comparar esa cantidad y calidad con
los resultados obtenidos para una serie de muestras de las cuales
se conoce la concentración de bacterias. Más preferiblemente, la
etapa de incubación se lleva a cabo a 41ºC durante un periodo de 24
horas usando el medio descrito antes.
La invención proporciona el medio óptimo para
determinar la presencia de microorganismos Enterococci
(incluyendo Streptococci fecales). Los Enterococci se
pueden detectar mucho antes en este medio que en los disponibles
actualmente. Por tanto, los resultados del ensayo están más
rápidamente disponibles. Los rápidos resultados ahorran tanto dinero
como tiempo en el laboratorio. La velocidad disminuye también el
peligro para la salud pública, permitiendo alertas y medidas
curativas precoces para tratar con la presencia de algunos
microorganismos en sitios tales como suministros de agua potable y
aguas de recreo. Además, el método de esta invención no requiere
generalmente ensayos confirmativos ya que se pueden usar indicadores
nutrientes específicos para un microorganismo. Adicionalmente, la
invención no requiere el uso de un medio estéril como requieren
muchos otros métodos.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes con la siguiente descripción de sus realizaciones
preferidas, y con las reivindicaciones.
En la siguiente descripción, se hará referencia a
diferentes metodologías conocidas por los expertos en las técnicas
química, biológica y microbiológica. Las composiciones, métodos y
productos de esta invención son aplicables a muestras biológicas y
medioambientales, y son útiles en las técnicas química, biológica y
microbiológica para la detección de microorganismos.
Los microorganismos específicos obtienen sus
nutrientes a partir de un conjunto de fuentes, sin embargo, algunas
fuentes pueden ser únicas para un microorganismo particular o grupo
de microorganismos. Familias, grupos o especies de microorganismos
pueden compartir las especificidad enzimática para ciertos
nutrientes que está ausente en otros microorganismos. Aprovechando
las características metabólicas de microorganismos específicos, es
posible demostrar su presencia. Se han identificado muchas enzimas
que son específicas para grupos o especies particulares y
probablemente en el futuro serán identificadas otras similares.
El grupo de bacterias enterococcus
contiene una única enzima constitutiva,
\beta-glucosidasa (Littel et al., Appl Environ.
Microbiol. 45:622-627 (1983). Dicha enzima cataliza
la hidrólisis de sustratos cromogénicos o fluorogénicos apropiados
en los entornos selectivos apropiados dando como resultado una
señal coloreada o fluorescente que se puede detectar o visual o
espectrofotométricamente. Un sustrato específico para
\beta-glucosidasa puede servir como el indicador
nutriente en los medios diseñados para detectar los
Enterococci y proporcionar un fuente principal de carbono en
la formulación del medio. Están disponibles una serie de sustratos
de indicadores nutrientes. Sin embargo, el sustrato preferiblemente
usado para detectar Enterococci es el sustrato fluorogénico
de
4-metillumbeliferil-\beta-D-glucopiranosida.
Cuando están presentes en una muestra bacterias enterococcus
viables, el indicador nutriente es metabolizado, con lo que se
separa la porción indicadora, la cual, cuando se separa, se hace
fluorescente. El resto de glucosa liberado se utiliza entonces por
las bacterias Enterococci para favorecer su crecimiento.
El grupo de bacterias enterococcus y
streptococcus fecal es un valioso indicador bacteriano para
determinar la extensión de la contaminación fecal en la superficie
de las aguas de recreo (Greenberg et al, Stándard Methods for the
Examination of water and Wastewater. 18th ed Eaton, A.D. (ed.)
American Public Health Association (1992). El genero
Enterococcus contiene actualmente 18 especies:
Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus
cecorum, Enterococcus columbae, Enterococcus dispar, Enterococcus
durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus
gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus malodoratus,
Enterococcus mundtii, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus
raffinosus, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus seriolicida,
Enterococcus solitarius, y Enterococcus sulfureus. Entre estas,
Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, y Enterococcus
hirae son las cepas de origen fecal (Hernandez et al, Wat. Res.
27:597-606 (1993)). Estas bacterias sobreviven
durante mucho más tiempo que otros indicadores en el entorno marino.
Los Enterococci son también resistentes al tratamiento de
las aguas residuales, incluyendo la cloración, y por tanto, son
indicadores sensibles de la supervivencia de patógenos y virus
intestinales en las muestras de agua. Se ha demostrado una
correlación directa entre la concentración de Enterococci en
aguas marinas y los riesgos de gastroenteritis asociada con el baño
(Cabelli, Wat. Sci. Tech. 21:13-21 (1989); y Cabelli
et al., Journal WPCF (1983)). Ha sido recomendado por la
agencia de protección medioambiental de Estados Unidos (U.S. EPA)
que el grupo de bacterias Enterococci sea usado como el
indicador bacteriano para las aguas frescas y marinas. Las guías
actuales de seguridad para las aguas de recreo basadas en la
densidad de Enterococci son de 33 Enterococci por 100
ml de agua fresca y 35 Enterococci por 100 ml de agua marina,
respectivamente.
Las técnicas estándar actuales para medir las
densidades de enterococcus en las aguas marinas y de recreo
frescas son laboriosas y muy largas. Los resultados basados en MPN
requieren un mínimo de 72 horas y en MF requieren 48 horas. Aunque
los Enterococci son indicadores bacterianos más sensibles
para los riesgos sanitarios asociados con el baño, el tiempo
requerido para la interpretación de los resultados ha dificultado
su aceptación como una adecuada monitorización. El sistema de
diagnóstico basado en la \beta-glucosidasa permite
la detección precoz de las especies de enterococcus en
muestras de agua en 24 horas. Los rápidos resultados permiten
respuestas veloces por parte del gobierno para realizar medidas
tales como cierre de playas para proteger la salud pública.
En general, la actividad de la
\beta-glucosidasa es una característica
específica para detectar los Enterococci y los
Streptococci fecales. Otras bacterias, sin embargo, poseen
también tal actividad enzimática. Estas incluyen los géneros de la
familia Enterobacteriaceae (enterobacter aerogenes, E colacae)
Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Listeria monocytogenes,
y Bacterioides fragilis. Se puede usar cierto factor o factores
selectivos para inhibir el crecimiento de dichas bacterias positivas
a la \beta-glucosidasa (es decir, otras especies
distintas de enterococcus).
Se puede producir un medio selectivo para
microorganismos específicos utilizando una combinación de
especificidad enzimática y medioambientes selectivos. Por ejemplo,
en un medio de esta invención, se suprimen los microbios no objetivo
que no poseen actividad de \beta-glucosidasa y
que no pueden digerir el indicador nutriente. Las bacterias
heterotróficas u otros microbios no objetivos que poseen
\beta-glucosidasa son suprimidos selectivamente
durante el periodo de prueba por la combinación de reactivos
químicos antibióticos específicamente formulados y otros parámetros
físicos (pH y temperatura). Los agentes selectivos típicos que se
pueden usar en el medio de esta invención incluyen azida de sodio,
acetato de talio, ácido nalixílico, sulfato de neomicina, sulfato
de gentamicina, sales biliares, cloruro de sodio, y polimicina B
(Hernandez et al., Wat. Res. 27:597-606 (1993);
Knuntson, et al., Appl. Environ. Microbiol.
59:936-938 ((1993), y Littel et al., Appl.
Environ. Microbiol. 45:622-627 (1983)).
La combinación de la especificidad enzimática y
la selectividad antibiótica proporciona múltiples barreras que
evitan la competencia de los microbios no enterococcus a ser
detectados dentro del periodo de prueba de 24 horas. Esto impide el
uso de un único elemento altamente tóxico que no sólo puede inhibir
los microorganismos no objetivos sino también suprimir los
microbios objetivos.
En los Enterococci, la
\beta-glucosidasa cataliza la conversión del
sustrato fluorescente,
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranosido
(MUD), a 4-metilumbeliferona y glucosa. El
fluoróforo, 4-metilumbeliferona, emite fluorescencia
azul cuando se excita a 365 nm (que puede ser vista bajo una
lámpara UV a 365 nm). El resto de azúcar liberado, glucosa, sirve
como una fuente principal de carbono para apoyar el crecimiento de
los Enterococci. Un aumento del nivel de indicador nutriente
puede proporcionar un mejor crecimiento microbiano y una
fluorescencia más fuerte, sin embargo, los altos niveles de
indicador nutriente pueden causar también citotoxicidad celular y un
nivel más alto de fluorescencia de fondo. El
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranosido
(MUD), a un nivel de 25 mg/l no inhibe el crecimiento de las
especies de enterococus.
La mayoría de las hidrolasas glucolíticas
(\beta-glucosidasa,
\beta-galactosidasa, y
\beta-glucuronidasa) son inducibles. La inducción
de la actividad de la \beta-galactosidasa por el
isopropil-\beta-D-tiogalactosido
(IPTG) es un ejemplo clásico. El
etil-\beta-D-tioglucósido
que funciona de un modo similar es un inductor de
\beta-glucosidasa.
NaHCO_{3} (2 g/litro),
Tween-80® (0,75 ml/litro), y KH_{2}PO_{4} (5
g/litro) estimulan el crecimiento de las especies de
Streptococcus fecales aisladas de aguas (véase, por ejemplo
Lachica et al., J. Appl. Bacteriol. 31:151-156
(1968)). Otros elementos trazas tales como aminoácido(s)
específicos (ácido glutámico), vitamina(s) (ácido lipoico),
y nucleótido(s) (quinetina-ribosido) pueden
tener todos actividades para favorecer el crecimiento de las
especies de enterococcus.
El medio de la invención para detectar los
Enterococci se describe en la tabla 1.
| Ingrediente | Fuente | Cantidad |
| Nitrógeno | Nitrógeno de amino | de 0,02 a 0,05 g/l |
| Aminoácidos | Alanina | de 0,015 a 0,055 g/l |
| Arginina | de 0,01 a 0,04 g/l | |
| Ácido aspártico | de 0,04 a 0,1 g/l | |
| Cistina | de 0,001 a 0,005 g/l | |
| Ácido glutámico | de 0,05 a 0,15 g/l | |
| Glicina | de 0,01 a 0,03 g/l | |
| Histidina | de 0,01 a 0,06 g/l |
| Ingrediente | Fuente | Cantidad |
| Isoleucina | de 0,01 a 0,10 g/l | |
| Leucina | de 0,03 a 0,08 g/l | |
| Lisina | de 0,03 a 0,07 g/l | |
| Metionina | de 0,01 a 0,04 g/l | |
| Fenilalanina | de 0,01 a 0,04 g/l | |
| Prolina | de 0,02 a 0,08 g/l | |
| Serina | de 0,01 a 0,05 g/l | |
| Treonina | de 0,01 a 0,04 g/l | |
| Triptófano | de 0,002 a 0,006 g/l | |
| Tirosina | de 0,01 a 0,02 g/l | |
| Valina | de 0,02 a 0,05 g/l | |
| Elementos | Calcio | Trazas |
| Cloruro | Trazas | |
| Cobalto | Trazas | |
| Cobre | Trazas | |
| Hierro | Trazas | |
| Plomo | Trazas | |
| Manganeso | Trazas | |
| Fosfato | de 0,0005 a 0,005 g/l | |
| Potasio | de 0,0004 a 0,004 g/l | |
| Sodio | de 0,03 a 0,06 g/l | |
| Sulfato | Trazas | |
| Azufre | Trazas | |
| Estaño | Trazas | |
| Cinc | Trazas | |
| Vitaminas | Biotina | de 0,15 a 0,4 \mug/l |
| Colina | de 5,0 a 10,0 \mug/l | |
| Piridoxina | de 6,0 a 7,5 \mug/l | |
| Riboflavina | de 10,0 a 20,0 \mug/l | |
| Tiamina | de 20,0 a 20,0 \mug/l | |
| Vitamina B_{12} | de 0,2 a 0,3 \mug/l | |
| Niacina | de 15,0 a 25,0 \mug/l | |
| Ácido pantoténico | de 45,0 a 65,0 \mug/l |
Componente
II
| Ácido libre HEPES | De 4,032-4,928 g/l |
| Sal de sodio HEPES | de 7,301-8,933 g/l |
| Base nitrogenada de levaduras modificada | de 4,635-5,665 g/l |
| Bicarbonato de sodio | de 1,8-2,2 g/l |
| Fosfato de potasio | de 0,1-1,0 g/l |
| \beta-ETG (etil-\beta-D-tioglucósido) | de 0,009-0,011 g/l |
| MUD (4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranosido) | de 0,02-0,03 g/l |
| Sulfato de amiKacina | de 0,0045-0,0055 g/l |
| Anfotericina B | de 0,00198-0,00242 g/l |
| Bacitracina | de 0,000476-0,000794 g/l |
| Trazas = menos de 0,001 g/litro. |
\newpage
El medio de esta invención se puede usar de tres
formas diferentes. En primer lugar, se puede usar para detectar la
presencia o ausencia de Enterococci. En segundo lugar, se
puede usar para cuantificar la cantidad de Enterococci
presentes en una muestra. En tercer lugar, se puede usar en un
formato de cribado para relacionar el tiempo de un resultado
positivo del ensayo con la concentración de Enterococci en
una muestra.
Se describe a continuación el procedimiento para
detectar la presencia o ausencia de las especies de
enterococcus en muestras de agua.
1. En primer lugar, se recogen una o más muestras
de agua usando recipientes estériles precalibrados. El volumen de
la muestra puede ser de diferentes cantidades, incluyendo 100 ml,
10 ml, o 1 ml dependiendo de la aplicación. El medio de esta
invención se puede añadir en forma de polvo a la muestra de agua
recogida. Alternativamente, el medio puede estar presente en forma
de polvo en los recipientes antes de la recogida de la muestra.
2. Los recipientes para las muestras se
equilibran después térmicamente (esto es se llevan a la temperatura
de incubación en un baño de agua) preferiblemente a 35ºC o a 41ºC
\pm 1ºC, preferiblemente durante 20 minutos.
3. Una fluorescencia azul es indicativa de la
presencia de especies de Enterococcus en la muestra de agua
ensayada cuando el
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranosido
es el indicador nutriente. La fluorescencia se puede leer
visualmente usando una lámpara UV a 365 nm. Alternativamente, la
señal se puede monitorizar con un espectrofotómetro fluorescente
usando una longitud de onda de excitación de 365 nm y una longitud
de onda de emisión de 440-450 nm.
Puede tener lugar una reacción positiva en
cualquier momento antes de 24 horas si hay bacterias viables
presentes en la muestra. Esto es, aproximadamente 95% de las
muestras que contienen 10 cfu/100 ml presentarán un cambio
característico detectable antes de 24 horas. El tiempo para la
detección, que está dentro del intervalo de aproximadamente 12 a 24
horas, varía con la concentración y la presencia de especies de
cepas de Enterococci.
Se puede usar el mismo medio para cuantificar las
moléculas objetivos. El ensayo se puede realizar con el formato
regular de MPN con 5 o 10 tubos o con el formato MPN
"Quanti-tray" de 50 a 100 pocillos (véase,
Naqui, solicitud de patente de Estados Unidos 08/201.110). El
procedimiento para cuantificar los Enterococci usando el
medio de la tabla I se describe a continuación:
1. Se recoge una muestra de agua usando uno o más
recipientes estériles precalibrados. El volumen de la muestra puede
ser de diferentes cantidades, incluyendo 100 ml, 10 ml, o 1 ml
dependiendo de la aplicación. El medio de esta invención se puede
añadir en forma de polvo a la muestra de agua recogida.
Alternativamente, el medio de esta invención puede estar presente
en forma de polvo en el recipiente antes de la recogida de la
muestra.
2. La muestra se vierte después en un
"Quanti-tray" y a continuación se sella con
calor para crear los 50 o 100 pocillos MPN. Alternativamente, se
pueden distribuir alícuotas de la muestra en 5 o 10 tubos MPN.
3. Los recipientes con la muestra se incuban
preferiblemente a 35ºC o 41ºC \pm 1ºC.
4. La fluorescencia se puede leer visualmente
usando una lámpara UV a 365 nm. Una fluorescencia azul es
indicativa de una reacción positiva cuando se usa el
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranosido
como indicador nutriente. La densidad de enterococcus en las
muestras de agua se puede correlacionar directamente con el número
de pocillos positivos del "Quanti-tray" o con
el número de tubos positivos usando la fórmula de cálculo de MPN,
MPN = Nln (N/N-X) en la que N representa el número
total de tubos o pocillos ensayados y X representa el número total
de tubos o pocillos positivos. El tiempo máximo para la detección es
de 24 horas.
El medio descrito antes se puede usar también
para la aplicación de cribado rápido pasa/no pasa. Este formato
implica el uso de una relación lineal directa entre la densidad de
enterococcus en una muestra de agua ensayada con el tiempo de
detección de los resultados positivos. El procedimiento para el
ensayo de cribado rápido pasa/no pasa usando la misma fórmula es el
siguiente:
1. Se recoge una muestra de agua usando uno o más
recipientes estériles precalibrados. El volumen de la muestra puede
ser de diferentes cantidades, incluyendo 100 ml, 10 ml, o 1 ml
dependiendo de la aplicación. El medio de esta invención se puede
añadir en forma de polvo a la muestra de agua recogida.
Alternativamente, el medio de esta invención puede estar presente
en forma de polvo en el recipiente antes de la recogida de la
muestra.
2. Los recipientes con la muestra se incuban
preferiblemente a 35ºC o 41ºC \pm 1ºC.
3. La fluorescencia se puede leer visual o
fluoroespectrofotométricamente. Una fluorescencia azul es
indicativa de una reacción positiva. El tiempo para un resultado
positivo se usa como un indicador para determinar si la muestra de
agua ensayada está en un nivel de "riesgo", "precaución",
o "pasa".
Experimento
1
Este experimento se realizó para determinar el
indicador nutriente que proporciona la detección más rápida.
Las cepas de enterococcus usadas se hicieron
crecer en placas con agar y sangre TSAI. Se hicieron crecer los
siguientes microorganismos: E. faecalis ATCC 19433, ATCC
33012, ATCC 33186, ATCC 35550, ATCC 29212; E. faecium ATCC
19434, ATCC 35667; E. durans ATCC 6056, ATCC 11576, ATCC
19432; E. avium ATCC 14025, ATCC 35665; E.
gallinarium ATCC 49573; Streptococcus bovis ATCC 9809,
ATCC 35034; y S. Equinus ATCC 9812. Se prepararon las
suspensiones celulares tomando las células de las placas usando una
torunda de algodón estéril (prehumedecida) y se resuspendieron en
tampón HEPES 50 mM pH 7,5 hasta una turbidez equivalente al estándar
de MacFarland. Los siguientes sustratos enzimáticos se ensayaron en
cuanto a su sensibilidad por la
\beta-glucosidasa:
o-nitrofenil-\beta-D-glucopiranosido
(ONPD) y
4-metilumbeliferona-\beta-D-glucopiranosido
(MUD).
Los datos mostraron que el
4-metilumbeliferona-\beta-D-glucopiranosido
era el sustrato más sensible a la actividad de la
\beta-glucosidasa del enterococcus. Este
sustrato cuando se excita a 315 \mum (monitorizado con una lámpara
UV), da una fluorescencia azul después de la hidrólisis con
\beta-glucosidasa.
Experimento
2
Se realizó un estudio usando la fórmula nutriente
proporcionada en la tabla 1. Esto permitió la detección de los
Enterococci a 1-2 cfu/100 ml en 16 a 22 horas
(véase la tabla más adelante). Las muestras de agua se recogieron y
se añadieron al medio descrito antes. Los recipientes de las
muestras se incubaron después a 41ºC \pm 1ºC. Los recipientes de
las muestras se monitorizaron para la aparición de la fluorescencia
azul. Los resultados se muestran a continuación e indican la
detección sensible de los Enterococci en un medio de esta
invención.
Detección de enterococcus con un ensayo
de enterococcus
prototipo
| Tiempo | |||||
| Cepas | Inóculo | 16 h | 18 h | 20h | 22 h |
| E. faecalis ATCC 33186 | 26 cfu; 100 ml | + | + | + | + |
| 2,6 cfu/100 ml | + | + | + | + | |
| E. faecium ATCC 35667 | 15 cfu/100 ml | + | + | + | + |
| 1,5 cfu/100 ml | + | + | + | + | |
| E. avium ATCC 35665 | 20 cfu/100 ml | D | + | + | + |
| 2 cfu/100 ml | - | + | + | + | |
| E. durans ATCC 6056 | 11 cfu/100 ml | D | + | + | + |
| 1,1 cfu/100 ml | - | - | D | + | |
| "+"-positivo; "-"- negativo; "D"- débil fluorescencia |
Otras realizaciones están dentro del alcance de
las siguientes reivindicaciones.
Claims (16)
1. Un medio para detectar la presencia o ausencia
de Enterococci en una muestra licuada y no gelificada, que
comprende:
a) alanina (de 0,015 a 0,055 g/l); arginina (de
0,01 a 0,04 g/l); ácido aspártico (de 0,04 a 0,10 g/l), cistina (de
0,001 a 0,005 g/l), ácido glutámico (de 0,05 a 0,15 g/l), glicina
(de 0,01 a 0,03 g/l), histidina (de 0,010 a 0,06 g/l), isoleucina
(de 0,01 a 0,10 g/l), leucina (aproximadamente de 0,03 a 0,08 g/l),
lisina (aproximadamente de 0,03 a 0,07 g/l), metionina
(aproximadamente de 0,01 a 0,04 g/l), fenilalanina (aproximadamente
de 0,01 a 0,04 g/l), prolina (aproximadamente de 0,02 a 0,08 g/l),
serina (aproximadamente de 0,01 a 0,05 g/l), treonina
(aproximadamente de 0,01 a 0,04 g/l), triptófano (aproximadamente de
0,002 a 0,006 g/l), tirosina (aproximadamente de 0,01 a 0,02 g/l),
y valina (aproximadamente de 0,02 a 0,05 g/l);
biotina (aproximadamente de 0,15 a 0,40
\mug/l), ácido pantoténico (aproximadamente de 45,0 a 65,0
\mug/l), piridoxina (aproximadamente de 6,0 a 9,0 \mug/l),
riboflavina (aproximadamente de 10,0 a 20,0 \mug/l), ácido fólico
(aproximadamente de 5,00 a 10,00 \mug/l), tiamina (aproximadamente
de 10,0 a 20,0 \mug/l), vitamina B_{12} (aproximadamente de
0,20 a 0,30 \mug/l), y niacina (aproximadamente de 15,0 a 25,0
\mug/l).
fosfato (aproximadamente de 0,0005 a 0,005 g/l),
potasio (aproximadamente de 0,0004 a 0,004 g/l), sodio
(aproximadamente de 0,03 a 0,06 g/l), y trazas de calcio, magnesio,
aluminio, bario, cloruro, cobalto, cobre, hierro, plomo, manganeso,
sulfato, azufre, estaño y zinc;
b) una cantidad efectiva de uno o más indicadores
nutrientes proporcionados en una cantidad suficiente para
proporcionar una señal característica detectable en el medio
durante el crecimiento de dichos Enterococci; liberando dicho
indicador nutriente un resto nutriente en la presencia de
\beta-glucosidasa; y
c) una cantidad efectiva de uno o más agentes
selectivos, activos para evitar o inhibir el crecimiento de otros
microorganismos distintos de los Enterococci
presentando dicho medio un cambio característico
detectable antes de 24 horas en una muestra que contiene de 1 a 10
Enterococci por 100 ml.
2. El medio de la reivindicación 1, que comprende
además: un tampón, de 4,0 a 6,0 g/litro de sulfato de amonio, una
fuente de dióxido de carbono y de iones fósforo, una cantidad
efectiva de un inductor de \beta-glucosidasa, una
cantidad efectiva de antibióticos para inhibir el crecimiento de
hongos y de bacterias gram positivas y gram negativas distintas de
los Enterococci.
3. El medio de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2, en el que dicho indicador nutriente se metaboliza
hasta un resto que sirve como una fuente de nutrición y un resto
que altera una característica observable de dicho medio.
4. El medio de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3, en el que dicho indicador nutriente altera el color de dicho
medio en un intervalo de longitudes de onda del espectro visible
por medio de la acción de la actividad de la
\beta-glucosidasa.
5. El medio de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3, en el que dicho indicador nutriente altera el color de dicho
medio en un intervalo de longitudes de onda del espectro no visible
por medio de la acción de la actividad de la
\beta-glucosidasa.
6. El medio de la reivindicación 5, en el que
dicho indicador nutriente es
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranosido.
7. El medio de la reivindicación 1, que comprende
además: un tampón, de 4,000 a 6,000 g/l de base nitrogenada de
levaduras modificada, de 1,0 a 2,5 g/l de bicarbonato de sodio, de
0,1 a 1,0 g/l de fosfato de potasio, de 0,009 a 0,011 g/l de
etil-\beta-D-tioglucósido,
de 0,02 a 0,03 g/l de
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranosido,
de 0,0045 a 0,0055 g/l de sulfato de amikacina, de 0,00198 a 0,00242
g/l de anfotericina B, y de 0,00476 a 0,00794 g/l de
bacitracina.
8. Un método para detectar la presencia o
ausencia de Enterococci en una muestra licuada y no
gelificada, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra líquida con el
medio de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;
b) incubar dicha muestra líquida y dicho medio;
y
c) monitorizar dicha muestra líquida para
determinar la presencia de un cambio detectable en una
característica física
presentando dicho medio un cambio característico
detectable antes de 24 horas en una muestra que contiene de 1 a 10
Enterococci por 100 ml.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
dicha etapa de monitorización dura un máximo de 24 horas.
10. El método de la reivindicación 8 o de la
reivindicación 9, en el que dicha muestra líquida se toma de una
fuente de agua fresca o marina.
11. El método de la reivindicación 8 o de la
reivindicación 9, en el que dicha muestra líquida se toma de una
fuente de aguas residuales.
12. El método de la reivindicación 8 o de la
reivindicación 9, en el que dicha muestra líquida se toma de una
fuente de agua potable.
13. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en el que dicho cambio físico
característico detectable es un cambio de color.
14. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 13, en el que dicho cambio físico
característico detectable es un cambio de color visible en presencia
de una fuente de luz de excitación.
15. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 14, en el que dicha etapa de incubación se
realiza de 35ºC a 45ºC.
16. Un método para cuantificar la cantidad o el
número de Enterococci presentes en una muestra líquida, no
gelificada que comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra líquida con el
medio de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;
b) poner dicha muestra líquida y dicho medio en
recipientes;
c) incubar dicha mezcla de la muestra líquida y
el medio;
d) observar la cantidad y calidad de un cambio
detectable en una característica física; y
e) comparar la calidad y cantidad de un cambio
detectable en dicha característica física con los valores numéricos
más probables
presentando dicho medio un cambio característico
detectable antes de 24 horas en una muestra que contiene de 1 a 10
Enterococci por 100 ml.
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